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TWI614340B - 體幹細胞及其製備方法 - Google Patents

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TWI614340B
TWI614340B TW105142256A TW105142256A TWI614340B TW I614340 B TWI614340 B TW I614340B TW 105142256 A TW105142256 A TW 105142256A TW 105142256 A TW105142256 A TW 105142256A TW I614340 B TWI614340 B TW I614340B
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Abstract

一種CD10+、CXCR4+以及CD31+之體幹細胞以及另一種CD105+、CD44+以及巢蛋白(nestin)+之體幹細胞。亦揭示製備此等幹細胞之方法以及使用其等來治療退化性疾病，如肌肉退化性疾病，之方法二者。本發明另外包括製造以及使用由CD105+、CD44+以及巢蛋白+之體細胞衍生而來之肝細胞。

Description

體幹細胞及其製備方法 發明領域
此申請案請求在2011年9月28日提申之美國臨時申請案第61/540,191號以及在2012年3月12日提申之美國臨時申請案第61/609,522號之優先權。此二個先前申請案之全部內容在此併入本案以為參考。
本發明有關體幹細胞以及相關的方法。
發明背景
幹細胞係可在活體內或試管中分化成許多或所有的細胞類型之全能性幹細胞、多功能性幹細胞或多潛能性幹細胞。由於其等之多功能性，一般認為胚胎幹(ES)細胞在治療退化性或先天性疾病方面擁有非常高的潛力。可是道德考量阻礙了人類ES細胞之使用。非胚胎起源之幹細胞可規避此障礙。因此，需要有一種非胚胎幹細胞。
發明概要
本發明之一態樣有關一種CD10+、CXCR4+以及CD31+之分離的體非貼壁幹細胞。此細胞在此稱作“SB-3細胞”。細胞標記後面之符號“+”，代表與同型之抗體對照組之較低的螢光染色相比，具較多專一性標記抗體之螢光染色。細胞標記後面之符號“-”，代表具有與同型之抗體對照組相同之專一性標記抗體之螢光染色。
本發明之另一態樣有關一種CD105+、CD44+以及巢蛋白+之分離的體貼壁幹細胞。此細胞在此稱作“SB-4細胞”。
在又另一態樣中，本發明描述一種細胞銀行，其包括多個體幹細胞群。該體幹細胞各自為CD10+、CXCR4+以及CD31+，以及該群源自於不同的個體。該個體可為人類或非人類。
於又另一態樣中，本發明描述一種細胞銀行，其包含多個體幹細胞群。該體幹細胞各自為CD105+、CD44+以及巢蛋白+，以及該群源自不同的個體。該個體可為人類或非人類。
同樣在本發明之範疇內的係一種用於治療肌肉損傷或肌肉退化性疾病之方法。該方法包括對需要此治療之個體投與一有效量之CD10+、CXCR4+以及CD31+之體幹細胞。該肌肉退化性疾病之例子包括肌肉萎縮症、纖維肌痛、肌肉病變、皮肌炎、多發性肌炎、橫紋肌溶解症以及心肌炎。
本發明另外描述另一種用於治療肌肉損傷或肌肉退化性疾病之方法。該方法包括對需要此治療之個體投與一有效量之CD105+、CD44+以及巢蛋白+之體幹細胞。
在此亦涵蓋一種製備體幹細胞之方法。該方法包括(1)從一個體(如，人類或非人類)獲得含有多種細胞之體液檢體(如，血液、骨髓、臍帶血、月經液以及羊水)、(2)於容器中用二價陽離子螯合劑(如，EDTA、EGTA以及檸檬酸鈉)或肝素培育該檢體，直到該檢體分成上層以及下層、(3)收集該上層、(4)從該上層分離出0.3-6.0微米大小之體幹細胞群以及(5)在含有特定成長因子：R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF之培養基中培養該分離的體幹細胞。體幹細胞可為CD10、CXCR4以及CD31陽性的。其等亦可為CD105、CD44以及巢蛋白陽性的。
進一步涵蓋的是一種由以上所述之CD105+、CD44+以及巢蛋白+之體幹細胞製備肝細胞之方法。該方法包括在含有活化素之第一分化培養基中培養該分離的體幹細胞；在含有鹼性纖維母細胞生 長因子(bFGF)以及骨形態發生蛋白2(BMP2)之第二分化培養基中培養該分離的體幹細胞；另外在含有肝細胞生長因子(HGF)、地塞米松(DEX)以及制瘤素M(OSM)之第三分化培養基中培養該分離的體幹細胞；以及收集因此獲得之肝細胞，該肝細胞會表達白蛋白、運鐵蛋白以及肝細胞核因子3B(HNF3B)。
本發明亦包括一種體外生物人工肝裝置。該裝置具有一卡匣，其含有一中空纖維陣列以及用以上所述之方法製得之肝細胞。該肝細胞會表達一或多種擇自於由下列所構成之群組之蛋白質：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、第V因子、補體C3、抗凝血酶III以及運鐵蛋白。其等被置於各由孔徑約0.1μm至0.3μm之膜形成之中空纖維間的毛細管外空間。該卡匣可具有圓柱形，在接近一端的側壁上具有第一開口，且在接近另一端之側壁上亦具有第二開口。該第一開口固定至第一通道，而該第二開口固定至第二通道，該二個通道各從該卡匣延伸出去。
此外，本發明描述一種治療急性肝衰竭之方法。該方法包括鑑定需要治療之個體；透過該第一通道將以上所述之體外生物人工肝裝置接到該個體之動脈，以及透過該第二通道接到該個體之靜脈；從該個體輸注血液通過該卡匣之各中空纖維內部之毛細管空間；以及藉由允許從該血液而來之毒素溶解物與培養在該中空纖維間之毛細管外空間之肝細胞交換，使能夠淨化血液，以及亦使從該肝細胞而來之重要代謝物能夠擴散至血液返回到該個體。該個體可為罹患慢性肝病之人類，其等大部分係因C型肝炎感染、酒精成癮以及藥物過量引起。在一具體例中，該個體正等待肝移植。
在此亦描述一種產生白蛋白之方法。該方法包括在培養基中培養使用以上所述方法製得之肝細胞，以及從該培養基收集由該肝細胞產生之白蛋白。
本發明之一或多個具體例之詳細內容述於所附之圖式以及以下之說明書中。本發明之其它的特徵、目的以及優點因本說明書以及圖式以及因申請專利範圍而更明白。
圖1係顯示培養中之SB-3細胞以及SB-4細胞的照片。
圖2係接到人類個體之體外生物人工肝裝置之概要圖。
圖3a係可用於體外生物人工肝裝置之例示卡匣的照片。
圖3b係例示卡匣之橫截面影像。
較佳實施例之詳細說明
本發明，至少部分，係根據非預期的發現(i)CD10、CXCR4以及CD31為陽性之非貼壁細胞(即，SB-3細胞)可分化成三種胚層；以及(ii)此等細胞可變成CD105、CD44以及巢蛋白為陽性之貼壁細胞(即，SB-4細胞)。
SB-3細胞以及SB-4細胞
SB-3以及SB-4細胞可從由體液檢體(如，血液、骨髓、臍帶血、月經液以及羊水)分離出之細胞群製得。該體液檢體可獲自人類或非人類。從其中可獲得以上所提及之體幹細胞之非人類的例子包括，但不限於，靈長類、狗、齧齒動物、天竺鼠、貓、馬、牛、羊以及豬。的確，涵蓋所有的寵物動物、農場動物、實驗動物以及疾病模型動物。
從一個體中抽出體液，然後於容器中以二價陽離子螯合劑(如，EDTA、EGTA以及檸檬酸鈉)或肝素培育，直到該檢體分成上層以及下層。從該上層中分離出0.3-6.0μm大小之體幹細胞群，之後在含有某些成長因子(即，R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF)之培養基中培養，歷時1至30天(如，4至14天)。該培養基可含有每一種的濃度1至100ng/ml(如，2至50ng/ml以及5至20ng/ml)。在此等培養條件下，細胞之直徑增加至6-25μm。
仍未貼壁的細胞為SB-3細胞，而該等變成貼壁的細胞為SB-4細胞。在該SB細胞群中之體幹細胞可為CD9+、SSEA1+、 SSEA4+、CD13+或Stro1+。例如，一些為CD9+CD349+。
SB-3以及SB-4細胞二者均為體幹細胞。其等可用於再生分化的功能細胞，用於治療各種退化性病症或組織傷害。此等細胞可容易地在試管中維持以及擴張，以及使用常規技術方法誘導分化。此外，在移植此等細胞進入動物個體(如，小鼠)之後，沒有惡性腫瘤生長之證據。此等幹細胞含有正常的染色體配對。其等對譜系誘導劑、增殖劑以及分化抑制劑有反應。由於此等優點，其等可為其它幹細胞之替代物。
在此之術語“幹細胞”意指一種全能性、多功能性、多潛能性或單能性細胞，即，能夠分化成一或多種終末分化細胞類型之細胞。全能性幹細胞典型地具有發展成任何細胞類型的能力。其等可為胚胎來源與非胚胎來源二種。多功能性幹細胞典型地能夠分化成外胚層、內胚層以及中胎層細胞。多潛能性幹細胞可分化成許多不同終末分化細胞類型。單能性幹細胞僅可分化成一種細胞類型。其等具有自我再生的特性，此區分其等與非幹細胞。以上提及之幹細胞可源自各種組織或器官，包括，但不限於，血液、神經、肌肉、皮膚、腸子、骨頭、腎、胰臟以及胸腺。
