TWI749381B

TWI749381B - 蛋白質酪胺酸-酪胺酸類似物及其使用方法

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Publication number: TWI749381B
Application number: TW108138383A
Authority: TW
Inventors: 丹尼爾安東尼布里埃; 丹尼爾克里斯多夫羅佩斯; 亞維納許穆匹迪
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2021-12-11
Also published as: BR112021006782A2; TW202208410A; AU2022231763B2; CL2021001073A1; CR20210192A; AU2019371232B2; KR102667979B1; KR20240093737A; JP2023082013A; EP3873924A1; TW202033544A; PH12021550964A1; JP2022506070A; PE20211466A1; SA521421873B1; ECSP21030933A; US20240209055A1; CN112888705A; WO2020092191A1; US20200140514A1

Abstract

本發明揭示PYY類似物，其包含與天然人類PYY相比增加半衰期之修飾，以及增加對NPY2受體之效力及選擇性之另外修飾。亦揭示醫藥組合物，其包含本文所述的一或多種PYY類似物在醫藥上可接受之載劑中。亦揭示製造及使用該PYY類似物之方法，尤其用於治療肥胖及與肥胖有關之疾病及病症(諸如第II型糖尿病)。

Description

蛋白質酪胺酸-酪胺酸類似物及其使用方法

本揭示內容大體上係關於生物學及醫學，及更特定言之其係關於可結合神經肽Y(NPY)受體(諸如NPY2受體)之肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物以及包含其之組合物及其在治療肥胖及與肥胖有關之疾病及病症(諸如第II型糖尿病(T2DM))中之治療用途。

PYY係胰臟多肽(PP)家族之成員並參與調節餐後的食物攝入及能量消耗(參見，Tatemoto (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 2514-2518)。PYY由胃腸道之L細胞分泌並具有兩種主要內源性形式-PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)。禁食期間PYY_1-36 高於PYY_3-36 ，而進食後PYY_3-36 高於PYY_1-36 。二肽基肽酶-IV(DPP-IV)水解PYY_1-36 之Pro² -Ile³ 鍵以產生PYY_3-36 ，其對NPY2受體比對PYY_1-36 更具選擇性。

血漿PYY_3-36 濃度通常在食物攝入後15分鐘內增加，在60-90分鐘內達到峰值，並在長達6小時保持升高狀態，然後返回至基線(參見Adrian等人(1985) Gastroenterology 89: 1070-1077；及De Silva & Bloom (2012) Gut Liver 6:10-20)。如此，咸信PYY_3-36 經由其直接中樞作用亦及經由其對腸蠕動之效應(亦即，其厭食效應)影響食慾。另外，咸信PYY_3-36 介導胰島素敏感性以藉此幫助降低血液葡萄糖(亦即，其敏化效應)。

有鑑於PYY_3-36 之厭食效應，特別是治療肥胖及其相關疾病及病症，包括T2DM及心血管疾病，PYY_3-36 已經研究為體重調節之潛在治療劑(參見，例如，國際專利申請公開案第2002/47712號；及Schwartz & Morton (2002) Nature 418:595-597)。

不幸地，由於蛋白酶及其他清除機制，外源投與的PYY_3-36 具有短的半衰期(例如，約10-15分鐘)(參見，Lluis等人(1989) Rev. Esp. Fisiol. 45: 377-384；及Torang等人(2016) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310: R866-R874)，此在將其用作治療劑時提出挑戰。由於此種短的半衰期，PYY_3-36 應每天至少一次投與以發揮治療效應，此對於有此需要的個體係不方便的。因此，已努力增加PYY_3-36 的半衰期及/或增加其NPY2受體選擇性。例如，Rubinstein等人描述具有9-茀基甲氧基-羰基(Fmoc)或2-磺基-9-茀基-甲氧基羰基(FMS)基團以增加半衰期之PYY類似物(參見，國際專利申請公開案第WO 2004/089279號)。此外，DeCarr等人描述具有胺基末端連接的PEG部分以增加半衰期之PYY類似物(參見，DeCarr等人(2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17: 1916-1919；亦可參見，Ortiz等人(2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 323: 692-700)。此外，Kofoed等人描述具有白蛋白結合側鏈、接近PYY的切割位點之至少一個經修飾之基團(例如所述胺基酸殘基之N-甲基胺基酸類似物)、N-甘胺酸、及/或精胺酸模擬物以增加半衰期之PYY類似物(參見，國際專利申請公開案第WO 2011/033068號)。

儘管對PYY_3-36 在代謝中之作用的理解顯著提高，但仍需要另外PYY類似物，尤其是在NPY2受體具有增強的效價及選擇性之PYY類似物。

如上所述，需要用於治療用途之另外PYY類似物。為滿足該需求，本揭示內容首先描述PYY類似物，其包括以下之基礎胺基酸序列(相對於天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)之編號)：³ PKPEX₇ PX₉ X₁₀ DASPEEX₁₇ X₁₈ RYYX₂₂ X₂₃ LRHYLNX₃₀ LTRQRY³⁶ (式I)，其中X₇ 為具有可用於共軛之官能基且該官能基係共軛至C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸之任何胺基酸，X₉ 為E或G，X₁₀ 為E或K，X₁₇ 為L或W，X₁₈ 為N或Q，X₂₂ 為A或I，X₂₃ 為E、D或S，及X₃₀ 為E或W(SEQ ID NO:3)，且其中羧基端(C端)胺基酸視需要地經醯胺化。

在某些情況下，具有可用於位置X₇ 之共軛之官能基之胺基酸可係C、D、E、K或Q。在特定情況下，具有可用於位置X₇ 之共軛之官能基之胺基酸係K，且胺基酸序列可係以下中之一者：

在一些情況下，C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸係共軛至具有可用於經由連接子共軛之官能基之胺基酸。在某些情況下，C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸具有-CO-(CH₂ )_a -CO₂ H之結構，其中_a 係介於16至22之間的整數。在特定情況下，脂肪酸係C₁₈ 二酸或C₂₀ 二酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸、花生酸或二十烷酸，尤其是飽和C₁₈ 二酸或C₂₀ 二酸。同樣地，且在一些情況下，連接子可係[2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基)]-乙酸(AEEA)、胺基己酸(Ahx)、麩胺酸(E)、γ-麩胺酸(γE)或其組合之一或多個單元。

在特定情況下，PYY類似物可係以下中之一者：

在一些情況下，本文中PYY類似物之基礎結構可進一步包含天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)之兩個胺基端(N端)胺基酸，其於隨後可經體內加工為PYY_3-36 類似物(亦即，SEQ ID NO:1之N端「YP」殘基可從PYY類似物之任何一者體內切割)。

在一些情況下，PYY類似物具有大於-2之電荷，尤其是-3或-4。

在一些情況下，PYY類似物在人類NPY2受體之結合親和力比人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之結合親和力大，諸如大約2倍至大約10倍，特別是大約2倍至大約3倍。

在一些情況下，PYY類似物之半衰期比人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之半衰期長，諸如長約5小時至約24小時，尤其是約12小時。

第二，描述醫藥組合物，其包含本文之至少一種PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽(例如，三氟乙酸鹽、乙酸鹽或鹽酸鹽)及醫藥上可接受之載劑。在一些情況下，醫藥組合物可進一步包含載劑、稀釋劑及/或賦形劑。

此外，醫藥組合物可包含另一治療劑，諸如(例如)其他抗糖尿病藥或減肥藥，尤其是腸促胰島素。在一些情況下，腸促胰島素可係胰高血糖素(GCG)或GCG類似物。在其他情況下，腸促胰島素可係胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、GLP-1(7-36)_醯胺或GLP-1類似物。在其他情況下，腸促胰島素可係胃抑制肽(GIP)或GIP類似物。在其他情況下，腸促胰島素可係雙重受體促效劑，諸如調酸素(OXM)或OXM類似物、GLP-1/GCG或GIP/GLP-1。在其他情況下，腸促胰島素可係具有三重受體活性之腸促胰島素類似物(亦即，在GIP、GLP-1及GCG受體中之各者具有活性之腸促胰島素類似物)。在其他情況下，該另外治療劑可係DPP-IV抑制劑。

第三，描述使用本文之PYY類似物，特別是使用PYY類似物以治療肥胖及與肥胖有關之疾病及病症(例如T2DM)之方法。該方法包括至少對有此需要的個體投與有效量之如本文所述之PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽之步驟。

在一些情況下，PYY類似物可經皮下(SQ)投與至個體。同樣地，且在一些情況下，PYY類似物可係每天、每隔一天、每週三次、每週兩次、每週一次(亦即，每週)、每兩週(亦即，每隔一週)、或每月投與的。在某些情況下，PYY類似物可係每隔一天SQ、每週三次SQ、每週兩次SQ、每週一次SQ、每隔一週SQ、或每月一次SQ投與的。在特定情況下，PYY類似物係每週一次(QW)SQ投與的。

或者，PYY類似物可經口投與至個體。如上述，PYY類似物可係每天、每隔一天、每週三次、每週兩次、每週一次(亦即，每週)、每兩週(亦即，每隔一週)或每月投與的。在某些情況下，PYY類似物可係每隔一天經口、每週三次經口、每週兩次經口、每週一次經口、每隔一週經口或每月一次經口投與的。在特定情況下，PYY類似物係每週一次經口投與的。

該等方法亦可包括投與至少一種PYY類似物與有效量之另一治療劑(諸如DPP-IV抑制劑或腸促胰島素(例如，GCG或GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺或GLP-1類似物、GIP或GIP類似物、OXM或OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素))之組合。DPP-IV抑制劑或腸促胰島素可與PYY類似物同時地、分開地或連續地投與。

在一些情況下，DPP-IV抑制劑或腸促胰島素可係以與PYY類似物相同的頻率(亦即，每隔一天、每週兩次、或甚至每週)投與的。在其他情況下，DPP-IV抑制劑或腸促胰島素係以不同於PYY類似物的頻率投與的。在其他情況下，DPP-IV抑制劑或腸促胰島素係QW投與的。又在其他情況下，PYY類似物係SQ投與的，及DPP-IV抑制劑或腸促胰島素可係經口投與的。

在一些情況下，個體係肥胖或過重的。在其他情況下，個體係罹患糖尿病(PwD)，尤其是T2DM之人。在某些情況下，個體係肥胖伴T2DM或過重伴T2DM。

該等方法亦可包括諸如測量或獲得個體的體重及/或血液葡萄糖及/或血紅蛋白A1c(HbA1c)並將此等獲得的值與一或多個基線值或先前獲得的值進行比較以評估治療有效性之步驟。

