TWI437097B - 可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞 - Google Patents

Description

可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞

本發明是提供一種可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，可作為臨床上細胞療法或基因療法等的實驗工具。

骨髓中含有一些幹細胞具有可分化成為多種組織的能力，稱為間葉(mesenchymal)或間質(stromal)幹細胞，這些紡垂狀的聚落形成纖維母細胞(colony forming unit-fibroblast,CFU-F)，在體內處於休眠狀態，在體外經適當刺激則可進入細胞週期。間葉幹細胞具有多種潛能，使得這些細胞可作為臨床上細胞療法或基因療法等的工具。

人類的成體幹細胞在臨床治療疾病上已多有臨床應用實例，例如以骨髓移植治療血液及免疫系統的疾病及重建接受癌症化學治療病患的整體造血與免疫系統、同種異體或異種間葉幹細胞局部注射或是經由血液循環治療心肌梗塞(myocardial infarction)、急性腎臟損傷、皮膚傷口、黏多糖症、再生性不良貧血、移植對抗宿主症(graft-vs-host disease,GVHD)、糖尿病、腦部缺血性中風、母腹中胎兒之先天性疾病如肌肉萎縮症或成骨不全症等疾病之治療或改善。

間葉幹細胞除了做為疾病的直接治療劑外，亦可用於基因療法，即利用腺病毒或反轉錄病毒將欲攜帶之基因轉染入間葉幹細胞之基因組，藉由其遷移至特定的組織或器官之特性以治療癌症或遺傳性疾病。例如將貝它干擾素(interferon beta)轉染入人類之間葉幹細胞，並植入具有惡性腫瘤之大鼠，抑制癌細胞生長；以經基因修飾的細胞與間葉幹細胞融合，再植入自體的組織中進行修復及治療，或做為治療用之蛋白質治療藥劑的傳輸工具，藉其在體內遷移至特定位置之特性，將易被體內免疫系統破壞的蛋白質藥物傳遞到作用位置，以增加其療效。

豬是除了非人類靈長類之外，最適用於人類生物醫學研究模式之實驗動物，然而在豬成體幹細胞之研究過程中，常遭遇幹細胞經過誘導分化及移植後，不易取得明確證據來證實新生組織確實是由外源幹細胞分化所生成。此外，成體幹細胞應用於再生醫學的研究常面臨的問題包括細胞經螢光報導基因轉染及後續繼代篩選後之表現螢光蛋白質之變化型式、細胞移植治療之數量不足及分化潛能改變等，且報導基因轉染後之成體幹細胞，經擴增三至五次後，其螢光蛋白質表現不一致，且發生短暫性表現之狀況，即使部分細胞持續表現螢光蛋白質，其分化潛能將隨細胞擴增之次數增加而下降，以此幹細胞進行細胞治療之效果及可應用治療或移植之細胞數量將大受限制。

本發明之目的，即在提供一種可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，作為人類再生醫學研究模式之工具。

本發明一方面提供一種可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，其係將螢光報導基因嵌入早期豬胚原核之染色體中，並進行胚移置，以產生全身性表現螢光蛋白質之基因轉殖豬，再自所得表現螢光蛋白質之基因轉殖豬螢光豬的骨髓中，分離一致及持續性表現螢光蛋白質之成體幹細胞，進一步純化取得骨髓間葉幹細胞。

本發明另一方面提供一種實驗平台系統，其係利用本發明可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，供再生醫學研究之用。

本發明之一實施例中，該螢光蛋白質為綠色螢光蛋白質。

本發明提供一種可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞。為克服現有再生醫學研究平台中不易確認是否新生組織確實是由外源幹細胞分化所生成，而利用螢光報導基因轉染細胞已以區分。但一般螢光報導基因轉染細胞及後續繼代篩選後之細胞，往往不能穩定表現螢光蛋白質，且轉染細胞所得數量有限，實驗往往受制等缺點，利用發明人員已建置之轉殖基因螢光豬技術，進一步發展可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，可持續提供大量之生物組織材料供再生醫學研究實驗。

根據本發明，可依已知之基因轉殖動物的標準程序或技術，將螢光報導基因嵌入早期豬胚原核之染色體中，並進行胚移置，以產生全身性表現螢光蛋白質之基因轉殖豬。並依已知程序或技術，自骨髓中分離一致及持續性表現螢光蛋白質之成體幹細胞，進一步純化取得骨髓間葉幹細胞。

參照下列具體實施例可更具體地說明本發明之特徵，此等具體實施例係本發明之例證而非限制。

實施例1、基因轉殖豬之產製

試驗豬隻之超級排卵與發情同情化處理，本試驗供胚與受胚用之雜交品系新母豬(gilts)，係採用6月齡以上已屆性成熟者。試驗用供胚與受胚母豬，均經律期媒(Regument,Intervet)以20 mg/day的量連續餵飼14~18天，以達到豬隻發情同期化處理，供胚豬與受胚豬於餵飼律期媒後第14或18天'於24小時內進行肌肉注射孕馬血清激素(pregnant mare’s serum gonadotropin,PMSG；中國化學製藥)且在注射PMSG後80小時，再予於肌肉注射人類絨毛膜激性腺素(human chorionic gonadotropin,hCG；中國化學製藥)，俾誘發其產生超級排卵反應；受胚豬與供胚豬其PMSG注射單位分別為1750 IU與1000 IU；hCG為1000 IU與500 IU。受胚豬於hCG注射後28~30小時內予於行第一次人工授精，並於hCG注射後38小時再進行第二次人工授精。此等供胚豬在hCG注射後之55小時屆已發育至原核階段；選擇此一時期進行腹中線外科手術，並從繖部沖洗輸卵管將豬胚悉數收集，俾進行基因顯微注射用。原核胚之收集與處理，經外科手術所收集原核胚置於含有1 ml DPBS之eppendrof中，以12000 rpm之離心速度予於離心10分鐘，將脂肪油滴離至一邊使原核位置顯露以利進行基因顯微注射(圖1)。注射用之外源基因，試驗中用來進行顯微注射用之外源之DNA係由台灣動物科技研究所李坤雄博士所提供含pCX-EGFP之Escherichia coli冷凍菌液，該質體經由限制酶Sal Ⅰ與HindⅢ截切後，唯一含巨細胞病毒強子(cytomeglavitus immediated-early enhancer,CMV-IE enhancer)，雞β-肌動蛋白啟動子(chicken beta-actin promoter)，一段β-肌動蛋白介入子(beta-actin intron)序列，綠色螢光蛋白互補DNA序列(enhance green fluorescent protein complementary DNA,EGFP cDNA)，以及兔子β-球蛋白多腺苷酸(rabbit β-globin ploy(A))之長度約3 kb線型DNA片段(圖2)，於進行顯微注射前，令其濃度為1 ng/μl並以12000 rpm之離心速度離心10分鐘。全體業經DNA注射後豬胚，其外觀仍保有緻密卵黃質且形態完整者，移置經發情同情化處理後至原核階段之受胚母豬二側輸卵管中；每側輸卵管被移置之胚數，平均為10~15不等。

