TWI742000B - 擴增ｄｎａ的方法 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及一種擴增細胞基因組DNA的方法，所述方法包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物，其中，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所述反應混合物。本申請還涉及一種用於擴增基因組DNA的試劑盒。
Description
本發明涉及擴增DNA的方法，特別是在擴增單細胞全基因組的方法。
單細胞全基因組測序技術是在單細胞水準對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整基因組後進行高通量測序。該技術的建立需要兩個必備條件：1.高品質的全基因組擴增技術；2.高通量低成本的測序技術。
目前主要的全基因組擴增技術主要有四類：擴增前引物延伸聚合酶鏈式反(Primer Extension Preamplification-Polymerase Chain Reaction，簡稱為PEP-PCR，具體方法參見Zhang L,Cui X,Schmitt K,Hubert R,Navidi W,Arnheim N.1992.Whole genome amplification from a single cell：implications for genetic analysis.Proc Natl Acad Sci U S A.89(13)：5847-51.)、退變寡核苷酸引物聚合酶鏈式反應(Degenerate Oligonucleotide-Primed
Polymerase Chain Reaction，簡稱為DOP-PCR，具體方法參見Telenius H,Carter NP,Bebb CE,Nordenskjo M,Ponder BA,Tunnacliffe A.1992.Degenerate oligonucleotide-primed PCR：general amplification of target DNA by a single degenerate primer.Genomics13：718-25)、多重置換擴增(Multiple Displacement Amplification，簡稱為MDA，具體方法參見Dean FB,Nelson JR,Giesler TL,LaskenRS.2001.Rapid amplification of plasmid and phageDNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification.Genome Res.11：1095-99)和多次退火環狀迴圈擴(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，簡稱為MALBAC，具體方法參見PCT專利申請WO2012166425)。但是現有的主流擴增方法中的一些雖然操作簡單但最終的擴增效果不甚理想，而另一些擴增效果好但操作過程較為繁瑣。以MALBAC為例，其主要由如下缺陷：1.一般需經過細胞裂解、終止裂解(升溫/添加中和試劑)、預擴增、擴增等若干個步驟才可得到擴增產物，整個過程涉及多次試劑配製，開蓋加液操作，增加了引入環境污染的風險；2.整個實驗過程需4小時以上，人員及儀器效率較低，無法對臨床上急需驗證的樣本在短時間內給出令人滿意的結果；3.整個實驗過程對操作人員的熟練程度要求較高，初次接觸者無法很快的獲得滿意的擴增結果。
因此，目前急需一種能夠克服主流擴增方法的一個、多個或全部缺陷的改進的擴增方法。
本發明提供了一種擴增細胞基因組DNA的方法和一種用於擴增基因組DNA的試劑盒。
在本申請的一個方面中，提供了一種擴增細胞基因組DNA的方法，所述方法包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物，其中，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所述反應混合物。
在一些實施方式中，所述的方法進一步包括分析所述擴增產物以識別與疾病或表型相關的序列特徵。在一些實施方式中，所述與疾病或表型相關的序列特徵包括染色體水準異常、染色體的異位、非整倍體、部分或全部染色體的缺失或重複、胎兒HLA單倍型和父源突變。在一些實施方式中所述疾病或表型選自下組：β-地中海貧血、唐氏綜合征、囊性纖維化、鐮狀細胞病、泰-薩克斯病、脆性X綜合征、脊髓性肌萎縮症、血紅蛋白病、α-地中海貧血、X連鎖疾病(由在X染色體上基因主導的疾病)、脊柱裂、無腦畸形、先天性心臟病、肥胖、糖尿病、癌症、胎兒性別和胎兒RHD。
在一些實施方式中，所述基因組DNA包含在細胞中，並且所述反應混合物進一步包含能夠裂解所述細胞的表面活性劑和/或裂解酶。
在一些實施方式中，在所述步驟(b)和步驟(c)之前還包括將所述反應混合物置於裂解溫度迴圈程式，使得所述細胞裂解並釋放出所述基因組DNA。
在一些實施方式中，所述通用序列被選擇以使得其基本上不會與基因組DNA結合產生擴增。在一些實施方式中，所述通用序列選自下組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：6。
在一些實施方式中，所述可變序列包含隨機序列。在一些實施方式中，所述可變序列的長度為2-20個鹼基、
3-10個鹼基，4-9個鹼基或5-8個鹼基。在一些實施方式中，所述可變序列中的三個或三個以上的鹼基位置由選自G、A、和T的一種或幾種鹼基組成，或者由C、A和T的一種或幾種鹼基組成。在一些實施方式中，所述三個或三個以上的鹼基位置位於所述可變序列的3’端或者中間。在一些實施方式中，所述可變序列選自下組：(N)nGGG、(N)nTTT，(N)mTNTNG，(N)xGTGG(N)y，其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸，n是選自3-17的正整數，m是選自3-15的正整數、x和y分別是選自3-13的正整數。在一些實施方式中，所述可變序列被選擇以使得在基因組上分別均勻並且覆蓋度高。
在一些實施方式中，所述第一類引物包括SEQ ID NO：11[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、SEQ ID NO：12[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、SEQ ID NO：13[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、SEQ ID NO：14[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]或SEQ ID NO：15[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]的序列，並且所述第二類引物從5’到3’具有SEQ ID NO：1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGT GGAG]的序列，其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸。
在一些實施方式中，所述核酸聚合酶具有熱穩定和/或鏈置換活性。在一些實施方式中，所述核酸聚合酶選自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pyrophage 3137、Vent聚合酶(例如Thermococcus litoralis的Vent
聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、Deep Vent(-exo)聚合酶)、TOPOTaq DNA聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反轉錄酶、AMV反轉錄酶、HIV反轉錄酶、T7 phase DNA聚合酶變種(缺少3’-5’外切酶活性)、Phusion®超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bst DNA聚合酶(全長)、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶，及其任意組合。
在一些實施方式中，反應混合物進一步包含pH值調節劑，使得所述反應混合物的pH值維持在7.0-9.0之間。
在一些實施方式中，所述反應混合物進一步包含一種或多種選自下組的成分：Mg2+、dTT、牛血清白蛋白、DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、Cl-、K+、Ca2+、Na+、和(NH4)+。
在一些實施方式中，所述第一溫度迴圈程式包括：(b1)將所述反應混合物置於能夠打開所述基因組DNA的雙鏈的溫度程式；(b2)將所述反應混合物置於能夠使所述第一類引物與DNA單鏈範本結合的溫度程式；(b3)將所述反應混合物置於能夠使與DNA單鏈範本結合的第一類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式，以產生擴增產物；(b4)將所述反應混合物置於能夠使所述擴增產物脫落成單鏈的溫度程式；(b5)重複步驟(b2)到(b4)至指定的第一迴圈次數。在一些實施
方式中，所述指定的第一迴圈次數大於2。在一些實施方式中，當進行到第二次迴圈後，所述擴增產物包含在5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列的基因組擴增產物。在一些實施方式中，所述方法在步驟(b4)後並且在步驟(b5)之前進一步包括步驟(b4’)，其中將所述反應混合物置於適當的溫度程式，使得所述基因組擴增產物的3’端與5’端雜交結合以形成環狀結構，或者使所述基因組擴增產物的3’端與引物結合。在一些實施方式中，所述方法在步驟(b4)後直接到步驟(b5)。在一些實施方式中，所述步驟(b5)的所述第一迴圈次數大於3、大於4、大於5、大於6，並且不超過10。
在一些實施方式中，所述步驟(c)包括：(c1)將經步驟(b)獲得的所述反應混合物置於能夠打開DNA雙鏈的溫度程式；(c2)將所述反應混合物置於能夠使所述第二類引物與所述經步驟(b)獲得的基因組擴增產物的單鏈結合的溫度程式；(c3)將所述反應混合物置於能夠使與所述擴增產物單鏈結合的第二類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式；(c4)重複步驟(c1)到(c3)至指定的第二迴圈次數。在一些實施方式中，所述步驟(c4)中的所述第二迴圈次數大於所述步驟(b5)中所述的第一迴圈次數。在一些實施方式中，所述步驟(b1)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應1-10分鐘。在一些實施方式中，所述步驟(b2)包括將所
述反應混合物置於多於一種的溫度程式，以促使所述第一類引物充分與所述DNA範本有效結合；在一些實施方式中，所述多於一種的溫度程式包括：介於5-10℃之間的第一溫度，介於25-30℃之間的第二溫度，和介於45-50℃之間的第三溫度。
在一些實施方式中，所述步驟(b2)中所述步驟包括在第一溫度反應3-50秒、在第二溫度反應3-50秒、和在第三溫度反應3-50秒。在一些實施方式中，所述步驟(b3)中所述的溫度程式包括在60-90℃的溫度之間反應1-15分鐘。在一些實施方式中，所述步驟(b4)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應10-50秒。在一些實施方式中，所述步驟(c1)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應10-30秒。在一些實施方式中，所述步驟(c2)中所述的溫度程式包括在45-65℃的溫度之間反應10-30秒。在一些實施方式中，所述步驟(c3)中所述的溫度程式包括在60-80℃的溫度之間反應1-15分鐘。在一些實施方式中，所述步驟(a)中的基因組DNA從被裂解的細胞釋放，所述裂解包括熱裂解、鹼裂解、酶裂解或機械裂解。
在一些實施方式中，所述熱裂解包括溫度在20-100℃之間裂解10-100分鐘。在一些實施方式中，所述熱裂解是在裂解試劑存在的條件下進行的。在一些實施方式中，所述裂解試劑包括一種或多種選自下組的表面活性劑：NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、和異硫氰酸
胍，和/或裂解酶。
在本申請的另一個方面中，提供了一種擴增細胞基因組的方法，所述方法包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；其中所述第一溫度迴圈程式包括：(b1)在介於90-95℃的溫度之間的第一變性溫度反應1-10分鐘；(b2)介於5-10℃之間的第一退火溫度反應3-50秒，介於25-30℃之間的第二退火溫度反應3-50秒，和介於45-50℃之間的第三退火溫度反應3-50秒；(b3)在介於60-90℃之間的第一延伸溫度反應1-15分鐘；(b4)在介於90-95℃的第一解鏈溫度之間反應10-50秒；(b5)重複步驟(b2)到(b4)至6-9個迴圈；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到
