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TWI763960B - 一種預防或治療骨關節炎的方法及藥物 - Google Patents

一種預防或治療骨關節炎的方法及藥物

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Publication number
TWI763960B
TWI763960B TW107145532A TW107145532A TWI763960B TW I763960 B TWI763960 B TW I763960B TW 107145532 A TW107145532 A TW 107145532A TW 107145532 A TW107145532 A TW 107145532A TW I763960 B TWI763960 B TW I763960B
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plasminogen
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osteoarthritis
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TW107145532A
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TW201927334A (zh
Inventor
李季男
Original Assignee
大陸商深圳瑞健生命科學研究院有限公司
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Abstract

本發明涉及藉由使用纖溶酶原預防或治療骨關節病的方法及藥物。本發明證明纖溶酶原可以改善骨關節的結構完整性,增強關節局部成骨細胞活性及/或降低破骨細胞的活性、促進軟骨再生和軟骨下骨骨重建,並可以有效緩解疼痛等症狀,為骨關節疾病的治療開闢了新的途徑。

Description

一種預防或治療骨關節炎的方法及藥物
本發明涉及藉由使用纖溶酶原預防或治療骨關節炎的方法及藥物。
骨關節炎,又稱骨性關節炎、退行性關節炎、退行性關節病、骨關節病,其 是最常見的關節炎形式,影響約2.37億 (3.3%)的人口,也是關節疼痛甚至殘疾的主導原因之一 (參考文獻1),在60歲以上的人中,約有10%的男性及18%的女性受到影響 (參考文獻2)。骨關節炎是一種多因素引起的,以關節軟骨進行性分解為特徵的異質性疾病,這些因素包括創傷、異常的機械負荷、營養供應不足和遺傳誘因等,還有代謝因素和髕下脂肪墊。過去的研究關注異常的生物力學對軟骨下骨、關節軟骨完整性和軟骨細胞病理生理的影響;最近的證據表明,骨關節炎的臨床症狀不僅影響關節軟骨,而且影響多種關節組織的完整性,包括滑膜、骨、韌帶、支持的肌肉和半月板等 (參考文獻3)。
骨關節炎的根本原因並非是骨骼發生了病變,現代醫學研究發現,患病的根本原因在於軟骨等「關節保護系統」對關節保護能力的喪失。具體表現在:各類骨關節疾病的發生往往始於滑膜病變、軟骨受損或是變性;服用某些抗炎類、激素類藥物所造成的軟骨損傷也是許多骨關節疾病的主要成因之一。由於關節滑膜、軟骨的損傷以及關節滑液的缺失,導致關節骨骼缺少必要的保護,以至於人體活動時,關節處的骨骼因缺乏必要的「軟骨保護」直接發生劇烈硬性摩擦,而引發患者關節疼痛、腫脹、變形、骨刺增生等多種症狀 (參考文獻4)。因此,修復受損關節軟骨、滑膜並促進軟骨、滑膜的再生能力,催生關節滑液,從而恢復關節器官的「軟骨保護層」是治療骨關節疾病的關鍵所在。
本研究證明纖溶酶原可以改善骨關節的結構完整性,增強關節局部成骨細胞活性及/或降低破骨細胞的活性、促進軟骨再生和軟骨下骨骨重建和有效緩解疼痛等,為包括骨關節炎在內的關節損傷疾病的治療開闢了新的途徑。
本發明涉及如下各項:
在一方面,本發明涉及:1. 一種治療骨關節炎的方法,包括給予受試者有效量的纖溶酶原。
2. 如前述第1項的方法,其中所述纖溶酶原增加關節軟骨的量及/或促進關節軟骨損傷修復。
3. 如前述第1項或第2項的方法,其中所述纖溶酶原改善關節滑膜炎症狀況。
4. 如前述第1項至第3項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原促進關節的軟骨下骨骨重建。
5. 如前述第1項至第4項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原改善關節的炎症狀況、疼痛和/或改善關節功能。
6. 如前述第1項至第5項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原減輕關節腫脹和疼痛。
7. 一種促進骨關節炎受試者關節軟骨再生的方法,包括給予受試者有效量的纖溶酶原。
8. 一種促進受試者關節損傷修復的方法,包括給予受試者有效量的纖溶酶原。
9. 如前述第8項的方法,其中所述纖溶酶原促進關節軟骨再生及/或軟骨下骨骨重建。
10. 如前述第8項或第9項的方法,其中所述受試者為骨關節炎受試者。
11. 如前述第8項至第10項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原改善關節組織的炎症狀況和/或減輕關節疼痛。
12. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原與序列 2、6、8、10 或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性,並且仍然具有纖溶酶原活性。
13. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
14. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。
15. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
16. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
17. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原的胺基酸如序列2、6、8、10或12所示。
18. 如前述第1項至第11項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。
19. 如前述第1項至第18項中任一項的方法,其中所述受試者是人。
20. 如前述第1項至第19項中任一項的方法,其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。
21. 如前述第1項至第20項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原與一種或多種關節損傷治療藥物或方法、或一種或多種骨關節炎治療藥物或方法聯合應用。
22. 一種用於前述第1項至第21項中任一項的方法之纖溶酶原。
23. 一種藥物組合物,其包含藥學上可接受的載劑及用於前述第1項至第21項中任一項所述方法之纖溶酶原。
24. 一種預防性或治療性試劑盒,其包含:(i) 用於前述第1項至第21項中任一項所述方法之纖溶酶原、及(ii) 用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件 (means)。
25. 如前述第24項所述的試劑盒,其中所述構件為注射器或小瓶。
26. 如前述第24項或第25項的試劑盒,其中還包含標籤或使用說明書,該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述第1項至第21項中任一項所述的方法。
27. 一種製品,其包含:含有標籤的容器;及包含(i) 用於前述第1項至第21項中任一項所述方法之纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物,其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述第1項至第21項中任一項所述的方法。
28. 如前述第24項至第26項中任一項的試劑盒或第27項的製品,其中還包含另外的一個或多個構件或容器,該構件或容器中含有一種或多種其它的關節損傷治療藥物或用品、或一種或多種其它的骨關節炎治療藥物或用品。
29. 如前述第24項至第26項中任一項的試劑盒或第27項的製品,其中還包括與骨關節炎併發的其它疾病的藥物。
30. 包含纖溶酶原之用於治療骨關節炎的藥劑。
31. 包含纖溶酶原之用於治療關節損傷的藥劑。
32. 包含纖溶酶原之用於治療骨關節炎的藥物組合物、試劑盒、或製品。
33. 包含纖溶酶原之用於治療關節損傷的藥物組合物、試劑盒、或製品。
34. 纖溶酶原在製備治療骨關節炎的藥物、製品或試劑盒中的用途。
35. 如前述第34項的用途,其中所述纖溶酶原增加關節軟骨的量及/或促進關節軟骨損傷修復。
36. 如前述第34項或第35項的用途,其中所述纖溶酶原改善關節滑膜炎症狀況。
37. 如前述第34項至第36項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原促進關節的軟骨下骨骨重建。
38. 如前述第34項至第37項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原改善關節的炎症狀況、疼痛和/或改善關節功能。
39. 如前述第34項至第38項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原減輕關節腫脹和疼痛。
40. 纖溶酶原在製備促進骨關節炎受試者關節軟骨再生的藥物中的用途。
41. 纖溶酶原在製備促進受試者關節損傷修復的藥物中的用途。
42. 如前述第41項的用途,其中所述纖溶酶原促進關節軟骨再生及/或軟骨下骨骨重建。
43. 如前述第41項或第42項的用途,其中所述受試者為骨關節炎受試者。
44. 如前述第41項至第43項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原改善關節組織的炎症狀況及/或減輕關節疼痛。
45. 如前述第34項至第44項中任一項的方法,其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,並且仍然具有纖溶酶原活性。
46. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
47. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。
48. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
49. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
50. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原的胺基酸如序列2、6、8、10或12所示。
51. 如前述第34項至第44項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。
52. 如前述第34項至第51項中任一項的用途,其中所述受試者是人。
53. 如前述第34項至第52項中任一項的用途,其中所述纖溶酶原與一種或多種關節損傷治療藥物或用途、或一種或多種骨關節炎治療藥物或方法聯合應用。
定義
「關節」為骨之間的連接組織,該連接組織中有腔隙,能做不同程度的活動。關節主要的結構有關節囊、關節腔、關節軟骨、滑液,以及韌帶、關節周圍的肌肉和肌腱、滑膜皺襞、滑囊、半月板、軟骨下骨等。關節囊是包繞關節相對的兩個骨端的結締組織膜囊。它分為內外兩層:外層為纖維層,由緻密結締組織構成,厚而堅韌,主要起著維持關節的牢固性及穩定性作用;內層為滑膜層,薄而柔軟,由血管豐富的疏鬆結締組織構成,覆蓋在纖維層的內面形成環繞滑膜腔的囊。關節腔是由關節囊與關節面圍成的組織腔隙。正常情況下,關節腔內會有少許黏稠的液體 (即滑液),具有潤滑和營養關節的作用。關節軟骨是指覆蓋在關節表面的那層很薄的軟骨。它覆蓋於關節面上,具有很好的彈性,從而有減少摩擦、緩衝震盪與衝擊力的作用。滑液即關節液,由滑膜所分泌。正常滑液清亮、黏稠。當關節有炎症時,滑液量明顯增多,關節腔內壓力增高,因而產生局部腫痛。
本發明的一些實施方案涉及纖溶酶原治療關節損傷的方法和促進關節損傷受試者關節損傷修復的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。在一些實施方案中,所述的關節損傷包括炎症、退行性病變、代謝障礙或創傷引起的關節損傷。在一些實施方案中,所述纖溶酶原藉由促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建治療關節損傷,或促進關節損傷的修復。在一些實施方案中,纖溶酶原改善關節損傷受試者的關節組織的炎症和/或減輕關節疼痛。在一些實施方案中,所述關節組織的炎症包括關節滑膜的炎症。在一些實施方案中,所述纖溶酶原減輕關節損傷受試者關節腫脹和疼痛。
在一些實施方案中,本發明涉及促進關節軟骨再生的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。在一些實施方案中,本發明涉及纖溶酶原藉由促進軟骨再生促進關節損傷的修復和治療關節損傷疾病。
在上述纖溶酶原治療關節損傷、促進關節損傷修復的一些實施方案中,所述關節損傷為骨關節炎導致的關節損傷。