實施例2、基因轉殖豬之分析及選育

自實施例1方法產製得轉殖基因豬胚所產生的仔豬，先用激發光(optima CL-150B,天亞)並配合黃色濾片進行初步篩選動作，再剪取其耳朵之組織，抽取其中之基因組DNA，俾供分析該外源基因在基因組DNA中之嵌插情形。組織基因組DNA之抽取，將前述剪取之組織樣品，置於630 ul之組織分解緩衝液【lysis buffer: 100 mM Tris‧HCl(Amresco,USA)pH 8.5,5 mM EDT(SIGMA,USA)、200 mM NaCl(SIGMA,USA)】,加入70 ul 10% sodium dodecyl sulfate(SDS,MERCK,Germany),及35 ul之100 mg/ml proteinase K(Qiagen,Germany)中，經剪碎並充分混合後，置於55℃水浴槽內作用overnight，然後以12,000 x g離心10 min俾除去毛髮與組織殘渣，再依序以等量之酚(phenol,Amresco,USA)、及氯仿(chloroform,MERCK,Germany)等，共萃取兩次經離心分層後(12000 rpm,10 min)取上清液，並加入1 ml之isopropenol沈澱DNA，最後加入1 ml 70%酒精(absolute ethanol, MERCK,Germany)清洗DNA，並將其溶於EB緩衝液中，並取少量DNA溶液進行迷你膠體電泳分析，確認萃取之DNA品質。出生仔豬基因組DNA之Southern-blot(南方墨點法)分析，所使用之探針，為利用經由PCR擴增EGFP cDNA序列上417片段為模板(2~25 ng/45μl)，經沸水變性後置於冰上10 min，而後加入核酸引子標定套組(rediprime II random prime labeling system,Amersham Pharmacia Biotech.,UK)與50μCi之32p-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech.,UK)後，於37℃培養1小時，利用Quick Spin Columns(Roche,Germany)純化套組去除未標定之放射線及酵素等物質。取用業經EcoR Ⅰ截切後之各出生仔豬基因組DNA，分別置於洋菜膠體先進行電泳處理，並經去嘌呤作用(depurination;0.25 N HCl(MERCK,Germany),15 min)後，待bromophenol blue染劑自藍色轉為黃色後，再將洋菜膠浸泡於變性溶液【denaturing solution;1.5 M NaCl(MERCK,Germany),0.5 M NaOH(MERCK,Germany)】，同時架設向下轉漬之鹽橋。經過2.5~4hr之轉漬作用，將業經轉印DNA之帶正電尼龍膜(Hybond-N+,Amersham Pharmacia Biotech.,UK)，置於2×SSC溶液(Amresco,USA)進行中和反應及去除殘留之洋菜膠體，而後直接進行前雜合(pre-hybridazation)及雜合(hybridazation)反應。前雜合反應，係先將帶正電尼龍膜置於雜合試管(hybridization tube,Schotte,Germany)內，並加入溶解之前雜合溶液【組成分為：2×SSC,1% SDS,0.5%脫脂乳粉(fat-free milk powder,安佳，台灣),及0.75/ml經變性之鮭魚精子DNA(salmon sperm DNA,SIGMA,USA)】中，並令其在62℃雜合培養箱(PersonalHyb hybrization oven,Stratagene,USA)內反應2~5 h後，再移入雜合溶液【組成分為：2×SSC,1% SDS,0.5%脫脂乳粉(fat-free milk powder,安佳，台灣),0.5mg/ml經變性之鮭魚精子DNA(salmon sperm DNA,SIGMA,USA)及10% dextran sulfate (Amresco,USA)】，並額外添加上述業經標定具有放射性標幟之DNA探針，並置於62℃水浴槽中進行16~24 h之DNA雜合反應。完成雜合反應之NC膜先於室溫下使用含0.1% SDS及2 x SSC之清洗溶液清洗兩次，每次各清洗10 min，再使用含0.1% SDS及0.1 x SSC之清洗溶液，於55℃清洗兩次各20 min，最後取出膜，經風乾後再以影像處理系統(Typhoon 9200,Amersham Bioscience,UK)進行自動放射顯影(autoradiography)，俾藉由ImageQuant軟體進行判讀分析。