擴大的基因組擴增產物；其中所述第二溫度迴圈程式包括：(c1)在介於90-95℃之間的第二變性溫度反應1-10分鐘；(c2)在介於90-95℃之間的第二解鏈溫度反應10-30秒；(c3)在介於45-65℃之間的第四退火溫度反應10-30秒；(c4)在介於60-80℃之間的第二延伸溫度反應1-15分鐘；(c5)重複步驟(c2)到(c4)5-30個迴圈；(d)獲得所述步驟(c)得到的擴增產物；其中，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所述反應混合物。
在一些實施方式中，所述通用序列包含或由SEQ ID NO：1組成；所述可變序列包含或由NNNNNTTT或NNNNNGGG組成，N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸。
在本申請的再一個方面中，提供了一種用於擴增基因組DNA的試劑盒，所述試劑盒包括含有第一類引物和第二類引物的混合物，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。
在一些實施方式中，所述混合物進一步包括核苷酸單體混合物和Mg2+。
在一些實施方式中，所述混合物進一步包括一種或多種選自下組的成分：dTT、牛血清白蛋白(BSA)、pH調節劑(例如Tris HCl)、DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、
Cl-、K+、Ca2+、Na+、和/或(NH4)+。
在一些實施方式中，所述混合物進一步包括核酸聚合酶。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包括能夠裂解細胞的表面活性劑和/或裂解酶。在一些實施方式中，所述表面活性劑選自NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、和異硫氰酸胍中的一種或多種。在一些實施方式中，所述裂解酶選自蛋白酶K、胃蛋白酶、和木瓜蛋白酶中的一種或多種。
在一些實施方式中，所述混合物進一步包括能夠裂解細胞的表面活性劑和/或裂解酶。
在本申請的又一個方面中，提供了一種用於擴增基因組DNA的試劑盒，所述試劑盒包括第一類引物和第二類引物，並且還包括使用說明書，所述使用說明書記載了在開始進行所述擴增之前在同一容器中混合所述第一類引物和所述第二類引物的步驟，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。
通過下面說明書和所附的權利要求書並與附圖結合，將會更加充分地描述本申請內容的上述和其他特徵。可以
理解，這些附圖僅描繪了本申請內容的若干實施方式，因此不應認為是對本申請內容範圍的限定。通過採用附圖，本申請內容將會得到更加明確和詳細地說明。
圖1示出了本申請擴增方法的基本原理。
圖2示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例3的兩步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別進行凝膠電泳的結果，其中a為實施例3的兩步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照，第18泳道為分子量標記；b為實施例2的三步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照，第18泳道為分子量標記。
圖3示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例3的兩步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別隨機選取7個樣品，即總共14個樣品分別作為範本，使用表7所示的引物分別針對表6所示的20個致病位點進行擴增，將擴增產物進行凝膠電泳的結果。其中a-g分別表示重複進行的單細胞基因組DNA擴增產物的凝膠電泳圖，其中上排條帶是用兩步法擴增的結果，下排條帶是用三步法擴增的結果：a：上排對應樣品2_1和下排對應樣品3_1、b：
上排對應樣品2_2和下排對應樣品3_3、c：上排對應樣品2_3和下排對應樣品3_4、d：上排對應樣品2_4和下排對應樣品3_5、e：上排對應樣品2_5和下排對應樣品3_6、f：上排對應樣品2_6和下排對應樣品3_7、g：上排對應樣品2_7和下排對應樣品3_8；在每張電泳圖片中，從左向右每個泳道依次表示分子量標記物、針對表6所示的致病位點1-20進行的擴增結果(在圖(a)中是1-16)。
圖4示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例3的兩步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別隨機選取3個樣品，即總共6個樣品分別作為範本，使用表11所示的引物分別針對表10所示的20個致病位點進行擴增，將擴增產物進行凝膠電泳的結果。其中a-c分別表示重複進行的單細胞基因組DNA擴增產物的凝膠電泳圖，其中上排條帶是用兩步法擴增的結果，下排條帶是用三步法擴增的結果：a：上排對應樣品2_1和下排對應樣品3_1、b：上排對應樣品2_2和下排對應樣品3_4、c：上排對應樣品2_7和下排對應樣品3_8；在每張電泳圖片中，從左向右每個泳道依次表示分子量標記物、針對表6所示的致病位點1-20進行的擴增結果。
圖5示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例3的兩步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別隨機選取4
個樣品，即總共8個樣品分別作為範本，使用表14所示的6對質檢引物進行qPCR擴增的結果。其中a-f分別表示使用針對染色體CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH6和CH7的質檢引物，對範本DNA進行的q-PCR檢測的資料。其中的CT表示閾值迴圈數，DNA1和DNA2代表陽性對照。
圖6示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA用實施例3的兩步法擴增，將得到的擴增產物構建基因組文庫並進行測序得到的染色體拷貝數的結果。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。其中a-j分別表示將樣品2_1、2_2、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9和2_10構建基因組文庫並進行測序得到的染色體拷貝數的結果。
圖7示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA用實施例2的三步法擴增，將得到的擴增產物構建基因組文庫進行測序得到的染色體拷貝數的結果。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。其中a-i分別表示將樣品3_1、3_3、3_4、3_5、3_6、3_7、3_8、3_9和3_10構建基因組文庫並進行測序得到的染色體拷貝數的結果。
圖8示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增(即樣品3_1、3_3、3_4、3_5、3_6、3_7、3_8、3_9和3_10)以及用實
施例3的兩步法擴增(即樣品2_1、2_2、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9和2_10)，將兩種方法得到的擴增產物分別構建基因組文庫進行二代測序，得到的測序結果的資料統計。
圖9示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增(即樣品3_1、3_3、3_4、3_5、3_6、3_7、3_8、3_9和3_10)以及用實施例3的兩步法擴增(即樣品2_1、2_2、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9和2_10)，將兩種方法得到的擴增產物分別構建基因組文庫進行二代測序，並對其拷貝數變異係數的比較結果。
圖10示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例3的兩步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物(其中三步法的擴增產物示為3-1和3-2，兩步法的擴增產物示為2-1)以及人類表皮成纖維細胞(AFP)細胞提取的基因組DNA(示為Gdna)分別進行多重PCR，並將多重PCR擴增產物進行高通量測序得到的結果。
圖11示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例5的一步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別進行凝膠電泳的結果，其中a為實施例5的一步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為
陰性對照，第18泳道為分子量標記；b為實施例2三步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照，第18泳道為分子量標記。
圖12示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例5的一步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別隨機選取4個樣品，即總共8個樣品分別作為範本，使用表7所示的引物分別針對表6所示的20個致病位點進行擴增，將擴增產物進行凝膠電泳的結果。其中a-d分別表示重複進行的單細胞基因組DNA擴增產物的凝膠電泳圖，其中上排條帶是用兩步法擴增的結果，下排條帶是用三步法擴增的結果：a：上排對應樣品1_1和下排對應樣品3_1、b：上排對應樣品1_2和下排對應樣品3_2、c：上排對應樣品1_3和下排對應樣品3_3、d：上排對應樣品1_4和下排對應樣品3_4；在每張電泳圖中，從左向右每個泳道依次表示針對表6所示的致病位點1-20進行的擴增結果。
圖13示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA用實施例5的一步法擴增，將得到的擴增產物構建基因組文庫進行測序得到的染色體拷貝數的結果。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。其中a-j分別表示將樣品1_1、1_2、1_3、1_4、1_5、1_6、1_7、1_8、1_9和
1_10構建基因組文庫並進行測序得到的染色體拷貝數的結果。
圖14示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA用實施例2的三步法擴增，將得到的擴增產物構建基因組文庫進行測序得到的染色體拷貝數的結果。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。其中a-i分別表示將樣品3_1、3_2、3_3、3_4、3_5、3_6、3_7、3_8和3_10構建基因組文庫並進行測序得到的染色體拷貝數的結果。
圖15示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例5的一步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別構建基因組文庫進行二代測序，得到的測序結果的資料統計。
圖16示出了對正常人表皮成纖維細胞(AFP)的基因組DNA分別用實施例2的三步法擴增以及用實施例5的一步法擴增，將兩種方法得到的擴增產物分別構建基因組文庫進行二代測序，並對其拷貝數變異係數的比較結果。
本發明提供了擴增基因組DNA的方法，特別是擴增單細胞全基因組的方法。
本發明至少部分基於以下發現，即，在基因組DNA的擴增反應之前，可以在單個反應混合物中加入擴增所需
的全部試劑，然後將該反應混合物置於擴增反應的條件下，直到完成擴增。該方法在擴增反應開始後無需再向反應混合物中添加試劑，因此大大降低了因添加試劑而帶來的額外操作以及可能導致的污染，並且將所需的反應時間大大縮短。
在本發明之前，當使用兩種及以上引物進行擴增基因組DNA時，需要將擴增反應分成至少兩步，每步中使用不同的引物，由此實現不同的擴增目的。此前一直認為，只有在第一步完成後才能在反應混合物中加入第二步所需的引物或者第一步僅使用非常低的迴圈次數(例如，1次)，這樣才能避免引物之間發生相互干擾進而影響擴增效果，因此，本發明以前的方法要麼在擴增反應前只加入第一步所需的引物，等到第一步的擴增反應結束後，再向反應體系中加入第二步所需的引物，然後再進行第二步的擴增反應(例如，請參見，WO2012/166425)；要麼第一步僅能使用非常低的次數，無法達到理想的擴增效率。但是，出乎意料的是，本申請的發明人發現，當把原本認為可能相互產生干擾的引物一次性地放入單個反應混合物，並且在本發明的反應條件下進行擴增時，能夠意外地得到與分次加入引物時相當的擴增效果。因此，本發明大大提高了反應效率，縮短了反應時間，而且降低了樣品污染的風險，提高了結果的可靠性。
在一方面，本申請提供了擴增細胞基因組DNA的方法，包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物
包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物。本申請提供的方法的一種實施方式的圖示請見圖1。
本申請的方法廣泛適用于基因組DNA的擴增，特別是痕量的基因組DNA的快速、精確擴增。
