Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

TWI607757B - 治療製劑 - Google Patents

治療製劑 Download PDF

Info

Publication number
TWI607757B
TWI607757B TW100141139A TW100141139A TWI607757B TW I607757 B TWI607757 B TW I607757B TW 100141139 A TW100141139 A TW 100141139A TW 100141139 A TW100141139 A TW 100141139A TW I607757 B TWI607757 B TW I607757B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mir
cells
cell
preparation
beads
Prior art date
Application number
TW100141139A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201304787A (zh
Inventor
喬伊狄普 巴蘇
理查 潘尼
尼爾Ｆ 二世 羅賓
歐路瓦托因Ａ 凱奈特
迪派克 金恩
克雷格Ｒ 希柏斯塔特
莫尼卡Ａ 賽賓
Original Assignee
英瑞金公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 英瑞金公司 filed Critical 英瑞金公司
Publication of TW201304787A publication Critical patent/TW201304787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI607757B publication Critical patent/TWI607757B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/10—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing inorganic materials
    • A61L2300/106—Halogens or compounds thereof, e.g. iodine, chlorite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/21—Acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/426—Immunomodulating agents, i.e. cytokines, interleukins, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/26—Materials or treatment for tissue regeneration for kidney reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

治療製劑
本發明係關於諸如生物活性細胞群等之活性劑的治療製劑和其製備方法，以及向需要之受檢者投與製劑的方法。
基於膠原蛋白及明膠的生物材料已經成功用於各種各樣的組織工程應用(Rohanizadeh等人J Mater Sci Mater Med 2008；19：1173-1182；Takemoto等人Tissue Eng Part A 2008；14：1629-1638；Young等人J Control Release 2005；109：256-274)。該等巨分子皆具有優良生物相容性及低抗原性之特性(Cenni等人J Biomater Sci Polym Ed 2000；11：685-699；Lee等人Int J Pharm 2001；221：1-22；Waksman等人J Immunol 1949；63：427-433)；然，由於明膠係藉由膠原蛋白之水解獲得，故它具有優於後者之一些優點。(a)容易得到且容易使用；(b)提供關於分子量及布盧姆值(bloom)的選擇(即，對物理性質的控制)；及(c)面對化學改質之靈活性更高以及製造更簡單直接。另外，自生物學觀點而言，明膠保持類似於膠原蛋白的細胞相容性及細胞黏附性質Engvall等人Int J Cancer 1977；20：1-5；Kim等人Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009；108：e94-100)。
已經報導各種方法用於該等巨分子的交聯，以延遲其生物降解從而延長其活體內滯留時間(在組織工程應用 中)或定製其藥物釋放能力(在用作藥物載劑時)。已經發表用於膠原蛋白或明膠之化學或光化學交聯的諸多方法(Adhirajan等人J Microencapsul 2007；24：647-659；Chang等人Macromol Biosci 2007；7：500-507；Gagnieu等人Biomed Mater Eng 2007；17：9-18；Kimura等人J Biomater Sci Polym Ed 2010；21：463-476；Ma等人J Biomed Mater Res A 2004；71：334-342；Vandelli等人Int J Pharm 2001；215：175-184；Vandelli等人J Control Release 2004；96：67-84)。該等程序中大多數靶向於降低該等生物材料對酶降解之易感性以及延長其活體內滯留時間(Chang等人同上2007；Ma等人同上2004)。通常採用其他交聯方法來產生適用作緩慢釋放藥物、蛋白質或核酸載劑的基於明膠或膠原蛋白之生物材料(Kimura同上2010；Vandelli同上2004；Kommareddy等人Nanomedicine 2007；3：32-42；Sehgal等人Expert Opin Drug Deliv 2009；6：687-695；Sutter等人J Control Release 2007；119：301-312)。對於膠原蛋白與明膠以及其他組織工程相容系統而言，廣泛使用之交聯劑種類為碳化二亞胺類(Adhirajan同上2007；Olde Damink等人Biomaterials 1996；17：765-773；Pieper等人Biomaterials 2000；21：581-593；Cornwell等人Clin Podiatr Med Surg 2009；26：507-523)。該等分子被稱作零長度交聯劑，係藉由介導在欲交聯之物種上存在的羧基與一級胺官能基之間醯胺鍵的形成來起作用。此外，碳化二亞胺類相較 於其他常用交聯劑(例如戊二醛)之細胞毒性較低(Lai等人J Mater Sci Mater Med 2010；21：1899-1911)。戊二醛在CultispherTM珠粒中用作交聯劑。Burg美國專利第6,991,652號描述用於可能欲遞送至受檢者之細胞的含有三維載體構築體的組織工程複合物。
再生醫學技術提供用於慢性腎病(CKD)之下一代治療選擇。Presnell等人WO/2010/056328及Ilagan等人PCT/US2011/036347描述分離之生物活性腎細胞，包含腎小管及產生紅血球生成素(EPO)之腎細胞群，及其分離與培養方法，以及用該等細胞群處理有需要之受檢者的方法。
對於適用於將活性劑，例如在組織工程及再生醫學應用中之生物活性細胞遞送至有需要之受檢者的治療製劑存在需要。
在一個態樣中，本發明提供含有活性劑，例如生物活性細胞之可注射的治療製劑。在一個實施例中，可注射的製劑包括生物活性細胞及溫度敏感性細胞穩定生物材料。在另一實施例中，溫度敏感性細胞穩定生物材料(i)在約8℃或8℃以下保持實質上之固態及/或(ii)在環境溫度或環境溫度以上保持實質上之液態。在另一實施例中，生物活性細胞包括如本文中所述之腎細胞。在另一實施例中，生物活性細胞實質上均勻地分散於細胞穩定生物材料之整個體積中。在其他實施例中，生物材料在 約8℃與約環境溫度或環境溫度以上之間具有固-液轉變態。在一個實施例中，實質上之固態為凝膠態。在另一實施例中，細胞穩定生物材料包括水凝膠(hydrogel)。在另一實施例中，水凝膠包括明膠。在其他實施例中，明膠以約0.5%至約1%(w/v)存在於製劑中。在一個實施例中，明膠以約0.75%(w/v)存在於製劑中。在另一實施例中，製劑進一步包含細胞活力劑(cell viability agent)。在另一實施例中，細胞活力劑包括選自由抗氧化劑、載氧體(oxygen carrier)、免疫調節因子、細胞募集因子、細胞黏附因子、抗發炎劑、免疫抑制劑、血管生成因子(angiogenic factor)及傷口癒合因子組成之群的試劑。在一些實施例中，細胞活力劑係為抗氧化劑。在一個實施例中，抗氧化劑係為6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)。在另一實施例中，6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸以約50μM至約150μM存在。在另一實施例中，6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸以約100μM存在。在一些實施例中，細胞活力劑係為載氧體。在一個實施例中，載氧體係為全氟碳(perfluorocarbon)。在其他實施例中，細胞活力劑係為免疫調節劑。在一個實施例中，細胞活力劑係為免疫抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供含有生物活性腎細胞之可注射的治療製劑。在一個實施例中，製劑包括生物活性腎細胞、約0.75%(w/v)明膠，及約100μM 6-羥基-2,5,7,8- 四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸，其中製劑(i)在約8℃或8℃以下具有實質上之固態及/或(ii)在環境溫度或環境溫度以上具有實質上之液態。在另一實施例中，生物活性腎細胞實質上均勻地分散於細胞穩定生物材料之整個體積中。在另一實施例中，生物材料在約8℃與約環境溫度之間包括固-液轉變態。在其他實施例中，實質上之固態為凝膠態。在一些實施例中，製劑進一步包含細胞活力劑。在另一實施例中，細胞活力劑包括選自由抗氧化劑、載氧體、免疫調節因子、細胞募集因子、細胞黏附因子、抗發炎劑、血管生成因子及傷口癒合因子組成之群的試劑。在一個實施例中，細胞活力劑係為載氧體。在另一實施例中，載氧體係為全氟碳。在另一實施例中，細胞活力劑係為免疫調節劑。在其他實施例中，細胞活力劑係為免疫抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供進一步包含生物相容性珠粒的本文所述之製劑。在一個實施例中，生物相容性珠粒包括生物材料。在另一實施例中，珠粒為經交聯的。在另一實施例中，經交聯之珠粒相較於未交聯之生物相容性珠粒具有對酶降解之降低易感性。在其他實施例中，經交聯之珠粒為經碳化二亞胺交聯之珠粒。在一個實施例中，碳化二亞胺選自由1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、DCC-N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)，及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIPC)組成之群。在另一實施例中，碳化二亞胺為1-乙基-3-[3-二甲胺 丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在另一實施例中，經交聯之珠粒包括相較於未交聯之珠粒降低數目之游離一級胺。在其他實施例中，游離一級胺之數目可用分光光度法在約355nm偵測。在一些實施例中，對珠粒接種生物活性細胞。在一個實施例中，生物活性細胞為腎細胞。在另一實施例中，製劑進一步包括額外的生物相容性珠粒，其包含(i)在環境溫度或環境溫度以下保持實質上之固態，及(ii)在約37℃或37℃以上保持實質上之液態的溫度敏感性生物材料。在另一實施例中，珠粒之生物材料在環境溫度與約37℃之間包含固-液轉變態。在其他實施例中，實質上之固態為凝膠態。在一個實施例中，珠粒之生物材料包括水凝膠。在另一實施例中，水凝膠包括明膠。在另一實施例中，珠粒包含約5%(w/v)至約10%(w/v)的明膠。在一些實施例中，額外的生物相容性珠粒為間隔珠粒(spacer bead)。在其他實施例中，未對間隔珠粒接種生物活性細胞。
在另一態樣中，本發明之製劑含有由腎細胞群分泌之產物。在一個實施例中，製劑包含由腎細胞群及/或生物活性細胞分泌之產物。在另一實施例中，生物活性細胞為腎細胞。在另一實施例中，該等產物包括旁分泌因子、內分泌因子及鄰分泌因子中之一或多者。在另一實施例中，產物包括囊泡。在其他實施例中，囊泡包括微囊泡(microvesicle)。在一個實施例中，囊泡包括外切體(exosome)。在另一實施例中，囊泡包括選自由旁分泌因 子、內分泌因子、鄰分泌因子及RNA組成之群的分泌性產物。
本發明係關於諸如生物活性細胞等之活性劑的治療製劑，以及其製備方法和用製劑治療有需要之受檢者的方法。該等生物活性細胞製劑可適用於生物活性腎細胞(BRC)之異質性混合物或餾分。生物活性腎細胞可為分離之腎細胞，包含腎小管及產生紅血球生成素(EPO)之腎細胞。BRC細胞群可包含富集之腎小管及產生EPO之細胞群。BRC可來源於來自健康個體之腎細胞餾分或者自身為來自健康個體之腎細胞餾分。此外，本發明提供自非健康個體獲得的腎細胞餾分，其相較於健康個體之對應腎細胞餾分可能缺少某些細胞組分，但仍保留治療性質。本發明亦提供相較於健康個體缺少細胞組分之治療活性細胞群，在一個實施例中，該等細胞群可為自各種疾病狀態中之同種自體性來源(autologous source)分離的且擴增的。
儘管本文中描述生物活性細胞製劑，但本發明涵蓋含有各種各樣的其他活性劑之製劑。其他適合的活性劑包含，但不限於，細胞聚集體、無細胞生物材料、自生物活性細胞分泌之產物、大分子與小分子治療劑，以及其組合。舉例而言，一種類型之生物活性細胞可與帶治療分子或不帶治療分子之基於生物材料之微載劑或與另一 類型之生物活性細胞組合，未黏附之分子可與無細胞粒子組合。
1.定義
除非另外定義，否則本文中使用之科技術語具有與熟習本發明所屬之技藝者所普遍理解之相同含義。第三版Principles of Tissue Engineering(R Lanza、R Langer及J Vacanti編)(2007)為熟習此項技藝者提供關於本申請中所使用之許多術語的總體準則。熟習此項技藝者將認識到，與本文所述之彼等方法與材料類似或等效之許多方法與材料可用於本發明之實踐中。當然，本發明絕不限制於所描述之方法與材料。
本文中所使用之術語「細胞群」係指直接自適合的組織源，通常自哺乳動物分離所獲得的一定數目之細胞。分離之細胞群隨後可在活體外(in vitro)培養。熟習此項技藝者將瞭解，用於分離及培養細胞群之各種方法可用於本發明，且細胞群中各種數目之細胞可適用於本發明。細胞群可為來源於器官或組織，例如腎之未分餾、異質性細胞群。舉例而言，異質性細胞群可分離自組織切片或分離自整個器官組織。或者，異質性細胞群可來源於自組織切片或整個器官組織建立的哺乳動物細胞之活體外培養物。未分餾之異質性細胞群亦可稱作未富集之細胞群。在一個實施例中，細胞群含有生物活性細胞。
術語「天然器官」應指活體受檢者之器官。受檢者可為健康的或非健康的。非健康的受檢者可具有與彼特定 器官相關之疾病。
術語「天然腎」應指活體受檢者之腎。受檢者可為健康的或非健康的。非健康的受檢者可具有腎病。
術語「再生效應」應指對天然器官，諸如腎提供益處之效應。該效應可包含，但不限於，對天然器官之損傷程度的降低，或天然器官功能之改良、恢復或穩定。腎損傷可為纖維化、發炎、腎絲球肥大等之形式，且和與受檢者中的天然器官相關之疾病有關。
本文中所使用之術語「摻雜物」係指來源於未分餾之異質性細胞群的兩個或兩個以上分離之富集細胞群的組合。根據某些實施例，本發明之細胞群為腎細胞群。
「經富集之」細胞群或製備物係指來源於起始器官細胞群(例如，未分餾之異質性細胞群)且所含的特定細胞類型之百分比高於起始群中彼細胞類型百分比之細胞群。舉例而言，起始腎細胞群可針對所關注之第一、第二、第三、第四、第五等細胞群富集。本文中所使用之術語「細胞群」、「細胞製備物」及「細胞原型」可互換地使用。
在一態樣中，本文中所使用之術語「經富集之」細胞群係指來源於起始器官細胞群(例如，來自腎切片或經培養之哺乳動物腎細胞的細胞懸浮液)且所含的能夠產生EPO之細胞之百分比高於起始群中能夠產生EPO之細胞百分比的細胞群。舉例而言，術語「B4」為來源於起始腎細胞群且所含的產生EPO之細胞、腎絲球細胞及血管 細胞之百分比相較於起始群更高之細胞群。本發明之細胞群可針對一或多種細胞類型富集且耗減一或多種其他細胞類型。舉例而言，經富集之產生EPO之細胞群可相對於未富集之細胞群中之間質纖維母細胞及腎小管細胞，針對間質纖維母細胞富集且耗減腎小管細胞及集合管上皮細胞，所述未富集之細胞群即為經富集之細胞群所來源之起始細胞群。在提及EPO富集群或「B4」群之所有實施例中，經富集之細胞群為含有可利用氧調節(oxygen-regulated)方式產生EPO之細胞的異質性細胞群，如由內源性天然EPO基因之氧調諧的(oxygen-tunable)EPO表現所證實。
在另一態樣中，所含的特定細胞類型，例如腎小管、腎絲球或內分泌細胞之百分比高於起始群中彼細胞類型之百分比的經富集之腎細胞群，相較於來源於健康個體或受檢者之起始腎細胞群，亦可能缺少或缺乏一或多種特定細胞類型，例如腎小管、腎絲球或內分泌細胞。舉例而言，在一態樣中，術語「B4’」或「B4引號(B4 prime)」為來源於起始腎細胞群且取決於起始試樣之疾病狀態，相較於健康個體缺少或缺乏一或多種細胞類型，例如腎小管、腎絲球或內分泌細胞的細胞群。在一個實施例中，B4’細胞群來源於具有慢性腎病之受檢者。在一個實施例中，B4’細胞群來源於具有局部節段性腎絲球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis；FSGS)之受檢者。在另一實施例中，B4’細胞群來源於具有自體免疫性腎絲 球腎炎之受檢者。在另一態樣中，B4’為來源於包含所有細胞類型(例如，血管、腎絲球或內分泌細胞)之起始細胞群的細胞群，其稍後耗減一或多種細胞類型，例如，血管、腎絲球或內分泌細胞，或造成該等細胞類型之缺乏。在又一態樣中，B4’為來源於包含所有細胞類型(例如，血管、腎絲球或內分泌細胞)之起始細胞群的細胞群，其中稍後富集一或多種特定細胞類型，例如，血管、腎絲球或內分泌細胞。舉例而言，在一個實施例中，B4’細胞群可針對血管細胞富集，而耗減腎絲球及/或內分泌細胞。在另一實施例中，B4’細胞群可針對腎絲球細胞富集，而耗減血管及/或內分泌細胞。在另一實施例中，B4’細胞群可針對內分泌細胞富集，而耗減血管及/或腎絲球細胞。在另一實施例中，B4’細胞群可針對血管及內分泌細胞富集，而耗減腎絲球細胞。在較佳之實施例中，B4’細胞群，單獨或與另一經富集之細胞群(例如B2及/或B3)摻雜，保留治療性質。舉例而言，本文在實例中，例如在實例11-13中描述B4’細胞群。
在另一態樣中，經富集之細胞群亦可指來源於如上文討論之起始腎細胞群且所含的表現一或多種血管、腎絲球及近端腎小管標誌物之細胞及一些產生EPO之細胞之百分比高於起始群中表現一或多種血管、腎絲球及近端腎小管標誌物之細胞及一些產生EPO之細胞之百分比的細胞群。舉例而言，術語「B3」係指來源於起始腎細胞群且所含的近端腎小管細胞以及血管與腎絲球細胞之百 分比相較於起始群更高之細胞群。在一個實施例中，B3細胞群所含的近端腎小管細胞之百分比相較於起始群更高，但相較於B2細胞群之近端腎小管細胞之百分比更低。在另一實施例中，B3細胞群所含的血管與腎絲球細胞標誌物及一些產生EPO之細胞之百分比相較於起始群更高，但相較於B4細胞群之血管與腎絲球細胞標誌物及一些產生EPO之細胞之百分比更低。
在另一態樣中，經富集之細胞群亦可指來源於如上文討論之起始腎細胞群且所含的表現一或多種腎小管細胞標誌物之細胞之百分比高於起始群中表現一或多種腎小管細胞標誌物之細胞之百分比的細胞群。舉例而言，術語「B2」係指來源於起始腎細胞群且所含的腎小管細胞之百分比相較於起始群更高之細胞群。此外，針對表現一或多種腎小管細胞標誌物之細胞富集之細胞群(或「B2」)可含有來自集合管系統的一些上皮細胞。雖然針對表現一或多種腎小管細胞標誌物之細胞富集之細胞群(或「B2」)相對耗減產生EPO之細胞、腎絲球細胞及血管細胞，但經富集之群相較於起始群可含有較小百分比之該等細胞(產生EPO之細胞、腎絲球細胞及血管細胞)。一般而言，異質性細胞群耗減一或多種細胞類型以使得經耗減之細胞群相對於耗減之前異質性細胞群中所含之該(等)細胞類型之比例，含有更小比例之該(等)細胞類型。可耗減之細胞類型可為任何類型之腎細胞。舉例而言，在某些實施例中，可耗減之細胞類型包含具有集合管與 腎小管系統之大細微性且具有<約1.045g/ml之密度的細胞，稱為「B1」。在某些其他實施例中，可耗減之細胞類型包含具有低細微性及活力且具有>約1.095g/ml之密度的碎片及小細胞，稱為「B5」。在一些實施例中，針對腎小管細胞富集之細胞群相對耗減所有以下細胞：「B1」、「B5」、氧調諧的表現EPO之細胞、腎絲球細胞及血管細胞。
本文中所使用之術語「低氧」培養條件係指相對於在大氣氧水準(約21%)下培養細胞之標準培養條件，細胞經受培養系統中可用氧水準之降低的培養條件。非低氧條件在本文中稱為正常或常氧培養條件。
本文中所使用之術語「氧調諧」係指細胞基於其可用之氧的量調節基因表現(向上或向下)之能力。「低氧誘導(Hypoxia-inducible)」係指回應於氧壓(oxygen tension)之降低(無論誘導前或起始氧壓如何)的基因表現之上調。
本文中所使用之術語「生物材料」係指適用於引入活體組織中之自然或合成的生物相容性材料。自然生物材料為由活體系統產生或源自於活體系統之材料。合成的生物材料為並非由活體系統產生或並非源自於活體系統之材料。本文中所揭示之生物材料可為自然與合成的生物相容性材料之組合。本文中所使用之生物材料包含例如聚合性基質及支架。熟習此項技藝者將瞭解，生物材料可經組態為各種形式，例如，呈多孔性泡沫、凝膠、 液體、珠粒、固體之形式，且可包括一或多種自然或合成的生物相容性材料。在一個實施例中，生物材料係為呈能夠變成水凝膠之溶液之液體形式。
術語「修飾釋放」或等效術語「控制釋放」、「延遲釋放」或「緩慢釋放」係指隨時間釋放或者在投與至個體之後在一個以上時間點釋放活性劑(諸如生物活性細胞)之製劑。活性劑之修飾釋放(可取決於製劑而在一定範圍之所需時間內發生，例如數分鐘、數小時、數天、數周或更長時間)係與標準製劑相比而言，在標準製劑中實質上整個劑量單位在投與之後立即可用。對於組織工程及再生醫學應用而言，優選之修飾釋放製劑提供活性劑在局部投與(例如，活性劑直接至實體器官之投與)之後在多個時間點之釋放。舉例而言，生物活性細胞之修飾釋放製劑將提供細胞在投與時間後立即之初始釋放以及稍後細胞在稍後時間之第二次釋放。對於活性劑之第二次釋放之時間延遲可為初始投與之後數分鐘、數小時或數天。一般而言，對於釋放延遲之時間段對應於活性劑之生物材料載劑喪失其結構完整性所花費的時間段。活性劑之延遲釋放隨著此完整性開始降級而開始且至完整性完全失效之時結束。熟習此項技藝者將瞭解其他適合的釋放機制。
本文中所使用之術語「貧血症」係指由於受檢者之產生EPO之細胞的功能性EPO蛋白質之產生不足，及/或EPO蛋白質至體循環中之釋放不足，及/或骨髓中之紅血 球母細胞無法回應於EPO蛋白質，而造成的紅血球數及/或血紅素水準之缺乏。有貧血症之受檢者無法維持紅血球系之穩態(erythroid homeostasis)。一般而言，貧血症可隨著腎功能下降或喪失(例如，慢性腎衰竭)、與相對EPO缺乏相關之貧血症、與充血性心臟衰竭相關之貧血症、與諸如化學療法或抗病毒療法(例如，AZT)等之骨髓抑制性療法相關之貧血症、與非骨髓系癌症相關之貧血症、與諸如HIV等之病毒感染相關之貧血症，及諸如自體免疫性疾病(例如，類風濕性關節炎)等之慢性疾病之貧血症、肝病及多器官系統衰竭而發生。
術語「EPO缺乏」係指可用紅血球生成素受體激動劑(例如，重組的EPO或EPO類似物)治療之任何病況或病症，包含貧血症。
本文中所使用之術語「器官相關性疾病」係指與急性或慢性器官衰竭之導致器官喪失執行其功能之能力的任何階段或程度相關之病症。
本文中所使用之術語「腎病」係指與急性或慢性腎衰竭之導致腎喪失執行血液過濾及從血液中排出過量分泌液、電解質及廢物之功能之能力的任何階段或程度相關之病症。腎病亦包含諸如貧血症(紅血球生成素缺乏)等之內分泌功能障礙，及礦物質不平衡(維生素D缺乏)。腎病可源自於腎或可繼發於各種各樣之病況，包含(但不限於)心臟衰竭、高血壓、糖尿病、自體免疫性疾病或肝病。腎病可為發展於對腎之急性損傷之後的慢性腎衰竭之病 況。舉例而言，因局部缺血及/或暴露於毒物所致的對腎之損傷可能造成急性腎衰竭；急性腎損傷之後的不完全恢復可能導致發展慢性腎衰竭。
術語「治療」係指對於腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷之治療性治療與預防性(prophylactic/preventative)措施，其中目的在於逆轉、阻止或減慢(減輕)目標病症。有治療需要者包含已經患上腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷者，以及容易患上腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷者，或欲防止其腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷者。本文中所使用之術語「治療」包含腎功能之穩定及/或改良。
本文中所使用之術語「活體內接觸(in vivo contacting)」係指由經富集之細胞群所分泌之產物與天然器官之間在活體內之直接接觸。舉例而言，由經富集之腎細胞群(或含有腎細胞及/或腎細胞餾分之摻雜物或構築體)所分泌之產物可在活體內接觸天然腎。直接活體內接觸在性質上可為旁分泌性、內分泌性或鄰分泌性。所分泌之產物可為本文中所述之不同產物之異質性群體。
本文中所使用之術語「核糖核酸」或「RNA」係指其中每一單元均由含氮鹼基、核糖及磷酸鹽構成之核苷酸單元鏈。RNA可為單鏈或雙鏈形式。RNA可為囊泡之一 部分、在囊泡內或與囊泡相關。囊泡可為外切體。RNA包含，但不限於，mRNAs、rRNA、小RNAs、snRNAs、snoRNAs、微RNAs(miRNAs)、小干擾RNAs(siRNAs)及非編碼RNAs。RNA較佳為人RNA。
術語「構築體」係指沈積在由一或多種合成或自然發生之生物相容性材料構成之支架或基質的表面上或表面中之一或多種細胞群。該一或多種細胞群可用由一或多種合成或自然發生之生物相容性生物材料、聚合物、蛋白質或肽構成之生物材料塗佈，沈積在該生物材料上，包埋於該生物材料中，黏附至該生物材料上，接種或捕獲於該生物材料中。該一或多種細胞群可在活體外(in vitro)或活體內(in vivo)與生物材料或支架或基質組合。一般而言，對用以形成支架/生物材料之一或多種生物相容性材料進行選擇，以引導、促進或允許沈積於其上之細胞群中的至少一者之多細胞、三維組織(organization)之形成。亦可對用以產生構築體之一或多種生物材料進行選擇，以引導、促進或允許構築體或構築體之細胞組分在內源性宿主組織中之分散或與後者之整合，或者以引導、促進或允許構築體或構築體之細胞組分之存活、植入、耐受或功能表現(functional performance)。
術語「標誌物」或「生物標誌物」一般而言係指DNA、RNA、蛋白質、碳水化合物或基於糖脂之分子標誌物，其在經培養之細胞群中之表現或存在可藉由標準方法(或本文所揭示之方法)偵測，且與該經培養之細胞群中 為特定細胞類型之一或多種細胞相一致。標誌物可為由細胞表現之多肽或染色體上可識別之物理位置，諸如基因、限制性內切核酸酶辨識位點或編碼由天然細胞表現之多肽(例如，mRNA)之核酸。標誌物可為基因之經表現區域，稱為「基因表現標誌物」，或者DNA之不具已知的編碼功能之某一節段。生物標誌物可為細胞源性產物，例如細胞分泌之產物。
術語「差異表現之基因」、「差異性基因表現」及其同義詞可互換使用，係指基因之表現在第一細胞或細胞群中相對於其在第二細胞或細胞群中之表現，經啟動而達到更高或更低水準。術語亦包含基因之表現經啟動而在第一或第二細胞於培養中之傳代期間隨時間在不同階段達到更高或更低水準。亦應理解，差異表現之基因可為在核酸水準或蛋白質水準上受啟動或受抑制的，或者可經受替代性剪接而導致不同之多肽產物。此等差別可由(例如)mRNA水準、表面表現、分泌或多肽之其他分割(partitioning)上之變化來證明。差異性基因表現可包含兩個或兩個以上基因或其基因產物之間表現之比較，或者兩個或兩個以上基因或其基因產物之間表現之比率之比較，或者甚至同一基因的兩種相異加工之產物之比較(其在第一細胞與第二細胞之間有所不同)。差異性表現包含基因或其表現產物之時間(temporal)或細胞表現樣式在例如第一細胞與第二細胞之間的定量以及定性差別。就本發明而言，當給定基因之表現在第一細胞與第 二細胞之間具有差別時，視為存在「差異性基因表現」。標誌物之差異性表現可為來自投與細胞群、摻雜物或構築體之前的患者之細胞中(第一細胞)相對於來自投與之後的患者之細胞中(第二細胞)之表現而言。
術語「抑制」、「下調」、「表現不足」及「降低」可互換使用且意謂基因之表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單位之RNA分子或等效RNA分子之水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單位之活性，相對於一或多種對照組，諸如(例如)一或多種陽性及/或陰性對照組，係為降低的。表現不足可為來自投與細胞群、摻雜物或構築體之前的患者之細胞中相對於來自投與之後的患者中之細胞而言。
術語「上調」或「表現過量」用以表示基因之表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單位之RNA分子或等效RNA分子之水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單位之活性，相對於一或多種對照組，諸如(例如)一或多種陽性及/或陰性對照組，係為升高的。表現過量可為來自投與細胞群、摻雜物或構築體之後的患者之細胞中相對於來自投與之前的患者中之細胞而言。
術語「受檢者」應表示符合治療條件之任何單個人受檢者，包含患者，其正在經歷或已經經歷器官相關性疾病(諸如腎病、貧血症或EPO缺乏)之一或多種跡象、症狀或其他指標。此等受檢者包含，但不限於，新進確診或先前確診且現在正經歷復發(recurrence)或複燃(relapse), 或者無論何種病因，處於患上腎病、貧血症或EPO缺乏之風險中的受檢者。該受檢者先前可針對腎病、貧血症或EPO缺乏進行過治療，或者未進行此治療。
術語「患者」係指需要進行治療之任何單個動物，更佳為哺乳動物(包含非人動物，諸如，例如，狗、貓、馬、兔、動物園動物、牛、豬、羊，及非人靈長類動物)。最佳地，本文中之患者為人。
術語「樣品」或「患者樣品」或「生物樣品」一般而言應表示自受檢者或患者、體液、身體組織、細胞株、組織培養物或其他來源獲得之任何生物樣品。該術語包含組織切片，諸如，例如，腎切片。術語包含經培養之細胞，諸如，例如，經培養之哺乳動物腎細胞。用於自哺乳動物獲得組織切片及經培養之細胞之方法在本技藝中眾所熟知。若術語「樣品」單獨使用，則其仍然應當表示該「樣品」為「生物樣品」或「患者樣品」，即，該等術語可互換使用。
術語「測試樣品」係指來自已經藉由本發明之方法處理之受檢者之樣品。測試樣品可源自於哺乳動物受檢者中之各種來源，包含，但不限於，血液、精液、血清、尿液、骨髓、黏液、組織等。
術語「對照組」或「對照樣品」係指期望其中之陰性或陽性結果來說明關聯測試樣品中之結果的陰性或陽性對照組。適用於本發明之對照組包含，但不限於，已知可展現正常紅血球系之穩態所特有之指標之樣品、已知 可展現貧血症所特有之指標之樣品、自已知未患貧血症之受檢者獲得之樣品，及自已知患有貧血症之受檢者獲得之樣品。適用於本發明之方法中之額外對照組包含，但不限於，來源於已經用已知可調節紅血球生成(erythropoiesis)之藥理學試劑(例如，重組EPO或EPO類似物)處理之受檢者之樣品。此外，該對照組可為在藉由本發明之方法處理之前自受檢者獲得之樣品。額外的適用對照組可為自已知具有任何類型或階段之腎病之受檢者獲得之測試樣品，及來自已知不具有任何類型或階段之腎病之受檢者之樣品。對照組可為正常健康之匹配對照組。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他對照組。
「再生預後」、「再生的預後」或「對於再生的預後」一般而言係指對投與或植入本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體的可能再生過程或結果之預報或預測。對於再生預後，該預報或預測可藉由以下一或多者告知：植入或投與之後功能器官(例如，腎)之改良、植入或投與之後功能腎之發展、植入或投與之後經改良之腎功能或能力之發展，及植入或投與之後天然腎對某些標誌物之表現。
「再生之器官」係指植入或投與本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之後的天然器官。再生之器官由各種指標表徵，該等指標包含，但不限於，天然器官中功能或能力之發展、天然器官中功能或能力之改良，及天 然器官中某些標誌物之表現。熟習此項技藝者將瞭解其他指標可適用於表徵再生之器官。
「再生之腎」係指植入或投與本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之後的天然腎。再生之腎由各種指標表徵，該等指標包含，但不限於，天然腎中功能或能力之發展、天然腎中功能或能力之改良，及天然腎中某些標誌物之表現。熟習此項技藝者將瞭解其他指標可適用於表徵再生之腎。
術語「細胞聚集體」或「球狀體」係指相對於呈單層之生長，經培養以允許三維生長之細胞之聚集體或集成體。應注意，術語「球狀體」並非暗示該聚集體為幾何學上之球體。聚集體可經高度組織為具有明確界定之形態，或者其可為未經組織之塊體；其可包含單個細胞類型或一個以上細胞類型。細胞可為原代分離株，或永生細胞株，或兩者之組合。此定義中包含類器官(organoid)及器官型培養物(organotypic culture)。
術語「環境溫度」係指本發明之製劑將要投與至受檢者時之溫度。一般而言，環境溫度為溫度受控制之環境之溫度。環境溫度處於約18℃至約30℃之範圍內。在一個實施例中，環境溫度為約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃或約30℃。
2.細胞群
本發明之製劑可含有分離之異質性腎細胞群，及其摻雜物，其針對特定生物活性組分或細胞類型富集及/或耗減特定非活性或非所需組分或細胞類型，用於治療腎病，即，提供腎功能之穩定及/或改良及/或再生，先前在Presnell等人之U.S.2011-0117162及Ilagan等人之PCT/US2011/036347中描述，該等專利的整個內容以引用之方式併入本文。製劑可含有分離之腎細胞餾分，其與健康個體相比缺少細胞組分而仍保留治療性質，即，提供腎功能之穩定及/或改良及/或再生。本文所述之細胞群、細胞餾分及/或細胞之摻雜物可來源於健康個體、有腎病之個體或如本文中所述之受檢者。
本發明提供本文所述之製劑適合與各種生物活性細胞群一起使用，該等細胞群包含，但不限於，分離之細胞群、細胞餾分、摻雜物、經富集之細胞群、細胞聚集體及其任何組合。在一個實施例中，生物活性細胞群為生物活性腎細胞。
生物活性細胞群
本發明涵蓋適用於欲投與至有需要之受檢者中之目標器官或組織的生物活性細胞群之治療製劑。生物活性細胞群一般而言係指一經投與至受檢者即潛在地具有治療性質之細胞群。舉例而言，一經投與至有需要之受檢者，生物活性腎細胞群即可提供受檢者中腎功能之穩定及/或改良及/或再生。治療性質可包含再生作用。
生物活性細胞群包含，但不限於，幹細胞(例如，複能性(pluripotent)、多能性(multipotent)、寡能性(oligopotent)、單能性(unipotent))，諸如胚胎幹細胞、羊水幹細胞、成體幹細胞(例如，造血、乳腺、腸、間質、胎盤、肺、骨髓、血液、臍帶、內皮、牙髓、脂肪、神經、嗅覺、神經脊、睾丸)、誘導性複能性幹細胞；遺傳修飾細胞；以及來源於身體之任何來源之細胞群或組織植入體。本發明之製劑亦可與2011年6月9日提審之Basu等人之PCT/US11/39859中所述的腎脂肪源性細胞群一起使用；及與2011年5月3日提審之Ludlow等人之U.S.2010-0131075與Ludlow等人之PCT/US11/35058中所述的脂肪源性或周邊血源性平滑肌細胞一起使用；或者與Atala之U.S.6,576,019中所述的膀胱源性泌尿上皮細胞或平滑肌細胞一起使用，各專利的整個內容以引用之方式併入本文。生物活性細胞群在性質上可為分離的、富集的、純化的、均質性或異質性。熟習此項技藝者將瞭解適合用於本發明之製劑中的其他生物活性細胞群。
在一個實施例中，細胞之來源與預期之目標器官或組織一樣。舉例而言，腎細胞可源自腎從而用於製劑中欲投與至腎。在另一實施例中，細胞之來源與預期之目標器官或組織不同。舉例而言，表現紅血球生成素之細胞可源自腎脂肪從而用於製劑中欲投與至腎。
在一態樣中，本發明提供含有異質性腎細胞群之某些次餾分(subfraction)之製劑，該等次餾分針對生物活性組 分富集且耗減非活性或非所需組分，提供較起始群優良之治療與再生結果。舉例而言，耗減非活性或非所需組分(例如B1及B5)的本文中所述之生物活性腎細胞(例如B2、B4及B3)單獨或摻雜地可為欲用於腎功能之穩定及/或改良及/或再生的製劑之一部分。
在另一態樣中，製劑含有特定次餾分B4，其耗減或缺乏一或多種細胞類型，例如血管、內分泌或內皮細胞，即B4’，但單獨或者與其他生物活性次餾分(例如，B2及/或B3)一起摻雜地保留治療性質，例如腎功能之穩定及/或改良及/或再生。在較佳之實施例中，生物活性細胞群為B2。在某些實施例中，B2細胞群與B4或B4’一起摻雜。在其他實施例中，B2細胞群與B3一起摻雜。在其他實施例中，B2細胞群與B3及B4二者或者B3及/或B4之特定細胞組分一起摻雜。
B2細胞群係藉由選自由以下一或多者組成之群的腎小管細胞標誌物之表現來表徵：megalin、cubilin、透明質酸合成酶2(HAS2)、維生素D3 25-羥化酶(CYP2D25)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin；Ncad)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin；Ecad)、水通道蛋白-1(Aquaporin-1；Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成員RAS原癌基因家族(Rab17)、GATA結合蛋白質3(Gata3)、含FXYD域之離子轉運調節因子4(Fxyd4)、溶質攜帶物家族9(鈉/氫交換劑)、成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族、成員B1(Aldh3b1)、醛脫氫酶1家族、成員A3(Aldh1a3)及鈣蛋白 酶(Calpain-8；Capn8)，及集合管標誌物水通道蛋白-4(Aqp4)。B2較B3及/或B4更大且細微性更大，因此具有介於約1.045g/ml與約1.063g/ml之間(齧齒動物)、介於約1.045g/ml與1.052g/ml之間(人)及介於約1.045g/ml與約1.058g/ml之間(犬科動物)的浮力密度(buoyant density)。