在此揭露之幹細胞係實質上純的。術語"實質上純的"用在有關幹細胞或從其衍生而來之細胞(如，分化的細胞)時，意指該特定細胞構成製品中主要的細胞(即，超過20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)。一般來說，實質上純化的細胞群構成製品中至少約70%的細胞，通常是製品中至少約80%的細胞，特別是製品中至少約90%的細胞(如，95%、97%、99%或100%)。如此，本發明之方法提供可在無其它細胞類型之污染下，獲得實質上純的特定細胞類型之群(如，SB-3以及SB-4細胞)之優點。
各種從一個體而來之含有細胞之檢體可用於製備本發明之體幹細胞。在本發明之較佳具體例中，SB-3以及SB-4細胞係從SB細胞群製得。
為確認分離的細胞的確為SB-3或SB-4細胞，可檢驗一些特徵，包括細胞表面標記。可使用抗細胞表面標記，諸如CD10、CXCR4、CD31、CD105、CD44以及巢蛋白，之抗體。其等可結合適合的標籤，諸如異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或量子點。
為確認此等體幹細胞之分化潛能，可用此技藝中已知之方法，誘導其等形成，例如，神經膠質細胞、骨細胞以及脂肪細胞。例如，可繼代培養此等細胞，並培養至細胞貼壁長滿，移至成骨培養基或脂肪形成培養基，然後培育一段適合的時間(如，3周)。骨生成之分化潛能可藉由鈣累積之礦化作用評估，其可利用von Kossa染色顯現。為檢驗脂肪形成之分化作用，可用油紅O染細胞內之脂質液滴，然後在顯微鏡下觀察。對於神經分化作用方面，可在神經生成培養基中培育此等細胞歷時一適合的期間(如，7天)，之後經血清耗竭之處理，以及用β-巰基乙醇培育。分化之後，其等會展現出折光細胞體之形態，具有排列成網狀之延伸像神經突之結構。進一步進行RT PCR以及譜系專一性標記之免疫細胞化學染色，以確認神經分化。標記之例子包括神經元專一性III類β-微管蛋白(Tuj-1)、神經纖維絲以及GFAP。
SB-3以及SB-4細胞可另外在非分化培養基中進一步增殖超過10、20、50或100個群倍增，而沒有顯示出自發性分化、衰老、形態改變、生長速率增加以及分化成神經元之能力改變。在使用之前，此等幹細胞可用標準方法貯存。
在此使用之術語"增殖"以及"擴增"，用在細胞時可交換使用，意指相同類型之細胞經分裂而數量增加。術語"分化"意指使細胞特化變成特定功能之發展過程，例如，在此細胞獲得一或多種與一開始的細胞類型不同的形態特徵和/或功能。術語"分化"包括譜系定向以及終末分化過程二者。分化之評估可經由，例如，使用免疫組織化學或其它熟悉此技藝之工作者已知之程序，監控譜系標記的出現與消失。從祖細胞衍生出之分化的後代細胞，可與該幹細胞之來源組織相同之胚層或組織有關聯，但不是必然地。例如，神經祖細胞以及肌肉 祖細胞可分化成造血細胞譜系。
術語"譜系定向"以及"特化"在此可交換使用，意指幹細胞經歷的過程，其中幹細胞引起祖細胞定向形成特定有限範圍之分化的細胞類型。定向祖細胞通常能夠自我再生或細胞分裂。
術語"終末分化"意指細胞最後分化成成熟、完全分化的細胞。例如，神經祖細胞以及肌肉祖細胞可分化成造血細胞譜系，其之終末分化產生特定細胞類型之成熟血液細胞。通常，終末分化與退出細胞周期以及終止增殖有關。在此使用之術語"祖細胞"意指一種細胞，其定向形成特定細胞譜系，且其會引起此譜系之細胞產生一系列的細胞分裂。祖細胞之例子可為肌母細胞，其能夠分化成僅一種類型之細胞，但其本身還未完全成熟或完全分化。
在本發明之範疇內的是一種具有多個SB-3或SB-4細胞群之細胞銀行或庫。此等幹細胞可為人類細胞或非人類細胞。該銀行可由下列產生：貯存源自不同個體之SB-3或SB-4細胞群；描述群中SB-3或SB-4細胞之特徵，以獲得針對每一種之至少一種預定特徵；以及根據該至少一種預定特徵編製各群之目錄。為產生該銀行，可進一步擴增SB-3或SB-4細胞群。該特徵之例子包括個體之名字、性別、生理狀況(包括基因病症以及MHC資料)。
以上所述之SB-3細胞以及SB-4細胞均可用於藥物篩選、治療退化性病症以及基因療法。
篩選方法
以上所述之SB-3細胞以及SB-4細胞可用於篩選分析，以便鑑定會影響特定細胞類型之藥物，在某種程度上指出可用於治療與該細胞類型相關之病症。例如，該幹細胞可使用於，用於鑑定可治療疾病(如，退化性疾病)之藥物候選者之方法。該方法包括下列步驟：使測試化合物與該幹細胞接觸，以及測定此疾病中向下調節之多肽的表達位準。測試化合物存在時之表達位準假如高於無該化合物之位準時，指出該化合物係用於治療該疾病之候選者。該疾病之例子包 括糖尿病、神經退化性疾病、關節炎、癌症或自體免疫病症。可測定的表達位準係mRNA位準或蛋白質位準。
因此，本發明之一態樣有關一種用於鑑定會改變SB-3或SB-4細胞之功能之劑，其係藉由使該細胞與測試劑接觸。與缺少測試劑之情況下相比，該細胞在有測試劑之情況下之功能或基因表達的改變，顯示出該測試劑係會改變細胞之功能或細胞中基因之表達之劑。術語"測試劑"意指任何欲檢驗其能夠改變細胞之功能或細胞中之基因的表達之能力的分子。雖然該方法通常係用作為鑑定之前具有所欲活性之未知的分子之篩選分析，但本發明之篩選方法亦可用於確認已知具有該活性之劑之特殊活性。
該功能可以是細胞中典型地表達(或沒有表達)之基因的表達，以及該劑可藉由增加或減少該細胞中表達基因之表達位準，或藉由打開該細胞中未表達基因的表達(如，誘導譜系專一性抗原之表達)而改變功能。
在一具體例中，會影響該細胞之功能之劑係一種會引起幹細胞分化，從而產生分化的細胞之劑。此分化的細胞可為多潛能性人類幹細胞(如，造血幹細胞)或可為終末分化的細胞(如，肌肉細胞、肝細胞、神經細胞、血液細胞、結締組織或表面細胞)。如此，該方法可用於鑑定會誘導SB-3或SB-4細胞分化成終末分化的細胞(包括胰臟β細胞、肝細胞、心肌細胞、骨髂肌細胞或任何其它細胞類型)之劑。因此鑑定出之劑或化合物可用於治療退化性病症、癌症或免疫病症。
該表達位準可以是測定mRNA位準或蛋白質位準。測量一檢體中mRNA位準的方法係業界熟知的。為測量mRNA位準，將細胞水解，然後可利用如雜交分析(使用可偵測標籤的基因專一性DNA或RNA探針)以及定量或半定量RT-PCR(使用適常的基因專一性引子)，測定水解物(不管純化與否)中mRNA之位準。選擇性地，可在組織切片或未水解的細胞懸浮液上，使用可檢測標籤(如，螢光或酵素)的DNA或RNA探針，進行定量或半定量原位雜交分析。額外的mRNA 定量方法包括RNA酶蛋白質分析(RPA)方法以及基因表現連續分析法(SAGE)方法，以及基於陣列之技術。
測量檢體中蛋白質位準之方法亦為業界熟知的。其等中一些使用抗體(如，單株或多株抗體)，其專一性結合至標的蛋白。於此分析法中，抗體本身或結合至其上之第二抗體可為可偵測標籤的。選擇性地，該抗體可與生物素結合。其之存在可用可偵測標籤的親和素(結合生物素之多肽)測定。結合此等方法(包括"多層三明治"分析法)，可用於提高方法之靈敏性。適當的標籤包括放射性核素(如，125I、131I、35S、3H或32P)、酵素(如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、螢光素酶或β-半乳糖苷酶)、螢光/冷光劑(如，螢光素、若丹明、藻紅朊、GFP、BFP以及奈米粒子(如，由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA提供之QdotTM)。一些蛋白測量分析法(如，ELISA以及西方點墨法)可應用於體液或細胞水解物，而其它(如，免疫組織學方法以及螢光流式細胞儀)可應用於組織切片或未水解的細胞懸浮液。其它可應用之方法包括定量免疫沈澱法以及補體固定分析法。
測試化合物或劑可為任何類型之分子，例如，多核苷酸、胜肽、擬胜肽、諸如乙烯化類肽之類肽類、小型有機分子或相似物，且可以各種方式作用，以改變SB-3或SB-4細胞之功能。例如，該測試劑可在細胞外作用，藉由結合至細胞表達之細胞表面受體，從而改變經由配位子(其通常結合至受體或透過受體產生作用)的結合而介導的功能。選擇性地，該測試劑可為一種被動或透過主動傳送機制橫過細胞膜，且在細胞內作用以改變功能之劑。
胜肽測試劑可為任何的胺基酸或胺基酸類似物之聚合物，且可從約3至4個殘基變化至數百或數千個。胜肽測試劑可經由化學合成法製得；或使用蛋白質純化方法，接著蛋白質水解，需要時，另外用色層分析法或電泳方法純化製得；或可從編碼多肽表達而得。胜肽測試劑可以已知之胜肽為基礎，例如，自然發生的胜肽，但與自然發生的序列不同，例如，含有一或多個胺基酸類似物。
多核苷酸劑可為二或多個由磷酸二酯鍵連接在一起之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之序列。其可為RNA或DNA，其可為基因或其蛋白質、cDNA、RNAi劑、合成多去氧核糖核酸序列或相似物，且可為單股或雙股以及DNA/RNA雜交物。其可為從細胞分離出之自然發生的核酸分子，以及可為經，例如，化學合成法或酵素方法(諸如聚合酶鏈反應(PCR))製成之合成分子。於各種具體例中，本發明之多核苷酸可含有核苷酸或核苷酸類似物，或除了磷酸二酯鍵外之骨架鍵。此核苷酸類似物係業界熟知的以及商業可得的，如含有此核苷酸類似物之多核苷酸(Pagratis et al.,Nature Biotechnol.15：68-73,1997)。