該等方法亦可與飲食及運動組合及/或可與除彼等上述者之外的另外治療劑組合。

第四，描述本文之PYY類似物在治療肥胖及與肥胖有關之疾病及病症(諸如T2DM)中之用途，可視需要將其與DPP-IV抑制劑及/或腸促胰島素(諸如GCG或GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺或GLP-1類似物、GIP或GIP類似物、OXM或OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受體活性之腸促胰島素)同時地、分開地或連續地(亦即，以組合方式)投與。

第五，描述本文之PYY類似物之用途，其用於製造用於治療肥胖及與肥胖相關之疾病及病症(諸如T2DM)的藥物，其中該藥物可視需要進一步包含DPP-IV抑制劑及/或降血糖素(諸如GCG或GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺或GLP-1類似物、GIP或GIP類似物、OXM或OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受體活性之腸促胰島素)。

本文PYY類似物之一個優點係其等不僅可促進體重減輕而且可降低葡萄糖。如此，個體(特別是彼等易感或患有T2DM者)可延遲進展至外源胰島素並可維持標靶HbA1c目標。此外，本文之PYY類似物可藉由改善胰島素敏化來增強血糖控制。經組合之GIP/GLP-1及PYY類似物可用於葡萄糖控制(腸促胰島素+潛在胰島素敏化劑)及體重減輕(協同)。特別地，本文之PYY類似物當投與有此需要的個體時可僅導致高達約12%的體重減輕並當投與有此需要的個體時結合另一治療劑(諸如腸促胰島素)可導致高達約25%的體重減輕。

本文之PYY類似物之另一個優點係其等可具有高達約24小時之半衰期，從而允許每週一次投藥。

本文之PYY類似物之另一個優點係其等具有當與天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比時增加之物理化學安定性及相容性、及當與天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比時在具有腸促胰島素之調配物中之增加之相容性。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有與熟習本揭示內容所屬技術者通常所瞭解相同的含義。儘管類似於或等效於彼等本文所述者之任何方法及材料可用於PYY類似物、醫藥組合物及方法之實踐或測試中，但本文描述較佳之方法及材料。

此外，用不定冠詞「一」或「一個」提及要素並不排除存在超過一個要素之可能性，除非上下文明確要求存在一個及僅一個要素。因此，不定冠詞「一」或「一個」通常意指「至少一個」。

本申請案依35 U.S.C. §119(e)主張2018年11月1日申請之美國臨時申請案序號62/754,244及2019年1月17日申請之美國臨時申請案序號62/793,544之權利；其揭示內容係以引用的方式併入本文中。

定義

如本文所用，「約」意指在一個或多個值諸如例如規定的濃度、長度、分子量、pH、序列同一性、時間框、溫度、體積等之統計學上有意義的範圍內。此值或範圍可係在給定值或範圍的一個數量級內，通常在20%之內，更通常在10%之內，且甚至更通常在5%之內。「約」涵蓋的容許變化將取決於研究下的特定系統，並熟習此項技術者可輕易地明瞭。

如本文所用，「胺基酸」意指從化學觀點來看特徵在於存在一或多個胺基及一或多個羧酸基並可包含其他官能基之分子。如此項技術中已知的，存在一組二十個胺基酸，其被指定為標準胺基酸並用作由任何生物產生的大多數肽/蛋白質之構築嵌段。

如本文所用，「具有可用於共軛之官能基之胺基酸」意指具有可藉助於(例如)連接子共軛至脂肪酸之官能基之任何天然或非天然胺基酸。此等官能基之實例包括但不限於炔基、烯基、胺基、疊氮基、溴、羧基、氯、碘及硫醇基。另外，包含此等官能基之天然胺基酸之實例包括C(硫醇)、D(羧基)、E(羧基)、K(胺基)及Q(醯胺)。

如本文所用，「類似物」意指活化靶受體並引起天然促效劑對該受體引起的至少一種體內或體外效應之化合物，諸如合成肽或多肽。

如本文所用，「厭食效應」意指本文之PYY類似物降低食慾導致較低的食物消耗並最終導致體重減輕之能力。厭食效應亦可指本文之PYY類似物增加腸蠕動之能力。

如本文所用，「C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸」意指具有16至22個碳原子之羧酸。適用於本文中之C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸可係飽和單酸或飽和二酸(「二酸」在每個末端具有羧基)。

如本文所用，「AUC」意指曲線下面積。

如本文所用，「有效量」意指本文之一或多種PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽的量、濃度或劑量，該等PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽在單次或多次劑量投與至有此需要的個體後，於診斷或治療下在該個體中提供所需效應(亦即，可能會在個體病狀上產生臨床上可測量之差異，諸如(例如)血液葡萄糖降低、HbA1c降低及/或體重或體脂肪降低)。熟習此項技術者可藉由使用已知技術並藉由觀測在類似情況下獲得的結果來輕易地確定有效量。在確定個體之有效量時，考慮許多因素，包括但不限於哺乳動物之物種、其大小、年齡及一般健康、所涉及的特定疾病或病症、疾病或病症之程度或涉及或嚴重度、個體之反應、所投與之特定PYY類似物、投藥模式、所投與製劑之生體可用率特徵、所選擇之劑量方案、合併用藥之用法、及其他相關情況。

如本文所用，「半數最大有效濃度」或「EC₅₀ 」意指導致50%活化/刺激檢定終點(諸如劑量-反應曲線(例如，cAMP))之化合物濃度。

如本文所用，「與……組合」意指與一或多種另外治療劑同時地、連續地或呈單一組合調配物投與本文之PYY類似物中之至少一者。

如本文所用，「腸促胰島素類似物」意指與GIP、GLP-1、GCG及OXM(尤其是天然人類GIP、GLP-1、GCG及OXM)中之各者具有結構相似性但存在多個差異之肽或多肽。一些腸促胰島素類似物亦具有對GIP、GLP-1及GCG受體中之兩者或甚至每一者之親和力及在GIP、GLP-1及GCG受體中之兩者或甚至每一者之活性(亦即，在(諸如)OXM、GIP/GLP-1或GLP-1/GCG中之兩種受體之促效劑活性、或甚至在所有三種受體之促效劑活性)。

如本文所用，「有此需要的個體」意指具有需要治療或療法之病狀、疾病、病症或症狀(包括(例如)彼等本文所列者)之哺乳動物，諸如人類。特別地，待治療的較佳個體係人類。

如本文所用，「長效」意指本文之PYY類似物之結合親和力及活性比天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及/或天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)持續更長的時間，允許至少以每天一次或甚至每週三次、每週兩次、每週一次或每月之頻率給藥。本文之PYY類似物之時間作用曲線可使用已知的藥物動力學測試方法(諸如彼等描述於以下實例中者)來測量。

如本文所用，「非標準胺基酸」意指可天然存在於細胞中但不參與肽合成之胺基酸。非標準胺基酸可係肽之成分並通常藉由修飾肽中之標準胺基酸(亦即，藉由轉譯後修飾)來產生。非標準胺基酸可包括D-胺基酸，其具有與上述標準胺基酸相反的絕對對掌性。

如本文所用，「肥胖」意指個體之身體質量指數(BMI)為＞30.0 kg/m² 之病狀。大體上可參見，疾病控制及預防中心之「Overweight & Obesity」，網址為cdc.gov/obesity/adult/defining.html；及國家健康研究院之「Definitions & Facts for Adult Overweight & Obesity」，網址為iddk.nih.gov/health-information/weight-management/adult-overweight-obesity/definition-facts。

如本文所用，「與肥胖有關之疾病或病症」意指由肥胖引起/加重之任何疾病或病症，包括但不限於心絞痛、心血管疾病、膽囊炎、膽石症、充血性心力衰竭、血脂異常、脂肪肝疾病、生育力併發症、葡萄糖耐受不良、痛風、高血壓、甲狀腺功能低下、高胰島素血症、胰島素抗性、骨關節炎、多囊卵巢症候群(PCOS)、妊娠併發症、心理病症、睡眠呼吸暫停及其他呼吸系統問題、壓力性尿失禁中風、T2DM、尿酸腎結石(腎結石)、及乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、腎臟癌、前列腺癌及直腸癌。

如本文所用，「過重」意指個體之BMI為約25.0 kg/m² 至＜30 kg/m² 之病狀。參見，同上。

如本文所用，「PYY」意指獲自或衍生自任何物種(諸如哺乳動物物種，尤其是人類)之肽YY。PYY包括天然PYY(亦即，全長)及其變體(亦即，天然PYY之添加、刪除及/或取代)。特定之PYY包括但不限於天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)。

如本文所用，「一種或多種PYY類似物」意指在一或多個NPY受體(諸如NPY2受體)發揮天然PYY之一或多種作用之PYY樣肽或多肽。在一些情況下，與天然PYY，尤其是人類PYY，諸如天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比，本文之PYY類似物可以更高或更低的親和力結合至NPY受體，尤其是人類NPY2受體但證實更長的體內或體外半衰期。如此，本文之PYY類似物係充當NPY2受體促效劑之合成化合物。

如本文所用，「飽和」意指脂肪酸不包含碳-碳雙鍵或三鍵。

如本文所用，「敏化效應」意指本文之PYY類似物增強胰島素之效應並藉此幫助降低血液葡萄糖之能力。

如本文所用，「治療(treating/treat)」意指減輕、抑制、逆轉、減慢或停止現有病狀、疾病、病症或症狀之進展或嚴重度。

某些縮寫定義如下：「ACR」係指尿白蛋白/尿肌酸酐比；「amu」係指原子質量單位；「tBoc」係指第三丁氧基羰基；「cAMP」係指環狀單磷酸腺苷；「DMF」係指二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲基亞碸；「EIA/RIA」係指酵素免疫檢定/放射免疫檢定；「hr」係指小時；「HTRF」係指均勻時間解析螢光；「IV」係指靜脈內；「kDa」係指千道耳頓；「LC-MS」係指液相層析-質譜法；「MS」係指質譜法；「OtBu」係指O-第三丁基；「Pbf」係指NG-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基；「RP-HPLC」係指反相高效液相層析；「SQ」係指皮下；「SEM」係指平均值標準誤差；「TFA」係指三氟乙酸；及「Trt」係指三苯甲基(Trityl)。