B3細胞群係藉由血管、腎絲球及近端腎小管標誌物及一些產生EPO之細胞之表現來表徵，相較於B2及B4具有中間之大小及細微性，因此具有介於約1.063g/ml與約1.073g/ml之間(齧齒動物)、介於約1.052g/ml與約1.063g/ml之間(人)及介於約1.058g/ml與約1.063g/ml之間(犬科動物)的浮力密度。B3係藉由選自由以下一或多者組成之群的標誌物之表現來表徵：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域之離子轉運調節因子2(Fxyd2)、溶質攜帶物家族17(磷酸鈉)、成員3(Slc17a3)、溶質攜帶物家族3、成員1(Slc3a1)、緊密連接蛋白2(claudin 2；Cldn2)、napsin A天冬胺酸肽酶(Napsa)、溶質攜帶物家族2(易化葡萄糖轉運蛋白)、成員2(Slc2a2)、丙胺醯基(膜)胺肽酶(Anpep)、跨膜蛋白質27(Tmem27)、乙醯輔酶A合成酶中鏈家族成員2(Acsm2)、谷胱甘肽過氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1,6-二磷酸酶1(Fbp1)，及丙胺酸-乙醛酸轉胺酶2(Agxt2)。B3亦由血管表現標誌物血小板內皮細胞黏附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule；Pecam)及腎絲球表現標誌物podocin(Podn)來表徵。
B4細胞群係藉由含有以下一或多者之血管標誌物組之表現：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146；含有以下一或多者之腎絲球標誌物組之表現：Podocin(Podn)及Nephrin(Neph)；及相較於未分餾(UNFX)之B2與B3的氧調諧的EPO富集群來表徵。B4亦藉由以下標誌物中之一或多者之表現來表徵：趨化激素(C-X-C基序)受體4(Cxcr4)、內皮素受體B型(Ednrb)、膠原蛋白V型、alpha 2(Col5a2)、鈣黏蛋白5(Cdh5)、纖溶酶原啟動物、組織(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受體(kinase insert domain protein receptor；Kdr)、分泌性蛋白質、酸性、富半胱胺酸(骨黏連蛋白(osteonectin))(Sparc)、serglycin(Srgn)、TIMP金屬肽酶抑制因子3(Timp3)、Wilms腫瘤1(Wt1)、無翅型MMTV整合位點家族、成員4(Wnt4)、G蛋白質信號傳遞調節因子4(Rgs4)、血小板內皮細胞黏附分子(Pecam)，及紅血球生成素(Epo)。B4亦由相較於B2或B3更小、細微性更小的細胞來表徵，具有介於約1.073g/ml與約1.091g/ml之間(齧齒動物)、介於約1.063g/ml與約1.091g/mL之間(人及犬科動物)的浮力密度。
將B4’細胞群定義為具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的浮力密度且表現以下標誌物中之一或多者：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、podocin、nephrin、EPO、CK7、CK8/18/19。在一個實施例中，B4’細胞群係藉由含有以下一或多者之血管標誌物組之表現來表徵： PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。在另一實施例中，B4’細胞群係藉由內分泌標誌物EPO之表現來表徵。在一個實施例中，B4’細胞群係藉由含有以下一或多者之腎絲球標誌物組之表現來表徵：Podocin(Podn)及Nephrin(Neph)。在某些實施例中，B4’細胞群係藉由含有以下一或多者之血管標誌物組之表現：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a，及藉由內分泌標誌物EPO之表現來表徵。在另一實施例中，B4’亦由相較於B2或B3更小、細微性更小的細胞來表徵，具有介於約1.073g/ml與約1.091g/ml之間(齧齒動物)、介於約1.063g/ml與約1.091g/mL之間(人及犬科動物)的浮力密度。
在一態樣中，本發明提供含有分離之經富集之B4’人腎細胞群之製劑，該細胞群包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞、血管細胞及腎絲球細胞中之至少一者，具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度。在一個實施例中，B4’細胞群係藉由血管標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。在一些實施例中，B4’細胞群能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO)之表現。
在一個實施例中，製劑含有B4’細胞群，但不包含包括腎小管細胞且具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度之B2細胞群。在另一實施例中，B4’細胞群製劑不包含包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml的密度之B1細胞群。在又一實施例中，B4’細 胞群製劑不包含包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml的密度之B5細胞群。
在一個實施例中，含有B4’細胞群之製劑不包含包括腎小管細胞且具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度之B2細胞群；包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml的密度之B1細胞群；及包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml的密度之B5細胞群。在一些實施例中，B4’細胞群可來源於具有腎病之受檢者。
在一態樣中，本發明提供含有人腎細胞之摻雜物之製劑，該摻雜物包括第一細胞群B2，其包括分離之經富集之腎小管細胞群，具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度；及第二細胞群B4’，其包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞及血管細胞，但耗減腎絲球細胞，具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度，其中該摻雜物不包含包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml之密度的B1細胞群，或包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度的B5細胞群。在某些實施例中，B4’細胞群係藉由血管標誌物之表現來表徵。在一個實施例中，B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，B2進一步包括集合管上皮細胞。在一個實施例中，製劑含有能夠進行受體介導之白蛋白攝取的細胞之摻雜物。在另一實施例中，該細胞摻雜物能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO) 之表現。在一個實施例中，摻雜物含有能夠在活體外及活體內產生及/或刺激透明質酸(HA)之高分子量物質之產生的表現HAS-2之細胞。在所有實施例中，第一與第二細胞群可來源於腎組織或經培養之腎細胞(Basu等人Lipids in Health and Disease,2011,10：171)。
在一個實施例中，製劑含有一經活體內遞送即能夠提供再生性刺激物之摻雜物。在其他實施例中，摻雜物一經活體內遞送即能夠減少腎絲球過濾、腎小管再吸收、尿液產生及/或內分泌功能之下降，穩定或改良腎絲球過濾、腎小管再吸收、尿液產生及/或內分泌功能。在一個實施例中，B4’細胞群來源於具有腎病之受檢者。
在一態樣中，本發明提供含有分離之經富集之B4’人腎細胞群之製劑，該細胞群包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞、血管細胞及腎絲球細胞中之至少一者，具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度。在一個實施例中，B4’細胞群係藉由血管標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。未受表現之腎絲球標誌物可為podocin(見實例10)。在一些實施例中，B4’細胞群能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO)之表現。
在一個實施例中，含有B4’細胞群之製劑不包含包括小管細胞且具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度之B2細胞群。在另一實施例中，B4’細胞群製劑不包含包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045 g/ml之密度之B1細胞群。在又一實施例中，B4’細胞群製劑不包含包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度之B5細胞群。
在一個實施例中，含有B4’細胞群之製劑不包含包括小管細胞且具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度之B2細胞群；包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml的密度之B1細胞群；及包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度之B5細胞群。在一些實施例中，B4’細胞群可來源於具有腎病之受檢者。
在一態樣中，本發明提供含有人腎細胞之摻雜物之製劑，該摻雜物包括第一細胞群B2，其包括分離之經富集之腎小管細胞群，具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度；及第二細胞群B4’，其包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞及血管細胞，但耗減腎絲球細胞，具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度，其中該摻雜物不包含包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml之密度的B1細胞群，或包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度的B5細胞群。在某些實施例中，B4’細胞群係藉由血管標誌物之表現來表徵。在一個實施例中，B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，B2進一步包括集合管上皮細胞。在一個實施例中，細胞之摻雜物能夠進行受體介導之白蛋白攝取。在另一實施例中，細胞之 摻雜物能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO)之表現。在一個實施例中，摻雜物含有能夠在活體外及活體內產生及/或刺激透明質酸(HA)之高分子量物質之產生的表現HAS-2之細胞。在所有實施例中，第一與第二細胞群可來源於腎組織或經培養之腎細胞。
在另一態樣中，本發明提供含有異質性腎細胞群之製劑，該異質性腎細胞群包括細胞餾分或經富集之細胞群(例如，B1、B2、B3、B4(或B4’)，及B5)之組合。在一個實施例中，該組合具有介於約1.045g/ml與約1.091g/ml之間的浮力密度。在另一實施例中，組合具有介於小於約1.045g/ml與約1.099g/ml或約1.100g/ml之間的浮力密度。在另一實施例中，組合具有藉由在密度梯度上之分離，例如藉由離心法所測定之浮力密度。在又一實施例中，細胞餾分之組合含有經耗減B1及/或B5之B2、B3及B4(或B4’)。在一些實施例中，細胞餾分之組合含有B2、B3、B4(或B4’)及B5，但耗減B1。一旦耗減B1及/或B5，隨後就在製備包括B2、B3及B4(或B4’)細胞餾分之組合的製劑之前活體外培養該組合。
本發明之發明者意外發現，B2、B3、B4及B5之經耗減B1之組合的活體外培養導致B5之耗減。在一個實施例中，在至少一次、兩次、三次、四次或五次傳代之後B5受到耗減。在另一實施例中，於本文所述之條件下傳代之B2、B3、B4及B5細胞餾分組合提供傳代之細胞群，其 中B5之百分比為該傳代之細胞群的小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%、小於約1%或小於約0.5%。
在另一實施例中，B4’為細胞餾分之組合之一部分。在另一實施例中，耗減B5之活體外培養處於低氧條件下。
在一個實施例中，製劑含有一經活體內遞送即能夠提供再生性刺激物之摻雜物。在其他實施例中，摻雜物一經活體內遞送即能夠減少腎絲球過濾、腎小管再吸收、尿液產生及/或內分泌功能之下降，穩定或改良腎絲球過濾、腎小管再吸收、尿液產生及/或內分泌功能。在一個實施例中，B4’細胞群來源於具有腎病之受檢者。
在較佳之實施例中，製劑含有包括B2與B3及/或B4相組合之摻雜物。在另一較佳之實施例中，摻雜物包括B2與B3及/或B4’相組合。在其他較佳之實施例中，摻雜物係由或基本上由(i)B2與B3及/或B4相組合；或(ii)B2與B3及/或B4’相組合所組成。
含有B4’細胞群之摻雜物可含有亦自非健康受檢者獲得之B2及/或B3細胞群。該非健康受檢者可為自其獲得B4’餾分之相同受檢者。相比於B4’細胞群而言，自非健康受檢者獲得之B2及B3細胞群與來源於健康個體之起始腎細胞群相比較，通常不缺乏一或多種特定細胞類型。
如Presnell等人之WO/2010/056328中所述，已發現B2及B4細胞製備物能夠經由透明質酸合成酶-2(HAS-2)(更特定而言在B2細胞群中經富集之標誌物)之作用，在活體外及活體內表現透明質酸(HA)之高分子量物質。已顯示 在5/6 Nx模型中以B2之處理可減少纖維化，同時相伴活體內HAS-2之強表現及經處理組織中預期的高分子量HA之產生。明顯地，未經治療之5/6 Nx模型導致纖維化，同時具有HAS-2之有限偵測及高分子量HA之少許產生。雖然不希望受理論約束，但假設主要由B2產生(及小部分程度上由B4產生)的此抗炎性高分子量HA物質在腎纖維化之減少及在腎再生之援助上與細胞製備物協同作用。相應地，本發明包含含有本文中所述之生物活性腎細胞以及包括透明質酸之生物材料之製劑。本發明還涵蓋經由植入之細胞所直接產生或刺激產生來提供再生性刺激物之生物材料組分。
在一態樣中，本發明提供含有產生EPO之腎細胞之分離之異質性群以用於治療有需要之受檢者中的腎病、貧血症及/或EPO缺乏之製劑。在一個實施例中，細胞群來源於腎切片。在另一實施例中，細胞群來源於整個腎組織。在另一實施例中，細胞群來源於自腎切片或整個腎組織建立的哺乳動物腎細胞之活體外培養物。在所有實施例中，此等群為未分餾之細胞群，本文中亦稱為未富集之細胞群。
在另一態樣中，本發明提供含有產生紅血球生成素(EPO)之腎細胞之分離群之製劑，該等分離之群進一步經富集以使得經富集之亞群中產生EPO之細胞之比例高於起始或初始細胞群中產生EPO之細胞之比例。在一個實施例中，經富集之產生EPO之細胞餾分相對於未富集之 初始群中所含之間質纖維母細胞及腎小管細胞，含有更高比例之間質纖維母細胞及更低比例之腎小管細胞。在某些實施例中，經富集之產生EPO之細胞餾分相對於未富集之初始群中所含之腎絲球細胞、血管細胞及集合管細胞，含有更高比例之腎絲球細胞與血管細胞及更低比例之集合管細胞。在此等實施例中，該等群在本文中稱為「B4」細胞群。
在另一態樣中，本發明提供含有與一或多種額外腎細胞群摻雜之產生EPO之腎細胞群之製劑。在一個實施例中，該產生EPO之細胞群為針對產生EPO之細胞富集之第一細胞群，例如B4。在另一實施例中，產生EPO之細胞群為未針對產生EPO之細胞富集之第一細胞群，例如B2。在另一實施例中，第一細胞群係與第二腎細胞群摻雜。在一些實施例中，第二細胞群針對腎小管細胞富集，其可藉由腎小管細胞表型之存在來證明。在另一實施例中，腎小管細胞表型可藉由一個腎小管細胞標誌物之存在來指示。在另一實施例中，腎小管細胞表型可藉由一或多個腎小管細胞標誌物之存在來指示。腎小管細胞標誌物包含，但不限於，megalin、cubilin、透明質酸合成酶2(HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、N-鈣黏蛋白(Ncad)、E-鈣黏蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成員RAS原癌基因家族(Rab17)、GATA結合蛋白質3(Gata3)、含FXYD域之離子轉運調節因子4(Fxyd4)、溶質攜帶物家族9(鈉/氫交換 劑)、成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族、成員B1(Aldh3b1)、醛脫氫酶1家族、成員A3(Aldh1a3)及鈣蛋白酶(Capn8)。在另一實施例中，第一細胞群與包含但不限於間質源性細胞、腎小管細胞、集合管源性細胞、腎絲球源性細胞及/或來源於血液或脈管系統之細胞之數種類型腎細胞中的至少一者摻雜。
本發明之製劑可包含含有呈與B2及/或B3之摻雜物形式或呈經富集之細胞群形式(例如，B2+B3+B4/B4’)的B4或B4’之產生EPO之腎細胞群。
在一態樣中，製劑含有產生EPO之腎細胞群，該等細胞群係藉由EPO之表現及對氧之生物回應性(bioresponsiveness)來表徵，以使得培養系統中氧壓之降低導致EPO之表現之誘導。在一個實施例中，產生EPO之細胞群係針對產生EPO之細胞富集。在一個實施例中，當相較於在可用氧之正常大氣(~21%)水準下培養之細胞群，在使細胞於培養系統中經受可用氧水準之降低之條件下培養細胞群時，EPO表現受到誘導。在一個實施例中，在較低氧之條件下培養之產生EPO之細胞相對於在正常氧之條件下培養的產生EPO之細胞，表現更高水準之EPO。一般而言，在降低之水準之可用氧下(亦稱為低氧培養條件)細胞之培養意謂降低之氧之水準係相對於在正常大氣水準之可用氧下(亦稱為正常或常氧培養條件)細胞之培養而降低。在一個實施例中，低氧細胞培養條件包含在約小於1%之氧、約小於2%之氧、約小於 3%之氧、約小於4%之氧或約小於5%之氧下培養細胞。在另一實施例中，正常或常氧培養條件包含在約10%之氧、約12%之氧、約13%之氧、約14%之氧、約15%之氧、約16%之氧、約17%之氧、約18%之氧、約19%之氧、約20%之氧、約21%之氧下培養細胞。
在另一實施例中，獲得EPO之誘導或增加之表現，且可藉由在約小於5%之可用氧下培養細胞並將EPO表現水準與在大氣(約21%)氧下培養之細胞相比較來觀測。在另一實施例中，藉由包含第一培養階段及第二培養階段之方法於能夠表現EPO之細胞之培養物中獲得EPO之誘導，其中在第一培養階段中，在大氣氧(約21%)下孵育細胞之培養物一段時間，在第二培養階段中，使可用氧水準降低且在約小於5%之可用氧下培養相同細胞。在另一實施例中，回應於低氧條件之EPO表現受HIF1α所調節。熟習此項技藝者將瞭解本技藝中已知之其他氧操縱培養條件可用於本文中所述之細胞。
在一態樣中，製劑含有藉由對灌注條件之生物回應性(例如，EPO之表現)來表徵的產生EPO之哺乳動物細胞之經富集之群。在一個實施例中，灌注條件包含暫時性、間歇性或連續性流體流動(灌注)。在一個實施例中，當使於其中培養細胞之培養基間歇地或連續地迴圈或者以經由該流動將動力轉移至細胞之方式攪動時，EPO之表現係以機械方式受到誘導。在一個實施例中，經受暫時性、間歇性或連續性流體流動之細胞係以其在一種材料 中或上呈現為三維結構之方式經培養，該材料為此等三維結構之形成提供框架及/或空間。在一個實施例中，在多孔珠粒上培養細胞，且藉助於搖擺之平臺、沿軌道運行之平臺或旋轉角瓶經受間歇性或連續性流體流動。在另一實施例中，於三維支架上培養細胞且將其置於一種裝置中，藉此該支架固定不動且流體定向穿過或跨過支架流動。熟習此項技藝者將瞭解本技藝中已知之其他灌注培養條件可用於本文中所述之細胞。
細胞聚集體
在另一態樣中，本發明之製劑含有細胞聚集體或球狀體。在一個實施例中，細胞聚集體包括本文中所述之生物活性細胞群。在另一實施例中，細胞聚集體包括生物活性腎細胞，諸如，例如，腎細胞摻雜物、經富集之腎細胞群，及腎細胞餾分之組合。
在某些實施例中，本發明之生物活性腎細胞可如本文中進一步所描述以三維格式進行培養。在一些實施例中，術語「類器官」係指細胞在表型及/或功能上與天然腎相一致之積聚。在一些實施例中，類器官包括通常在給定組織中活體內發現之各種各樣譜系之細胞之混合群。在一些實施例中，本發明之類器官在活體外經由任何手段形成，藉此本發明之細胞形成聚集體，其轉而又可形成球狀體、類器官或其組合。在一些實施例中，此等聚集體、球狀體或類器官採取與特定器官相一致之結構。在一些實施例中，此等聚集體、球狀體或類器官表 現通常由該特定器官之細胞所表現之表面標誌物。在一些實施例中，此等聚集體、球狀體或類器官產生通常由該特定器官之細胞所表現之化合物或材料。在某些實施例中，可在自然基質，例如明膠上培養本發明之細胞。在其他實施例中，可在合成基質，例如PGLA上培養本發明之細胞。實例20中提供用於提供細胞聚集體之示例性方法。
非活性細胞群
如本文中所述，本發明部分上係基於意外之發現，即針對生物活性組分富集且耗減非活性或非所需組分的異質性腎細胞群之某些次餾分，提供較起始群優良之治療與再生結果。在較佳之實施例中，由本發明提供之製劑含有耗減B1及/或B5細胞群之細胞群。舉例而言，以下各物可耗減B1及/或B5：B2、B3及B4(或B4’)中兩者或兩者以上之摻雜物；B2、B3及B4(或B4’)之經富集之細胞群。
B1細胞群包括集合管與腎小管系統之大顆粒細胞，該群之細胞具有小於約1.045g/m之浮力密度。B5細胞群係由具有低細微性及活力且具有大於約1.091g/ml之浮力密度之碎片及小細胞構成。
分離與培養細胞群之方法
在一態樣中，本發明之製劑含有已自腎組織分離及/或培養之細胞群。本文中提供用於分離及隔離腎細胞組分，例如將會於製劑中使用以達成治療用途之經富集之細胞群之方法，該治療用途包含腎病、貧血症、EPO缺 乏、腎小管轉運缺陷及腎絲球過濾缺陷之治療。在一個實施例中，細胞群係分離自經新鮮消化，即以機械方式或酶方式消化之腎組織，或分離自哺乳動物腎細胞之活體外培養物。
製劑可含有腎細胞之異質性混合物，其在密度梯度上分離之前已於低氧培養條件中進行培養，提供細胞於B4(包含B4’)與B2及/或B3餾分中的增強之分佈及組成。對於分離自患病及非患病腎之腎細胞皆觀測到B4中來自B2之氧依賴性細胞之富集。雖然不希望受理論約束，但此可歸因於以下現象中之一或多者：1)於低氧培養期期間特定細胞組分之選擇性存活、死亡或增殖；2)回應於低氧培養，細胞細微性及/或大小之改變，由此造成於密度梯度分離期間浮力密度及隨後定位之改變；及3)回應於低氧培養期，細胞基因/蛋白質表現之改變，由此導致於該梯度之任何給定餾分內細胞之差異性特性。因此，在一個實施例中，製劑含有針對腎小管細胞富集之細胞群，例如B2，為低氧抗性。
用於分離及隔離本發明之細胞群之示例性技術包含基於所關注之群內所含的不同細胞類型之差異性比重，於密度梯度上之分離。任何給定細胞類型之比重可受細胞內之細微性、細胞內水之體積及其他因素所影響。在一態樣中，本發明提供用於在包含但不限於人、犬科動物及齧齒動物之多種物種中分離本發明之細胞製備物(例如，B2及B4，包含B4’)之最佳梯度條件。在較佳之實施 例中，使用密度梯度來獲得新穎之腎小管細胞餾分之經富集之群，即B2細胞群，其來源於腎細胞之異質性群。在一個實施例中，使用密度梯度來獲得新穎之產生EPO之細胞餾分之經富集之群，即B4細胞群，其來源於腎細胞之異質性群。在其他實施例中，使用密度梯度來獲得腎小管細胞、腎絲球細胞及腎內皮細胞之經富集之亞群。在一個實施例中，自紅血球及細胞碎片分離產生EPO之細胞及腎小管細胞二者。在一個實施例中，自其他細胞類型及自紅血球及細胞碎片分離產生EPO之細胞、腎絲球細胞及血管細胞，同時自其他細胞類型及自紅血球及細胞碎片相伴地分離腎小管細胞及集合管細胞之亞群。在另一實施例中，自其他細胞類型及自紅血球及細胞碎片分離內分泌細胞、腎絲球細胞及/或血管細胞，同時自其他細胞類型及自紅血球及細胞碎片相伴地分離腎小管細胞及集合管細胞之亞群。
在一態樣中，本發明之製劑含有藉由部分上使用OPTIPREP®(Axis-Shield)密度梯度介質(包括60%之非離子型碘化化合物碘克沙醇(iodixanol)之水溶液)，基於下面所述之某些關鍵特點所產生之細胞群。然，熟習此項技藝者將認識到，任何密度梯度或其他手段，例如此項技藝中已知之使用細胞表面標誌物之免疫學分離，包括用於分離本發明之細胞群之必要特點，皆可依本發明使用。熟習此項技藝者亦應認識到，促成經由細胞梯度(大小及細微性)分離細胞亞群之同樣細胞特點可經開發 以經由流式細胞術來分離細胞亞群(前向散射光=經由流式細胞術之大小之反映；及側向散射光=細微性之反映)。重要地，密度梯度介質對於所關注之特定細胞應具有低毒性。儘管密度梯度介質對於所關注之特定細胞應具有低毒性，但本發明涵蓋於所關注之細胞之選擇過程中起作用的梯度介質之使用。雖然不希望受理論約束，但看似由包括碘克沙醇之梯度所回收之本發明之細胞群係為碘克沙醇抗性，因為載入與回收步驟之間存在明顯的細胞損失，表明於該梯度之條件下暴露於碘克沙醇導致某些細胞之消除。在碘克沙醇梯度之後出現於特定譜帶中之細胞對碘克沙醇及/或密度梯度暴露之不良作用具抗性。相應地，亦涵蓋額外對比介質之使用，該等對比介質在用於本文中所述之製劑之細胞群之分離及/或選擇中係為輕度至中度之腎毒素(nephrotoxin)。此外，密度梯度介質應不與人血漿中之蛋白質結合或者不利地影響所關注細胞之關鍵功能。
在另一態樣中，本發明提供含有已使用螢光啟動之細胞分選法(FACS)富集及/或耗減腎細胞類型之細胞群之製劑。在一個實施例中，可使用BD FACSAriaTM或等效物富集及/或耗減腎細胞類型。
在另一態樣中，製劑含有已使用磁性細胞分選法富集及/或耗減腎細胞類型之細胞群。在一個實施例中，可使用Miltenyi autoMACS®系統或等效物富集及/或耗減腎細胞類型。
在另一態樣中，製劑可包含已經受三維培養之腎細胞群。在一態樣中，培養細胞群之方法係經由連續灌注。在一個實施例中，經由三維培養及連續灌注所培養之細胞群與以靜置方式培養之細胞群相比較時，展現更高之細胞性(cellularity)及貫通性(interconnectivity)。在另一實施例中，經由三維培養及連續灌注所培養之細胞群與此等細胞群之靜置培養物相比較時，展現更高之EPO之表現，以及增強之腎小管相關基因(諸如，e-鈣黏蛋白)之表現。在又一實施例中，經由連續灌注所培養之細胞群與以靜置方式培養之細胞群相比較時，展現更高水準之葡萄糖及麩醯胺酸消耗。
如本文中所述(包含實例7)，可於方法中使用較低或低氧性氧條件來製備用於本發明之製劑之細胞群。然，可在沒有較低之氧條件之步驟下使用製備細胞群之方法。在一個實施例中，可使用常氧條件。
在另一態樣中，本發明提供用於製備細胞聚集體或球狀體之方案(例如見實例20)。
熟習此項技藝者將瞭解本技藝中已知之其他分離及培養之方法可用於本文中所述之細胞。
3.生物材料
各種各樣之生物材料可與活性劑組合以提供本發明之治療製劑。生物材料可處於任何適合之形狀(例如，珠粒)或形式(例如，液體、凝膠等)。如Bertram等人之美國公開申請案20070276507(其整個內容以引用之方式併入本 文)中所述，聚合性基質或支架可經成形為許多所需之構型以滿足許多整體系統、幾何學或空間限制。在一個實施例中，本發明之基質或支架可為三維的且經成形為符合器官或組織結構之尺寸及形狀。舉例而言，在使用聚合性支架治療腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷時，可使用三維(3-D)基質。可使用各種各樣的相異成形之3-D支架。自然地，聚合性基質可成形為不同大小及形狀以符合大小不同之患者。聚合性基質亦可以其他方式成形以適應患者之特殊需要。在另一實施例中，聚合性基質或支架可為生物相容性、多孔性聚合性支架。支架可由各種各樣之合成或自然發生之材料形成，該等材料包含，但不限於，開放室聚乳酸(open-cell polylactic acid)(OPLA®)、纖維素醚、纖維素、纖維素酯、氟化聚乙烯、苯酚系、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚醯胺、聚醯胺醯亞胺、聚丙烯酸酯、聚苯噁唑(polybenzoxazole)、聚碳酸酯、聚芳醚腈(polycyanoarylether)、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚醯亞胺、聚醚酮、聚醚碸、聚乙烯、聚氟烯烴、聚醯亞胺、聚烯烴、聚噁二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚碸、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚胺酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纖維素、聚矽氧、尿素-甲醛、膠原蛋白、明膠、海藻酸鹽、層黏連蛋白(laminins)、纖連蛋白(fibronectin)、絲、彈力蛋白、海藻酸鹽、透明質酸、瓊脂糖，或其共聚物 或物理摻混物。支架構型可在自液體懸浮液至柔軟多孔性支架至剛性、保形(shape-holding)多孔性支架之範圍內。在一個實施例中，構型係為呈能夠變成水凝膠之溶液之液體形式。
水凝膠可由各種各樣之聚合性材料形成且適合於各種各樣之生物醫學應用。水凝膠可在物理上描述為親水性聚合物之三維網路。取決於水凝膠之類型，其含有不同百分比之水，但總而言之不溶於水。儘管具有高水含量，但由於親水性殘基之存在，使得水凝膠能夠另外結合高體積之液體。水凝膠在不改變其凝膠狀結構之情況下廣泛地膨脹。水凝膠之基本物理特點可根據所用聚合物之性質及產物之額外特殊設備而經特定改質。
較佳地，水凝膠由聚合物、生物衍生性材料、合成衍生性材料或其組合形成，該材料係在生物學上為惰性且與哺乳動物組織在生理學上相容。水凝膠材料較佳地不誘導發炎反應。可用以形成水凝膠之其他材料之實例包含(a)改質之海藻酸鹽，(b)藉由暴露於單價陽離子而膠凝之多醣(例如，結蘭膠(gellan gum)及卡拉膠(carrageenan))，(c)為非常黏稠之液體或具搖變性(thixotropic)且藉由結構之緩慢演變而隨時間形成凝膠之多醣(例如，透明質酸)，(d)明膠或膠原蛋白，及(e)聚合性水凝膠前體(例如，聚氧乙烯-聚丙二醇(polyethylene oxide-polypropylene glycol)嵌段共聚物及蛋白質)。美國專利第6,224,893 B1號提供對各種聚合物及此等聚合物 之化學性質之詳細描述，此等聚合物適合於依本發明製成水凝膠。
支架或生物材料之特性可使細胞黏附於支架或生物材料並與其相互作用，且/或可提供可將細胞捕獲於其中之多孔性空間。在一個實施例中，本發明之多孔性支架或生物材料允許於經構型為多孔性支架之生物材料上(例如，藉由細胞之黏附)及/或於支架之孔內(例如，藉由細胞之捕獲)添加或沈積一或多種細胞群或細胞摻雜物。在另一實施例中，支架或生物材料允許或促進支架內的細胞與細胞及/或細胞與生物材料之相互作用以形成如本文中所述之構築體。
在一個實施例中，根據本發明使用之生物材料係由呈水凝膠形式之透明質酸(HA)構成，該水凝膠含有大小在5.1kDA至>2 x 106kDa之範圍內之HA分子。在另一實施例中，根據本發明使用之生物材料係由呈多孔性泡沫形式之透明質酸(HA)構成，該多孔性泡沫亦含有大小在5.1kDA至>2 x 106kDa之範圍內之HA分子。在又一實施例中，根據本發明使用之生物材料係由基於聚乳酸(PLA)之泡沫構成，該泡沫具有開放性蜂窩結構(open-cell structure)及約50微米至約300微米之孔大小。在又一實施例中，特定細胞群，較佳為B2及B4，直接提供及/或刺激經由透明質酸合成酶-2(HAS-2)之高分子量透明質酸之合成，尤其在腎內植入(intra-renal implantation)之後。
本文所述之生物材料亦可經設計或改造而回應於某些外部條件，例如活體外或活體內。在一個實施例中，生物材料係為溫度敏感性的(例如，活體外或活體內)。在另一實施例中，生物材料係經改造而回應於對酶降解之暴露(例如，活體外或活體內)。生物材料對外部條件之回應可如本文中所述進行微調。所描述之製劑之溫度敏感性可藉由調整製劑中生物材料之百分比來改變。舉例而言，可調整溶液中明膠之百分比以調節最終製劑中(例如，液體、凝膠、珠粒等)明膠之溫度敏感性。或者，可對生物材料進行化學交聯以提供對酶降解之更高抗性。舉例而言，可使用碳化二亞胺交聯劑以使明膠珠粒化學交聯，由此提供對內源性酶之降低之易感性。
在一態樣中，生物材料對外部條件之回應涉及生物材料之結構完整性之喪失。雖然上文提供溫度敏感性及對酶降解之抗性，但存在其他機制，藉此可在不同生物材料中發生材料完整性之喪失。該等機制可包含，但不限於，熱動力學(例如，諸如熔融之相變、擴散(例如，離子型交聯劑自生物材料至周圍組織中之擴散))、化學、酶學、pH(例如，pH敏感性脂質體)、超音波，及光不穩定性(photolabile)(透光)。生物材料喪失結構完整性之確切機制會有所不同，但通常在植入之時或植入後觸發該機制。
熟習此項技藝者將瞭解本技藝中已知之其他合成或自然發生之材料之類型可用以形成本文中所述之支架。
在一態樣中，本發明提供由上文提及之支架或生物材料形成之本文所述之構築體。
4.構築體
在一態樣中，本發明提供含有具有本文所述之細胞群中之一或多者的可植入式構築體之製劑，以用於治療有需要之受檢者中之腎病、貧血症或EPO缺乏。在一個實施例中，構築體係由以下構成：生物相容性材料或生物材料、由一或多種合成或自然發生之生物相容性材料組成之支架或基質，及藉由黏附及/或捕獲而沈積於支架表面上或包埋於支架表面中之本文所述之一或多種細胞群或細胞之摻雜物。在某些實施例中，構築體係由生物材料及本文所述之一或多種細胞群或細胞之摻雜物構成，該等細胞群或細胞之摻雜物係經該(等)生物材料組分塗佈、沈積於該(等)生物材料組分上、沈積於該(等)生物材料組分中、黏附至該(等)生物材料組分、捕獲於、包埋於、接種於該(等)生物材料組分中或者與該(等)生物材料組分組合。本文中所述之細胞群中之任一者，包含經富集之細胞群或其摻雜物，可與基質組合使用以形成構築體。
在一態樣中，製劑含有由經設計或經改造以回應於如本文中所述之外部條件之生物材料構成之構築體。因而，細胞群與構築體中之生物材料之關聯之性質將取決於外部條件而改變。舉例而言，細胞群與溫度敏感性生物材料之關聯隨溫度而變化。在一個實施例中，構築體 含有細胞群及在約8℃或8℃以下具有實質上之固態且在約環境溫度或環境溫度以上具有實質上之液態之生物材料，其中細胞群在約8℃或8℃以下係懸浮於生物材料中。
然，細胞群在約環境溫度或環境溫度以上係於生物材料之整個體積中實質上自由移動。使細胞群在較低溫度下懸浮於實質上之固相中對於細胞，諸如對於錨定依賴性細胞，相較於流體中之細胞提供穩定性之優勢。另外，使細胞懸浮於實質上之固態中提供以下益處中之一或多者：i)防止細胞之沈降，ii)允許細胞保持以懸浮之狀態錨定至生物材料；iii)允許細胞保持更均勻地分散於生物材料之整個體積中；iv)防止細胞聚集體之形成；及v)於製劑之儲存及運輸期間對細胞提供更好之保護。可保留此等特點直至投與至受檢者之製劑係為有利的，其原因至少在於製劑中細胞之整體健康狀況將更好且將投與更均勻一致之細胞劑量。
在另一實施例中，構築體之經沈積之細胞群或細胞組分係為針對氧調諧的產生EPO之細胞所富集之第一腎細胞群。在另一實施例中，第一腎細胞群除氧調諧的產生EPO之細胞之外，還含有腎絲球與血管細胞。在一個實施例中，第一腎細胞群為B4’細胞群。在另一實施例中，構築體之經沈積之細胞群或細胞組分包含第一經富集之腎細胞群及第二腎細胞群二者。在一些實施例中，第二細胞群係未針對氧調諧的產生EPO之細胞富集。在另一實施例中，第二細胞群係針對腎小管細胞富集。在另一 實施例中，第二細胞群係針對腎小管細胞富集且含有集合管上皮細胞。在其他實施例中，腎小管細胞係藉由一或多種腎小管細胞標誌物之表現來表徵，該等標誌物可包含，但不限於，megalin、cubilin、透明質酸合成酶2(HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、N-鈣黏蛋白(Ncad)、E-鈣黏蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成員RAS原癌基因家族(Rab17)、GATA結合蛋白質3(Gata3)、含FXYD域之離子轉運調節因子4(Fxyd4)、溶質攜帶物家族9(鈉/氫交換劑)、成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族、成員B1(Aldh3b1)、醛脫氫酶1家族、成員A3(Aldh1a3)及鈣蛋白酶(Capn8)。
在一個實施例中，沈積於生物材料或支架上或與生物材料或支架組合以形成本發明之構築體之細胞群係來源於各種各樣之來源，諸如同種自體性來源。非同種自體性來源亦適合使用，包含但不限於同種異體性(allogeneic)或同系性(syngeneic)(自體性(autogeneic)或同基因(isogeneic))來源。
熟習此項技藝者將瞭解存在數種適合之方法用於沈積細胞群或以其他方式將細胞群與生物材料組合以形成構築體。
在一態樣中，本發明之構築體係適用於本文中所述之使用之方法中。在一個實施例中，構築體適用於投與至有針對任何病因學之腎病、貧血症或任何病因學之EPO 缺乏之治療需要的受檢者。在其他實施例中，構築體係適用於投與至有紅血球系之穩態之改良或恢復之需要之受檢者。在另一實施例中，構築體係適用於投與至有改良之腎功能之需要之受檢者。
在又一態樣中，本發明提供用於植入有改良之腎功能之需要的受檢者中之構築體，其包括：a)生物材料，其包括一或多種生物相容性合成聚合物或自然發生之蛋白質或肽；及b)來源於具有腎病之受檢者的哺乳動物腎細胞之摻雜物，其包括第一細胞群B2，其包括分離之經富集之腎小管細胞群且具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度，及第二細胞群B4’，其包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞及血管細胞，但耗減腎絲球細胞，且具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度，該細胞摻雜物係經生物材料塗佈、沈積於生物材料上或生物材料中、捕獲於、懸浮於、包埋於生物材料中及/或以其他方式與生物材料組合。在某些實施例中，摻雜物不包含包括集合管與腎小管系統之大顆粒細胞且具有<1.045g/ml之密度之B1細胞群，或包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度之B5細胞群。
在一個實施例中，構築體包含藉由血管標誌物之表現來表徵之B4’細胞群。在一些實施例中，B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，摻雜物能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO)之表現。在所 有實施例中，摻雜物可來源於哺乳動物腎組織或經培養之腎細胞。
在一個實施例中，構築體包含經構型為三維(3-D)多孔性生物材料以適用於摻雜物之捕獲及/或黏附之生物材料。在另一實施例中，構築體包含經構型為液體或半液體凝膠以適用於包埋、黏附、懸浮或塗佈哺乳動物細胞之生物材料。在又一實施例中，構築體包含由呈水凝膠形式之主要為高分子量之透明質酸(HA)物質構成之生物材料。在又一實施例中，構築體包含由呈多孔性泡沫形式之主要為高分子量之透明質酸物質構成之生物材料。在又一實施例中，構築體包含由具有介於約50微米至約300微米之間的孔的基於聚乳酸之泡沫構成之生物材料。在再一實施例中，構築體包含可來源於腎樣品之一或多種細胞群，該腎樣品對有改良之腎功能之需要之受檢者而言係為同種自體性的。在某些實施例中，樣品為腎切片。在一些實施例中，受檢者具有腎病。在其他實施例中，細胞群係來源於非同種自體性腎樣品。在一個實施例中，構築體提供紅血球系之穩態。
