TWI748349B

TWI748349B - 腫瘤特異性多肽序列及其應用

Info

Publication number: TWI748349B
Application number: TW109105388A
Authority: TW
Inventors: 邱思; 李波; 李佑平; 張樂
Original assignee: 大陸商武漢華大吉諾因生物科技有限公司
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-12-01
Also published as: TW202118772A; WO2021087839A1; CN114651002A

Abstract

提供了腫瘤特異性多肽序列及其應用。該多肽包括第一肽組中的至少任意一種多肽，還可選擇性包括第二肽組中的至少任意一種多肽；第一肽組包括具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示序列的多肽；第二肽組包括SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示序列的衍生肽，該衍生肽包括依次相連的前中和後肽段，中肽段與SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示序列具有至少80%以上的同源性，前後肽段的長度之和為14~16個胺基酸。還提供了分離的核酸，構建體，表達載體，藥物組合物，抗原呈遞細胞，免疫效應細胞，腫瘤疫苗，以及多肽在製備預防或者治療腫瘤的藥物中的用途和治療腫瘤患者的方法。

Description

腫瘤特異性多肽序列及其應用

本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種腫瘤特異性多肽序列及其應用，具體涉及一組分離的多肽，分離的核酸，構建體，表達載體，宿主細胞，藥物組合物，抗原呈遞細胞，免疫效應細胞，腫瘤疫苗，以及多肽在製備預防或者治療腫瘤的藥物中的用途和治療病人腫瘤的方法。

癌症作為細胞內基因突變導致細胞增殖失控的一種疾病，目前已成為人類健康的重大威脅，是導致人類死亡的一個主要原因。國家癌症中心發佈的《2015年中國惡性腫瘤流行情況分析》指出，2015年中國惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。癌症負擔呈持續上升態勢，近10多年來，惡性腫瘤發病率每年保持約3.9%的增幅，死亡率每年保持2.5%的增幅。其中，占主要的高發惡性腫瘤依次為肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌和食管癌等。因此，尋找高效特異的癌症治療方法具有重大的臨床價值。

免疫療法藉由調動機體的免疫系統，增強腫瘤微環境抗腫瘤免疫力，從而達到控制和殺傷腫瘤細胞的目的，具有效率高、特異性強、耐受性好的優點，在腫瘤治療中具有廣闊的前景。免疫療法主要包括細胞因數療法、免疫檢驗點單抗、過繼細胞回輸、腫瘤免疫治療疫苗等。其中，腫瘤免疫治療疫苗主要包括腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞疫苗、蛋白&多肽疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗和抗獨特型抗體疫苗，這些疫苗能夠殺傷腫瘤的主要機制是藉由引起患者針對于腫瘤的免疫反應，使得T細胞識別腫瘤細胞，進而殺傷腫瘤細胞。

腫瘤免疫治療疫苗靶向的腫瘤抗原，包括腫瘤相關抗原以及腫瘤新抗原(neoantigen)。腫瘤相關抗原來源於腫瘤組織中高表達，而在正常組織中低表達或者不表達的蛋白；而腫瘤新抗原來源於腫瘤基因組突變產生的變異蛋白。因為腫瘤新抗原只存在於腫瘤細胞中而不存在于正常細胞中，所以新抗原能繞過中樞免疫耐受而引起強的T細胞免疫反應，具有效果好的特點；同時，腫瘤特異性的特點使得腫瘤新抗原具有安全性好、副作用小的優點。然而合適的腫瘤免疫治療疫苗靶向的腫瘤新抗原還有待於進一步改進。

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種腫瘤特異性多肽序列及其應用，具體涉及一組分離的多肽，分離的核酸，構建體，表達載體，宿主細胞，藥物組合物，抗原呈遞細胞，免疫效應細胞，腫瘤疫苗，以及多肽在製備預防或者治療腫瘤的藥物中的用途和治療腫瘤患者的方法。