本申請的方法優選適用于基因組DNA。在某些實施方式中，反應混合物中包含的基因組DNA的起始量不超過10ng、不超過5ng、不超過1ng、不超過500pg、不
超過200pg、不超過100pg、不超過50pg、不超過20pg、或者不超過10pg。
基因組DNA可以來自生物樣品，例如生物組織或含有細胞或游離DNA的體液。含有基因組DNA的樣品可以通過已知的方法獲取，例如通過口腔粘膜樣本、鼻腔樣本、頭髮、漱口水、臍帶血、血漿、羊水、胚胎組織、內皮細胞、指甲樣本、蹄樣本等獲取。生物樣品可以是任何適當的形式提供，例如可以是石蠟包埋的形式，新鮮分離的形式等。基因組DNA可以來自任何物種或生物種類，例如但不限於，人類、哺乳動物、牛、豬、羊、馬、齧齒動物、禽類、魚類、斑馬魚、蝦、植物、酵母、病毒或細菌。
在某些實施方式中，基因組DNA是來自於單個細胞的基因組DNA，或者來自兩個或多個同類細胞的基因組DNA。單個細胞或同類細胞可以來自，例如，植入前的胚胎、孕婦外周血中的胚胎細胞、單精子、卵細胞、受精卵、癌細胞、細菌細胞、腫瘤迴圈細胞、腫瘤組織細胞、或者從任意組織獲得的單個或多個同類細胞。本申請的方法可以用於擴增一些寶貴的樣本或起始量低樣本中的DNA，如人類的卵細胞、生殖細胞、腫瘤迴圈細胞、腫瘤組織細胞等。
獲得單細胞的方法在本領域也是公知的，例如，可以通過流式細胞分選的方法(Herzenberg等人Proc Natl Acad Sci USA 76：1453-55,1979；lverson等人Prenatal
Diagnosis 1：61-73,1981；Bianchi等人Prenatal Diagnosis 11：523-28,1991)、螢光啟動細胞分選法、通過磁珠分離的方法(MACS,Ganshirt-Ahlert等人Am J Obstet Gynecol 166：1350,1992)、使用半自動細胞挑取儀(例如Stoelting公司生產的細胞轉移系統QuixellTM)或者上述多種方法的結合。在一些實施方式中，可以使用梯度離心和流式細胞技術來提高分離和分選的效率。在一些實施方式中，可以根據單個細胞不同的性質來進行挑選特定類型的細胞，例如表達某種特定的生物標記的細胞。
獲得基因組DNA的方法也是本領域公知的。在某些實施方式中，可以從生物樣品中或單個細胞中裂解細胞並釋放獲得基因組DNA。可以使用本領域公知的任何適當的方法進行裂解，例如可以通過熱裂解、鹼裂解、酶裂解、機械裂解，或其任意組合的方式進行裂解(具體可參見，例如，U.S.7,521,246、Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook v2和Current Protocols in Molecular Biology(1995).John Wiley和Sons,Inc.(supplement 29)pp.9.7.1-9.7.2.)。
機械裂解包括使用超聲、高速攪拌、均質、加壓(例如法式濾壓壺)、減壓和研磨等使用機械力破壞細胞的方法。最常用的機械裂解法是液體均質法，其迫使細胞懸浮液通過一個很狹窄的空間，從而對細胞膜施加剪切力(WO2013153176 A1)。
在某些實施方式中，可以使用溫和的裂解方法。例
如，可以將細胞在含有Tween-20的溶液中72℃加熱2分鐘、在水中65℃加熱10分鐘(Esumi等人.,Neurosci Res 60(4)：439-51(2008)、在含有0.5% NP-40的PCR緩衝液II(Applied Biosystems)中70℃加熱90秒(Kurimoto et al.,Nucleic Acids Res 34(5)：e42(2006)、或者使用蛋白酶(例如蛋白酶K)或者離鹽液(例如異硫氰酸胍)進行裂解(美國專利申請US 20070281313)。
熱裂解包括加熱法和反復凍融法。在一些實施方式中，所述熱裂解包括溫度在20-100攝氏度之間，裂解10-100分鐘。在一些實施方式中，熱裂解的溫度可以是介於在20-90、30-90、40-90、50-90、60-90、70-90、80-90、30-80、40-80、50-80、60-80或70-80℃之間的任意溫度。在一些實施方式中，熱裂解的溫度不低於20、30、40或50℃。在一些實施方式中，熱裂解的溫度不高於100、90或80℃。在一些實施方式中，熱裂解時間可以是介於20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50或30-40分鐘之間的任意時間。在一些實施方式中，熱裂解的時間不少於20、30、40、50、60、70、80或90分鐘。在一些實施方式中，熱裂解的時間不多於90、80、70、60、50、40、30或20分鐘。在一些實施方式中，熱裂解溫度是隨時間進行變化的。在一些實施方式中，熱裂解是溫度在30-60℃保持10-30分鐘，之後在70-90℃保持5-20分鐘。
在一些實施方式中，所述熱裂解是在裂解試劑存在的條件下進行的。當裂解試劑存在時，可以降低裂解所需的時間或降低裂解所需的溫度。裂解試劑可以破壞蛋白-蛋白、脂質-脂質和/或蛋白-脂質相互作用，從而促進細胞釋放基因組DNA。
在一些實施方式中，所述裂解試劑包括表面活性劑和/或裂解酶。表面活性劑可以分為離子型、兩性和非離子型表面活性劑。一般情況下，兩性和非離子型表面活性劑的裂解效能弱於離子型表面活性劑。示例性的表面活性劑包括，但不限於，NP-40、吐溫、SDS、GHAPS、TritonX-100、TritonX-114、EDTA、去氧膽酸鈉、膽酸鈉、異硫氰酸胍中的一種或多種。本領域技術人員可以根據實際的需要選擇表面活性劑的種類和濃度。在一些實施方式中，表面活性劑的工作濃度為0.01%-5%、0.1%-3%、0.3%-2%或0.5-1%。
示例性的裂解酶可以是蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，或其任意組合。在一些實施方式中，裂解酶的工作濃度為0.01%-1%、0.02%-0.5%、0.03%-0.2%或0.4-0.1%。
在本申請提供的方法中，可以在反應混合物中直接使用含有基因組DNA的裂解產物，例如，可以將生物樣品預先進行裂解處理，得到裂解產物，然後將裂解產物與反應混合物的其他成分混合。如有需要，可以對裂解產物經過進一步的處理，以分離得到其中的基因組DNA，再將
該分離的基因組DNA與反應混合物的其他成分混合得到反應混合物。
在一些實施方式中，裂解後的核酸樣品無需進行純化即可進行擴增。
本申請還提供了一種更為簡便的方法，即，直接將包含基因組DNA的細胞與擴增所需的其他成分混合得到反應混合物，也就是說，在反應混合物中的基因組DNA存在於細胞內部。在這樣的情況下，反應混合物中還可以進一步含有能夠裂解所述細胞的表面活性劑(例如但不限於，NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、異硫氰酸胍中的一種或多種)和/或裂解酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或多種)。這樣，細胞的裂解和基因組DNA的擴增都在同一個反應混合物中進行，不僅提高了反應效率，縮短了反應時間，而且仍然保持了相當好的擴增效果。
在某些實施方式中，本申請提供的方法在步驟(a)完成以後並且在進行步驟(b)之前還可以進一步包括將所述反應混合物置於裂解溫度迴圈程式，使得所述細胞裂解並釋放出所述基因組DNA。本領域技術人員根據反應混合物中含有的裂解成分、細胞的種類等可以選擇適當的裂解溫度迴圈程式。示例的裂解溫度迴圈程式包括，將反應混合物置於50℃ 3分鐘到8小時(例如，在3分鐘到7小時、3分鐘到6小時、3分鐘到5小時、3分鐘到4小時、3分鐘到3小時、3分鐘到2小時、3分鐘到1小
時、3分鐘到40分鐘、3分鐘到20分鐘之間的任意時間，例如10分鐘、20分鐘、30分鐘等)，然後置於80℃ 2分鐘到8小時(例如，在2分鐘到7小時、2分鐘到6小時、2分鐘到5小時、2分鐘到4小時、2分鐘到3小時、2分鐘到2小時、2分鐘到1小時、2分鐘到40分鐘、2分鐘到20分鐘之間的任意時間，例如10分鐘、20分鐘、30分鐘等)。裂解溫度程式可以進行1個迴圈，如有需要，也可以進行兩個或更多個迴圈，取決於具體的裂解條件。
反應混合物中還含有兩類不同的引物，其中第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。第一類引物中的可變序列可以與基因組DNA範本結合，並且在核酸聚合酶的作用下複製一定長度的基因組範本以得到5’端為通用序列而3’端為基因組序列的擴增產物，在本申請中也稱為半擴增子。第一類引物中的可變序列還可以與半擴增子配對結合，並以半擴增子為範本進行複製，得到5’端為通用序列而3’端為通用序列的互補序列的擴增產物，在本申請中也稱為全擴增子。第二類引物可以結合全擴增子中的3’端的通用序列的互補序列，從而進一步複製該全擴增子，使其數量大大增加。
通用序列在本申請中是指位於第一類引物5’端的特定
序列。通用序列的長度可以是例如，10-30、12-29、15-28、18-26或20-24個鹼基。在本申請中，選擇適當的通用序列，使得基本上不會與基因組DNA結合產生擴增，並且避免第一類引物與第一類引物之間，或者第一類引物與第二類引物之間的聚合。
在某些實施方式中，通用序列中僅包含三類或兩類自身互補配對能力較弱的鹼基，而不含有另一種或兩種鹼基。在某些實施方式中，通用序列由G、A和T三種鹼基組成，即通用序列中不含有C鹼基。在某些實施方式中，通用序列由C、A和T三種鹼基組成，即通用序列中不含有G鹼基。在某些實施方式中，通用序列由A和T、A和C、A和G、T和C或T和G兩種鹼基組成，即通用序列中不同時含有G和C鹼基。不希望受理論限制，但認為通用序列中如果含有C或G鹼基可能會導致引物與引物之間的相互聚合，產生多聚體，從而削弱對基因組DNA的擴增能力。優選地，通用序列中不具有自身配對的序列，或者會導致引物與引物之間配對的序列，或者連續多個同種的鹼基。
在某些實施方式中，可以選擇適當的通用序列的鹼基序列以及其中各鹼基的比例，以確保通用序列本身不與基因組DNA範本序列發生鹼基配對或產生擴增。
在某些實施方式中，所述通用序列選自下組：SEQ ID NO：1(GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG)、SEQ ID NO：2(GTGGAGTTAGTGAGTGTAATGGAT)、SEQ ID NO：3
(GGTTTGGTGTGGTGTGTGGTGGTG)、SEQ ID NO：4(ACAACACTATCAATCCCTATCCTAC)、SEQ ID NO：5(ATGGTAGTGGGTAGATGATTAGGT)、SEQ ID NO：6(CATATCCCTATACCTAATACCATTAC)。
在第一類引物的5’端為通用序列，3’端為可變序列。通用序列和可變序列可以是直接相鄰的，或者也可以具有一個或多個鹼基的間隔序列。可變序列在本申請中是指序列不固定的一段鹼基序列，例如可以包含隨機序列。隨機序列可以包含任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸，例如A、T、G、和C四種天然鹼基以及本領域技術人員公知的其他核苷酸類似物、修飾核苷酸等，只要能夠與基因組DNA配對並實現擴增反應即可。可變序列中的核苷酸序列可以有多種的變化可能。因此，第一類引物可以包含一組序列不同的引物，其中每一個引物都具有位於5’端的通用序列，以及位於3’端的可變序列，這些引物中的通用序列都相同，但是可變序列可能各不相同。
可變序列可以具有適當的長度，例如2-20個鹼基、2-19個鹼基、2-18個鹼基、2-17個鹼基、2-16個鹼基、2-15個鹼基、2-14個鹼基、2-13個鹼基、2-12個鹼基、2-11個鹼基、2-12個鹼基、2-11個鹼基、2-10個鹼基、2-9個鹼基、2-8個鹼基、3-18個鹼基、3-16個鹼基、3-14個鹼基、3-12個鹼基、3-10個鹼基，4-16個鹼基、4-12個鹼基、4-9個鹼基、或5-8個鹼基。在某些實施方式中，可變序列的長度為5個鹼基。在某些實施方式中，可
變序列的長度為8個鹼基。理論上來說，如果每個鹼基位置都從A、T、G、C四種鹼基中隨機選擇的話，那麼長度為4個鹼基的可變序列可以組合出256種可能的隨機序列，長度為5個鹼基的可變序列可以組合出1024種可能的隨機序列，以此類推。這些可變序列可以與基因組DNA上的不同位置的對應序列互補配對，從而在基因組DNA的不同位置開始複製。
可以通過隨機的方式選擇可變序列，也可以在隨機的基礎上進一步增加某些限定條件，從而排除一些不希望的情況或者增加與目標基因組DNA的匹配程度。在某些實施方式中，可變序列中的三個或三個以上的鹼基位置由選自G、A、和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為C)，或者由C、A和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為G)，以避免可變序列與通用序列產生互補配對。在一些實施方式中，當通用序列不含有G但含有C時，可變序列中的三個或三個以上的鹼基位置由C、A和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為G)。在一些實施方式中，當通用序列不含有C但含有G時，可變序列中的三個或三個以上的鹼基位置由G、A、和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為C)。在一些實施方式中，當通用序列不含有C也不含有G時，可變序列中的三個或三個以上的鹼基位置選自G、A、和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為C)或者由C、A和T的一種或幾種鹼基組成(即，不為G)。所述三個或三個以上的鹼基可以位於可變序列的3’