在上述纖溶酶原治療關節損傷、促進關節損傷修復的一些實施方案中,所述纖溶酶原藉由促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建,使關節損傷得以修復,由關節損傷發展成骨關節炎的過程得以截斷。因此,本發明也涉及纖溶酶原用於預防骨關節炎的方法,包括對骨關節損傷的受試者施用有效量的纖溶酶原。
在上述所有纖溶酶原治療關節損傷、促進關節損傷修復、促進軟骨再生、預防關節損傷發展為骨關節炎的方法中,所述纖溶酶原可以單獨施用,也可以與一種或多種其它藥物或方法聯合施用。所述聯合施用包括在一種或多種其它藥物或方法施用之前,同時或之後施用纖溶酶原。
「骨關節炎 (osteoarthritis, OA)」為一種退行性病變,是由於增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常、關節畸形等諸多因素引起的關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生,又稱骨關節病、退行性關節炎、老年性關節炎等。臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等。
骨關節炎是骨關節的退行性病變,好發於負重關節及活動量較多的關節,例如,頸椎、腰椎、膝關節、髖關節等。過度負重或使用這些關節,均可促進退行性變化的發生。臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等。影像學改變包括關節軟骨及軟骨下骨質的異常改變,關節間隙狹窄 (此表明關節軟骨已開始變薄),骨質鈣化,關節邊緣變尖,骨贅形成和/或軟骨下骨性囊腔形成。本發明所述的「骨關節炎「涵蓋身體各部位發生的骨關節炎,包括頸椎、腰椎、膝關節、髖關節部位的骨關節炎或相關退行性病變。
本發明的一些實施方案涉及纖溶酶原治療骨關節炎的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。在一些實施方案中,所述纖溶酶原促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建。在一些實施方案中,纖溶酶原改善關節組織的炎症狀況和/或減輕關節腫脹和/或疼痛。在一些實施方案中,纖溶酶原改善關節滑膜的炎症和/或減輕關節腫脹和/或疼痛。在一些實施方案中,所述骨關節炎為頸椎、腰椎、膝關節、髖關節部位的骨關節炎或相關退行性病變。
在上述纖溶酶原治療骨關節炎的實施方案中,所述「治療」包括減輕、緩解、改善或消除如下的一個或多種症狀或體徵:關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、關節功能障礙或受限、關節軟骨或軟骨下骨質異常改變、關節間隙狹窄,骨質鈣化、關節邊緣變尖、骨贅、軟骨下骨性囊腔。在所述的纖溶酶原治療骨關節炎的實施方案中,所述骨關節炎包括頸椎、腰椎、膝關節、髖關節的骨關節炎及其相關退行性病變。
「骨重建」也稱「骨重塑」,指成熟的骨組織從骨骼中移除(稱為骨吸收的過程)並且形成新的骨組織 (稱為骨化或新骨形成的過程)。這些過程還控制骨折等損傷後骨骼的再成形或置換,以及在正常活動期間發生的微損傷。重塑也響應機械負載的功能需求。骨骼的結構以及鈣的充足供應需要成骨細胞 (分泌新骨)和破骨細胞 (破骨)二種細胞類型與骨重建部位存在的其它細胞群 (例如免疫細胞等)的密切配合,並依賴於複雜的訊號傳導途徑和控制機制,實現適當的生長和分化速率。
在一些實施方案中,本發明涉及纖溶酶原促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建。在一些實施方案中,本發明涉及纖溶酶原促進 (增強)骨關節炎受試者骨關節炎患病部位成骨細胞的活性和/或降低破骨細胞的活性。
在一些實施方案中,本發明涉及纖溶酶原促進受試者關節損傷修復的方法,包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。在一些實施方案中,所述的關節損傷包括炎症、退行性病變、代謝障礙或創傷引起的關節損傷。在一些實施方案中,所述纖溶酶原藉由促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建治療關節損傷,或促進關節損傷的修復。在一些實施方案中,所述纖溶酶原促進 (增強)關節損傷受試者關節損傷部位成骨細胞的活性和/或降低破骨細胞的活性。在一些實施方案中,所述關節損傷為骨關節炎導致的關節損傷。在一些實施方案中,所述的關節損傷為炎症、代謝障礙或創傷引起的關節損傷。
「改善」關節滑膜炎症 (狀況)、「改善」關節的炎症 (狀況)、「改善」關節組織的炎症 (狀況)或「改善」關節組織的炎症是指炎症或炎症狀況經過給藥纖溶酶原治療得到改善,炎症反應最終緩解、消退。
在上述所有纖溶酶原治療骨關節炎的實施方案中,所述纖溶酶原可以單獨施用,也可以與一種或多種其它藥物或方法聯合施用。所述聯合施用包括在一種或多種其它藥物或方法施用之前,同時或之後施用纖溶酶原。
纖溶酶是纖溶酶原啟動系統 (PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶,能夠水解細胞外基質 (ECM)的幾個組分,包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖 (參考文獻5)。此外,纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體 (pro-MMPs)啟動形成具有活性的金屬蛋白酶 (MMPs)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物 (參考文獻6及7)。纖溶酶是由纖溶酶原藉由兩種生理性的PAs:組織型纖溶酶原啟動劑 (tPA )或尿激酶型纖溶酶原啟動劑 (uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水準較高,傳統上認為PA系統的調節主要藉由PAs的合成和活性水準實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節,如激素、生長因子和細胞因子。此外,還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原啟動劑抑制劑-1 (PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原啟動劑抑制劑-2 (PAI-2)調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體 (uPAR) (參考文獻8及9)。
纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白,由791個胺基酸組成,分子量約為92 kDa (參考文獻10及11)。纖溶酶原主要在肝臟合成,大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源 (參考文獻12及13)。纖溶酶原存在兩種分子形式:谷胺酸-纖溶酶原 (Glu-plasminogen)和賴胺酸-纖溶酶原 (Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個胺基末端 (N-末端)谷胺酸,因此被稱為谷胺酸-纖溶酶原。然而,在纖溶酶存在時,谷胺酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴胺酸-纖溶酶原。與谷胺酸-纖溶酶原相比,賴胺酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力,並可以更高的速率被PAs啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割,導致二硫鍵連接的雙股蛋白酶纖溶酶的形成 (參考文獻14)。纖溶酶原的胺基末端部分包含五個同源三環,即所謂的kringles,羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴胺酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原為38 kDa的片段,其中包括kringles1-4,是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素,可藉由幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。
纖溶酶的主要底物是纖維蛋白,纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵 (參考文獻15)。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性,包括層黏連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠,表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用 (參考文獻11、16、及17)。間接地,纖溶酶還可以藉由轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分,包括MMP-1,MMP-2,MMP-3和MMP-9。因此,有人提出,纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器 (參考文獻18)。此外,纖溶酶具有啟動某些潛在形式的生長因子的能力 (參考文獻19-21)。在體外,纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。
「纖溶酶」是存在於血液中的一種非常重要的酶,能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。
「纖溶酶原」是纖溶酶的酶原形式,根據swiss prot中的序列,按含有訊號肽的天然人源纖溶酶原胺基酸序列 (序列4)計算由810個胺基酸組成,分子量約為90kD,主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白,編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域:位於C末端的絲胺酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple (PAp)結構域以及5個Kringle結構域 (Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列,其訊號肽包括殘基Met1-Gly19,PAp包括殘基Glu20-Val98,Kringle1包括殘基Cys103-Cys181,Kringle2包括殘基Glu184-Cys262,Kringle3包括殘基Cys275-Cys352,Kringle4包括殘基Cys377-Cys454,Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料,絲胺酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。
Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原,由791個胺基酸組成 (不含有19個胺基酸的訊號肽),編碼該序列的cDNA序列如序列1所示,其胺基酸序列如序列2所示。 在體內,還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位胺基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原,如序列6所示,編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段,僅含有Kringle1和絲胺酸蛋白酶域 (參考文獻22及23),有文獻報導了delta-纖溶酶原的胺基酸序列(序列8) (參考文獻23),編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原 (Mini-plasminogen)由Kringle5和絲胺酸蛋白酶域組成,有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791 (以不含有訊號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸) (參考文獻24),其胺基酸序列如序列10所示,編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲胺酸蛋白酶結構域,有文獻報導其胺基酸序列包括殘基Ala543-Asn791 (以不含有訊號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸) (參考文獻25),也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791 (以不含有訊號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸),本專利序列參考專利文獻CN102154253A,其胺基酸序列如序列12所示,編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本發明的「纖溶酶」與「纖維蛋白溶酶」、「纖維蛋白溶解酶」可互換使用,含義相同;「纖溶酶原」與「纖維蛋白溶酶原」、「纖維蛋白溶解酶原」可互換使用,含義相同。