在對病人進行腫瘤免疫治療時，常採用幾種方案：1、藉由使用在病人腫瘤中高表達的腫瘤相關抗原對病人進行治療，這種治療方式可能會由於腫瘤相關抗原在一些正常組織中也存在表達，免疫原性低從而使得效果差。2、使用在部分病人中已經經實驗鑒定得到的腫瘤相關抗原或者腫瘤新抗原進行治療。但是腫瘤突變具有病人特異性，而絕大部分腫瘤突變不會在複數病人中重複出現，因此在部分病人中鑒定的腫瘤特異性抗原，如果未經過在大量腫瘤病人人群中的出現頻率驗證，在新病人中可以重複使用的概率較低，從而使得利用這些腫瘤新抗原能夠治療的病人數少。3、針對每一位病人進行個體化的腫瘤新抗原篩選，例如可以藉由對其基因組和轉錄組的測序數據進行分析得到該病人的腫瘤特異性突變以及這些突變可能產生的變異肽段，再藉由機器學習演算法預測哪些變異肽段可能被MHC分子呈遞成為抗原，再將這些預測的腫瘤新抗原用於病人的治療。基於測序的個體化的腫瘤新抗原篩選方案，雖然可以藉由對某個病人進行基因組和轉錄組測序，藉由測序數據分析和演算法預測抗原篩選出對某位病人進行治療的腫瘤新抗原，但是整個過程成本高，時間長，且由於目前抗原預測演算法的準確性不高，篩選出的抗原假陽性較高，部分預測出的抗原不能有效引起病人機體內的免疫反應，因此導致病人的療效不佳。4、結合上述各方案，即利用已鑒定的腫瘤相關抗原和腫瘤新抗原集合，聯合個體化的腫瘤新抗原篩選方案。例如使用方案1或方案2中的已知抗原對病人進行第一階段的治療，同時參照方案3對病人進行個體化抗原篩選，再使用該篩選獲得的抗原進行病人第二階段的治療。該方案雖然可以彌補個體化腫瘤新抗原篩選時間長的問題，但是由於還涉及到個體化的腫瘤新抗原篩選方案，治療成本仍無法降低。

本發明藉由大量的資料分析和實驗篩選，發現了在多種癌症中重複出現的高頻突變基因MUC3A(野生型MUC3A基因編碼粘蛋白3A，提供潤滑，細胞信號通路及化學屏障的功能)，該高頻突變基因導致其編碼326位元點的胺基酸由絲氨酸(S)變化為蘇氨酸(T)。該突變多肽能在腫瘤組織中特異性高表達。本發明藉由實驗驗證了該突變多肽與HLA-A11：01分型的分子的高親和力以及在腫瘤細胞中的呈遞情況。進一步的，對該突變多肽進行序列改進，藉由大量的實驗篩選出能和原突變多肽被同樣的T細胞識別，但是啟動T細胞和誘導誘導抗原特異性T細胞殺傷腫瘤能力更強的變形多肽。

具體而言，本發明提供了如下技術方案：在本發明的第一方面，本發明提出了一組分離的多肽。根據本發明的實施例，該多肽包括第一肽組中的至少任意一種多肽，還可選擇性包括第二肽組中的至少任意一種多肽；該第一肽組包括具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的多肽；該第二肽組包括SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的衍生肽，該衍生肽包括依次相連的前肽段，中肽段和後肽段，該中肽段與該SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列具有至少80%以上的同源性，該前肽段和該後肽段的長度之和為14~16個胺基酸。

本發明所提出的多肽序列，是由腫瘤基因突變所產生的腫瘤特異性抗原及其變體，不會在正常組織中表達和呈遞，因此克服了使用腫瘤相關抗原治療安全性低的問題。同時，所提出的多肽序列來自多種癌症中高頻突變的基因，並可由人群中高頻出現的HLA分子所呈遞，因此可在多種癌症的病人腫瘤中重複出現，可覆蓋目前已知的腫瘤新抗原序列無法覆蓋的病人。

根據本發明的實施例，以上所述的分離的多肽可以進一步包括如下技術特徵：在本發明的一些實施例中，該中肽段與該SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列具有至少90%以上的同源性。

在本發明的一些實施例中，該中肽段與該SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列相同。

在本發明的一些實施例中，該衍生肽具有SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列。

在本發明的一些實施例中，該多肽選自下列中的至少一組：(1)具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的至少兩種多肽；(2)具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的至少一種多肽，以及SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的至少一種多肽。

在本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的核酸，根據本發明的實施例，該核酸編碼上述多肽或者為其互補序列。如前所述，上述多肽能被和其具有親和力的HLA分子作為抗原呈遞於腫瘤細胞表面，並且具備啟動T細胞並指引這些T細胞殺傷腫瘤地能力，因此能夠編碼上述多肽的核酸序列或者這些編碼上述多肽的核酸序列的互補序列可用於預防或治療腫瘤。

在本發明的協力廠商面，本發明提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構建體包含本發明第二方面該的核酸和控制序列，該控制序列與該核酸可操作地連接。本發明實施例所提出的構建體可在適合條件下，在合適的宿主細胞中高效表達上述多肽，進而可有效用於對腫瘤的治療或者預防。其中，該控制序列可指導核酸在宿主中表達上述多肽，這些控制序列可以是一個或者複數。這些控制序列根據需要，可以是啟動子、終止子、SD序列、用於調控基因的表達的調節基因等等。