選育出具有表現綠色螢光蛋白質特性之轉殖基因豬，飼養於傳統畜舍，提供充足之豬專用飼糧及乾淨飲水，並定期清潔。豬舍維持良好之通風與空氣之清新。

本實施例經由體內成熟及受精並由外科手術所取得豬胚總計339個，並完成278個處於原核時期豬胚之顯微注射，其中265個業經顯微注射pCX-EGFP外源基因後，經胚移置於8頭代理孕母之輸卵管中，共計4頭受胚母豬懷孕並順利生下36頭仔豬，近一步利用波長475 nm藍色激發光並配合黃色綠片於暗處照射下，36頭仔豬中其中有3頭仔豬表現綠色螢光，分別為編號84-1、64-8及64-9，且於自然光下3頭仔豬其眼球、腳蹄與鼻鏡跟正常豬相比呈現明顯黃色外觀。利用3頭仔豬之基因組DNA各15 μg為基因組模版，以EcoR Ⅰ酵素進行截切，再以EGFP cDNA序列上417片段為探針進行南方墨點法分析，結果證實該3頭仔豬確實帶有pCX-EGFP基因，以下稱為螢光豬。同時進一步觀察，本實施例產製帶有綠色螢光蛋白之轉殖基因豬(螢光豬)所有的組織器官皆表現大量之綠色螢光蛋白包括：肋骨，腎，心，肌肉，肝，腦，眼睛，睪丸，肺，腸，舌頭，陰莖，如圖3所示。

實施例3、骨髓間葉幹細胞之取得

本時實施例以抽取骨髓的方式取得骨髓細胞，以密度梯度離心法(Ficoll paque)進行纯化。

自由實施例2方法選育出之螢光豬的股骨抽取骨髓液，隨即以70μm之篩網過濾，並分裝為每管5 mL，分裝之骨髓液經離心(1200 X rpm,10 min)後，去除上清液，並加入10 mL之培養液(αMEM,SigmaM0894 USA;20% FBS,Hyclone USA;Pen/Str,Gibco15140-122 USA)打散細胞塊，取5 mL的骨髓細胞懸浮液緩慢沿離心管壁加入裝有6 mL之0.012 ng/mL之Ficoll-Paque^TM PLUS(Amersham,Sweden)，將加好Ficoll-Paque^TM PLUS的骨髓細胞懸浮液離心1700 X rpm,20 min。離心速度梯度為400 X rpm開始，並每隔30 sec往上調200 X rpm直到達1000 X rpm。此時再每隔1 min後增加200 X rpm，直到達1700 X rpm為止，並繼續離心20 min。離心後之骨髓細胞懸浮液可以分成四層，從上往下分別為血漿層、渾濁白色MSCs與白血球等之混合細胞層、透明Ficoll-Paque^TM PLUS層、紅血球層。先吸去血漿層，再將白色渾濁的MSCs與白血球等之混合細胞層吸入含有5 ml培養液的15 ml tube中。以1200 X rpm離心5 min並去除上清液，重複此步驟2次。最後取2 ml培養液將細胞塊打散，放置於3.5 cm培養皿內培養72 hr。之後再去除懸浮的未貼附細胞，即為純化之螢光豬骨髓間葉幹細胞。

實施例4、骨髓間葉幹細胞性質研究

而目前為止豬間葉幹細胞並無專一性的標誌來檢測，因此使用不同抗體CD4a、CD31、CD44、CD90與CD29，藉由流式細胞儀來鑑定螢光豬幹細胞之純度。方法如下。

(1)　間葉幹細胞的培養與保存

間葉幹細胞為貼附型之細胞，所以當細胞增殖至飽和(100% confluence)時，必須進行繼代或冷凍保存。進行繼代時先移除培養液，並用不含胎牛血清之培養液清洗，以去除殘留之胎牛血清，爾後加入0.25%之trypsin-EDTA(Gibco 25200 USA)，放入37℃培養箱培養5 min，待細胞漂離培養皿底，再使用含有胎牛血清之培養液重新懸浮細胞，並以1200 X rpm離心5 min，並去除上清液。將小鼠MSCs以1:2或豬MSCs以1:3比例將細胞重新植入新的培養皿中。當細胞進行冷凍保存時，則將細胞顆粒懸浮於含有10%之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO,Sigma D2650 USA)之培養液中，旋即置入液態氮儲存之。

(2)　細胞計數

吸取50 μl之懸浮細胞與錐藍(trypan blue,Gibco 15250-061 USA)混合均勻染色之，將染色後之細胞液滴在上蓋玻片之血球計數器(hemocytometer)上，在顯微鏡下計數不被染成藍色之活細胞，經換算後，以此數據代表總細胞數。

(3)　流式細胞儀-表面抗原分析(flowcytometry)

培養中的MSCs，將其培養液去除後以PBS沖洗兩次，並以trypsin-EDTA懸浮後取下，將細胞懸浮液以1200 X rpm離心5 min。吸去培養液後，使用washing buffer(49.5 mL PBS+0.5 mL FBS)清洗，取10 ml washing buffer使細胞塊重新懸浮，並以1200 X rpm離心5 min。將檢測欲使用之抗體(BD,USA)與細胞混合(5x10⁵ cells/100 μL)。檢測之抗體分別為CD11b-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD166-PE、CD133-PE、CD117-PE、CD31-PE、CD86-PE、CD29-PE、CD44-PE、MHC-II-PE、MHC-I-PE及Sca-1-PE於小鼠之間葉幹細胞。CD4a-PE、CD31-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD29-PE於豬之間葉幹細胞。將離心管以鋁薄紙包裹避光，並放入4℃培養30 min。之後加入500 μl washing buffer重新懸浮，在2000 X rpm離心5 min。同樣的步驟重複兩次。將去除上清液之細胞塊加入500μl之fixing buffer(48.1mL PBS+0.5 mL FBS+1.35 mL formaldehyde)懸浮後即進行流式細胞儀分析(FACS scan flow cytometer Becton-Dickinson)。

其中CD4a為免疫球蛋白表現之標誌，CD31為內皮細胞、纖維母細胞、血小板、吞噬細胞、T淋巴球與自然殺手細胞等表現的標誌，因此豬之間葉幹細胞不表現此標誌。而CD44與CD29為細胞遷移、貼附的標誌，CD90為一般幹細胞均表現之標誌，因此豬之間葉幹細胞表現此標誌。由此可知，利用密度梯度離心法(Ficoll paque)並藉由以上抗體之確認後，間接證實可得到纯化之綠色螢光骨髓間葉幹細胞(圖4)。