5.分泌性產物
在另一態樣中，本發明係關於含有諸如細胞群等之活性劑與由如本文中所述之經富集之腎細胞群或經富集之腎細胞群之摻雜物所分泌之產物相組合之製劑。在一個實施例中，產物包含以下各物中之一或多者：旁分泌因子、內分泌因子、鄰分泌因子及囊泡。囊泡可包含以下 各物中之一或多者：旁分泌因子、內分泌因子、鄰分泌因子、微囊泡、外切體及RNA。分泌性產物亦可包含未在微囊泡內之產物，包含，但不限於，旁分泌因子、內分泌因子、鄰分泌因子及RNA。舉例而言，已於囊泡之外部偵測到細胞外miRNA(Wang等人，Nuc Acids Res 2010,1-12 doi：10.1093/nar/gkq601,July 7,2010)。分泌性產物亦可稱為細胞源性產物，例如細胞源性囊泡。
在另一實施例中，製劑含有作為來源於腎細胞之囊泡之一部分的分泌性產物。囊泡可能夠將該等因子遞送至其他目的地。在一個實施例中，囊泡為分泌性囊泡。涵蓋數種類型分泌性囊泡，包含，但不限於，外切體、微囊泡、核外粒體(ectosome)、膜微粒(membrane particle)、外切體樣囊泡(exosome-like vesicle)及凋亡囊泡(apoptotic vesicle)(Thery等人2010.Nat.Rev.Immunol.9：581-593)。在一個實施例中，分泌性囊泡為外切體。在另一實施例中，分泌性囊泡為微囊泡。在另一實施例中，分泌性囊泡含有或包括一或多種細胞組分。該等組分可為以下各物中之一或多者：膜脂(membrane lipid)、RNA、蛋白質、代謝產物、胞漿組分(cytosolic component)及其任何組合。在較佳之實施例中，分泌性囊泡包括microRNA、由microRNA組成或基本上由microRNA組成。較佳地，miRNA為人miRNA。在一個實施例中，一或多種miRNA選自由miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124及miR-151組成之 群。在另一實施例中，一或多種miRNA可選自由以下各物組成之群：let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、mir-1-1、mir-1-2、mir-7-1、mir-7-2、mir-7-3、mir-9-1、mir-9-2、mir-9-3、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-15b、mir-16-1、mir-16-2、mir-17、mir-18a、mir-18b、mir-19a、mir-19b-1、mir-19b-2、mir-20a、mir-20b、mir-21、mir-22、mir-23a、mir-23b、mir-23c、mir-24-1、mir-24-2、mir-25、mir-26a-1、mir-26a-2、mir-26b、mir-27a、mir-27b、mir-28、mir-29a、mir-29b-1、mir-29b-2、mir-29c、mir-30a、mir-30b、mir-30c-1、mir-30c-2、mir-30d、mir-30e、mir-31、mir-32、mir-33a、mir-33b、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-92a-1、mir-92a-2、mir-92b、mir-93、mir-95、mir-96、mir-98、mir-99amir-99b、mir-100、mir-101-1、mir-101-2、mir-103-1、mir-103-1-as、mir-103-2、mir-103-2-as、mir-105-1、mir-105-2、mir-106a、mir-106b、mir-107、mir-122、mir-124-1、mir-124-2、mir-124-3、mir-125a、mir-125b-1、mir-125b-2、mir-126、mir-127、mir-128-1、mir-128-2、mir-129-1、mir-129-2、mir-130a、mir-130b、mir-132、mir-132、mir-133a-1、mir-133a-2、mir-133b、mir-134、mir-135a-1、mir-135a-2、mir-135b、mir-136MI101351120、mir-137、mir-138-1、mir-138-2、mir-139、mir-140、mir-141、mir-142、mir-143、mir-144、mir-145、mir-146a、mir-146b、mir-147、mir-147b、mir-148a、 mir-148b、mir-149、mir-150、mir-151、mir-152、mir-153-1、mir-153-2、mir-154、mir-155、mir-181a-1、mir-181a-2、mir-181b-1、mir-181b-2、mir-181c、mir-181d、mir-182、mir-183、mir-184、mir-185、mir-186、mir-187、mir-188、mir-190、mir-190b、mir-191、mir-192、mir-193a、mir-193b、mir-194-1、mir-194-2、mir-195、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-197、mir-198、mir-199a-1、mir-199a-2、mir-199b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-202、mir-203、mir-204、mir-205、mir-206、mir-208a、mir-208b、mir-210、mir-211、mir-212、mir-214、mir-215、mir-216a、mir-216b、mir-217、mir-218-1、mir-218-2、mir-219-1、mir-219-2、mir-221、mir-222、mir-223、mir-224、mir-296、mir-297、mir-298、mir-299、mir-300、mir-301a、mir-301b、mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d、mir-302e、mir-302f、mir-320a、mir-320b-1、mir-320b-2、mir-320c-1、mir-320c-2、mir-320d-1、mir-320d-2、mir-320e、mir-323、mir-323b、mir-324、mir-325、mir-326、mir-328、mir-329-1、mir-329-2、mir-330、mir-331、mir-335、mir-337、mir-338、mir-339、mir-340、mir-342、mir-345、mir-346、mir-361、mir-362、mir-363、mir-365-1、mir-365-2、mir-367、mir-369、mir-370、mir-37、mir-372、mir-373、mir-374a、mir-374b、mir-374c、mir-375、mir-376a-1、mir-376a-2、mir-376b、mir-376c、mir-377、mir-378、mir-378b、 mir-378c、mir-379、mir-380、mir-381、mir-382、mir-383、mir-384、mir-409、mir-410、mir-411、mir-412、mir-421、mir-422a、mir-423、mir-424、mir-425、mir-429、mir-431、mir-432、mir-433、mir-448、mir-449a、mir-449b、mir-449c、mir-450a-1、mir-450a-2、mir-450b、mir-451、mir-452、mir-454、mir-455、mir-466、mir-483、mir-484、mir-485、mir-486、mir-487a、mir-487b、mir-488、mir-489、mir-490、mir-491、mir-492、mir-493、mir-494、mir-495、mir-496、mir-497、mir-498、mir-499、mir-500a、mir-500b、mir-501、mir-502、mir-503、mir-504、mir-505、mir-506、mir-507、mir-508、mir-509-1、mir-509-2、mir-509-3、mir-510、mir-511-1、mir-511-2、mir-512-1、mir-512-2、mir-513a-1、mir-513a-2、mir-513b、mir-513c、mir-514-1、mir-514-2、mir-514-3、mir-514b、mir-515-1、mir-515-2、mir-516a-1、mir-516a-2、mir-516b-1、mir-516b-2、mir-517a、mir-517b、mir-517c、mir-518a-1、mir-518a-2、mir-518b、mir-518c、mir-518d、mir-518e、mir-518f、mir-519a-1、mir-519a-2、mir-519b、mir-519c、mir-519d、mir-519e、mir-520a、mir-520b、mir-520c、mir-520d、mir-520e、mir-520f、mir-520g、mir-520h、mir-521-1、mir-521-2、mir-522、mir-523、mir-524、mir-525、mir-526a-1、mir-526a-2、mir-526b、mir-527、mir-532、mir-539、mir-541、mir-542、mir-543、mir-544、mir-544b、mir-545、mir-548a-1、mir-548a-2、mir-548a-3、 mir-548aa-1、mir-548aa-2、mir-548b、mir-548c、mir-548d-1、mir-548d-2、mir-548e、mir-548f-1、mir-548f-2、mir-548f-3、mir-548f-4、mir-548f-5、mir-548g、mir-548h-1、mir-548h-2、mir-548h-3、mir-548h-4、mir-548i-1、mir-548i-2、mir-548i-3、mir-548i-4、mir-548j、mir-548k、mir-5481、mir-548m、mir-548n、mir-548o、mir-548p、mir-548s、mir-548t、mir-548u、mir-548v、mir-548w、mir-548x、mir-548y、mir-548z、mir-549、mir-550a-1、mir-550a-2、mir-550b-1、mir-550b-2、mir-551a、mir-551b、mir-552、mir-553、mir-554、mir-555、mir-556、mir-557、mir-558、mir-559、mir-561、mir-562、mir-563、mir-564、mir-566、mir-567、mir-568、mir-569、mir-570、mir-571、mir-572、mir-573、mir-574、mir-575、mir-576、mir-577、mir-578、mir-579、mir-580、mir-581、mir-582、mir-583、mir-584、mir-585、mir-586、mir-587、mir-588、mir-589、mir-590、mir-591、mir-592、mir-593、mir-595、mir-596、mir-597、mir-598、mir-599、mir-600、mir-601、mir-602、mir-603、mir-604、mir-605、mir-606、mir-607、mir-608、mir-609、mir-610、mir-611、mir-612、mir-613、mir-614、mir-615、mir-616、mir-617、mir-618、mir-619、mir-620、mir-621、mir-622、mir-623、mir-624、mir-625、mir-626、mir-627、mir-628、mir-629、mir-630、mir-631、mir-632、mir-633、mir-634、mir-635、mir-636、mir-637、mir-638、mir-639、mir-640、 mir-641、mir-642a、mir-642b、mir-643、mir-644、mir-645、mir-646、mir-647、mir-648、mir-649、mir-650、mir-651、mir-652、mir-653、mir-654、mir-655、mir-656、mir-657、mir-658、mir-659、mir-660、mir-661、mir-662、mir-663、mir-663b、mir-664、mir-665、mir-668、mir-670、mir-671、mir-675、mir-676、mir-708、mir-711、mir-718、mir-720、mir-744、mir-758、mir-759、mir-760、mir-761、mir-762、mir-764、mir-765、mir-766、mir-767、mir-769、mir-770、mir-802、mir-873、mir-874、mir-875、mir-876、mir-877、mir-885、mir-887、mir-888、mir-889、mir-890、mir-891a、mir-891b、mir-892a、mir-892b、mir-920、mir-921、mir-922、mir-924、mir-933、mir-934、mir-935、mir-936、mir-937、mir-938、mir-939、mir-940、mir-941-1、mir-941-2、mir-941-3、mir-941-4、mir-942、mir-942、mir-943、mir-944、mir-1178、mir-1179、mir-1180、mir-1181、mir-1182、mir-1183、mir-1184-1、mir-1184-2、mir-1184-3、mir-1185-1、mir-1185-2、mir-1193、mir-1197、mir-1200、mir-1202、mir-1203、mir-1204、mir-1205、mir-1206、mir-1207、mir-1208、mir-1224、mir-1225、mir-1226、mir-1227、mir-1228、mir-1229、mir-1231、mir-1233-1、mir-1233-2、mir-1234、mir-1236、mir-1237、mir-1238、mir-1243、mir-1244-1、mir-1244-2、mir-1244-3、mir-1245、mir-1246、mir-1247、mir-1248、mir-1249、mir-1250、mir-1251、mir-1252、mir-1253、 mir-1254、mir-1255a、mir-1255b-1、mir-1255b-2、mir-1256、mir-1257、mir-1258、mir-1260、mir-1260b、mir-1261、mir-1262、mir-1263、mir-1264、mir-1265、mir-1266、mir-1267、mir-1268、mir-1269、mir-1270-1、mir-1270-2、mir-1271、mir-1272、mir-1273、mir-1273c、mir-1273d、mir-1273e、mir-1274a、mir-1274b、mir-1275、mir-1276、mir-1277、mir-1278、mir-1279、mir-1280、mir-1281、mir-1282、mir-1283-1、mir-1283-2、mir-1284、mir-1285-1、mir-1285-2、mir-1286、mir-1287、mir-1288、mir-1289-1、mir-1289-2、mir-1290、mir-1291、mir-1292、mir-1293、mir-1294、mir-1295、mir-1296、mir-1297、mir-1298、mir-1299、mir-1301、mir-1302-1、mir-1302-10、mir-1302-11、mir-1302-2、mir-1302-3、mir-1302-4、mir-1302-5、mir-1302-6、mir-1302-7、mir-1302-8、mir-1302-9、mir-1303、mir-1304、mir-1305、mir-1306、mir-1307、mir-1321、mir-1322、mir-1323、mir-1324、mir-1468、mir-1469、mir-1470、mir-1471、mir-1537、mir-1538、mir-1539、mir-1825、mir-1827、mir-1908、mir-1909、mir-1910、mir-1911、mir-1912、mir-1913、mir-1914、mir-1915、mir-1972-1、mir-1972-2、mir-1973、mir-1976、mir-2052、mir-2053、mir-2054、mir-2110、mir-2113、mir-2114、mir-2115、mir-2116、mir-2117、mir-2276、mir-2277、mir-2278、mir-2355、mir-2861、mir-2909、mir-3065、mir-3074、mir-3115、mir-3116-1、 mir-3116-2、mir-3117、mir-3118-1、mir-3118-2、mir-3118-3、mir-3118-4、mir-3118-5、mir-3118-6、mir-3119-1；mir-3119-2、mir-3120、mir-3121、mir-3122、mir-3123、mir-3124、mir-3125、mir-3126、mir-3127、mir-3128、mir-3129、mir-3130-1、mir-3130-2、mir-3131、mir-3132、mir-3133、mir-3134、mir-3135、mir-3136、mir-3137、mir-3138、mir-3139、mir-3140、mir-3141、mir-3142、mir-3143、mir-3144、mir-3145、mir-3146、mir-3147、mir-3148、mir-3149、mir-3150、mir-3151、mir-3152、mir-3153、mir-3154、mir-3155、mir-3156-1、mir-3156-2、mir-3156-3、mir-3157、mir-3158-1、mir-3158-2、mir-3159、mir-3160-1、mir-3160-2、mir-3161、mir-3162、mir-3163、mir-3164、mir-3165、mir-3166、mir-3167、mir-3168、mir-3169、mir-3170、mir-3171、mir-3173、mir-3174、mir-3175、mir-3176、mir-3177、mir-3178、mir-3179-1、mir-3179-2、mir-3179-3、mir-3180-1、mir-3180-2、mir-3180-3、mir-3180-4、mir-3180-5、mir-3181、mir-3182、mir-3183、mir-3184、mir-3185、mir-3186、mir-3187、mir-3188、mir-3189、mir-3190、mir-3191、mir-3192、mir-3193、mir-3194、mir-3195、mir-3196、mir-3197、mir-3198、mir-3199-1、mir-3199-2、mir-3200、mir-3201、mir-3202-1、mir-3202-2、mir-3605、mir-3606、mir-3607、mir-3609、mir-3610、mir-3611、mir-3612、mir-3613、 mir-3614、mir-3615、mir-3616、mir-3617、mir-3618、mir-3619、mir-3620、mir-3621、mir-3622a、mir-3622b、mir-3646、mir-3647、mir-3648、mir-3649、mir-3650、mir-3651、mir-3652、mir-3653、mir-3654、mir-3655、mir-3656mir-3657、mir-3658、mir-3659、mir-3660、mir-3661、mir-3662、mir-3663、mir-3664、mir-3665、mir-3666、mir-3667、mir-3668、mir-3669、mir-3670、mir-3670、mir-3671、mir-3671、mir-3673、mir-3673、mir-3675、mir-3675、mir-3676、mir-3663、mir-3677、mir-3678、mir-3679、mir-3680、mir-3681、mir-3682、mir-3683、mir-3684、mir-3685、mir-3686、mir-3687、mir-3688、mir-3689a、mir-3689b、mir-3690、mir-3691、mir-3692、mir-3713、mir-3714、mir-3907、mir-3908、mir-3909、mir-3910-1、mir-3910-2、mir-3911、mir-3912、mir-3913-1、mir-3913-2、mir-3914-1、mir-3914-2、mir-3915、mir-3916、mir-3917、mir-3918、mir-3919、mir-3920、mir-3921、mir-3922、mir-3923、mir-3924、mir-3925、mir-3926-1、mir-3926-2、mir-3927、mir-3928、mir-3929、mir-3934、mir-3935、mir-3936、mir-3937、mir-3938、mir-3939、mir-3940、mir-3941、mir-3942、mir-3943、mir-3944、mir-3945、mir-4251、mir-4252、mir-4253、mir-4254、mir-4255、mir-4256、mir-4257、mir-4258、mir-4259、mir-4260、mir-4261、mir-4262、mir-4263、mir-4264、mir-4265、mir-4266、mir-4267、 mir-4268、mir-4269、mir-4270、mir-4271、mir-4272、mir-4273、mir-4274、mir-4275、mir-4276、mir-4277、mir-4278、mir-4279、mir-4280、mir-4281、mir-4282、mir-4283-1、mir-4283-2、mir-4284、mir-4285、mir-4286、mir-4287、mir-4288、mir-4289、mir-4290、mir-4291、mir-4292、mir-4293、mir-4294、mir-4295、mir-4296、mir-4297、mir-4298、mir-4299、mir-4300、mir-4301、mir-4302、mir-4303、mir-4304、mir-4305、mir-4306、mir-4307、mir-4308、mir-4309、mir-4310、mir-4311、mir-4312、mir-4313、mir-4314、mir-4315-1、mir-4315-2、mir-4316、mir-4317、mir-4318、mir-4319、mir-4320、mir-4321、mir-4322、mir-4323、mir-4324、mir-4325、mir-4326、mir-4327、mir-4328、mir-4329、mir-4329及mir-4330。
本發明係關於可自本文所述之細胞群或構築體獲得的細胞源性或分泌性miRNA之製劑。或者，製劑含有包括本文中所述之miRNA之序列之核酸分子。在一個實施例中，製劑含有可用以提供對天然腎之再生作用之個別miRNA中之一或多者。個別miRNA之組合可適用於提供此作用。示例性組合包含以下各物中之兩者或兩者以上：miR-21、miR-23a、miR-30c、miR-1224、miR-23b、miR-92a、miR-100、miR-125b-5p、miR-195、miR-10a-5p及其任何組合。另一示例性組合包含以下各物中之兩者或兩者以上：miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、 miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124、miR-151及其任何組合。在一個實施例中，miRNA之組合可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上之個別miRNA。熟習此項技藝者將瞭解其他miRNA及miRNA之組合可適合用於本發明中。額外miRNA之來源包含http：//mirbase.org上之miRBase，其代管且維持於曼徹斯特大學(University of Manchester)之生命科學院(Faculty of Life Sciences)。
在一個實施例中，製劑含有分泌性產物，該等產物包括旁分泌及/或鄰分泌因子，諸如alpha-1微球蛋白、beta-2-微球蛋白、鈣結合蛋白(calbindin)、叢生蛋白(clusterin)、結締組織生長因子、cystatin-C、谷胱甘肽-S-轉移酶alpha、腎損傷分子-1、嗜中性白血球膠原蛋白酶相關性lipocalin、骨橋蛋白(osteopontin)、三葉因子3(trefoil factor 3)、tam-horsfall尿醣蛋白、金屬蛋白酶組織抑制因子1、血管內皮生長因子、纖連蛋白、白介素-6、單核細胞趨化蛋白質-1。
一般而言，旁分泌因子係為由細胞所合成之可於小距離上擴散以誘導或造成相鄰細胞之變化(即，旁分泌相互作用)之分子。該等可擴散之分子稱為旁分泌因子。一般而言，鄰分泌因子係為促進經由寡醣、脂質或細胞膜之蛋白質組分傳遞之細胞間通訊之分子，且可影響發射細胞(emitting cell)或緊鄰細胞。鄰分泌信號傳遞通常涉及所涉及之兩個細胞之間的物理接觸。
在又一實施例中，本發明係關於含有如本文中所述之 一或多種分離之腎細胞源性分泌性囊泡之製劑。熟習此項技藝者將瞭解含有分泌性囊泡之各種類型之製劑將為適合的。
在另一態樣中，本發明提供製備含有腎細胞分泌性產物(例如，囊泡)之製劑之方法。在一個實施例中，該方法包含提供腎細胞群，包含一或多種經富集之腎細胞群之摻雜物之步驟。在另一實施例中，該方法進一步包含於適合之條件下培養該群之步驟。條件可為較低氧之條件。在另一實施例中，方法進一步包含自腎細胞群分離分泌性產物之步驟。可自細胞群之細胞培養基獲得分泌性囊泡。分離出分泌性產物之後，接著可將其用作本文中所述之製劑之一部分。在另一實施例中，提供分泌性產物之腎細胞係藉由對氧水準具生物響應性之囊泡產生及/或分泌來表徵，其中培養系統之氧壓之降低導致囊泡產生及/或分泌之誘導。在一個實施例中，當相較於在可用氧之正常大氣(~21%)水準下培養之細胞群，在使細胞於培養系統中經受可用氧水準之降低之條件下培養細胞群時，囊泡產生及/或分泌受到誘導。在一個實施例中，於較低氧之條件下培養之細胞群相對於正常氧之條件下培養之細胞群，產生及/或分泌更高水準之囊泡。一般而言，在降低之水準之可用氧下(亦稱為低氧培養條件)細胞之培養意謂降低之氧之水準係相對於在正常大氣水準之可用氧下(亦稱為正常或常氧培養條件)細胞之培養而降低。在一個實施例中，低氧細胞培養條件包含在約小 於1%之氧、約小於2%之氧、約小於3%之氧、約小於4%之氧或約小於5%之氧下培養細胞。在另一實施例中，正常或常氧培養條件包含在約10%之氧、約12%之氧、約13%之氧、約14%之氧、約15%之氧、約16%之氧、約17%之氧、約18%之氧、約19%之氧、約20%之氧、約21%之氧下培養細胞。在較佳之實施例中，該方法提供外切體及/或微囊泡自腎細胞之分離。
在一個實施例中，製劑含有自腎細胞所分泌之產物。產物可分泌自非處於支架上之腎細胞，例如，該等細胞並非為如本文中所述之構築體之一部分。
在另一實施例中，製劑含有由已接種於支架上(例如，構築體)之腎細胞所分泌之產物。該構築體包含經直接接種於支架上或支架中之一或多種經富集之腎細胞群或其摻雜物。
在另一態樣中，本發明提供用於在調配之前篩選/優化/監測一或多種經富集之腎細胞群及含有其之摻雜物或構築體之生物治療功效之活體外方法。在一個實施例中，該方法包含提供一或多種測試群、測試摻雜物或測試構築體(「測試品」)之步驟。在另一實施例中，該方法包含如本文中所述於適合之條件下培養該測試品之步驟。在另一實施例中，該方法包含自經培養之測試品收集細胞培養基之步驟。該培養基可稱為「條件培養基」且預期其含有由測試品之腎細胞所分泌之產物。
在另一態樣中，使用該條件培養基引導一或多種活體外測定以便測試該測試品之生物治療功效。在一個實施例中，使條件培養基經受上皮-間質細胞轉換(epithelial-mesenchymal transition；EMT)測定。該測定可測試由TGFβ1所誘導之EMT。實例18提供用於該測定之示例性方案。
在另一實施例中，使條件培養基經受RNA之偵測，例如經由基於PCR之測定，及/或經受囊泡或外切體之偵測，例如經由FACS。在另一實施例中，使條件培養基經受信號傳遞路徑測定，例如，免疫反應(例如NFκB)、纖維化反應(PAI-1)及血管生成(angiogenesis)。實例15-17提供用於此等測定之示例性方案。
6.使用方法
在另一態樣中，本發明之製劑可經投與以用於治療疾病。舉例而言，可將生物活性細胞作為本文中所述之製劑之一部分投與至天然器官。在一個實施例中，生物活性細胞可源自作為投與對象之天然器官，或源自並非為目標天然器官之來源。
在一個態樣中，本發明提供利用含有如本文中所述之腎細胞群及腎細胞之摻雜物之製劑來治療有需要之受檢者中之腎病、貧血症或EPO缺乏之方法。在一個實施例中，該方法包括向受檢者投與製劑，該製劑含有包含針對產生EPO之細胞富集之第一腎細胞群之組合物。在另一實施例中，第一細胞群係針對產生EPO之細胞、腎絲 球細胞及血管細胞富集。在一個實施例中，第一腎細胞群為B4’細胞群。在另一實施例中，組合物可進一步包含一或多種額外之腎細胞群。在一個實施例中，該額外之細胞群係為未針對產生EPO之細胞富集之第二細胞群。在另一實施例中，該額外之細胞群係為未針對產生EPO之細胞、腎絲球細胞或血管細胞富集之第二細胞群。在另一實施例中，組合物亦包含如本文中所述沈積於生物材料中、沈積於生物材料上、包埋於生物材料中、經生物材料塗佈、懸浮於生物材料中或捕獲於生物材料中以形成可植入式構築體之腎細胞群或腎細胞之摻雜物，以用於本文中所述之疾病或病症之治療。在一個實施例中，細胞群係單獨使用或者與其他細胞或生物材料，例如水凝膠、多孔性支架或者天然或合成肽或蛋白質組合使用，以刺激急性或慢性疾病狀態中之再生。
在另一態樣中，可透過紅血球生成及/或腎功能之各種指標來觀測本發明之方法對受檢者中之腎病、貧血症或EPO缺乏之有效治療。在一個實施例中，紅血球系之穩態之指標包含但不限於血容比(HCT)、血紅素(HB)、平均紅血球血紅素(MCH)，紅血球計數(RBC)、網狀紅血球數、網狀紅血球%、平均血球體積(MCV)及紅血球分佈寬度(RDW)。在另一實施例中，腎功能之指標包含但不限於血清白蛋白、白蛋白比球蛋白比率(A/G比率)、血清磷、血清鈉、腎大小(可由超音波量測)、血清鈣、磷：鈣比率、血清鉀、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血尿素氮 (BUN)、膽固醇水準、三酸甘油酯水準及腎絲球過濾速率(GFR)。此外，一般健康及幸福感之幾個指標包含但不限於體重增加或減少、存活期、血壓(體動脈平均壓(mean systemic blood pressure)、舒張壓或收縮壓)及身體耐力表現。
在另一實施例中，藉由腎功能之一或多個指標之穩定來證明以生物活性腎細胞群之有效治療。腎功能之穩定係藉由觀測到由本發明之方法所治療之受檢者中之指標相較於未由本發明之方法治療之受檢者中同一指標之變化來證實。或者，可藉由觀測到由本發明之方法所治療之受檢者中之指標相較於治療之前同一受檢者中同一指標之變化來證實腎功能之穩定。第一指標之變化可為數值上之增加或減少。在一個實施例中，由本發明提供之治療可包含受檢者中血尿素氮(BUN)水準之穩定，其中於該受檢者中所觀測之BUN水準相較於未由本發明之方法治療之具有類似疾病狀態之受檢者係更低。在另一實施例中，該治療可包含受檢者中血清肌酐水準之穩定，其中於該受檢者中所觀測之血清肌酐水準相較於未由本發明之方法治療之具有類似疾病狀態之受檢者係更低。在另一實施例中，該治療可包含受檢者中血容比(HCT)水準之穩定，其中於該受檢者中所觀測之HCT水準相較於未由本發明之方法治療之具有類似疾病狀態之受檢者係更高。在另一實施例中，該治療可包含受檢者中紅血球(RBC)水準之穩定，其中於該受檢者中所觀測之RBC 水準相較於未由本發明之方法治療之具有類似疾病狀態之受檢者係更高。熟習此項技藝者將瞭解可量測本文中所述或此項技藝中已知之一或多個額外指標以確定受檢者中腎病之有效治療。
在另一態樣中，本發明係關於用於在受檢者中提供紅血球系之穩態之方法中之製劑。在一個實施例中，該方法包含以下步驟：(a)向受檢者投與含有如本文中所述之腎細胞群(例如B2或B4’)或腎細胞之摻雜物(例如B2/B4’及/或B2/B3)或經富集之腎細胞群之製劑；及(b)確定來自受檢者之生物樣品中紅血球生成指標之水準相對於對照組中之指標水準有所不同，其中指標水準之差別(i)指示受檢者回應於投與步驟(a)，或(ii)指示受檢者中紅血球系之穩態。在另一實施例中，該方法包含以下步驟：(a)向受檢者投與包括如本文中所述之腎細胞群或腎細胞之摻雜物之製劑；及(b)確定來自受檢者之生物樣品中紅血球生成指標之水準相對於對照組中之指標水準有所不同，其中指標水準之差別(i)指示受檢者回應於投與步驟(s)，或(ii)指示受檢者中紅血球系之穩態。在另一實施例中，該方法包含以下步驟：(a)提供生物材料或生物相容性聚合性支架；(b)以本文所述之方式於生物材料或支架上或生物材料或支架內沈積本發明之腎細胞群或腎細胞之摻雜物；(c)製備含有該構築體之製劑；(d)將構築體植入受檢者中；及(e)確定來自受檢者之生物樣品中紅血球生成指標之水準相對於對照組中之指標水準有所不同， 其中指標水準之差別(i)指示受檢者回應於投與步驟(a)，或(ii)指示受檢者中紅血球系之穩態。
在另一態樣中，本發明係關於用於向有需要之受檢者提供腎功能之穩定及紅血球系之穩態之恢復的方法中之製劑，該受檢者具有腎功能之缺陷及貧血症及/或EPO缺乏。在一個實施例中，該方法包含以下步驟：投與含有如本文中所述之腎細胞群或腎細胞之摻雜物之製劑，該腎細胞群或腎細胞之摻雜物含有以下細胞類型中之至少一者：腎小管源性細胞、腎絲球源性細胞、間質源性細胞、集合管源性細胞、基質組織(stromal tissue)源性細胞，或來源於脈管系統之細胞。在另一實施例中，該群或摻雜物含有產生EPO之細胞及腎小管上皮細胞二者，該等腎小管細胞已藉由以下標誌物中之至少一者識別：megalin、cubilin、透明質酸合成酶2(HAS2)、維生素D3 25-羥化酶(CYP2D25)、N-鈣黏蛋白(Ncad)、E-鈣黏蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成員RAS原癌基因家族(Rab17)、GATA結合蛋白質3(Gata3)、含FXYD域之離子轉運調節因子4(Fxyd4)、溶質攜帶物家族9(鈉/氫交換劑)、成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族、成員B1(Aldh3b1)、醛脫氫酶1家族、成員A3(Aldh1a3)及鈣蛋白酶(Capn8)。在此實施例中，將藉由相較於未治療之受檢者或相較於受檢者之治療前指標，腎功能之至少一個指標之改良且相伴紅血球生成之至少一個指標之改良，來證實對受檢者之治療。
在一態樣中，本發明提供用於以下方法中之製劑：(i)治療腎病、貧血症或EPO缺乏；(ii)穩定腎功能；(iii)恢復紅血球系之穩態；或(iv)其任何組合，其係藉由投與如本文所述之針對產生EPO之細胞富集之腎細胞群或含有針對產生EPO之細胞富集之細胞群之腎細胞之摻雜物來達成的，其中該投與之有益作用係高於投與未針對產生EPO之細胞富集之細胞群之作用。在另一實施例中，經富集之細胞群提供改良之血清血尿素氫(BUN)之水準。在另一實施例中，經富集之細胞群提供改良之蛋白質於血清中之滯留。在另一實施例中，經富集之細胞群提供改良之血清膽固醇及/或三酸甘油酯之水準。在另一實施例中，經富集之細胞群提供改良之維生素D之水準。在一個實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之磷：鈣比。在另一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之血紅素之水準。在另一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之血清肌酐之水準。在又一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之血容比之水準。在另一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之紅血球數(RBC#)之水準。在一個實施例中，改良之血容比之水準係經恢復至95%之正常健康水準。在另一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之網狀紅血球數(reticulocyte number)。在其他實施例中，經富集之細胞 群提供相較於未富集之細胞群經改良之網狀紅血球百分比。在其他實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之紅血球體積分佈寬度(RDW)之水準。在又一實施例中，經富集之細胞群提供相較於未富集之細胞群經改良之血紅素之水準。在又一實施例中，經富集之細胞群提供骨髓中之紅血球生成反應(erythroietic response)，以使得骨髓細胞性係為接近正常(near-normal)且骨髓系細胞：紅血球系細胞之比(myeloid：erythroid ratio)係為接近正常。
在另一態樣中，本發明提供用於以下方法中之製劑：(i)治療腎病、貧血症或EPO缺乏；(ii)穩定腎功能；(iii)恢復紅血球系之穩態；或(iv)其任何組合，其係藉由投與經富集之細胞群來達成的，其中投與本文中所述之腎細胞群或腎細胞群之摻雜物之有益作用係藉由相較於由投與重組EPO(rEPO)所提供之有益作用經改良之紅血球系之穩態來表徵。在一個實施例中，該群或摻雜物在投與至有需要之受檢者中時提供相較於投與重組EPO蛋白質經改良之紅血球系之穩態(如由血容比、血紅素或RBC#所確定)。在一個實施例中，該群或摻雜物在投與時提供相較於重組EPO經改良之血容比、RBC或血紅素之水準，較對照組中之血容比低或高不大於約10%。在另一實施例中，單次劑量或遞送之該群或摻雜物在投與時提供經治療之受檢者中紅血球系之穩態之改良(如由血容比、血紅素或RBC#之增加所確定)持續一段時間，該段時間顯 著超過單次劑量或遞送之重組EPO蛋白質提供紅血球系之穩態之改良之時間段。在另一實施例中，該群或摻雜物在以本文所述之劑量投與時不會導致血容比、血紅素或RBC#高於匹配之健康對照組中正常水準之約110%。在另一實施例中，該群或摻雜物在以本文所述之劑量投與時提供相較於以本文所述之劑量遞送之重組EPO蛋白質較為優良之紅血球系之穩態(如由血容比、血紅素或RBC#所確定)。在另一實施例中，重組EPO係以約100IU/kg、約200IU/kg、約300IU/kg、約400IU/kg或約500IU/kg之劑量遞送。熟習此項技藝者將瞭解此項技藝中已知之重組EPO之其他劑量可為適合的。