在本發明的第四方面，本發明提出了一種表達載體。根據本發明的實施例，該表達載體包含本發明協力廠商面該的構建體。本發明所提供的表達載體可在合適條件下，在宿主中高效表達上述多肽，該表達載體可有效用於對腫瘤的治療或者預防。

在本發明的第五方面，本發明提出了一種宿主細胞。根據本發明的實施例，該宿主細胞攜帶本發明協力廠商面該的構建體或者本發明第四方面該的表達載體，宿主細胞可藉由轉染或者轉化前述核酸構建體或者表達載體獲得的。該宿主細胞在合適條件下可高效表達上述多肽，該宿主細胞可有效用於對腫瘤的治療或者預防。

在本發明的第六方面，本發明提出了多肽在製備預防或者治療腫瘤的藥物或者在製備診斷腫瘤的試劑盒中的用途。若腫瘤表達上述突變基因MUC3A，該高頻突變基因導致其編碼326位元點的胺基酸由絲氨酸(S)變化為蘇氨酸(T)，以及表達與多肽具有親和力的HLA-A11：01分型的HLA分子，則上述多肽具有被和其具有親和力的HLA-A11：01分型的HLA分子作為抗原呈遞於腫瘤細胞表面，啟動T細胞並指引這些T細胞殺傷腫瘤的能力。因此，所提出的多肽可以用於預防和控制腫瘤。同時，如前所述，由於本發明提出的多肽特異性地表達於腫瘤細胞中，因此其用於治療或預防腫瘤，具有較好地安全性。也可以用於應用於製備診斷腫瘤的試劑盒中。

在本發明的第七方面，本發明提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，該藥物組合物包括前面該多肽以及藥學上可用的輔料。包含前面該多肽和輔料的藥物組合物可顯著刺激腫瘤特異性T細胞的增殖以及這些T細胞的細胞因數分泌，進而殺傷表達對應突變基因的腫瘤細胞，可用於對腫瘤的治療或者預防。當然，所提供的藥物組合物中還可以包括一些藥學上可用的佐劑，這些佐劑作為非特異性免疫增強劑，當和前述多肽一起注射或者預先注入到機體中時，可以增強機體對多肽抗原的免疫應答或者改變免疫應答類型。可用的佐劑包括但不限於PD-1抑制劑。

在本發明的第八方面，本發明提出了一種抗原呈遞細胞。根據本發明的實施例，該抗原呈遞細胞可呈遞前面所述的多肽。抗原呈遞細胞可藉由負載該多肽、轉染或者轉化前述核酸構建體或者表達載體，或吞噬前述宿主細胞等途徑獲得。根據本發明的實施例，呈遞前述多肽的抗原呈遞細胞顯著刺激腫瘤特異性T細胞的增殖以及這些T細胞的細胞因數分泌，進而殺傷表達對應突變基因的腫瘤細胞，可用於對腫瘤的治療或者預防。這些可用的抗原呈遞細胞可以為樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞等。

在本發明的第九方面，本發明提出了一種免疫效應細胞。根據本發明的實施例，該免疫效應細胞可識別前面所述多肽或者識別本發明第八方面該的抗原呈遞細胞。該免疫效應細胞可藉由前述多肽或者前述抗原呈遞細胞誘導得到。該免疫效應細胞可特異性殺傷表達對應突變基因的腫瘤細胞，用於對腫瘤的治療或者預防。這些可用的免疫效應細胞可以為T細胞、效應T細胞、NK細胞等。

在本發明的第十方面，本發明提出了一種腫瘤疫苗。根據本發明的實施例，該腫瘤疫苗包含前面所述的核酸，或前面所述的核酸構建體，或前面所述的表達載體，或前面所述的宿主細胞，或前面所述的抗原呈遞細胞，或前面所述的免疫效應細胞。

在本發明的第十一方面，本發明提供了一種治療腫瘤患者的方法，該方法包括給予患者有效量的藥物組合物或者有效量的腫瘤疫苗，該藥物組合物為本發明第七方面所述的藥物組合物，該腫瘤疫苗為本發明第十方面所述的腫瘤疫苗。其中，“有效量的”藥物組合物指只要能夠達到抑制腫瘤生長或者干預腫瘤增殖的目的即可。“有效量的”腫瘤疫苗，是指將這些腫瘤疫苗導入到患者體內，能夠克服腫瘤引起的免疫抑制狀態，啟動患者自身的免疫系統，從而達到控制或者消除腫瘤的目的即可。