使用在此所述之方法或其它業界已知之方法，可使多肽測試劑與SB-3或SB4細胞接觸或將其引入SB-3或SB4細胞中。一般而言，但不是必須地，將多核苷酸引入細胞內，在此其會直接或在轉錄或轉譯或二者之後影響其功能。例如，多核苷酸可編碼胜肽測試劑，其在細胞中表達，然後改變細胞之功能。多核苷酸測試劑亦可為，或可編碼，反股分子、核酶或三聯劑，其可設計成可標靶一或多個專一性標的核酸分子。
使用業界已知之組合庫方法中許多方法中之任一種，可獲得欲進行篩選之候選劑或化合物(如，蛋白質類、胜肽類、擬肽類、類肽類、抗體類、小型分子類或其它藥物)。此等庫包括：胜肽庫、類肽庫(具有胜肽之功能，但具新的、非胜肽骨架(對酵素降解具有抗性)之分子庫)；空間可定位平行固相或液相庫；反卷積運算或親和性色層分析選擇法獲得之合成庫；以及“一珠一化合物”庫。參見，如Lam,1997,Anticancer Drug Des.12：145。用於合成分子庫之例子可在如Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；以及Gallop et al.,1994 J.Med.Chem.37：1233中找到。化合物之庫可存在溶液中(如，Houghten,1992,Biotechniques 13：412-421)或在珠子上(Lam,1991,Nature 354：82-84)、晶片上(Fodor,1993,Nature 364：555-556)、細菌中(美國專利案第5,223,409號)、孢子中(美國專利案第5,223,409號)、質體中(Cull et al.,1992,PNAS USA 89：1865-1869)或噬菌體中(Felici 1991,J.Mol.Biol.222：301-310；以及美國專利案第5,223,409號)。
治療方法
可使用在此揭示之SB-3或SB-4細胞來治療退化性或先天性疾病，避免人類胚胎操作之道德考量。
如此，可從病人(如，缺少組織或器官之適當發展必須之功能基因之病人)中分離出SB細胞群。之後使該SB細胞群經歷可獲得SB-3細胞或SB-4細胞之條件處理。之後可於此等幹細胞中引入編碼該功能性版之基因之表達核酸載體。可透過各種技術將該載體引入該幹細胞中，包括磷酸鈣共沈澱、DEAE-葡聚糖介導轉染、脂質體轉染、電穿孔法、微注射或病毒介導的技術。不影響細胞之多能性的方法係較佳的。此等技術之說明可在公開文件中找到，如美國專利案第7,422,736號以及第5,591,625號。在將該功能基因送進該幹細胞後，可使用業界熟悉之方法將其等移植回病人身上。當該幹細胞在病人身上產生時，此治療不會引起免疫排斥。
選擇性地，可從由健康個體製得之SB-3或SB-4細胞，製造通用型供體細胞。製造通用型供體細胞之方法係業界已知的。從SB-3或SB-4細胞製造通用型多功能性幹細胞之例示性技術述於下文中。
在適當的條件下，移植的幹細胞可發展成功能組織或器官。為促進此發展，可投與病人用以誘發細胞發展之因子。此等因子可為小型分子化合物類、胜肽類以及核酸類。例子包括，但不限於，轉形成長因子β、骨形態發生蛋白以及神經成長因子。
通用型多功能性幹細胞亦可用於研究譜系發展以及分化之發展以及分化機制。可使用此等細胞作為模型系統，用以鑑定可誘導全能性多功能性幹細胞發展成特定組織或器官之條件。此外，可使用業界已知之差異cDNA篩選方法，分離在發展期間參與之基因。可由已經誘導發展成某譜系，如，以上所述之神經膠質譜系，之細胞 製備cDNA庫。之後該庫可用於分離以及研究差異表達基因。此等分離的基因可經進一步的研究，界定其等在各別過程中之角色。相關的技術係業界已知的。見，美國專利案第7,422,736號。使用業界已知之方法亦可使多功能性幹細胞發展成動物之器官或選殖株。據此，此等細胞對寵物以及家畜產業很有用，且可用於保存快絕種的動物。
在一態樣中，本發明描述一種治療一個體之退化性疾病之方法。該方法包括對一需要此治療之個體投與一有效量之以上所述之SB-3或SB-4細胞。於一具體例中，此等細胞中之至少一種包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽以及該幹細胞可含有編碼該多肽之mRNA。退化性疾病之例子包括肌肉退化性疾病、肝退化性疾病、糖尿病、神經退化性疾病以及關節炎。神經退化性疾病之例子係帕金森氏症。
在另一態樣中，本發明描述一種治療一個體之自體免疫的方法。該方法包括對一需要此治療之個體投與一有效量之以上所述之SB-3或SB-4細胞。
退化性疾病意指一種疾病，其中受影響的組織或器官的功能或結構，因基因缺失、損傷、缺少適當的細胞分化(如，細胞增生病症)、正常的身體消耗或生活形態之選擇，隨著時間日漸的惡化。退化性疾病之例子包括神經退化性疾病(如，阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症、多發性硬化症以及肌萎縮性側索硬化症(ALS))；其它神經系統病症(如，橫貫性脊髓炎、腦或脊髓創傷後發生之脫髓鞘、急性腦損傷、頭部創傷、脊髓損傷、周邊神經損傷、缺血性腦損傷、CNS之遺傳髓鞘病變、癲癇、新生兒周產期窒息、窒息、缺氧症、癲癇持續狀態、Shy-Drager症候群、孤獨症以及中風)；癌症(如，肝癌)或由抗癌治療(如，化療)產生之病況；代謝病症(如，糖尿病以及尼曼匹克症(Niemann Pick disease))；自體免疫或發炎相關病症(如，紅斑、發炎性腸病(IBD)、前列腺炎、骨關節炎、骨質疏鬆、風濕性關節炎、狼瘡、糖尿糖以及氣喘)；眼病(如，青光眼、色素沉積性視網膜炎、諾里病 (Norrie disease)以及黃斑部退化)；心臟以及循環病症(如，動脈硬化症、心衰竭、心肌梗塞以及心血管疾病)；血液病症(如，Wiscott-Aldrich氏症候群)；肌肉營養失調；胃腸疾病、腎病、肝病；肺病、腎上腺病(如，艾迪森氏病(Addison's disease))；因損傷引起之病況(如，燒傷、中風、包括輕傷之受損組織、老化受損的細胞以及老化受損的組織)；與老化相關之病況(如，掉髮，包括雄性禿以及圓禿)；病毒病況(如，C型肝炎感染以及後天免疫缺乏症候群)；以及任何其它可藉由器官移植或幹細胞而復原，或減緩與該其相關之症候和/或症狀之病症。本發明之方法可用於治療勃起障礙以及女性之整型手術或隆乳。
於又另一態樣中，在此所述的是一種治療一個體之腦或CNS組織損害或減緩該病症之症狀之方法。該方法包括鑑定罹患或有發展成腦組織損害之風險之個體。腦組織損害之例子包括該等因腦缺氧(如，慢性中風)或神經退化疾病(如，帕金森氏症、阿茲海默症、脊髓小腦疾病以及亨丁頓舞蹈症)引起之病症。該治療方法需要對需要該治療之個體投與一有效量之以上所述之幹細胞或活性劑/化合物。
幹細胞之治療作用可依照標準方法評估。例如，為確認促進腦血管之血管新生之效率，可在治療前以及治療後，用標準腦影像技術，諸如電腦斷層(CT)、都卜勒超音波造影(DUI)、核磁共振造影(MRI)以及質磁共振光譜法(1H-MRS)檢驗該個體。例如，1H-MRS代表一種可獲得與腦代謝活性有關聯之生化資訊之非侵入性工具(Lu et al.,1997,Magn.Reson.Med.37,18-23)。此技術可用以評估在有或無幹細胞移植之情況下，涉及腦部缺血之代謝的改變。例如，其可用於研究腦中N-乙醯天門冬胺酸(NAA)之濃度，一種神經元完整性標記。雖然神經元碎片中之NAA的再分配以及扣留限制了其用作為定量神經標記之用途，但在腦部缺氧時腦中的NAA濃度之減少仍可被視為神經元丟失或功能障礙之指標(Demougeot et al.,2004,J.Neurochem.90,776-83)。因此，由1H-MRS測得之NAA位準係腦部缺血後，用於密切注意幹細胞移植的作用之有用的指標。
可用針對以上所述之病症之標準診斷技術，鑑定一個體是否患有該等特殊病症之一種。“治療”意指對一罹患或有發展成一病症之個體投與一組成物(如，細胞組成物)，目的係治癒、減輕、緩和、去除、延遲、預防或改善該病症、該病症之症狀、該病症繼發的疾病狀態或易患該傷害/病症之體質。可用診斷相關病狀或病症之標準技術，鑑定欲治療之個體。“有效量”意指該組成物在治療個體中能夠產生醫療所需之結果的數量。該治療方法可單獨進行，或結合與其它藥物或治療法一起進行。該個體可為人類或非人類哺乳動物，諸如貓、狗或馬。
製造以及使用肝細胞
在本發明之範疇內亦為製造以及使用從SB-4衍生而來之活細胞之方法。SB-4細胞當在含有活化素之培養基中培養5天後，在含有bFGF以及BMP2之培養基中培養10天至15天，最後在含有HGF、DEX以及OSM之培養基中培養10至15天，會經歷分化而形成內胚層細胞。此等內胚層細胞會表達白蛋白、運鐵蛋白以及HNF3B，其等全部係肝專一性蛋白。換句話說，SB-4細胞可分化成用於產生白蛋白或用於生物合成肝裝置之肝細胞。在此之術語“肝細胞(liver cells)”與“肝細胞(hepatocytes)”可交換使用。
本發明之一具體例係一種使用從SB-4細胞衍生而來之肝細胞之體外生物人工肝裝置。此一裝置係用於治療具有或懷疑具有肝相關病況或因疾病或創傷產生之肝功能不全之個體。