PYY類似物

本文之PYY類似物與天然PYY肽具有結構相似性，但存在許多結構差異。例如，當與天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及/或天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比時，本文所述之PYY類似物包括在相對於天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)之編號之位置3、7、9、10、17、18、22、23、30及31中之一者或多者之修飾。在某些情況下，本文之PYY類似物之示例性胺基酸序列包括(相對於天然人類PYY(SEQ ID NO:1)之對應之殘基之特定變化為粗體)：

本文之PYY類似物導致在人類NPY2受體之活性足夠，但在NPY1、NPY4及NPY5受體之活性不足。同樣地，本文之PYY類似物具有與其可開發作為治療性治療有關之有益屬性，包括在水溶液中之改善之溶解度、改善之化學及物理調配物安定性、延伸之藥物動力學特性、及免疫原性之最小化潛力。

在一些情況下，本文之PYY類似物在C端胺基酸經醯胺化以影響安定性。除了本文所述的變化之外，該等類似物可包括一或多種另外胺基酸修飾，然而，其前提條件係該等類似物保持能夠結合至並活化人類NPY2受體之能力。

本文之PYY類似物進一步包括(例如)藉助於連接子共軛至具有可用於共軛之官能基之天然或非天然胺基酸(亦即，「醯化」)之脂肪酸。在一些情況下，具有可用於共軛之官能基之胺基酸可係C、D、E、K及Q。在特定情況下，具有可用於共軛之官能基之胺基酸係K，其中共軛係共軛至K側鏈之ε-胺基。

此處，當與天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)相比時，PYY類似物之醯化係在位置7。如此，脂肪酸可充當白蛋白結合劑以提供更長效之類似物。

相對於脂肪酸，其可藉由直接鍵或藉由連接子化學共軛至可用於共軛之胺基酸之官能基。脂肪酸之長度及組成會影響PYY類似物之半衰期、PYY類似物之體內效價、及PYY類似物之溶解度及安定性。共軛至C₁₆ -C₂₂ 飽和脂肪單酸或二酸，從而得到展示所需半衰期、所需體內效價、及所需溶解度及安定性特徵之PYY類似物。

用於本文中之示例性飽和C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸包括但不限於十六烷酸(亦即，棕櫚酸、C₁₆ 單酸)、十六烷二酸(C₁₆ 二酸)、十七烷酸(亦即，珍珠酸、C₁₇ 單酸)、十七烷二酸(C₁₇ 二酸)、硬脂酸(C₁₈ 單酸)、十八烷二酸(C₁₈ 二酸)、十九酸(亦即，十九烷酸、C₁₉ 單酸)、十九烷二酸(C₁₉ 二酸)、二十烷酸(亦即，花生酸、C₂₀ 單酸)、二十烷二酸(C₂₀ 二酸)、二十一烷酸(亦即，二十一酸、C₂₁ 單酸)、二十一烷二酸(C₂₁ 二酸)、二十二烷酸(亦即，山萮酸、C₂₂ 單酸)、二十二烷二酸(C₂₂ 二酸)及其分支鏈及經取代之衍生物。在某些情況下，C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸可係飽和C₁₈ 單酸、飽和C₁₈ 二酸、飽和C₁₉ 單酸、飽和C₁₉ 二酸、飽和C₂₀ 單酸、飽和C₂₀ 二酸及其分支鏈及經取代之衍生物。在特定情況下，C₁₆ -C₂₂ 脂肪酸可係棕櫚酸或十六烷酸、硬脂酸或十八烷二酸、或花生酸或二十烷酸。

為幫助將脂肪酸共軛至具有可用於共軛之官能基之天然或非天然胺基酸，本文之PYY類似物可包括連接子。在一些情況下，連接子可係AEEA、Ahx、E或γE中之至少一者、以及其組合。

當連接子包含胺基酸時，其可具有一至四個E或γE胺基酸殘基。在一些情況下，連接子可包含一個或兩個E及/或γE胺基酸殘基。例如，連接子可包含一個或兩個E及/或γE胺基酸殘基。在其他情況下，連接子可包含與AEEA或Ahx組合使用的一至四個胺基酸殘基(諸如，例如，E或γE胺基酸)。具體地，連接子可係E及γE胺基酸殘基與AEEA或Ahx之組合。又在其他情況下，連接子可係一個或兩個γE胺基酸殘基及一個或兩個AEEA或Ahx之組合。在特定情況下，連接子可係(AEEA)₂ •γE部分、Ahx•E•γE部分或AEEA•γE部分。

示例性連接子-脂肪酸部分可包括(AEEA)₂ •γE•C₂₀ 二酸、Ahx•E•γE•C₁₈ 二酸或AEEA•γE•C₁₈ 二酸。此等連接子-脂肪酸部分之結構特徵導致與天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)或天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比具有改善的半衰期之類似物。

總之，示例性PYY類似物為：

儘管PYY類似物被描述為具有如天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之三十四個胺基酸，但預期本文之PYY類似物可具有基於天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)之胺基酸序列。亦即，PYY類似物可包括天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)之兩個N端胺基酸(亦即SEQ ID NO:1之位置1及2之「YP」殘基)，其隨後可在投與個體時在體內切割，如內源釋放天然人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)時發生。

本文之PYY類似物之半衰期可使用此項技術中已知的技術(包括例如述於以下實例中者)測量。同樣地，本文之PYY類似物對各種人類NPY受體(例如NPY2R、NPY5R)之各親和力可使用此項技術中已知的用於測量受體結合程度之技術(包括例如描述於以下實例中者)測量，並通常以抑制常數(K_i )值表示。此外，本文之PYY類似物在各受體之活性亦可使用此項技術中已知的技術(包括例如以下所述的體外活性檢定)來測量，並通常以EC₅₀ 值表示。

由於上述修飾，本文之PYY類似物之半衰期比天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之半衰期長。例如，PYY類似物之半衰期可為約5小時至約24小時、約6小時至約23小時、約7小時至約22小時、約8小時至約21小時、約9小時至約20小時、約10小時至約19小時、約11小時至約18小時、約12小時至約17小時、約13小時至約16小時、或甚至約14小時至約15小時。或者，本文之PPY類似物之半衰期可為約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時，或甚至約24小時，尤其約12小時。

同樣地，本文之PYY類似物在NPY2受體之結合親和力比天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之結合親和力大，諸如約2倍至約10倍。或者，本文之PYY類似物之結合親和力可比天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)之結合親和力大達約2倍、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約6倍、大約7倍、大約8倍、大約9倍，或甚至大約10倍，尤其大2倍至大3倍。

醫藥組合物

本文之PYY類似物可經調配成醫藥組合物，其可藉由非經腸途徑(例如，靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下或經皮)投與。此等醫藥組合物及其製備技術係此項技術中熟知的。參見，例如，Remington，「The Science and Practice of Pharmacy」(D.B.Troy編，第21版，Lippincott，Williams & Wilkins，2006)。在特定情況下，PYY類似物係SQ投與的。然而，或者，PYY類似物可經調配成用於其他醫藥上可接受之途徑之形式，諸如，例如，用於經口投與之錠劑或其他固體；定時釋放膠囊；及目前使用的任何其他形式，包括霜劑、乳劑、吸入劑及類似物。

為改善其體內相容性及有效性，本文之PYY類似物可與許多無機及有機酸/鹼中之任何一者反應以形成醫藥上可接受之酸/鹼加成鹽。醫藥上可接受之鹽及用於製備其之常用方法係此項技術中熟知的(參見，例如，Stahl等人，「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use」，第2修正版(Wiley-VCH，2011))。用於本文中之醫藥上可接受之鹽包括鈉鹽、三氟乙酸鹽、鹽酸鹽及乙酸鹽。

本文之PYY類似物可由醫師投與或使用注射液自投與。應明瞭熟習此項技術者可輕易地確定計量尺寸及注射體積量。然而，注射體積量可係≤約2 mL或甚至≤約1 mL，及針式計量器可係≥約27 G或甚至≥約29 G。

本發明亦提供並因此涵蓋可用於合成本文之PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽之新穎中間物及方法。本文之中間物及PYY類似物可藉由此項技術中熟知的多種方法來製備。例如，以下實例中說明使用化學合成之方法。所述的每種途徑之特定合成步驟可以不同方式組合以製備本文所述之PYY類似物。熟習此項技術者輕易地獲得試劑及起始物質。

本文之PYY類似物一般在寬劑量範圍內有效。本文之PYY類似物或包含其之醫藥組合物之示例性劑量可係每千克(kg)個體之毫克(mg)、微克(μg)、奈克(ng)或皮克(pg)數。如此，日劑量可係約1 μg至約100 mg。

此處，醫藥組合物中PYY類似物之有效量可係約0.25 mg至約5.0 mg之劑量。然而，熟習此項技術者應明瞭在一些情況下，有效量(亦即，劑量)可能低於前述範圍的下限並綽綽有餘，而在其他情況下，有效量可係更大的劑量並使用時可能會出現可接受之副作用。

除PYY類似物外，醫藥組合物亦可包含另一治療劑，尤其是其他抗糖尿病藥或減肥藥。在一些情況下，該另外治療劑可係腸促胰島素或DPP-IV抑制劑中之至少一者。示例性腸促胰島素包括但不限於GCG、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GIP、OXM、GCG類似物、GLP-1類似物、GIP類似物、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受體活性之腸促胰島素類似物。

如此，醫藥組合物可包含有效量之SEQ ID NO:9之PYY類似物及腸促胰島素或DPP-IV抑制劑、有效量之SEQ ID NO:10之PYY類似物及腸促胰島素或DPP-IV抑制劑、有效量之SEQ ID NO:11之PYY類似物及腸促胰島素或DPP-IV抑制劑、有效量之SEQ ID NO:12之PYY類似物及腸促胰島素或DPP-IV抑制劑、或有效量之SEQ ID NO:13之PYY類似物及腸促胰島素或DPP-IV抑制劑。

在彼等腸促胰島素係GLP-1或GLP-1類似物之情況下，其可係GLP-1或GLP-1類似物，諸如阿比魯肽(albiglutide)、杜拉魯肽(dulaglutide)、利拉魯肽(liraglutide)、司馬魯肽(semaglutide)或其組合，尤其是杜拉魯肽。

製造及使用PYY類似物之方法

本文之PYY類似物可使用標準手動或自動化固相合成程式，藉由此項技術中已知的任何數目之肽合成方法來合成。自動化肽合成儀係購自例如Applied Biosystems(Foster City，CA)及Protein Technologies Inc. (Tucson，AZ)。用於固相合成之試劑可輕易地從商業來源獲得。固相合成儀可根據製造商的說明書用於阻斷干擾基團，在反應期間保護胺基酸，偶聯，脫保護及封端未反應的胺基酸。