圖1是根據本發明的實施例提供的突變多肽質譜鑒定結果圖。

圖2是根據本發明的實施例提供的多肽與T2親和力的流式驗證結果圖。

圖3是根據本發明的實施例提供的多肽與體外免疫原性ELISPOTs檢測結果圖。

圖4是根據本發明的實施例提供的多肽疫苗控制小鼠腫瘤生長的結果圖。

圖5是根據本發明的實施例提供的多肽DC疫苗控制小鼠腫瘤生長的結果圖。

圖6是根據本發明的實施例提供的DC-CTL疫苗控制小鼠腫瘤生長的結果圖。

下面參考附圖詳細描述本發明的實施例，需要說明的是，這些實施例是範例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。

同時，為了方便本領域技術人員的理解，對本發明的某些術語進行解釋和說明，需要說明的是，這些解釋和說明，僅用來幫助對於本發明技術方案的理解，而不應當看做是對本發明保護範圍的限制。

本文中，術語“第一肽組”或者“第二肽組”分別指包含有不同胺基酸序列的多肽。

術語“衍生肽”用來表示由具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的多肽衍生的多肽序列，這些衍生的序列從N端到C端，依次包括相連的前肽段，中肽段和後肽段，其中中肽段與SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列具有至少80%以上的同源性，優選具有至少90%以上的同源性，前肽段和後肽段的長度之和為14~16個胺基酸。對於前肽段和後肽段的胺基酸的具體類型可不做特殊限制。在至少一些實施方式中，這些衍生肽可以為在SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列往兩側延伸得到的總長度為23mer~25mer的長肽序列。在一些優選實施方式中，這些衍生肽可以是具有 SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的多肽。

在本發明的至少一些實施方式中，本發明所提供的分離的多肽選自下列中的至少一組：1)具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的多肽；(2)具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的至少任意一條多肽，以及SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的至少任意一條多肽。

其中SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的多肽如下表1所示。

這些多肽序列來源於腫瘤基因突變所產生的腫瘤特異性抗原，不會在正常組織中表達和呈遞，因此其特異性更高，引起的免疫反應也是特異性更高，用於治療安全性好，副作用小，且其結構簡單、易於人工合成。同時，這些多肽序列具備和HLA分子親和能力、刺激T細胞擴增並分泌細胞因數能力、以及誘導抗原特異性T細胞殺傷靶細胞的能力強等特點，且不改變其與T細胞之間的特異性，具有更好的腫瘤控制效果。

下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以藉由市購獲得的常規產品。

實施例一

基於公共資料庫如TCGA/ICGC的大量腫瘤突變資料，統計其中高頻發生的突變，對中國人群的高頻分型進行預測、篩選，以及實驗驗證，得到了多肽序列，該多肽序列如SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示，同時還利用腫瘤突變資料，獲得衍生肽，該衍生肽序列為多肽序列向兩邊延伸至23個胺基酸的長度形成的多肽序列，該衍生肽序列如SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：10所示。

下面實施例對各多肽序列以及衍生肽序列進行研究。其中為了表述方便，SEQ ID NO：3所示序列可稱為突變型多肽，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列可稱為變形多肽。

實施例二質譜實驗驗證多肽在腫瘤細胞表面被HLA分子呈遞

本發明將實施例一所獲得的多肽序列和衍生肽的編碼基因藉由慢病毒轉染入腫瘤細胞，再藉由免疫共沉澱-質譜聯合的方式，富集細胞表面的多肽-MHC複合體，對腫瘤細胞表面的MHC分子是否呈遞了該突變多肽進行了鑒定。具體方法如下：

1、MHC-I限制性T細胞表位肽的分離與純化：

使用pan-MHC-I A/B/C抗體(克隆號：w6/32)與表面偶聯protein A分子的sepharose CL-4B beads在4℃結合1小時，使用NanoDrop檢測上清殘餘的抗體含量，抗體結合率>90%視為合格，製備pan-MHC-I A/B/C結合sepharose，4℃備用。細胞樣本中加入40ml RIPA裂解液，4℃孵育1小時，12000rpm離心30min，上清加入sepharose CL-4B beads進行預雜交，4℃孵育1小時；離心去除beads，上清加入pan-MHC-A/B/C結合sepharose CL-4B beads，4℃孵育過夜(16-18小時)。使用4℃預冷的PBS洗滌beads，重複三次；使用超純水洗滌beads；離心去除洗滌液，使用0.1N acetic acid洗脫beads表面的抗體-MHC-I蛋白複合物，抗體-MHC-I蛋白複合在酸性條件下解離，進一步，使用3kDa超濾管或c18固相萃取柱(25mg，waters)對洗脫產物中的蛋白和多肽進行分離純化，使用冷凍真空離心機對純化產物進行濃縮，濃縮產物-20℃保存至質譜上機。