體外生物人工肝裝置包括一或多個卡匣。見圖2。各卡匣含有各由可滲透性或半滲透性膜形成之中空纖維陣列。見圖3a以及3b。各卡匣可具有圓柱形，在一終端具有第一開口以及在另一終端具有第二開口；以及該第一開口固定至第一通道，而該第二開口固定至第二通道，該二個通道從該卡匣延伸出去。見圖3a。一通道接到一個體之動脈上，而另一個接到此個體之靜脈上。
形成各中空纖維之膜能夠藉由允許從血液而來之毒素 溶解物與培養在該中空纖維內之肝細胞交換，使能夠淨化血液(如，膽紅素，其會擴散通過該膜，然後被處理以及代謝掉)，且亦使培養在該裝置中之細胞而來之重要代謝物能夠擴散至血液回到該個體。該膜之選擇性滲透或半滲透特徵亦提供該個體之血液中免疫系統之組份的物理障礙。典型地，該膜具有分子量截留值從約20,000道爾頓至約80,000道爾頓，通常約30,000道爾頓至約50,000道爾頓。在一較佳具體例中，該膜具有孔徑0.1μm至0.3μm，典型地約0.2μm。在此範圍內之孔徑，除了細胞元素之外，容許蛋白質(如，白蛋白)以及蛋白質錯合物通過，因此減輕罹患肝衰竭之個體之血清蛋白質的缺失。
在此使用之術語"淨化"或"清理"意指從該個體之血液中移除不想要的分子。此外，術語"淨化"或"清理"進一步包括使從SB-4衍生的肝細胞而來之不欲的分子(即，白蛋白)，在其返回至該個體之前，釋放至血液中。
相似的裝置、其等之用途以及作用之機制係熟悉此技藝人士皆知的。例如，生物人工肝裝置述於Viles,et al.之美國專利案第4,675,002號以及第4,853,324號；Jauregin,GB 2,221,857A；Wolf,et al.之1979,International J.of Artificial Organs 2：97-103；Wolf,et al.之1978,International J.of Artificial Organs,1：45-51；以及Ehrlich,et al.之1978,In Vitro 14：443-450中。此等裝置亦可用SB-4細胞衍生的肝細胞。
中空纖維卡匣具有二個槽單元，即，一槽在該中空纖維每一個之內部，而另一個位在該中空纖維之外部，其再生出正常器官之三維特徵。見Knazek,R.H.,1974,Feder.Proc.33：1978-1981；以及Ku,K.et al.,1983,Biotechnol.Bioeng.23：79-95。
培養或生長培養基在該卡匣的每一個中空纖維的內部之毛細管空間循環，以及提供接種後在該卡匣的中空纖維之間的毛細管外空間生長之細胞恆定的新鮮培養基流入。見Tharakan,J.P.et al.,1986,Biotechnol.Bioeng.28：1605-1611。典型地，在1400cm2之卡匣中接種一有效量的SB-4細胞衍生的肝細胞(如，大約1 x 109個細胞)，然 後在14至約21天內生長至貼壁長滿。此中空纖維培養系統係已知的(如，Heifetz et al.,1989,BioTechniques 7：192-199；以及Donofrio,D.,Amer.Biotech.Lab.Sept.1989,Publication #940)且可在市面上購得(如，Anchornet series)。
當用在生物人工肝裝置時，中空纖維為主的系統提供許多的優點。卡匣能支撐非常高密度培養物之生長。以毛細管外體積為基礎，1400cm2之單元中可長15至20g之細胞，而7000cm2中可長100g之細胞。此細胞團之數量能夠提供罹患肝衰竭之個體肝的支持。且，卡匣生長的細胞係分化的，且其等之生長近似正常的肝結構。該細胞接受從毛細管空間而來之養份，且分泌廢物至該毛細管外空間。灌洗毛細管外空間，以預防毒素的累積。連續流動的培養基以及在線製氧機提供更恆定的氧以及能量供給。
就絕大部分而言，預計使用SB-4衍生的肝細胞之生物人工肝裝置先藉由體外接到一個體來處理血液(如，典型地，製造該裝置至該個體的血液供應之流體連通，通常是動脈與靜脈之間)。此一安排特別有用於提供罹患嚴重肝病之個體暫時的肝支持。
選擇性地，SB-4衍生的肝細胞在身體內使用作為生物人工肝或作為生物人工肝支持。當以此方式使用時，該SB-4衍生的肝細胞係被包覆起來的，或在中空纖維毛細管膜中生長，供內部使用。典型地，該細胞生長時會附著於該支撐物上。然而，可提供連接材料使該細胞附著於支撐物上(見，如Jauregin,GB 2,221,857A)。Cai et al.,Artificial Organs 12：388-393；Sun et al.,1986,Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs Vol.XXXII：39-41；O'Shea et al.,1984,Biochimica Biophysica Acta 804：133-136；Sun et al.,1985,J.Controlled Release 2：137-141；以及Lim,美國專利案第4,391,909中，教示將該SB-4衍生的肝細胞包覆在諸如藻酸聚離胺酸膜之生物材料中。之後將包覆的細胞以及載體膠囊經腹膜注射至個體中。
額外地，SB-4衍生的肝細胞可用於合成像肝的組織， 包含纖維母細胞以及該SB-4衍生的肝細胞。典型地，一起培養纖維母細胞以及肝細胞，不會自動採用典型地在肝中找到之排列。此外，因為二種細胞類型之交流很差，所以肝細胞之功能常常效率不好。為解決此問題，可使用微電技術之標準的光刻技術，以圖案化之膠原薄膜壓印基材(如，硼矽酸晶圓)，其會促進細胞之附著。見Toner et al.,1997,Fall Meeting of the Materials Research Association,1-5；Toner et al.,1988,Nature,39：128。之後SB-4衍生的肝細胞可在此表面上培養，僅貼在膠原塗覆的區域。隨後在裸表面區域上引入纖維母細胞，在周期圖案中產生二種細胞類型之親密混合。此技術容許在基材上產生任何比率的細胞類型，因此允許調整至任何生理值。再者，可演算以及工程設計出任何圖案尺寸、形狀以及數量密度。
基因療法
在此所述之幹細胞可用於表達外源重組多肽。因此，在本發明之範疇內係此種含有重組核酸之幹細胞。該重組核酸可編碼多肽以及該幹細胞可含有編碼該多肽之mRNA。
此等幹細胞可經基因操作成其等不會表達β2-微球蛋白基因或不會表達一或多種由第I類主要組織相容性複合體(MHC)基因編碼之蛋白(其會引起對抗細胞之T淋巴細胞介導的反應)。此等細胞可用作為通用型供體細胞，因為其等不會引起宿主對移植物排斥。
據此，本發明描述一種於一個體中引入異源核酸之方法。該方法包括下列步驟：獲得以上所述之幹細胞，在此該幹細胞中之至少一種包括異源核酸；以及將該細胞投與至需要治療之個體。該異源核酸可編碼多肽。
術語"異源"係相對術語，其當用於核酸之部分時，指的是該核酸包含二或多個在自然情況下，彼此找不到相同關係之序列。例如，重組產生之核酸典型地具有二或多個從不相關之基因而來，經人工合成安排製成一個新的功能核酸之序列，如，啟動子從一來源而來，而編碼區域從另一來源而來。因此在此情況下，該二個核酸彼此 之間為異源的。當加入細胞時，該重組核酸與該細胞之內源性基因亦可為異源的。因此，在染色體中，異源核酸可能包括已整合進入染色體中之非天然(非天然發生的)核酸，或非天然(非天然發生的)染色體外核酸。相反的，在此專利申請案中，染色體之天然易位的片段，不被視為異源的，因為其包含突變細胞中天然的內源性核酸序列。相似地，異源性蛋白指的是，該蛋白包含二或多種在天然情況下彼此找不到相同關係之序列(如，"融合蛋白"，在此二種序列由單一核酸序列編碼)。此蛋白可利用重組技術產生。
術語"重組"當用在，如，細胞、核酸、蛋白或載體時，意指該細胞、核酸、蛋白或載體已藉由引入異源核酸或蛋白，或修改天然核酸或蛋白之修飾，或意指該細胞係從如此修飾之細胞衍生而來。因此，例如，重組細胞會表達不會在該細胞之天然形式內找到的(天然發生的)基因，或會表達一在表達或根本不會表達之情況下，以其它方式正常或不正常表達之天然基因之第二複本。
以上所述之幹細胞以及方法可用於各種業界已知之基因療法。基因療法包括活體外以及活體內技術二者。明確而言，用寡核苷酸調整物或編碼該調整物之核酸分子，對以上所述之幹細胞進行活體外基因工程，之後提供該基因工程細胞給欲進行治療之病人。細胞培養物可藉由，例如，將細胞分開(如，機械分開)以及密切混合該細胞與一藥學上可接受之載劑(如，磷酸鹽緩衝液)進行配製，以供投與至病人。選擇性地，細胞可在適合的生物相容性支撐物上培養，然後移植至病人。該基因工程細胞典型地係自體移植的，以致防止異種或同種異體排斥發生。此活體外方法係業界熟知的。
使用業界已知之技術，藉由投與寡核苷酸或核酸分子，可進行細胞之基因工程。例如，寡核苷酸以及其它核酸分子可以下列方式投與：直接注射"裸"核酸分子(美國專利案第5,679,647號)或，核酸分子配製於具有一或多種其它劑之組成物中，其會促進核酸分子被細胞吸收，諸如皂苷(見，例如，美國專利案第5,739,118號)或陽離子 聚醯胺(見，例如，美國專利案第5,837,533號)；微粒轟擊(例如，透過使用"基因槍"；Biolistic,Dupont)；用脂質、細胞表面受體或轉染劑塗覆該核酸分子；將該核酸分子包覆在脂質體、微粒或微膠囊中；投與連結至已知可進入細胞核之胜肽之核酸分子；或投與連結至配位子之核酸分子，經受受體介導的內吞作用，其可用於標靶專一性表達該受體之細胞類型。