端，或者也可以位於可變序列的中間部分。所述三個或三個以上的鹼基可以是連續的或者也可以是不連續的，例如，可變序列的3’端的三個相鄰鹼基均不為C，或者可變序列3’端的三個相互間隔的鹼基不為C，或者可變序列3’端的某兩個連續鹼基以及另一個與之間隔的鹼基不為C。當所述三個鹼基位置連續時，其可以為以下的示例性的序列：TTT、GGG、TTG、GAA或ATG。
在某些實施方式中，可變序列選自下組：(N)nGGG、(N)nTTT，(N)mTNTNG，和(N)xGTGG(N)y，其中其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的隨機的核苷酸，n是選自3-17的正整數，m是選自3-15的正整數、x和y分別是選自3-13的正整數。在某些實施方式中，所述第一類引物中的可變序列可以具有(N)nGGG、(N)nTTT，(N)mTNTNG，(N)xGTGG(N)y中的一種或多種序列。在某些實施方式中，可變序列選自下組：SEQ ID NO：7(NNNNNGGG)，SEQ ID NO：8(NNNNNTTT)，SEQ ID NO：9(NNNTNTNG)，SEQ ID NO：10(NNNGTGGNN)。
在某些實施方式中，還可以通過統計計算，選擇在基因組上分佈更加均勻，覆蓋度更高的可變序列，從而增加可變序列與基因組DNA的識別機會。
在某些實施方式中，第一類引物可以包含SEQ ID NO：11[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、SEQ ID NO：12[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、SEQ ID NO：13[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、SEQ ID NO：
14[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]或SEQ ID NO：15[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]，其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸(例如，A、T、G、C)。
反應混合物中的第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。第二類引物的5’端和3’端可以含有或不含有其他額外的序列。在某些實施方式中，第二類引物的序列由第一類引物中的通用序列組成。在某些實施方式中，第二類引物從5’到3’包含或者由SEQ ID NO：1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]的序列組成。
在一些實施方式中，引物在反應混合物中的濃度為300ng-1500ng/μL。在一些實施方式中，引物在反應混合物中的濃度為300ng-1400ng/μL、300ng-1200ng/μL、300ng-1000ng/μL、300ng-800ng/μL、300ng-600ng/μL或300ng-400ng/μL。在一些實施方式中，引物在反應混合物中的濃度為500ng-1400ng/μL、600ng-1400ng/μL、800ng-1400ng/μL、900ng-1400ng/μL、1000ng-1400ng/μL或1200ng-1400ng/μL。在一些實施方式中，引物在反應混合物中的濃度為400ng-1400ng/μL、500ng-1200ng/μL、600ng-1000ng/μL或700ng-800ng/μL。
反應混合物還包括DNA擴增所需的其他組分，例如核酸聚合酶、核苷酸單體混合物、以及酶活性所需的適當
的金屬離子和緩衝液成分等。至少一種或多種這些成分可以使用本領域已知的試劑。
核酸聚合酶在本申請中是指能夠合成新的核酸鏈的酶。任何適用於本申請方法的核酸聚合酶都可以使用。優選使用DNA聚合酶。在某些實施方式中，本申請的方法使用熱穩定的核酸聚合酶，例如那些在PCR擴增的溫度下(例如95攝氏度)聚合酶活性不會下降或者下降小於1%、3%、5%、7%、10%、20%、30%、40%或者50%的那些核酸聚合酶。在某些實施方式中，本申請的方法使用的核酸聚合酶具有鏈置換活性。本申請所述的“鏈置換活性”是指核酸聚合酶的一種活性，其能夠使得核酸範本和與其配對結合的互補鏈分離，並且這種分離以從5’到3’的方向進行並伴隨著新的與範本互補的核酸鏈的生成。具有鏈置換能力的核酸聚合酶及其應用是本領域已知的，例如可以參見美國專利U.S.5824517，該專利的全部內容通過引用併入本申請。適合的核酸聚合酶包括，但不限於：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Bst 2.0 DNA聚合酶、Pyrophage 3137、Vent聚合酶(例如Thermococcus litoralis的Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、Deep Vent(-exo)聚合酶)、TOPOTaq DNA聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反轉錄酶、AMV反轉錄酶、HIV反轉錄酶、T7 phase DNA聚合酶變種(缺少3’-5’外切酶活性)、Phusion®超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、Psp GBD(exo-
)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶(全長)、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶中的一種或多種。
在某些實施方式中，反應混合物中含有Thermococcus litoralis的Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、或Deep Vent(-exo)聚合酶中的一種或多種。在某些實施方式中，反應混合物中含有Thermococcus litoralis的Vent聚合酶。Thermococcus litoralis的Vent聚合酶是指分離自Thermococcus litoralis的天然的聚合酶。在某些實施方式中，反應混合物中含有Deep Vent聚合酶。Deep Vent聚合酶是指分離自Pyrococcus species GB-D的天然的聚合酶。在某些實施方式中，反應混合物中含有Vent(-exo)聚合酶。Vent(-exo)聚合酶是指將Thermococcus litoralis的Vent聚合酶進行過D141A/E143A基因改造的酶。在某些實施方式中，反應混合物中含有Deep Vent(-exo)聚合酶。Deep Vent(-exo)聚合酶是指對Deep Vent聚合酶進行過D141A/E143A基因改造的酶。本申請中所述的各種Vent聚合酶可以從商業途徑獲得，例如從New England Biolabs公司獲得。
反應混合物中還可以包括核酸聚合酶發揮酶活性所需的適當的金屬離子(例如，適當濃度的Mg2+離子(例如終濃度可以為約1.5mM到約8mM)，核苷酸單體混合物(例如dATP、dGTP、dTTP、和dCTP)、牛血清白蛋白(BSA)、dTT(例如終濃度可以為約2mM到約7
mM)、純水等。
在某些實施方式中，反應混合物中還可以進一步包括pH調節劑，使得反應混合物的PH值維持在7.0-9.0之間。適當的pH調節劑可以包括，例如Tris HCl和Tris SO4。在某些實施方式中，反應混合物中還可以進一步包括一種或多種其他成分，例如DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、Cl-、K+、Ca2+、Na+、和/或(NH4)+等。
本申請提供的方法的特點之一在於，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所述反應混合物。由於反應混合物的配置在進行溫度迴圈程式之前全部完成，只要進入溫度迴圈程式，反應混合物就可以按照預定的設置進行反應，無需再開蓋或者增加任何組分，從而避免污染而且提高反應效率。在一些實施方式中，在所述步驟(a)完成之後無需再向所述反應混合物中添加反應物，例如酶，引物和dNTP。。在一些實施方式中，在所述步驟(b)之前完成提供所述反應混合物。在一些實施方式中，在所述步驟(b)開始之後不再向所述反應混合物中添加反應物，例如酶，引物和dNTP。在一些實施方式中，所述步驟(a)在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前。
本申請提供的方法包括步驟(b)：將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序
列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列。
“擴增”在本申請中是指，在核酸聚合酶的作用下，在引物的3’端添加與核酸範本互補的核苷酸，從而合成得到與核酸範本鹼基互補的新的核酸鏈。可以使用適合的擴增核酸的方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)，或其他適合的擴增方法。這些方法都是本領域已知的，可以參見例如美國專利U.S.4,683,195和U.S.4,683,202，以及Innis等人"PCR protocols：a guide to method and applications" Academic Press,Incorporated(1990)和Wu等人(1989)Genomics 4：560-569，這些文獻和專利的全部內容通過引用併入本申請。
在擴增過程中，將反應混合物置於適當的溫度迴圈程式，使得DNA範本雙鏈解開成單鏈、引物與範本單鏈雜交、和引物延伸。因此，溫度迴圈程式通常包括：變性或解鏈溫度，在該溫度下DNA範本雙鏈解開成單鏈；退火溫度，在該溫度下引物與DNA範本單鏈特異性雜交；以及延伸溫度，在該溫度下DNA聚合酶在引物的3’端添加與DNA範本鹼基互補的核苷酸，使得引物得以延長，得到與DNA範本互補的新的DNA鏈。新合成的DNA鏈在下一個反應迴圈中又可以作為新的DNA範本，進行新一輪的DNA合成。
在本申請方法的步驟(b)中，將反應混合物置於第
一溫度迴圈程式，使得反應混合物中的第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA通過鹼基配對結合，在核酸聚合酶的作用下複製基因組DNA。
在第一溫度迴圈程式中，首先將反應混合物置於能夠打開所述基因組DNA的雙鏈的溫度程式(步驟(b1))。為確保基因組DNA雙鏈完全解開成單鏈(即，變性/解鏈)，可以使用較高的反應溫度例如90℃-95℃，並且可以保持較長的反應時間。在某些實施方式中，步驟(b1)中的溫度程式包括在介於90-95℃之間的溫度反應1-10分鐘。
然後，將反應混合物置於能夠使所述第一類引物與DNA單鏈範本結合的溫度程式(步驟(b2))。在這個溫度程式中，第一類引物中的可變序列與基因組DNA中的不同位置的互補序列通過鹼基互補結合(即，退火)，並由此在基因組DNA的不同位置開啟複製。由於第一類引物中的可變序列各不相同，其中的鹼基比例、序列都存在差異，因此每個可變序列與基因組DNA結合的最佳溫度也存在較大的差別。這樣，在某個特定的退火溫度下，可能只有一部分的引物能夠很好地與基因組DNA結合，而另一部分引物與基因組DNA的結合可能並不理想。在某些實施方式中，所述步驟(b2)包括將所述反應混合物置於多於一種溫度的程式，以促使所述第一類引物充分與所述DNA範本有效結合。例如，可以將DNA變性的反應混合物快速降溫至低溫，例如約5℃-10℃，再通過梯度升
溫的方式，使得反應混合物分別在不同的退火溫度下反應適當的時間，從而確保盡可能多的引物與基因組DNA配對結合。在某些實施方式中，步驟(b2)包括在介於5-10℃之間的第一退火溫度(例如10℃)反應適當的時間(例如3-50秒)，在介於25-30℃之間的第二退火溫度(例如30℃)反應適當的時間(例如3-50秒)，以及在介於45-50℃之間的第三退火溫度(例如50℃)反應適當的時間(例如3-50秒)。
本領域公知，引物的退火溫度通常不會比引物Tm值低5℃以上，而過低的退火溫度會導致引物與引物之間發生非特異性結合，從而導致出現引物聚合體以及非特異性擴增產物。因此，通常在引物退火溫度中不會使用如5℃-10℃這樣的低溫。但是，本申請的發明人意想不到地發現，即使從低溫(例如5℃-10℃)開始梯度升溫，引物與基因組DNA之間的配對仍然能夠保持很好的特異性，擴增結果仍然保持非常低的變異性，表明擴增的結果準確可靠。同時，由於引物退火溫度覆蓋了低溫的情況，因此可以確保更廣範圍的引物序列與基因組DNA的結合，從而能夠提供更好的基因組覆蓋率和擴增深度。
在引物退火的溫度程式後，將所述反應混合物置於能夠使與DNA單鏈範本結合的第一類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式，以產生擴增產物(步驟(b3))。延伸溫度通常與DNA聚合酶的最適溫度相關，本領域技術人員可以根據具體的反應混合物進行具體