2、MHC-I限制性T細胞表位肽的質譜鑒定：

濃縮的MHC-I限制性表位肽溶液藉由線上連接nanoflow HPLC(Thermo Fisher Scientific)的Q Exactive質譜儀(Thermo Fisher Scientific)進行分析，採用ReproSil-Pur C18-AQ 1.9um填料手工填裝長15cm，內徑75um的分離柱進行分離，使用線性梯度2-30%的buffer B(80% ACN/0.5% acetic acid)洗脫多肽，流速設置250nl/min，洗脫時間90min。二級質譜採用HCD進行碎片化，資料獲取選擇資料依賴的“Top 20”方法。MS圖譜的採集解析度為70,000，200m/z，目標值為3E6離子；離子強度排行前10的離子通常採用最大注射時間為120ms進行分離和累積直至自動增益控制器的數值顯示為1E5。多肽匹配選項設置“disable”，MS/MS解析度設置17,500(200 m/z)。

3、MHC-I限制性T細胞表位元肽的質譜資料分析：

資料分析採用MaxQuant(version 1.3.10.15)比對質譜圖譜和人全蛋白庫(Uniprot，86,749個蛋白)、腫瘤相關抗原、腫瘤特異性突變肽段以及一個包含247個常見污染物(角蛋白、牛血清蛋白和蛋白酶)的資料集生成的圖譜列表。可變修飾檢測設置：N端乙醯化和甲硫氨酸氧化。第二位多肽鑒定設置：enable；特異性酶切設置：unspecific；多肽鑒定FDR(false discovery rate)設置1%，蛋白鑒定FDR不設置；序列匹配長度限制設置為8-15aa，最大多肽品質設置為1500Da，最大電荷狀態設置為3。前導離子的初始允許品質偏差設置為6ppm，最大碎片品質偏差設置為20ppm。“match between runs”設置開啟。鑒定結果輸出保存在“peptide.txt”文件中，去除匹配到反庫和污染庫中的多肽，其餘為MHC-I限制性表位的鑒定結果。

實驗結果表面突變型多肽、變形多肽以及各衍生肽序列均可以表達並呈遞於細胞表面的HLA分子上。以突變型多肽SEQ ID NO：3為例，該多肽的質譜譜圖見圖1，結果顯示上述多肽可以表達並呈遞於細胞表面的HLA分子。

實施例三多肽T2親和力的驗證

T2細胞是內源性抗原提呈途徑中必需的抗原多肽轉運蛋白缺陷細胞株，可用於研究抗原呈遞過程和MHC分子的相互識別作用的強弱。

為了檢驗外源性多肽與T2細胞的親和力，以已經被證實與T2細胞有強的親和力的多肽作為陽性對照，以不加多肽的T2細胞作為背景對照，藉由外源性多肽與T2細胞表面MHC I類分子的結合可使其表面MHC I類分子的表達量增加，二者結合越穩固，可檢測到的MHC I類分子越多，最終以平均螢光強度為檢測指標，以螢光係數(FI)作為衡量指標。以此判斷多肽與T2細胞的親和力大小，FI數值越高，多肽與T2細胞的親和力越強，有利於後續特異性CD8+T細胞的識別。

實驗取合成好的多肽，加入到2*105個T2細胞中，並加入人類β2微球蛋白(最終濃度，3ug/ml)，培養于24孔板中，在培養箱(37℃,5%CO2)，培養過夜。以沒有加多肽的T2細胞被用作背景對照，以CMV多肽(其序列為NLVPMVATV，是一種病毒多肽，是已知的經證實與T2細胞存在強親和力的多肽)作為陽性對照，實驗設置2個複孔，取平均值。

取培養的細胞200g，離心5分鐘收集細胞。細胞用PBS洗滌兩次後，將細胞直接用FITC標記的抗對應HLA分型(HLA-A*11：01)的單克隆抗體孵育，4℃維持30分鐘。然後用流式細胞儀(BD FACSJazz^TM)及其軟體檢測並分析其平均螢光強度，見圖2。T2親和力結果，如下表2所示。

從表2可以看出，相比較於陽性對照，所提供的多肽TTLPTTITR表現出非常高的親和力。

實施例四多肽體外刺激擴增CD8+T細胞

取多肽對應亞型呈陽性的志願者的PBMC細胞，2×107個PBMC細胞，用貼壁法分離單核細胞(貼3h)，以及CD8磁珠的方法分離得到CD8+的T細胞。採用GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)誘導貼壁單核細胞為未成熟DC，再用IFN-gamma(100U/ml)、LPS(10ng/ml)，以及各多肽誘導位成熟DC細胞為多肽特異性成熟DC細胞。將所獲得的多肽特異性成熟DC細胞與志願者的CD8+T細胞共培養，並加入IL-21。3天後，補加IL-2和IL-7。之後於第5，7天補加一次IL-2和IL-7，第10天取共培養的細胞進行計數，和後續的ELISPOTs以及LDH檢測。