可形成核酸-配位子錯合物，其中該配位子包含融合病毒胜肽以便打斷核內體，使該核酸能夠避免溶酶體的降解；或該核酸分子可為細胞專一性攝入之標的，且藉由標靶專一性受體而在活體內表達。此外，有關導入、表達以及累積反股寡核苷酸於細胞核中之有效的方法，述於美國專利案第6,265,167號中，其容許反股寡核苷酸與細胞核內之正股mRNA雜交，從而預防反股寡核苷酸被處理或轉送至細胞質。本發明亦有關細胞內導入核酸分子以及隨後併入宿主細胞DNA內，供利用業界已知之同源重組進行表達。
亦可將多核苷酸併入適合的表達載體中。一些適合基因療法應用之載體係業界已知的(見，例如，Viral Vectors：Basic Science and Gene Therapy,Eaton Publishing Co.(2000))。
表達載體可為質體載體。產生以及純化質體DNA之方法係快速且簡單的。此外，質體DNA典型地不會整合入宿主細胞之基因組中，而是以個別實體之形式維持在游離位置中，排除染色體整合可能引起之基因毒性爭議。目前從市面上可很容易地購得各式各樣的質體，包括該等從大腸桿菌以及枯草桿菌衍生而得的，許多特別設計成用於哺乳動物系統。可用於本發明之質體的例子包括，但不限於，真核生物表達載體pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV以及pAd/TR5/GFPq(Massie et al.,(1998)Cytotechnology 28：53-64)。在例示性具體例中，該質體係pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)或PVAX Invitrogen)。
表達載體可為病毒為主的載體。病毒為主的載體的例子包括，但不限於，該等從複製缺失型逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒以及腺相關病毒衍生而來的。逆轉錄病毒載體以及腺相關病毒載體係目前選擇用於在活體內傳送外源性寡核苷酸或基因之重組基因傳送系統，特別至傳送至人類。此等載體提供基因有效的傳送進入細胞，以及轉移的核酸穩定地整合進入宿主之染色體DNA。使用逆轉錄病毒之主要的前提係確定其等使用之安全性，特別是有關野生型病毒在細胞群中擴散的可能性。可衍生成逆轉錄病毒載體之逆轉錄病毒包括，但不限於，莫洛尼(氏)鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞氏(Rous)肉瘤病毒、哈維(Harvey)肉瘤病毒、鳥類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒以及乳房腫瘤病毒。特別的逆轉錄病毒包括pLJ、pZIP、pWE以及pEM，其係熟悉此技藝之人士熟知的。
細胞銀行
本發明描述一種幹細胞銀行或庫，供用於方便的有系統的取得不同的幹細胞株。在該銀行或庫中之SB-3或SB-4細胞係從健康個體或具有已知疾病狀態或疾病症狀之個體衍生而來的，對使用者，如研究人員，而言係很寶貴的。本發明之範疇亦包括一種具有從以上所述之幹細胞分化的細胞之細胞銀行或庫。從該幹細胞分化的細胞之例子包括腦細胞、神經元、星形細胞、膠質細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島細胞、脂肪細胞、心臟細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、肌細胞以及眼睛細胞。該個體可為人類或非人類脊椎動物。該幹細胞可從任何哺乳動物有機體衍生而來，諸如人類、小鼠、兔子、牛、豬等等。
將在該銀行或庫中之細胞依照預定的特徵分類，包括表現型資訊、形態特徵、分化的檔案、血型、主要組織相容性複合體、供體之疾病狀態、基因型資料(如，與基因或基因組或粒腺體DNA相關之專一性核酸序列之單一核苷酸多態性(SNPs))。將細胞貯存在適當 的條件下(典型地冷凍)，以保持幹細胞存活以及有作用。編製目錄可指定製造一個從各細胞群獲得之特徵之集中記錄，諸如，但不限於，匯集的書面記錄或輸入有資訊的電腦資料庫。基本上，此具體例有關產生幹細胞銀行。該幹細胞銀行可幫助從複數個特定幹細胞檢體中選擇適合使用者需求之檢體。因此，本發明之另一具體例有關一種幹細胞銀行，其包含複數個從不同的來源獲得之幹細胞檢體，然後描述其等之特徵，之後根據至少一種預定特徵編製目錄。額外的具體例有關一種建立幹細胞銀行之方法，其包含收集從多方來源而來之檢體；根據至少一種預定的特徵編製該檢體之目錄以及將該細胞貯存在保持細胞存活之條件下。
本發明之範疇包括一種幹細胞銀行建制系統，其含有複數個幹細胞群，安置在個別容器中，保持在使該幹細胞群存活之條件下；一資料庫電腦，包含至少一種處理模組、顯示器以及儲存媒體，包含各幹細胞群之至少一種特徵之資訊；以及至少一種程式碼模組，用於在使用者下命令時，可在該顯示器上看見該資訊。在一特定具體例中，本發明描述一種幹細胞銀行建制系統，在此幹細胞群具有從具有疾病病況之個體獲得之幹細胞。該疾病病況可包括以上所述之退化性疾病。SB-3或SB-4細胞從具有不同疾病之個體衍生而來，且描述該幹細胞之特徵。該/該等特徵輸入該資料庫電腦中。此外，或選擇性地，依照特定表現型(不一定要與疾病病況有關)描述細胞之特徵。例如，以其等有代謝某些化合物，諸如咖啡因、酒精、藥物等之能力來描述肝細胞，以便研究此不同代謝能力之遺傳基礎或與其相關之潛在生理機能。可依照功能和/或形態表現型描述其它類型的細胞之特徵。
在某些具體例中，可使從SB-3或SB-4細胞分化而來之細胞，經歷透過引入基因工程載體或其它遺傳物質影響分化或去分化之處理。分化包含將細胞操作成使其呈現較少分化細胞之特性。
本發明之幹細胞庫可用於篩選可用以上所述之方法治療退化性病症、癌症或免疫病症之劑或化合物。該庫適合高通量篩選， 且可用於鑑定對特殊個體特別有效之劑。在高通量篩選方面，將幹細胞引入多孔培養皿之孔中或玻璃玻片或微晶片之孔中，且使其與測試劑接觸。大體而言，將該細胞組織成陣列，特別是可尋址的陣列，如此機器人可方便地用於操縱該細胞以及溶液且用於監控該細胞，特別是有關要檢驗的功能。使用高通量形式之優點係可平行檢驗數個測試劑，且需要的話，亦可在與測試條件一致的條件下進行對照組反應。如此，本發明之篩選方法提供一種篩選一種、小或大量測試劑之工具，以便鑑定可改變幹細胞之功能之劑，例如，會引起細胞分化成所欲細胞類型之劑，或預防自發性分化之劑，例如藉由維持調節分子高位準的表達。
通用型供體細胞
以上所述之幹細胞可經基因工程而產生供移植用之組織相容性供體細胞或組織。移植以及細胞療法之目標，係順利地用功能性供體組織或器官取代衰竭組織或器官。然而，為能順利的移植，需要克服二個主要的障礙：適合供體組織或器官之可利用性以及免疫排斥。衰竭組織或器官之取代以及排斥之治療，受有限數量的可接受供體以及同時投與毒性免疫抑制藥物以及長效免疫操作程序之限制。目前以及實驗室移植操作程序主要依靠兄弟姐妹捐贈、其它小型的同種異體捐贈者以及異種捐贈者池。以上所述之基因工程幹細胞可用於克服此等限制。
更明確地，在此所述之幹細胞可經基因工程而在其等之表面上不表達第II型MHC分子。更佳地，該細胞可經基因工程而實質上不表達所有的細胞表面第I型以及第II型MHC分子。在此使用之術語"不表達"意指在細胞之表面上表達不足以引起反應的數量，或表達有缺失之蛋白質，因此不會引起反應。
MHC分子意指HLA分子，具體地有HLA A型、B型以及C型，以及第II型HLA DP、DQ以及DR，以及其等之亞型。此術語通常理解為對人類MHC之專一性，但在此意圖包括從供體細胞種 類而來之相等的MHC基因，例如，假如細胞為豬來源，術語HLA可能意指相等的豬MHC分子，不管之MHC I或II。當移除第II型MHC分子時，CD4+ T-細胞無法辨認出基因工程內皮細胞；當第I型以及第II型MHC分子均移除時，CD4+以及CD8+細胞均無法辨認出該經修飾的細胞。
在該幹細胞上進行之較佳的基因修飾包括1)打斷功能為整合以及傳送第II型MHC分子至細胞表面上以及裝載抗原性胜肽之內源性不變鏈基因，以及2)打斷內源性β2-微球蛋白基因(β2M基因)，其編碼細胞表面表現所有第I型MHC分子所需之蛋白。選擇性地，僅打斷不變鏈基因。一般認為將抗原性胜肽片段插進第II型MHC分子需要不變鏈。同時，T細胞可辨認出抗原性胜肽以及MHC。在缺少抗原性胜肽之情況下，T細胞辨認無法正常的獲得，第II型MHC分子亦無法適當地折疊。因此，在缺少不變鏈之細胞中，胜肽之呈現會被取消，即使獲得微小量的細胞表面MHC，其等可能缺乏胜肽，因此為無致免疫性的。
打斷此等基因可藉由同源重組基因標靶技術之方法完成。此等技術係業界熟知的。見，如，美國專利案第6916654號以及第6986887號。
組成物