本發明之另一實施例係關於製劑於製備藥劑中之用途，該等製劑含有至少一種細胞群，包含本文中所述之經富集之細胞群或其摻雜物，或含有本文中所述之可植入式構築體，或含有本文中所述之分泌性產物，該藥劑係用於治療有需要之受檢者中之腎病、貧血症或EPO缺乏，提供有需要之受檢者中之紅血球系之穩態，改良有需要之受檢者中之腎功能，或提供對天然腎之再生作用。
本發明之另一實施例係關於含有特定之經富集之細胞群(本文中所述)之製劑，以用於基於特定細胞群之選擇、基於特定之經確認之治療屬性來治療具特定病因學之腎病。
在又一態樣中，本發明提供用於治療有需要之受檢者中腎病之方法中之製劑，該等方法包括：向受檢者投與 包括哺乳動物腎細胞之摻雜物之製劑，該摻雜物包括第一細胞群B2，其包括分離之經富集之腎小管細胞群，具有介於1.045g/mL與1.052g/mL之間的密度；及第二細胞群B4’，其包括產生紅血球生成素(EPO)之細胞及血管細胞，但耗減腎絲球細胞，具有介於1.063g/mL與1.091g/mL之間的密度，其中該摻雜物不包含包括集合管與腎小管系統之大細微性細胞且具有<1.045g/ml之密度的B1細胞群，或包括具有低細微性及活力之碎片及小細胞且具有>1.091g/ml之密度的B5細胞群。在某些實施例中，該方法包含確定來自受檢者之測試樣品中腎功能指標之水準相對於對照組中之指標水準有所不同，其中指標水準之差別指示受檢者中一或多種腎功能下降之降低、穩定或改良。在一個實施例中，方法中所用之B4’細胞群係藉由血管標誌物之表現來表徵。在某些實施例中，方法中所用之B4’細胞群並非藉由腎絲球標誌物之表現來表徵。在一個實施例中，方法中所用之細胞之摻雜物能夠進行氧調諧的紅血球生成素(EPO)之表現。在某些實施例中，欲藉由本發明之方法治療之腎病伴隨有紅血球生成素(EPO)缺乏。在某些實施例中，EPO缺乏係為貧血症。在一些實施例中，EPO缺乏或貧血症係繼受檢者中之腎衰竭之後而發生。在其他一些實施例中，EPO缺乏或貧血症係繼選自由以下組成之群之病症之後而發生：慢性腎衰竭、原發性EPO缺乏、化學療法或抗病毒療法、非骨髓系癌症、HIV感染、肝病、心臟衰竭、類 風濕性關節炎或多器官系統衰竭。在某些實施例中，方法中所用之組合物進一步包括生物材料，其包括一或多種生物相容性合成聚合物及/或自然發生之蛋白質或肽，其中該摻雜物係經生物材料塗佈、沈積於生物材料上或生物材料中、捕獲於、懸浮於、包埋於生物材料中及/或以其他方式與生物材料組合。在某些實施例中，本發明之製劑中所用之摻雜物係來源於哺乳動物腎組織或經培養之哺乳動物腎細胞。在其他實施例中，摻雜物係來源於對有需要之受檢者而言為同種自體性的腎樣品。在一個實施例中，樣品為腎切片。在其他實施例中，製劑含有來源於非同種自體性腎樣品之摻雜物。
在又一態樣中，本發明提供含有本文所述之細胞製備物及摻雜物或本發明之可植入式構築體之製劑於製備藥劑中之用途，該藥劑適用於治療需要其之受檢者中之腎病、貧血症或EPO缺乏。
在另一態樣中，本發明提供用於有需要之受檢者中天然腎之再生之方法中之製劑。在一個實施例中，該方法包含向受檢者投與或植入本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之步驟。再生之天然腎可由許多指標表徵，該等指標包含，但不限於，天然腎中功能或能力之發展、天然腎中功能或能力之改良，及天然腎中某些標誌物之表現。在一個實施例中，可基於本文所述之紅血球系之穩態及腎功能之各種指標來觀測經發展或改良之功能或能力。在另一實施例中，藉由一或多種幹細胞標誌物之 差異性表現來表徵再生之腎。幹細胞標誌物可為以下各物中之一或多者：SRY(性別決定區Y)-box 2(Sox2)；未分化之胚胎細胞轉錄因子(UTF1)；小鼠Nodal同源物(NODAL)；Prominin 1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24；及其任何組合(參見Ilagan等人PCT/US2011/036347，其整個內容以引用之方式併入本文)。在另一實施例中，該(等)幹細胞標誌物之表現相較於對照組係經上調。
可使用本文中所述之細胞群，包含經富集之細胞群及其摻雜物，以及含有其之構築體，來提供對天然腎之再生作用。該作用可由細胞自身及/或由細胞所分泌之產物提供。再生作用可藉由以下各項中之一或多者表徵：上皮-間質細胞轉換之降低(其可為經由TGF-β信號傳遞之減弱)；腎纖維化之降低；腎炎症之降低；天然腎中幹細胞標誌物之差異性表現；植入之細胞及/或天然細胞至腎損傷(例如腎小管損傷)之位點之遷移，所植入細胞於腎損傷(例如腎小管損傷)之位點處之植入；腎功能之一或多個指標(如本文中所述)之穩定；紅血球系之穩態(如本文中所述)之恢復；及其任何組合。
7.監測再生之方法
在另一態樣中，本發明提供一種用於監測在向受檢者投與或植入含有本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體的製劑之後天然腎之再生之預後方法。在一個實施例中，該方法包含偵測自受檢者獲得之測試樣品中及對照 樣品中標誌物表現之水準，其中測試樣品中相較於對照樣品中標誌物之表現之更高水準係對於受檢者中天然腎之再生之預後。在另一實施例中，方法包含樣品中一或多個幹細胞標誌物之表現之偵測。幹細胞標誌物可選自Sox2、UTF1、NODAL、CD133、CD24及其任何組合(參見Ilagan等人PCT/US2011/036347中之實例11)。偵測步驟可包含確定測試樣品中相對於對照樣品中幹細胞標誌物之表現係經上調或更高，其中更高之表現水準係對於受檢者之天然腎之再生之預後。在另一實施例中，偵測幹細胞標誌物之mRNA表現。在其他實施例中，mRNA表現之偵測可為經由基於PCR之方法，例如qRT-PCR。亦可使用原位雜交法(In situ hybridization)進行mRNA表現之偵測。在另一實施例中，亦可使用抗幹細胞標誌物試劑(anti-stem cell marker agent)偵測幹細胞標誌物之多肽表現。在另一實施例中，該試劑係為針對標誌物之抗體。在另一實施例中，使用免疫組織化學法或西方墨點法(Western Blot)偵測幹細胞標誌物之多態表現。熟習此項技藝者將瞭解用於偵測標誌物之mRNA及/或多肽表現之其他方法。
在另一態樣中，本發明提供用於在植入或投與含有本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之後對患者之預後評價之方法。在一個實施例中，該方法包含以下步驟：偵測自該受檢者獲得之測試樣品中標誌物表現之水準；(b)相對於對照樣品中標誌物表現之水準(或對照參考 值)，確定測試樣品中之表現水準；及(c)基於標誌物表現水準之確定，預測患者之再生預後，其中測試樣品中相較於對照樣品中(或對照參考值)的標誌物之更高表現水準係對於受檢者中再生之預後。
在另一態樣中，本發明提供用於監測在向受檢者投與或植入含有本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體的製劑之後天然腎之再生之預後方法，其中使用了非侵襲性方法。作為對組織切片之替代，可自體液，例如尿液之偵測來評估接受治療之患者中的再生結果。已發現，自受檢者源性尿液來源獲得之微囊泡含有最終來源於受以本發明之細胞群治療所影響之腎細胞群之某些組分，包含但不限於特定蛋白質及miRNA。該等組分可包含於幹細胞複製與分化、凋亡、炎症及免疫調節中所涉及之因子。微囊泡相關性miRNA/蛋白質表現樣式之時間分析(temporal analysis)允許對接受本發明之細胞群、摻雜物或構築體之受檢者之腎內的再生結果之連續監測。實例19描述用於受檢者尿液之分析之示例性方案。
可針對指示再生結果之生物標誌物來分析該等腎源性囊泡及/或腎源性囊泡之流入受檢者尿液中之管腔內容物。
在一個實施例中，本發明提供評估腎病(KD)患者是否回應於以治療製劑之治療之方法。該方法可包含相較於或相對於對照樣品中囊泡之量，測定或偵測自以該治療劑治療之KD患者獲得之測試樣品中囊泡或其管腔內容 物之量之步驟，其中測試樣品中囊泡或其管腔內容物之量相較於對照樣品中囊泡或其管腔內容物之量更高或更低係指示經治療患者對以治療劑之治療之響應性。
本發明亦提供監測KD患者中以治療劑治療之功效之方法。在一個實施例中，該方法可包含相較於或相對於對照樣品中囊泡或其管腔內容物之量，測定或偵測自以治療劑治療之KD患者獲得之測試樣品中囊泡之量之步驟，其中測試樣品中囊泡或其管腔內容物之量相較於對照樣品中囊泡或其管腔內容物之量更高或更低係指示KD患者中以治療劑之治療之功效。
本發明提供識別試劑對於治療其腎病(KD)有效之患者亞群之方法。在一個實施例中，該方法包含相較於自對照樣品獲得之樣品中囊泡或其管腔內容物之量，測定試劑之功效與來自患者亞群之樣品中囊泡或其管腔內容物之量之存在之間的相關性之步驟，其中來自患者亞群之樣品中囊泡之量相較於對照樣品中囊泡或其管腔內容物之量更高或更低係指示該試劑對治療患者亞群中之KD有效。
該測定或偵測步驟可包含分析測試樣品中可能存在的miRNA或其他分泌性產物之量(見實例19)。
非侵襲性預後方法可包含在投與或植入本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之前及/或之後自受檢者獲得尿液樣品之步驟。可使用包含但不限於離心以移除非所需碎片之標準技術自尿液樣品分離囊泡及其他分泌性產物 (Zhou等人2008.Kidney Int.74(5)：613-621；Skog等人之美國公開專利申請案第20110053157號，其各自之整個內容以引用之方式併入本文)。
本發明係關於用以偵測治療之後受檢者中之再生結果之非侵襲性方法。該等方法涉及來自經治療之受檢者之尿液中的囊泡或其管腔內容物之偵測。管腔內容物可為一或多種miRNA。個別miRNA之組合或小組之偵測可適用於此等預後方法。示例性組合包含以下各物中之兩者或兩者以上：miR-24、miR-195、miR-871、miR-30b-5p、miR-19b、miR-99a、miR-429、let-7f、miR-200a、miR-324-5p、miR-10a-5p及其任何組合。在一個實施例中，miRNA之組合可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或11個以上之個別miRNA。熟習此項技藝者將瞭解其他miRNA及miRNA之組合可適合用於此等預後方法中。額外miRNA之來源包含http：//mirbase.org上之miRBase，其代管且維持於曼徹斯特大學之生命科學院。
熟習此項技藝者將瞭解，用於偵測再生之預後方法除適用於本文中所述之細胞群及構築體之外，還可適用於以此項技藝中已知之其他治療劑治療之受檢者。
在一些實施例中，測定步驟包括由適合之處理器執行之軟體程式之使用，其目的為(i)量測測試樣品及對照組中標誌物表現(或囊泡/囊泡內容物)之差異性水準；及/或(ii)分析自量測測試樣品及對照組中標誌物表現之差異性水準所獲得之資料。適合之軟體及處理器於此項技 藝中眾所熟知且可自市場上購得。該程式可嵌入儲存於諸如CD-ROM、軟碟、硬碟、DVD或與處理器關聯之記憶體等之有形媒體上之軟體中，但熟習此項技藝者將容易瞭解，整個程式或其部分可替代地由除處理器以外之裝置執行，及/或以眾所熟知之方式嵌入韌體及/或專屬之硬體中。
測定步驟之後，通常記錄量測結果、發現、診斷、預測及/或治療建議且傳送至(例如)技師、醫師及/或患者。在某些實施例中，使用電腦將此等資訊傳送至相關方，諸如患者及/或主治醫師。在一些實施例中，將在不同於結果或診斷所傳送至之國家或地區的國家或地區執行測定及分析測定結果。
在較佳之實施例中，將基於測試受檢者中所量測之標誌物表現水準具有標誌物表現之差異性水準的預後、預測及/或治療建議於測定完成且產生預後及/或預測之後儘快傳送至受檢者。結果及/或相關資訊可由受檢者之治療醫師傳送至受檢者。或者，可藉由包含書面形式、諸如電子郵件等之電子通訊形式或電話之任何通訊手段，將結果直接傳送至測試受檢者。可藉由電腦之使用便利通訊，諸如於電子郵件通訊之情況下。在某些實施例中，可使用熟習電信技藝者所熟知之電腦硬體與軟體之組合，產生含有預後測試之結果及/或自測試得出之結論及/或基於測試之治療建議的通訊且自動傳送至受檢者。美國專利第6,283,761號中描述定向於醫療衛生之通訊系統 的一個例子；然，本發明並不限於利用此特定通訊系統之方法。在本發明方法之某些實施例中，方法步驟之全部或部分，包含樣品之測定、再生之預後及/或預測及測定結果或預後之傳送，可於不同(例如，外地)地區執行。
在另一態樣中，本文中所述之預後方法將資訊提供至關注植入或投與之再生成功之相關方。
在所有實施例中，如本文中所述向需要此治療之受檢者提供再生之腎的方法可包含如本文所述之再生之預後評價之植入後步驟。
8.生物活性細胞製劑
本文中所述之製劑併入有生物材料，該等生物材料具有為欲投與至受檢者之諸如生物活性腎細胞等之活性劑創建有利環境之性質。在一個實施例中，製劑含有第一生物材料，該第一生物材料係自活性劑與生物材料一起調配之時起直至投與至受檢者之時刻提供有利環境。在另一實施例中，有利環境涉及在投與至受檢者之前使生物活性細胞懸浮於實質上之固態中相對於細胞於流體中(如本文所述)之優勢。在另一實施例中，第一生物材料係為溫度敏感性生物材料。溫度敏感性生物材料可(i)在約8℃或8℃以下具有實質上之固態及/或(ii)在環境溫度或環境溫度以上具有實質上之液態。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。
在另一態樣中，製劑含有生物活性分子與第二生物材料相組合，該第二生物材料係自調配之時起直至投與至 受檢者後之時刻為所組合之細胞提供有利環境。在一個實施例中，由第二生物材料提供之有利環境涉及在保留結構完整性直至投與至受檢者之時刻且於投與後持續一段時間之生物材料中投與細胞之優勢。在一個實施例中，植入之後第二生物材料之結構完整性係為數分鐘、數小時、數天或數周。在一個實施例中，結構完整性係為少於一個月、少於一周、少於一天或少於一小時。相對短期之結構完整性提供一種製劑，其可在受控制之搬運、置放或分散下將活性劑及生物材料遞送至組織或器官中之目標位置，而不會成為所併入之元件與其所置放入之組織或器官之相互作用之阻礙或障壁。
在另一實施例中，第二生物材料係為具有不同於第一生物材料之敏感性之溫度敏感性生物材料。第二生物材料可(i)在約環境溫度或環境溫度以下具有實質上之固態及/或(ii)在37℃或37℃以上具有實質上之液態。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。
在一個實施例中，第二生物材料係為經交聯之珠粒。經交聯之珠粒可具有取決於交聯度，可微調之活體內滯留時間，如本文中所述。在另一實施例中，經交聯之珠粒包括生物活性細胞且如本文中所述對酶降解具抗性。
本發明之製劑可包含第一生物材料與活性劑(例如生物活性細胞)相組合，其中存在或不存在第二生物材料與活性劑(例如生物活性細胞)相組合。在製劑包含第二生 物材料時，其可為溫度敏感性珠粒及/或經交聯之珠粒。於下面之實例(亦見第3-7圖)中提供各種代表性製劑。
本文中所述之生物活性細胞製備物、摻雜物及/或構築體可作為生物活性細胞製劑之形式投與。在一態樣中，製劑包含細胞及對本文中所述之生物活性細胞製備物、摻雜物及/或構築體提供穩定性之一或多種生物材料。在一個實施例中，生物材料係為可取決於溫度而保持至少兩個不同的相或狀態之溫度敏感性生物材料。生物材料能夠於第一溫度下保持第一狀態、於第二溫度下保持第二狀態及/或於第三溫度下保持第三狀態。第一、第二或第三狀態可為實質上之固態、實質上之液態或實質上之半固態或半液態。在一個實施例中，生物材料於第一溫度下具有第一狀態及於第二溫度下具有第二狀態，其中第一溫度係低於第二溫度。在另一實施例中，溫度敏感性生物材料之狀態於約8℃或8℃以下之溫度下為實質上之固態。在其他實施例中，實質上之固態係保持於約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃或約8℃。在一個實施例中，實質上之固態具有凝膠之形式。在其他實施例中，溫度敏感性生物材料之狀態於環境溫度或環境溫度以上為實質上之液態。在一個實施例中，實質上之液態係保持於約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃或約37℃。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。
在另一實施例中，溫度敏感性生物材料之狀態於約環境溫度或環境溫度以下之溫度下為實質上之固態。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。在另一實施例中，實質上之固態係保持於約17℃、約16℃、約15℃、約14℃、約13℃、約12℃、約11℃、約10℃、約9℃、約8℃、約7℃、約6℃、約5℃、約4℃、約3℃、約2℃或約1℃。在一個實施例中，實質上之固態具有珠粒之形式。在另一實施例中，溫度敏感性生物材料之狀態於約37℃或37℃以上之溫度下為實質上之液態。在另一實施例中，實質上之固態係保持於約37℃、約38℃、約39℃或約40℃。
溫度敏感性生物材料可提供為溶液之形式、珠粒之形式或本文中所述及/或熟習此項技藝者所已知之其他適合形式。本文中所述之細胞群及製備物可經溫度敏感性生物材料塗佈、沈積於溫度敏感性生物材料上、包埋於溫度敏感性生物材料中、黏附至溫度敏感性生物材料、接種於、懸浮於或捕獲於溫度敏感性生物材料中。或者，溫度敏感性生物材料可不提供以任何細胞，諸如，例如呈間隔珠粒之形式。
在其他實施例中，溫度敏感性生物材料在第一狀態與第二狀態之間具有轉變態。在一個實施例中，轉變態係為於約8℃之溫度與約環境溫度之間的固-液轉變態。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。在另一實施例中，固-液轉變態發生於約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、約 12℃、約13℃、約14℃、約15℃、約16℃、約17℃或約18℃中之一或多個溫度下。
溫度敏感性生物材料於給定溫度下具有以厘泊(cP)量測之某一黏度。在一個實施例中，生物材料於25℃具有約1cP至約5cP、約1.1cP至約4.5cP、約1.2cP至約4cP、約1.3cP至約3.5cP、約1.4cP至約3.5cP、約1.5cP至約3cP、約1.55cP至約2.5cP或約1.6cP至約2cP之黏度。在另一實施例中，0.75%(w/v)溶液於37℃下具有約1.0cP至約1.15cP之黏度。37℃下之黏度可為約1.0cP、約1.01cP、約1.02cP、約1.03cP、約1.04cP、約1.05cP、約1.06cP、約1.07cP、約1.08cP、約1.09cP、約1.10cP、約1.11cP、約1.12cP、約1.13cP、約1.14cP或約1.15cP。在另一實施例中，生物材料係為明膠溶液。明膠係以約0.5%、約0.55%、約0.6%、約0.65%、約0.7%、約0.75%、約0.8%、約0.85%、約0.9%、約0.95%或約1%(w/v)存在於溶液中。在一實例中，生物材料係為於PBS中之0.75%(w/v)明膠溶液。在一個實施例中，0.75%(w/v)溶液於25℃下具有約1.6cP至約2cP之黏度。在一個實施例中，0.75%(w/v)溶液於37℃下具有約1.07cP至約1.08cP之黏度。明膠溶液可提供於PBS、DMEM或另一適合之溶劑中。
在一態樣中，生物活性細胞製劑亦包含細胞活力劑。在一個實施例中，細胞活力劑係選自由抗氧化劑、載氧體、免疫調節因子、細胞募集因子、細胞黏附因子、抗 發炎劑、血管生成因子、傷口癒合因子及自生物活性細胞分泌之產物組成之群。
抗氧化劑係藉由抑制其他分子之氧化之能力來表徵。抗氧化劑包含但不限於以下各物中之一或多者：6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox®)、類胡蘿蔔素、類黃酮、異黃酮、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗壞血酸、維生素E、維生素A、混合之類胡蘿蔔素(例如beta胡蘿蔔素、alpha胡蘿蔔素、gamma胡蘿蔔素、黃體素、番茄紅素、八氫番茄紅素(phytopene)、六氫番茄紅素(phytofluene)及蝦青素)、硒、輔酶Q10、吲哚-3-甲醇、前花青素(proanthocyanidin)、白藜蘆醇(resveratrol)、槲皮黃酮(quercetin)、兒茶素(catechin)、水楊酸、薑黃色素(curcumin)、膽紅素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸(vanilic acid)、聚酚(polyphenol)、阿魏酸(ferulic acid)、茶黃素(theaflavins)及其衍生物。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他抗氧化劑。
載氧體係為藉由攜帶及釋放氧之能力來表徵之試劑。其包含但不限於全氟碳及含有全氟碳之藥物。適合的基於全氟碳之載氧體包含但不限於全氟辛基溴(C8F17Br)、perfluorodichorotane(C8F16C12)、全氟癸基溴、perfluobron、全氟萘烷(perfluorodecalin)、全氟三丙基胺(perfluorotripopylamine)、全氟甲基環呱啶(perfluoromethylcyclopiperidine)、Fluosol®(全氟萘烷& 全氟三丙基胺)、Perftoran®(全氟萘烷&全氟甲基環呱啶)、Oxygent®(全氟癸基溴& perfluobron)、OcycyteTM(全氟(第三丁基環己烷))。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他基於全氟碳之載氧體。
免疫調節因子包含但不限於骨橋蛋白、FAS配體因子、白介素、轉型生長因子beta、血小板源性生長因子、叢生蛋白、轉鐵蛋白、調節活化正常T細胞表現與分泌之蛋白質(regulated upon action,normal T-cell expressed,secreted protein；(RANTES)、纖溶酶原啟動物抑制劑-1(Pai-1)、腫瘤壞死因子alpha(TNF-alpha)、白介素6(IL-6)、alpha-1微球蛋白及beta-2-微球蛋白。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他免疫調節因子。
抗發炎劑或免疫抑制劑(下文描述)亦可為製劑之一部分。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他抗氧化劑。
細胞募集因子包含但不限於單核細胞趨化蛋白質1(monocyte chemotatic protein 1；MCP-1)及CXCL-1。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他細胞募集因子。
細胞黏附因子包含但不限於纖連蛋白、前膠原(procollagen)、膠原蛋白、ICAM-1、結締組織生長因子、層黏連蛋白、蛋白聚糖(proteoglycans)、特異性細胞黏附肽諸如RGD及YSIGR。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他細胞黏附因子數。
血管生成因子包含但不限於基質金屬蛋白酶1(matrix metalloprotease 1；MMP1)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、血管內皮生長因子F(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor or matalloproteases-1；TIMP-1)、血管內皮生長因子F(VEGF)、血管生成素-2(ANG-2)。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他血管生成因子數。
傷口癒合因子包含但不限於角質細胞生長因子(keratinocyte growh factor 1；KGF-1)、組織纖溶酶原啟動物(tissue plasminogen activator；tPA)、鈣結合蛋白、叢生蛋白、cystatin C、三葉因子3。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他傷口癒合因子。
自本文中所述之生物活性細胞分泌之產物亦可添加至生物活性細胞製劑以作為細胞活力劑。
在另一態樣中，製劑包含本文中所述之溫度敏感性生物材料及含有生物材料之生物相容性珠粒之群組。在一個實施例中，珠粒為經交聯的。交聯可使用熟習此項技藝者所已知之任何適合之交聯劑達成，該等交聯劑諸如，例如碳化二亞胺類、醛類(例如糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)、基於琥珀醯亞胺之交聯劑{雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate；BS3)、二琥珀醯亞胺基戊二酸酯(Disuccinimidyl glutarate；DSG)、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate；DSS)、二硫代雙(琥珀醯亞胺 基丙酸酯)(Dithiobis(succinimidyl propionate))、乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(Ethylene glycolbis(sulfosuccinimidylsuccinate))、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)；EGS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)戊二酸酯(Bis(Sulfosuccinimidyl)glutarate；BS2G)、二琥珀醯亞胺基酒石酸酯(Disuccinimidyl tartrate；DST)}；環氧化物類(乙二醇二縮水甘油醚(Ethylene glycol diglycidyl ether)、1,4丁二醇二縮水甘油醚(1,4 Butanediol diglycidyl ether))；醣類(葡萄糖及醛醣)；磺酸類及對甲苯磺酸；羰基二咪唑；京尼平(genipin)；亞胺類；酮類；疊氮磷酸二苯酯(diphenylphosphorylazide；DDPA)；對苯二醯氯(terephthaloyl chloride)；六水合硝酸鈰(III)(cerium(III)nitrate hexahydrate)；微生物轉麩醯胺酶(microbial transglutaminase)；及過氧化氫。熟習此項技藝者將瞭解適用於本發明中之其他交聯劑及交聯方法。
在一個實施例中，珠粒為經碳化二亞胺交聯之珠粒。經碳化二亞胺交聯之珠粒可經選自由1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、DCC-N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)，及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIPC)組成之群之碳化二亞胺交聯。經較低濃度之EDC處理之珠粒預期具有較高之游離一級胺之數目，而經較高濃度之交聯劑處理之樣品所具有之一級胺大部分參與醯胺鍵。 由一級胺與苦基磺酸之間的共價鍵結所顯現之橙色之強度(可用分光光度法在約335nm偵測)係與樣品中存在的一級胺之數目成正比。當按樣品中存在的蛋白質之毫克正規化時，可觀測到所存在的游離胺之數目與用於交聯之EDC之初始濃度之間的負相關。此結果指示差異性珠粒交聯，其受反應中所用之碳化二亞胺之量所支配。一般而言，經交聯之珠粒展現相較於未交聯之珠粒降低數目之游離一級胺。游離一級胺之數目可用分光光度法在約335nm偵測。
經交聯之珠粒相較於未交聯之生物相容性珠粒具有對酶降解之降低易感性，由此提供具有可微調之活體內滯留時間之珠粒。舉例而言，經交聯之珠粒對諸如膠原蛋白酶等之內源性酶具抗性。經交聯之珠粒之提供係為集中於促進以下各項中之一或多者之生物材料的開發與生產之遞送系統之一部分：(a)所黏附之細胞至所需位點之遞送及用於天然組織及維管連結之再生與長入之空間之創建；(b)於該位點持續足夠長時間以允許細胞建立、起作用、重塑其微環境且分泌其自身細胞外基質(ECM)之能力；(c)所植入之細胞與周圍組織之整合之促進；(d)以實質上之固體形式植入細胞之能力；(e)不會對所遞送之細胞/材料之組織長入或與宿主組織之整合提供顯著障壁之短期結構完整性；(f)以實質上之固體形式之定位活體內遞送，由此防止植入期間細胞於組織內之分散；(g)錨定依賴性細胞相較於懸浮於流體中之細胞經改良 之穩定性及活力；及(h)當i)以實質上之固體形式(例如，黏附至珠粒)及ii)以實質上之液體形式(例如，懸浮於流體中)遞送細胞時之雙相釋放概況。
在一個實施例中，本發明提供含有明膠之經交聯之珠粒。未交聯之明膠珠粒因快速喪失完整性且細胞自注射位點消散而不適用於生物活性細胞製劑。相比而言，經高度交聯之珠粒可能於注射位點持續過久且可能妨礙新生(de-novo)ECM分泌、細胞整合及組織再生。本發明允許經交聯之珠粒之活體內滯留時間可微調。為了定製生物材料之生物降解性，對於所有樣品可在保持總體反應條件恆定的同時使用碳化二亞胺之不同交聯劑濃度。舉例而言，可藉由自約零至約1M改變交聯劑之濃度來微調經碳化二亞胺交聯之珠粒之酶易感性。在一些實施例中，該濃度係為約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約26mM、約27mM、約28mM、約29mM、約30mM、約31mM、約32mM、約33mM、約34mM、約35mM、約36mM、約37mM、約38mM、約39mM、約40mM、約41mM、約42mM、約43mM、約44mM、約45mM、約46mM、約47mM、約48mM、約49mM、約50mM、約55mM、約60mM、約65mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約 95mM或約100mM。交聯劑濃度亦可為約0.15M、約0.2M、約0.25M、約0.3M、約0.35M、約0.4M、約0.45M、約0.5M、約0.55M、約0.6M、約0.65M、約0.7M、約0.75M、約0.8M、約0.85M、約0.9M、約0.95M或約1M。在另一實施例中，交聯劑係為1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在一個實施例中，經EDC交聯之珠粒係為明膠珠粒。第10圖描繪用於經EDC介導之明膠珠粒之交聯之示意圖且第15圖說明如何可取決於交聯劑之濃度來微調珠粒之降解%。
經交聯之珠粒可具有有利於接種、黏附或包囊之某些特性。舉例而言，珠粒可具有多孔性表面及/或可為實質上中空。孔之存在提供增加之細胞黏附表面，從而相較於無孔或平滑表面，允許更高數目之細胞黏附。此外，孔結構可支援宿主組織與多孔珠粒之整合，從而支援新生組織之形成。珠粒具有可擬合至對應於一般性粒子分佈樣式之Weibull曲線的大小分佈。在一個實施例中，經交聯之珠粒具有小於約120μm、約115μm、約110μm、約109μm、約108μm、約107μm、約106μm、約105μm、約104μm、約103μm、約102μm、約101μm、約100μm、約99μm、約98μm、約97μm、約96μm、約95μm、約94μm、約93μm、約92μm、約91μm或約90μm之平均直徑。經交聯之珠粒之特性取決於鑄造製程而變化。舉例而言，為提供具有上述特性使用一種製程，該製程中使用空氣流來氣霧化液體明膠溶液並利用薄層層析試劑 噴霧器將其噴灑至液氮中(ACE Glassware)。熟習此項技藝者將瞭解調節鑄造過程之參數提供定製珠粒之不同特性，例如不同的大小分佈之機會。
使用其中將珠粒與對應於最終生物活性細胞製劑之細胞一起培養之細胞培養技術，在調配之前於活體外評估經交聯之珠粒之細胞相容性。舉例而言，在製備生物活性腎細胞製劑之前將珠粒與原代腎細胞一起培養，且使用活/死細胞測定來確認細胞相容性。
在某些製劑中，將生物相容性交聯珠粒與呈溶液形式之溫度敏感性生物材料組合，其係為溶液之體積之約5%(w/w)至約15%(w/w)。經交聯之珠粒可以溶液之體積之約5%(w/w)、約5.5%(w/w)、約6%(w/w)、約6.5%(w/w)、約7%(w/w)、約7.5%(w/w)、約8%(w/w)、約8.5%(w/w)、約9%(w/w)、約9.5%(w/w)、約10%(w/w)、約10.5%(w/w)、約11%(w/w)、約11.5%(w/w)、約12%(w/w)、約12.5%(w/w)、約13%(w/w)、約13.5%(w/w)、約14%(w/w)、約14.5%(w/w)或約15%(w/w)存在。
在另一態樣中，本發明提供含有經數分鐘、數小時或數天之數量級之時間段降解之生物材料之製劑。此與集中於植入隨後經數天、數周或數月緩慢降解之固體材料之較大主體或工作形成對比。
在另一態樣中，本發明提供具有以生物活性細胞接種之生物相容性交聯珠粒以及遞送基質一起之製劑。在一 個實施例中，遞送基質具有以下特性中之一或多者：生物相容性、生物降解性/生物吸收性、植入至受檢者之前及期間實質上之固態、植入後結構完整性(實質上之固態)之喪失，及細胞相容性環境以支援細胞活力。遞送基質保持所植入之粒子(例如經交聯之珠粒)於植入期間間隔開之能力增強天然組織長入。若遞送基質不存在，則細胞化之珠粒於植入期間之壓縮會導致用於充分組織長入之空間不足。遞送基質促進固體製劑之植入。此外，結構完整性之短持續時間意謂植入後不久，植入不會對所遞送之細胞/材料之組織長入或與宿主組織之整合提供顯著障壁。遞送基質提供本文所述之製劑之定位，因為固體單元之插入有助於防止所遞送之材料於植入期間在組織內分散。對於基於細胞之製劑，固體遞送基質改良錨定依賴性細胞相較於懸浮於流體中之細胞之穩定性及活力。
在一個實施例中，遞送基質係為未以細胞接種之生物相容性珠粒之群體。在另一實施例中，未經接種之珠粒分散遍佈經細胞接種之珠粒及於個別經細胞接種之珠粒中間。未經接種之珠粒於植入之前及緊接植入之後充當經細胞接種之珠粒之間的「間隔珠粒」。間隔珠粒含有於第一溫度下具有實質上之固態及於第二溫度下具有實質上之液態之溫度敏感性生物材料，其中第一溫度係低於第二溫度。舉例而言，間隔珠粒含有於約環境溫度或環境溫度以下具有實質上之固態及於約37℃具有實質上之 液態之生物材料，諸如本文中所述者。在一個實施例中，環境溫度係約為室溫。在另一實施例中，生物材料係為明膠溶液。明膠溶液係以約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約10.5%或約11%(w/v)之濃度存在。明膠溶液可提供於PBS、細胞培養基(例如DMEM)或另一適合之溶劑中。
在一態樣中，本發明提供含有以實質上之固體形式植入(例如間隔珠粒)且接著於植入身體中之後液化/熔融或以其他方式喪失結構完整性之生物材料之製劑。此與集中於使用可作為液體形式注射而隨後於身體中固化之材料之重大工作主體形成對比。
可於調配之前於活體外評估間隔珠粒之溫度敏感性。間隔珠粒可經標記且與未標記之非溫度敏感性珠粒混合。隨後於37℃孵育混合物以觀測物理轉變之變化。隨時間觀測較高溫度下經標記之溫度敏感性珠粒之形狀之喪失。舉例而言，溫度敏感性明膠珠粒可用阿爾襄藍(Alcian blue)染料製成以充當物理轉變之標誌物。將藍色明膠珠粒與Cultispher S珠粒(白色)混合，載入於導管中，隨後擠出並於1X PBS(pH 7.4)中37℃孵育。用顯微鏡於不同時間點跟蹤藍色明膠珠粒之形狀之喪失。藍色明膠珠粒之物理狀態之變化於30分鐘後可見，且在延長之孵育時間下變得更為顯著。由於材料之黏性，故珠粒不會完全消散。(第2圖)。
可使用本文中所述之生物活性細胞製劑來製備基於腎細胞之製劑以供注射入腎中。然，熟習此項技藝者將瞭解製劑將適合於許多其他類型之生物活性細胞群。舉例而言，本發明涵蓋用於供注射入任何實體器官或組織之生物活性細胞之製劑。
在一態樣中，本文中所述之生物活性細胞製劑將含有一定數目之細胞。在一個實施例中，用於製劑之細胞之總數為約104、約105、約106、約107、約108或約109。在一個實施例中，用於本文中所述之製劑之細胞之劑量可基於目標器官或組織之估算品質或功能性品質(functional mass)進行計算。在某些實施例中，本發明之生物活性細胞製劑所含有之劑量係對應於基於將作為製劑所治療之受檢者之宿主器官之重量的細胞數。舉例而言，生物活性腎細胞製劑係基於人腎之約150公克之平均重量。在一個實施例中，每公克(g)腎之細胞數係為約600細胞/g至約7.0 x 107細胞/g。在一些實施例中，每公克腎之細胞數係為約600細胞/g、約1000細胞/g、約1500細胞/g、約2000細胞/g、約2500細胞/g、約3000細胞/g、約3500細胞/g、約4000細胞/g、約4500細胞/g、約5000細胞/g、約5500細胞/g、約6000細胞/g、約6500細胞/g、約7000細胞/g、約7500細胞/g、約8000細胞/g、約8500細胞/g、約9000細胞/g、約9500細胞/g或約10,000細胞/g。
在其他實施例中，每公克腎之細胞數係為約1.5 x 104細胞/g、約2.0 x 104細胞/g、約2.5 x 104細胞/g、約3.0 x 104 細胞/g、約3.5 x 104細胞/g、約4.0 x 104細胞/g、約4.5 x 104細胞/g、約5.0 x 104細胞/g、約5.5 x 104細胞/g、約6.0 x 104細胞/g、約6.5 x 104細胞/g、約7.0 x 104細胞/g、約7.5 x 104細胞/g、約8.0 x 104細胞/g、約9.5 x 104細胞/g。
在其他實施例中，每公克腎之細胞數係為約1.0 x 105細胞/g、約1.5 x 105細胞/g、約2.0 x 105細胞/g、約2.5 x 105細胞/g、約3.0 x 105細胞/g、約3.5 x 105細胞/g、約4.0 x 105細胞/g、約4.5 x 105細胞/g、約5.0 x 105細胞/g、約5.5 x 105細胞/g、約6.0 x 105細胞/g、約6.5 x 105細胞/g、約7.0 x 105細胞/g、約7.5 x 105細胞/g、約8.0 x 105細胞/g、約8.5 x 105細胞/g、約9.0 x 105細胞/g或約9.5 x 105細胞/g。
在其他實施例中，每公克腎之細胞數係為約1.0 x 106細胞/g、約1.5 x 106細胞/g、約2.0 x 106細胞/g、約2.5 x 106細胞/g、約3.0 x 106細胞/g、約3.5 x 106細胞/g、約4.0 x 106細胞/g、約4.5 x 106細胞/g、約5.0 x 106細胞/g、約5.5 x 106細胞/g、約6.0 x 106細胞/g、約6.5 x 106細胞/g、約7.0 x 106細胞/g、約7.5 x 106細胞/g、約8.0 x 106細胞/g、約8.5 x 106細胞/g、約9.0 x 106細胞/g、約9.5 x 106細胞/g、1.0 x 107細胞/g或約1.5 x 107細胞/g。
可選擇用於製劑之細胞之總數且可調整製劑之體積以達到恰當之劑量。
在一些實施例中，製劑可含有對於受檢者之單劑量或單劑量外加額外劑量之細胞之劑量。在其他實施例中，可藉助於本文中所述之構築體來提供劑量。本文中所述 之腎細胞群或腎細胞群之摻雜物之治療有效量可在自受檢者所安全接受之最大細胞數至腎病之治療所必需之最小細胞數之範圍內，該腎病之治療例如為一或多種腎功能之穩定、降低之下降率或改良。