在本申請中,所述纖溶酶原「缺乏」的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低,低至足以影響所述受試者的正常生理功能;所述纖溶酶原「缺失」的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人,甚至活性或表達極微,只有藉由外源提供才能維持正常生理功能。
本發明技術領域具通常知識者可以理解,本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶,因此,本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。
在循環過程中,纖溶酶原採用封閉的非活性構象,但當結合至血栓或細胞表面時,在纖溶酶原啟動劑 (plasminogen activator,PA)的介導下,其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體,進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定叢,而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴胺酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶,包括:組織纖溶酶原啟動劑 (tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑 (uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII (哈格曼因子)等。
「纖溶酶原活性片段」是指在纖溶酶原蛋白中,能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲胺酸蛋白酶域的蛋白質,較佳為,本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的胺基酸序列的蛋白質。因此,本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。
目前,對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括:對組織纖溶酶原啟動劑活性的檢測 (t-PAA)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抗原的檢測 (t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測 (plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測 (plgAg) 、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測 (PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法:向受檢血漿中加鏈激酶 (SK)和發色底物,受檢血漿中的PLG在SK的作用下,轉變成PLM,後者作用於發色底物,隨後用分光光度計測定,吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。
「直系同源物或直系同系物 (ortholog) 」指不同物種之間的同源物,既包括蛋白同源物也包括DNA同源物,也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原,還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。
「保守取代變體」是指其中一個給定的胺基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能,這包括但不限於以相似特性 (如酸性,鹼性,疏水性,等)的胺基酸取代親本蛋白質中胺基酸序列中的胺基酸。具有類似性質的胺基酸是眾所周知的。例如,精胺酸、組胺酸和賴胺酸是親水性的鹼性胺基酸並可以互換。同樣,異白胺酸是疏水胺基酸,則可被白胺酸、甲硫胺酸或纈胺酸替換。因此,相似功能的兩個蛋白或胺基酸序列的相似性可能會不同。例如,基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度 (同一性)。「保守取代變體」還包括藉由BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的胺基酸同一性的多肽或酶,若能達 75%以上更好,最好能達85%以上,甚至達90%以上為最佳,並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。 「分離的」纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中,所述纖溶酶原會純化:(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計),如藉由Lowry法所確定的,例如超過99% (按重量計),(2)至足以藉由使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度,或(3)至同質性,該同質性是藉由使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括藉由生物工程技術從重組細胞製備,並藉由至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用,指任何長度的胺基酸的聚合形式,其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的胺基酸,化學或生物化學修飾的或衍生化的胺基酸,和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白,包括但不限於具有異源胺基酸序列的融合蛋白,具有異源和同源前導序列 (具有或沒有N端甲硫胺酸殘基)的融合物;等等。
關於參照多肽序列的「胺基酸序列同一性百分數(%)」定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後,且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時,候選序列中與參照多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現,例如使用公眾可得到的電腦軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本發明技術領域具通常知識者能決定用於比對序列的適宜參數,包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而,為了本發明的目的,胺基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。
在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中,給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性 (或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一%胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算:分數X/Y 乘 100;其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目,且其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應當領會,在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等的情況下,A相對於B的%胺基酸序列同一性會不等於B相對於A的%胺基酸序列同一性。除非另有明確說明,本文中使用的所有%胺基酸序列同一性值都是依照上一段所述,使用ALIGN-2電腦程式獲得的。
如本文中使用的,術語「治療」和「處理」指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀,和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀,並且包括:(a)預防疾病在受試者體內發生,所述受試者可以具有疾病的素因,但是尚未診斷為具有疾病;(b)抑制疾病,即阻滯其形成;和(c)減輕疾病和/或其症狀,即引起疾病和/或其症狀消退。
術語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用,指哺乳動物,包括但不限於鼠 (大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
「治療有效量」或「有效量」指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。「治療有效量」會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。本發明纖溶酶原的製備
纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途,也可以藉由標準的化學肽合成技術來合成。當藉由化學合成多肽時,可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成 (SPPS) (其中將序列的C末端胺基酸附接於不溶性支援物,接著序貫添加序列中剩餘的胺基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS,諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis;第3-284頁於The Peptides:Analysis, Synthesis, Biology.第2卷:Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963);Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之,用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後,將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的胺基酸單元偶聯。然後,將此單元去保護,露出可以與別的胺基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上,之後將其切掉。
可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如,將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中,使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子 (例如天然關聯的或異源的啟動子)、訊號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統,所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞 (例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中,在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。
合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常,表達載體含有選擇標誌物 (例如安比西林抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。
大腸桿菌 (Escherichia coli )是可以用於選殖主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌,諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )和其他腸桿菌科 ( nterobacteriaceae ),諸如沙門氏菌屬 (Salmonella )、沙雷氏菌屬 (Serratia )、和各種假單胞菌屬 (Pseudomonas )物種。在這些原核宿主中,也可以生成表達載體,其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列 (例如複製起點)。另外,會存在許多公知的啟動子,諸如乳糖啟動子系統,色胺酸 (trp)啟動子系統,beta-內醯胺酶啟動子系統,或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達,任選在操縱基因序列的情況中,並且具有核糖體結合位點序列等,以啟動並完成轉錄和翻譯。
其他微生物,諸如酵母也可用於表達。酵母 (例如釀酒酵母(S. cerevisiae )和畢赤酵母 (Pichia )是合適的酵母宿主細胞的例子,其中合適的載體根據需要具有表達控制序列 (例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