本發明提供含有SB-3或SB-4細胞或活性劑/化合物之藥學組成物。藥學組成物可藉由混合藥學上有效量之細胞或活性劑/化合物，以及任擇地其它活性物質，以及藥學上可接受之載劑而製得。該載劑可具有不同的形式，取決於投與之途徑。其它活性物質之例子包括已知或由以上所述之篩選方法鑑定之活性化合物。
以上所述之藥學組成物可藉由使用習用藥學賦形劑以及製備方法製得。所有的賦形劑均可混合與崩散劑、溶劑、造粒劑、濕潤劑以及結合劑。在此使用之術語“有效量”或‘治療上有效量’意指一數量，其導致至少一種症狀或特定病症之參數顯著的改善。治療有效 量之以上所述的幹細胞可由業界已知之方法測定。用於治療病症之有效量可很容易地由熟悉此技藝之人士已知之實驗方法測定。要投與至病人的正確數量會隨著病症的狀態以及嚴重性以及病人之生理狀況而改變。任何症狀或參數之顯著的改善可由熟悉此技藝之人士，或由病人對臨床醫師之報告而決定。應了解，以上所述病症之任何臨床上或統計學顯著的減少，或任何症狀或參數之改善，均落在本發明之範疇內。臨床上顯著的減少或改善，意指可被病人和/或臨床醫師察覺。
片語“藥學上可接受”意指此組成物之分子實體或其它成份，當投與至人類時，係具生理耐受性的且典型地不會產生不想要的反應。較佳地，術語"藥學上可接受"意指由聯邦或州政府之管理機構認可，或列在美國藥典或其它普遍認可的藥典中，可用於哺乳動物，更特別地於人類。藥學上可接受之鹽類、酯類、醯胺類以及前趨藥物，意指該等落在深思熟慮之醫療決定內，適合用於與病人之組織接觸，無不當的毒性、刺激、過敏反應等等，具合理的利益/風險比率，且對其等意圖之用途有效的鹽類(如，羧酸鹽、胺基酸加成鹽)、酯類、醯胺類以及前趨藥物。
應用於以上所述之藥學組成物之載劑，意指與化合物一起投與之稀釋劑、賦形劑或載劑。此藥學載劑可為無菌液體，諸如水與油。水或水溶液、食鹽水以及葡萄糖液以及甘油溶液最常作用為載劑，特別是用於注射溶液。適當的藥學載劑述於"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W.Maitin,18th edition中。
以上所述之幹細胞可透過輸注或注射(例如，靜脈內、腦脊髓膜內、肌肉內、管腔內、氣管內、腹膜內或皮下)、口服、經皮或其它業界已知之方法投與至個體。投藥可為每二周一次、一周一次或更常，但在疾病或病症之維持階段期間，頻率可減少。
可使用異源以及自體細胞二者。在前者之情況下，應進行HLA-配對，以避免或使宿主的反應最小。在後者之情況下，濃縮以及純化從一個體中而來之自體細胞，然後貯存供以後使用。可在宿主 或移植T細胞之存在下，活體外培養該細胞，然後重新導回該宿主。此具有宿主可辨識該細胞為自己的以及提供活性減低之T細胞之優點。
劑量以及投與頻率取決於臨床徵兆，當減少或缺少至少一或多種(較佳地超過一種)熟悉此技藝之人士已知之急性期之臨床徵兆時，確認維持在緩解期。更一般地，劑量以及頻率部分取決於預期用以上所述之組成物治療之病理徵兆的衰退以及疾病病況之臨床以及亞臨床症狀。劑量以及投藥方案可隨著下列調整：被投藥的年齡、性別、身體狀況以及在欲治療之病人或哺乳動物個體中之綴合物之利益以及副作用以及臨床醫師之判斷，此係熟悉此技藝之人士公認的。在以上所述之所有方法中，可投與至一個體之幹細胞之數量為1x104至1x1010個/次。
以下具體範例僅用以例示說明，任何情況下均不能作為該揭示內容剩餘部分之限制。在無進一步詳細說明之情況下，一般相信熟悉此技藝之人士，依照在此之說明書，可利用本發明至其最大的範圍。在此所引述之所有的公開文獻之全部內容均在此併入本案限制以為參考。另外，以下假設之任何的機制，在任何情況下均不能約束所請求之發明的範疇。
範例1
從人的身體上抽出血液檢體或骨髓，然後置於抗凝血EDTA管或肝素管中。令該管在4℃下靜置72個小時後，將該檢體分成二層。看起來紅色之底層幾乎全部由紅血球(RBC)以及白血球構成。上層含有具直徑小於6μm之細胞，即SB細胞。SB細胞在US2012/0034194中有更詳細之說明。
之後將SB細胞培養在含有5ng/ml之R-Spondin-1、5ng/ml之SCF、5ng/ml之G-CSF、20ng/ml之bFGF、20ng/ml之EGF以及5ng/ml之PDGF之StemPro-34培養基(INVITROGEN)中，歷時4至14天。在以上所述之培養條件下，細胞之直徑增大至6-25μm。保 持未貼壁之細胞稱作SB-3細胞，該等變成貼壁的稱作SB-4細胞。SB-4細胞呈圓形或橢圓形，比SB-3細胞大，即7-30μm。
使用CD349抗體，從SB混合物中分離出CD349+細胞。亦見US2012/0034194。此等以與SB細胞相同方法培養之CD349+細胞亦長成SB-3細胞，且像SB-4細胞一樣貼在壁上。
測試顯示出，SB-3細胞具有擴張之能力。只要添加所需之生長因子，SB-4細胞能夠經歷增殖以及分化。SB-4細胞能夠經歷至少40個具正常染色體核型以及正常端粒酶活性之繼代。培養的SB-4細胞具有倍增時間約24個小時。
T-PCR分析顯示，SB-3細胞會表達CD10、CXCR4以及CD31，但不會表達CD9、CD349、CD271、CD133、CD66e、CD45、CD20或CD4。SB-4細胞會表達CD105、CD44以及巢蛋白，但不會表達CD34、CD90、CD41、CD117、α-胎兒蛋白、POU5F1、Nanog、Sox2、HNF4a、CD36、HNF3B、Pax6或Pax7。用於RT-PCR之引子示於以下表1中：
Figure TWI614340BD00001
Figure TWI614340BD00002
Figure TWI614340BD00003
範例2
進行用以證實SB-3能夠分化成不同細胞譜系之幹細胞之分析。
簡言之，用以上所述之方法，從一個體中取得SB-3細胞。之後將SB-3細胞培養在分化培養基中。所有用在RT-PCR中，用於偵測分化標記之引子列在以下表2中：
Figure TWI614340BD00004
Figure TWI614340BD00005
誘導SB-3細胞表達巢蛋白，一種形成神經元(外胚層)以及小島細胞(內胚層)之早期標記。簡言之，在含有10nM糖皮質激素以及10% FBS之誘導培養基中培養SB-3細胞。處理1個月後，取出RNA，然後用即時PCR測定基因表達。檢測巢蛋白之表達。
內胚層細胞之特徵為具多角形之形狀。檢測二種肝細胞標記(運鐵蛋白以及白蛋白)以及三種小島細胞標記(胰島素、α-胎兒蛋白以及HNF4α)之表達。此外，西方點墨法以及ELISA二者亦會檢測分化細胞中之白蛋白的表達。此等結果指出，SB-3細胞分化成肝細胞，而一些分化成小島細胞。
外胚層細胞之特徵為具有細絲狀特徵。SB-3細胞分化成神經細胞可用即時RT-PCR確認，其會檢測許多神經元標記之表達，包括CD133、巢蛋白、微管相關蛋白II、GABA受體、NR4A2、N-cam、酪胺酸羥化酶、神經纖維絲以及Tau。
另外，誘導SB-3分化成脂肪細胞或成骨細胞，即中胎層細胞。依序在培養基A、B、C、D以及E中培養SB-3細胞。之後，用脂肪細胞分化培養基(Invitrogen)取代該培養基，歷時8周。使用油紅-O染脂肪細胞，然後在OD490 ELISA分光光度計中檢測。選擇性地，用成骨培養基(Invitrogen)取代該培養基。在培養基取代後2-4周 觀察成骨細胞。用茜素紅染成骨細胞，然後萃取出細胞茜素紅，在分光光度計中，OD 405nm下測量。結果顯示，SB-3細胞可分化成脂肪細胞或成骨細胞。
在誘導成其它中胎層細胞方面，在含有10nM糖皮質激素以及10% FBS之培養基中培養SB-3細胞。處理1個月後，從細胞中取出RNA，然後用即時PCR測定許多基因之表達。檢測至肌球蛋白重鏈以及骨骼肌球蛋白輕鏈之表達指出，SB-3細胞分化成心肌細胞以及骨髂肌細胞。
以上之結果建議，收到訊號時，SB-3細胞被活化以及分化成適合的組織，用以修復受損的組織。因此，此等細胞含有成熟多功能性幹細胞，且可用於基因治療、基因銀行建制、藥物篩選以及製造通用型供體細胞。此外，此等細胞可用於治療退化性疾病、自體免疫疾病或癌症。
範例3
在4種不同類型的培養基中培養SB-4細胞，分析以便確認分化成功。為測試中胎層分化，於脂肪生成以及成骨培養基中培養細胞。油紅O以及茜素紅染色顯示，與其等之陰性對照組相比，脂肪細胞以及成骨細胞分別顯著的增加。
為研究外胚層分化能力，在神經元分化培養基中培養SB-4細胞。從ICC神經纖維絲染色以及即時PCR之結果確認，SB-4具神經元分化能力。
亦藉由將SB-4細胞連續於如下3種不同培養基中培養，誘導SB-4細胞分化成肝細胞。
首先，在含有3%馬血清、1x抗鰴菌、1xL-麩醯胺酸以及5ng/mL活化素之DMEM/高葡萄糖培養基中培養SB-4細胞5天。接著，在相同培養基(但以20ng/mL bFGF以及5ng/mL BMP2取代活化素)中進一步培養15天。最後，在含有1%馬血清、10ng/mL HGF、10nM糖皮質激素DEX以及10ng/mL OSM之培養基中培養該細胞15 天，直到像肝細胞之細胞出現。常規更新培養基至少一周二次。用顯微鏡觀察像肝細胞之細胞。另外，用以下列出之引子進行即時RT-PCR，測試其等之肝細胞標記之表達：
Figure TWI614340BD00006
結果顯示，像肝細胞之細胞的確表達三種肝細胞標記，即，白蛋白、運鐵蛋白以及HNF-3β。