通常，在室溫下，在惰性溶劑(諸如DMF、N-甲基吡咯啶酮或二氯甲烷)中，在存在偶聯劑(諸如二異丙基-碳二亞胺及1-羥基苯并；三唑)下，將N-α-胺甲醯基保護之胺基酸及連接至樹脂之生長肽鏈上之N端胺基酸偶聯。使用諸如TFA或哌啶之試劑從所得的肽樹脂除去N-α-胺甲醯基保護基，並用下一個所需的N-α-保護之胺基酸重複偶聯反應以添加至肽鏈。適宜之胺保護基係此項技術中熟知並描述於例如Green & Wuts，「Protecting Groups in Organic Synthesis」，(John Wiley and Sons，1991)中。最常用的實例包括tBoc及Fmoc。合成完成後，使用酸性條件下之標準處理方法，將肽從固相支撐物切下同時使側鏈脫除保護基。

熟習此項技術者將瞭解用C端羧醯胺來合成本文所述的肽鏈。為合成C端醯胺肽，併入Rink醯胺MBHA或Rink醯胺AM連接子之樹脂通常用於Fmoc合成，而MBHA樹脂一般用於tBoc合成。

粗肽通常在C8或C18管柱上使用RP-HPLC使用0.05%至0.1% TFA中之水-乙腈梯度純化。純度可藉由分析型RP-HPLC驗證。肽之同一性可藉由MS驗證。肽可在寬pH範圍內溶解在水性緩衝液中。

本文之PYY類似物之一種用途係用於降低個體(特別是超重或肥胖並患有T2DM之個體)之血液葡萄糖及/或體重。投與如本文所述的PYY類似物可藉由改善胰島素敏化及體重減輕而導致血糖控制。因此，本文之PYY類似物顯示葡萄糖降低效力及體重減輕之附加益處，使得個體可延遲進展至胰島素並維持標靶HbA1c目標。

該等方法可包括本文所述的步驟，且此等步驟可(但不是必須)以所述的順序進行。然而，亦可思及其他順序。此外，單個或多個步驟可並行及/或在時間上重疊及/或單獨地或以多個重複的步驟來實施。此外，該等方法可包括另外未指定的步驟。

因此，此等方法可包括選擇過重且患有T2DM或易患該疾病之個體。或者，該等方法可包括選擇肥胖且患有T2DM或易患該疾病之個體。

該等方法亦可包括對個體投與有效量之如本文所述的至少一種PYY類似物，其可係呈亦如本文所述的醫藥組合物之形式。在一些情況下，該至少一種PYY類似物/醫藥組合物可包括另一治療劑，諸如腸促胰島素或DPP-IV抑制劑。

該至少一種PYY類似物及可選之腸促胰島素或DPP-IV抑制劑之濃度/劑量/給藥論述於本文其他地方。

關於投藥途徑，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物可根據已知方法(諸如，例如，經口；藉由注射(亦即，經動脈內、經靜脈內、經腹膜內、經腦內、經腦室內、經肌肉內、經眼內、經門靜脈內或經病灶內)；藉由持續釋放系統、或藉由植入裝置)投與。在某些情況下，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物可藉由大量注射或連續地SQ投與。

關於給藥頻率，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物可係每天、每隔一天、每週三次、每週兩次、每週一次(亦即，每週)、每兩週(亦即，每隔一週)或每月投與的。在某些情況下，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物係每隔一天SQ、每週三次SQ、每週兩次SQ、每週一次SQ、每隔一週SQ或每月SQ投與的。在特定情況下，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物係每週一次(QW) SQ投與的。

或者，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物可係經口投與的。如上述，且關於給藥頻率，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物可係每天、每隔一天、每週三次、每週兩次、每週一次(亦即，每週)、每兩週(亦即，每隔一週)或每月投與的。在某些情況下，該至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物係每隔一天經口、每週三次經口、每週兩次經口、每週一次經口或每個一週經口投與的。在特定情況下，PYY類似物係每週一次經口投與的。

關於彼等將至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物與有效量之腸促胰島素組合投與之情況，腸促胰島素可係GCG或GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺或GLP-1類似物、GIP或GIP類似物、OXM或OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或甚至具有三重受體活性之腸促胰島素。GCG、GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GLP-1類似物、GIP、GIP類似物、OXM、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素可與至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物同時地、分開地或連續地投與。

此外，GCG、GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GLP-1類似物、GIP、GIP類似物、OXM、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素可以與至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物相同的頻率(亦即，每隔一天、每週兩次、或甚至每週)投與。或者，GCG、GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GLP-1類似物、GIP、GIP類似物、OXM、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素可以與至少一種PYY類似物或包含其之醫藥組合物不同的頻率投與。在其他情況下，GCG、GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GLP-1類似物、GIP、GIP類似物、OXM、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素係QW投與的。又在其他情況下，PYY類似物係SQ投與的，及GCG、GCG類似物、GLP-1、GLP-1(7-36)_醯胺、GLP-1類似物、GIP、GIP類似物、OXM、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG、或具有三重受體活性之腸促胰島素可係經口投與的。

進一步預期該等方法可與飲食及運動組合及/或可與除彼等上述者之外的另外治療劑組合。實例

出於說明而非限制之目的，提供以下非限制性實例。

實例1：PYY類似物1

併入本發明概念之一種PYY類似物可具有以下結構：

此處，N端係游離的，且C端胺基酸係經醯胺化為C端一級醯胺。位置7之K係藉由與(Ahx-E-(γE)-CO-(CH₂ )₁₆ -COOH共軛至位置7之K側鏈之ε-胺基進行化學修飾。

根據SEQ ID NO:9之PYY類似物係藉由固相肽合成使用Fmoc/t-Bu策略在SymphonyX自動化肽合成儀(PTI Protein Technologies Inc.)上從RAPP AM-Rink醯胺樹脂(H40023聚苯乙烯AM RAM，Rapp polymere GmbH)開始來產生的。在25℃下，使用10當量之胺基酸、0.9 M二異丙基碳二亞胺(DIC)及0.9 M Oxyma(1:1:1莫耳比)於DMF中進行胺基酸偶聯3 h。使用含在DMF中之25%哌啶溶液實施脫除保護基。

如以上所述使肽-樹脂伸長後，使用含在二氯甲烷(DCM)中之30%六氟異丙醇(HFIP)除去存在於位置7之K中之MTT保護基。使用Fmoc/t-Bu策略來延長位置7側鏈之K之另外偶聯/脫除保護基循環涉及Fmoc-6-胺基己酸(Chem-Impex國際目錄號02490)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu(ChemPep目錄號100703)及HOOC-(CH₂ )₁₆ -COOtBu。在所有偶聯中，在25℃下，將3當量之構築嵌段與含在DMF中之PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)一起使用3 h。

在25℃下在含有TFA:三異丙基矽烷:1,2-乙二硫醇:甲醇:硫苯甲醚 80:5:5:5:5 (v/v)之溶液中同時實施自樹脂切割及去除側鏈保護基2小時，接著以冷醚沉澱。藉由RP-HPLC在苯基己基管柱(Phenomenex，Luna；5 μm，100A)上將粗肽純化至＞99%純度(15-20%純化產率)，其中將適宜之流份組併在一起並凍乾。

藉由分析型RP-HPLC檢查PYY類似物之純度，並使用LC/MS證實同一性(觀測值：M+3H⁺ /3 = 1659.2 (+/-0.2)；計算值：M+3H⁺ /3 = 1659.2；觀測值：M+4H⁺ /4 = 1244.6 (+/-0.2)；計算值：M+4H⁺ /4 = 1244.6；觀測值：M+5H⁺ /5 = 995.9 (+/-0.2)；計算值：M+5H⁺ /5 = 995.9)。

實例2：PYY類似物2

併入本發明概念之一種PPY類似物可具有以下結構：

如在實例1中，N端係游離的，且C端胺基酸係經醯胺化為C端一級醯胺。然而，相反地，位置7之K係藉由與([2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)₂ -(γE)-CO-(CH₂ )₁₈ -COOH共軛至K側鏈之ε-胺基進行化學修飾。

根據SEQ ID NO:10之PYY類似物係由固相肽產生，類似於以上在實例1中所述者。因此，於25℃下在MTT切割後使用含在DMF中之3當量之具有PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)之構築嵌段3小時使FMOC-NHPEG₂ -CH₂ COOH及HOOC-(CH₂ )₁₈ -COOtBu連接至側鏈。

藉由分析型RP-HPLC檢查PYY類似物之純度，並使用LC/MS證實同一性(觀測值：M+3H⁺ /3 = 1665.4 (+/-0.2)；計算值：M+3H⁺ /3 = 1665.5；觀測值：M+4H⁺ /4 = 1249.3 (+/-0.2)；計算值M+4H⁺ /4 = 1249.4；觀測值：M+5H⁺ /5 = 999.7 (+/-0.2)；計算值：M+5H⁺ /5 = 999.7)。

實例3：PYY類似物3

併入本發明概念之一種PYY類似物可具有以下結構：

如在實例1中，N端係游離的，且C端胺基酸係經醯胺化為C端一級醯胺。然而，相反地，位置7之K係藉由與([2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)-(γE)-CO-(CH₂ )₁₆ -COOH共軛至K側鏈之ε-胺基進行化學修飾。

根據SEQ ID NO:11之PYY類似物由固相肽產生，類似於以上在實例1中所述者。因此，於25℃下在MTT切割後使用含在DMF中之3當量之具有PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)之構築嵌段3小時使FMOC-NHPEG₂ -CH₂ COOH及HOOC-(CH₂ )₁₆ -COOtBu連接至側鏈。

藉由分析型RP-HPLC檢查PYY類似物之純度，並使用LC/MS證實同一性(觀測值：M+3H⁺ /3 = 1664.7 (+/-0.2)；計算值：M+3H⁺ /3 = 1664.9；觀測值：M+4H⁺ /4 = 1248.9 (+/-0.2)；計算值：M+4H⁺ /4 = 1248.9；觀測值：M+5H⁺ /5 = 999.3 (+/-0.2)；計算值：M+5H⁺ /5 = 999.3)。