在微生物外,哺乳動物細胞 (例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體 (例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列,如複製起點,啟動子和增強子 (Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986),以及必需的加工資訊位元點,諸如核糖體結合位點,RNA剪接位點,多聚腺苷酸化位點,和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。
一旦合成 (化學或重組方式),可以依照本領域的標準規程,包括硫酸銨沉澱,親和柱,管柱層析,高效液相層析 (HPLC),凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的,例如至少約80%至85%純的,至少約85%至90%純的,至少約90%至95%純的,或98%至99%純的或更純的,例如不含污染物,所述污染物如細胞碎片,除主題抗體以外的大分子,等等。藥物配製劑
可以藉由將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑、或穩定劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol, A. ed.(1980)混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性,並包括緩衝劑例如磷酸鹽,檸檬酸鹽及其它有機酸;抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫胺酸;防腐劑 (例如十八烷基二甲基苄基氯化銨;氯化己烷雙胺;氯化苄烷銨 (benzalkonium chloride),苯索氯銨;酚、丁醇或苯甲醇;烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;間甲酚);低分子量多肽 (少於約10個殘基);蛋白質如血清白蛋白,明膠或免疫球蛋白;親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;胺基酸如甘胺酸,穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸;單糖,二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇;成鹽反離子如鈉;金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物);和/或非離子表面活性劑,例如 TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇 (PEG)。較佳為凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述,其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物,較佳為活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如,抗高血壓的藥物,抗心律失常的藥物,治療糖尿病的藥物等。
本發明的纖溶酶原可包裹在藉由諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中,例如,可置入在膠質藥物傳送系統 (例如:脂質體、白蛋白微球、微乳劑、奈米顆粒或奈米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以藉由在冷凍乾燥和重新配製之前或之後藉由除菌濾膜過濾而輕易實現。
本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質,例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠 (如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯) (Langer等,J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981);Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982)或聚 (乙烯醇),聚交酯 (美國專利3773919, EP 58,481),L-谷胺酸與γ乙基-L-谷胺酸的共聚物(Sidman,等,Biopolymers 22:547(1983),不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯 (ethylene-vinyl acetate) (Langer,等,出處同上),或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮胺醯脯胺酸 (leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體),以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上,而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如,如果發現凝聚的機理是藉由硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵,則可藉由修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。給藥和劑量
可以藉由不同方式,例如藉由靜脈內,腹膜內,皮下,顱內,鞘內,動脈內 (例如經由頸動脈),肌內來實現本發明藥物組合物的施用。
用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油,和可注射有機酯,如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液,包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物,等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑,諸如例如,抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體,等等。
醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的,任一患者的劑量取決於多種因素,包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為例如每天約0.0001至2000 mg/kg,或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg,0.25 mg/kg,0.5 mg/kg,0.75 mg/kg,10 mg/kg,50 mg/kg等等)受試者體重。例如,劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍,或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內,特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據藉由經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10 mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估治療效果和安全性。製品或藥盒
本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒,其包含可用於治療骨關節炎的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品較佳為包括一個容器,標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子,小瓶,注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物,所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口 (例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶,其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述骨關節炎。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器,諸如磷酸鹽緩衝的鹽水,林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質,包括其它緩衝液,稀釋劑,過濾物,針和注射器。此外,所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁,包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。
下面將藉由實施例對本發明進行詳細說明。這些實施例是對本發明的示例性說明,本領域具有一般知識的人應理解,本發明的權利範圍並不局限於所述實施例。實施例 1 纖溶酶原減少維生素 D 誘導的骨質疏鬆小鼠膝關節軟骨丟失
取5-6周齡的雄性C57小鼠15隻,稱重後隨機分為3組,空白對照組、給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組,每組各5隻。空白對照組小鼠每天腹腔注射50μL玉米油;給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠按照0.5μg/kg體重每天腹腔注射維生素D (Sigma Aldrich),誘導骨質疏鬆模型 (參考文獻26及27)。與此同時小鼠開始給藥,給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天,給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS,空白對照組小鼠不做給藥處理,連續造模給藥28天。給藥期間所有小鼠飼喂低鈣飼料。開始造模給藥定為第1天,第29天犧牲後取材膝關節於4%多聚甲醛固定24小時,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,以上操作需在4℃條件下進行。然後石蠟包埋,8 μm切片行Safranin O染色。切片在100倍光學顯微鏡下觀察。
軟骨染色液 (番紅O法)染色原理在於嗜鹼性的軟骨與鹼性染料番紅O結合呈現紅色,番紅O是一種結合多陰離子的陽離子染料,其顯示軟骨是基於陽離子染料與多糖中陰離子基團 (硫酸軟骨素或硫酸角質素)結合。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關係,間接反映基質中蛋白多糖的含量和分佈。
Safranin O染色即番紅染色,主要顯示軟骨組織中的酸性蛋白聚糖成分,能夠顯示軟骨形成 (參考文獻28)。
結果顯示,給纖溶酶原組 (圖1C)膝關節軟骨 (箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組 (圖1B),統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖1D),且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組膝關節軟骨更加接近空白對照小鼠 (圖1A)。說明纖溶酶原能夠顯著減少維生素D骨質疏鬆模型小鼠膝關節軟骨丟失。實施例 2 纖溶酶原減少二型膠原酶誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節損傷
10周齡的C57雄性小鼠12隻,按照50 mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉小鼠,然後肌肉注射Tolfedine (0.1mL/kg)。在小鼠右側膝關節處開個缺口,膝關節彎曲90度,小鼠按照5 μg/6μL/隻關節腔內注射二型膠原酶 (C6885,sigma);左側膝關節與右側膝關節操作相同,但僅注射相同體積的生理鹽水 (參考文獻29及30)。注射7天後小鼠分別按照體重隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各6隻,並開始給藥。給纖溶酶原組按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射給予人纖溶酶原,給溶媒PBS對照組尾靜脈注射相同體積的PBS,連續給藥14天。開始給藥定為第1天,第15天犧牲後取材膝關節於4%多聚甲醛固定24小時,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,以上操作需在4℃條件下進行。然後石蠟包埋,8μm切片行Safranin O染色。切片在40 (A、B)和100 (C、D)倍光學顯微鏡下觀察,並按表1對膝關節進行病理評分 (參考文獻31)。 1.