吾人相信，此等像肝細胞之細胞可具有代謝以及成功地移除毒性，諸如氨，以及合成尿素用於排毒之能力。因此，像肝細胞之細胞可用作為人工肝系統，其能夠複製人類肝功能以及支持具急性肝衰竭之病人。此外，我們的像肝細胞之細胞可產生白蛋白，其係市場上非常重要的產品，因為其可用作為小型丸劑/藥物之載劑。
因此，此等像肝細胞之細胞可用於製造人工肝系統以及促進藥學傳送。此等細胞亦可用於治療肝退化性疾病以及肝癌。
其它具體例
在此說明書中所揭示之所有的特徵可以任何組合之形式組合。在此說明書中揭示之每一種特徵均可被作用相同、相等或相似目的之替代特徵取代。因此，除了明確地說明，否則所揭示之每一種特徵僅一系列相等或相似特徵之範例。
已經說明了本發明之一些具體例。不過，應了解，可在不逸離本發明之技術思想之範疇之情況下製得各種修飾物。據此，其它具體例係落在以下申請專利範圍之範疇內。
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
Figure TWI614340BD00033
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
Figure TWI614340BD00034
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
Figure TWI614340BD00035
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
Figure TWI614340BD00036
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
Figure TWI614340BD00037
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
Figure TWI614340BD00038
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
Figure TWI614340BD00039
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
Figure TWI614340BD00040
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
Figure TWI614340BD00041
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
Figure TWI614340BD00042
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
Figure TWI614340BD00043
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
Figure TWI614340BD00044
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
Figure TWI614340BD00045
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
Figure TWI614340BD00046
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
Figure TWI614340BD00047
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
Figure TWI614340BD00048
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
Figure TWI614340BD00049
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
Figure TWI614340BD00050
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
Figure TWI614340BD00051
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
Figure TWI614340BD00052
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
Figure TWI614340BD00053
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
Figure TWI614340BD00054
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
Figure TWI614340BD00055
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
Figure TWI614340BD00056
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
Figure TWI614340BD00057
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
Figure TWI614340BD00058
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
Figure TWI614340BD00059
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
Figure TWI614340BD00060
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
Figure TWI614340BD00061
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
Figure TWI614340BD00062
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
Figure TWI614340BD00063
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
Figure TWI614340BD00064
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
Figure TWI614340BD00065
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
Figure TWI614340BD00066
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
Figure TWI614340BD00067
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
Figure TWI614340BD00068
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
Figure TWI614340BD00069
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
Figure TWI614340BD00070
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
Figure TWI614340BD00071
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
Figure TWI614340BD00072
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
Figure TWI614340BD00073
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
Figure TWI614340BD00074
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
Figure TWI614340BD00075
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
Figure TWI614340BD00076
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
Figure TWI614340BD00077