實例4：PYY類似物4

併入本發明概念之一種PYY類似物可具有以下結構：

如在實例1中，N端係游離的，且C端胺基酸係經醯胺化為C端一級醯胺。然而，相反地，位置7之K係藉由與([2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)₂ -(γE)-CO-(CH₂ )₁₆ -COOH共軛至K側鏈之ε-胺基進行化學修飾。

根據SEQ ID NO:12之PYY類似物由固相肽產生，類似於以上在實例1中所述者。因此，於25℃下在MTT切割後使用含在DMF中之3當量之具有PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)之構築嵌段3小時使FMOC-NHPEG₂ -CH₂ COOH及HOOC-(CH₂ )₁₆ -COOtBu連接至側鏈。

藉由分析型RP-HPLC檢查PYY類似物之純度，並使用LC/MS證實同一性(觀測值：M+3H⁺ /3 = 1664.8 (+/-0.2)；計算值：M+3H⁺ /3 = 1665.5；觀測值：M+4H⁺ /4 = 1248.9 (+/-0.2)；計算值：M+4H⁺ /4 = 1249.4；觀測值：M+5H⁺ /5 = 998.9 (+/-0.2)；計算值：M+5H⁺ /5 = 995.7)。

實例5：PYY類似物5

併入本發明概念之一種PYY類似物可具有以下結構：

如在實例1中，N端係游離的，且C端胺基酸係經醯胺化為C端一級醯胺。然而，相反地，位置7之K係藉由與([2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)₂ -(γE)₃ -CO-(CH₂ )₁₈ -COOH共軛至K側鏈之ε-胺基進行化學修飾。

根據SEQ ID NO:13之PYY類似物由固相肽產生，類似於以上在實例1中所述者。因此，於25℃下在MTT切割後使用含在DMF中之3當量之具有PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)之構築嵌段3小時使FMOC-NHPEG₂ -CH₂ COOH及HOOC-(CH₂ )₁₈ -COOtBu連接至側鏈。

藉由分析型RP-HPLC檢查PYY類似物之純度，並使用LC/MS證實同一性(觀測值：M+3H⁺ /3 = 1732.2 (+/-0.2)；計算值：M+3H⁺ /3 = 1732.3；觀測值：M+4H⁺ /4 = 1299.4 (+/-0.2)；計算值：M+4H⁺ /4 = 1299.5；觀測值：M+5H⁺ /5 = 1039.7 (+/-0.2)；計算值：M+5H⁺ /5 = 1039.8)。

實例6：PYY類似物之體外活性。

(1) 與hNPY1、hNPY2、hNPY4及hNPY5受體之體外結合

目的：

評估實例1至5之PYY類似物在不存在牛血清白蛋白(BSA)下與以下人類(h)受體之體外結合親和力(K_i )：hNPY1R、hNPY2R、hNPY4R及hNPY5R。閃爍鄰近檢定(SPA)方法中使用利用自過度表現重組受體及相關[¹²⁵ I]標記肽中之各者之細胞系製備的膜之競爭性放射性配體結合檢定。在每個檢定中確定對相關天然肽PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)、PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)及胰臟多肽_1-36 (PP_1-36 ；SEQ ID NO:14)之結合親和力為對照。

方法：

PYY類似物、天然人類PYY_1-36 及對照PYY_3-36 係在Lilly研究實驗室(Indianapolis，IN，USA)合成的並藉由LC/MS、NMR及LC/UV分析進行表徵(99.5%純度)。肽含量經估計在80%粉末質量。肽係經製備為含在100% DMSO中之10 mM儲備溶液並保持在-20℃下冷凍直至在檢定中即將進行測試。

對於hNPY1R，使用CHO細胞進行瞬時過度表現。藉由將受體cDNA次選殖至pcDNA3.1表現質體中並轉染至人類胚胎腎臟(HEK)293細胞中，然後用遺傳黴素進行選擇來製備用於hNPY2R及hNPY4R之穩定轉染之細胞系。在Multispan, Inc. (Hayward，CA)進行hNPY5R選殖。

為製備hNPY1R、hNPY2R、mNPY2R及hNPY4R粗細胞膜，使用兩種不同方法(如下所述)。hNPY5R膜購自Multipan, Inc. (#MCG1275)。

方法1–對於hNPY2R及hNPY4R膜，將冷凍的細胞沉澱在冰上於包含50 mM Tris HCl(pH 7.5)及每公克濕細胞糊劑具有EDTA(#1169749001)之Roche Complete™蛋白酶抑制劑之10 mL低滲均質緩衝液中溶解。使用安裝有Teflon®杵之玻璃Potter-Elvehjem均質儀破壞細胞懸浮液25次。在4℃下以1100 x g離心均質物10分鐘。收集上清液並儲存在冰上同時將沉澱再懸浮於均質化緩衝液中並如上所述進行均質化。以1100 x g離心均質物10分鐘。將第二上清液與第一上清液組合並在4℃下以35000 x g離心1小時。將所得的膜沉澱以約1至3 mg/mL再懸浮於含有蛋白酶抑制劑之均質化緩衝液中，在液氮中快速冷凍，並以等分試樣儲存在-80℃的冷凍機中直至使用。使用BCA蛋白檢定套組(Pierce，#23225)以BSA作為標準品測定蛋白質濃度。

方法2–對於hNPY1R膜，將冷凍的細胞沉澱在冰上於包含25 mM Tris HCl(pH 7.5)、1 mM MgCl₂ 、25單位/mL DNA酶I(Invitrogen，#18047-019)及每公克濕細胞糊劑不含EDTA(#11836170001)之Roche Complete™蛋白酶抑制劑之5 mL低滲均質緩衝液中溶解。使用安裝有Teflon®杵之玻璃Potter-Elvehjem均質儀破壞細胞懸浮液25次。在4℃下於50 mL錐形管中以1800 x g離心均質物15分鐘。收集上清液並儲存在冰上同時將沉澱再懸浮於均質化緩衝液中並如上所述進行均質化，只是均質化緩衝液中不使用DNA酶I。以1800 x g離心均質物15分鐘。將第二上清液與第一上清液組合並在4℃下以25000 x g離心30分鐘。將所得的膜沉澱以約2 mg/mL再懸浮於含有蛋白酶抑制劑之均質化緩衝液中，等分試樣化，並儲存在-80℃的冷凍機中直至使用。使用BCA蛋白檢定套組(Pierce，#23225)以BSA作為標準品測定蛋白質濃度。

一般結合檢定方法–使用與以下所述的用於化合物測試的相同的試劑及緩沖液，藉由飽和結合分析確定各種受體/放射性配體相互作用之平衡解離常數(K_d )。確定用於該研究中之受體製劑的K_d 值如下：hNPY2R，0.0047 nM；hNPY1R，0.07 nM；hNPY4R，0.084 nM；及hNPY5R，0.896 nM。

hNPY1R受體結合方案–利用從Perkin Elmer(Waltham，MA)獲得的人類重組[¹²⁵ I]-PYY_1-36 (#NEX341，2200 Ci/mmol)藉由競爭性放射性配體結合檢定確定PYY類似物肽及PYY_1-36 對hNPY1R之受體結合親和力(K_i )。藉由使用聚乙烯基甲苯(PVT)小麥胚芽凝集素偶聯的SPA珠粒(#RPNQ0001，Perkin Elmer)之SPA方法進行該檢定。使用檢定緩衝液(25 mM HEPES(pH 7.5)、1 mM MgCl₂ 、2.5 mM CaCl₂ 及0.2% w/v桿菌肽(RPI，#32000))以用於製備試劑。解凍PYY類似物及PYY_1-36 並使用Tecan Evo液體處理器3倍連續稀釋於100% DMSO(10點濃度反應曲線)中。在添加至檢定板中之前，將肽20倍逐步稀釋成檢定緩衝液以降低DMSO之水平及肽濃度。接下來，將5 µL連續稀釋之肽或DMSO轉移至含有45 µL檢定緩衝液或未標記之PYY_1-36 對照(非特異性結合或NSB，10 nM最終濃度)之Corning® 3632透明底檢定板中。然後，添加50 µL[¹²⁵ I]-PYY_1-36 (0.05 nM最終濃度)及50 µL hNPY1R膜(1.0 µg/孔)。最後添加50 µL WGA SPA珠粒(50 µg/孔)。最終DMSO濃度為0.125%。密封板並在板振盪器(設置6)上混合1分鐘並在室溫下在10小時的培養/珠粒沉澱時間後用PerkinElmer Trilux MicroBeta®閃爍計數器讀取。在反應曲線中測試的肽之最終檢定濃度範圍係：PYY類似物(2.5 µM至0.13 nM)及PYY_1-36 (10 nM至0.5 pM)。

hNPY2受體結合方案–藉由如以上針對hNPY1R所述的競爭性放射性配體結合檢定確定PYY類似物肽及PP_1-36 對hNPY2R之受體結合親和力(K_i )。在反應曲線中測試的肽之最終檢定濃度範圍係：PYY類似物(0.1 µM至5 pM)及PYY_3-36 (10 nM至0.5 pM)。

hNPY4R受體結合方案–藉由如以上針對hNPY1R所述的競爭性放射性配體結合檢定確定PYY類似物肽及PP_1-36 對hNPY4R之受體結合親和力(K_i )。在反應曲線中測試的肽之最終檢定濃度範圍係：PYY類似物(2.5 µM至0.13 nM)及PYY_1-36 (10 nM至0.5 pM)。

hNPY5R受體結合方案–藉由如以上針對hNPY1R所述的競爭性放射性配體結合檢定確定PYY類似物肽及PYY_1-36 對hNPY5R之受體結合親和力(K_i )。在反應曲線中測試的肽之最終檢定濃度範圍係：PYY類似物(1 µM至10 pM)及PYY_1-36 (1 µM至10 pM)。

NPY受體結合檢定之數據分析–將PYY類似物、PYY_1-36 、PYY_3-36 或PP_1-36 之濃度曲線之每分鐘原始計數(CPM)數據轉換為特異性抑制百分比，藉由從各個CPM值減去非特異性結合(NSB，分別在存在過量的未標記之PYY_1-36 、PYY_3-36 或PP_1-36 下進行結合)並除以總結合信號，亦藉由減去非特異性結合來校正，如以下公式所示：

