TWI418362B - 溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白e及含此之疫苗組成物 - Google Patents

Description

溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E及含此之疫苗組成物

本發明是有關於一種細菌重組蛋白及其於疫苗組成物之應用，特別是有關於一種溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E及其於疫苗組成物之應用。

溶血性巴斯德桿菌(Pasteurella haemolytica )又稱為溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica )屬於革蘭氏陰性菌中的巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae )，是反芻類動物(例如牛、羊等)呼吸道上的常在菌之一。但當動物的抵抗力下降時，使得溶血性曼哈米亞桿菌有機會大量繁殖，進而引起動物之急性纖維素性胸膜肺炎，導致感染動物迅速死亡，造成畜牧業嚴重的經濟損失。

對於溶血性巴斯德桿菌引起動物的肺炎，習知技術係藉由使用溶血性巴斯德桿菌之不活化疫苗(inactivated vaccine)接種動物，藉此提供動物免疫力。不活化疫苗又稱為死菌疫苗(killed bacterial vaccine)或死菌苗(bacterin)，其係利用物理或化學方法處理菌體，使其失去生命力。雖然不活化疫苗容易製造，然而不活化疫苗僅能提供短效的免疫力。理由在於，不活化疫苗提供的是外源性抗原(exogenous antigens)，而外源性抗原在動物體內引發的免疫細胞，主要為CD4⁺ 幫助型T細胞(helper T cell)。幫助型T細胞辨識抗原後，必須經過一段時間以及一連串的反應，才能產生細胞激素(cytokines)進而活化免疫細胞，故較慢產 生免疫效果，且免疫記憶(immune memory)效果亦較差。通常不活化疫苗的抗原呈獻的時間較短，因此在第1劑疫苗接種數週後，往往必須再補強(boost)免疫第2劑，甚至要多次補強免疫，才獲致較佳的免疫效果。

其次，溶血性巴斯德桿菌的血清型眾多，使用單一血清型的不活化疫苗，難已達到交叉保護效果。再者，有關溶血性巴斯德桿菌之防疫現況，國內尚無引進國外的商業性疫苗，亦未發展出本土化疫苗。

綜上所述，習知的溶血性巴斯德桿菌之不活化疫苗於應用上仍有其限制，又無法提供完善的預防效果。有鑑於此，急需提供有效的共同抗原，以幫助受免疫動物抵抗不同血清型之溶血性巴斯德桿菌感染。

因此，本發明之一態樣是在提供一種疫苗組成物，利用原核生物表現系統大量表現溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)作為抗原，並結合雙相油質佐劑製成疫苗，藉以有效提供至少一種受免疫(immunized)動物具有對抗不同血清型之溶血性巴斯德桿菌的免疫力。

根據本發明之上述態樣，提出一種疫苗組成物。在一實施例中，此疫苗包括溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E以及雙相油質佐劑，其中溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E包括如辨識編號1所示之胺基酸序列，而雙相油質佐劑為一水包油包水(water-in-oil-in-water；w/o/w)之雙相油質乳劑(double oil emulsion)。此疫苗可誘發至少一種受 免疫動物之體內產生抗體，且此抗體可專一性對抗溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica ；寄存編號為BCRC 13948、BCRC 13946)以及溶血性曼哈米亞桿菌B2。

依據本發明一實施例，上述之至少一種受免疫動物例如可為牛、羊或鼠。

應用本發明之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)及含此之疫苗組成物，其係利用原核生物表現系統大量表現溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)，並結合雙相油質佐劑製得疫苗組成物，藉以有效提供至少一種受免疫動物具有對抗不同血清型之溶血性巴斯德桿菌的免疫力。

承前所述，本發明提供一種疫苗組成物，其係利用原核生物表現系統大量表現全長之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)作為抗原，並結合雙相油質佐劑製得疫苗組成物，以誘發至少一種受免疫動物之體內產生抗體，且此抗體可具有交叉保護效果。

疫苗組成物

本發明此處所稱之「溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)」主要指包括如序列辨識編號1所示序列之胺基酸序列的溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(rPlpE)。在一實施例中，上述之溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(rPlpE)具有約356個胺基酸，其係源自於例如溶血性曼哈米亞桿 菌(Mannheimia haemolytica )，其中此溶血性曼哈米亞桿菌係屬於第1型血清型，購自於臺灣新竹食品工業研究與發展研究所，寄存編號為BCRC 13948。