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結果顯示,給纖溶酶原組膝關節 (圖2B、D)病理評分明顯低於給溶媒PBS對照組 (圖2A、C),且統計差異極其顯著 (**表示P<0.01) (圖2E)。說明纖溶酶原能夠顯著減輕二型膠原酶誘導的骨關節炎對膝關節的損傷,減少關節軟骨的丟失。實施例 3 纖溶酶原改善二型膠原酶誘導的骨關節炎模型 Plg-/- 小鼠膝關節組織結構狀態
10周齡的Plg-/-雄性小鼠10隻,按照50 mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉小鼠,然後肌肉注射Tolfedine (0.1mL/kg)。在小鼠右側膝關節處開個缺口,膝關節彎曲90度,小鼠按照5 μg/6μL/隻關節腔內注射二型膠原酶 (C6885,sigma);左側膝關節與右側膝關節操作相同,但僅注射相同體積的生理鹽水 (參考文獻29及30)。注射7天後小鼠分別按照體重隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻,並開始給藥。給纖溶酶原組按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射給予人纖溶酶原,給溶媒PBS對照組尾靜脈注射相同體積的PBS,連續給藥14天。開始給藥定為第1天,第15天犧牲後取材膝關節於4%多聚甲醛固定24小時,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,以上操作需在4℃條件下進行。然後石蠟包埋,4μm切片行Safranin O染色。切片在40 (A、B)和100 (C、D)倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示,給溶媒PBS對照組 (圖3A、C)軟骨組織 (細箭頭標識)結構排列紊亂,細胞數目明顯減少,Safranin O著色明顯減少,骨小梁 (粗箭頭標識)變細、斷裂;給纖溶酶原組 (圖3B、D)相對於給溶媒PBS對照組,軟骨組織結構相對整齊,軟骨處細胞數目相對較多,Safranin O著色範圍相對較廣。說明纖溶酶原能夠減少二型膠原酶誘導的骨關節炎Plg-/-小鼠膝關節的損傷。實施例 4 纖溶酶原改善韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節組織結構狀態
9-10周齡的C57雄性小鼠10隻。按照50 mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉小鼠。脫去膝關節周圍毛髮,臨近手術前小鼠肌肉注射Tolfedine (0.1mL/kg)鎮痛劑。小鼠放置在解剖顯微鏡下,在右側膝蓋骨遠端和脛骨坪開口,分離髕骨韌帶,暴露關節腔;鈍性分離股骨髁間的脂肪墊,使得前十字交叉韌帶能夠被觀察到;用顯微刀片挑斷前十字交叉韌帶和內側副韌帶,縫合關節囊與皮膚, 建立骨關節炎模型 (參考文獻32及33)。左側膝關節僅暴露關節腔,不進行切斷操作。術中應注意避免損傷關節軟骨,術後不固定肢體,籠內自由活動。手術後第一天,每隔12小時小鼠肌肉注射Tolfedine (0.1mg/kg)及青黴素鉀 (4萬單位/kg)。兩周後小鼠根據體重隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻,並開始給藥。給纖溶酶原組按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射給予人纖溶酶原,給溶媒PBS對照組尾靜脈注射相同體積的PBS,連續給藥14天。開始給藥定為第1天,第15天犧牲後取材膝關節於4%多聚甲醛固定24小時,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,以上操作需在4℃條件下進行。然後石蠟包埋,4μm切片行Safranin O染色。切片在40倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示,給溶媒PBS對照組 (圖4A)軟骨 (三角形標識)丟失嚴重,骨小梁 (箭頭標識)變細,斷裂,出現較大面積的無骨小梁骨髓腔;給纖溶酶原組 (圖4B),較之於PBS對照組,骨小梁連續性較好,沒有較嚴重的斷裂,沒有較大面積的無骨小梁區域,軟骨組織相對較多。說明纖溶酶原能夠改善韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節組織結構狀況。實施例 5 纖溶酶原增加韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶活性
9-10周齡的C57雄性小鼠10隻。按照50 mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉小鼠。脫去膝關節周圍毛髮,臨近手術前小鼠肌肉注射Tolfedine (0.1mL/kg)鎮痛劑。小鼠放置在解剖顯微鏡下,在右側膝蓋骨遠端和脛骨坪開口,分離髕骨韌帶,暴露關節腔;鈍性分離股骨髁間的脂肪墊,使得前十字交叉韌帶能夠被觀察到;用顯微刀片挑斷前十字交叉韌帶,縫合關節囊與皮膚, 建立骨關節炎模型 (參考文獻32及33)。左側膝關節僅暴露關節腔,不進行切斷操作。術中應注意避免損傷關節軟骨,術後不固定肢體,籠內自由活動。手術後第一天,每隔12小時小鼠肌肉注射Tolfedine (0.1mg/kg)及青黴素鉀 (4萬單位/kg)。兩周後小鼠根據體重隨機分為兩組,給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組,每組各5隻,並開始給藥。給纖溶酶原組按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射給予人纖溶酶原,給溶媒PBS對照組尾靜脈注射相同體積的PBS,連續給藥14天。開始給藥定為第1天,第15天犧牲後取材膝關節於固定液中固定。固定液配方:2%多聚甲醛,0.075mol/L賴胺酸,0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃PBS洗液梯度洗滌各12小時,然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周,每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃PBS洗液梯度洗滌12小時,膝關節經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片5 μm,脫蠟複水,氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時,蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘,60℃烤30分鐘,中性樹膠封片,切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
鹼性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, ALP) 是成骨細胞早期分化的標誌 (參考文獻32)。
結果顯示,給纖溶酶原組小鼠 (圖5B、D)膝關節軟骨表面和生長板鹼性磷酸酶著色 (箭頭標識)均多於給溶媒PBS對照組 (圖5A、C),且統計差異顯著(*表示P<0.05) (圖5E)。說明纖溶酶原能夠顯著促進韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶活性的增加,即纖溶酶原促使膝關節關節軟骨的成骨細胞活性明顯增加。實施例 6 纖溶酶原促進 MIA 骨關節炎模型小鼠膝關節軟骨再生
取8-10周C57雄性小鼠25隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組5隻,模型組20隻。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉後模型組小鼠脫去左側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,左側膝關節彎曲90度,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。 用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,關節腔內注射MIA (碘乙酸,monoiodoacetic acid, MIA)生理鹽水溶液0.1mg/10μL;假手術組左側關節腔注射10μL生理鹽水,注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈 (參考文獻34)。右側膝關節不處理。關節腔內MIA注射 3天後,模型組小鼠進行疼痛測試,根據測試結果小鼠隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各10隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。MIA溶液配製:MIA粉末(Sigma, 57858-5G)溶解於生理鹽水中,濃度為10mg/mL,然後0.22μm濾膜過濾,現用現配。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,然後石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織,以3%雙氧水孵育15分鐘,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。5%的正常羊血清液 (Vector laboratories, Inc., USA)封閉30分鐘;時間到後,棄除羊血清液,滴加兔源抗II型膠原抗體 (Abcam,ab34712) 4°C孵育過夜,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體 (Abcam) (二抗)室溫孵育1小時,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水,二甲苯透明並中性樹膠封片,切片在200倍光學顯微鏡下觀察拍照,並用Image-Pro 軟體處理收集資料。
碘乙酸 (Monoiodoacetic acid, MIA)有破壞關節軟骨和周圍滑膜韌帶的作用,將其注射入關節腔內,能改變關節腔原有的穩態,還可引發關節內炎症反應,從而改變軟骨和軟骨下骨的新陳代謝,破壞關節內環境的穩定,使軟骨細胞凋亡,軟骨磨損。研究表明,碘乙酸能夠抑制關節軟骨細胞代謝,引起軟骨細胞死亡,進而導致軟骨基質降解,誘導出關節炎軟骨改變和骨關節炎模型。II型膠原是軟骨基質的主要成分之一,在軟骨機械特性維持上發揮重要作用 (參考文獻35)。
結果顯示,假手術組 (圖6A)小鼠膝關節有一定量的II型膠原 (箭頭標識),給溶媒對照組 (圖6B)膝關節II型膠原量與假手術組無明顯差別,而給纖溶酶原組 (圖6C)膝關節II型膠原量明顯多於給溶媒對照組和假手術組,且平均光密度定量分析結果統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖6D)。結果表明纖溶酶原能夠促進骨關節炎模型小鼠膝關節軟骨再生。實施例 7 纖溶酶原對 MIA 誘導的骨關節炎改善作用