治療有效量之本文中所述之腎細胞群或其摻雜物可懸浮於醫藥學上可接受之載劑或賦形劑中。此種載劑包含但不限於基礎培養基外加1%血清白蛋白、生理鹽水、緩衝生理鹽水、右旋糖、水、膠原蛋白、海藻酸鹽、透明質酸、纖維蛋白膠(fibrin glue)、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纖維素及其組合。製劑應適應投與之模式。
相應地，本發明提供含有腎細胞製劑或其摻雜物，例如單獨之或與B3及/或B4或B4’細胞群摻雜之B2細胞群的製劑之用途，其係用於製造用以治療受檢者腎病之藥劑。在一些實施例中，藥劑進一步包括重組多肽，諸如生長因子、趨化激素(chemokine)或細胞激素(cytokine)。在其他實施例中，藥劑包括人腎源性細胞群。可使用對於本文中所述之方法所提供之任何變體對用以製造藥劑之細胞進行分離、衍生或富集。
依據常規程序將腎細胞製備物或其摻雜物或組合物調配為適合用於投與至人類之醫藥組合物。通常，用於例如靜脈內投與、動脈內投與或於腎囊(kidney capsule)內投與之組合物係為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。若需要，則組合物亦可包含局部麻醉劑以改善注射位點之任何疼痛。一般而言，該等成分係單獨供應或者一起混 合於單位劑量形式中，例如凍存之濃縮物於密封之容器中，諸如指示活性劑之量之安瓶。當欲藉由輸注投與組合物時，其可用含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸注瓶分配。在藉由注射投與組合物時，可提供無菌注射用水或生理鹽水之安瓶以使得可於投與之前混合該等成分。
醫藥學上可接受之載劑部分上係藉由所投與之特定組合物以及藉由用以投與組合物之特定方法確定。相應地，存在各種各樣適合之醫藥組合物之製劑(例如參見Alfonso R Gennaro(ed),Remington：The Science and Practice of Pharmacy，以前之Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed.,Lippincott,Williams & Wilkins,2003，其整個內容以引用之方式併入本文)。醫藥組合物一般經調配為無菌的、實質上等張的且完全遵從美國食品藥品監督管理局(U.S.Food and Drug Administration)之所有優良製造標準(Good Manufacturing Practice；GMP)規範。
本發明之一態樣進一步提供醫藥製劑，其包括本發明之腎細胞製備物，例如單獨之或與B3及/或B4或B4’細胞製備物組合之B2細胞製備物，及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，製劑包括104至109哺乳動物腎源性細胞。
修飾釋放製劑
在一態樣中，本發明之製劑經提供為修飾釋放製劑。一般而言，修飾釋放係藉由一經投與後第一活性劑之初 始釋放，接著第二活性劑之至少一額外、隨後釋放來表徵。第一與第二活性劑可為相同或其可為不同。在一個實施例中，製劑透過多種組分於同一製劑中提供修飾釋放。在另一實施例中，修飾釋放製劑含有活性劑作為第一組分之一部分，該第一組分允許活性劑於製劑之整個體積中自由移動，由此容許一經投與後於目標位點之立即釋放。第一組分可為具有實質上之液相及實質上之固相之溫度敏感性生物材料，其中第一組分於投與之時係於實質上之液相中。在一個實施例中，活性劑係於實質上之液相中以使得其於製劑之整個體積中實質上自由移動，且因此一經投與後立即釋放至目標位點。
在另一實施例中，修飾釋放製劑具有活性劑作為第二組分之一部分，其中活性劑係黏附至第二組分、沈積於第二組分上、經第二組分塗佈、包埋於第二組分中、接種於第二組分上或捕獲於第二組分中，其持續投與至目標位點前後。第二組分含有結構性元件，活性劑能夠與其締合，由此防止於投與之時活性劑自第二組分之立即釋放。舉例而言，第二組分係以實質上之固體形式提供，例如生物相容性珠粒，其可經交聯以防止或延遲活體內酶降解。在一個實施例中，於實質上之固相中之活性劑於投與前後保留其在製劑內的結構完整性，且因此其不會一經投與後就立即釋放活性劑至目標位點。適用於修飾釋放製劑之載劑於本文中已加以描述，但熟習此項技藝者將瞭解適宜用於本發明中之其他載劑。
在一個實施例中，製劑提供包含細胞、奈米粒子、治療分子等之所遞送元件之初始快速遞送/釋放，接著元件之稍後延遲釋放。本發明之製劑可針對此雙相釋放概況而設計，其中欲遞送之試劑係以未黏附之形式(例如細胞於溶液中)及經黏附之形式(例如細胞與珠粒或另一適合之載劑一起)提供。一經初始投與，未受阻礙之試劑立即經提供至遞送之位點，而受阻礙之試劑之釋放受到延遲直到載劑(例如珠粒)之結構完整性失效，此時先前黏附之試劑得以釋放。如下文所討論，熟習此項技藝者將瞭解其他適合之釋放機制。
可基於活性劑之性質調整釋放之時間延遲。舉例而言，生物活性細胞製劑中釋放之時間延遲可為數秒、數分鐘、數小時或數天之數量級。在一些情形中，以數周之數量級之延遲可為適當的。對於其他活性劑，諸如小分子或大分子，製劑中釋放之時間延遲可為數秒、數分鐘、數小時、數天、數周或數月之數量級。亦有可能製劑含有不同之生物材料，其提供不同之時間延遲釋放概況。舉例而言，具有第一活性劑之第一生物材料可具有第一釋放時間且具有第二活性劑之第二生物材料可具有第二釋放時間。第一與第二活性劑可為相同或可為不同。
如本文所討論，延遲釋放之時間段一般而言可對應於生物材料之結構完整性喪失之時間段。然，熟習此項技藝者將瞭解延遲釋放之其他機制。舉例而言，活性劑可隨時間連續釋放，而與任何特定生物材料之降解時間(例 如藥物自聚合性基質之擴散)無關。此外，生物活性細胞可自含有生物材料及生物活性細胞之製劑遷移離開，到達天然組織。在一個實施例中，生物活性細胞遷移離開生物材料，例如珠粒，達到天然組織。
可使用生物降解性、生物相容性聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐類、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯類及聚乳酸。可藉由於製劑中包含延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鹽及明膠，帶來可注射製劑之延長之吸收。用於製備此等製劑之許多方法獲得有專利或一般為熟習此項技藝者所已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。適用於多肽試劑之控制或延長釋放之額外方法例如描述於美國專利第6,306,406號及第6,346,274號中以及例如於美國專利申請案第US20020182254號及第US20020051808號中，該等文獻皆以引用之方式併入本文。
9.投與之方法與途徑
本發明之生物活性細胞製劑可單獨或與其他生物活性組分組合投與。該等製劑適用於將所併入之組織工程元件注射或植入至實體器官之內部以再生組織。此外，製劑可用於將組織工程元件注射或植入至中空器官之體壁以再生組織。
在一態樣中，本發明提供向有需要之受檢者提供本文中所述之生物活性細胞製劑之方法。在一個實施例中， 生物活性細胞之來源可為同種自體性或同種異體性、同系性(自體性或同基因)及其任何組合。在來源為非同種自體性之情形下，方法可包含免疫抑制劑之投與。適合之免疫抑制性藥物包含但不限於硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、咪唑立賓(mizoribine)、環孢靈(ciclosporin)、他克莫司水合物(tacrolimus hydrate)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯苯紮利二鈉(lobenzarit disodium)、金諾芬(auranofin)、前列地爾(alprostadil)、胍立莫司鹽酸鹽(gusperimus hydrochloride)、biosynsorb、莫羅莫那(muromonab)、阿法賽特(alefacept)、噴司他丁(pentostatin)、達利珠單抗(daclizumab)、西羅莫司(sirolimus)、麥考酚酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflonomide)、巴厘昔單抗(basiliximab)、阿法鏈道酶(dornase α)、bindarid、克拉屈濱(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(ilodecakin)、西利珠單抗(cedelizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、依維莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加維莫單抗(gavilimomab)、法拉莫單抗(faralimomab)、氯法拉濱(clofarabine)、雷帕黴素(rapamycin)、希普利珠單抗(siplizumab)、柴苓湯(saireito)、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、 J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG，及AGI-1096(見美國專利第7,563,822號)。熟習此項技術者將瞭解其他適合的免疫抑制性藥物。
本發明之治療方法涉及本文中所述之生物活性細胞製劑之遞送。在一個實施例中，細胞至具有預期益處之位點之直接投與係為較佳。亦可藉由天然腎與本文中所述之生物活性細胞製劑以及自一或多個經富集之腎細胞群及/或含有其之摻雜物或構築體所分泌之產物一起的活體內接觸，來治療有需要之受檢者。
可經由使用/投與含有自細胞培養基(例如條件培養基)分泌之產物之群體的製劑，或藉由植入經富集之細胞群及摻雜物或能夠在活體內分泌產物之構築體，來實現使天然腎活體內與分泌性產物接觸之步驟。活體內接觸之步驟對天然腎提供再生作用。
鑒於本說明書，熟習此項技藝者將很清楚用於向受檢者投與細胞及/或分泌性產物之各種各樣之手段。此等方法包含將細胞注射入受檢者中之目標位點中。
可將細胞及/或分泌性產物插入遞送裝置或媒劑中，其便利藉由注射或植入向受檢者中之引入。在某些實施例中，遞送媒劑可包含自然材料。在某些其他實施例中，遞送媒劑可包含合成材料。在一個實施例中，遞送媒劑 提供結構以模仿器官之架構或適當配合進器官之架構。在其他實施例中，遞送媒劑性質上係為流體樣。此等遞送裝置可包含管，例如導管，用於將細胞及流體注射入所接受之受檢者之身體中。在較佳之實施例中，管另外具有針頭，例如注射器，經由其可將本發明之細胞引入受檢者中之所需位置。在一些實施例中，哺乳動物腎源性細胞群係經調配用於經由導管投與至血管中(其中術語「導管」意圖包含用於將物質遞送至血管的各種管狀系統中之任一者)。或者，可將細胞插入生物材料或支架中或者插入生物材料或支架上，該生物材料或支架包含但不限於織物，諸如梭織物、針織物、編織物、網狀織物，及非織物，打孔膜、海綿與泡沫，及珠粒，諸如固體或多孔性珠粒、微粒子、奈米粒子等(例如Cultispher-S明膠珠粒-Sigma)。細胞可經製備以用於以各種各樣之不同形式之遞送。舉例而言，細胞可懸浮於溶液或凝膠中。可將細胞與醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑混合，於該載劑或稀釋劑中本發明之細胞可保持成活。醫藥學上可接受之載劑及稀釋劑包含生理鹽水、水性緩衝溶液、溶劑及/或分散介質。此等載劑及稀釋劑之使用在此項技藝中眾所熟知。溶液較佳為無菌及流體，且常常將為等張的。較佳地，溶液於製造及儲存之條件下係穩定的，且經由例如對羥基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等之使用而免受諸如細菌及真菌等之微生物之污染作用。熟習此項技藝者將瞭解於 本發明之細胞群及其摻雜物之遞送中所使用的遞送媒劑可包含上述特性之組合。
含有分離之腎細胞群(例如單獨或與B4’及/或B3摻雜之B2細胞群)之製劑之投與模式包含但不限於全身性、腎內(例如腎實質(parenchymal))、靜脈內或動脈內注射及直接注射入組織中預期之活性位點。欲根據本發明使用之額外的投與模式包含經由直接剖腹術、經由直接腹腔鏡檢查、經腹或經皮之單次或多次注射。再有的欲根據本發明使用之投與模式包含例如逆行性(retrograde)及腎盂輸尿管(ureteropelvic)輸注。外科手術之投與手段包含一步式程序，諸如但不限於部分腎切除術與構築體植入(partial nephrectomy and construct implantation)、部分腎切除術(partial nephrectomy)、部分髕骨切除術(partial pyelectomy)、以網膜±腹膜之血管化(vascularization with omentum±peritoneum)、多病灶活檢針道(multifocal biopsy needle tracks)、圓錐或錐體至圓柱體，及腎門樣置換，以及兩步式程序，包含例如供再植之類器官-內部生物反應器(organoid-internal bioreactor)。在一個實施例中，含有細胞之摻雜物之製劑係經由相同途徑同時遞送。在另一實施例中，包括受控制之摻雜物之細胞組合物中之每一者係單獨遞送至特定位置或經由特定方法學，同時或以時間受控之(temporally-controlled)方式，藉由本文中所述方法中之一或多者遞送。
人之適當的細胞植入劑量可由與細胞活性相關之現有資訊(例如EPO產生)確定，或者自臨床前研究中所執行之給藥研究推斷。根據活體外培養及活體內動物實驗，可量化細胞之量且將其用於計算所植入之材料之適當劑量。另，可監測患者以確定是否可進行額外之植入或相應地減少所植入之材料。
可向本文中所述之細胞群及其摻雜物添加一或多種其他組分，包含選定之細胞外基質組分，諸如此項技藝中已知之一或多種類型之膠原蛋白或透明質酸，及/或生長因子、富血小板血漿及藥物。
熟習此項技藝者將瞭解適用於本文中所述之分泌性產物之各種投與之製劑及方法。
10.製品及套組
本發明進一步包含套組，其包括本發明之聚合性基質及支架以及相關之材料，及/或細胞培養基及使用說明書。使用說明書可含有例如用於細胞之培養或細胞及/或細胞產物之投與之說明書。在一個實施例中，本發明提供包括如本文中所述之支架及說明書之套組。在又一實施例中，套組包含用於標誌物表現之偵測之試劑、用於該試劑之使用之試劑，及使用說明書。該套組可用於確定在植入或投與本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之後受檢者中天然腎之再生預後之目的。套組亦可用以確定本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之生物治療功效。
本發明之另一實施例係為含有適用於治療有需要之受檢者之生物活性細胞之製品。該製品包括容器及該容器上或與該容器結合之標籤或仿單(package insert)。適合之容器包含例如瓶、小瓶、注射器等。該等容器可由玻璃或塑膠等各種各樣之材料形成。容器保存有效於治療病況之組合物且可具有無菌入口(sterile access port)(例如，容器可為具有可經注射針刺破之塞子之輸液袋或小瓶)。製劑中之至少一種活性劑係為本發明之生物活性細胞群。標籤或仿單指示製劑係用於治療特定病況。標籤或仿單將進一步包括用於向患者投與製劑之說明書。亦涵蓋包括本文中所述之組合療法之製品及套組。仿單係指按慣例包含於治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於涉及此等治療產品之使用之適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或警告之資訊。在一個實施例中，仿單指示製劑係用於治療諸如(例如)腎疾病或病症等之疾病或病症。其可進一步包含自商業及使用者觀點而言所需要之其他材料，包含其他緩衝劑、稀釋劑、篩檢程序、針及注射器。亦可提供適用於各種目的之套組，例如用於再生結果之評估。亦可提供含有用於如本文中所述之尿液源性囊泡及/或其內容物(例如核酸(諸如miRNA)、囊泡、外切體等)之偵測試劑之套組。偵測試劑包含但不限於核酸引子及探針，以及用於所需目標之活體外偵測之抗體。如同該製品，套組包括容器及該容器上或與該容器結合之標籤或仿單。容器保存包括至少一種偵測試劑 之組合物。可包含含有例如稀釋劑及緩衝劑或對照偵測試劑之額外容器。標籤或仿單可提供該組合物之描述以及用於預期之活體外、預後或診斷用途之說明書。
11.報告
本發明之方法在用於商業目的而實踐時，一般產生再生預後之報告或總結。本發明之方法將產生報告，其包括在含有本文中所述之細胞群、摻雜物或構築體之製劑之任何投與或植入之前及之後，再生之可能過程或結果之預測。該報告可包含關於與預後相關之任何指標之資訊。本發明之方法及報告可進一步包含儲存該報告於資料庫中。或者，該方法可進一步為受檢者創建記錄於資料庫中且用資料填充該記錄。在一個實施例中報告係為紙質報告，在另一實施例中報告係為語音報告(auditory report)，在另一實施例中報告係為電子記錄。打算將報告提供給醫師及/或患者。報告之接收可進一步包含建立至包含資料及報告之伺服器電腦之網路連接且自伺服器電腦請求資料及報告。本發明所提供之方法亦可整體上或部分上自動化。
本文中適合地說明性描述之發明可於本文中未明確揭示之任何一或多個元件、一或多個限制之不存在下加以實踐。因此，舉例而言，在本文中之每一情形下術語「包括」、「基本上由......組成」及「由......組成」中之任一者可由其他兩個術語中之任一者替換。因此，對於使用其中一個術語之本發明之實施例，本發明亦包含其中該等 術語中之一者係經其中另一個術語替換之另一實施例。在每一實施例中，該等術語具有其經確立之含義。因此，舉例而言，一個實施例可涵蓋「包括」許多組分之製劑，另一實施例將涵蓋「基本上由相同組分組成」之製劑，且第三實施例將涵蓋「由相同組分組成」之製劑。已採用之術語及措辭係用作說明之術語而非加以限制，在此等術語及措辭之使用中不打算排除所顯示及所描述之特點或其部分之任何等效物，而認識到於所要求之發明之範疇內有可能存在各種修飾。因此，應理解雖然本發明已藉由較佳之實施例及優化特點加以明確揭示，但熟習此項技藝者可訴諸本文中所揭示之思路之修飾及變更，且認為此等修飾及變更係處於由所附申請專利範圍所定義之本發明之範疇內。
認為前文之書面描述係足以能夠使熟習此項技藝者來實踐本發明。提供以下實例僅係為說明性之目的，而非打算以任何方式限制本發明之範疇。更確切地，除本文中所顯示及所描述之實例外，熟習此項技藝者將根據前文之描述明顯瞭解本發明之各種修飾，且其屬於所附申請專利範圍之範疇內。
本說明書中所引證之全部專利、專利申請案及參考文獻其整個內容皆以引用之方式併入本文。
實例
實例1：具有短期結構完整性之遞送基質之使用
在考察新穎生物材料/細胞系統及評估其於吾人之齧 齒動物注射模型中之表現之過程中，吾人設計且開發了一種用於產生基於明膠之熱逆變珠粒之方法，以及熱逆變明膠連續相遞送基質，其將於細胞化之珠粒、細胞聚集體或單一細胞懸浮液周圍創建仿生微環境，從而允許細胞誘導之細胞外基質重塑、細胞-細胞相互作用、細胞遷移、增殖及組織再生。吾人已明確論證遞送基質技術於形成室溫或室溫以下為固體且體溫下為液體之明膠溶液中之效用。已使用該熱逆變可注射基質將游離細胞、細胞聚集體、微載劑珠粒上之細胞，及游離細胞與微載劑上之細胞之混合物植入大鼠腎之實質中。
方法
珠粒製作 於去離子水中製備10% w/v明膠溶液(Gelita,Inc.,Sioux City,IA)，接著利用薄層層析試劑噴霧器經空氣噴灑液氮中(LN2)。使LN2於化學通風櫥中蒸發且收集珠粒。
生物材料之細胞相容性及活體內植入評價 結合螢光顯微鏡成像使用Live/Dead®哺乳動物細胞活力/細胞毒性套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)以評估細胞相容性。對注射間隔珠粒與Cultispher S珠粒之混合物之腎執行組織學分析(植入後1周)，以評估珠粒之生物相容性及其空間創建能力。組織學載片經梅生三色劑(Masson’s Trichrome)(其將膠原蛋白染色藍色)或蘇木紫-伊紅(hematoxylin & eosin；H&E)染色。針對正向指標(組織長入、1月時最少至無可偵測之生物材料及健康組織)及 負向指標(巨噬細胞、巨細胞及其他發炎細胞之存在；支持纖維化囊形成之生物材料持久性，及集合管大小之增加)，進行影像之評價。
結果
熱逆變珠粒
由豬明膠溶液產生珠粒，該溶液之濃度允許該材料於25℃以下之溫度下膠凝/固化且於30℃以上液化。觀測未交聯之明膠珠粒(藍色)之溫度回應性。阿爾襄藍染料包含於初始明膠溶液中以充當物理轉變之標誌物。接著將藍色明膠珠粒與市場上可購得之微載劑珠粒(白色)混合，載入於導管中，隨後擠出並於1X PBS(pH 7.4)中37℃孵育。用顯微鏡於不同時間點跟蹤藍色明膠珠粒之形狀之喪失。藍色明膠珠粒之物理狀態之變化於30分鐘後可見，且在延長之孵育時間下變得更為顯著。由於材料之黏性，故珠粒不會完全消散(第1圖)。
熱逆變遞送基質
將熱逆變可注射基質與欲遞送之元件於流體狀態組合，置於管狀導管中，冷卻至室溫以下以使基質膠凝。在螢光顯微鏡影像中，使用Live/Dead®哺乳動物細胞活力/細胞毒性套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色，其展示活細胞染色綠色及死細胞染色紅色(第2-6圖)。吾人發現包埋於熱逆變可注射基質中之細胞在冷卻以使基質膠凝之後保持成活。其中植入含有微載劑珠粒之基質之組織之組織學分析(植入後1周)展現微載劑珠粒為暗紫色結 構。基質材料在該載片上不可見，且無證據表明其為組織長入之障壁(第7圖)。
第8圖中描繪基質之結構完整性之喪失之說明。基質於室溫下不流動，而於37℃流動。所觀測到之基質材料之特性及特點將允許所併入之元件於諸多組織工程及再生醫學應用中之遞送。具體而言，本發明利用1)植入之前及期間之結構完整性以及2)植入後不久某一時刻結構之喪失二者之益處，以在受控制之搬運、置放或分散下將材料遞送至組織或器官中之目標位置，而不會成為所併入之元件與其所置放入之組織或器官之相互作用之阻礙或障壁。
實例2：經由化學交聯定製生物材料之酶易感性
為定製生物材料對內源性膠原蛋白酶之酶易感性，基於豬明膠蛋白之熱逆變珠粒之產生(如上文實例1中所述)可進一步經化學交聯至不同程度以便調節其活體內滯留時間。此舉亦允許材料充當離散之組織再生構築體(諸如接種於載劑珠粒上之細胞)之間的間隔體，從而促進組織長入及創建仿生利基(niche)。此外，該材料具有充當細胞、藥物或其他分子遞送系統之潛力。為此，吾人選擇使用經充分表徵且廣泛使用之試劑，N-(3-二甲胺丙基)-N′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。該零長度之交聯劑促進位於分子內或分子間之空間上相鄰之羧基與一級胺官能基之間的醯胺鍵之形成(第9圖)。
方法
材料。自Gelita公司(Sioux City,IA)購得低內毒素明膠。自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)購得苦基磺酸溶液(TNBS)及N-乙基-N′-(3-二甲胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。自Invitrogen(Carlsbad,CA)購得LIVE/DEAD®哺乳動物細胞活力/細胞毒性套組。自Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)購得氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈣(CaCl2)及2-[N-嗎啉基]乙磺酸、0.9% NaCl,pH 4.7(MES)緩衝液。自Worthington Biochemical Corp.(Lakewood,NJ)購得膠原蛋白酶IV且自Stemcell Technologies(Vancouver,BC)購得分散酶I(dispase I)(4U/ml)。自Invitrogen/Gibco(Carlsbad,CA.)購得Dulbecco氏改良Eagle培養基(DMEM)、角質細胞-無血清培養基(Keratinocyte-SFM)及磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。
化學交聯。將凍幹之明膠珠粒懸浮於0.1M MES緩衝液，pH 4.7(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)中(20ml緩衝液/公克之珠粒)且再水合1-3小時，較佳於4℃進行。接著移除緩衝液(基於化學反應之pH及緩衝要求而選擇)，且利用等於珠粒之體積之EDC(1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽)/MES pH 7.4溶液製得1：1(v/v)懸浮液，其中EDC濃度介於10-100mM之範圍內，於短暫渦旋後將懸浮液於室溫於靜態條件下孵育隔夜。隨後，過濾珠粒，以去離子水洗滌(洗滌液體積=20X珠粒體積)，接著冷凍且凍幹。
活體外酶降解測定。藉由對膠原蛋白酶/分散酶消化之 易感性來測定經不同濃度之EDC交聯之珠粒之降解速率，且與市場上可購得之CULTISPHER®珠粒相比較。稱取CULTISPHER®及經交聯之珠粒並懸浮於PBS,pH 7.4中達到~20mg/ml之濃度。向0.5ml體積之珠粒懸浮液中添加含0.5mM CaCl2之50μl 30U/ml膠原蛋白酶/分散酶混合液(Thermo Fisher Scientific)，接著渦旋樣品且於37℃在搖擺器上孵育1h(對於所用之每一交聯劑濃度n=3)。隨後，自經部分消化之樣品收集20μl上清液，使用經修改之Bradford測定來評價可溶性蛋白質之含量，該測定中染料與蛋白質溶液之比率經設定為1：9 v/v以便增加其敏感性。剩餘之消化混合液如上文孵育隔夜，且類似地針對總蛋白質含量之確定進行測定。使用該等值來正規化經部分消化之樣品之值。由明膠標準曲線計算樣品中總蛋白質之量，該明膠標準曲線係藉由對於經完全消化、接著以Bradford試劑測定之由已知量之明膠製成之溶液擬合A595值而獲得。將樣品中總蛋白質之量視為100%且相對於100%來正規化藉由部分消化所獲得之蛋白質之量。降解係經計算為如藉由Bradford測定所量測的1小時可溶性蛋白質/總可溶性蛋白質之比率。
胺量化。藉由向每一小瓶添加5μl 1M NaOH(終pH值為~8.5)，來升高經完全消化之經交聯之珠粒溶液(如上文所述獲得)之pH(n=3)。隨後，向每一樣品添加TNBS達到0.25% w/v之終濃度，且於搖擺器上於37℃孵育小瓶2小時。接著利用板讀取器測定A335值，且按先前所測定 每一樣品中之毫克蛋白質將值正規化(上文所述)。由明膠標準曲線計算樣品中總蛋白質之量，該明膠標準曲線係藉由對於經完全消化、接著以Bradford試劑測定之由已知量之明膠製成之溶液擬合A595值而獲得。
珠粒大小設定。為窄化大小分佈，將經交聯之珠粒懸浮於70% v/v乙醇中且藉由經具有已定義孔大小之耐綸網之連續過濾而將大小設定至64-250μm。
形態及大小分佈。將凍幹之珠粒施加至具碳膠之短棒(carbon taped stub)上，濺射塗佈且利用Philips 515掃描式電子顯微鏡(SEM)成像。藉由分析十個SEM影像並彙編500個珠粒之量測值(n=500)，測定珠粒之大小分佈。
結果
藉由將濃縮之明膠溶液噴灑至液氮中，凍幹所得珠粒，接著使其與碳化二亞胺反應，獲得基於明膠之、經化學交聯之多孔珠粒。藉由改變交聯溶液之濃度(自0至1M EDC)，能夠控制交聯度且合成具有可微調之酶易感性之珠粒。
藉由SEM分析經噴灑之珠粒之形態及大小分佈(第10 A-B圖)。珠粒看似為球狀，具有多孔表面及主要為中空之核心。水合或交聯不會影響珠粒之物理特點(結果未顯示)。整個群體之大小分佈遵循Weilbull分佈概況，對粒子具特異性，其中大部分之珠粒直徑小於100μm，通常介於50-75μm之範圍內(第11圖)。該形態及大小範圍係與吾人先前之以腎組織工程為目標之生物材料篩選研究相 一致(Basu supra 2011)。
另外，珠粒之內部係為中空，將使其適用於作為微載劑之各種應用。珠粒之整個表面具有多孔外觀，此於濕態中會因水合作用而更為顯著(第12 A-B圖)。孔之存在轉化為增加之細胞黏附表面，相較於具平滑表面之對應物，將允許更高數目之細胞黏附。前述之物理特點，尤其珠粒之大小，係高度依賴於鑄造製程。在該情況下，藉由使用空氣流來氣霧化液體明膠溶液並利用薄層層析試劑噴霧器(ACE Glassware)將其噴灑至液氮中來獲得珠粒。與該製程相關之參數之調節可導致不同之大小分佈。
於生理條件下，未交聯之明膠珠粒於數分鐘內喪失其完整性，由此限制其作為載劑之應用範圍。目標在於開發一種載劑系統，其將細胞遞送至所需之位點，同時亦將其保持在適當位置直到其開始整合於新環境中。另外，載劑將經由外源性與內源性細胞之經定位、協調之相互作用來介導組織再生過程。為此目的，藉由使用一定範圍之碳化二亞胺濃度使明膠共價交聯。藉由以比色法量化反應完成後明膠中仍存在之一級胺之數目來測定交聯之程度(第13 A-B圖)。
經較低濃度之EDC處理之珠粒預期具有較高之游離一級胺之數目，而經較高濃度之交聯劑處理之樣品所具有之一級胺大部分參與醯胺鍵。由一級胺與苦基磺酸之間的共價鍵結所顯現之橙色之強度(可用分光光度法在約355nm偵測)係與樣品中存在的一級胺之數目成正比。當 按樣品中存在的蛋白質之毫克正規化時，吾人之結果顯示所存在的游離胺之數目與用於交聯之EDC之初始濃度之間的良好負相關。此結果指示差異性珠粒交聯，其受反應中所用之碳化二亞胺之量所支配。
吾人假設經交聯之明膠珠粒對諸如酶降解等之生理參數之易感性將與化學交聯之程度成比例地改變。為測試此，以酶法使經差異性交聯之珠粒部分降解，且按總樣品量將資料正規化。藉由開發基於最佳化Bradford試劑測定之篩選測試於活體外評估可調之酶易感性。將樣品與30U膠原蛋白酶/分散酶混合液一起孵育1h，並測定降解作用(n=3)。按完全酶降解(隔夜)之後所測定於樣品中明膠之總量，將資料正規化。ANOVA統計分析P=0.0008。暴露於膠原蛋白酶/分散酶使得自Cultispher及經交聯之明膠珠粒二者釋放不同量之可溶性蛋白質。對於明膠珠粒，該等活體外降解速率與用於交聯之EDC濃度良好相關。暴露於膠原蛋白酶/分散酶混合物1h之後經交聯之明膠珠粒之降解速率與EDC交聯劑之濃度大致成正比。結果顯示，與吾人之假設一致，具有最高交聯度之樣品對酶降解之易感性最低且消化速率與反應中所用之EDC濃度良好相關(R2=0.97)(第14 A-B圖)。結果暗示經交聯之珠粒之活體內滯留時間將與交聯之程度相關。
實例3-細胞化之經交聯之珠粒之驗證
在生物材料直接微注射入健康成年大鼠之腎中之後於活體外及活體內評估經交聯之珠粒之生物降解性。為測 定經交聯之珠粒之細胞相容性，於經交聯之珠粒上於動態條件下培養原代大鼠腎細胞。24小時後，測定珠粒之細胞活力。未交聯之珠粒係未包含於本測定中，因為其於培養條件下(37℃之溫度)液化。
方法
選定腎細胞(SRC)之製備。用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗滌切片並切碎，稱重，於包括4單位之分散酶1於HBSS中、含5mM CaCl2之300單位/ml膠原蛋白酶IV型之緩衝液中分解(dissociated)。所得之細胞懸浮液用含有5%(v/v)FBS之高葡萄糖(4.5g/L)DMEM：KSFM之1：1混合物洗滌，之後再懸浮於含有5%(v/v)FBS之高葡萄糖(4.5g/L)DMEM：KSFM之1：1混合物、2.5μg人重組表皮生長因子1-53(rEGF 1-53)、25mg牛垂體萃取物(BPE)、1X ITS(胰島素/轉鐵蛋白/硒)，及1X抗生素/抗黴菌劑以供接種。於37℃/5% CO2執行孵育。使細胞脫離用於以含EDTA之0.25%胰蛋白酶之傳代。經由台盼藍拒染法(Trypan Blue exclusion)評估活力且使用血球計數器手動執行計數。
於培養後分離之前，將培養物自近大氣氧條件(16-21%)轉移至更生理上相關之低氧(2%)環境隔夜。使細胞脫離用於以含EDTA之0.25%胰蛋白酶之收集。經由台盼藍拒染法評估活力且使用血球計數器手動執行計數。將細胞懸浮液製備為60-75 x 106細胞於2mL未經補充之KSFM(uKSFM)中，且以兩步式碘克沙醇(OptiPrep®；60% w/v於uKSFM中)密度梯度(16%,7%)於 15mL錐形聚丙烯管中藉由室溫以800xg離心20分鐘(無刹車(brake))加以分離。收集處於16%與7%碘克沙醇層之間介面之細胞譜帶且於調配之前於無菌生理鹽水中洗滌三次。
調配。成譜帶(banding)後，使選定腎細胞(SRC)成團，計數，於生理鹽水中洗滌，最後於明膠中洗滌。最終離心後，移除明膠溶液上清液，添加含有100uM trolox等效物之足夠體積之0.75%明膠至目標體積/細胞濃度。
或者，首先將SRC接種於經交聯之珠粒上，其比率為2.5 x 106細胞/35μl珠粒(堆積體積(packed volume))，於37℃/5% CO2，以1.5ml基礎培養基/百萬細胞，於設定為1rpm之旋轉裝置中之管中孵育隔夜。基礎培養基係由DMEM-HG(Invitrogen)與角質細胞-SFM(Invitrogen)以1：1體積比率混合而組成。隨後藉由離心使該等經細胞接種之珠粒輕柔成團，移除上清液，接著藉由再懸浮於PBS中之10%明膠溶液中進一步調配。10%明膠於環境溫度下係為凝膠，而於37℃為液體。明膠：珠粒比率以體積計係為1：5。
細胞相容性。24小時後藉由使用LIVE/DEAD®細胞活力/細胞毒性套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)，測定經調配之細胞之活力。
生物材料之活體內植入及評價。經交聯之珠粒係以細胞接種且如上文所述加以調配。所有實驗程序係於卡羅來納州醫學中心(Carolinas Medical Center)之PHS及 IACUC準則下進行。於異氟烷麻醉下，磁性Lewis大鼠經歷正中切口，且暴露左腎。藉由微注射將經調配之生物材料(35μl)引入腎實質中(Basu supra 2011)。注射後1或4周犧牲大鼠。無早期死亡發生。
統計分析。對於大小分佈概況，利用兩參數Weibull方程擬合珠粒直徑值。對於胺量化及酶消化資料，將值與單因素變異數分析(single-factor ANOVA)比較。
結果
如所預期，珠粒支撐高細胞黏附及活力(第15圖)。藉由於動態條件下孵育24h後，於經25mM EDC交聯之經交聯明膠珠粒上之原代大鼠腎細胞之LIVE/DEAD®染色，來評估經交聯之珠粒之細胞相容性。選擇經25mM EDC交聯之珠粒上經染色之大鼠腎細胞之影像作為該系列之代表。藉由顯微鏡評估，發現細胞黏附及活力皆與先前發表之關於經EDC交聯之生物材料之細胞相容性之資料相一致(Lai等人supra 2010；Lv等人J Biomed Mater Res A 2008；84：198-207)。
為進一步驗證吾人之活體外觀測結果，將代表性細胞化之經交聯珠粒(25、50及100mM EDC)原位注射入磁性Lewis大鼠腎，於1周及4周後進行組織學評價。1周後，對於經交聯材料之所有注射位點皆藉由增加之多細胞反應(hypercellular response)表徵，該增加之多細胞反應主要係由慢性發炎性滲出物(infiltrate)(巨噬細胞、漿細胞、淋巴細胞及巨細胞)且伴隨以局灶性、輕度腎小管擴 張/萎縮及輕度致纖維化反應(fibrogenic reaction)組成。總體而言，於該時間點，注意到生物材料之中度(moderate)降解，及適度之(modest)組織長入及血管生成(neovascularization)。重要地，於注射後1周，所觀測之降解樣式已表現出與活體外資料所顯示之趨勢良好相關。
該等生物材料於齧齒動物中之活體內表現之評估(腎注射)確認，珠粒係為生物相容性且能夠賦予其中細胞可於生理學上起作用之細胞相容性利基(第17圖)。另外，經交聯之珠粒之可調諧的降解樣式係與吾人之活體外觀測結果相關(第18圖)。第18圖及第19圖描繪明膠珠粒且其上接種以大鼠細胞之組織學影像。組織學載片係經梅生三色劑(其將膠原蛋白染色藍色)或蘇木紫-伊紅染色。針對正向指標(組織長入、1月時最少至無可偵測之生物材料及健康組織)及負向指標(巨噬細胞、巨細胞及其他發炎細胞之存在；支持纖維化囊形成之生物材料持久性，及集合管大小之增加)，進行影像之評價。該等影像顯示穩固的至生物材料中之組織長入，且伴隨極少之發炎反應及輕度之纖維化囊形成。此外，相關於植入物形成充分血管化之組織。
第18圖顯示腎切片之組織學評價，其顯示注射後1周時經交聯之明膠珠粒的降解。白色箭頭指示於經H&E及三色劑染色之切片中之經交聯之珠粒。三色劑染色明膠藍色且允許珠粒(白色箭頭)及由珠粒降解所產生之明膠跡 線(黑色箭頭)之視覺化(所有影像之尺規為200μm)。4周時，所有注射位點顯示中度之纖維細胞反應及慢性間質發炎(單核細胞)。
第19圖顯示腎切片之組織學評價，其顯示注射後4周時經交聯之明膠珠粒的降解。白色箭頭指示於經H&E及三色劑染色之切片中之經交聯之珠粒。三色劑染色明膠藍色且允許珠粒(白色箭頭)及由珠粒降解所產生之明膠跡線(黑色箭頭)之視覺化(所有影像之尺規為200μm)。生物材料之降解係自中度(經100mM EDC交聯)至明顯(經25mM EDC交聯)分級(第19圖，珠粒由白色箭頭指示；黑色箭頭指示降解之材料)。對於經25mM EDC交聯之珠粒，存在極少之殘留生物材料(珠粒)，圍繞以輕度慢性發炎(巨噬細胞及巨細胞)，且具中度至明顯之組織長入及中度之血管生成。對於經50mM EDC交聯之珠粒注意到中度至顯著之降解，而100mM EDC之對應物表現為部分(輕度)降解之無定形珠粒聚集體，圍繞以中度慢性發炎，其主要由巨噬細胞及巨細胞，及一些漿細胞與淋巴細胞組成。另，對於本實例，注意到在週邊中度至明顯之纖維細胞反應且伴隨足夠之組織/細胞長入。總體而言，對於兩個時間點之組織學觀測結果係與活體外測試中觀測之降解樣式相一致。此外，經差異性交聯之珠粒於活體內良好耐受，不會誘導生物材料之纖維化包囊之形成，且良好整合於周圍組織中。
合成時利用用於交聯之ECD之濃度可控制基於明膠之 珠粒之活體外酶降解速率。本文中呈現之製作方法可代表使用當前於臨床產品之生產中所使用之試劑，產生具有可調諧之酶易感性之生物降解性支架之更簡單直接且成本有效之方法。可調諧之活體外降解至可調諧之活體內降解之轉化處於積極研究中且有可能代表一種用於產生生物材料之適用平臺技術，其中空間及結構特性之時間持久性可針對所再生之器官及/或組織之特定需要得以優化。
對生物材料之物化及生物特性之控制對於任何組織工程應用之成功皆具重要性。於吾人之情況下，對於具有特定活體內滯留時間且將活細胞遞送至所需位點之生物材料而言，一個要求係為提供空間以用於自細胞浸潤及增殖之再生性變化，接著逐步再吸收，同時允許細胞適應新環境條件並分化為適當之組織及器官。此處顯示藉由使用EDC(一種於經FDA批準之基於明膠蛋白之裝置之製造中廣泛採用之碳化二亞胺)及基於水之化學交聯方法，可獲得具有跨越較大範圍之生物降解速率之明膠珠粒。另外，該方法係為高度可再現的。總體而言，該途徑提供用於產生具有器官特異性生物降解速率之組織工程生物材料之有效且高效手段。
總體而言，吾人能夠製造對於各種分子可充當間隔體、細胞遞送系統或微載劑之基於明膠之微珠粒。該設計利用明膠之濃度依賴性熔融溫度且應用此特點來產生溫度響應性間隔珠粒。再者，藉由使用簡單的、充分表 徵之化學，該等珠粒可經定製以於活體內及活體外遵循所需之酶降解速率。先前報導之經類似交聯之系統不具有此處報導之物理特點，其使得吾人之系統更適用於微載劑或細胞遞送應用。
實例4-齧齒動物半腎切除術模型對由選定腎細胞及生物材料構成之新腎加強原型之植入之生物反應
為解決用以恢復腎功能之新治療之需要，已開發一種獨特的整合性再生醫學技術平臺，其能夠催化組織及器官之再生。