的選擇。在某些實施方式中，在反應混合物中的DNA聚合酶可以具有鏈置換活性，這樣，如果引物在延伸的過程中遇到與下游範本結合的引物或擴增子，DNA聚合酶的鏈置換活性可以使這些下游結合的引物與範本鏈分開，從而確保延伸中的引物可以繼續延伸，以得到較長的擴增序列。具有鏈置換活性的DNA聚合酶包括但不限於，例如，phi29 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、SEQUENASE 1.0和SEQUENASE 2.0。在某些實施方式中，在反應混合物中的DNA聚合酶是熱穩定的DNA聚合酶。熱穩定的DNA聚合酶包括但不限於，例如，Taq DNA聚合酶、OmniBaseTM序列酶、Pfu DNA聚合酶、TaqBeadTM暖開機聚合酶、Vent DNA聚合酶(例如Thermococcus litoralis的Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、Deep Vent(-exo)聚合酶)、Tub DNA聚合酶、TaqPlus DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。在某些實施方式中，反應混合物中的DNA聚合酶可以是熱穩定並且具有鏈置換活性的DNA聚合酶。在某些實施方式中，在反應混合物中的DNA聚合酶選自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pyrophage 3137、Vent聚合酶(例如Thermococcus litoralis的Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、DeepVent(-exo)聚合酶)、TOPOTaq DNA聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反轉錄酶、AMV反轉錄酶、HIV反轉錄酶、T7 phase DNA聚合酶變
種(缺少3’-5’外切酶活性)、Phusion®超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bst DNA聚合酶(全長)、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶中的一種或多種。在某些實施方式中，步驟(b3)包括在介於60-90℃之間的延伸溫度(例如，65-90℃、70-90℃、75-90℃、80-90℃、60-85℃、60-80℃、60-75℃、或60-70℃)反應1-15分鐘(例如，1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-14、3-14、5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14、或13-14分鐘)。在某些實施方式中，步驟(b3)包括在70℃反應2分鐘。
引物延伸程式後，將所述反應混合物置於能夠使所述擴增產物脫落成單鏈的溫度程式(步驟(b4))。該步驟中的溫度可以與步驟(b1)中的溫度相近，但反應時間略短。在某些實施方式中，步驟(b4)包括在90-95℃的溫度之間反應10-50秒。這時的反應混合物中的DNA單鏈不僅包含原始的基因組DNA單鏈，也包含擴增得到的新合成的DNA單鏈，兩者都可以作為下一個迴圈中的DNA範本，與引物結合並開啟下一輪的複製。
然後重複步驟(b2)到(b4)至指定的第一迴圈次數，以獲得基因組擴增產物。第一迴圈次數應至少為2。在第一次迴圈時，第一類引物的可變序列的3’端的序列得以延長，得到的擴增產物在5’端為通用序列，3’端為與基因組範本單鏈序列互補的序列，這樣的擴增產物也稱為半
擴增子。在第二次迴圈時，之前的擴增產物本身也可以作為DNA範本與第一類引物中的可變序列結合，引物在核酸聚合酶的作用下向擴增產物的5’端延伸，直到複製完擴增產物5’末端的通用序列，由此得到在5’端為通用序列，3’端為通用序列的互補序列的基因組擴增產物，這樣的擴增產物也稱為全擴增子。
在某些實施方式中，將第一迴圈的次數控制在適當的範圍內，以確保既有足夠的擴增產物用於後續的反應，又不會因為迴圈次數過多影響擴增產物的準確度。例如，第一迴圈次數次數至少為3、至少為4、至少為5、或至少為6，並且最好不超過8、不超過9、不超過10、不超過11、或不超過12。如果迴圈次數過低，則得到的擴增產物少，為獲得足夠的擴增產物，就需要在下一次擴增(即步驟(c))中增加迴圈次數，這樣會降低擴增結果的準確性。而如果迴圈次數過高，則會導致在基因組DNA的擴增過程中出現變異的序列，使得下一次擴增(即步驟(c))的範本中出現偏差，導致最終的擴增結果不準確。
在某些實施方式中，在步驟(b)中，在步驟(b4)後進一步包括包括步驟(b4’)，其中將所述反應混合物置於適當的溫度程式，使得所述基因組擴增產物的3’端與5’端雜交結合以形成環狀結構，或者使所述基因組擴增產物的3’端與引物結合。此前認為，步驟(b4’)能夠將全擴增子的3’末端保護起來，從而避免全擴增子之間發生首
尾聚合，從而避免將兩個原本在基因組上不相鄰的序列結合在一起。這將有助於提高擴增結果的準確性。
在某些實施方式中，所述方法在步驟(b4)後不經其他步驟(例如步驟(b4’))而直接到步驟(b5)。這樣，全擴增子並未經過特定的步驟以避免首尾聚合的情況，因此，理論上，這樣的擴增結果應該在準確性上存在一定的缺陷。但是，意想不到的是，在本申請的方法中，即使在步驟(b4)後不經特定的步驟使全擴增子成環或者3’端與引物結合，最終的擴增結果仍然具有相當高的準確度，與使用步驟(b4’)的方法相比效果差不多。這精簡了反應步驟，同時仍然保持了反應的特異性。
在步驟(b)中，反應體系中不僅存在第一類引物，而且還存在第二類引物。第二類引物包含第一類引物中的通用序列。由於通用序列基本上不與基因組序列互補，因此如果擴增反應的特異性足夠高，那麼在步驟(b)中第二類引物不會直接與基因組DNA發生配對並開啟基因組DNA的複製。但是，當步驟(b)進行了兩個迴圈時，反應混合物中開始出現在3’端具有通用序列互補序列的全擴增子，而這樣的全擴增子的3’端能夠與第二類引物通過鹼基配對，因此有可能導致第二類引物在步驟(b)中(例如從第三個迴圈開始)就開始對全擴增子進行複製。這有可能會干擾第一類引物對基因組DNA複製，使得第一類引物對基因組DNA的擴增不夠充分，達不到期望的對基因組DNA的覆蓋範圍。此外，當第一類引物和第二類引
物同時存在於反應體系中時，有可能第一類引物與第二類引物發生與範本無關的引物-引物擴增反應，導致引物多聚體的產生。但是出乎意料的是，即使存在上述這些不確定的因素，本申請的發明人意想不到地發現，在第一類引物與第二類引物同時存在於反應混合物中並且都能進行擴增反應的情況下，第一類引物似乎並不受第二類引物的干擾，對基因組DNA的擴增仍然保持了較高的特異性以及較廣的覆蓋度，並且與在步驟(b)中單獨使用第一類引物然後在步驟(c)中額外添加第二類引物的方法相比，得到的結果在總體上相當。
本申請提供的方法還包括步驟(c)：將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物。
由於步驟(b)得到的基因組擴增產物，即全擴增子，在3’端具有通用序列的互補序列，因此可以與第二類引物的通用序列互補，在核酸聚合酶的作用下，第二類引物延伸，複製全擴增子的全長。
在第二溫度迴圈程式中，首先將反應混合物置於能夠打開DNA雙鏈的溫度程式(步驟(c1))。這裡的DNA雙鏈主要是指在步驟(b)中得到的基因組擴增產物(即
全擴增子)的雙鏈。雖然此時的反應混合物中仍然存在原始的基因組DNA，但由於第二類引物基本上不與基因組DNA配對結合，因此原始的基因組DNA並不是步驟(c)中的待擴增的DNA範本。可以使用較高的反應溫度例如90℃-95℃反應適當的時間，只要待擴增的全擴增子雙鏈能夠變性成為單鏈即可。在某些實施方式中，步驟(c1)中的溫度程式包括在介於90-95℃之間(例如94℃)的解鏈溫度反應10-30秒(例如20秒)。在某些實施方式中，在第一溫度迴圈程式結束以後但是在第二溫度迴圈程式開始之前，進一步包括將反應混合物置於能夠打開DNA雙鏈的溫度反應足夠的時間。這將有助於確保範本DNA雙鏈全部變性成單鏈。
在步驟(c1)以後，將反應混合物置於能夠使所述第二類引物與步驟(b)獲得的基因組擴增產物的單鏈結合的溫度程式(步驟(c2))。根據第二類引物中的鹼基組成，可以計算出第二類引物的Tm值，並基於該Tm值找出對於第二類引物的適合的退火溫度。在某些實施方式中，步驟(c2)中的溫度程式包括在介於45-65℃之間的退火溫度(例如58℃)反應10-30秒(例如15秒)。在某些實施方式中，第二類引物為SEQ ID NO：1，且步驟(c2)中的溫度程式包括在58℃反應10-30秒。在某些實施方式中，步驟(c2)中的退火溫度高於在步驟(b2)中的退火溫度。在步驟(c2)時，反應混合物可能仍然含有在步驟(b)中未反應的第一類引物，這些第一類引物中
的可變序列可能與步驟(c1)中得到的DNA單鏈範本配對結合，從而產生不完整的擴增序列。當步驟(c2)中的退火溫度高於第一類引物適合的退火溫度時，可以減少或避免第一類引物與DNA單鏈範本結合，從而選擇性地允許第二類引物進行擴增。
在引物退火完成以後，將所述反應混合物置於能夠使與所述擴增產物單鏈結合的第二類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式。在某些實施方式中，步驟(c3)中所述的溫度程式包括在介於60-80℃之間的延伸溫度(例如72℃)反應1-15分鐘(例如2分鐘)。
可以重複步驟(c1)到(c3)至第二迴圈次數，以獲得所需的擴大的基因組擴增產物。在這個過程中，步驟(b)中得到的基因組擴增產物被進一步複製擴增，數量大大增加，以提供足夠的基因組DNA序列用於後續的研究或操作。在某些實施方式中，步驟(c4)中的所述第二迴圈次數大於所述步驟(b5)中的第一迴圈次數。在某些實施方式中，將第二迴圈的次數控制在適當的範圍內，使得其既能夠提供足夠量的DNA，又不會因為過多的迴圈數而影響擴增的準確度。在某些實施方式中，第二迴圈次數為15-30個迴圈(例如，15-30個、15-28個、15-26個、15-24個、15-22個、15-20個、15-18個、15-17個、16-30個、17-30個、18-30個、20-30個、22-30個、24-30個、26-30個、28-30個迴圈)。
在某些實施方式中，步驟(c)進一步包括在第二溫
度迴圈程式以後，將反應混合物置於與步驟(c3)相同的溫度程式(例如72℃)反應適當的時間(例如5分鐘)。然後將反應混合物置於4℃的溫度下以結束反應。在某些實施方式中，步驟(c)反應結束後直接將反應混合物置於4℃的溫度下以結束反應。
在某些特定的實施方式中，本申請還提供了一種擴增細胞基因組的方法，所述方法包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；其中所述第一溫度迴圈程式包括：(b1)在介於90-95℃的溫度之間的第一變性溫度反應1-10分鐘；(b2)介於5-10℃之間的第一退火溫度反應3-50秒，介於25-30℃之間的第二退火溫度反應3-50秒，
和介於45-50℃之間的第三退火溫度反應3-50秒；(b3)在介於60-90℃之間的第一延伸溫度反應1-15分鐘；(b4)在介於90-95℃的第一解鏈溫度之間反應10-50秒；(b5)重複步驟(b2)到(b4)至6-9個迴圈；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物；其中所述第二溫度迴圈程式包括：(c1)在介於90-95℃之間的第二變性溫度反應1-10分鐘；(c2)在介於90-95℃之間的第二解鏈溫度反應10-30秒；(c3)在介於45-65℃之間的第四退火溫度反應10-30秒；(c4)在介於60-80℃之間的第二延伸溫度反應1-15分鐘；(c5)重複步驟(c2)到(c4)5-30個迴圈；(d)獲得所述步驟(c)得到的擴增產物；其中，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所述反應混合物。
在某些實施方式中，在步驟(a)的反應混合物中的
基因組DNA存在於細胞內部，即：反應混合物含有細胞，而在細胞中包含了待擴增的基因組DNA。在某些實施方式中，在步驟(a)的反應混合物含有細胞，而且還進一步包含能夠裂解細胞的成分，例如表面活性劑和/或裂解酶等。可以使用適當的表面活性劑，例如NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、異硫氰酸胍中的一種或多種。也可以選擇適當的裂解酶，例如蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或多種。在這樣的實施方式中，上述擴增細胞基因組的方法在步驟(a)之後以及步驟(b)之前進一步包括將所述反應混合物置於裂解溫度迴圈程式(例如將反應混合物置於50℃ 20分鐘，然後置於80℃ 10分鐘)，使得所述細胞裂解並釋放出所述基因組DNA。這樣，整個擴增反應實際上是將裂解細胞和擴增基因組都發生在同一個反應混合物中，通過將該反應混合物置於不同的溫度迴圈程式中完成。這大大簡化了操作步驟，避免了多次操作樣品而帶來的污染的風險，而且在擴增結果上同樣能夠實現很好的擴增特異性和低變異性。
在某些實施方式中，第一類引物包含或者由SEQ ID NO：11、12、13、14、和/或15組成，其中的通用序列包含或由SEQ ID NO：1組成。
本申請提供的方法與現有技術中的方法相比具有多種優勢。
一方面，本發明在熱迴圈條件下將核酸的預擴增、擴增等步驟組合成一個反應。這一反應減少了人為操作，將核酸放入PCR管內並執行特定的程式即可實現核酸的全基因組擴增，擴增產物基因組覆蓋程度高，擴增偏差小。省去了試劑配製，開蓋加液等操作，減少了實驗環境和操作人員帶來的污染風險，同時縮短整體實驗時間週期，整體擴增時間僅需2.5小時。