取8-10周C57雄性小鼠25隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組5隻,模型組20隻。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉後模型組小鼠脫去左側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,左側膝關節彎曲90度,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。 用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,關節腔內注射MIA生理鹽水溶液0.1mg/10μL;假手術組左側關節腔注射10μL生理鹽水,注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈 (參考文獻34)。右側膝關節不處理。關節腔內MIA注射 3天後,模型組小鼠進行疼痛測試,根據測試結果小鼠隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各10隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。MIA溶液配製:MIA粉末 (Sigma, 57858-5G)溶解於生理鹽水中,濃度為10mg/mL,然後0.22μm濾膜過濾,現用現配。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10% EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,然後石蠟包埋。5μm切片行Safranin O染色。切片在40倍光學顯微鏡下觀察拍照,按照表1進行病理學評分。
結果顯示,假手術組 (圖7A)小鼠膝關節有一定量的軟骨存在 (箭頭標識);給溶媒對照組 (圖7B)膝關節軟骨量明顯減少並且病理學評分明顯增加,說明MIA成功誘導骨關節炎;給纖溶酶原組 (圖7C)膝關節軟骨量明顯多於給溶媒對照組,病理學評分也明顯低於給溶媒對照組,且統計學差異顯著 (*表示P<0.05) (圖7D)。該結果表明纖溶酶原能夠促進軟骨再生,修復骨關節炎對關節的損傷。實施例 8 纖溶酶原促進骨關節炎模型小鼠膝關節軟骨再生
取11-15周齡db/db雌性小鼠18隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組3隻,模型組15隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒,切開皮膚、背部肌肉和腹膜,以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外,分離脂肪團,便可見卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮,然後摘除卵巢。假手術組小鼠麻醉後隻切開皮膚、背部肌肉和腹膜,不摘除卵巢。所有手術小鼠縫合消毒後每隻肌肉注射抗生素 (5000U/隻),皮下注射止痛藥 (2mg/kg),連續注射3天。卵巢切除65天後,所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,脫去右側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,右側膝關節彎曲90度,找到精確的注射部位,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,應該感覺不到任何阻力,模型組小鼠右側關節腔內注射5μg/6μL II型膠原酶生理鹽水溶液,假手術組小鼠右側關節腔內注射6μL生理鹽水 (參考文獻36及37)。注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈。左側膝關節不做注射處理。膠原酶注射7天後,所有小鼠稱重,模型組小鼠按照體重隨機分為兩組,給溶媒對照組7隻和給纖溶酶原組8隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10% EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌。然後石蠟包埋,5 μm切片行Safranin O染色。切片在100倍光學顯微鏡下觀察拍照,並用Image-Pro 軟體處理收集資料。
結果顯示,假手術組 (圖8A)小鼠膝關節處股骨表面有少量的軟骨 (箭頭標識),給溶媒對照組 (圖8B)股骨表面軟骨量與假手術組無明顯差別,而給纖溶酶原組 (圖8C)股骨表面軟骨量明顯多於給溶媒對照組和假手術組,且平均光密度定量分析結果統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖8D)。結果表明纖溶酶原能夠促進骨關節炎模型小鼠股骨表面軟骨再生。實施例 9 纖溶酶原減輕 MIA 骨關節炎模型大鼠關節炎疼痛
取SD大鼠21隻,體重約200g~250g,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組5隻,模型組16隻。所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (50mg/kg)麻醉,模型組大鼠脫去左、右兩側膝關節處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,膝關節彎曲90度,找到精確的注射部位,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。 用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱, 應該感覺不到任何阻力,雙側關節腔內分別注射MIA生理鹽水溶液2 mg/50 μL;假手術組左、右兩側關節腔內注射50μL生理鹽水。注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈 (參考文獻38)。MIA溶液配製:MIA粉末(Sigma, 57858-5G)溶解於生理鹽水中,濃度40mg/mL,0.22μm濾膜過濾,現用現配。MIA 注射3天後,模型組大鼠進行疼痛測試,根據測試結果隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各8隻,並開始給藥,記為第1天。給溶媒對照組每隻大鼠每天尾靜脈注射0.7mL溶媒 (10mM檸檬酸鈉緩衝液,2%鹽酸精胺酸,3%甘露醇,PH7.4),給纖溶酶原組大鼠按照7mg/0.7mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,連續給藥7天,給藥期間注意觀察動物狀態。第8天左右腿進行疼痛測試 (參考文獻38)。
結果顯示,假手術組大鼠疼痛閾值相對較高;給溶媒對照組大鼠左右腿疼痛閾值均明顯降低,明顯低於假手術組;給纖溶酶原組大鼠左右腿疼痛閾值明顯升高,與給溶媒對照組相比,左腿統計差異接近顯著 (P=0.08),右腿統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖9)。結果表明纖溶酶原能夠明顯減輕骨性關節炎疼痛。實施例 10 纖溶酶原減輕骨關節炎模型小鼠關節炎疼痛
取7周齡C57雌性小鼠19隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組3隻,模型組16隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒,切開皮膚、背部肌肉和腹膜,以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外,分離脂肪團,便可見卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮,然後摘除卵巢。假手術組小鼠麻醉後隻切開皮膚、背部肌肉和腹膜,不摘除卵巢。所有手術小鼠縫合消毒後肌肉注射抗生素 (5000U/隻),皮下注射止痛藥 (2mg/kg),連續注射3天。卵巢切除65天後,所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,脫去右側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,右側膝關節彎曲90度,找到精確的注射部位,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,應該感覺不到任何阻力,模型組小鼠右側關節腔內注射5μg/6μL II型膠原酶生理鹽水溶液,假手術組小鼠右側關節腔內注射6μL生理鹽水 (參考文獻36及37)。注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈。左側膝關節不做注射處理。膠原酶注射7天後,所有小鼠稱重,模型組小鼠按照體重隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各8隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。第29天右腿進行疼痛測試 (參考文獻34)。
結果顯示,假手術組小鼠疼痛閾值相對較高;給溶媒對照組小鼠疼痛閾值明顯降低,明顯低於假手術組小鼠;給纖溶酶原組小鼠疼痛閾值明顯升高,明顯高於給溶媒對照組小鼠,且統計差異接近顯著 (P=0.09) (圖10)。該結果表明纖溶酶原能夠減輕骨關節炎疼痛。實施例 11 纖溶酶原促進骨關節炎模型小鼠軟骨再生
取7周齡C57雌性小鼠19隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組3隻,模型組16隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒,切開皮膚、背部肌肉和腹膜,以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外,分離脂肪團,便可見卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮,然後摘除卵巢。假手術組小鼠麻醉後隻切開皮膚、背部肌肉和腹膜,不摘除卵巢。所有手術小鼠縫合消毒後肌肉注射抗生素 (5000U/隻),皮下注射止痛藥 (2mg/kg),連續注射3天。卵巢切除65天後,所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,脫去右側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,右側膝關節彎曲90度,找到精確的注射部位,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,應該感覺不到任何阻力,模型組小鼠右側關節腔內注射5μg/6μL II型膠原酶生理鹽水溶液,假手術組小鼠右側關節腔內注射6μL生理鹽水 (參考文獻36及37)。注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈。左側膝關節不做注射處理。膠原酶注射7天後,所有小鼠稱重,模型組小鼠按照體重隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各8隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。第29天犧牲小鼠取材兩側膝關節於PLP固定液中固定,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌。然後石蠟包埋,5μm切片行Safranin O染色。切片在100倍光學顯微鏡下觀察拍照,並用Image-Pro 軟體處理收集資料。