實施例5、遷移測定試驗(Wound and Healing Assay)

為確認螢光豬間葉幹細胞帶有綠色螢光基因是否會影響其遷移與分化的能力而進行了體外細胞之傷口與修復之試驗(Wound and healing assay)。此方法為根據Faber-Elman氏等(1996)及Schmidt氏等(2006)兩研究團隊所使用的步驟，操作如下：將間葉幹細胞培養於10cm培養皿中，至90% confluence時，使用P 200(200μl) tip劃上一條線，每隔一段時間測定期遷移之情形。

結果顯示經過28小時，帶有綠色螢光之豬與正常豬之間葉幹細胞其遷移增殖能力是無顯著差異的。且比較繼代次數第2代及第13代之遷移與分化的能力，結果顯示出繼代次數不同之細胞皆不影響其遷移增殖能力。且正常豬之間葉幹細胞、帶有綠色螢光豬之第二代間葉幹細胞與帶有綠色螢光豬之第十三代間葉幹細胞的骨分化能力是無顯著差異的。此結果顯示本螢光間葉幹細胞繼代至後期與初期細胞之增殖、遷移之能力為沒有差別是一致的(圖5及圖6)。

實施例6、螢光豬骨髓間葉幹細胞中胚層骨骼、脂肪及軟骨之分化

6.1　骨髓間葉幹細胞體外骨骼分化與檢測

6.1.1.　骨髓間葉幹細胞體外骨骼細胞分化誘導(osteogenesis)

把螢光豬之骨髓間葉幹細胞培養於6-well的plate中，至完全長滿(100% confluence)後24 hr，將培養液移除並加入骨骼細胞誘導培養液(α-MEM+10%FBS+0.1μM dexamethasone(Sigma D8893 USA)+10mM glycerol-2-phosphate(Sigma G9891 USA)+50μM ascorbate-2-phosphate(Sigma A0207 USA)，每3天更換一次骨骼細胞誘導培養液。

6.1.2.　鹼性磷酸酶(Alkaline phosphotase)檢測法

將完成誘導分化的MSCs自培養箱中取出，並吸除培養液，以PBS徹底清洗細胞後加入預冷之甲醇(-20℃)。將培養皿移入-20℃冰箱培養5 min。將甲醇去除並以去離子水洗淨。接著加入FAST BCIP/NBT溶液(Sigma B5655 USA)，在室溫下以輕微搖動的方式培養10 min。將呈色溶液吸除後以去離子水洗淨，再加入300 μl之去離子水保持細胞之濕潤並迅速移至顯微鏡下觀察並照相。最後以膠原蛋白(gelatin)+甘油(glycerol)之封膠液保存。

6.1.3. Alizarin Red S鈣離子染色法

以Alizarin Red S染色分析MSCs分化成骨骼細胞之鈣化，在分化後第21天，利用10% Formaldehyde在室溫下處理30 min來固定細胞，用PBS清洗3次後加入2% Alizarin Red S(Sigma A5533 USA)溶液，於使用之前先用ammonium hydroxide(Merck 8.22149 Germany)調整pH值到4.1~4.3。在室溫下進行染色20 min，以PBS將殘餘染劑徹底洗清後在顯微鏡下觀察。

6.2　骨髓間葉幹細胞體外脂肪分化與檢測

6.2.1.　骨髓間葉幹細胞體外脂肪細胞分化誘導(adipogenesis)

把螢光豬之MSCs培養於6-well的plate中，至完全長滿(100% confluence)後24 hr，將培養液移除並加入脂肪細胞誘導培養液(α-MEM+10%FBS+1μM dexamethasone(Sigma D8893 USA)+0.5 mM isobutyl-methyxanthine(Sigma G9891 USA)+10μg/ml insulin()+100μM indomethacin，每3天更換一次脂肪細胞誘導培養液。

6.2.2. Oil Red O檢測法

將完成誘導分化的MSCs自培養箱中取出，並吸除培養液，以PBS徹底清洗細胞後加入預冷之甲醇(-20℃)。將培養皿移入-20℃冰箱培養5 min。將甲醇去除並以去離子水洗淨。接著加入Oil Red O溶液在室溫下染色15 min，以PBS將剩下的Oil Red O洗除後可於顯微鏡下觀察細胞中被染色的油滴。

6.3.　間葉幹細胞體外軟骨分化與檢測

6.3.1.　間葉幹細胞體外軟骨細胞分化誘導(chondrogenesis)

把螢光豬之MSCs培養於6-well的plate中，至完全長滿(100% confluence)後24 hr，將培養液移除並加入軟骨細胞誘導培養液(α-MEM+1% FBS+6.25 μg/ml insulin+50 μM ascorbic acid+10 ng/ml TGF-β1(R＆D Systems,Mirmeapolis,MN,http://www.rndsystems.com),每3天更換一次軟骨細胞誘導培養液。

6.3.2. Toluidine blue檢測法

將完成誘導分化的MSCs自培養箱中取出，並吸除培養液，以PBS徹底清洗細胞後加入預冷之甲醇(-20℃)。將培養皿移入-20℃冰箱培養5 min。將甲醇去除並以去離子水洗淨。接著加入Toluidine blue溶液在室溫下染色15 min，以PBS將剩下的Toluidine blue洗除後可於顯微鏡下觀察細胞中被染色的軟骨細胞。

6.4.　結果

綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞體外分化分析中，硬骨細胞分化試驗顯示此間葉幹細胞培養於骨分化培養基中三個星期，發現有鈣結晶之沉澱，在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成硬骨細胞表現螢光蛋白，藉由鹼性磷酸酶(alkaline phospatase)檢測骨分化第十天與ARS染色檢測骨分化第二十一天發現有骨鈣離子的沉積。於軟骨細胞分化試驗中，於螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成軟骨細胞表現螢光蛋白。藉由Toluidine blue染色檢測軟骨分化組織切片micromass pellet顯示出glycosaminoglycan的表現。於脂肪細胞分化中，此間葉幹細胞培養於脂肪細胞分化培養基中三個星期有油滴之形成，且於螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成脂肪細胞表現螢光蛋白，藉由Oil Red O檢測脂質顆粒於細胞中。經由流氏細胞儀顯示此間葉幹細胞分化成造骨細胞、軟骨細胞與脂肪細胞仍表現大量螢光蛋白(圖7及圖8)。