由生物材料及選定再生腎細胞(SRC)構成的新腎加強(Neo-Kidney Augment；NKA)產物原型係為能夠促進腎組織之再生之該種平臺。自腎切片之酶消化及細胞之密度梯度分離獲得SRC。基於明膠之水凝膠(Gelatin based hydrogel；GBH)用作生物材料。哺乳動物腎對NKA原型之植入之生物反應先前已於健康成體齧齒動物中評價(Basu等人，2011,Cell Transplantation，出版中)。然，自齧齒動物之單個腎之摘除(半腎切除術)增加模型之敏感性，從而允許全身性作用之毒理效應之偵測。本研究中，15只經半腎切除術之齧齒動物於剩餘腎之腎實質內注射NKA原型，且針對關鍵腎生理指標加以評價。
方法
藉由如表1中所示組合選定腎細胞與生物材料，製得新腎加強原型。細胞/生物材料構築體係如第20圖中所示(用於NKA構築體之創建之策略概要)製備。
明膠溶液之製備：
計算製備0.75%或1.0% w/v明膠/100μM trolox等效物溶液所需要的粉末狀明膠及trolox等效物/PBS之量。將PBS置於具有磁力攪拌棒之燒杯中且於設定為50℃之電磁攪拌加熱器(stirring hot plate)上加熱15分鐘。緩慢添加明膠，使混合物於50℃攪拌1小時。使用預熱之無菌篩檢程序總成過濾所得之明膠溶液。接著將無菌明膠溶液等分為較小體積(10ml於15ml管中)並儲存於4℃直至使用。
較佳之方法係為於PBS中製備0.76%或1.01%明膠溶液，接著在與SRC混合時添加足夠體積之100X(10mM)trolox等效物以產生所需之0.75%(或1.0%)明膠/100μM trolox等效物溶液。
結果：
第21A-C圖顯示選定齧齒動物再生腎細胞生物材料構築體之代表性活/死染色。構築體係經由18號針遞送至經半腎切除術之Lewis大鼠(2月齡)之剩餘腎。植入之前或植入後4周之時間點評價來源於全血、血清及尿液化學之生理指標。注射後4周犧牲動物，對剩餘腎進行組織學檢 查以求發炎性或纖維化生物反應之證據。
NKA原型之植入未顯著影響關鍵腎生理指標，且呈現發炎性、壞死性或纖維化生物反應之極少證據。因此，基於GBH中之SRC之NKA原型在齧齒動物半腎切除術模型中由剩餘腎所良好耐受。
第22圖顯示植入後4周按組別之體重(A)、血尿素氮水準(B)及血清肌酐水準(C)之變化之總結(ANOVA分析)-A：按組識別字之體重變數之單因素分析；B：按組識別字之sBUN變數之單因素分析(BUN：血尿素氮)；C：按組識別字之Scre變數之單因素分析(Scre：血清肌酐)。
第23圖顯示植入後4周按組別之尿蛋白質/肌酐(A)及尿蛋白質(B)之變化之總結(ANOVA分析)-A：按組識別字之UPC變數之單因素分析(UPC：尿蛋白質/肌酐)；B：按組識別字之Uprotein變數之單因素分析(Uprotein：尿蛋白質)。
第24圖顯示植入後4周按組別之比重(A)及尿肌酐(B)之變化之總結(ANOVA分析)-A：按組識別字之比重變數之單因素分析；B：按組識別字之Ucre變數之單因素分析(Ucre：尿肌酐)。總體而言，細胞/生物材料構築體於半腎切除術齧齒動物模型內之引入經一個月之時間段，相較於SRC，未影響腎生理學之關鍵指標。
細胞/生物材料構築體於半腎切除術齧齒動物模型內之引入亦未顯著影響剩餘腎之組織學。
第25圖顯示4周後經半腎切除術之大鼠；腎外髓(內帶)；HE，x400。批次A(第25圖之上排)，由固縮核(piknotic nuclei)表徵之腎小管壞死(批次1中所述)亦於大鼠編號(HN-16及HN-18)中觀測到，而於HN-7及HN-10中未觀測到，其表明腎實質內無顯著損傷。批次B(第25圖之底排)；於外髓之內帶中顯示固縮核之極小、局灶性腎小管壞死於一隻大鼠中觀測到(HN11)，而於其餘動物中(HN-12、HN-13及HN-14)未觀測到，且因此視為在正常限度內。
總之，選定腎細胞/生物材料新腎加強原型於齧齒動物半腎切除術模型中之植入未影響剩餘腎之生理學或組織學。
實例5-生物反應性腎細胞之分離與表徵
一例成年雄性豬(Sus scrofa)中之特發性進行性慢性腎病(CKD)伴貧血症提供新鮮之患病腎組織以用於細胞組成之評估及利用與年齡匹配之正常豬腎組織之直接比較之表徵。於收集之時腎組織之組織學檢查確認由嚴重之彌漫性慢性間質纖維化及半月狀腎絲球腎炎伴多病灶性纖維化所表徵之腎病。臨床化學確認氮血症(azotemia)(血尿素氮及血清肌酐之升高)及輕度貧血症(血容比之輕度降低及削弱之血紅素水準)。自患病及正常之腎組織分離細胞、擴增及表徵。Presnell等人之WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之 第1圖中所示，Gomori氏三色劑染色突出患病之腎組織中相較於正常腎組織之纖維化(由箭頭指示之藍色染色)。自正常及患病之腎組織繁殖功能性腎小管細胞，該等細胞表現cubulin：megalin且能夠進行受體介導之白蛋白轉運。表現紅血球生成素(EPO)之細胞亦存在於培養物中且經由多次傳代及冷凍/解凍迴圈而保留。此外，分子分析確認，來自正常及患病組織之表現EPO之細胞響應於活體外利用以HIF1α驅動之EPO及其他低氧調節基因目標(包含vEGF)之誘導之低氧條件。經由以膠原蛋白酶+分散酶之酶消化自豬腎組織分離細胞，且亦於單獨實驗中藉由執行簡單之機械消化及外植體培養進行分離。在第二代，使含有表現epo之細胞之外植體源性細胞培養物經受大氣(21%)及不同之低氧(<5%)培養條件以確定對低氧之暴露導致EPO基因表現之上調。如利用齧齒動物培養物時所注意到的(見實例3)，正常豬展現EPO基因之氧依賴性表現及調節。意外地，雖然CKD豬處於尿毒癥/貧血症狀態(血容比<34，肌酐>9.0)，但容易自組織分離及繁殖表現EPO之細胞且EPO基因之表現仍為低氧調節性，如Presnell等人之WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第2圖中所示。如Presnell等人之WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第3圖中所示，經繁殖之培養物中之細胞展示自組織為腎小管樣(tubule-like)結構之能力。如Presnell等人之 WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第4圖中所示，藉由觀測經培養之細胞對經FITC共軛之白蛋白之由受體介導之攝取，確認培養物中(第3代)功能性腎小管細胞之存在。綠點(由白色細箭頭指示)代表經胞飲之螢光素共軛之白蛋白，係由腎小管細胞特異性受體Megalin及Cubilin所介導，其表明功能性腎小管細胞對蛋白質之再吸收。藍色染色(由白色粗箭頭指示)係為Hoescht染色之核。總之，該等資料暗示可自豬腎組織分離及繁殖功能性腎小管及內分泌細胞，即使於因CKD而嚴重受損之腎組織中。此外，該等發現支持基於同種自體性細胞之治療產物用於治療CKD之進展。
此外，用酶法自正常成年人腎分離產生EPO之細胞(如上文實例1中所述)。如Presnell等人之WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第5圖中所示，分離程序導致分離後與初始組織中相比更相關之(more relative)EPO表現。如Presnell等人之WO/2010/056328其整個內容以引用之方式併入本文)之第6圖中所示，有可能在保留EPO基因表現之情況下保持人產生EPO之細胞於培養物中。於單純的(plain)經組織培養物處理之塑膠或已塗佈一些細胞外基質(諸如例如纖連蛋白或膠原蛋白)之塑膠上培養/繁殖人細胞，發現皆隨時間支持EPO表現。
實例6-特定生物反應性腎細胞之分離與富集
腎細胞之分離：簡言之，自商業供應商(Hilltop Lab Animals Inc.)獲得成批之10個、2周齡雄性Lewis大鼠腎，於Viaspan保存培養基中於大致4℃之溫度下運送隔夜。本文中所述之所有步驟係於生物安全櫥(BSC)中執行以保存無菌性。腎於Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中洗滌3次以洗掉Viaspan保存培養基。第三次洗滌之後，移除剩餘之腎囊以及任何剩餘之基質組織(stromal tissue)。亦使用顯微解剖技術移除腎大盞。接著使用無菌解剖刀將腎切碎成漿料。接著將漿料轉移至50ml錐形離心管，稱重。為RNA收集較小樣品，置於無RNAse之無菌性1.5ml微離心管中，於液氮中速凍。一旦冷凍，則將其轉移至-80度冷凍機直至分析。10個幼體腎之組織重量近似等於1公克。基於批次之重量，調整消化培養基以遞送每1公克組織20ml消化培養基。用於此程序之消化緩衝液含有4單位之分散酶(Stem Cell Tech)於HBSS中、含5mM CaCl2(Sigma)之300單位/ml之膠原蛋白酶IV型(Worthington)。
向管中添加適當體積之經預熱之消化緩衝液，接著將管密封，置於37℃孵育箱中之搖擺器上歷時20分鐘。該第一消化步驟移除許多紅血球且增強剩餘組織之消化。20分鐘後，移出管且置於BSC中。使組織沈降於管之底部，接著移除上清液。接著向剩餘組織補充等於起始體 積之新鮮消化緩衝液。再次將管置於37℃孵育箱中之搖擺器上歷時額外30分鐘。
30分鐘後，將消化混合物經由70μm細胞篩子(BD Falcon)移送至等體積之中和緩衝液(DMEM w/10% FBS)以停止消化反應。接著藉由以300xg離心5分鐘洗滌細胞懸浮液。離心後，接著將團塊再懸浮於20ml KSFM培養基中，獲得樣品以用於細胞計數，且使用台盼藍拒染法評估活力。一旦細胞計數經計算，則為RNA收集1百萬細胞，於PBS中洗滌，於液氮中速凍。剩餘細胞懸浮液利用KSFM培養基達到50ml，再次藉由以300xg離心5分鐘進行洗滌。洗滌後，將細胞團塊再懸浮於每ml of KSFM 15百萬細胞之濃度中。
接著將5毫升腎細胞懸浮液添加至於15ml錐形離心管(BD Falcon)中之5ml 30%(w/v)Optiprep®，藉由倒轉6次進行混合。此舉形成15%(w/v)Optiprep®之終混合物。倒轉後，用1mL PBS使管小心分層。以800 x g將管離心15分鐘，無刹車。離心後，移出管，於混合梯度之頂上形成細胞譜帶。亦存在團塊含有紅血球、死細胞及一小群活細胞，該等活細胞包含一些小的低細微性細胞、一些產生epo之細胞，一些腎小管細胞及一些內皮細胞。使用吸管小心移除譜帶且轉移至另一15ml錐形管。藉由抽吸移除梯度培養基，藉由再懸浮於1ml KSFM中收集團塊。接著再合併譜帶細胞及團塊細胞，再懸浮於使用 KSFM之所收集譜帶體積之至少3倍稀釋液中，藉由以300xg離心5分鐘進行洗滌。洗滌後，將細胞再懸浮於20ml KSFM中，收集樣品用於細胞計數。一旦使用台盼藍拒染法計算細胞計數，則為RNA樣品收集1百萬細胞，於PBS中洗滌，於液氮中速凍。
預培養 使用密度梯度分離法「淨化」以增強特定生物活性腎細胞之活力及培養表現 為得到乾淨之成活之細胞群供培養，首先如上文於「腎細胞之分離」中所述產生細胞懸浮液。作為視情況選用之步驟且作為淨化初始製備物之手段，將懸浮於無菌等張緩衝液中之多達100百萬總細胞與等體積之30% Optiprep® 1：1徹底混合，該Optiprep®係於室溫由原液60%(w/v)碘克沙醇(因此得到最終15% w/v Optiprep溶液)製備，且藉由倒轉6次徹底混合。混合後，1ml PBS緩衝液於經混合之細胞懸浮液頂上小心分層。接著將梯度管小心載入至離心機中，確保適當平衡。於25℃以800 x g將梯度管離心15分鐘，無刹車。經淨化之細胞群(含有成活之功能性集合管、腎小管、內分泌、腎絲球及血管細胞)於6%與8%(w/v)Optiprep®之間分割，對應於1.025-1.045g/mL之間的密度。其他細胞及碎片成團至管之底部。
腎細胞之培養：接著將合併之細胞譜帶及團塊接種於經組織培養物處理之三角培養瓶(Nunc T500)或等效物中，細胞濃度為30,000細胞/cm2，於150ml DMEM(高葡 萄糖)/KSFM之50：50混合物中，其含有5%(v/v)FBS、2.5μg EGF、25mg BPE、1X ITS(胰島素/轉鐵蛋白/亞硒酸鈉培養基添加劑)，及抗生素/抗黴菌劑。將細胞於加濕之5% CO2孵育箱中培養2-3天，為細胞提供21%之大氣氧水準。兩天后，更換培養基，將培養物置於由CO2/氮氣多氣體加濕孵育箱(Sanyo)提供之2%氧水準之環境中歷時24小時。24小時孵育後，用60ml 1XPBS洗滌細胞，接著使用40ml 0.25%(w/v)胰蛋白酶/EDTA(Gibco)移除。一經移除，即利用含10% FBS之等體積之KSFM中和細胞懸浮液。接著藉由以300xg離心10分鐘洗滌細胞。洗滌後，將細胞再懸浮於20ml KSFM中且轉移至50ml錐形管，收集樣品用於細胞計數。一旦使用台盼藍拒染法確定活細胞計數，則為RNA樣品收集1百萬細胞，於PBS中洗滌，於液氮中速凍。再次於PBS中洗滌細胞，藉由以300xg離心5分鐘收集。將經洗滌之細胞團塊以37.5百萬細胞/ml之濃度再懸浮於KSFM中。
使用密度分級梯度分離法針對特定生物活性腎細胞富集：使用由多濃度w/v碘克沙醇(Optiprep)製成之密度分級梯度，將經培養之腎細胞分成其組成亞群，該等經培養之腎細胞係主要由腎小管細胞組成，但含有其他細胞類型(集合管、腎絲球、血管及內分泌)之較小亞群。於收集及施加至梯度之前，將培養物置於低氧環境中長達24小時。分級之梯度如下產生：於無菌15mL錐形管中使 四種不同密度培養基彼此上下分層、將具有最高密度之溶液置於底部，且於頂部分層至密度最小之溶液。將細胞施加至分級梯度之頂部且離心，其導致群體基於大小及細微性分隔為多個譜帶。
簡言之，使用KFSM培養基作為稀釋劑，製得7%、11%、13%及16% Optiprep®(60% w/v碘克沙醇)之密度。舉例而言：對於50ml 7%(w/v)Optiprep®，將5.83ml原料60%(w/v)碘克沙醇添加至44.17ml KSFM培養基，且藉由倒轉充分混合。將載入有無菌L/S 16Tygon管材連接至無菌毛細管之蠕動幫浦(Master Flex L/S)設定至每分鐘2ml之流速，且將四種溶液中每一者之2ml載入至無菌錐形15mL管中，以16%溶液開始，接著為13%溶液、11%溶液及7%溶液。最後，於分級梯度之頂上載入含有75百萬經培養之齧齒動物腎細胞之2mL細胞懸浮液(懸浮液已如上文於「腎細胞之培養」中所述產生)。重要地，當啟動幫浦以將梯度溶液遞送至管時，小心地使流體以45°角沿管之側面緩慢留下以確保梯度之每層之間形成恰當之介面。接著以800 x g離心載入有細胞之分級梯度歷時20分鐘，無刹車。離心後，小心移除管以致不會干擾每一介面。產生五個明顯不同之細胞餾分(4譜帶及1團塊)(B1-B4，+團塊)(見第26圖，左邊錐形管)。使用無菌拋棄式球吸管或5ml吸管收集每一餾分，且在表型上及功能上進行表徵(見Presnell等人之WO/2010/056328之實例 10)。使齧齒動物腎細胞懸浮液於分離後立即經受分級梯度分餾時，針對腎小管細胞富集之餾分(且含有來自集合管之一些細胞)分割至1.062-1.088g/mL之間的密度。相比而言，於離體(ex vivo)培養後執行密度梯度分離時，針對腎小管細胞富集之餾分(且含有來自集合管之一些細胞)分割至1.051-1.062g/mL之間的密度。類似地，使齧齒動物腎細胞懸浮液於分離後立即經受分級梯度分餾時，針對產生epo之細胞、腎絲球足細胞及血管細胞富集之餾分(「B4」)於1.025-1.035g/mL之間的密度分隔。相比而言，於離體培養後執行密度梯度分離時，針對產生epo之細胞、腎絲球足細胞及血管細胞富集之餾分(「B4」)於1.073-1.091g/mL之間的密度分隔。重要地，細胞於「B2」及「B4」餾分中之培養後分佈係藉由在收集及分級梯度程序之前使培養物暴露(歷時約1小時至約24小時之時期)於低氧培養環境(低氧經定義為<21%(大氣)氧水準)而得到增強(關於低氧對譜帶分佈之影響之額外細節係提供於實例7中)。
藉由以3倍體積之KSFM稀釋來洗滌每一譜帶，充分混合，且以300 x g離心5分鐘。將團塊再懸浮於2ml KSFM中，使用台盼藍拒染法及血球計數器對活細胞計數。為RNA樣品收集1百萬細胞，於PBS中洗滌，於液氮中速凍。將來自B2及B4之細胞用於至尿毒癥及貧血症磁性大鼠中之植入研究，該等大鼠係經由兩步式5/6腎切除術程序 於Charles River Laboratories產生。B4之特性係藉由定量即時PCR確認，包含氧調節之紅血球生成素及VEGF之表現、腎絲球標誌物(nephrin、podocin)之表現，及血管標誌物(PECAM)之表現。「B2」餾分之表型係經由E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白及水通道蛋白-2之表現確認。見Presnell等人WO/2010/056328之第49a及49b圖。
因此，分級梯度策略之使用不僅允許對於產生epo之細胞之稀少群體(rare population)之富集(B4)，而且亦為產生功能性腎小管細胞之相對富集餾分(B2)之手段(見Presnell等人WO/2010/056328之第50及51圖)。分級梯度策略亦允許產生EPO之細胞及腎小管細胞與紅血球、細胞碎片及其他可能非所需之細胞類型(諸如大細胞聚集體及某些類型之免疫細胞)分離。
分級梯度程序可能要求關於為提供細胞組分之良好分離所採用之比密度進行調諧。調諧梯度之較佳途徑涉及1)運轉連續密度梯度，其中自梯度底部之高密度(例如16-21% Optiprep)至梯度頂部之相對低密度(例如5-10%。連續梯度可利用任何標準密度梯度溶液(Ficoll、Percoll、蔗糖、碘克沙醇)根據標準方法(Axis Shield)製備。將相關之細胞載入至連續梯度上，以800xG離心20分鐘，無刹車。類似大小及細微性之細胞往往一起於梯度中分隔，使得可量測梯度中之相對位置，且亦可量測該位置上溶液之比重。因此，隨後可匯出經定義之分級 梯度，其集中於基於在特定條件下橫跨密度梯度之能力對特定細胞群之分離。在自非健康與健康組織分離細胞時，或者在自不同物種分離特定細胞時，可能需要採用該優化。舉例而言，對犬科動物及人腎細胞培養物執行優化，以確保於大鼠中識別之特定B2及B4亞群可自其他物種分離。用於齧齒動物B2及B4亞群之分離之最佳梯度係由(w/v)7%、11%、13%及16% Optiprep組成。用於犬科動物B2及B4亞群之分離之最佳梯度係由(w/v)7%、10%、11%及16% Optiprep組成。用於人B2及B4亞群之分離之最佳梯度係由(w/v)7%、9%、11%及16%組成。因此，表2中提供用於自經培養之齧齒動物、犬科動物及人腎細胞之B2及B4之定位之密度範圍。
實例7-於梯度之前較低氧之培養影響譜帶分佈、組成及基因表現
為測定氧條件對原型B2及B4之分佈及組成之影響，使來自不同物種之新腎細胞製備物於梯度步驟之前暴露於不同氧條件。使用用於大鼠細胞分離及培養起始之標準程序，如前文所述，建立齧齒動物新腎加強(NKA)細胞製備物(RK069)。所有培養瓶於21%(大氣)氧條件中培養 2-3天。更換培養基，接著將一半培養瓶重新安置於設定為2%氧之控氧孵育箱，而剩餘培養瓶保存於21%氧條件，另歷時24小時。接著使用前文所述之標準酶法收集程序，自每一組條件收集細胞。根據標準程序製備分級梯度，單獨收集「常氧」(21%氧)及「低氧」(2%氧)培養物且並排施加至完全相同的分級梯度。(第27圖)。雖然於兩種條件中產生4個譜帶及1個團塊，但細胞於整個梯度中之分佈於21%及2%氧培養之批次中有所不同(表3)。特定言之，B2之產量隨低氧而增加，同時伴隨B3之減少。此外，B4特異性基因(諸如紅血球生成素)之表現於由低氧培養之細胞所產生之所得梯度中經增強(Presnell等人WO/2010/056328之第73圖)。
使用用於狗細胞分離及培養之標準程序(類似於齧齒動物分離及培養程序)，如前文所述，建立犬科動物NKA細胞製備物(DK008)。所有培養瓶於21%(大氣)氧條件中培養4天，接著將一小組培養瓶轉移至低氧(2%)歷時24小時，而一小組培養瓶保持在21%。隨後，收集每一組燒瓶並使其經受完全相同的分級梯度(第28圖)。類似於大鼠結果(實例6)，低氧培養之狗細胞於整個梯度中之分佈係不同於大氣氧培養之狗細胞(表3)。再次，B2之產量隨梯度之前的低氧暴露而增加，以及伴隨於B3中之分佈之減少。
以上資料顯示梯度之前對低氧之暴露增強B2之組成以及特定專化細胞(產生紅血球生成素之細胞、血管細胞及腎絲球細胞)於B4中之分佈。因此，低氧培養，接著如前文所述之密度梯度分離，係為跨物種產生「B2」及「B4」細胞群之有效方式。
實例8-腎小管/腎絲球細胞自人腎之分離
藉由通篇描述之酶分離方法自正常人腎組織分離及繁殖腎小管及腎絲球細胞。藉由上文所述之梯度方法，離體且於培養後富集腎小管細胞餾分。如Presnell等人WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第68圖所示，表型屬性於分離及繁殖中得到保持。腎小管功能經由經標記之白蛋白之攝取評估，於重複之傳代及超低溫保存(cryopreservation)之後亦得以保留。Presnell等人WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第69圖顯示，當於三維動態培養中培養腎小管富集及腎小管耗減之群時，腎小管富集之群中表現腎小管標誌物鈣黏蛋白之表現之明顯增加。此確認於三維動態環境中培養細胞時，腎小管細胞之富集可維持於初始富集之外。使實例7中上文描述之腎細胞之相同培養 群經受流式細胞術分析以檢測前向散射光及側向散射光。較小、低細微性的產生EPO之細胞群係可分辨(8.15%)，且經由較小、低細微性群之正選擇，使用流式細胞儀之分選能力分離(見Presnell等人WO/2010/056328(其整個內容以引用之方式併入本文)之第70圖))。
實例9-由自體免疫性腎絲球腎炎患者樣品分離之腎細胞之未分化混合物之表徵
如上文所述，由自體免疫性腎絲球腎炎患者樣品分離腎細胞之未分化混合物。為測定自腎組織分離及擴增之腎細胞特定亞群之無偏見之基因型組成，採用定量即時PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等人，supra 2008)以識別細胞次餾分之間的差異性細胞類型特異性及途徑特異性基因表現樣式。如Ilagan等人之PCT/US2011/036347之表6.1所示，HK20係為自體免疫性腎絲球腎炎患者樣品。如Ilagan等人之PCT/US2011/036347之表6.2所示，自HK20產生之細胞缺少腎絲球細胞，如藉由qRTPCR所測定。
實例10-自一例局部節段性腎絲球硬化症分離之治療相關性腎生物活性細胞群之基因剖析
為測定自腎組織分離及擴增之腎細胞特定亞群之無偏見之基因型組成，採用定量即時PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等人，supra 2008)以識別細胞次餾分之間的差異性細胞類型特異性及途徑特異性基因表現樣式。評價 人製備物HK023於收集之時B4餾分中腎絲球細胞之存在，該人製備物HK023係來源於一例局部節段性腎絲球硬化症(FSGS)，其中較大部分之腎絲球受到破壞。簡言之，自使用標準切片程序由腎取得之(4)核心切片之每一者獨立產生(Aboushwareb等人，supra 2008)且維持未分餾之(UNFX)培養物。於離體UNFX之(2)傳代後，收集細胞，使其經受密度梯度方法(如實例6中)以產生次餾分，包含次餾分B4，其已知係基於齧齒動物、狗及其他人試樣中執行之工作，針對內分泌、血管及腎絲球細胞而富集。
自HK023之每一獨立UNFX樣品單獨收集B4餾分，其呈現為具有1.063-1.091g/mL之間的浮力密度之細胞之明顯不同之譜帶。自每一樣品分離RNA，藉由定量即時PCR檢測Podocin(腎絲球細胞標誌物)及PECAM(內皮細胞標誌物)之表現。如自一例嚴重FSGS由切片產生之樣品所預期，B4餾分中podocin(+)腎絲球細胞之存在於2/4之樣品中podocin不可偵測係為不一致。相比而言，PECAM+血管細胞係一致地存在於4/4之切片起動培養物之B4餾分中。因此，B4餾分可以1.063-1.091g/mL之密度範圍分離，甚至自具有嚴重疾病狀態之人腎中。
此外，如Ilagan等人PCT/US2011/036347之表7.2中所示，人樣品(HK018)展示密度梯度分離後藉由qRTPCR未偵測到之Podocin(腎絲球標誌物)。
實例11-使用螢光啟動之細胞分選法(FACS)對活腎細胞類型之富集/耗減
可使用螢光啟動之細胞分選法(FACS)自分離之原代腎組織富集一或多種分離之腎細胞，及/或耗減一或多種特定腎細胞類型。
試劑：70%乙醇；洗滌緩衝液(PBS)；50：50腎細胞培養基(50% DMEM高葡萄糖)：50%角質細胞-SFM；台盼藍0.4%；對於腎內皮細胞靶向諸如CD31及對於腎腎絲球細胞靶向諸如Nephrin之腎細胞群之初級抗體。匹配之同種型(isotype)特異性螢光二級抗體；染色緩衝液(0.05% BSA於PBS中)。
程序：在用於清洗生物安全櫥(BSC)之標準程序之後，可自T500 T/C處理之培養瓶獲得來自初級分離或經培養之細胞之腎細胞之單一細胞懸浮液，再懸浮於腎細胞培養基中，置於冰上。接著使用台盼藍拒染法測定細胞計 數及活力。對於自異質性群之(例如)腎絲球細胞或內皮細胞之腎細胞富集/耗減，獲得具有至少70%之活力之10與50e6之間的活細胞。接著用特異於目標細胞類型之初級抗體對異質性腎細胞群染色，起始濃度為1μg/0.1ml染色緩衝液/1 x 106細胞(需要時滴定)。目標抗體可經共軛諸如CD31 PE(特異於腎內皮細胞)或未經共軛諸如Nephrin(特異於腎腎絲球細胞)
接著於水上或於避光之4℃對細胞染色30分鐘。孵育30分鐘後，藉由以300xg離心5分鐘洗滌細胞。接著將團塊再懸浮於PBS或染色緩衝液中，取決於是否需要經共軛之同種型特異性二級抗體。若細胞經螢光染料共軛之初級抗體標記，則將細胞再懸浮於2ml PBS每10e7細胞且繼續至FACS aria或等效之細胞分選儀。若細胞未經螢光染料共軛之抗體標記，則以同種型特異性螢光染料共軛之二級抗體對細胞加標記，起始濃度為1ug/0.1ml/1e6細胞。
接著於冰上或於避光之4℃對細胞染色30分鐘。孵育30分鐘後，藉由以300xg離心5分鐘洗滌細胞。離心後，將團塊以5e6/ml PBS之濃度再懸浮於PBS中，接著將4ml每12x75mm轉移至無菌管。
準備FACs Aria以按製造商之說明書(BD FACs Aria使用者手冊)用於活細胞無菌分選。將樣品管載入至FACs Aria中，擷取開始之後調整PMT電壓。拉下閘以採用特 定波長，使用螢光強度選擇腎特定細胞。拉下另一閘以選擇負性群。一旦拉下所需之閘以包囊正性目標群及負性群，則使用製造商之說明書對細胞分選。
正性目標群收集於一個15ml錐形管中，而負性群收集於裝有1ml腎細胞培養基之另一15ml錐形管中。收集後，藉由流式細胞術分析來自每一管之樣品以測定純度。藉由以300xg離心5分鐘洗滌所收集之細胞，將團塊再懸浮於腎細胞培養基鎮南關以用於進一步分析及實驗。
實例12-使用磁性細胞分選之腎細胞類型之富集/耗減
可自分離之原代腎組織富集一或多種分離之腎細胞，及/或耗減一或多種特定腎細胞類型。
試劑：70%乙醇，洗滌緩衝液(PBS)，50：50腎細胞培養基(50% DMEM高葡萄糖)：50%角質細胞-SFM，台盼藍0.4%，運轉緩衝液(Running Buffer)(PBS、2mM EDTA、0.5% BSA)、沖洗緩衝液(Rinsing Buffer)(PBS、2mM EDTA)、清洗溶液(70% v/v乙醇)、Miltenyi FCR阻斷試劑、Miltenyi微珠粒，特異於IgG同種型、目標抗體諸如CD31(PECAM)或Nephrin，或二級抗體。
程序：在用於清洗生物安全櫥(BSC)之標準程序之後，獲得來自初級分離或培養之腎細胞之單一細胞懸浮液，且再懸浮於腎細胞培養基中。接著使用台盼藍拒染法測定細胞計數及活力。對於自異質性群之(例如)腎絲球細 胞或內皮細胞之腎細胞富集/耗減，獲得具有至少70%之活力之至少10e6多達4e9活細胞。
基於相關之目標細胞測定用於富集/耗減方法之最佳分離。對於使用Nephrin抗體之小於10%(例如)腎絲球細胞之目標頻率之富集，使用Miltenyi autoMACS或等效之儀器程式POSSELDS(於敏感模式中之雙正性選擇)。對於大於10%之目標頻率之耗減，使用Miltenyi autoMACS或等效之儀器程式DEPLETES(於敏感性模式中之耗減)。
用目標特異性初級抗體，例如用於腎絲球細胞之Nephrin rb多株抗體，標記活細胞：添加1μg/10e6細胞/0.1ml PBS(含0.05% BSA)於15ml錐形離心管中，接著於4℃孵育15分鐘。
標記後，藉由添加1-2ml緩衝液/10e7細胞，接著以300xg離心5min，來洗滌細胞以移除非結合之初級抗體。洗滌後，添加同種型特異性二級抗體，諸如雞抗兔PE，以1ug/10e6/0.1ml PBS(含0.05% BSA)，接著於4℃孵育15分鐘。
孵育後，藉由添加1-2ml緩衝液/10e7細胞、接著於300xg離心5min，來洗滌細胞以移除非結合之二級抗體。移除上清液，將細胞團塊再懸浮於60μl緩衝液/10e7總細胞中，接著添加20μl FCR阻斷試劑/10e7總細胞，然後充分混合。
添加20μl直接MACS微珠粒(諸如抗-PE微珠粒)，混合，接著於4℃孵育15min。
孵育後，藉由添加10-20x標記體積之緩衝液，以300xg離心細胞懸浮液5min，且將細胞團塊再懸浮於500μl-2ml緩衝液/10e8細胞中，來洗滌細胞。
按照製造商之說明書，在使用autoMACS用於磁性細胞分離之準備中，清洗autoMACS系統並塗底漆。新的無菌收集管置於出口端下。選擇autoMACS細胞分離程式。對於選擇，選擇POSSELDS程式。對於耗減，選擇DEPLETES程式。
將經標記之細胞插入攝取端，接著開始程式。
在細胞選擇或耗減後，收集樣品，置於冰上直至使用。藉由流式細胞術驗證經耗減或選定之樣品之純度。
實例13-可自正常及慢性患病之腎組織分離及繁殖具有治療潛力之細胞
本研究之目的在於經由高內涵分析(high content analysis；HCA)確定人NKA細胞之功能性表徵。高內涵成像(HCI)使用跨許多樣品之兩種或兩種以上螢光探針(多重)，提供多亞細胞事件之同時成像。高內涵分析(HCA)提供於高內涵影像中所捕捉之多細胞參數之同時定量量測。簡言之，使用標準切片程序，由取自患有晚期慢性腎病(CKD)之五個人腎及三個非CKD人腎之核心切片，單獨產生未分餾之(UNFX)培養物(Aboushwareb等 人，supra 2008)且進行維持。離體UNFX之(2)傳代後，收集細胞，使其經受密度梯度方法(如實例2中)以產生次餾分，包含次餾分B2、B3及/或B4。
如Ilagan等人之PCT/US2011/036347之表10.1中所概述，自非CKD及CKD人供體取得人腎組織。Ilagan等人之PCT/US2011/036347之第4圖顯示HK17及HK19樣品之組織病理學特點。自所有非-CKD(3/3)及CKD(5/5)腎建立離體培養物。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第5圖(人NKA細胞中白蛋白轉運之HCA)中顯示定義相關區域(regions of interest；ROI)之人NKA中白蛋白轉運之高內涵分析(HCA)。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第6圖中顯示來源於非CKD及CKD腎之NKA細胞中白蛋白轉運之定量比較。如Ilagan等人PCT/US2011/036347之第6圖中顯示，於CKD源性NKA培養物中白蛋白轉運未受損。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第7圖(CK8/18/19)中顯示腎小管富集之B2與腎小管細胞耗減之B4次餾分之間標誌物表現之比較分析。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第8圖中顯示腎小管富集之B2與腎小管細胞耗減之B4次餾分之間白蛋白轉運之比較功能分析。次餾分B2於近端腎小管細胞中經富集且因此展現增加之白蛋白轉運功能。
白蛋白攝取：於24孔、膠原蛋白IV培養盤(BD BiocoatTM)中生長至匯合(confluency)之細胞之培養基係以含有 1X抗黴菌劑/抗生素及2mM麩醯胺酸之無酚紅、無血清、低葡萄糖DMEM(pr-/s-/lg DMEM)替換18-24小時。剛好於測定之前，洗滌細胞且利用pr-/s-/lg DMEM+10mM HEPES、2mM麩醯胺酸、1.8mM CaCl2及1mM MgCl2孵育30分鐘。使細胞暴露於25μg/mL羅丹明共軛之牛白蛋白(Invitrogen)30min，利用冰冷PBS洗滌以停止胞飲作用，立即用含有25μg/mL Hoechst核染料之2%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。對於抑制實驗，於白蛋白添加之前10分鐘，添加1μM受體結合蛋白質(receptor-associated protein；RAP)(Ray Biotech,Inc.,Norcross GA)。利用BD PathwayTM 855 High-Content BioImager(Becton Dickinson)執行顯微鏡成像及分析(見Kelley等人Am J Physiol Renal Physiol.2010 Nov；299(5)：F1026-39.Epub Sep 8,2010)。
總之，HCA產生細胞水準資料且可展現藉由其他測定(即基因或蛋白質表現)無法偵測之群動力學。可利用用於量測白蛋白轉運(HCA-AT)功能之可量化離體HCA測定來表徵作為人NKA原型之組分之人腎小管細胞。HCA-AT能夠進行細胞功能之比較評價，顯示白蛋白轉運競爭性細胞於來源於人CKD腎之NKA培養物中得到保留。亦顯示，NKA培養物之特定次餾分B2及B4於表型及功能上明顯不同，其中B2代表具有增強之白蛋白轉運活性之腎小管細胞富集之餾分。來自人CKD之B2細胞亞群 在表型上及功能上類似於展示活體內功效之齧齒動物B2細胞(如上文所示)。
實例14-來源於原代腎細胞之外切體含有microRNAs
吾人設想將特定外切體源性miRNAs與活體外目標細胞中功能上相關之結果相關聯，以告知用於闡明產生再生性結果之機制之活體內研究之設計。
方法：使用市場上可購得之細胞考察條件培養基對與再生癒合反應相關之信號傳遞途徑之影響：HK-2(人近端腎小管細胞株)、原代人腎膈細胞(human renal mesangial cell；HRMC)，及人臍帶內皮細胞(human umbilical cord endothelial cell；HUVEC)。藉由為偵測已知之miRNAs所設計之基於PCR之陣列，篩選來自人及大鼠原代腎細胞培養物(UNFX)之條件培養基中來自外切體之RNA內容物。已報導低氧影響外切體流出；因此，將一組培養物於培養基收集之前暴露於低氧(2% O2)24小時。藉由FACS自細胞碎片分離外切體。第29圖提供用於UNFX條件培養基之製備與分析之示意圖。
結果：發現UNFX-條件培養基影響與再生癒合反應相關之信號傳遞途徑；該等反應於使用非條件培養基之對照組中未觀測到。特定而言，NFκB(免疫反應)及上皮-間質細胞轉換(纖維化反應)於HK-2細胞中得到削弱，PAI-1(纖維化反應)於HRMC細胞中得到削弱，而血管生成於HUVEC中得到促進。來自UNFX-條件培養基之外切 體內容物之PCR陣列篩選之初步資料顯示，UNFX產生含有miRNA序列之外切體，與對於UNFX-條件培養基所觀測之反應相一致。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第13A-C圖顯示，來自UNFX培養物之條件培養基影響可能與再生性結果相關之活體外多個細胞過程。提議將NFkB信號傳遞作為腎病中發炎性過程之關鍵指標(Rangan等人，2009.Front Biosci 12：3496-3522；Sanz等人，2010.J Am Soc Nephrol 21：1254-1262)，且可由腫瘤壞死因子(TNF)啟動。HK-2細胞以非條件培養基(左)或UNFX條件培養基(右)以37℃預孵育1小時，接著利用或不利用10ng/ml TNFa啟動。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第13A圖顯示，UNFX-條件培養基削弱TNF-a介導之NF-kB之啟動。藉由RelA/p65免疫螢光染色(綠色)量測NFkB啟動。Hoechst反染色核(藍色)及鬼筆環肽(phalloidin)染色之絲狀肌動蛋白(紅色)促進RelA/p65核定位之評估(白色箭頭)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第13B圖顯示，UNFX-條件培養基增加HUVEC細胞培養物之促血管生成行為。將HUVEC細胞(100,000/孔)覆蓋於Media 200外加0.5% BSA中經聚合之Matrigel上。添加非條件培養基(左)或UNFX-條件培養基(右)，目視監測細胞組織反應(cellular organizational response)3-6小時且進行影像捕捉。針對細胞遷移(白色箭頭)、對準(黑色箭頭)、腎小管 形成(紅色箭頭)及閉合多邊形之形成(星號)，對細胞組織評分。UNFX條件培養基相較於非條件培養基誘導更多腎小管及閉合多邊形，暗示該培養基中存在促血管生成因子。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第13C圖顯示，UNFX-條件培養基削弱上皮細胞中之纖維化途徑。HK-2細胞在活體外暴露於轉型生長因子(TGF)時喪失上皮特性且獲得間質表型，複製與腎纖維化之進展相關之上皮-間質細胞轉換(EMT)(Zeisberg等人2003 Nat Med 9：964-968)。於非條件培養基(CTRL)、含有10ng/ml TGFβ1之非條件培養基(TGFβ1)或含有10ng/ml TGFβ1之UNFX條件培養基(TGFβ1+CM)中培養HK-2細胞72小時。藉由定量RT-PCR測定細胞之CDH1(上皮標誌物)、CNN1(間質標誌物)及MYH11(間質標誌物)。條件培養基降低藉由CDH1、CNN1及MYH11基因表現所量測之由TGFβ1誘導之EMT之程度。誤差條代表三次實驗重複之平均值之標準誤差(SEM)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第13D圖描繪 由TGFβ1及纖溶酶原啟動物抑制劑-1(PAI-1)所建立之正回饋環路，其在未檢查時(unchecked)可導致細胞外基質蛋白質之進行性積聚(Seo等人，2009.Am J Nephrol 30：481-490)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第14A-B圖顯示 腎膈細胞中纖維化途徑之削弱。於對照組(CTRL)或UNFX條件培養基(UNFX CM)中培養HRMC 24小時，其中添加(+)或不添加(-)5ng/ml TGFβ1。對於PAI-1之西方墨點分析證實UNFX CM削弱由TGFβ1誘導之PAI-1蛋白質水準之增加。bActin顯示為載入對照組。人腎膈細胞於5ng/ml TGFb1之存在(+)下表現增加之PAI-1水準。與來源於人生物活性腎細胞之條件培養基(CM)共培養削弱由TGFb1誘導之PAI-1蛋白質表現。CM未改變mRNA水準下之PAI-1表現(資料未顯示)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第14B圖顯示，來自大鼠生物活性腎細胞之CM對經(+)及未經(-)TGFb1誘導之經培養之HRMC具有類似作用。離心後收集之CM上清液(耗減之大鼠CM)對於削弱PAI-1表現不太有效，暗示負責所觀測之PAI-1蛋白質之削弱之CM組分可能與大鼠生物活性腎細胞所分泌之囊泡相關。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第15圖顯示，來自UNFX之條件培養基含有分泌性囊泡。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第15A圖描繪分泌性囊泡(包含外切體)，其為圍繞細胞質源性內部組分(綠色)之雙脂質結構(紅色)。磷脂醯絲胺酸(藍色三角形)係為於囊泡生物發生期間經暴露於細胞外空間之膜之組分(Thery等人，2010.Nat Rev Immunol 9：581-593)。