結果顯示,假手術組 (圖11A,D)左側膝關節股骨和脛骨表面存在一定量的關節軟骨 (箭頭標識),給溶媒對照組 (圖11B,E)脛骨和股骨表面軟骨量與假手術組差別不明顯, 給纖溶酶原組 (圖11C,F)軟骨量明顯多於給溶媒對照組和假手術組。說明纖溶酶原可促進骨關節炎模型小鼠關節軟骨再生。實施例 12 纖溶酶原抑制骨關節炎模型小鼠骨吸收
取7周齡C57雌性小鼠19隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組3隻,模型組16隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒,切開皮膚、背部肌肉和腹膜,以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外,分離脂肪團,便可見卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮,然後摘除卵巢。假手術組小鼠麻醉後隻切開皮膚、背部肌肉和腹膜,不摘除卵巢。所有手術小鼠縫合消毒後肌肉注射抗生素 (5000U/隻),皮下注射止痛藥 (2mg/kg),連續注射3天。卵巢切除65天後,所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,脫去右側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,右側膝關節彎曲90度,找到精確的注射部位,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,應該感覺不到任何阻力,模型組小鼠右側關節腔內注射5μg/6μL II型膠原酶生理鹽水溶液,假手術組小鼠右側關節腔內注射6μL生理鹽水 (參考文獻36及37)。注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈。左側膝關節不做注射處理。膠原酶注射7天後,所有小鼠稱重,模型組小鼠按照體重隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各8隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,切片5μm,脫蠟複水,進行酸性磷酸酶 (TRAP)染色。
酸性磷酸酶 (TRAP)為破骨細胞的特異性標誌酶,破骨細胞是骨吸收的主要功能細胞。結果顯示,假手術組 (圖12A)膝關節存在一定量的酸性磷酸酶 (箭頭標識);給溶媒對照組 (圖12B)膝關節酸性磷酸酶增多,明顯多於假手術組;給纖溶酶原組 (圖12C)膝關節酸性磷酸酶明顯少於給溶媒對照組,且統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖12D)。該結果表明纖溶酶原可減少骨關節炎膝關節酸性磷酸酶,降低破骨細胞活性,抑制骨吸收。實施例 13 纖溶酶原促進 MIA 骨關節炎膝關節脛骨端 Sox 9 陽性幹細胞數量增加
取8-10周C57雄性小鼠25隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組5隻,模型組20隻。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉後模型組小鼠脫去左側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,左側膝關節彎曲90度,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,關節腔內注射MIA生理鹽水溶液0.1mg/10μL;假手術組左側關節腔注射10μL生理鹽水,注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈 (參考文獻34)。右側膝關節不處理。關節腔內MIA注射 3天後,模型組小鼠進行疼痛測試,根據測試結果小鼠隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各10隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。MIA溶液配製:MIA粉末 (Sigma, 57858-5G)溶解於生理鹽水中,濃度為10mg/mL,然後0.22μm濾膜過濾,現用現配。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,然後石蠟包埋。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織,以3%雙氧水孵育15分鐘,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。5%的正常羊血清液 (Vector laboratories, Inc., USA)封閉30分鐘;時間到後,棄除羊血清液,滴加兔源抗Sox 9抗體 (Abcam,ab185966) 4°C孵育過夜,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體 (Abcam) (二抗)室溫孵育1小時,0.01M PBS洗2次,每次5分鐘。按DAB試劑盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)顯色,水洗3次後蘇木素複染30秒,流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水,二甲苯透明並中性樹膠封片,切片在100(A-C)和400(D-F)倍光學顯微鏡下觀察拍照,並用Image- Pro 軟體處理收集資料。
Sox 9 是軟骨發育形成過程中的關鍵轉錄因子,決定間充質幹細胞的聚集和向軟骨細胞分化,對軟骨的發育成熟及損傷修復等過程起著重要的調節作用 (參考文獻39)。
結果顯示,假手術組 (圖13A,D)膝關節脛骨存在一定量的Sox 9 陽性幹細胞 (箭頭標識),給溶媒對照組 (圖13B,E)膝關節脛骨Sox 9 陽性幹細胞數量明顯減少,給纖溶酶原組 (圖13C,F)膝關節脛骨Sox 9 陽性幹細胞數量明顯多於給溶媒對照組。該結果表明纖溶酶原可促進骨關節炎膝關節脛骨端Sox 9 陽性幹細胞數量增加,修復骨關節炎對膝關節的損傷。實施例 14 纖溶酶原改善 MIA 骨關節炎模型小鼠膝關節滑膜炎症
取8-10周C57雄性小鼠25隻,稱重,按體重隨機分為兩組,假手術組5隻,模型組20隻。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉後模型組小鼠脫去左側膝蓋處毛髮,70%的酒精以及碘酊消毒,左側膝關節彎曲90度,沿著膝蓋水準運行注射器的針 (以免刺穿皮膚),直到發現髕骨下方的間隙。用輕微的壓力標記該區域,然後垂直提起針頭和注射器,將針頭插入標記區域,穿過垂直於脛骨的髕腱,關節腔內注射MIA生理鹽水溶液0.1mg/10μL;假手術組左側關節腔注射10μL生理鹽水,注射後,按摩膝蓋,以確保均勻分佈 (參考文獻34)。右側膝關節不處理。關節腔內MIA注射 3天後,模型組小鼠進行疼痛測試,根據測試結果小鼠隨機分為兩組,給溶媒對照組和給纖溶酶原組,每組各10隻,並開始給藥,記為給藥第1天,給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射人纖溶酶原,給溶媒對照組小鼠每天尾靜脈注射同體積溶媒PBS緩衝液,連續注射28天。假手術組小鼠不做給藥處理。MIA溶液配製:MIA粉末 (Sigma, 57858-5G)溶解於生理鹽水中,濃度為10mg/mL,然後0.22μm濾膜過濾,現用現配。第29天犧牲小鼠取材左側膝關節於PLP固定液中固定,然後10%EDTA中脫鈣三周,梯度蔗糖溶液洗滌,然後石蠟包埋 (保留膝關節周邊的肌肉)。組織切片厚度為5μm,切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色 (H&E染色),1%鹽酸酒精分化,氨水返藍,並酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,切片在400倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示,假手術組 (圖14A)膝關節滑膜未見明顯的炎症細胞浸潤,給溶媒對照組 (圖14B)膝關節滑膜可見明顯的炎症細胞浸潤(箭頭標識),給纖溶酶原組 (圖14C)膝關節滑膜炎症細胞浸潤明顯少於給溶媒對照組。該結果表明纖溶酶原可改善骨關節炎膝關節滑膜炎症。
以上所有實施例中使用的 (人)纖溶酶原來自人捐贈者血漿,基於文獻 (參考文獻40-42)所描述的方法並進行工藝優化,從人血漿中純化所得。纖溶酶原單體的純度>95%。
圖1A-D係0.5μg/kg維生素D衰老模型小鼠膝關節Safranin O染色結果。A為空白對照組,B為給溶媒PBS對照組,C為給纖溶酶原組,D為定量分析結果。結果顯示, 給纖溶酶原組膝關節軟骨 (箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組,統計差異顯著 (*表示P<0.05),且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組膝關節軟骨量更加接近空白對照小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著減少維生素D衰老模型小鼠膝關節軟骨丟失。 圖2A-E係給予纖溶酶原14天二型膠原酶誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節Safranin O染色評分結果。A、C為給溶媒PBS對照組,B、D為給纖溶酶原組,E為定量分析結果。結果顯示,給纖溶酶原組膝關節病理評分明顯低於給溶媒PBS對照組,且統計差異極其顯著 (**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能夠減輕二型膠原酶誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節的損傷。 圖3A-D係給予纖溶酶原14天二型膠原酶誘導的骨關節炎模型Plg-/-小鼠膝關節Safranin O染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS對照組,B、D為給纖溶酶原組。結果顯示,給溶媒PBS對照組軟骨組織 (細箭頭標識)結構排列紊亂,細胞數目明顯減少,Safranin O著色明顯減少,骨小梁(粗箭頭標識)變細、斷裂;給纖溶酶原組相對於給溶媒PBS對照組,軟骨組織結構相對整齊,軟骨處細胞數目相對較多,Safranin O著色範圍相對較廣。說明纖溶酶原能夠減少二型膠原酶誘導的骨關節炎Plg-/-小鼠膝關節的損傷。 