實施例五 ELISPOTs方法驗證多肽啟動CD8+T細胞免疫反應

ELISPOT方法即酶聯免疫斑點實驗(Enzyme linked immunospot assay)，能夠檢測到單個細胞分泌的細胞因數情況。實驗在培養板包被上特異性的單克隆抗體，然後加入待檢測的細胞和抗原刺激物進行培養，在刺激物的刺激下，T細胞分泌相應的細胞因數，所分泌的細胞因數就被包被在培養板上的抗體捕獲。洗去細胞後，被捕獲的細胞因數可以螢光標記的第二抗體結合，形成斑點。即可以利用包被好的抗體捕獲培養中的細胞分泌的細胞因數，並以酶聯斑點顯色的方式呈現出來，以此檢測驗證多肽啟動CD8+T細胞的免疫反應的強弱。

參照ELISPOTs試劑盒說明書中描述，將實驗例四中培養後的細胞與負載過實驗多肽(即TTLPTTITR)和無關多肽(是指不會刺激T細胞分泌IFN-gamma干擾素的多肽，具體序列為LSYRNKPSI，以下實施例中所用到的無關多肽也為該序列)的T2細胞分別加入到ELISPOTs板中進行培養，20小時後進行ELISPOTs檢測(見試劑盒說明書)。ELISPOTs結果見圖3，結果總結見下表3所示：

其中，表3中第二列和第三列分別代表利用實驗多肽作為刺激物或者利用無關多肽作為刺激物，所檢測到的斑點數，第四列倍數代表利用實驗多肽作為刺激物與利用無關多肽作為刺激物所產生的斑點數的比值。通常來說當該比值超過一定的倍數(>=2)就視為有免疫原性，而且該比值越高，說明多肽的免疫原性越強。

實施例六 LDH釋放實驗證明CD8+T細胞多肽特異性殺傷活性

LDH(乳酸脫氫酶)是存在於細胞質的一種酶，當細胞膜受到損傷時，LDH會釋放到培養基中。由於釋放出的LDH穩定，檢測培養基中LDH的量可以作為測定死細胞和受損細胞數量的指標。

實驗例四中培養的細胞與與負載過實驗多肽或無關多肽或未負載多肽的T2細胞進行共培養，實驗中設置最大釋放孔，體積校正孔，培養基對照孔，自發釋放孔，不同效靶比(T細胞與T2細胞的數目比)等對照，每組設置3個複孔，4h後，取出共培養的細胞上清50μl，並加入到50ul LDH底物混合液中，使細胞上清催化LDH底物反應，最終讀取490nm波長和680nm參考波長，並根據對照孔，計算靶細胞殺傷T2的殺傷活性。其結果如下表4所示，表4中所示出的數值越大，代表殺傷作用越強。

結果顯示，這些多肽刺激產生的CD8+T細胞具有多肽特異性殺傷活性。

結果顯示，TTLPTTITR多肽刺激產生的CD8⁺T細胞具有多肽特異性殺傷活性。

實施例七小鼠皮下移植瘤模型的建立

該實施例構建了小鼠皮下移植瘤模型，本模型用於驗證本發明提出的多肽藥物組合，抗原呈遞細胞，疫苗對於腫瘤的控制效果。

1、將各多肽的編碼基因藉由慢病毒轉染的方式導入，構建並包裝表達前述突變多肽或其變形的重組慢病毒。

2、表達多肽的人源肺癌細胞系的建立

人肺癌細胞系HCC827購買於ATCC(編號：CRL-2868)，其HLA亞型為HLA-A*1101陽性。細胞培養于含10%胎牛血清，100U/mL青黴素和鏈黴素的DMEM培養基中。37℃，5% CO2的孵箱中培養。將包裝好的慢病毒轉染HCC827細胞系，並採用Puromycin抗生素(嘌吟黴素)，持續篩選存活的HCC827細胞系，最終建立表達多肽的HCC827細胞系。

3、NOD SCID小鼠人免疫重建

採集健康志願者抗凝外周血600至900ml。Ficoll分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear,PBMC)，收集細胞待用。取300只排除免疫滲漏的NOD SCID小鼠，每只腹腔注射PBMC 2*10⁷/0.5ml，對NOD SCID小鼠進行人免疫重建。4周後，選取小鼠準備接種人肺癌細胞系模型。