實施例7、螢光豬骨髓間葉幹細胞跨胚層之分化

7.1　間葉幹細胞體外神經分化與檢測(外胚層)

把螢光豬之MSCs培養於6-well的plate中，至完全長滿(100% confluence)後24 hr，將培養液移除並加入神經細胞誘導培養液(α-MEM+0.5 mM isobutyl-methylxanthine(Sigma-Aldrich) and 10 μg/ml insulin(Sigma-Aldrich))每3天更換一次軟骨細胞誘導培養液。第九天分化成類神經細胞後，使用beta 3 tubulin做細胞免疫染色。

此螢光豬骨髓間葉幹細胞培養於類神經細胞分化培養基中三個星期，此分化後的類神經細胞持續表現螢光蛋白。藉由細胞免疫染色得知此類神經細胞表現beta 3 tubulin(圖9)。

7.2間葉幹細胞體外胰島素分泌細胞分化與檢測(內胚層)

取得6╳10⁶ 之EGFP-pMSCs後以0.25% Trypsin-EDTA(Gibco,25200,USA)作用。接種至直徑3.5 cm之ultra low cluster plate(Costar,COR3471,USA)中24小時。24小時後，於ultra low cluster plate中之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞將形成緊密球狀團塊。將業經形成球狀clumps之細胞團種於聚-D-離胺酸細胞外基質培養皿中。以上即可將螢光豬骨髓間葉幹細胞形成緊密之團塊。將此團塊種於αMEM+10 mM nicotinamide(Sigma,N0636,USA)+10 μM exendin-4(Sigma,E7144,USA)+2% B27 serum-free supplement(Invitrogen,17504-044,USA)+1% N2 serum-free supplement(Invitrogen,17502-048,USA)再添加glucose(Sigma,G7021,USA)至28.5 mM為誘導分化培養液。每3天更換一次軟骨細胞誘導培養液。

經純化之豬骨髓間葉幹細胞培養於加入誘導分化培養液後，於培養之第六天開始發現細胞型態逐漸改變，以細胞免疫螢光染色偵測分化細胞表現白蛋白(albumin)，此為肝細胞特定表現之標記，結果顯示分化後第十二天之細胞已具有表現albumin之特性(圖10)。因此確定豬骨髓間葉幹細胞於體外分化成肝細胞之潛能，且該細胞於分化後仍可穩定表現綠色螢光蛋白質，因此可供後續應用於體內追蹤試驗。

7.3　螢光豬間葉幹細胞體外肝臟分化與檢測(內胚層)將純化後之螢光豬骨髓間葉幹細胞調整其密度為5×10⁴ cells/cm² 培養於6-well plate中，以肝細胞誘導分化培養基(α-MEM+HGF(Peprotech 100-31)+FGF-4(Peprotech 100-39))刺激之，爾後每三天更換一次培養基，直到誘導分化後第12天。

以細胞團塊誘導培養螢光豬骨髓間葉幹細胞轉分化為胰島素分泌細胞之型態於其分化過程中綠色螢光蛋白持續之表現。利用細胞免疫染色偵測分化後(14天)之螢光豬骨髓間葉幹細胞表現胰島素蛋白質(圖11及圖12)。分化後之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞類胰島細胞相關轉錄因子與基因之表現包括Insulin，Glucagon，Glucokinase，Somatostatin，Pax6，Nkx6.1，Glut2.(圖13)。

實施例8、糖尿病鼠基因治療研究

8.1　細胞免疫染色(Immunocytochemistry)

將細胞以phosphate-buffered saline(PBS)潤洗後，取4% para-formaldehyde(Sigma,158127,USA)固定15分鐘。利用PBS洗三次(每次各5分鐘)後，加入PBST(內含0.25% Triton X-100之PBS)培養10分鐘，爾後再以PBS潤洗三次(每次各5分鐘)，加入內含1% BSA(Sigma,A7030,USA)之PBST以預防抗體非專一性雜合，再以利用含有1% BSA(Sigma,A7030,USA)之PBST稀釋後之第一級抗體polyclonal guinea pig anti-insulin(1:200)(Abcam,ab7842,USA)與polyclonal guniea pig anti-C-peptide(1:200)(Abcam,ab30477,USA)，於室溫培養1小時。再以PBS潤洗三次(每次各5分鐘)，爾後，加入二級抗體rodamine-conjucated anti-guinea pig IgG(1:200)(Abcam,ab6768,USA)與DAPI(1:1000)(Invitrogen,D3571,USA)於室溫培養1小時，隨後利用螢光顯微鏡觀察。

8.2　反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)