圖4係A-B給予纖溶酶原14天韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節Safranin O染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組,B為給纖溶酶原組。結果顯示, 給溶媒PBS對照組軟骨 (三角形標識)丟失嚴重,骨小梁 (箭頭標識)變細,斷裂,出現較大面積的無骨小梁骨髓腔;給纖溶酶原組,較之於PBS對照組,骨小梁連續性較好,沒有較嚴重的斷裂,沒有較大面積的無骨小梁區域,軟骨組織相對較多。說明纖溶酶原能夠改善韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節組織結構狀況。 圖5A-E係給予纖溶酶原14天韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶染色果。A、C為給溶媒PBS對照組,B、D為給纖溶酶原組,E為定量分析結果。結果顯示,給纖溶酶原組小鼠膝關節軟骨表面 (細箭頭標識)和生長板 (粗箭頭標識)鹼性磷酸酶著色均多於給溶媒PBS對照組,且統計差異顯著 (*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著促進韌帶切斷誘導的骨關節炎模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶活性的增加,即纖溶酶原促使膝關節成骨細胞活性明顯增加。 圖6A-D係給予纖溶酶原28天MIA骨關節炎模型小鼠膝關節II型膠原免疫組化染色結果。A為假手術組,B為給溶媒對照組,C為給纖溶酶原組,D為定量分析結果。 結果顯示,假手術組小鼠膝關節有一定量的II型膠原 (箭頭標識),給溶媒對照組膝關節II型膠原量與假手術組無明顯差別,而給纖溶酶原組膝關節II型膠原量明顯多於給溶媒對照組和假手術組,且平均光密度定量分析結果統計差異顯著 (*表示P<0.05)。結果表明纖溶酶原能夠促進骨關節炎模型小鼠膝關節軟骨再生。 圖7A-D係給予纖溶酶原28天MIA骨關節炎模型小鼠膝關節Safranin O染色代表性圖片。A為假手術組,B為給溶媒對照組,C為給纖溶酶原組,D為病理評分結果。結果顯示,假手術組小鼠膝關節有一定量的軟骨存在 (箭頭標識);給溶媒對照組膝關節軟骨量明顯減少並且病理學評分明顯增加,說明MIA成功誘導骨關節炎;給纖溶酶原組膝關節軟骨量明顯多於給溶媒對照組,病理學評分也明顯低於給溶媒對照組,且統計學差異顯著 (*表示P<0.05)。該結果表明纖溶酶原能夠促進軟骨再生,改善骨關節炎損傷。 圖8A-D係給予纖溶酶原28天骨關節炎模型小鼠左側膝關節股骨表面Safranin O染色結果。A為假手術組,B為給溶媒對照組,C為給纖溶酶原組,D為平均光密度定量分析結果。結果顯示,假手術組小鼠膝關節處股骨表面有少量的軟骨 (箭頭標識),給溶媒對照組股骨表面軟骨量與假手術組無明顯差別,而給纖溶酶原組股骨表面軟骨量明顯多於給溶媒對照組和假手術組,且平均光密度定量分析結果統計差異顯著 (*表示P<0.05)。結果表明纖溶酶原能夠促進骨關節炎模型小鼠股骨表面軟骨再生。 圖9係給予纖溶酶原7天MIA骨關節炎模型大鼠疼痛檢測結果。結果顯示,假手術組大鼠具有較高的疼痛閾值;給溶媒對照組大鼠左右腿疼痛閾值均明顯降低,明顯低於假手術組;給纖溶酶原組大鼠左右腿疼痛閾值明顯升高,與給溶媒對照組相比,左腿統計差異接近顯著 (P=0.08),右腿統計差異顯著 (*表示P<0.05)。結果表明纖溶酶原能夠明顯減輕骨性關節炎疼痛。 圖10係給予纖溶酶原28天骨關節炎模型小鼠疼痛檢測結果。結果顯示,假手術組小鼠疼痛閾值相對較高;給溶媒對照組小鼠疼痛閾值明顯降低,明顯低於假手術組小鼠;給纖溶酶原組小鼠疼痛閾值明顯升高,明顯高於給溶媒對照組小鼠,且統計差異接近顯著 (P=0.09)。該結果表明纖溶酶原能夠減輕骨關節炎疼痛。 圖11A-F係給予纖溶酶原28天骨關節炎模型小鼠左側膝關節Safranin O染色結果。結果顯示,假手術組左側膝關節股骨和脛骨表面存在一定量的關節軟骨 (箭頭標識),給溶媒對照組脛骨和股骨表面軟骨量與假手術組差別不明顯, 給纖溶酶原組軟骨量明顯多於給溶媒對照組和假手術組。說明纖溶酶原可促進骨關節炎模型小鼠關節軟骨再生。 圖12A-D係顯示纖溶酶原抑制骨關節炎模型小鼠骨吸收。結果顯示,假手術組 (圖12A)膝關節存在一定量的酸性磷酸酶 (箭頭標識);給溶媒對照組 (圖12B)膝關節酸性磷酸酶增多,明顯多於假手術組;給纖溶酶原組 (圖12C)膝關節酸性磷酸酶明顯少於給溶媒對照組,且統計差異顯著 (*表示P<0.05) (圖12D)。該結果表明纖溶酶原可減少骨關節炎膝關節酸性磷酸酶,降低破骨細胞活性,抑制骨吸收。 圖13A-F係顯示纖溶酶原促進MIA骨關節炎膝關節脛骨端Sox 9 陽性幹細胞數量增加。結果顯示,假手術組 (圖13A,D)膝關節脛骨存在一定量的Sox 9 陽性幹細胞 (箭頭標識),給溶媒對照組 (圖13B,E)膝關節脛骨Sox 9 陽性幹細胞數量明顯減少,給纖溶酶原組 (圖13C,F)膝關節脛骨Sox 9 陽性幹細胞數量明顯多於給溶媒對照組。該結果表明纖溶酶原可促進骨關節炎膝關節脛骨端Sox 9 陽性幹細胞數量增加,修復骨關節炎對膝關節的損傷。 圖14A-C係顯示纖溶酶原改善MIA骨關節炎模型小鼠膝關節滑膜炎症。結果顯示,假手術組 (圖14A)膝關節滑膜未見明顯的炎症細胞浸潤,給溶媒對照組 (圖14B)膝關節滑膜可見明顯的炎症細胞浸潤 (箭頭標識),給纖溶酶原組 (圖14C)膝關節滑膜炎症細胞浸潤明顯少於給溶媒對照組。該結果表明纖溶酶原可改善骨關節炎膝關節滑膜炎症。
<110> 大陸商深圳瑞健生命科學研究院有限公司
<120> 一種預防或治療骨關節炎的方法及藥物
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2376
<212> DNA
<213> 不含有訊號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG,Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列
<400> 1
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Claims (12)

  1. 一種纖溶酶原用於製備治療骨關節炎之藥物的用途,其中所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途,其中所述纖溶酶原增加關節軟骨的量及/或促進關節軟骨損傷修復。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用途,其中所述纖溶酶原改善關節滑膜炎症狀況。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用途,其中所述纖溶酶原促進關節的軟骨下骨骨重建。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的用途,其中所述纖溶酶原改善關節的炎症狀況、疼痛及/或改善關節功能。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的用途,其中所述纖溶酶原減輕關節腫脹和疼痛。
  7. 一種纖溶酶原用於製備促進骨關節炎受試者關節軟骨再生之藥物的用途,其中所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
  8. 一種纖溶酶原用於製備促進受試者關節損傷修復之藥物的用途,其中所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的用途,其中所述纖溶酶原促進關節軟骨再生和/或軟骨下骨骨重建。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的用途,其中所述受試者為骨關節炎受試者。
  11. 如申請專利範圍第8項所述的用途,其中所述纖溶酶原改善關節組織的炎症狀況和/或減輕關節疼痛。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的用途,其中所述纖溶酶原為天然的或重組製備的人全長纖溶酶原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021190563A1 (zh) * 2020-03-24 2021-09-30 泰伦基国际有限公司 一种治疗亨廷顿病的方法和药物
CA3176926A1 (en) * 2020-03-24 2021-09-30 Talengen International Limited Method and drug for treating alzheimer's disease
WO2021190561A1 (zh) * 2020-03-24 2021-09-30 泰伦基国际有限公司 一种治疗帕金森病的方法和药物
EP4122489A4 (en) * 2020-03-24 2023-04-12 Talengen International Limited METHOD AND MEDICINE FOR PROMOTING DEGRADATION OF A MISFOLDED PROTEIN AND OF AN AGGREGATE THEREOF
KR20230052929A (ko) * 2020-08-20 2023-04-20 탈렌젠 인터내셔널 리미티드 종양 치료 방법 및 약물
CN116064767B (zh) * 2022-08-23 2024-06-04 南京医科大学 一种与骨关节炎相关的LncRNA标志物及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4214215A1 (de) * 1992-04-30 1993-11-04 Behringwerke Ag Verwendung von inhibitoren von plasminogenaktivatoren zur behandlung von entzuendungen
CA2278823A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Joe M. Mccord Plasminogen activator as an anti-inflammatory agent
US6475784B1 (en) * 1997-11-14 2002-11-05 Valentis, Inc. Inhibition of angiogenesis by delivery of nucleic acids encoding anti-angiogenic polypeptides
EP1096945A4 (en) * 1998-07-14 2003-01-02 Bristol Myers Squibb Co ANGIOSTATIN FRAGMENTS BINDING LYSINE
JP4740531B2 (ja) * 2003-09-30 2011-08-03 雪印乳業株式会社 骨吸収抑制剤
JP5188523B2 (ja) * 2010-03-03 2013-04-24 雪印メグミルク株式会社 骨形成促進及び骨吸収抑制剤
CN105664145A (zh) * 2016-01-29 2016-06-15 湘潭大学 一种用于抗炎镇痛的药物组合物及其应用

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