其次，此處所稱之「雙相油質佐劑」係指水包油包水(water-in-oil-in-water；w/o/w)型雙相油質乳劑(double oil emulsion)，其係由油(油相)以及界面活性劑(水相)所組成之三層結構。申言之，此w/o/w型雙相油質乳劑係具有內層抗原(水相)、油層、外層免疫原(水相)之結構，依內層抗原、油層、外層抗原的重量比例為1：1：2，在一實施例中，水相部分例如可為含有免疫原及生理食鹽水之水溶液，油相部分例如可為界面活性劑，例如Tween 80。

再者，此處所稱之「交叉保護效果」係指利用上述之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E作為共同抗原，並與雙相油質佐劑製成之疫苗，以有效誘發至少一種受免疫動物之體內產生抗體，且此抗體又可專一性對抗與抗原血清型不同之溶血性巴斯德桿菌。在一實施例中，上述之受免疫動物可為牛、羊或鼠之一。經免疫產生之抗體可對抗溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica ；寄存編號為BCRC 13948、寄存編號為BCRC 13946)以及溶血性曼哈米亞桿菌B2。上述之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)屬於血清型第1型，溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13946)屬於血清型第5型，其係由受感染的小羊(lamb)肺部分離而得，溶血性曼哈米亞桿菌B2(本土型)的血清型則不詳。

疫苗組成物之製造方法

在一實施例中，上述之疫苗組成物可將溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)與雙相油質佐劑混合，製成疫苗，其中rPlpE於此疫苗含量例如可為約200μg/mL。在其他實施例中，溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E於此疫苗組成物之含量係視不同的受免疫動物而調整，亦可多於或少於200μg/mL，例如100μg/mL至400μg/mL。

溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)之製造方法

在一實施例中，上述溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)可進一步利用原核生物表現系統，表現含有如序列辨識編號2所示之核苷酸序列，以獲得如序列辨識編號1所示序列之胺基酸序列。在此實施例中，序列辨識編號2所示之核苷酸序列包含溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E之啟始密碼子(start codon；GTG)至終止密碼子(stop codon；TAA)的開放譯讀架(open reading frame；ORF)序列，其長度為約1071鹼基對。在一例示中，可利用專一性引子對進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)增幅而得到序列辨識編號2所示之核苷酸序列。

上述適合的引子對可依據例如美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)網站之基因庫(GenBank)中，由Pandher K.等人1998年發表之溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(PlpE)之基因序列(編號：AF059036，共具有1310個鹼基)，利用市售序列分析軟體或其他功能相當之軟體，例如EditSeq 5.0 DNASTAR 專業序列分析軟體(Expert Sequence Analysis Software；DNASTAR Inc.)，以設計專一性引子對之序列。上述引子對包括上游引子與下游引子，其中上游引子之5’端設計有第一限制酶切位，且與PlpE基因序列的第1鹼基至第18鹼基互補，如序列辨識編號3所示；而下游引子之5’端設計有第二限制酶切位，且與溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E之基因序列的第1054鹼基至第1071鹼基互補，如序列辨識編號4所示。

在一例示中，第一限制酶例如可為EcoR I，第二限制酶例如可為Xho I。利用上述引子對可由溶血性巴斯德桿菌(BCRC 13948)染色體DNA增幅出約1071bp之rPlpE的核酸片段，如序列辨識編號2所示序列。上述例舉之引子對玆整理如後述之第1表所示。

接下來，可利用第一限制酶與第二限制酶分別切割上述PlpE的核酸片段以及市售載體後，利用接合酶，進行接合反應，以接合上述PlpE的核酸片段與市售載體，而形成含PlpE的核酸片段之重組表現質體。之後將此重組表現質體轉型至一原核生物表現系統中，並藉此系統表現(或稱轉譯)溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E。

在轉譯上述PlpE的核酸片段時，同時也會一併轉譯出載體所攜帶之標記蛋白(tagged protein)，其中轉譯出的溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(PlpE)可與此標記蛋白直接相連。因此，在其他實施例中，上述所稱之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)，亦可指溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(PlpE)及其直接相連之標記蛋白。在一例示中，上述的標記蛋白可包括但不限於組氨酸標記(histidine tag；his-tag)蛋白、S抗原表現基標記(s-epitope tag；s-tag)蛋白以及硫醇氧化還原蛋白標記(thioredoxin tag；trx-tag)蛋白，惟本發明不限於此處所舉。在其他實施例中，當可使用其他市售可得之載體，且此等載體亦可攜帶其他標記蛋白或其他種類的蛋白。由原核生物表現系統表現而得之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E為約63kDa，其中PlpE的部分為約45kDa，而標記蛋白的部分則約18kDa。