RNA由TRIZOL method(Ambion,AM9738,USA)萃取之，於每10 cm² 培養皿中加入3 ml之TRIzol reagent(Ambion,AM9738,USA)混勻後置於1.5 ml塑膠離心管。混勻後置於室溫5分鐘。爾後加入0.2 ml chloroform(Merck,1.02445.1000,USA)輕搖混勻15秒並置室溫3分鐘，再以12000 rpm於4℃離心15分鐘。離心後將可以得到RNA->Protein->DNA之分層，將上清液(RNA)置換到新的1.5 ml塑膠離心管，再加入0.5 ml Phenol(Merck,400 ml,0981,USA)/Chloroform(Merck,1.02445.1000,USA)mixture並搖勻後以12000 rpm於4℃離心15分鐘，重複此步驟以將蛋白質去除乾淨，再將上清液置於新的1.5 ml塑膠離心管中再添入0.5 ml Chloroform混勻後以12000 rpm於4℃離心15分鐘以將phenol(Merck,400 ml,0981,USA)去除乾淨。離心後將上清液置於新的1.5 ml塑膠離心管中，並加入0.6 ml isopropanol(Merck,1.09634.1000,USA)以將RNA沉澱下來，爾後置於室溫10分鐘，再以12000 rpm於4℃離心20分鐘。沉澱即為RNA pellet。將1 ml之75% ethanol加入pellet中，再以12000 rpm於4℃離心5分鐘。將沉澱物加入21 μl之DEPC-ddH₂ O回溶RNA沉澱。回溶後置於55-60℃ 5分鐘即用nanodrop測定濃度。取500 μg之total RNA於RNAse-free之離心管，加入1 μl之oligo(dT)20(50 μM)、1 μl 10 mM dNTP Mix(10 mM each dATP,dGTP,dCTP and dTTP at neutral pH)、並添加滅菌去離子水至總體積為13 μl，將其加熱至於65℃，5分鐘，爾後置於冰上1分鐘，添加4 μl5X First-Strand Buffer、1 μl0.1 M DTT、1 μl RNaseOUT^TM Recombinant RNase Inhibitor(40 units/μl)(Invitrogen,10777-019,USA)、與1 μl之SuperScript^TM III RT(200 units/μl)(Invitrogen,18080-093,USA)混勻後置於50℃，60分鐘，70℃，15分鐘。最終即cDNA，冷凍存放於-20℃冰箱中。PCR總反應體積為20 μl，內含去離子水5.5 μl，cDNA為1 μl，Primer(10 μM)(Forward+Reverse)共1μl、1 μl 10 mM dNTP Mix(10 mM each dATP,dGTP,dCTP and dTTP at neutral pH)(Invitrogen,18427-013,USA)、10X PCR Buffer(200 mM Tris-HCl(pH 8.4),500 mM KCl)2.0 μl、以及Taq DNA polymerase(5 U/μl)(Invitrogen,10966-018,USA) 0.2 μl、50 mM MgCl₂ 0.7 μl、cDNA(from first-strand reaction)1 μl、添加滅菌去離子水至總體積25 μl；以ABI 9700進行32-35 cycles，溫度設定為95 ℃-45秒、58 ℃-30秒、72-45℃秒，最後再以72 ℃鏈延長7分鐘(其中Insulin,Glucagon,Pax 6,Nkx 6.1,Somatostatin,Glut2,Glucokinase,GAPDH annealing溫度皆為58℃，而cycle數Pax 6為30，其餘皆35個cycle)。

8.3　皮下移植EGFP-pIPCs之試驗流程

誘發後產生高血糖之NOD/LtJ糖尿病鼠先以剃刀於背部除毛後以18G針頭，並將細胞置於500 μl bFGF(0.1mg/ml)，1 ml之針筒中。直接於背部以皮下移植入細胞，細胞包含以下：1.分化後源自於綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞轉分化之胰島素分泌細胞(EGFP-pIPCs)(6╳10⁶ )(n=6)。2. PBS(n=3)。3. EGFP-MSCs(6╳10⁶ )(n=3)。4.不處理之控制組(n=6)。植入後將傷口縫合，以待翌日觀察。

8.4　血糖之偵測與存活率之偵測

本試驗先紅外線燈將試驗小鼠照射30分鐘，增加體循環以觀察尾靜脈，再以30 G針頭以眼科夾彎曲成90度，採小鼠尾靜脈注射並取血液，爾後採用羅氏(ACCU-CHEK)血糖機，偵測血醣。於STZ處理後與細胞移植手術後每兩天偵測一次。其血糖偵測範圍10~600 mg/dL。於術後偵測血醣亦觀察糖尿病小鼠之存活率。

8.5　結果

將螢光豬骨髓間葉幹細胞以團塊結構種於poly-D-lysine coated(MW>300000)之培養皿配合無添加血清之high glucose differentiation medium(αMEM medium+B27 supplement+N2 supplement+28.5 mM glucose+10 mM Exedin-4+10 mM nicotinamide)，便開始分化，14日內遂可見細胞聚集成islet-like cluster。且對於源自螢光豬骨髓間葉幹細胞轉分化後類胰島素細胞之分子特徵則以RT-PCR技術證實胰臟特異性表現基因與轉錄因子(Insulin,Glucagon,Somatostatin,Glucokinase,Pax6,Nkx6.1,Glut2)均有表現，另外藉由細胞免疫染色技術亦證實分化後之後類胰島素細胞均可表現Insulin，此結果證實骨髓幹細胞所分化之β細胞能取代受損之β細胞，且具降低糖尿病小鼠體內之高血糖功能。因此利用本發明螢光豬骨髓間葉幹細胞為實驗平台，進行螢光豬骨髓間葉幹細胞轉分化為胰島素分泌細胞再以皮下埋殖技術驗證分化後之後類胰島素細胞於第一型糖尿病小鼠(NOD/LtJ)體內是否具有功能之研究。按照本實施例之胰島素分泌細胞分化平台，可於9天內得到足夠量之胰島素分泌細胞(6╳10⁶ )，將誘導分化時間較其他實驗縮短。本試驗以螢光豬骨髓間葉幹細胞誘導分化為胰島素分泌細胞(6╳10⁶ )皮下注射糖尿病小鼠(六隻)為處理組，亦注射螢光豬骨髓間葉幹細胞(6╳10⁶ )(三隻)、PBS(三隻)與高血糖糖尿病小鼠做為控制組(六隻)。與其經過源自於綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞分化後之胰島素分泌細胞埋殖3~4天，原本血糖值接近600 mg/dl之第一型糖尿病小鼠(NOD/LtJ)(6隻)，其血醣有緩慢下降之趨勢，直至埋殖後20天，其血醣值較控制組明顯改善，且存活率至20天仍然為100%，他組則於16至18天死亡。分化後之螢光豬胰島素分泌細胞經證實可分泌胰島素且異種移植至NOD/LtJ小鼠皮下亦可降低其體內之高血糖(圖14及圖15)。