PKH26及CFSE分別標記分泌性囊泡之脂膜及細胞質(Aliotta等人，2010.Exp Hematol 38：233-245)，而膜聯蛋白V(Annexin V)結合磷脂醯絲胺酸。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第15B-C圖顯示FACS分選。UNFX條件培養基係以PKH26、CFSE及APC共軛之膜聯蛋白V標記，接著藉由螢光輔助之細胞分選法(FACS)分選。收集代表分泌性囊泡之三重陽性粒子，使用TRIZol試劑萃取總RNA。使用市場上可購得之基於RT-PCR之陣列針對已知之序列篩選microRNA內容物。
表5顯示分泌性囊泡含有具有所預測之治療結果之microRNAs。UNFX細胞流出含有已知之miRNA序列之外切體。UNFX-條件培養基影響人細胞株中功能上相關之再生反應。經偵測之miRNAs與所觀測之再生反應之間的因果關係係處於積極研究中；然，迄今為止所達成之結果暗示UNFX細胞有可能經由外切體所介導之miRNAs至目標細胞及組織之轉移而產生治療上相關之旁分泌作用。
*Taganov等人，2006.Proc Natl Acad Sci USA 103：12481-12486。
**Chen及Gorski,2008.Blood 111：1217-1226。
***Rogler等人，2009.Hepatology 50：575-584。
資料支援結論：來自生物活性腎細胞培養物之分泌性囊破含有削弱由TGFb1/PAI-1回饋環路所誘導之PAI-1之組分。
微陣列及RT-PCR分析。於基礎培養基中(不含血清或添加劑之DMEM及KSFM之50：50混合物)於低氧條件下(2% O2)培養來自Lewis大鼠之未分餾(UNFX)生物活性腎細胞24小時。收集條件培養基，於4C以100,000 xg超離心2小時以使分泌性囊泡(例如微囊泡、外切體)成團。自所得之團塊萃取總RNA，藉由即時RT-PCR(Rat MicroRNA Genome V2.0 PCR Array；Qiagen #MAR-100A)針對已知之microRNA物種進行測定。Ilagan等人PCT/US2011/036347中第74頁第26列至第77頁第67列上所列之miRNAs係可偵測的。
實例15-來源於生物活性腎細胞之旁分泌因子
本研究中，採用活體外基於細胞之測定來考察生物活性腎細胞可經由諸如纖溶酶原啟動物抑制劑-1(PAI-1)等之介體調節纖維化之潛在旁分泌機制。
材料與方法：於無血清及無添加劑之條件下自生物活性腎細胞之大鼠及人培養物收集條件培養基 (Aboushwareb等人，World J Urol 26,295,2008；Presnell等人2010 supra)，且用於活體外測定。於活體外測定中將市場上可購得之大鼠及人源性腎膈細胞用作宿主反應組織之代用品，因為腎膈細胞係為受損傷或患病腎中PAI-1產生之來源(Rerolle等人，Kidney Int 58,1841,2000)。分別藉由定量RT-PCR及西方墨點法測定PAI-1基因及蛋白質表現。藉由高速離心收集由細胞流入培養基中之囊泡粒子(例如，外切體)(Wang等人，Nuc Acids Res 2010,1-12 doi：10.1093/nar/gkq601,July 7,2010)，利用TRIzol試劑(Invitrogen)自團塊萃取總RNA。使用已知microRNA序列(Qiagen)之基於PCR之陣列篩選囊泡之RNA內容物。
結果：來自生物活性腎細胞培養物之條件培養基削弱腎膈細胞中PAI-1穩態蛋白質水準之由TGFβ1誘導之增加，但不影響穩態mRNA水準；該觀測結果與microRNAs調節目標基因之機制相一致。基於microRNAs經由細胞外囊泡運輸可於細胞之間轉移之假設(Wang等人，supra 2010)，針對microRNA內容物分析條件培養基且確認PAI-1之推定抑制劑microRNA 30b-5p(miR-30b-5p)之存在。
此處呈現之資料暗示生物活性腎細胞可透過miR-30b-5p至目標腎膈細胞經由外切體之細胞間轉移而直接調節纖維化。作為腎膈細胞對miR-30b-5p攝取之結 果，由TGFβ1所誘導之穩態PAI-1蛋白質水準之增加受到削弱，該反應於腎組織中最終可降低腎絲球空間內細胞外基質之沈積。當前工作係正在進行中以確認PAI-1的確為miR-30b-5p之直接目標。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第14A-B圖顯示 於人腎膈細胞中PAI-1及α-肌動蛋白(對照組)蛋白質表現之西方墨點，該等細胞於對照組(CTRL)或生物活性腎細胞條件培養基(CM)中培養24小時，其中除培養基外添加(+)或未添加(-)TGFβ1。在CTRL培養物中，TGFβ1增加PAI-1蛋白質表現。在CM培養物中，TGFβ1所誘導之反應受到削弱。
針對可為PAI-1之推定阻抑物之microRNAs分析分泌性囊泡。藉由高速離心收集來自人及大鼠生物活性腎細胞CM之分泌性囊泡，使用已知序列之基於PCR之陣列針對microRNA內容物進行測定。識別PAI-1(6)之推定調節劑miR-449a。HRMC經miR-449a暫態轉染或未進行(CTRL)。轉染後24小時使細胞暴露於5ng/ml TGFb1(+)或不暴露(-)另24小時。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第16A圖顯示 其中製備總蛋白質且針對PAI-1及b肌動蛋白測定之西方墨點。miR-449a降低穩態PAI-1蛋白質水準(比較泳道1與泳道3)且經誘導之PAI-1蛋白質之水準於經miR-449a轉染之培養物中亦較低(比較泳道2與泳道4)。資料支援結 論：分泌性囊泡含有miR-449a且miR-449a於腎膈細胞中之攝取降低PAI-1表現。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第16B圖描繪microRNA，miR-30b-5p，其於基於PCR之陣列中亦得到識別且基於預測性演算法係為PAI-1之推定調節劑(http：//mirbase.org-miRBase代管且維持於曼徹斯特大學之生命科學院。
以生物活性腎細胞治療藉由5/6腎切除術誘導之CKD後，於活體內檢測腎絲球中之PAI-1蛋白質水準。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17A-C圖顯示Lewis大鼠腎中PAI-1(A-C)之代表性免疫組織化學影像，該等腎已經歷單側腎切除術(A)、5/6腎切除術(B)或在生物活性腎細胞之腎內遞送下之5/6腎切除術(C)。作為5/6腎切除術程序(B)之結果於腎絲球中PAI-1之積聚(箭頭)因治療而降低(C)。
在獨立研究中，對屍檢時收集之腎組織執行qRT-PCR且將相對基因表現值針對研究之天數繪圖。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17D圖顯示，經5/6腎切除術之大鼠(紅色方形)相對於以生物活性腎細胞處理者(藍色菱形)及假手術對照組(綠色三角形)展示更穩固之PAI-1表現。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17E圖顯示治療後3及6個月取得之腎樣品之代表性西方墨點分析。經5/6腎 切除術之大鼠(Nx)之經治療組織(Nx+Tx)具有降低之PAI-1及纖連蛋白(FN)之積聚(Kelley等人2010 supra)。
資料支援結論：以生物活性腎細胞治療藉由5/6腎切除術誘導之CKD後，腎絲球中之活體內PAI-1蛋白質水準下降。總之，實例15-16支援假設：生物活性腎細胞之腎內遞送改良腎功能之一種機制可能係為經由常駐腎細胞中調節纖維化途徑之組分之細胞-細胞轉移。
實例16-來自生物活性腎細胞之分泌性因子削弱NFκB信號傳遞途徑
本研究中，考察5/6腎切除術模型中NFκB途徑於NKA所介導之疾病進展之削弱中之作用，及識別可經由NFκB啟動之直接調節而促進再生結果之生物活性腎細胞之特性。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17G圖描繪TNFα對NFkB途徑之經典啟動。
材料與方法：自Lewis大鼠收集剩餘腎，其中於經PBS中之B2+B4處理之前(NKA原型)6周執行兩步式5/6腎切除術程序。藉由免疫組織化學、RT-PCR、西方墨點分析及電泳電泳遷移率變動測定(electrophoresis mobility shift assay；EMSA)，針對NFκB啟動測定經NKA處理(TX)或未經處理(UNTX)之組織。自於無血清、無添加劑之培養基中生長之離體NKA細胞培養物所收集之條件培養基(CM)係用於活體外功能測定。對於分子及基於免疫螢光之測定讀取，使用人近端腎小管細胞株(HK-2)作為目標 細胞類型。藉由高速離心收集由細胞流入培養基中之囊泡粒子(外切體)。使用已知microRNA序列(Qiagen)之基於PCR之陣列篩選自外切體分離之總RNA。
結果：於來自經5/6腎切除術之大鼠之剩餘腎中觀測到NFκB亞單位RelA/p65之核定位，暗示UNTX中發炎途徑之啟動。藉由RT-PCR之TX組織之初步比較顯示RelA基因表現中之減少，暗示NKA治療可能經由RelA/p65表現之抑制而影響NFκB途徑啟動。此假設由以下觀測支援：CM削弱活體外由TNFα誘導之NFκB啟動，如藉由經CM暴露之HK-2細胞中相對於回應於腫瘤壞死因子-α(TNF α)所見，RelA/p65之降低之核定位所證明(Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17F圖)。正進行中的NKA外切體microRNAs之RT-PCR分析考察是否存在已知可影響NFκB途徑之序列。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17F圖顯示，對NKA CM之2小時暴露降低HK-2中NFκB p65之核定位(綠色)，此係相較於免疫螢光測定中經TNFα預處理之對照培養物中所觀測之結果而言。HK-2中，暴露於TNFα(對照培養基)30分鐘之後NFkB p65(綠色)定位至核。然，於TNFα添加之前以NKA條件培養基對HK-2細胞預處理2小時削弱NFkB p65核定位反應。核以DAPI染色(藍色)，絲狀肌動蛋白以Alexa594-鬼筆環肽染色(紅色)以輔助定性評估NFκB核定位之穩固性(注意到底排之合併圖中於經 TNFα處理之對照細胞中稍微減輕之鬼筆環肽邊界)。反染色提供合併之影像中NFkB定位之參照。
Lewis大鼠之腎組織中NFkB p65亞單位之免疫組織化學展現，具有藉由5/6腎切除術(第B圖)起動之進行性CKD之動物相對於對照動物中藉由單側腎切除術(第A圖)起動之非進行性腎功能不全，具有更穩固之NFkB p65亞單位之核定位，尤其於腎小管上皮細胞中(黑色箭頭)。腎切除術後六周收集組織。200X之放大。
第C圖：已經歷5/6腎切除術之Lewis大鼠腎組織之細胞質(「C」)及細胞核(「N」)蛋白質萃取物中NFkB p65之西方墨點分析。比較g微管蛋白水準(載入對照組)相對一致之1周及13周，核NFkB p65隨時間增加，與免疫組織化學結果一致。
第D圖：對核萃取物之電泳遷移率變動測定(EMSA)確認5/6腎切除術後定位至核之NFkB經啟動以用於DNA結合。泳道代表每一時間點自兩隻動物製備之核萃取物。
於慢性腎病之5/6腎切除術模型中NFkB途徑係經進行性啟動。對Lewis大鼠之腎組織中之NFkB p65亞單位執行免疫組織化學。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第18A-D圖揭露 具有藉由5/6腎切除術(第B圖)起動之進行性CKD之動物相對於對照動物中藉由單側腎切除術(第A圖)起動之非進行性腎功能不全，具有更穩固之NFkB p65亞單位之核定 位，尤其於腎小管上皮細胞中(黑色箭頭)。腎切除術後六周收集組織。200X之放大。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第18C圖顯示 已經歷5/6腎切除術之Lewis大鼠腎組織之細胞質(「C」)及細胞核(「N」)蛋白質萃取物中NFkB p65之西方墨點分析。比較g微管蛋白水準(載入對照組)相對一致之1周及13周，核NFkB p65隨時間增加，與免疫組織化學結果一致。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第18D圖顯示 對核萃取物之電泳遷移率變動測定(EMSA)確認5/6腎切除術後定位至核之NFkB經啟動以用於DNA結合。泳道代表每一時間點自兩隻動物製備之核萃取物。將1mg核蛋白質與5ng NFkB DNA結合位點一起孵育，於6% DNA阻滯凝膠上進行電泳，接著以溴化乙錠染色。
NKA細胞之腎內遞送降低NFkB核定位。已分離腎細胞之多個經定義之亞群，且於CKD之5/6腎切除術模型中活體內測定改良腎功能方面之生物活性(Presnell等人2010 supra)。NKA細胞展示生物活性，而其他亞群沒有(Kelley等人2010 supra)。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第18E圖顯示 具有已建立之CKD且接受NKA(A)或非生物活性腎細胞(B)之腎內注射之Lewis大鼠。具有已建立之CKD之Lewis大鼠接受NKA(A)或非生物活性腎細胞(B)之腎內注射。治療後6個月，收集組織，且藉由免疫組織化學針對NFkB p65 亞單位測定。來自經NKA治療之動物之組織相對於來自經非生物活性腎細胞治療之動物之組織，展現更少之NFkB p65之核定位，尤其於近端腎小管中，暗示NKA治療參與活體內削弱NFkB途徑活性。
基於文獻報導(Marquez RT等人(2010)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298：G535；Taganov KD等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：12481)或預測性演算法(http：//mirbase.org-miRBase係代管且維持於曼徹斯特大學之生命科學院)，使用已知序列之基於PCR之陣列，對藉由高速離心自人及大鼠NKA條件培養基分離之分泌性囊泡之microRNA內容物之分析識別出可能經由NFkB影響免疫反應之幾個microRNA物種。
活體內及活體外發現提供對生物活性腎細胞(NKA)如何可能藉由調節免疫反應途徑(諸如受NFkB啟動所影響者)來改良慢性患病腎中之腎功能之洞悉。經啟動之NFkB(p65核定位，尤其於近端腎小管細胞中)係與5/6腎切除術齧齒動物模型中慢性腎病之建立相關，且因NKA治療而削弱。近端腎小管細胞(HK-2)對NKA條件培養基之活體外反應模仿NFkB核定位回應於NKA治療之活體 內削弱。於NKA條件培養基中識別NFkB啟動之細胞-細胞抑制之推定介體(microRNAs)總之，該等資料支援假設：生物活性腎細胞之腎內遞送改良腎功能之一種機制可能係為經由常駐腎細胞中調節免疫反應之組分(例如RNA)之細胞-細胞轉移。
實例17-NKA構集體之功能性評價
接種於明膠或基於HA之水凝膠上之腎細胞群係為可見且於3天之活體外熟化期間保持腎小管上皮功能性表型，如藉由轉錄組學、蛋白質組學、分泌組學及共聚焦免疫螢光測定所量測。為考察NKA構築體可能影響疾病狀態之潛在機制，評價條件培養基對與CKD進展相關之腎小管-間質纖維化有關之TGF-β信號傳遞途經之影響。經觀測條件培養基於人近端腎小管細胞株(HK2)中活體外削弱由TGF-β誘導之上皮-間質細胞轉換(EMT)。材料與方法係如Ilagan等人PCT/US2011/036347中所述(實例15)
HK2細胞中經TGF-β介導之EMT之分析。於塗佈纖連蛋白或膠原蛋白(IV)之培養皿(BD Biosciences)中之50：50培養基中培養HK2細胞(ATCC)。對於EMT測定，將HK2細胞接種於24孔膠原蛋白(IV)塗佈之盤中，70-80%之匯合，利用50：50培養基或自二維(2D)人UNFX培養物或由培養基收集前熟化3天之人UNFX製成之NKA構築體收集之條件培養基。藉由添加10ng/ml至培養基中起動TGF-β 誘導，三天后自細胞分離RNA用於EMT測定。藉由三天孵育期結束時分析E-鈣黏蛋白(上皮標誌物)及鈣調寧蛋白(calponin)(間質標誌物)之相對表現，由qRT-PCR監測EMT。由所收集之HK2細胞製備RNA以用於如上文所述之TaqMan qRT-PCR分析。使用標準雙尾學生t檢驗，對每一樣品假定相同變異數，進行統計分析。使用95%(p-值<0.05)及99%(p-值<0.01)之信賴區間以確定統計顯著性。
結果：來自NKA構築體之條件培養基對HK2細胞中由TGF-β介導之EMT之影響CKD之進展期間腎小管-間質纖維化之發展係與腎小管上皮細胞之由TGF-β介導之EMT相關(Zeisberg等人Am J Pathol 160(6)：2001-2008；2002)。又，於進行性CKD之齧齒動物模型中活體內觀測到TGF-β途徑之削弱，其中藉由以UNFX及B2細胞之治療，存活期經延長且腎功能經改良。WO/2010/056328)。人近端腎小管細胞株HK2已充分建立以作為活體外模型系統來測試小分子或蛋白質對TGF-β所誘導之EMT之刺激性或異質性作用(Dudas等人Nephrol Dial Transplant 24(5)：1406-1416；2009；Hills等人Am J Physiol Renal Physiol 296(3)：F614-621；2009)。為考察NKA構築體可能影響植入後腎組織反應之潛在機制，於HK2 EMT測定系統中評價自以UNFX細胞及水凝膠製備之NKA構築體收集之條件培養基。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第26圖顯示來自NKA構築體之條件培養基削弱活體外HK2細胞中TGF-β所誘導之EMT。藉由量化ECAD(上皮)及CNN1(間質)標誌物之相對表現，監測EMT。於50：50培養基(對照組及TGFB對照組樣品)或來自人UNFX細胞(TC)之二維培養物或由人UNFX細胞及所指示之明膠或HA/明膠製得之NKA構築體之條件培養基(CM)中培養(CM)細胞。未誘導EMT，測定前向每一樣品添加10ng/ml TGF-β(對照組除外)歷時3天。於50：50培養基(對照組)中培養HK2細胞時，以高於CNN1(間質標誌物)之水準表現ECAD(上皮標誌物)。將TGF-β添加至培養基3天(TGFB對照組)時，ECAD表現顯著下調，且伴隨CNN1之上調，與EMT事件之誘導相一致。來自2D UNFX細胞培養物之條件培養基顯著(對於ECAD及CNN1二者，p<0.05)削弱HK2細胞對TGF-β(TC CM)之EMT反應。來自NKA構築體之條件培養基(明膠CM及HA/明膠CM)亦削弱對TGF-β之EMT反應；然，總體作用係小於利用來自2D UNFX細胞培養物之條件培養基所觀測者(顯著-p<0.05-對於ECAD，利用兩個NKA構築體，且逐漸傾向於對照組，儘管對於CNN1統計上不顯著)。篩選額外之間質標誌物，得到類似結果(資料未顯示)。該等資料暗示NKA構築體可能潛在影響活體內與腎小管-間質纖維化相關之TGF-β途徑，其方式類似於利用基於細胞之治療所觀測者(Presnell等人 WO/2010/056328)。該等資料亦暗示若活體內反應可證實與活體外EMT反應具有統計顯著之相關性，則活體外EMT測定對於篩選/優化/監測NKA構築體之生物治療功效具有潛在應用，由此潛在降低對耗時且昂貴之活體內測定之需要。
實例18-經培養之人腎細胞之低氧暴露誘導細胞遷移及黏附之介體且促進活體外腎小管細胞單層之修復
考察氧壓於慢性腎病(CKD)之模型中於具有已證明之治療功能之選定腎上皮細胞群(B2)的分離及功能中之作用。本研究檢測加工期間之低氧暴露是否改變選定人腎細胞(SRCs)或生物活性腎細胞(BRCs)之組成及功能。一經暴露於2%氧，則觀測到以下內容：細胞於密度梯度上之分佈之變化(見Presnell等人WO 10/056328，其整個內容以引用之方式併入本文)、總體梯度後產率之改良、氧調節之基因表現之調節(先前報導於Kelley等人supra(2010)中)、紅血球生成素、VEGF、HIF1-alpha及KDR(VEGFR2)之增加之表現。過程中對低氧之暴露增強選定生物活性腎細胞修復/再生受損傷之腎小管之能力。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第27圖描繪 處理期間使細胞暴露於低氧之程序。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第28圖顯示，一經暴露於2%氧，則觀測到以下內容：改變細胞於密度梯度上之分佈，改良總體梯度後產率。低氧暴露(<3%)相對於大氣氧壓 (21%)增加自基於碘克沙醇之密度梯度之經培養人CKD源性腎細胞之回收(96%對74%)，且增加選定細胞B2)於高密度(>9%碘克沙醇)餾分中之相對分佈(21.6%對11.2%)。
競爭性活體外測定展示預暴露於低氧條件24小時之B2細胞相較於21%氧壓下培養之B2細胞，在修復受損傷之腎近端腎小管單層培養物方面更為擅長，其中58.6%±3%之修復發生於2小時損傷以內。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第29A圖描繪為觀測活體外腎小管單層之修復所開發之測定。1.以螢光染料標記細胞(2%氧、21%氧及HK2腎小管細胞)。2.建立腎小管細胞單層並損傷。3.添加經氧暴露之經標記細胞(經2%及21%暴露之細胞)。將其相等地以20,000/cm2接種。於無血清培養基中以5% O2培養24小時。4.量化修復創傷之細胞。第29B圖-定量影像分析(BD Pathway 855 BioImager)-紅色圓圈=2% O2培養之細胞，藍色圓圈=21% O2。第29C圖-據觀測，2%氧誘導之細胞黏附更快速(2小時)且持續輕微優勢24小時。以2%氧誘導之細胞在腎小管上皮單層之修復上更為擅長。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第30A圖描繪為觀測活體外腎小管單層之修復所開發之測定。1.以螢光染料標記細胞。2.於8μm孔大小transwell插入板之底部建立腎小管細胞單層並損傷。3.輕擊插入板且添加經氧暴露 之經標記細胞(經2%及21%暴露之細胞)。將其相等地以50,000/cm2接種。於無血清培養基中以5% O2培養24小時。4.量化修復創傷之細胞。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第30B圖顯示，以2%氧對細胞之誘導相較於未經誘導(21%氧)，增強遷移及創傷修復。第30C圖繪示針對遷移時間之遷移細胞%。表6中提供細胞之平均數及細胞之平均百分比。
低氧亦誘導CXCR4、MMP9、ICAM1及肌營養不良蛋白聚糖(dystroglycan)之mRNA表現；介導細胞遷移及黏附之基因之mRNA表現。藉由免疫細胞化學確認細胞之質膜上MMP9之局部積聚及連接蛋白43聚集體之增加。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第31A圖顯示，骨橋蛋白由腎小管細胞分泌且回應於損傷而上調(Osteopontin Immunocytochemistry：Hoechst核染色(藍色)，骨橋蛋白(紅色)，10倍)。骨橋蛋白係為分泌性磷酸化之醣蛋白(Kelly等人J Am Soc Soc Nephrol,1999)。骨橋蛋白係表現於腎小管中且參與黏附及遷移。骨橋蛋白於所建立之腎小管細胞單層中由損傷上調，如免疫螢光(Ilagan等人PCT/US2011/036347之第31A圖)及ELISA(Ilagan等人PCT/US2011/036347之第31B圖)所顯示。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第32A圖顯示，細胞之遷移反應部分上係由骨橋蛋白所介導(綠色=遷移細胞(5x))。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第32B圖顯示，針對骨橋蛋白之中和抗體(NAb)將腎細胞遷移反應降低50%。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第33圖顯示，細胞之低氧誘導調節組織重塑基因之表現。小窩蛋白1(Caveolin 1)係為參與整合素信號傳遞之調節之支架蛋白質。MMP9係為促進經由細胞外基質降解之遷移之金屬蛋白酶。ICAM1係為與上皮細胞運動性相關之細胞內黏附分子。CXCR4係為介導細胞遷移之趨化激素表面受體。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之第34圖描繪用於導致腎再生之細胞生物活性之低氧加強之推定機制。
總之，該等結果暗示低氧暴露促進特定腎細胞亞群之分離，其具有已證實之用於活體外腎小管損傷之修復之生物活性，且因此於活體內遞送後可潛在地增強該等細胞遷移及移入患病組織中之能力。SRCs展示於進行性 CKD之齧齒動物模型中穩定腎功能及增強存活之能力。低氧水準(2% O2)提供以下內容：增強之選定再生細胞之培養後回收；回應於腎小管損傷，增強之細胞黏附及單層修復；及回應於腎小管損傷，經刺激之細胞遷移。此外，於活體外、低氧上調之整合素、分泌性蛋白質，及介導組織重塑、遷移及細胞-細胞通訊之細胞黏附分子中，細胞遷移及黏附係部分上由骨橋蛋白介導。
實例19-尿液源性微囊泡
對流入尿液中之腎源性微囊泡之管腔內容物內所含之miRNAs及蛋白質執行分析，以確定其是否可能用作用於評估再生結果之生物標誌物。過量之微囊泡流入細胞外空間中，一些與相鄰細胞融合而其他經分泌至尿液中(Zhou等人2008.Kidney Int.74(5)：613-621)。該等尿液微囊泡現已成為用於測定開發之優良之生物標誌物以求更好地理解治療結果。
使用代謝性疾病伴慢性進行性腎衰竭之ZSF1齧齒動物模型。將B2+B4細胞注射入ZSF1動物之腎實質中。健康動物及PBS媒劑用作對照組。在不同時間點如下面所概述分析尿液源性囊泡。
1：ZSF1動物-注射PBS媒劑；注射197天后收集尿液
2：ZSF1動物-注射PBS媒劑；注射253天后收集尿液
3：ZSF1動物-注射B2+B4餾分；注射197天后收集尿液
4：ZSF1動物-注射B2+B4餾分；注射253天后收集尿液
5.ZSF1動物-無注射；研究之第197天收集尿液
6.ZSFI動物-無注射；研究之第253天收集尿液
7.健康動物-無注射；研究之第197天收集尿液
8.健康動物-無注射；研究之第253天收集尿液
於治療後第197天及約253天自測試動物收集尿液。藉由此項技藝中已知之標準方法自尿液回收微囊泡(例如，見Zhou等人Kidney Int.2008 September；74(5)：613-621)。如Ilagan等人PCT/US2011/036347之第35圖中之標準西方墨點分析所顯示，自經治療動物之尿液回收之微囊泡(泳道3-4)顯示相較於媒劑治療(泳道1-2)或未治療對照組(泳道5-8)，與祖細胞(CD133 & WNT7A)相關之蛋白質之增加。事實上，僅自患病動物之尿液回收微囊泡(泳道1-6)，而未自健康對照組回收(泳道7-8)，如由微囊泡特異性蛋白質CD63之表現所示(Ilagan等人PCT/US2011/036347之第35圖)。含有CD133之微囊泡看似為自腎細胞流出之引發體(prominosome)。已將CD133及WNT7A二者與再生及幹細胞分裂相關(Romagnani P and Kalluri R.2009.Fibrogenesis Tissue Repair.2(1)：3；Lie等人2005.Nature.437(7063)：1370-5；Willert et al.2003.Nature.423(6938)：448-52；Li等人2009.Am J Physiol Renal Physiol.297(6)：F1526-33)。總之，此支持微囊泡中表現之靶向蛋白質作為生物標誌物用於為監測再生所設計之測定開發。
miRNA微陣列及RT-PCR。藉由此項技藝中已知之標準方法對來自尿液源性囊泡之miRNA執行微陣列及RT-PCR分析(例如見Wang等人supra 2010)。除蛋白質外，於分離之微囊泡之內容物內還發現miRNAs。Ilagan等人PCT/US2011/036347之第17.1圖提供經發現因治療而增加之miRNAs之實例。於經B2+B4治療之ZSF1動物中隨時間分析miRNA之變化(第197天及第253天)。針對於Ilagan等人PCT/US2011/036347中之第98頁第1列至第100頁第50列所列出之miRNAs，觀測倍數變化。於經B2+B4治療之ZSF1動物中(第253天)分析miRNA水準，且與經PBS媒劑治療之ZSF1動物中之miRNA水準(第253天)相比較。針對於Ilagan等人PCT/US2011/036347中之第100頁第53列至第103頁第7列所列出之miRNAs，觀測倍數變化。於經B2+B4治療之ZSF1動物中(第197天)分析miRNA水準，且與經PBS媒劑治療之ZSF1動物中之miRNA水準(第197天)相比較。針對於Ilagan等人PCT/US2011/036347中之第103頁第12列至第105頁第10列所列出之miRNAs，觀測倍數變化。
Ilagan等人PCT/US2011/036347之表17.1中所列出之miRNAs提供已參與組織再生之過程中之miRNAs之實例。miR-15b已經由BCL-2及半胱天冬酶(caspase)調節而參與調控凋亡(Guo等人2009.J Hepatol.50(4)：766-78)以及經由週期蛋白(cyclin)而參與細胞週期進程(Xia等人 2009.Biochem Biophys Res Commun.380(2)：205-10)。已顯示miR-21係藉由調節存活途徑MAPK/ERK來抑制凋亡。miR-30家族之miRNAs對於足細胞結構及功能至關重要，暗示增加可能係為腎發生(glomerulargenisis)所必需。miR-141、200a、200c及429皆回應於TGF-β信號傳遞而參與調節上皮-間質細胞轉換(EMT)，有可能減少纖維化(Saal等人2009.Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.18：317-323)。miR-146a及151已參與NFκB調節，因此有可能活體內降低發炎反應(Taganov等人2006.Proc Natl Acad Sci U S A.103(33)：12481-6；Griffiths-Jones等人2006.NAR.34 Database Issue：D140-D144)。總言之，該等miRNAs調節與成功之再生結果有關之過程；因此使其成為用於測定開發之候選生物標誌物。總體而言，該資料支援以下思路：尿液微囊泡及/或其管腔內容物係為用於再生測定之可行目標，因為其除了為從業人員提供監測治療之非侵襲性手段外，還含有能夠調節多種途徑之蛋白質及miRNAs，該等途徑包含：TGF β-1、NFκB、凋亡、細胞分裂及複能性(pluripotency)。
實例20-製備人腎細胞聚集體之方法
使用用於產生NKA之標準操作程序，如前文所述，分離人腎細胞。經由兩次傳代對細胞進行擴增及亞培養，之後暴露於低氧環境(2%O2)歷時18小時。暴露後，收集細胞，使其經受兩步式密度梯度(7%及16% w/v Optiprep)，以800 x g離心20分鐘，無剎車。於7%與16%層之前形成所得譜帶，收集並洗滌(B2、B3、B4)。對細胞計數且評估活力。藉由於經poly-HEMA塗佈以防黏附之多孔培養盤中培養細胞(20-30 x103細胞/cm2)，產生細胞聚集體或球狀體，置於孵育箱中之軌道旋轉器上24小時(第30A圖)。或者，將成譜帶之細胞以1x106細胞/ml之濃度再懸浮於75ml腎生長培養基中，置於125ml旋轉角瓶(BD)中於37℃/5% CO2之孵育箱內部之磁力攪拌器上(4-40rpm)(第30B圖)。使細胞自聚集以產生球狀體歷時24-48小時，之後測定表型變化(第31圖)。細胞可於旋轉角瓶內進行測定，亦可轉移至較小之poly-HEMA塗佈之多孔培養盤用於測定，該等多孔培養盤保持球狀體。執行許多適合之測定以量測表型變化、功能、活力及凋亡。表7提供示例性測定及相應之結果。
第1圖未交聯之明膠珠粒的溫度回應性。
第2圖含有懸浮之個別腎細胞的基質。
第3圖含有細胞聚集體之基質。
第4圖含有黏附於微載劑珠粒之細胞的基質。
第5圖含有細胞外加可溶性因子(透明質酸)之基質。
第6圖在基質中4℃下3天后之細胞活力。
第7圖注射了間隔珠粒與Cultispher S珠粒之混合物之腎的組織學(1周)，其說明珠粒之生物相容性及其空間創建能力。
第8圖基質之結構完整性喪失之說明(左圖：固體；右圖：流體)。
第9圖碳化二亞胺介導之明膠交聯之合成圖解，其指出反應中所涉及之胺基酸殘基(未交聯之明膠中)及它們形成之醯胺鍵(經交聯之明膠中)。
第10A-B圖明膠珠粒之形態。A-掃描式電子顯微鏡影像，其顯示未交聯之明膠珠粒的整體形態及大小分佈(尺規為1mm)。B-高倍率掃描式電子顯微鏡影像，其顯示珠粒之多孔、中空結構(尺規為100μm)。
第11圖珠粒之大小分佈概況。
第12 A-B圖珠粒之表面形貌。上排(A)-幹珠粒之SEM影像。下排(B)-濕珠粒之明視野顯微鏡影像。兩組影像說明珠粒之多孔表面。SEM影像亦說明中空內部。
第13 A-B圖經交聯之明膠中胺的量化。A-說明一級胺與苦咪基磺酸(picryllsulfonic acid)之間橙色加合物的形成之反應圖解。B-經酶消化之差異交聯的明膠珠粒(n=3)中存在的一級胺基團之量化。ANOVA統計分析P=0.007。
第14 A-B圖經差異交聯之明膠珠粒(A)以及與Cultispher S珠粒相比較(B)的酶降解概況。
第15圖經10mM EDC交聯之珠粒的細胞相容性，其顯示細胞對珠粒之黏附及細胞活力(綠色=活細胞；紅色=死細胞)。
第16圖經交聯珠粒之細胞相容性。在經交聯之明膠珠粒上原代大鼠腎細胞之LIVE/DEAD®染色。
第17圖注射了經0.1M EDC交聯之明膠珠粒(1周)的腎之組織學，其說明珠粒之生物相容性。
第18圖腎切片之組織學評價，其顯示注射後1周時經交聯之明膠珠粒的降解。
第19圖腎切片之組織學評價，其顯示注射後4周時經交聯之明膠珠粒的降解。
第20圖：用於NKA原型之創建的策略概要
第21 A-C圖：選定的齧齒動物再生性腎細胞生物材料構築體(A：細胞/PBS；B：細胞/GBH；C：細胞/珠粒)之代表性活細胞/死細胞染色。
第22 A-C圖：植入後4周中關鍵的腎生理指標之總結 (ANOVA分析)。(A)體重；(B)血尿素氮(BUN)；(C)血清肌酐(Scre)
第23 A-B圖：作為植入後4周之腎生理指標的(A)尿蛋白質/肌酐(UPC)及(B)尿蛋白質(Uprotein)之總結(ANOVA分析)
第24 A-B圖：作為植入後4周之腎生理指標的(A)比重及(B)尿肌酐(Ucre)之總結(ANOVA分析)
第25圖：在半腎切除術模型中與齧齒動物腎內細胞/生物材料構築體之植入相關的代表性組織學結果。
第26圖：顯示使用多層化分級梯度技術(左圖)或單層混合梯度技術(右圖)從新鮮分離之腎組織中對產生epo之細胞餾分之富集。兩種方法導致從epo譜帶中非產生epo之細胞組分(主要為腎小管細胞)之部分耗減，其出現在1.025g/mL與1.035g/mL之間。
第27圖：顯示單獨收集且並排施加至完全相同的分級梯度之「常氧」(21%氧)及「低氧」(2%氧)齧齒動物培養物之分級梯度。
第28圖：顯示單獨收集且並排施加至完全相同的分級梯度之「常氧」(21%氧)及「低氧」(2%氧)犬科動物培養物之分級梯度。
第29圖：提供用於UNFX條件培養基之製備與分析之示意圖。
第30A-B圖製備細胞聚集體之方法。A-帶有低結合板 之軌道旋轉器(Orbital Roatator)；B-帶有細胞之旋轉角瓶(spinner flask)。
第31圖描繪細胞聚集體或球狀體。
第32圖描繪細胞聚集體-NKCC2綠色；核-藍色。
第33圖描繪細胞聚集體-GGT-1綠色；核-藍色。
第34圖描繪細胞聚集體-水通道蛋白1(Aquaporin1)綠色；核-藍色。
第35圖描繪細胞聚集體-白胺酸胺基肽酶3紅色；核-藍色。
第36圖描繪細胞聚集體-有機離子轉運體(OAT1)紅色；核-藍色。
第37圖描繪細胞聚集體-Cubilin紅色：核-藍色。

Claims (54)

  1. 一種可注射之製劑，其包括生物活性腎細胞及溫度敏感性細胞穩定生物材料，該生物材料(i)於8℃且8℃以下保持實質上之固態，及(ii)於環境溫度且環境溫度以上保持實質上之液態，其中該環境溫度為18℃至30℃之範圍，其中該生物材料包括在8℃與環境溫度或環境溫度以上之間具有固-液轉變態的水凝膠，且其中在整個轉變態中，該等生物活性腎細胞懸浮於且實質上均勻地分散於該細胞穩定生物材料的整個體積中。
  2. 如請求項1之製劑，其中該實質上之固態係為凝膠態。
  3. 如請求項1之製劑，其中該水凝膠包括明膠。
  4. 如請求項3之製劑，其中該明膠係以0.5%至1%(w/v)存在於該製劑中。
  5. 如請求項3之製劑，其中該明膠係以0.75%(w/v)存在於該製劑中。
  6. 如請求項1之製劑，其進一步包括細胞活力劑。
  7. 如請求項6之製劑，其中該細胞活力劑包括選自由抗氧化劑、載氧體、免疫調節因子、細胞募集因子、細胞黏附因子、抗發炎劑、免疫抑制劑、血管生成因子及傷口癒合因子組成之群的試劑。
  8. 如請求項6之製劑，其中該細胞活力劑係為抗氧化劑。
  9. 如請求項8之製劑，其中該抗氧化劑係為6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸。
  10. 如請求項9之製劑，其中該6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸係以50μM至150μM存在。
  11. 如請求項9之製劑，其中該6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸係以100μM存在。
  12. 如請求項7之製劑，其中該細胞活力劑係為載氧體。
  13. 如請求項12之製劑，其中該載氧體係為全氟碳。
  14. 如請求項7之製劑，其中該細胞活力劑係為免疫調節劑。
  15. 如請求項7之製劑，其中該細胞活力劑係為免疫抑制劑。
  16. 如請求項1之製劑，其中該等生物活性腎細胞在8℃或8℃以下懸浮於且分散於該生物材料中。
  17. 一種可注射之製劑，其包括生物活性腎細胞及溫度敏感性細胞穩定生物材料，其中該細胞穩定生物材料包含約0.75%(w/v)明膠及約100μM 6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸，且其中該細胞穩定生物材料具有：(i)於8℃且8℃以下具有實質上之固態，及(ii)於環境溫度且環境溫度以上具有實質上之液態，其中該環境溫度為18℃至30℃之範圍，其中該生物材料包括在8℃與環境溫度或環境溫度以上之間具有固-液轉變態的水凝膠，且其中在整個轉變態中，該等生物活性腎細胞懸浮於且實質上均勻地分散於該細胞穩定生物材料的整個體積中。
  18. 如請求項17之製劑，其中該實質上之固態係為凝膠態。
  19. 如請求項17之製劑，其進一步包括細胞活力劑。
  20. 如請求項19之製劑，其中該細胞活力劑包括選自由抗氧 化劑、載氧體、免疫調節因子、細胞募集因子、細胞黏附因子、抗發炎劑、血管生成因子及傷口癒合因子組成之群的試劑。
  21. 如請求項20之製劑，其中該細胞活力劑係為載氧體。
  22. 如請求項21之製劑，其中該載氧體係為全氟碳。
  23. 如請求項20之製劑，其中該細胞活力劑係為免疫調節劑。
  24. 如請求項20之製劑，其中該細胞活力劑係為免疫抑制劑。
  25. 如請求項1-24中任一項之製劑，其進一步包括生物相容性珠粒。
  26. 如請求項25之製劑，其中該等珠粒係經交聯。
  27. 如請求項26之製劑，其中該等經交聯之珠粒相較於未交聯之生物相容性珠粒具有對酶降解之降低易感性。
  28. 如請求項26之製劑，其中該等經交聯之珠粒係為經碳化二亞胺交聯之珠粒。