使用四參數(曲線最大值、曲線最小值、IC₅₀ 、希爾斜率(Hill斜率))非線性回歸常式(Genedata Screener，版本13.0.5，Genedata AG，Basal，Switzerland)分析數據。基於公式K_i =IC₅₀ /(1+D/K_d )自相對IC₅₀ 值計算親和力(K_i )，其中D=實驗中放射性配體之濃度，IC₅₀ 係引起50%結合抑制之濃度，及K_d 係藉由飽和結合分析(列於以上)確定的放射性配體之平衡結合親和力常數。限定符(＞)指示與不存在競爭者之最大結合相比，數據未達到50%抑制，因此，使用檢定中所測試化合物之最高濃度計算K_i 。

報告的K_i 值經計算為幾何平均，如下所示：

使用Δ方法計算平均值標準誤差(SEM)，如下所示：

其中SD係標準偏差，n係獨立運行的次數，及ln(10)係10的自然對數。

藉由除以hNPY2R結果(單位為nM)來計算肽對hNPY2R(Y2)(相對於hNPY5R(Y5)、hNPY4R(Y4)及/或hNPY1R(Y1))之選擇性。

結果：

表1：與hNPY1R、hNPY2R、hNPY4R及hNPY5R之體外結合(K_i )。

肽	hNPY2R (nM)	hNPY5R (nM)	hNPY4R (nM)	hNPY1R (nM)	倍率(Y5/Y2)	倍率(Y4/Y2)	倍率 (Y1/Y2)
PP_1-36	--	--	0.07	--	--	--	--
PYY_1-36	0.007	0.37	5	0.06	52	714	8.6
PYY_3-36	0.008	3.6	27	7	450	3375	875
實例1	0.011	59	626	256	5363	56909	23272
實例2	0.070	＞1000	＞1840	＞1460	＞14285	＞26286	＞20857
實例3	0.009	36.4	112	＞1550	4044	12444	＞193750
實例4	0.005	ND	280	＞148	NA	56000	＞29600
實例5	0.030	ND	560	＞1530	NA	18666	＞51000
參考例1^*	0.016	189	--	--	11812	--	--
參考例2*	0.021	112	--	--	5333	--	--
參考例3^*	0.013	469	--	--	36076	--	--

*用於比較的已知PYY類似物；參見國際專利申請公開案第WO 2016/198682號，其中參考例1對應於其中的化合物4，參考例2對應於其中的化合物21，及參考例3對應於其中的化合物32。 ND–未偵測到 NA–不適用

如上所示，實例1至5之PYY類似物對hNPY2受體具有高度選擇性，甚至證實與天然人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)相比，與hNPY5、hNPY4及hNPY1受體之結合親和力降低。

(2) 對人類NPY2受體之體外cAMP活性

目的：

藉由測量過度表現重組人類NPY2受體之HEK 293細胞中毛喉素(forskolin)誘導之細胞內cAMP產生之抑制，來確定實例1至5之PYY類似物與天然人類PYY_3-36 相比之體外功能活性。

方法：

如以上在受體結合檢定中所述，合成、表徵並儲存PYY類似物及人類PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)。

受體選殖–藉由將受體cDNA次選殖至pcDNA3.1表現質體中並將其轉染至HEK 293細胞中然後用遺傳黴素進行選擇，製得穩定轉染之hNPY2受體細胞。製備第9代細胞等分試樣(1 x 10⁷ 個細胞/mL)並在液氮罐之氣相中保持冷凍。在檢定之時使用此等冷凍的等分試樣。在幾個月內細胞保持大於95%之存活率。

hNPY2R cAMP檢定 – 使用過度表現重組hNPY2R之HEK 293細胞，測定PYY類似物或PYY_3-36 對毛喉素(forskolin)誘導之cAMP產生之抑制。在37℃水浴中融化冷凍的細胞等分試樣。將細胞轉移至具有10 mL培養基(MEM細胞培養基(來自Life Tech 11090-081)，具有10% FBS(來自Life Tech 10082-147)、1 mM L-麩醯胺酸(來自Life Tech 25030-081)、1xNEAA(來自Life Tech 11140-050)、1 mM丙酮酸鈉(來自Life Tech 11360-070)、1x抗生素‑抗黴劑(來自Life Tech 15240-062))的50 mL管中，並在Beckman桌上型離心機(tabletop centrifuge)中以1500 rpm離心5分鐘。除去上清液，並將細胞沉澱再懸浮於10 mL細胞培養基中，然後通過40 µm過濾器。使用Vi-Cell分析儀(Beckman-Coulter (Vi-Cell XR 2.03))測定細胞數及細胞活力之準確計數。使用Combi-Tip分配器(Thermo Scientific)將每孔8000個細胞接種至白色384孔檢定板(Corning，聚-D-離胺酸塗佈，白色/不透光，cat# 356661)中。板以1000 rpm離心1秒，並於37℃在5% CO₂ 控制培育箱中培育18至20小時。藉由在紙巾上輕拂，從檢定板除去培養基。使用Combi-Tip分配器將10 µL檢定緩衝液[1X HBSS (Hyclone, #SH3026801)、20 mM HEPES (pH 7.5) (Hyclone #SH 30237.01)、0.1% w/v酪蛋白(CTL Scientific Supply Corp., #440203H)、500 µM IBMX (Sigma-Aldrich #I5876)]添加至孔中，然後以1500 rpm離心10秒。使用聲音分配技術(Labcyte Echo 550)在100% DMSO中製備2倍稀釋之濃度反應曲線(20點)。在37℃用PYY類似物或人類PYY_3-36 處理細胞45分鐘(最終DMSO濃度=1%)，然後在37℃用1µM毛喉素(Sigma-Aldrich，#F6886)刺激45分鐘。使用CisBio cAMP-G_i 動態套組(#62AM9PEB)定量細胞內cAMP。簡而言之，使用HTRF套組試劑藉由添加cAMP-d2共軛物於細胞溶解緩衝液(10 μL)中，然後亦添加抗體抗-cAMP-Eu³⁺ -穴狀化合物(Cryptate)於細胞溶解緩衝液(10 μL)中，來偵測細胞內的cAMP水平。所進行的競爭性檢定係在室溫培養至少60分鐘，然後在PerkinElmer Envision™儀器上利用在320 nm激發及在665 nm及620 nm發射讀取。在反應曲線中測試肽之最終檢定濃度範圍係：PYY類似物(0.1 µM至0.2 pM)及人類PYY_3-36 (10 nM至0.02 pM)。在檢定緩衝液中製備已知cAMP濃度(0.5 µM至1 pM)之標準曲線。在各板上包括無添加競爭者之孔或具有過量添加人類PYY_3-36 之孔分別作為最大反應及抑制劑對照。

hNPY2受體cAMP檢定之數據分析–使用時間解析螢光發射計算螢光比(665 nM/620 nm)，其與存在的cAMP的量成反比。使用繪製為相對反應單位(在665 nm/620 nm之發射*10,000，y軸)與cAMP濃度(x軸)之cAMP標準曲線將PYY類似物及人類PYY_3-36 之信號轉換為每孔之nM cAMP。

將每孔中之所產生的cAMP的量(nM)轉換為用單獨毛喉素觀測到的最大反應百分比，如以下公式所示：

其中抑制劑對照係在存在添加的過量的人類PYY_3-36 下產生的cAMP，最大反應係在僅存在毛喉素下產生的cAMP，及肽係在存在測試肽下產生的cAMP。

將特異性抑制百分比(y軸)相對於競爭者之濃度(x軸)作圖並使用如以下所定義的四參數(曲線頂部、曲線底部、IC₅₀ 、希爾斜率)非線性回歸常式(Genedata Screener，版本13.0.5，Genedata AG，Basal，Switzerland)進行分析：

。

相對IC₅₀ 值表示引起毛喉素誘導之cAMP產生之50%抑制之濃度。

報告的IC₅₀ 值經計算為幾何平均，如下所示：

使用Δ方法計算平均值標準誤差(SEM)，如下所示：

結果：

表2：對hNPY2受體之體外cAMP活性

肽	hNPY2R EC₅₀ (nM)
PYY_1-36	0.12
PYY_3-36	0.15
實例1	0.07
實例2	1.23
實例3	0.15
實例4	0.06
實例5	0.55
參考例1^*	0.30
參考例2^*	0.23
參考例3^*	0.32

*用於比較的已知PYY類似物；參見，國際專利申請公開案第WO 2016/198682號，其中參考例1對應於其中的化合物4，參考例2對應於其中的化合物21，及參考例3對應於其中的化合物32。

如上所示，來自cAMP檢定之結果證實實例1至5之PYY類似物對hNPY2受體之功能活性，其中實例2顯示在比人類PYY_3-36 低12倍的效力下最弱的效力。

(3)對hNPR2受體之體外GTPγS活性

目的：

藉由實例1至5之PYY類似物評估G蛋白之受體介導之活化。可使用不可水解之GTP類似物GTPγ[³⁵ S]測量受體介導之活化。G蛋白偶聯受體之促效劑介導之刺激導致膜相關Gαβγ-蛋白異三聚複合物之活化。此代表轉導細胞外信號以修飾細胞內途徑中之第一步驟。本文中，使用GTPγ[³⁵ S]功能檢定評估各種PYY類似物在hNPY2受體之效力。

方法：

如以上在受體結合檢定中所述，合成、表徵並儲存PYY類似物、人類PYY_1-36 (SEQ ID NO:1)及對照肽PYY_3-36 (SEQ ID NO:2)。

對於每種測試肽，利用Hamilton NIMBUS液體處理器在補充0.2%桿菌肽(U.S. Biologicals #11805)及0.5% DMSO之檢定緩衝液(20mM HEPES(pH 7.4)、100mM NaCl、6mM MgCl₂ 、1 mM EDTA)中完成1/3 log稀釋(對數濃度為-6.52至-12.52)之濃度反應曲線(CRC)。桿菌肽及DMSO之最終檢定濃度分別為0.05%及0.125%。在補充20 uM GDP(Sigma #G-7127)及6 ug/mL皂素(Sigma #S-4521)之檢定緩衝液中將hNPY2R膜(Multispan #HTS066M)製備成7.5 ug/mL之濃度並將hNPY2R膜在添加至檢定之前在室溫下培養20分鐘。在檢定緩衝液中將GTPγS[³⁵ S](PerkinElmer #NEG030H)製備成0.6 nM之濃度。在檢定緩衝液中將WGA SPA珠粒(PerkinElmer #RPNQ0001)製備為12 mg/mL之濃度。藉由先添加100 uL至hNPY2R膜，然後添加50 uL CRC溶液，然後添加50 uL GTPγS[³⁵ S]溶液，最終體積為200 uL，在96孔板(Costar #3604)中進行該檢定。覆蓋板並在室溫下置於迴旋式振盪器(175 rpm，45分鐘)上。然後，添加25 uL SPA珠粒且再密封板並渦轉混合，然後在室溫下放回迴旋式振盪器上3小時。然後以500 rpm離心板5分鐘並在PerkinElmer 2450微板計數器上每孔計數1分鐘。在不存在PYY類似物或人類PYY_3-36 下確定基礎結合(CPM)並利用以下公式用於計算每種濃度之肽的高於基礎值之百分比：(PYY類似物或人類PYY_3-36 ，CPM–基礎CPM)/(基礎CPM)*100。EC₅₀ (nM)值係藉由在GraphPad Prism 7.0中對濃度之對數及基礎值之百分比進行非線性回歸分析(對數(促效劑)與反應--可變斜率(四個參數))確定的，使用以下公式：Y=底部+(頂部-底部)/(1+10^((LogEC₅₀ -X)*希爾斜率))。使用GraphPad Prism 7.0中的列統計功能，從EC₅₀ (nM)值計算幾何平均及平均值標準誤差。