本發明可表現螢光蛋白質的豬骨髓間葉幹細胞於體外轉分化為胰島素分泌細胞之平台，可於短時間內建立足夠量之胰島素分泌細胞，若未來能落實使用於糖尿病病人之自體幹細胞於治療病人本身糖尿病，即可能解決長期仰賴胰島素注射、胰島器官/細胞移植來源不足與免疫排斥問題，對於糖尿病治療之研究極具臨床應用潛力。

同樣地，亦可將本發明螢光豬骨髓間葉幹細胞應用於骨質疏鬆症小鼠，處理2個月後沖出骨髓之相片如圖16及17。

綜合上述，本發明可表現螢光蛋白質的豬骨髓間葉幹細胞，可有效率的轉分化為其他細胞，進一步應用至疾病動物模式或人類臨床治療研究。

圖1為外源基因經顯微技術注入豬受精卵之原核內(x 200)之顯影照片，(A)為基因顯微注射前，(B)為基因顯微注射後(原核膜膨脹箭頭處)。

圖2為pCX-EGFP限制酶圖譜。

圖3為藉由原核顯微注射的方式產製帶有綠色螢光蛋白之轉殖基因豬，(A)為CMV-β-actin-EGFP轉殖基因；(B)為於自然光照下控制組不帶基因豬(左)及帶有綠色螢光蛋白之轉殖基因豬(右)，且轉基因豬於自然光下其眼球、腳蹄與鼻鏡呈現黃色；(C)為出生36頭分娩仔豬中，3頭仔豬透過藍色激發光照射表現綠色螢光於暗視野下；(D)為於GFP濾片及藍光照射下，綠色螢光蛋白之轉殖基因豬表現大量的綠色螢光蛋白；(E)為應用Southern blot EcoR Ⅰ所切割之基因組DNA分析轉基因豬基因組DNA帶有綠色螢光蛋白基因片段(probe: 739 bp) M,marker;Pc,positive control;Nc,negative control.(F-Q)綠色螢光蛋白之轉殖基因豬所有的組織器官皆表現大量之綠色螢光蛋白(右圖,LY品系豬)包括肋骨(F),腎(G),心(H),肌肉(I),肝(J),腦(K),眼睛(L),睪丸(M),肺(N),腸(O),舌頭(P),陰莖(Q).野生型(Wild-type)組織/器官(左圖，李宋迷你豬)當作控制組。

圖4為螢光豬骨髓間葉幹細胞表型與其表面抗原分析之表現：(A)為綠色螢光蛋白轉基因豬骨髓間葉幹細胞被拍照於於白光下；(B)為於螢光下；(C)為西方墨點法檢測螢光豬骨髓間葉幹細胞綠色螢光蛋白之表現；(D)為流氏細胞移檢測骨髓間葉幹細胞綠色螢光蛋白之表現量；(E)為流氏細胞儀檢測綠色螢光蛋白質轉基因豬間葉幹細胞之表面抗原。

圖5為螢光豬骨髓間葉幹細胞不同代數之傷口與修復之試驗：螢光豬骨髓間葉幹細胞之(1)第2代與(2)第13代的遷移增殖能力無顯著差異：0h(1): 71.551±1.380,(2): 72.568±3.0919,16h(1): 25.600±1.1472,(2): 24.782±2.9133,28h(1): 3.360±0.5669,28h(2): 3.439±0.7611. 0h,16h,28h: p value=0.9795,0.9885,0.9501。

圖6為螢光豬與一般豬之骨髓間葉幹細胞之傷口與修復之試驗：(1)綠色螢光蛋白質轉基因豬與(2)一般豬之骨髓間葉幹細胞的遷移增殖能力無顯著差異：0h(1): 74.3464±4.6808,(2): 75.4045±5.8721,(p=0.9838)；16h(1): 30.2290±1.4930,(2): 31.4220±0.9757,(p=0.9885)；28h(1): 2.5177±0.2647,(2): 2.5727±0.3356(p=0.9719).

圖7為綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞體外分化分析：(A-D)為硬骨細胞分化：(A)此間葉幹細胞培養於骨分化培養基中三個星期，箭頭指的是鈣結晶之沉澱；(B)在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成硬骨細胞表現綠色螢光蛋白；(C)鹼性磷酸酶(alkaline phospatase)檢測骨分化第十天；(D) ARS染色檢測骨分化第二十一天骨鈣離子的沉積。(E,F)為軟骨細胞分化：(E)在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成軟骨細胞表現綠色螢光蛋白；(F) Toluidine blue染色檢測軟骨分化組織切片micromass pellet顯示出glycosaminoglycan的表現。(G-I)為脂肪細胞分化：(G)此間葉幹細胞培養於脂肪細胞分化培養基中三個星期有油滴之形成；(H)在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成脂肪細胞表現綠色螢光蛋白；(I) Oil Red O檢測脂質顆粒於細胞中。(J,K,L)流氏細胞儀顯示此間葉幹細胞分化成造骨細胞、軟骨細胞與脂肪細胞仍表現大量綠色螢光蛋白。

圖8為螢光豬骨髓間葉幹細胞體外分化分析：(A)為紅色螢光豬骨髓間葉幹細胞；(B)為在螢光顯微鏡下此細胞表現紅色螢光蛋白；(C)為藉由H.E.染色得知此間葉幹細胞可分化成軟骨細胞；(D)為Toluidine blue染色檢測軟骨分化組織切片micromass pellet顯示出glycosaminoglycan的表現；(E)為此間葉幹細胞培養於脂肪細胞分化培養基中三個星期有油滴之形成；(F)為在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成脂肪細胞表現紅色螢光蛋白；(G)為Oil Red O檢測脂質顆粒於此脂肪細胞中；(H)為此間葉幹細胞培養於骨分化培養基中三個星期有鈣結晶之沉澱；(I)為在螢光下拍攝此間葉幹細胞分化成硬骨細胞表現紅色螢光；(J)為ARS染色檢測骨分化第二十一天骨鈣離子的沉積。