另一方面，本發明還可以在熱迴圈條件下將細胞裂解、核酸的預擴增、擴增等步驟組合成一個反應。這又進一步減少了人為操作，省去了單獨進行細胞裂解的步驟，進一步縮短實驗時間和降低污染的風險。
本申請的方法在簡化操作的基礎上還保持了擴增的高準確性和廣覆蓋程度。本申請的方法使用準線性擴增技術，減少序列依賴的擴增偏倚性。在預擴增中，側重於從原始的樣品DNA範本擴增，並且基因組覆蓋度高，擴增偏差小。預擴增階段產生的全擴增子在擴增階段被大量的擴增。該技術擴增過程產量高，最低起始範本幾個皮克，結果可靠，可重複。
在某些實施方式中，本申請方法擴增得到的產物可以進一步用於進行測序，如進行全基因測序。由於各種測序分析平臺如新一代測序(NGS)，基因晶片(Microarray)，螢光定量PCR等均對待分析樣本的起始
量有較高的要求(100ng以上)，因此如需要從單個人類細胞(6pg左右)或者少量起始量的樣本中得到足量用於分析的核酸物質，則需要進行全基因組擴增。可以通過本申請的方法對生物樣品(例如單細胞)中的基因組DNA進行擴增，再通過本領域適當的測序方法對擴增得到的產物進行測序。示例的測序方法包括，雜交測序法(SBH)、連接酶測序法(SBL)、定量增量螢光核酸增加測序法(QIFNAS)、逐步連接和切割法、分子信標法、焦磷酸測序法、原位螢光測序法(FISSEQ)、螢光共振能量轉移法(FRET)、多重測序法(美國專利申請12/027039；porreca等人(2007)NAT.Methods 4：931)、聚合群體(POLONY)測序法(U.S.6,432,360、U.S.6,485,944和PCT/US05/06425)、擺動測序法(PCT US05/27695)、TaqMan報告分子探針消化法、微粒滾動迴圈測序法(ROLONY)(美國專利申請12/120541)、FISSEQ小珠法(U.S.7,425,431)、和等位基因特異的寡核苷酸連接分析法等。
在某些實施方式中，可以以高通量的方法實現對本申請方法的擴增產物的測序。高通量的方法通常將待測序的核酸分子片段化(例如通過酶解或機械剪切等方式)，以形成大量的長度為幾十bp到幾百bp的短片段。通過在一次測序反應中平行地對幾萬個、幾十萬個、幾百萬個、幾千萬個、甚至上億個這樣的短片段測序，可以大大提高測序的通量、縮短測序所需的時間。將測得的短片段的序列
通過軟體進行資料處理，可以拼接成完整的序列。本領域已知多種高通量測序平臺，例如Roche 454、Illumina Solexa、AB-SOLiD、Helicos、Polonator平臺技術等。本領域還已知多種基於光的測序技術，例如可以參見Landegren等人(1998)Genome Res.8：769-76、Kwok(2000)Pharmacogenomics 1：95-100和Shi(2001)Clin.Chem.47：164-172中描述的那些。
在某些實施方式中，本申請方法擴增得到的產物還可以用於對基因組DNA中的基因型或遺傳多態性進行分析，例如單核苷酸多態性(SNP)分析、短串聯重複序列(STR)分析、限制性片段長度多態性(RFLP)分析、可變數目串聯重複序列(VNTRs)分析、複雜重複序列(CTR)分析、或微衛星分析等，例如可以參考Krebs,J.E.,Goldstein,E.S.和Kilpatrick,S.T.(2009).Lewin’s Genes X(Jones & Bartlett Publishers)，其公開內容通過引用整體併入本申請。
在某些實施方式中，本申請的方法得到的擴增產物還可以用於醫學分析和/或診斷分析。例如，可以對個體的生物樣品用本申請的方法進行擴增，分析擴增產物中在感興趣的基因或DNA序列中是否存在突變、缺失、插入或染色體之間的融合等異常情況，從而評估該個體患上某種疾病的風險、疾病的進展階段、疾病的基因分型、疾病的嚴重程度、或者該個體對某種療法反應的可能性。可以使用本領域已知的適當的方法對感興趣的基因或DNA序列
進行分析，例如但不限於，通過核酸探針雜交、引物特異性擴增、對感興趣的序列測序、單鏈構象多態性(SSCP)等。
在某些實施方式中，本申請的方法可以用於比較來源於不同單細胞的基因組，特別是來自於同一個體的不同單細胞。例如，當同一個體的不同單細胞的基因組之間存在差異時，例如腫瘤細胞和正常細胞之間，可以使用本申請的方法分別擴增不同單細胞的基因組DNA，並對擴增產物進行進一步的分析，例如，通過測序分析和比較，或者進行比較基因組雜交(CGH)分析。可以參考Fan,H.C.,Wang,J.,Potanina,A.,and Quake,S.R.(2011).Whole-genome molecular haplotyping of single cells.Nature Biotechnology 29,51-57.以及Navin,N.,Kendall,J.,Troge,J.,Andrews,P.,Rodgers,L.,McIndoo,J.,Cook,K.,Stepansky,A.,Levy,D.,Esposito,D.,et al.(2011).Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.Nature 472,90-94，其公開內容通過引用整體併入本申請。
在某些實施方式中，本申請的方法可以用於識別在同源染色體中的單倍體結構或單倍體基因型。單倍體基因型是指同一單倍體的染色體上共同遺傳的多個基因座上等位元基因的組合。可以將生物樣品(例如來自個體的二倍體的單細胞)分成足夠多的部分，以使得同源的兩個單倍體上的DNA序列在統計學意義上被分隔到不同的部分中。
每一個部分配置成一個反應混合物，對每一個反應混合物通過本申請的方法進行DNA擴增，然後將擴增產物進行序列分析，並與參照的基因組序列(例如公開的人的標準基因組序列，請參見：International Human Genome Sequencing Consortium,Nature 431,931-945(2004))進行比對，以識別其中的單核苷酸突變情況。如果沒有現成的參照基因組序列，也可以通過從頭基因組組裝(de-novo genome assembly)的方法從基因組的多個片段序列組裝得到適當長度的一段區域以供比較。
在某些實施方式中，本申請的方法擴增得到的產物可以進一步用於基因克隆、螢光定量PCR等分析。
在某些實施方式中，本申請的方法還可以進一步包括分析所述擴增產物以識別與疾病或表型相關的序列特徵。在一些實施方式中，分析所述擴增產物包括對DNA擴增物的基因型分析。在另一些實施方式中，分析所述擴增產物包括識別DNA擴增物的多態性，如單核苷酸多態性分析(SNP)。SNP可以通過一些眾所周知的方法進行檢測，例如寡核苷酸連接測定法(OLA)、單鹼基延生法、等位基因特異性引物延伸法、錯配雜交法等。可以通過比對SNP與已知疾病表型的關係來診斷疾病。
在一些實施方式中，所述與疾病或表型相關的序列特徵包括染色體水準異常、染色體的異位、非整倍體、部分或全部染色體的缺失或重複、胎兒HLA單倍型和父源突變。
在一些實施方式中，所述疾病或表型可以是β-地中海貧血、唐氏綜合征、囊性纖維化、鐮狀細胞病、泰-薩克斯病、脆性X綜合征、脊髓性肌萎縮症、血紅蛋白病、α-地中海貧血、X連鎖疾病(由在X染色體上基因主導的疾病)、脊柱裂、無腦畸形、先天性心臟病、肥胖、糖尿病、癌症、胎兒性別、或胎兒RHD。
在本申請的另一方面還提供了可用于基因組DNA擴增的試劑盒，其中包括含有第一類引物和第二類引物的混合物，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。
在某些實施方式中，其中所述混合物進一步包括核苷酸單體混合物(例如dATP、dGTP、dTTP、和dCTP)、dTT和Mg2+。在某些實施方式中，所述混合物的Mg2+濃度介於2mmol-8mmol/μL，dNTP濃度介於1mmol-8mmol/μL，dTT濃度介於2mmol-7mmol/μL。在某些實施方式中，所述混合物進一步包括一種或多種選自下組的成分：牛血清白蛋白(BSA)、pH調節劑(例如Tris HCl)、DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、Cl-、K+、Ca2+、Na+、和/或(NH4)+等。在某些實施方式中，所述混合物的
pH值範圍介於7.0-9.0之間。
在某些實施方式中，試劑盒進一步包括核酸聚合酶，且所述核酸聚合酶不包含在第一類引物和第二類引物的混合物中。在這樣的實施方式中，核酸聚合酶可以存放於單獨的容器中，可選地可以與其他成分組成混合物，或者也可以是以基本上純的形式存在。
在某些實施方式中，所述第一類引物和第二類引物的混合物中進一步包括核酸聚合酶。在某些實施方式中，所述混合物包括：第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、Mg2+、dTT、Tris HCl、和核酸聚合酶，以及一種或多種選自下組的成分：BSA、DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、Cl-、K+、Ca2+、Na+、和(NH4)+等。在這樣的實施方式中，所述混合物可以含有擴增反應所需的除基因組DNA以外的全部反應物。當這樣的混合物用於本申請所述的擴增反應時，可以將含有基因組DNA的反應物與試劑盒中的混合物直接混合，可選地可以加入適量的純水以獲得需要的反應體積，即可獲得本申請方法的步驟(a)中的反應混合物。
在某些實施方式中，試劑盒進一步包括能夠裂解細胞的成分，例如一種或多種表面活性劑，和/或一種或多種裂解酶。示例性的表面活性劑包括，但不限於，NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、異硫氰酸胍中的一種或多種。示例性的裂解酶可以是蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或多種。裂解細胞的成分可以單獨存放
於獨立的容器中，也可以與其他某些成分混合在一起。在某些實施方式中，試劑盒包括表面活性劑和裂解酶，兩者分別置於不同的容器中，或者置於同一個容器中。
在某些實施方式中，所述第一類引物、第二類引物以及核酸聚合酶的混合物中進一步包含表面活性劑和/或裂解酶。
在某些實施方式中，所述試劑盒中包括一個容器，其中包含了所有的反應物。在某些實施方式中，試劑盒中包括兩個容器，其中一個容器存放包括核酸聚合酶在內的在擴增反應中所需的成分，另一個容器存放包括裂解酶在內的在細胞裂解中所需的成分。在某些實施方式中，試劑盒中包括四個容器，其中第一容器存放核酸聚合酶，第二容器存放除核酸聚合酶以外的在擴增反應中所需的成分，第三容器存放裂解酶，第四容器存放除裂解酶以外的在細胞裂解中所需的成分。
在本申請的另一方面還提供了可用于基因組DNA擴增的試劑盒，所述試劑盒包括第一類引物和第二類引物，並且還包括使用說明書，所述使用說明書記載了在開始進行所述擴增之前在同一容器中混合所述第一類引物和所述第二類引物的步驟，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四種鹼基中的三種或者兩種組成，條件是所述通用序列不同時包括G和C，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列。試劑盒中的第一引物和第
二引物可以分別置於不同的容器中，但說明書中可以包括在開始擴增前將兩者混合在同一容器中的步驟。
單細胞基因組DNA：使用胰蛋白酶消化培養狀態良好的人表皮成纖維細胞(AFP)，將消化後的細胞收集進入1.5ml EP管內。將收集的細胞離心並用1x的PBS溶液沖洗。沖洗完成後加入1x的PBS使細胞懸浮。用移液器抽取一部分包含細胞的懸浮液，在10x顯微鏡下使用口吸管挑取單細胞，吸取的PBS溶液體積不超過1微升，並將挑取的單細胞轉移進入包含4微升裂解緩衝液含有Tris-Cl、KCl、EDTA、Triton X-100和Qiagen Protease的PCR管內。短暫離心後將PCR管置於PCR儀上執行裂解程式，具體程式如表1所示。
陽性對照：用無核酸酶水將標準基因組DNA稀釋為30皮克/微升的DNA溶液，取1微升上述溶液加入到含有4微升細胞裂解緩衝液的PCR管中。標準基因組DNA為事先提取好的人類細胞的基因組DNA。
陰性對照：將5微升細胞裂解緩衝液加入到PCR管中。
本實施例的方法在這裡也稱為三步法，因為基本上包括三個步驟，即：裂解細胞、預擴增和指數擴增。
按照實施1所述的方法對人表皮成纖維細胞進行分離和裂解，以獲得單細胞基因組DNA。使用江蘇億康基因科技有限公司的單細胞全基因組擴增試劑盒(貨號YK001A/B)並按照其產品說明書進行擴增。具體而言，按照30：1的比例混合預擴增緩衝液和預擴增酶混合物以形成預擴增混合液。向分別包括待擴增樣品(根據實施例1獲得的基因組DNA、陽性對照和陰性對照)的PCR管內分別加入30微升預擴增混合液。將PCR管放入PCR儀進行預擴增，預擴增的程式如表2所示。
按照30：0.8的比例混合擴增緩衝液和擴增酶混合物以形成擴增混合液。向完成預擴增後的PCR管中加入30微升擴增混合液，之後進行指數擴增，指數擴增的程式如表
3所示。
本實施例的方法在這裡也稱為兩步法，基本上包括兩個步驟，即：裂解細胞和擴增反應。
按照實施1所述的方法對人表皮成纖維細胞進行分離和裂解，以獲得單細胞基因組DNA。
配製擴增混合液，其中含有Na+、Mg2+、Cl-、Tris-Cl、TritonX-100、dNTP、Vent聚合酶、SEQ ID NO：1所示的引物、SEQ ID NO：12所示的引物和SEQ ID NO：13所示的引物。
本實施例中使用的引物根據如下原則設計：
1.在引物的通用序列中僅包含三類自身互補配對能力較弱的鹼基，如G,A,T.