結果：

表3：對hNPY2受體之體外GTPγS活性。

肽	hNPY2R EC₅₀ (nM)
PYY_1-36	0.42
PYY_3-36	0.43
實例1	0.08
實例2	1.83
實例3	0.06
實例4	0.04
實例5	0.16
參考例1^*	0.22
參考例2^*	0.13
參考例3^*	0.11

如上所示，來自GTPγ[³⁵ S]功能檢定之結果證實PYY類似物對hNPY2受體之功能活性，其中實例2顯示在比人類PYY_3-36 低4倍的效力下最弱的效力。

(4)藥物動力學

目的：

研究PYY類似物之藥物動力學性質。

方法：

LC/MS–各種PYY類似物之血漿濃度藉由LC/MS方法來確定。該等方法測量整體化合物；肽加鍵聯時間延長。對於檢定，使用具有0.1%甲酸之甲醇從小鼠、大鼠或猴血漿(50 µL)提取PYY類似物及內部標準。離心該等樣品並將上清液轉移至熱蛋白質沉澱板。將該等樣品加載於經含在水中之甲醇及0.1%甲酸處理之Sep-Pak tC18 SPE µ洗脫板上。用含在水中之0.1%甲酸洗SPE管柱兩次。然後使用甲酸/水/乙腈(0.1:15:85)洗脫該等化合物，然後將其乾燥並復水，然後將等分試樣(10 µL)注射至Thermo Acclaim PepMap100 C18，300 µm x 5 mm trap管柱及Thermo Easy Spray PepMap C18，75 µm x 15 cm管柱上以進行LC/MS分析。使管柱流出物導入至Thermo Q-Exactive加質譜儀中以進行偵測及定量。

PYY類似物在CD-1小鼠中之藥物動力學–單次皮下給予200 nmol/kg後，在雄性CD-1小鼠中評估PYY類似物之血漿藥物動力學。歷時168小時，每個時間點從2只動物採集血液樣品。由於使用非連續採樣評估小鼠中PYY類似物之動力學，因此使用平均濃度與時間數據列出PYY類似物在單次皮下給予200 nmol/kg後之藥物動力學參數。單次皮下投與200 nmol/kg後歷時120小時偵測PYY類似物之血漿濃度。

PYY類似物在SD大鼠中之藥物動力學–單次皮下給予50 nmol/kg後，在雄性斯潑累格多雷(Sprague Dawley)大鼠中評估PYY類似物之血漿藥物動力學。歷時168小時，每個時間點從2只動物採集血液樣品。由於連續採樣用於評估大鼠中PYY類似物之動力學，因此使用個別動物濃度與時間數據列出PYY類似物在單次皮下給予50 nmol/kg後之藥物動力學參數。單次皮下投與50 nmol/kg後歷時120小時偵測PYY類似物之血漿濃度。

PYY類似物在食蟹獼猴中之藥物動力學–單次皮下給予50 nmol/kg後，在雄性及雌性食蟹獼猴中評估PYY類似物之血漿藥物動力學。歷時504小時採集血液樣品。由於連續採樣用於評估猴中PYY類似物之動力學，因此使用個別動物濃度與時間數據列出PYY類似物在單次皮下給予50 nmol/kg後之藥物動力學參數。單次皮下投與50 nmol/kg後歷時504小時偵測PYY類似物之血漿濃度。

結果：

表4：對雄性CD-1小鼠單次皮下給藥後之平均藥物動力學參數。

肽	劑量(nmol/kg)	T_1/2 (h)	T_max (h)	C_max (nmol/L)	AUC_inf (hr*nmol/L)	CL/F(mL/hr/kg)
實例1	200	15	6	1140	29795	6.71
實例2	200	27	12	1014	56198	3.56
實例3	200	26	12	1360	52751	3.79
實例4	200	15	12	916	31257	6.40

縮寫：AUCinf=從0至無窮大之曲線下面積；CL/F=清除率除以生體可用率(F)；Cmax=最大濃度；Tmax=最大濃度下的時間；T1/2=半衰期。

表5：對雄性SD小鼠單次皮下給藥後之平均藥物動力學參數。

肽	劑量(nmol/kg)	T_1/2 (h)	T_max (h)	C_max (nmol/L)	AUC_inf (hr*nmol/L)	CL/F(mL/hr/kg)
實例1	50	22	12	221	8621	5.83
實例3	50	38	12	399	21094	2.39
實例4	50	19	8	219	8289	6.41

縮寫：AUC_inf =從0至無窮大之曲線下面積；CL/F=清除率除以生體可用率(F)；C_max =最大濃度；T_max =最大濃度下的時間；T1/2=半衰期。

表6：對食蟹獼猴單次皮下給藥後之平均藥物動力學參數。

肽	劑量(nmol/kg)	T_1/2 (h)	T_max (h)	C_max (nmol/L)	AUC_inf (hr*nmol/L)	CL/F (mL/hr/kg)
實例1	50	101	9	500	64552	0.775
實例2	50	131	18	583	123173	0.408
實例3	50	148	9	599	105839	0.509

結果：

此等數據證實上述化合物具有適於每週一次投藥之藥物動力學特性。

(5) 溶解度&安定性

目的：

確定PYY類似物之可溶性pH範圍及安定性

方法：

目測溶解度範圍評估–將凍乾的PYY類似物粉末在水中以4 mg/mL濃度復水，並用檸檬酸/磷酸鹽緩衝液將pH調整至pH 4。用0.5 N NaCl滴定使系統之pH升至pH 8並然後用0.5 N HCl滴定降至pH 4。

熱安定性評估–製備1 mg/mL或2 mg/mL濃度之含在10 mM或20 mM磷酸鈉(pH 7.0)中之PYY類似物溶液並在4℃及40℃下培養4週。藉由尺寸排除層析(SEC)及RP-HPLC分析4週時間點的樣品。

SEC方法–使用TOSOH TSKgelG2000SWxl，7.8 mm ID x 30 cm，5 um管柱進行，流動相組成為50 mM磷酸鈉、具有20%乙腈之300 mM NaCl(pH 7.0)，歷時30分鐘，流速為0.5 mL/min，λ–214 nm。

RP方法–使用Cortecs C18，2.7 um，4.6 x 50 mm管柱，具有0.085% TFA之20%-45% 乙腈/水進行，歷時10分鐘，流速為1 mL/min，λ-214 nm。

結果：

表7：PYY類似物之溶解度及熱安定性。

肽	溶解度 (pH範圍)	熱安定性(10或20 mM磷酸鹽，pH 7.0)
RP%主峰	SEC%主峰
4℃	40℃	4℃	40℃
實例1	＞5.7	95.8	92.9	98.9	95.7
實例2	＞5.5	99.7	99.3	99.9	99.6
實例3	＞6.1	99.5	97.1	95.2	92.4
實例4	＞6.8	96.8	97.5	99.6	98.7
實例5	＞5.8	96.8	95.2	99.7	97.5

如上所示，所有肽在pH＞7.0下均可溶。如藉由RP及SEC評估，安定性表明此等肽在劇烈熱應力下相對安定。

實例7：PYY之體內效應。

(1)對正常小鼠中食物攝取及體重之體內效應

目的：

比較實例1至5之PYY類似物在單次注射後減輕體重及抑制正常小鼠中食物攝取之效應。

方法：

將Envigo RMS(Indianapolis，IN)的雄性C57Bl/6小鼠維持日常飲食(chow diet)(5008；LabDiet，St. Louis，MO)並單獨飼養在具有正常12:12小時照明循環並可自由獲得食物及水之溫度可控之設施(74.0°F；23.3℃)中。在9至10週大時，記錄未禁食的體重及初始食物重量，並對動物投與媒劑或肽之單次皮下注射液，然後在給藥後3天每天測量體重及食物攝取。計算體重及食物攝取與媒劑之曲線分析下面積(AUC)。在每次檢定中以30 nmol/kg之實例4用作體重及食物攝取之100%效力的基準。

結果：

表8：單次給予PYY類似物後，C57/Bl6小鼠中3天體重及食物攝取之變化。

肽	劑量 (nmol/kg，SC)	Δ體重 (%)**	Δ食物攝取 (%)**
實例1	30	89	103
100	108	105
實例2	100	71	71
300	117	78
實例3	30	98	93
100	111	100
實例4	3	22	12
10	41	48
30	100	100
實例5	100	70	99
300	129	118
參考例1^*	100	87	79
300	127	104
參考例2^*	100	62	67
300	110	85
參考例3^*	100	50	78
300	104	99

*用於比較的已知PYY類似物；參見，國際專利申請公開案第WO 2016/198682號，其中參考例1對應於其中的化合物4，參考例2對應於其中的化合物21，及參考例3對應於其中的化合物32。 **30 nmol/kg(AUC)之實例4設置為100%效力

如上所示，體重及食物攝取兩者之減少證實PYY類似物之體內效力，其中對完全效力所需劑量之比較證實效力之提高。

(2) 對飲食誘導之肥胖小鼠之食物攝取及體重之體內效應

目的：

研究在飲食誘導之肥胖(DIO)小鼠中歷時兩週時間每日給予實例1-5之PYY類似物(單獨地或與GLP-1受體促效劑組合)以減輕體重之效應。

方法：

20週大的DIO雄性C57Bl/6小鼠(Taconic)在到達時保持60%脂肪飲食(D12492；Research Diets，New Brunswick，NJ)。將動物單獨地飼養在具有12小時照明/黑暗循環(在22:00照明)並可自由獲得食物及水之溫度可控之設施(74.0°F；23.3℃)中。在每天媒劑給藥之一週適應期後，測量非禁食體重，並根據體重將動物隨機分為實驗組(n=6)並每天投與媒劑、GLP-1受體促效劑(GLP-1 RA；SEQ ID NO:15)、PYY類似物、或PYY類似物加GLP-1 RA之組合之皮下注射液。給藥2週後，記錄非禁食體重並計算平均體重與媒劑之變化。為確定PYY類似物與GLP-1 RA之組合之累加或協同效應，計算得的效力要高於單獨GLP-1 RA之效力(淨效應)。