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
Figure TWI614340BD00078
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
Figure TWI614340BD00079
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
Figure TWI614340BD00080
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
Figure TWI614340BD00081
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
Figure TWI614340BD00082
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
Figure TWI614340BD00083
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
Figure TWI614340BD00084
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
Figure TWI614340BD00085
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
Figure TWI614340BD00086
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
Figure TWI614340BD00087
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
Figure TWI614340BD00088
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
Figure TWI614340BD00089
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
Figure TWI614340BD00090
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
Figure TWI614340BD00091
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
Figure TWI614340BD00092
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
Figure TWI614340BD00093
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 88
Figure TWI614340BD00094
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
Figure TWI614340BD00095
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
Figure TWI614340BD00096
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
Figure TWI614340BD00097
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
Figure TWI614340BD00098

Claims (14)

  1. 一種經分離的體幹細胞群，其為CD105+、CD44+、巢蛋白(Nestin)+、CD34-、CD90-、CD41-、CD117-、α-胎兒蛋白-、POU5F1-、Nanog-、Sox2-、HNF4a-、CD36-、HNF3B-、Pax6-及Pax-7-，以及為7-30微米大小，其中該經分離的體幹細胞群係藉由一方法而被製備，該方法包含：於容器中用EDTA或肝素培育從一個體獲得之含有多種細胞的體液檢體，直到該檢體分成上層以及下層，收集該上層，從該上層分離出0.3-6.0微米大小之小體幹細胞群，以及在含有R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF之培養基中培養該經分離的小體幹細胞群，藉此該體幹細胞群被製備。
  2. 如請求項1之經分離的體幹細胞群，其中該經分離的體幹細胞群係多功能性或多潛能性的。
  3. 如請求項1或2之經分離的體幹細胞群，其中該經分離的體幹細胞群係貼壁的。
  4. 如請求項1或2之經分離的體幹細胞群，其中該個體係人類。
  5. 一種細胞銀行，其包含多種體幹細胞群，其中各群為CD105+、CD44+、巢蛋白+、CD34-、CD90-、CD41-、CD117-、α-胎兒蛋白-、POU5F1-、Nanog-、Sox2-、HNF4a-、CD36-、HNF3B-、Pax6-及Pax-7-，以及該群係源自於不同的個體，其中各個體幹細胞群係藉由一方法而被製備，該方法包含：於容器中用EDTA或肝素培育從一個體獲得之含有多種細胞的體液檢體，直到該檢體分成上層以及下層， 收集該上層，從該上層分離出0.3-6.0微米大小之小體幹細胞群，以及在含有R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF之培養基中培養該經分離的小體幹細胞群，藉此該體幹細胞群被製備。
  6. 如請求項5之細胞銀行，其中該不同的個體係人類。
  7. 一種製備體幹細胞群之方法，該方法包含：於容器中用EDTA或肝素培育從一個體獲得之含有多種細胞的體液檢體，直到該檢體分成上層以及下層，收集該上層，從該上層分離出0.3-6.0微米大小之小體幹細胞群，以及在含有R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF之培養基中培養該經分離的小體幹細胞群，藉此CD105+、CD44+、巢蛋白+、CD34-、CD90-、CD41-、CD117-、α-胎兒蛋白-、POU5F1-、Nanog-、Sox2-、HNF4a-、CD36-、HNF3B-、Pax6-及Pax-7-以及7-30微米大小之體幹細胞群被製備。
  8. 如請求項7之方法，其中該體液檢體係血液檢體或骨髓檢體。
  9. 一種從體幹細胞製備肝細胞之方法，該方法包含：在含有活化素之第一分化培養基中培養如請求項1之經分離的體幹細胞群；在含有鹼性FGF以及BMP2之第二分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群；在含有HGF、DEX以及OSM之第三分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群；以及 收集因此獲得之肝細胞，該肝細胞會表達白蛋白、運鐵蛋白以FTNF3B。
  10. 一種製造體外生物人工肝裝置之方法，其包含：在含有活化素之第一分化培養基中培養如請求項1之經分離的體幹細胞群；在含有鹼性FGF以及BMP2之第二分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群；在含有HGF、DEX以及OSM之第三分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群；收集因此獲得之肝細胞，該肝細胞會表達白蛋白、運鐵蛋白以及FTNF3B；提供一生物人工裝置，該裝置包括含有一中空纖維陣列的卡匣，其中該中空纖維各由具有孔大小約0.1微米至0.3微米之膜形成；以及將該所收集的肝細胞置於該中空纖維間的毛細管外空間。
  11. 如請求項10之方法，其中該卡匣為圓柱形，其在一端具有第一開口且在另一端具有第二開口；以及該第一開口固定至第一通道而該第二開口固定至第二通道，該二個通道從該卡匣延伸出去。
  12. 一種產生白蛋白之方法，其包含：在含有活化素之第一分化培養基中培養如請求項1之經分離的體幹細胞群；在含有鹼性FGF以及BMP2之第二分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群；在含有HGF、DEX以及OSM之第三分化培養基中培養該經分離的體幹細胞群； 收集因此獲得之肝細胞，該肝細胞會表達白蛋白、運鐵蛋白以及FTNF3B；於一培養基中培養該所收集的肝細胞，以及從該培養基收集由該肝細胞所產生之白蛋白。
  13. 一種從體幹細胞製備神經細胞、脂肪細胞或成骨細胞之方法，該方法包含：在容許如請求項1之經分離的體幹細胞群分化成為神經細胞、脂肪細胞或成骨細胞的條件下，將該經分離的體幹細胞群培養在用於誘導出神經細胞、脂肪細胞或成骨細胞的分化培養基中。
  14. 如請求項13之方法，其中該經分離的體幹細胞群係人類細胞。
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