2.在引物可變鹼基序列的3’端(連續或不連續三個及以上鹼基)使用1中提到的三類鹼基中的一種或幾種，保證引物3’端與自身或不同引物的5’端不會產生互補配對的現象。
3.引物可變鹼基序列在基因組上的識別位點經過統計計算，選擇符合上述條件且在基因組上分佈更加均勻，覆蓋度更高的序列，增加可變鹼基序列與基因組DNA的識別機會。
4.引物通用序列中三類鹼基的使用比例及組成方式經過特殊設計，保證通用序列不會與基因組DNA結合產生擴增。分別向每個待擴增樣品(根據實施例1獲得的基因組DNA、陽性對照和陰性對照)的PCR管內加入60微升擴增混合液。將PCR管放入PCR儀進行擴增，擴增的程式如表4所示。
分別取5微升未純化的實施例2的三步法擴增產物和實施例3的兩步法擴增產物，並分別添加1微升6xDNA
加樣緩衝液(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0610A)準備上樣。凝膠使用1%瓊脂糖凝膠，標記物使用DM2000(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0632C)。
電泳圖請參見附圖2，其中a為實施例3的兩步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照(不含基因組DNA)，第18泳道為分子量標記；b為實施例2的三步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照(不含基因組DNA)，第18泳道為分子量標記。電泳圖顯示：實施例3的兩步法擴增產物的條帶和亮度與實施例2的三步法擴增產物的條帶位置相當、亮度相當，沒有顯著的差別，表明兩步法擴增的準確性和得到的產物的產量與三步法的結果相當。
取50微升未純化的實施例2的三步法擴增產物和實施例3的兩步法擴增產物，使用通用柱式純化試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2301)對擴增產物進行純化處理，純化步驟按照試劑盒說明書操作。使用50微升EB洗脫。純化完成後取2微升純化產物使用Nanodrop(AOSHENG，NANO-100)檢測濃度。濃度
檢測結果如表5所示。
濃度檢測結果顯示：兩種擴增方法獲得的擴增產物在純化後的濃度相當，沒有顯著差別。
隨機選取20個致病位點(選擇的位點參見下表)，並設計引物。選取的致病位點及其相應的引物分別如表6和表7所示。
隨機選擇根據實施例2擴增出的7個擴增產物以及根據實施例3擴增出的7個擴增產物分別作為範本DNA。
使用含染料的2xTaq MasterMix(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0682)進行PCR，分別擴增上述20個致病位點。擴增體系組成如表8所示，擴增程式如表9所示。
擴增的結果如圖3所示。擴增結果顯示：兩種方法在擴增的準確性和擴增產物的量上沒有顯著差別。
再次隨機選取另外20個致病位點(選擇的位點參見下表)，並設計引物。選取的致病位點及其相應的引物分別如表10和表11所示。
隨機選擇根據實施例2擴增出的3個樣品(在圖4中
顯示為2_1、2_3和2_7)以及根據實施例3擴增出的3個樣品(在圖4中顯示為3_1、3_4和3_8)分別作為範本DNA，使用含染料的2xTaq MasterMix(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0682)進行PCR擴增，分別擴增上述20個致病位點。擴增體系和擴增程式分別如表8和表9所示，只是退火溫度均選擇55攝氏度。
擴增的結果如圖4所示。擴增結果顯示：20個致病位點在上述兩個擴增方法的擴增產物中均能得到了很好地擴增，兩種方法在擴增的準確性和擴增產物的量上沒有顯著差別。
隨機選擇根據實施例2的三步法擴增出的4個樣品(在圖5中示為3-5、3-6、3-9、3-10)以及根據實施例3的兩步法擴增出的4個樣品(在圖5中示為2-1、2-3、2-7、2-10)分別作為範本DNA。使用如表14所示的6組質檢引物，分別針對不同染色體上的DNA序列，對範本DNA進行q-PCR檢測。在螢光定量PCR中使用2xFastSYBR Mixture(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0955)。擴增體系組成如表12所示，擴增程式如表13所示。
擴增的結果如圖5所示，其中a-f分別表示針對染色體CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH6和CH7上的DNA序列，對範本DNA進行的q-PCR檢測的資料。擴增結果顯示：當用兩步法和三步法的擴增產物作為q-PCR的範本進行q-PCR時得到的Cr值相當，沒有顯著差別，表明q-PCR的起始範本數沒有顯著差別，即兩步法和三步法的擴增產物的量沒有顯著差別。而且6對質檢引物分別驗證了染色體1、2、4、5、6、7上的不同序列，結果都一致顯示兩種起始範本量沒有顯著差別。
隨機選取10個純化後的實施例3的兩步法擴增出的產物(在圖6、圖8和圖9中示為2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10)和10個純化後的實施例2的三步法擴增出的樣品(在圖7、圖8和圖9中示為3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10)，使用打斷方法構建基因組文庫，並採取淺測序的方式使用hiseq2500測序儀進行測序，每個樣品測定1.5Mb的資料量，並將測序得到的序列比對到人類參考基因組(hg19)上。
實施例3的兩步法的結果如圖6所示，實施例2的三步法的結果如圖7所示。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。上述結果表明：實施例2的三步法和實施例3的兩步法對細胞的染色體檢測結果一致。
在測序結果中還提供了高通量測序結果的各個指標參數，如圖8所示。其中原始資料中“唯一比對到人類基因組的資料比例”(即，unique_mapped_of_raw)是最重要的衡量指標，實施例3的兩步法所有樣品的平均unique_mapped_of_raw為74.15%，而實施例2的三步法所有樣品的平均unique_mapped_of_raw為68.5%，這表明實施例3的兩步法擴增樣品的unique_mapped_of_raw的比例顯著高於MALBAC三步法擴增樣品。
拷貝數變異係數可以用來比較兩類擴增方法擴增樣品後樣品拷貝數的離散程度的大小。實施例3的兩步法所有擴增樣品的平均拷貝數變異係數為0.1200，而實施例2的三步法所有擴增樣品的平均拷貝數變異係數為0.1205。兩類擴增方法拷貝數變異係數相比無明顯差別。具體資料參見圖9。
隨機挑選150個SNP位點並設計相應的引物，挑選的位點以及相應引物參見表15。
為了衡量擴增給定位點的效率和等位基因脫扣率(ADO)，以確定擴增效率和擴增是否成功，隨機選取實施例2的三步法的兩個擴增產物(3-1和3-2)，實施例3的兩步法的一個擴增產物(2-1)和人類表皮成纖維細胞(AFP)細胞提取的120ng DNA分別進行多重PCR，引物參見表15。擴增體系的組成如表16所示，擴增程式如表
17所示。
對擴增產物採用打斷建庫方式構建基因組文庫，使用hiseq2500測序儀測序，平均測序深度為5Mb，統計結果參見圖10。多重PCR資料表明：上述三種樣本的擴增產物的GC含量、高品質資料(high_quality_of_raw)、原始資料特定map比率(unique_mapped_of_raw)，以及平均覆蓋度(average depth)等各項指標參數無明顯差距。
此外，二代測序分析結果顯示，以gDNA為起始材料的多重PCR產物中共檢測到純合位點23個，這23個純合位點在實施例2的三步法的兩個擴增產物中分別檢測到23和22個；實施例3的兩步法的擴增產物中檢測到21個，實施例2的擴增產物和實施例3的擴增產物純合位點的ADO比例無顯著差別。具體資料參見表18。
二代測序分析結果顯示，以gDNA為起始材料的多重PCR產物中共檢測到雜合位點62個，這62個雜合位點在實施例2的兩個樣品中分別檢測到59和56個；實施例3的一個樣品中檢測到51個，實施例2的擴增產物和實施例3的擴增產物雜合位點的ADO比例無顯著差別。具體資料參見表19。
本實施例的方法在這裡也稱為一步法，因為其中將裂解細胞、預擴增和指數擴增合併在一個步驟中完成。
按照實施1所述的方法對人表皮成纖維細胞進行分離和裂解，以獲得單細胞基因組DNA。
配製擴增混合液，其中含有Na+、Mg2+、Cl-、Tris-Cl、dNTP、TritonX-100、Vent聚合酶、SEQ ID NO：1所
示的引物、SEQ ID NO：12所示的引物和SEQ ID NO：13所示的引物。
向每個待擴增樣品(根據實施例1製備的陽性對照和陰性對照，以及未裂解的單細胞)的PCR管內加入50微升擴增混合液。將PCR管放入PCR儀進行擴增，擴增的程式如表20所示。
分別取5微升未純化的實施例2的三步法擴增產物和實施例5的一步法擴增產物，並分別添加1微升6xDNA加樣緩衝液(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0610A)準備上樣。凝膠使用1%瓊脂糖凝膠，標記物使用DM2000(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨
號CW0632C)。
電泳圖請參見附圖11，其中第一排為實施例5的一步法擴增結果，自左向右第1泳道為分子量標記，2-11泳道為單細胞擴增樣品，12-14泳道為陽性對照(40pg gDNA)，15-17泳道為陰性對照(不含基因組DNA)，第18泳道為分子量標記。電泳圖顯示：實施例5的一步法擴增產物的條帶和亮度與實施例2的三步法擴增產物的條帶位置和亮度相當，沒有顯著差異。
取50微升未純化的實施例2的三步法擴增產物和實施例5的一步法擴增產物，使用通用柱式純化試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2301)對擴增產物進行純化處理，純化步驟按照試劑盒說明書操作。使用50微升EB洗脫。純化完成後取2微升純化產物使用Nanodrop(AOSHENG，NANO-100)檢測濃度。濃度檢測結果參見表21。
濃度檢測結果顯示：兩種擴增方法獲得的擴增產物在純化後的濃度相當，沒有顯著差異。
隨機選取20個致病位點，並設計引物。選取的致病位點及其相應的引物分別如實施例4中的表6和表7所示。
隨機選擇根據實施例2擴增出的4個樣品以及根據實施例5擴增出的4個樣品分別作為範本DNA，擴增體系組成和擴增程式分別如實施例4中的表8和表9所示，只是圖12(a)和圖12(b)中的迴圈次數為30輪。使用含染料的2xTaq MasterMix(購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0682)進行PCR，分別擴增上述20個致病位點。
擴增的結果如圖12所示。擴增結果顯示：兩種方法在擴增的準確性和擴增產物的量上沒有顯著差別。
隨機選取10個純化後的實施例2的三步法擴增出的產物(在圖14中示為2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10)和10個純化後的實施例5的一步法擴增出的產物(在圖13中示為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10)，使用打斷方法構建基因組文庫，並採取淺測序的方式使用hiseq2500測序儀進行
測序，每個樣品測定1.5Mb的資料量，並將測序得到的序列比對到人類參考基因組(hg19)上。
實施例5的一步法的結果如圖13所示，實施例2的三步法的結果如圖14所示。其中縱坐標代表染色體的拷貝數，正常人為2；橫坐標代表染色體的1-22號染色體及性染色體。上述結果表明：實施例2的三步法和實施例5的一步法對細胞的染色體檢測結果一致。