結果：

表9：在飲食誘導之肥胖小鼠中利用單獨PYY類似物或與GLP-1受體促效劑之組合之2週研究之體重變化。

肽	劑量 (nmol/kg，SC)	Δ體重(%)
單獨PYY	PYY+GLP-1RA*
實例1	1	-4	-18
3	-6	-26
10	-15	-31
實例2	3	ND	-1
10	ND	-6
30	2	-11
實例3	1	-3	-16
3	-6	-28
10	-23	-30
實例4	0.3	0	-3
1	-1	-12
3	-4	-17
10	-12	-21
實例5	1	-2	-2
3	0	-11
10	-2	-18
30	-3	ND

*效力高於GLP-1受體促效劑(GLP-1 RA)之效力

如上所示，單獨地及與GLP-1 RA組合使用PYY類似物下體重之減輕證實PYY類似物之體內效力，其中對體重減輕之程度進行比較。

(3)對糖尿病及肥胖(db/db)小鼠體重及葡萄糖之體內效應

目的：

研究在肥胖及糖尿病小鼠(db/db)中歷時十天時間每天給予實例1至5之PYY類似物以減小體重及血液葡萄糖含量之效應。

方法：

將Envigo RMS(Indianapolis，IN)的Lepr^db/db (db/db)雄性小鼠維持風味飲食(chow-style diet)(5008；LabDiet，St. Louis，MO)並每個籠子5隻動物飼養在具有正常12:12小時照明循環並可自由獲得食物及水之溫度可控之設施(74.0°F；23.3℃)中。在8至9週大時，使用Accu-Check®血糖儀(Roche Diabetes Care, Inc.，Indianapolis，IN)測量體重及血液葡萄糖含量，然後每天皮下注射媒劑或肽。給藥10天後，測量體重及血液葡萄糖含量並計算相對於媒劑處理之變化。

結果：

表10：對經處理10天的db/db小鼠體重及血液葡萄糖之效應。

肽	劑量 (nmol/kg，SC)	Δ體重 (%)	Δ葡萄糖 (%)
實例1	1	-1	7
3	-1	-10
10	-10	-56
30	-14	-59
實例2	30	-5	-40
100	-9	-60
300	-17	-67
實例3	1	0	0
3	-5	-7
10	-9	-50
30	-15	-53
實例4	3	-2	-23
10	-12	-61
30	-17	-62
實例5	10	-4	-24
30	-11	-59
100	-17	-66

如上所示，利用PYY類似物降低體重及血液葡萄糖含量證實PYY類似物之體內效力，其中對體重減輕及葡萄糖降低之程度進行比較。

總言之，本文之PYY類似物顯示針對NPY2R之選擇性。其等亦顯示體重之劑量依賴性降低，如在正常小鼠、飲食誘導之肥胖小鼠及db/db小鼠中所反映的，以及db/db小鼠血液葡萄糖之劑量依賴性改善，其中實例1、3及4之PYY類似物係最有效的，與體外情況一致。序列SEQ ID NO:1– 人類 PYY_1-36

SEQ ID NO:2– 人類 PYY_3-36 IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYSEQ ID NO:3–PYY 類似物 PKPEX₇ PX₉ X₁₀ DASPEEX₁₇ X₁₈ RYYX₂₂ X₂₃ LRHYLNX₃₀ LTRQRYSEQ ID NO:4–PYY 類似物 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRYSEQ ID NO:5–PYY 類似物 PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRYSEQ ID NO:6–PYY 類似物 PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRYSEQ ID NO:7–PYY 類似物 PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRYSEQ ID NO:8–PYY 類似物 PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRYSEQ ID NO:9–PYY 類似物

SEQ ID NO:10–PYY 類似物

SEQ ID NO:11–PYY 類似物

SEQ ID NO:12–PYY 類似物

SEQ ID NO:13–PYY 類似物

SEQ ID NO:14–PP_1-36 APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRYSEQ ID NO:15 – GLP-1 RA

Claims

一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含以下之胺基酸序列：PKPEX₇PX₉X₁₀DASPEEX₁₇X₁₈RYYX₂₂X₂₃LRHYLNX₃₀LTRQRY(式I)，其中X₇係任何具有可用於共軛之官能基之胺基酸且該官能基係共軛於C₁₆-C₂₂脂肪酸，其中該C₁₆-C₂₂脂肪酸係經由連接子共軛於具有可用於共軛之官能基之胺基酸，且其中該連接子可係一或多個選自由[2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基)]-乙酸(AEEA)、胺基己酸(Ahx)、麩胺酸(E)、γ麩胺酸(γE)及其組合組成之群之單位，其中X₉係E或G，其中X₁₀係E或K，其中X₁₇係L或W，其中X₁₈係N或Q，其中X₂₂係A或I，其中X₂₃係E、D或S，其中X₃₀係E或W(SEQ ID NO：3)，及其中C端胺基酸視需要經醯胺化。
如請求項1之PYY類似物，其中X₇係選自由C、D、E、K及Q組成之群。
如請求項1之PYY類似物，其中X₇係K，並藉由K側鏈之ε-胺基共軛於C₁₆-C₂₂脂肪酸。
如請求項1之PYY類似物，其中該胺基酸序列係選自由以下組成之群：PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNWLTRQRY(SEQ ID NO：4)；PKPEKPGEDASPEEWQRYYAELRHYLNELTRQRY(SEQ ID NO：5)；PKPEKPEEDASPEEWQRYYIELRHYLNWLTRQRY(SEQ ID NO：6)；PKPEKPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY(SEQ ID NO：7)；及PKPEKPGEDASPEELQRYYASLRHYLNWLTRQRY(SEQ ID NO：8)。
如請求項1至4中任一項之PYY類似物，其中該C₁₆-C₂₂脂肪酸係選自由十六烷酸、十六烷二酸、十七烷酸、十七烷二酸、硬脂酸、十八烷二酸、十九烷酸、十九烷二酸、二十烷酸、二十烷二酸、二十一烷酸、二十一烷二酸、二十二烷酸、二十二烷二酸、及其分支鏈及經取代之衍生物組成之群。
如請求項5之PYY類似物，其中該C₁₆-C₂₂脂肪酸係C₁₈-C₂₀脂肪酸。
如請求項6之PYY類似物，其中該C₁₈-C₂₀脂肪酸係具有式CO-(CH₂)_x-CO₂H之直鏈脂肪酸，且其中_x係18或20。
如請求項7之PYY類似物，其中該C₁₈-C₂₀脂肪酸係選自由棕櫚酸、硬脂酸、花生酸及二十烷酸組成之群。
一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含：
(SEQ ID NO：9)。
一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含：
(SEQ ID NO：10)。
一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含：
(SEQ ID NO：11)。
一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含：
(SEQ ID NO：12)。
一種肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物，其包含：
(SEQ ID NO：13)。
如請求項1至4及9至13中任一項之PYY類似物，其中該PYY類似物具有大於-2之電荷。
如請求項1至4及9至13中任一項之PYY類似物，其中該PYY類似物在NPY2受體之結合親和力大於PYY_3-36(SEQ ID NO：2)之結合親和力。
如請求項1至4及9至13中任一項之PYY類似物，其中該PYY類似物之半衰期大於人類PYY_3-36(SEQ ID NO：2)之半衰期。
如請求項1之PYY類似物，其中該連接子及該脂肪酸一起係選自由(AEEA)₂‧γE‧C₂₀二酸、Ahx‧E‧γE‧C₁₈二酸及AEEA‧γE‧C₁₈二酸組成之群。
如請求項17之PYY類似物，其中該(AEEA)₂‧γE‧C₂₀二酸為(AEEA)₂-(γE)-CO-(CH₂)₁₈-COOH，其中該Ahx‧E‧γE‧C₁₈二酸為(Ahx-E-(γE)-CO-(CH2)₁₆-COOH，以及其中該AEEA‧γE‧C₁₈二酸為(AEEA)-(γE)-CO-(CH₂)₁₆-COOH。
一種醫藥組合物，其包含：至少一種如請求項1至18中任一項之肽酪胺酸-酪胺酸(PYY)類似物或其鹽；及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑。
如請求項19之醫藥組合物，其進一步包含另一治療劑。
如請求項20之醫藥組合物，其中該另一治療劑係選自由升糖素(GCG)、GCG類似物、升糖素樣肽-1(GLP-1)、GLP-1_7-36-醯胺、GLP-1類似物、胃抑制肽(GIP)、GIP類似物、調酸素(oxyntomodulin)(OXM)、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG組成之群之腸促胰島素(incretin)，或具有三重(triple)受體活性之腸促胰島素類似物。
如請求項20之醫藥組合物，其中該另一治療劑係二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制劑。
一種如請求項1至18中任一項之PYY類似物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療肥胖、與肥胖有關之疾病或病症或第II型糖尿病的藥物。
如請求項23之用途，其中該藥物係用於皮下(SQ)投與。
如請求項23之用途，其中該藥物係用於經口投與。
如請求項24或25之用途，其中該藥物係用於每天、每隔一天、每週三次、每週兩次、每週一次或每兩週投與。
如請求項23之用途，其中該藥物係用於每週一次(QW)SQ投與。
如請求項23之用途，其中該藥物係用於每週一次經口投與。
如請求項23至25、27及28中任一項之用途，其中該藥物進一步包含另一治療劑或係與另一治療劑組合使用。
如請求項29之用途，其中該另一治療劑係選自由升糖素(GCG)、 GCG類似物、升糖素樣肽-1(GLP-1)、GLP-1_7-36-醯胺、GLP-1類似物、胃抑制肽(GIP)、GIP類似物、調酸素(OXM)、OXM類似物、GIP/GLP-1、GLP-1/GCG組成之群之腸促胰島素，或具有三重受體活性之腸促胰島素類似物。
如請求項29之用途，其中該另一治療劑係二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制劑。