圖9為螢光豬骨髓間葉幹細胞類神經細胞體外分化：(A)為此間葉幹細胞培養於類神經細胞分化培養基中三個星期；(B)為此分化後的類神經細胞持續表現綠色螢光蛋白；(C)為藉由細胞免疫染色得知此類神經細胞表現beta 3 tubulin。

圖10為綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞(GFP-pMSCs)於體外經誘導而轉分化為類肝細胞：(A)為於螢光顯微鏡下觀察，綠色螢光蛋白質於GFP-pMSCs分化後仍高度表現，(B)為利用DAPI染色可確定細胞核位置，(C)為GFP-pMSCs分化後表現白蛋白(albumin)經由紅色螢光二級抗體與山羊抗豬白蛋白之一及抗體反應，(D)為(A)(B)(C)三圖之融合圖。

圖11為以細胞團塊誘導培養綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞轉分化為胰島素分泌細胞之型態於第1天(A)為第1天、(B)為第7天、(C)為第14天之改變，與其分化過程中綠色螢光蛋白持續之表現(D,E,F)(100X)。

圖12為利用細胞免疫染色偵測分化後(14天)之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞表現胰島素蛋白質(類胰島細胞團塊)(200X)：(A)為以螢光顯微鏡下觀察綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞分化成類胰島素分泌細胞持續表現綠色螢光蛋白；(B)為DAPI染核；(C)為經紅色螢光二級抗體抗天筑鼠免疫球蛋白表現之天筑鼠胰島素一級抗體，顯示分化後之類胰島素細胞偵測到胰島素蛋白；(D)為(A)(B)(C)三圖之融合圖。

圖13為分化前(A)與分化後(B)之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞胰島細胞相關轉錄因子與基因之表現：(A)為分化前之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞，(B)為分化後之綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞胰島細胞相關轉錄因子與基因之表現。其中：Lane 1:Marker;Lane 2:Blank;Lane 3:Insulin;Lane 4:Glucagon;Lane 5:Glucokinase;Lane 6:Somatostatin;Lane 7:Pax6;Lane 8:Nkx6.1;Lane 9:Glut2。

圖14為移植源自於綠色螢光豬骨髓間葉幹細胞之綠色螢光豬類胰島細胞(6×10⁶ )後對糖尿病小鼠血糖之影響。NOD小鼠體內之高血糖於移植綠色螢光豬類胰島細胞後明顯較其他組別(注射PBS、EGFP-MSCs、控制組)有血糖回穩之影響。

圖15為NOD糖尿病小鼠於移植後之存活率：源自螢光豬骨髓間葉幹細胞之綠色螢光豬類胰島細胞(6×10⁶ )之糖尿病小鼠，能存活至少20天且存活率(100%)，而其他組別最多活至僅18天。

圖16為處理螢光豬骨髓間葉幹細胞於骨質疏鬆症小鼠2個月後沖其骨髓之圖。相片被照於於(A)白光下、(C)螢光下與(B)2者合併圖(100x)。(D)顯示組織化學免疫染色法中使用綠色螢光蛋白質抗體來確定骨髓中綠色螢光蛋白質轉基因豬之骨髓間葉幹細胞的存在。

圖17為處理螢光豬骨髓間葉幹細胞於骨質疏鬆症小鼠2個月後，經由組織化學免疫法偵測骨組織中綠色螢光蛋白質轉基因豬之骨髓間葉幹細胞的存在，使用綠色螢光蛋白質抗體被發現於骨小樑(A)與皮質骨(C)上(100x)，無處理綠色螢光蛋白質轉基因豬之骨髓間葉幹細胞當作對照組(B,D)，下圖為上圖之放大倍率圖(200x)。

Claims (8)

1. 一種可表現螢光蛋白質之豬骨髓間葉幹細胞，其係將螢光報導基因嵌入早期豬胚原核之染色體中，並進行胚移置，以產生全身性表現螢光蛋白質之基因轉殖豬，再自所得表現螢光蛋白質之基因轉殖豬螢光豬的骨髓中，分離一致及持續性表現螢光蛋白質之成體幹細胞，其中進一步純化取得骨髓間葉幹細胞，其中該豬骨髓間葉幹細胞經誘導分化產生特定外、中、內胚層細胞。
2. 如申請專利範圍第1項之豬骨髓間葉幹細胞，其中該螢光蛋白質為綠色螢光蛋白質。
3. 如申請專利範圍第1項之豬骨髓間葉幹細胞，其中該豬骨髓間葉幹細胞經誘導分化產生骨骼細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經細胞或胰島素分泌細胞。
4. 一種產生表現螢光蛋白質之特定細胞之方法，其包括將螢光報導基因嵌入早期豬胚原核之染色體中，並進行胚移置，以產生全身性表現螢光蛋白質之基因轉殖豬，再自所得表現螢光蛋白質之基因轉殖豬螢光豬的骨髓中，分離一致及持續性表現螢光蛋白質之成體幹細胞，進一步純化取得骨髓間葉幹細胞，在以特定因子誘導下，使所得之豬骨髓間葉幹細胞經誘導分化成表現螢光蛋白質之特定外、中、內胚層細胞。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該豬骨髓間葉幹細胞經誘導分化產生骨骼細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經細胞或胰島素 分泌細胞。
6. 一種如申請專利範圍第1、2或3項之豬骨髓間葉幹細胞，其可用以建立研究細胞誘導分化來源之實驗平台系統。
7. 如申請專利範圍第6項之豬骨髓間葉幹細胞，其可用以建立供糖尿病基因治療檢測之實驗平台系統。
8. 如申請專利範圍第6項之豬骨髓間葉幹細胞，其可用以建立供骨質疏鬆症基因治療檢測之實驗平台系統。