在測序結果中還提供了高通量測序結果的各個指標參數，如圖15所示。其中原始資料中“唯一比對到人類基因組的資料比例”(即，unique_mapped_of_raw)是最重要的衡量指標，實施例5的一步法所有樣品的平均unique_mapped_of_raw為79.13%，而實施例2的三步法所有樣品的平均unique_mapped_of_raw為74.25%，這表明實施例5的一步法擴增樣品的unique_mapped_of_raw的比例顯著高於實施例2的三步法擴增樣品。
拷貝數變異係數可以用來比較兩類擴增方法擴增樣品後樣品拷貝數的離散程度的大小。實施例5的一步法所有擴增樣品的平均拷貝數變異係數為與實施例2的三步法所有擴增樣品的平均拷貝數變異係數相近。具體資料可參見圖16。
儘管本發明已公開了多個方面和實施方式，但是其它方面和實施方式對本領域技術人員而言將是顯而易見的。本發明公開的多個方面和實施方式僅用於舉例說明，其並非旨在限制本發明，本發明的實際保護範圍以權利要求為准。
<110> 上海序康醫療科技有限公司
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Claims (35)
- 一種擴增細胞基因組DNA的方法，所述方法包括：(a)提供反應混合物，其中所述反應混合物包括所述基因組DNA、第一類引物、第二類引物、核苷酸單體混合物、和核酸聚合酶，其中所述第一類引物從5’端到3’端包含通用序列和可變序列，其中所述通用序列從5’端到3’端具有SEQ ID NO：1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]的序列，且所述可變序列選自下組：(N)nGGG、(N)nTTT、(N)mTNTNG、和(N)xGTGG(N)y，其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸，n是選自3-17的正整數，m是選自3-15的正整數，x和y分別是選自3-13的正整數，並且所述第二類引物包含所述通用序列且不包含所述可變序列；(b)將所述反應混合物置於第一溫度迴圈程式，使得所述第一類引物的可變序列能夠與所述基因組DNA配對並擴增所述基因組DNA以得到基因組擴增產物，其中所述基因組擴增產物的5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列；(c)將步驟(b)得到的反應混合物置於第二溫度迴圈程式，使得所述第二類引物的所述通用序列能夠與所述基因組擴增產物的3’端配對並擴增所述基因組擴增產物以得到擴大的基因組擴增產物，其中，在所述步驟(b)和所述步驟(c)之前提供所 述反應混合物。
- 根據請求項1所述的方法，其中所述基因組DNA包含在細胞中，並且所述反應混合物進一步包含能夠裂解所述細胞的表面活性劑和/或裂解酶。
- 根據請求項1所述的方法，其中在所述步驟(b)和步驟(c)之前還包括將所述反應混合物置於裂解溫度迴圈程式，使得所述細胞裂解並釋放出所述基因組DNA。
- 根據請求項1所述的方法，其中所述通用序列不會與基因組DNA結合產生擴增。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述可變序列的長度為2-20個鹼基、3-10個鹼基，4-9個鹼基或5-8個鹼基。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述可變序列被選擇以使得在基因組上分別均勻並且覆蓋度高。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述第一類引物包括SEQ ID NO：11[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、SEQ ID NO：12[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、SEQ ID NO：13[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、SEQ ID NO：14[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]或SEQ ID NO：15[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]的序列，其中N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述核 酸聚合酶具有熱穩定和/或鏈置換活性。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述核酸聚合酶選自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pyrophage 3137、Vent聚合酶、TOPOTaq DNA聚合酶、9° Nm聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反轉錄酶、AMV反轉錄酶、HIV反轉錄酶、T7 phase DNA聚合酶變種(缺少3’-5’外切酶活性)、Phusion®超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bst DNA聚合酶(全長)、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶，及其任意組合。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述核酸聚合酶選自：Thermococcus litoralis的Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶、Deep Vent(-exo)聚合酶。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述反應混合物進一步包含pH值調節劑，使得所述反應混合物的pH值維持在7.0-9.0之間。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述反應混合物進一步包含一種或多種選自下組的成分：Mg2+、dTT、牛血清白蛋白、DNase抑制劑、RNase、SO4 2-、Cl-、K+、Ca2+、Na+、和(NH4)+。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述第一溫度迴圈程式包括：(b1)將所述反應混合物置於能夠打開所述基因組 DNA的雙鏈的溫度程式；(b2)將所述反應混合物置於能夠使所述第一類引物與DNA單鏈範本結合的溫度程式；(b3)將所述反應混合物置於能夠使與DNA單鏈範本結合的第一類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式，以產生擴增產物；(b4)將所述反應混合物置於能夠使所述擴增產物脫落成單鏈的溫度程式；(b5)重複步驟(b2)到(b4)至指定的第一迴圈次數。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述指定的第一迴圈次數大於2。
- 根據請求項13所述的方法，當進行到第二次迴圈後，所述擴增產物包含在5’端包含所述通用序列，3’端包含所述通用序列的互補序列的基因組擴增產物。
- 根據請求項13所述的方法，所述方法在步驟(b4)後並且在步驟(b5)之前進一步包括步驟(b4’)，其中將所述反應混合物置於適當的溫度程式，使得所述基因組擴增產物的3’端與5’端雜交結合以形成環狀結構，或者使所述基因組擴增產物的3’端與引物結合。
- 根據請求項13所述的方法，所述方法在步驟(b4)後直接到步驟(b5)。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b5) 的所述第一迴圈次數大於3、大於4、大於5、大於6，並且不超過10。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(c)包括：(c1)將經步驟(b)獲得的所述反應混合物置於能夠打開DNA雙鏈的溫度程式；(c2)將所述反應混合物置於能夠使所述第二類引物與所述經步驟(b)獲得的基因組擴增產物的單鏈結合的溫度程式；(c3)將所述反應混合物置於能夠使與所述擴增產物單鏈結合的第二類引物在所述核酸聚合酶的作用下延伸長度的溫度程式；(c4)重複步驟(c1)到(c3)至指定的第二迴圈次數。
- 根據請求項19所述的方法，其中所述步驟(c4)中的所述第二迴圈次數大於所述步驟(b5)中所述的第一迴圈次數。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b1)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應1-10分鐘。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b2)包括將所述反應混合物置於多於一種的溫度程式，以促使所述第一類引物充分與所述DNA範本有效結合。
- 根據請求項22所述的方法，其中所述多於一種的 溫度程式包括：介於5-10℃之間的第一溫度，介於25-30℃之間的第二溫度，和介於45-50℃之間的第三溫度。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b2)中所述步驟包括在第一溫度反應3-50秒、在第二溫度反應3-50秒、和在第三溫度反應3-50秒。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b3)中所述的溫度程式包括在60-90℃的溫度之間反應1-15分鐘。
- 根據請求項13所述的方法，其中所述步驟(b4)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應10-50秒。
- 根據請求項19所述的方法，其中所述步驟(c1)中所述的溫度程式包括在90-95℃的溫度之間反應10-30秒。
- 根據請求項19所述的方法，其中所述步驟(c2)中所述的溫度程式包括在45-65℃的溫度之間反應10-30秒。
- 根據請求項19所述的方法，其中所述步驟(c3)中所述的溫度程式包括在60-80℃的溫度之間反應1-15分鐘。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述步驟(a)中的基因組DNA從被裂解的細胞釋放，所述裂解包括熱裂解、鹼裂解、酶裂解或機械裂解。
- 根據請求項30所述的方法，其中所述熱裂解包括 溫度在20-100℃之間裂解10-100分鐘。
- 根據請求項30所述的方法，其中所述熱裂解是在裂解試劑存在的條件下進行的。
- 根據請求項32所述的方法，其中所述裂解試劑包括一種或多種選自下組的表面活性劑：NP-40、吐溫、SDS、TritonX-100、EDTA、和異硫氰酸胍，和/或裂解酶。
- 根據請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述第一溫度迴圈程式包括：(b1)在介於90-95℃的溫度之間的第一變性溫度反應1-10分鐘；(b2)介於5-10℃之間的第一退火溫度反應3-50秒，介於25-30℃之間的第二退火溫度反應3-50秒，和介於45-50℃之間的第三退火溫度反應3-50秒；(b3)在介於60-90℃之間的第一延伸溫度反應1-15分鐘；(b4)在介於90-95℃的第一解鏈溫度之間反應10-50秒；(b5)重複步驟(b2)到(b4)至6-9個迴圈；且其中所述第二溫度迴圈程式包括：(c1)在介於90-95℃之間的第二變性溫度反應1-10分鐘；(c2)在介於90-95℃之間的第二解鏈溫度反應10-30秒； (c3)在介於45-65℃之間的第四退火溫度反應10-30秒；(c4)在介於60-80℃之間的第二延伸溫度反應1-15分鐘；(c5)重複步驟(c2)到(c4)5-30個迴圈；(d)獲得所述步驟(c)得到的擴增產物。
- 如請求項34所述的方法，其中所述可變序列包含或者由NNNNNGGG或NNNNNTTT組成，N為任意的可與天然核酸進行鹼基配對的核苷酸。
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