  29. 如請求項28之製劑，其中該碳化二亞胺選自由1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、DCC-N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)，及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIPC)組成之群。
  30. 如請求項28之製劑，其中該碳化二亞胺係為1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。
  31. 如請求項27之製劑，其中該等經交聯之珠粒包括相較於未交聯之珠粒降低數目之游離一級胺。
  32. 如請求項31之製劑，其中該游離一級胺之數目可用分光光度法在355nm偵測。
  33. 如請求項26之製劑，其中該等珠粒係以該等生物活性腎細胞接種。
  34. 如請求項26之製劑，其進一步包括額外之生物相容性珠粒，其包括溫度敏感性生物材料，該溫度敏感性生物材料(i)於環境溫度或環境溫度以下保持實質上之固態，其中該環境溫度為18℃至30℃之範圍，及(ii)於37℃或37℃以上保持實質上之液態。
  35. 如請求項34之製劑，其中該等珠粒之該生物材料在環境溫度與37℃之間具有固-液轉變態。
  36. 如請求項34之製劑，其中該實質上之固態係為凝膠態。
  37. 如請求項34之製劑，其中該等珠粒之該生物材料包括水凝膠。
  38. 如請求項37之製劑，其中該水凝膠包括明膠。
  39. 如請求項37之製劑，其中該等珠粒包含5%(w/v)至10%(w/v)之明膠。
  40. 如請求項34之製劑，其中該額外之生物相容性珠粒係為間隔珠粒，其中該等間隔珠粒在該製劑中提供空間。
  41. 如請求項40之製劑，其中該額外之生物相容性珠粒係未以生物活性腎細胞接種。
  42. 如請求項1及16-24之製劑，其進一步包括由腎細胞群所分泌之產物。
  43. 如請求項42之製劑，其中該等產物包括旁分泌因子。
  44. 如請求項42之製劑，其中該等產物包括內分泌因子。
  45. 如請求項42之製劑，其中該等產物包括鄰分泌因子。
  46. 如請求項42之製劑，其中該等產物包括囊泡。
  47. 如請求項46之製劑，其中該等囊泡包括微囊泡。
  48. 如請求項46之製劑，其中該等囊泡包括外切體。
  49. 如請求項46之製劑，其中該等囊泡包括選自由旁分泌因子、內分泌因子、鄰分泌因子及RNA組成之群的分泌性產物。
  50. 一種如請求項1至49中任一項之製劑用於製備藥劑之用途，其中該藥劑用於治療需要其之受檢者，其中該受檢者正在經歷或已經經歷器官相關性疾病之一或多種跡象、症狀或其他指標，且其中該器官相關性疾病選自腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷。
  51. 如請求項50之用途，其中該治療為器官相關性疾病之穩定及/或改良。
  52. 如請求項51之用途，其中該欲穩定及/或改良的器官相關性疾病選自腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷。
  53. 如請求項50之用途，其中該治療為器官相關性疾病之預防。
  54. 如請求項53之用途，其中該欲預防的器官相關性疾病選自腎病、貧血症、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎絲球過濾缺陷。
TW100141139A 2010-11-10 2011-11-10 治療製劑 TWI607757B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41238310P 2010-11-10 2010-11-10
US201161474278P 2011-04-12 2011-04-12
US201161550184P 2011-10-21 2011-10-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201304787A TW201304787A (zh) 2013-02-01
TWI607757B true TWI607757B (zh) 2017-12-11

Family

ID=45217618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100141139A TWI607757B (zh) 2010-11-10 2011-11-10 治療製劑

Country Status (12)

Country Link
US (2) US9724367B2 (zh)
EP (2) EP4403197A3 (zh)
JP (1) JP6054299B2 (zh)
KR (4) KR102302069B1 (zh)
CN (2) CN103298498B (zh)
AU (7) AU2011326767B2 (zh)
CA (2) CA3065694A1 (zh)
DK (1) DK2637711T3 (zh)
ES (1) ES2981183T3 (zh)
HK (1) HK1249451A1 (zh)
TW (1) TWI607757B (zh)
WO (1) WO2012064369A1 (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI690320B (zh) 2010-05-12 2020-04-11 開曼群島商英瑞金公司 生物活性腎細胞
CA3065694A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Inregen Methods of forming injectable formulations for providing regenerative effects to an organ such as a kidney
WO2017117229A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Wake Forest University Health Sciences Tissue-engineered gut-sphincter complexes and methods of making the same
US11311367B2 (en) 2012-01-31 2022-04-26 Wake Forest University Health Sciences Tissue-engineered gut-sphincter complexes and methods of making the same
AU2013334276B2 (en) * 2012-10-24 2019-07-04 Prokidney Renal cell populations and uses thereof
DK2994528T3 (da) * 2013-05-08 2024-02-05 Prokidney Organoider, der omfatter isolerede renale celler og anvendelser deraf
WO2014197747A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Exosomes for orofacial diagnostics and therapeutics
WO2015026326A1 (en) * 2013-08-20 2015-02-26 Wake Forest University Health Sciences Tissue repair devices utilizing self-assembled materials
US11833172B2 (en) 2015-11-25 2023-12-05 The Regents Of The University Of Colorado Use of microRNA-146A and nanoceria conjugate to improve wound healing and promote tissue regeneration
CN105400893A (zh) * 2015-12-24 2016-03-16 北京泱深生物信息技术有限公司 椎间盘退行性病变miRNA标志物
KR20190065245A (ko) * 2016-07-29 2019-06-11 디팍 자인 만성 신장 질환의 치료를 위한 생체활성 신장 세포
US11123372B2 (en) 2016-07-29 2021-09-21 Prokidney Bioactive renal cells for the treatment of chronic kidney disease
CN106399473B (zh) * 2016-08-23 2019-12-06 南京大学 检测和评价力量训练效果的miRNA标志物或其组合及其应用
WO2018183199A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Deepak Jain Injectable cell and scaffold compositions
CN108310463B (zh) * 2018-02-08 2020-10-23 中山大学附属第一医院 一种3d打印生物墨水及其制备方法
CN108452378B (zh) * 2018-02-08 2020-10-23 中山大学附属第一医院 一种3d生物打印成型方法
US20210386786A1 (en) * 2018-08-31 2021-12-16 Timothy A. Bertram Compositions comprising cell-delivered vesicles and uses thereof
US20220016316A1 (en) * 2018-11-16 2022-01-20 Wake Forest University Health Sciences Methods of bioengineering internal anal sphincter constructs
CA3137915A1 (en) * 2019-05-02 2020-11-05 Timothy Bertram Treatment of kidney disease in subjects with kidney and/or urinary tract anomalies
CN110639052B (zh) * 2019-09-30 2021-06-29 新乡医学院 一种促进创面愈合的复合凝胶体系及其制备方法和应用
EP4179088A1 (en) * 2020-07-10 2023-05-17 Société des Produits Nestlé S.A. Nutritional composition comprising mir-3141
CN112760376B (zh) * 2020-12-30 2021-12-07 陈晓熠 miRNA-3918在非小细胞肺癌检测中的应用
PT118103A (pt) * 2022-07-13 2024-01-15 Univ Aveiro Biomaterial para imunomodulação, processo de produção e suas aplicações
CN116240161B (zh) * 2023-02-27 2024-05-10 四川大学华西医院 具有肾脏损伤修复作用的细胞外囊泡制备方法及应用
CN117860958B (zh) * 2024-01-10 2024-09-03 四川大学 基于章鱼喷墨式温敏抗菌型的敷料及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002600A1 (en) * 1998-07-10 2000-01-20 Encelle, Inc. Method of obscuring immune recognition
US6365385B1 (en) * 1999-03-22 2002-04-02 Duke University Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells
WO2010056328A1 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Tengion, Inc. Isolated renal cells and uses thereof

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6045849B2 (ja) 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
SE464816B (sv) * 1985-10-15 1991-06-17 Nilsson Kjell Makroporoesa partiklar, foerfarande foer dess framstaellning och dess anvaendning
PT83746B (pt) * 1985-11-15 1988-08-17 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos biocatalisadores imobilizados e para a producao de etanol por fermentacao
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5032508A (en) 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US4769037A (en) 1986-10-28 1988-09-06 Midcalf Robert J Artificial replacement kidney implant and method of dialyzing blood
JPS63174934A (ja) * 1987-01-13 1988-07-19 Green Cross Corp:The ウロキナ−ゼ前駆体乾燥製剤
GB8722854D0 (en) 1987-09-29 1987-11-04 Hardy S M Implantable artificial kidney
US5085629A (en) 1988-10-06 1992-02-04 Medical Engineering Corporation Biodegradable stent
WO1990012604A1 (en) 1989-04-25 1990-11-01 Vacanti Joseph P Method for implanting large volumes of cells on polymeric matrices
US4996154A (en) 1989-05-04 1991-02-26 Millipore Corporation Method for growing cellular tissue
CN1014677B (zh) 1990-02-10 1991-11-13 北京市东风制药厂 止鼾药的制备方法
CA2046830C (en) 1990-07-19 1999-12-14 Patrick P. Deluca Drug delivery system involving inter-action between protein or polypeptide and hydrophobic biodegradable polymer
AU666118B2 (en) * 1991-04-25 1996-02-01 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
WO1993007913A1 (en) 1991-10-24 1993-04-29 Children's Medical Center Corporation Neomorphogenesis of urological structures in vivo from cell culture
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US5549674A (en) 1992-03-02 1996-08-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions of a bioartificial kidney suitable for use in vivo or ex vivo
US5429938A (en) 1992-03-02 1995-07-04 University Of Michigan Methods and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US6060270A (en) 1992-03-02 2000-05-09 The University Of Michigan Methods and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US6410320B1 (en) 1992-03-02 2002-06-25 The University Of Michigan Method and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US6283761B1 (en) 1992-09-08 2001-09-04 Raymond Anthony Joao Apparatus and method for processing and/or for providing healthcare information and/or healthcare-related information
US5545131A (en) 1994-04-28 1996-08-13 White Eagle International Technologies, Lp Artificial kidney
US5916790A (en) 1995-03-03 1999-06-29 Metabolex, Inc. Encapsulation compositions, and methods
PT814778E (pt) 1995-03-10 2001-11-30 Roche Diagnostics Gmbh Formas de administracao farmaceuticas contendo polipeptidos sob a forma de microparticulas e processo para a sua preparacao
US6129761A (en) 1995-06-07 2000-10-10 Reprogenesis, Inc. Injectable hydrogel compositions
US6673339B1 (en) 1996-09-05 2004-01-06 Children's Medical Center Corporation Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
US5952226A (en) 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
US5854006A (en) 1997-03-28 1998-12-29 The University Of Virginia Gamma-glutamyl transpeptidase-specific antibody, prodrugs for the treatment of gamma-glutamyl transpeptidase-expressing tumors, and methods of administration thereof
US6224893B1 (en) 1997-04-11 2001-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Semi-interpenetrating or interpenetrating polymer networks for drug delivery and tissue engineering
US20020012961A1 (en) * 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
WO1999022781A2 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Children's Medical Center Corporation Bladder reconstruction
DE69921636T2 (de) 1998-04-20 2005-11-03 Genzyme Corp., Cambridge Medikamentöse verabreichung von proteinen aus polymergemischen
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
PL193824B1 (pl) * 1998-12-23 2007-03-30 Idea Ag Preparat zawierający środki penetrujące, sposób wytwarzania preparatu zawierającego środki penetrujące oraz zastosowanie preparatu do wytwarzania leku
PL360581A1 (en) 1999-05-11 2004-09-06 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling of erythropoietin administration
US20040167634A1 (en) 1999-05-26 2004-08-26 Anthony Atala Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
KR100369788B1 (ko) 1999-09-03 2003-01-29 동아제약 주식회사 재조합 인간 에리트로포이에틴의 제조방법
US6376244B1 (en) 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
US6479064B1 (en) 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
CO5271709A1 (es) * 2000-01-12 2003-04-30 Pfizer Prod Inc Composiciones y procedimientos para el y tratamiento de afecciones que responden a estrogenos
WO2001092322A1 (fr) 2000-05-26 2001-12-06 Coletica Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
US6689807B1 (en) * 2000-06-08 2004-02-10 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. HMG CoA reductase inhibitors for promoting angiogenesis
US6991652B2 (en) * 2000-06-13 2006-01-31 Burg Karen J L Tissue engineering composite
US7326570B2 (en) 2000-06-16 2008-02-05 The Regents Of The University Of California Induction of tubular morphogenesis using pleiotrophin
DE60133744T2 (de) 2000-07-28 2009-05-14 Anika Therapeutics, Inc., Woburn Bioabsorbierbare kompositmaterialien aus derivatisierter hyaluronsäure
JP4249482B2 (ja) 2000-10-30 2009-04-02 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 腎機能を改良するための組成物及び方法
WO2002061053A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 The General Hospital Corporation Renal stem cells and uses thereof
GB0115320D0 (en) * 2001-06-22 2001-08-15 Univ Nottingham Matrix
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
AU2002340463A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 Children's Medical Center Corporation Augmentation of organ function
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
MXPA04009234A (es) 2002-03-22 2005-01-25 Kissei Pharmaceutical Agente preventivo o terapeutico para enfermedades renales.
US8084424B2 (en) 2003-04-09 2011-12-27 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods related to erythropoietin
JP5059406B2 (ja) * 2003-08-29 2012-10-24 メイヨ フオンデーシヨン フオー メデイカル エジユケーシヨン アンド リサーチ 生分解性スカフォールド類製造用ヒドロゲルポロゲン類
CN1989236B (zh) * 2004-05-18 2012-05-16 澳大利亚核科学技术组织 膜生物反应器
DE102004041340A1 (de) 2004-08-20 2006-02-23 Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag Nanopartikel und Verfahren zu deren Herstellung
JP5519108B2 (ja) * 2004-10-25 2014-06-11 セルラント セラピューティクス，インコーポレイティド 骨髄細胞集団の増殖方法及びその使用
US8716220B2 (en) * 2005-09-07 2014-05-06 Nikolaos Tezapsidis Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amyloid beta
US20070128174A1 (en) 2005-09-21 2007-06-07 Kleinsek Donald A Methods and compositions for organ and tissue functionality
DE102005057106A1 (de) * 2005-11-25 2007-06-06 Cytonet Gmbh & Co. Kg Kryokonservierung von Hepatocyten
CA2641733C (en) * 2006-02-10 2015-03-31 Tengion, Inc. Scaffolds for organ reconstruction and augmentation
EP2422798A3 (en) * 2006-03-07 2013-03-06 Geeta Shroff Compositions comprising human embryonic stem cells and their derivatives, methods of use, and methods of preparation
US10500230B2 (en) 2006-10-12 2019-12-10 DePuy Synthes Products, Inc. Kidney-derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration
US20080103606A1 (en) * 2006-10-30 2008-05-01 Cory Berkland Templated islet cells and small islet cell clusters for diabetes treatment
US8784893B2 (en) 2007-02-05 2014-07-22 Carbylan Therapeutics, Inc. Polymer formulations for delivery of bioactive agents
SE531318C2 (sv) * 2007-02-22 2009-02-24 Tigran Technologies Ab Publ Injicerbar suspension innefattande titan-,titanlegerings- eller titanoxidpartiklar av mikrostruktur
US10590391B2 (en) 2007-06-08 2020-03-17 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
EP2162529B1 (en) 2007-06-08 2019-03-27 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
CN101338036B (zh) * 2007-07-06 2010-11-03 常州百瑞吉生物医药有限公司 生物相容快速凝胶化水凝胶及其喷雾剂的制备方法
DE102007040370B4 (de) * 2007-08-20 2011-06-16 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Kollagenhaltiger Zellträger
CN100577204C (zh) * 2007-11-30 2010-01-06 中国兽医药品监察所 用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法
SG10201609507TA (en) 2008-02-01 2017-01-27 Gen Hospital Corp Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
KR20110076918A (ko) * 2008-09-10 2011-07-06 제넨테크, 인크. 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법
EP3461507A1 (en) 2008-11-04 2019-04-03 inRegen Cell-scaffold constructs
WO2010057015A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Wake Forest University Health Sciences Kidney structures and methods of forming the same
US9393267B2 (en) 2009-02-19 2016-07-19 University Of Southern California Gel delivery system for tissue repair
CN101828937A (zh) * 2009-03-13 2010-09-15 王影 一种利用组织工程脂肪再生技术进行整形美容的方法
US8402966B2 (en) 2009-08-14 2013-03-26 Scott Technologies, Inc. Air purifying respirator having inhalation and exhalation ducts to reduce rate of pathogen transmission
CN103025361B (zh) 2010-05-03 2016-05-25 再生医学Tx有限责任公司 平滑肌细胞结构
TWI690320B (zh) 2010-05-12 2020-04-11 開曼群島商英瑞金公司 生物活性腎細胞
WO2011156642A1 (en) 2010-06-11 2011-12-15 Tengion, Inc. Erythropoietin-expressing adipose cell populations
CA3065694A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Inregen Methods of forming injectable formulations for providing regenerative effects to an organ such as a kidney

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002600A1 (en) * 1998-07-10 2000-01-20 Encelle, Inc. Method of obscuring immune recognition
US6365385B1 (en) * 1999-03-22 2002-04-02 Duke University Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells
WO2010056328A1 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Tengion, Inc. Isolated renal cells and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adhirajan N. et al., Gelatin microspheres cross-linked with EDC as a drug delivery system for doxycyline: development and characterization. J Microencapsul. 2007 Nov;24(7):647-59. *
Goh F. et al., Limited beneficial effects of perfluorocarbon emulsions on encapsulated cells in culture: experimental and modeling studies. J Biotechnol. 2010 Oct 15;150(2):232-9. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.08.013. Epub 2010 Sep 8. *
Huaping Tan et al., Injectable, Biodegradable Hydrogels for Tissue Engineering Applications, Materials 2010, 3, 1746-1767; doi:10.3390/ma3031746. *
Mojgan Zandi, Studies on the Gelation of Gelatin Solutions and on the Use of Resulting Gels for Medical Scaffolds, Dokument erstellt am: 11.03.2008. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024205710A1 (en) 2024-08-29
KR102056324B1 (ko) 2019-12-16
CN107823706B (zh) 2022-02-01
KR101913874B1 (ko) 2018-10-31
KR102238108B1 (ko) 2021-04-12
AU2017232058A1 (en) 2017-10-12
AU2022275395A1 (en) 2023-01-05
CN107823706A (zh) 2018-03-23
EP2637711B1 (en) 2024-03-27
KR102302069B1 (ko) 2021-09-14
HK1249451A1 (zh) 2018-11-02
CA3065694A1 (en) 2012-05-18
CA2817206A1 (en) 2012-05-18
AU2019203167A1 (en) 2019-05-30
ES2981183T3 (es) 2024-10-07
WO2012064369A1 (en) 2012-05-18
JP6054299B2 (ja) 2016-12-27
EP4403197A2 (en) 2024-07-24
JP2014502261A (ja) 2014-01-30
AU2011326767A1 (en) 2013-05-30
KR20210040468A (ko) 2021-04-13
AU2022275395B2 (en) 2024-05-16
US20170368102A1 (en) 2017-12-28
CN103298498A (zh) 2013-09-11
EP2637711A1 (en) 2013-09-18
DK2637711T3 (da) 2024-07-01
AU2016202836A1 (en) 2016-05-26
CA2817206C (en) 2020-03-10
AU2019203167B2 (en) 2020-11-05
KR20180119701A (ko) 2018-11-02
EP4403197A3 (en) 2024-10-09
AU2020260482B2 (en) 2022-09-01
AU2020260482A1 (en) 2020-11-26
KR20130140061A (ko) 2013-12-23
CN103298498B (zh) 2017-12-08
US9724367B2 (en) 2017-08-08
KR20190139346A (ko) 2019-12-17
US20130330364A1 (en) 2013-12-12
AU2011326767B2 (en) 2016-02-11
TW201304787A (zh) 2013-02-01
AU2017232058B2 (en) 2019-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022275395B2 (en) Injectable formulations for organ augmentation
TWI542690B (zh) 生物活性腎細胞