4、人肺癌腫瘤模型的構建

已建系的人肺癌細胞系，培養於含10%胎牛血清，100U/mL青黴素和鏈黴素的DMEM培養基中。37℃,5% CO₂的孵箱中培養。收集腫瘤細胞，3000轉離心，用無菌生理鹽水洗滌腫瘤細胞3次。做適當稀釋，取40微升細胞懸液加入10微升0.4%台酚藍染色並鏡檢計數，製成濃度為1*108個/ml的腫瘤細胞懸液，選取免疫重建後的NOD/SCID小鼠，每只小鼠皮下接種腫瘤細胞懸液100ml。接種完成後，逐日觀察接種部位有無感染，腫瘤生長後有無自然消退。7天後，小鼠皮下瘤可摸到約米粒大小腫瘤。對免疫重建4周的皮下瘤模型NOD/SCID小鼠分別進行DC疫苗治療，並每3-4天記錄腫瘤的體積。

實施例八多肽疫苗的製備及治療方案

將免疫重建4周的HCC827皮下瘤模型NOD/SCID小鼠隨機分為4 組：佐劑+野生型多肽組(該野生型多肽為TTLPTTISR)、佐劑+空白多肽組(即僅含有佐劑)、佐劑+突變型多肽組(該突變性多肽為TTLPTTITR)、佐劑+變形多肽組(其中根據所用到的變形多肽不同，又可以分為四組，所用到的變形多肽分別為TILPTTITK，TSLPTTITK，TTLPTTITK，TVLPTTITK)，每組各6只。其中所用到的佐劑為弗氏佐劑。

各組多肽的首次免疫劑量為100ml/只。上述多肽用PBS重懸後，與150ml/只弗氏完全佐劑混勻後，用PBS調整至300ml/只，于背部皮下雙點注射。2周後，使用相同劑量進行加強免疫(第1次使用完全弗氏佐劑，以後均用不完全弗氏佐劑)，共免疫4次。注射結束後觀察小鼠生命體征，每3-4天用遊標卡尺測量腫瘤縱橫大小。腫瘤體積計算為：腫瘤體積=1/2*長*寬²。同時，記錄小鼠體重變化情況。結果見圖4。

結果顯示，相對於佐劑+野生型多肽負載的多肽疫苗組和佐劑+空白多肽組，佐劑+突變型多肽或佐劑+變形多肽負載的多肽疫苗組可以明顯的減緩小鼠腫瘤的生長。

實施例九 DC多肽疫苗的製備及治療方案

採集健康志願者抗凝外周血100至150ml。Ficoll分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear,PBMC)，收集PBMC細胞，按2-3*10⁶/ml重懸於RPMI 1640培養基中，37℃孵育2h，貼壁細胞即為DC，吸取未貼壁細胞即是外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)備用。採用GM-CSF(1000U/ml)，IL-4(1000U/ml)，誘導貼壁單核細胞為未成熟DC，再加入IFN-gamma(100U/ml)，CD40L(10ng/ml)，最後分別加入野生型多肽組合、突變多肽組合(濃度為10微克/ml)，誘導貼壁細胞為成熟DC細胞，收穫成熟DC，用生理鹽水洗滌3次。用生理鹽水將負載多肽後的DC調整為(4.0±0.5)*10⁷/ml，用於後續實驗。將小鼠隨機分為4組：DC-負載野生型多肽組(該野生型多肽為TTLPTTISR)、DC-負載突變多肽組(該突變性多肽為TTLPTTITR)、DC-負載變形多肽組(其中根據所用到的變性多肽不同，又可以分為四組，所用到的變性多肽分別為TILPTTITK，TSLPTTITK，TTLPTTITK，TVLPTTITK)、空白多肽組(即未負載任何多肽組)，每組各6只。製備DC-負載野生型多肽、DC-負載突變多肽、DC-負載變形多肽及DC-負載空白多肽的多肽細胞懸液。對小鼠近腹股溝大腿內側進行皮內注射，每側注射0.1ml，每週注射1次。劑量為(4.0±0.5)*10⁶細胞/次，共注射2次。注射結束後觀察小鼠生命體征，每3-4天用遊標卡尺測量腫瘤縱橫大小。腫瘤體積計算為：腫瘤體積=1/2*長*寬²。同時，記錄小鼠體重變化情況。結果見圖5。

結果顯示，相對於野生型多肽負載的DC疫苗組和空白多肽負載的DC疫苗組，突變多肽或變形多肽負載的DC疫苗組可以明顯的減緩小鼠腫瘤的生長。

實施例十多肽特異性DC-CTL疫苗的製備及治療方案

實施例九收集的PBL經過磁珠分選獲得CD8⁺T細胞與負載空白多肽的DC、負載野生型多肽的DC、負載突變多肽的DC、負載變形多肽的DC共育致敏，細胞比例為DC：CD8⁺T細胞=1：4。培養液中加入500IU/ml IL-2和50ng/ml IL-7,37V 5% CO₂培養箱共同孵育，培養1周後進行細胞計數；第2周再用負載空白多肽的DC、負載野生型多肽的DC、負載突變多肽的DC、負載變形多肽的DC進行第二輪剌激。共剌激三輪，培養期間適當添加培養基。于培養第0,7,14和21天分別計數淋巴細胞數量，計算細胞增殖指數(proliferation index，PI)。其中，PI=擴增後細胞數/接種細胞數。培養至21天後收穫細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocytes,CTL)。將細胞用生理鹽水重懸，重懸體積為0.2ml，經尾靜脈回輸，每只腫瘤模型小鼠回輸細胞數約為1*10⁸細胞。注射結束後觀察小鼠生命體征，每3-4天用遊標卡尺測量腫瘤縱橫大小。腫瘤體積計算為：腫瘤體積=1/2*長*寬²。同時，記錄小鼠體重變化情況。結果見圖6。

結果顯示，相對於空白多肽對照組和野生型多肽組，突變多肽或變形多肽啟動的DC-CTL疫苗可以明顯的減緩小鼠腫瘤的生長。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“範例”、“具體範例”、或“一些範例”等的描述意指結合該實施例或範例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或範例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必針對的是相同的實施例或範例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或複數實施例或範例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或範例以及不同實施例或範例的特徵進行結合和組合。

儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是範例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。

<110> 武漢華大吉諾因生物科技有限公司/GENOIMMUNE THERAPEUTICS Co.,LTD.

<120> 腫瘤特異性多肽序列及其應用

<130> PIOC3194029TW

<150> PCT/CN2019/116164

<151> 2019/11/07

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 變形多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 變形多肽

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> 突變型多肽

<400> 3

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> 變形多肽

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<211> 9

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<213> Artificial Sequence

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<223> 變形多肽

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<212> PRT

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<223> 衍生肽

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<223> 衍生肽

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<223> 衍生肽

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<210> 9

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<223> 衍生肽

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<212> PRT

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<223> 衍生肽

<400> 10

Claims

一組分離的多肽，其特徵在於，該多肽包括一第一肽組中的至少任意一種多肽，該第一肽組包括具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的多肽。
如請求項1所述的多肽，其中，該多肽還包括一第二肽組中的至少任意一種多肽，該第二肽組包括SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4~SEQ D NO：5所示胺基酸序列的一衍生肽，該衍生肽具有SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列。
如請求項1所述的多肽，其中，該多肽選自下列中的至少一組：(1)具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的至少兩種多肽；(2)具有SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的至少一種多肽，以及SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9~SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的至少一種多肽。
一種分離的核酸，其特徵在於，該核酸編碼請求項1~3中任一項所述的多肽或者為其互補序列。
一種構建體，其特徵在於，該構建體包括請求項4項所述的核酸和控制序列，該控制序列與該核酸可操作地連接。
一種表達載體，其特徵在於，該表達載體包括請求項5所述的構建體。
一種宿主細胞，其特徵在於，該宿主細胞攜帶有請求項5所述的構建體或者請求項6所述的表達載體。
一種如請求項1~3中任一項所述的多肽在製備預防或者治療腫瘤的藥物或者在製備診斷腫瘤的試劑盒中的用途。
一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物包括請求項第1~3中任一項所述的多肽和藥學上可用的輔料。
一種抗原呈遞細胞，其特徵在於，該抗原呈遞細胞呈遞請求項1~3中任一項所述的多肽。
一種免疫效應細胞，其特徵在於，該免疫效應細胞可識別請求項1~3中任一項所述的多肽或者識別請求項10所述的抗原呈遞細胞。
一種腫瘤疫苗，其特徵在於，該腫瘤疫苗包括請求項1~3中任一項所述的多肽，或者請求項4所述的核酸，或者請求項5所述的構建體，或者請求項6所述的表達載體，或者請求項7所述的宿主細胞，或者請求項10所述的抗原呈遞細胞，或者請求項11所述的免疫效應細胞。
一種如請求項1至請求項3中任一項所述的多肽在製備用於治療腫瘤患者的一藥物組合物或一腫瘤疫苗的用途，其特徵在於，包括給予該患者有效量的該藥物組合物或者有效量的該腫瘤疫苗。
一種如請求項9所述的藥物組合物或如請求項12所述的腫瘤疫苗在製備用於預防或者治療腫瘤患者的藥物中的用途。