雙相油質佐劑之製造方法

在其他實施例中，上述雙相油質佐劑可進一步參考習知方法製備，或參考Miyakawa T.等人於1993年三月在生物藥學簡報(Biological and Pharmaceutical Bulletin)期刊第16卷第3期第268-272頁發表之題目為「靜脈注射穩定化水包油包水型複合乳劑於大鼠中以於活體內釋放水溶性藥劑(In Vivo Release of Water-Soluble Drugs from Stabilized Water-in-Oil-in-Water(W/O/W)Type Multiple Emulsions Following Intravenous Administrations Using Rats)」一文所揭示的方法製備，在此一併列為參考文獻。

簡言之，當上述雙相油質佐劑為w/o/w型雙相油質乳劑時，此w/o/w型雙相油質乳劑可利用例如二階段乳化法形成，其係將等重量比之水相與油相，利用例如均質機(homomixer)或其他功能相當的設備，形成油包水(w/o)型油質乳劑。然後，再將此油包水(w/o)型油質乳劑與等重量比之水相，利用上述均質機或其他功能相當的設備，進而形成w/o/w型雙相油質乳劑。

以下利用數個實施方式以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一：構築溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E全長基因之重組質體及大量培養 1.利用聚合酶鏈鎖反應合成溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E全長基因之核酸片段

此實施例係構築溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)基因之重組質體、轉型株及大量培養。而所含之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)全長基因之核酸片段，則利用專一性引子對，從溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica ；寄存編號為BCRC 13948)DNA，進行聚合酶鏈鎖反應增幅而得。

申言之，可利用市售套組萃取出溶血性曼哈米亞桿菌DNA後，將第1表所示之引子對與DNA，添加至市售商品 化之PCR反應試劑(TaKaRa,Shiga,Japan)中，利用溫度循環控制器(Thermocycler；TaKaRa,Shiga,Japan)，進行聚合酶鏈鎖反應，以獲得核酸片段。上述PCR反應之試劑如第2表所例示：

在利用引子對與DNA進行聚合酶鏈鎖反應時，其反應條件可例如但不限於以下所例示：約94℃下進行約1分鐘，94℃反應約30秒進行、52℃反應約30秒、72℃進行約1分鐘，共重複進行30個循環的反應，以獲得長度為約1071鹼基對PlpE之核酸片段。

2.構築含有溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之重組質體與製備轉型株

經上述聚合酶鏈鎖反應後，以引子對所得之rPlpE全 長基因的核酸片段經限制酶作用，例如EcoR I與Xho I(均為TaKaRa,Shiga,Japan)，截切並純化出rPlpE全長基因的核酸片段後，可構築並接合於經同樣限制酶處理並純化之載體中，例如哺乳類動物細胞表現載體pET-32a(+)(Novagen,U.S.A.)載體，以形成重組質體，以獲得含有PlpE全長基因的核酸片段之重組質體或稱(pET-32a/13948-PlpE)。所得之重組質體亦經PCR及DNA定序確定構築之序列無誤。惟此處有關重組質體之限制酶作用、構築重組質體、接合反應等為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不另贅述。

上述重組質體可進一步轉型(transform)至適當的宿主，例如大腸桿菌(E.coli )BL21(DE3)菌株之勝任細胞(competent cell)，以作為上述重組表現質體之轉殖及保存的宿主。之後，進行藍白篩選，即利用異丙基-β-D-硫代半乳醣苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside；IPTG；Amresco,U.S.A.)誘導重組表現質體之乳糖操作子(lac operon)，並利用5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside；X-gal)使轉型成功之菌落顯色，並經PCR及DNA定序確定構築之序列無誤的菌落後，即可進行大量培養。

上述DNA定序係與基因庫(GenBank)之溶血性巴斯德桿菌外膜脂蛋白E(PlpE)之基因序列(編號：AF059036)比對後，確認其序列無誤。惟此處有關構築重組質體、轉型至勝任細胞、大量培養、抽取質體DNA、測光學密度(optical density；O.D.)值、建立標準曲線及DNA定序等為本技術 領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不另贅述。

實施例二：溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E的製備與定性 (一)製備溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E

在此實施例中，首先，將含有上述重組表現載體(pET-32a/13948-PlpE)之轉型株培養在200mL Luria-Bertani培養液(含有Ampicillin)中，於37℃環境下培養至OD_600nm 值為約0.6時，以1mM異丙基硫化蒎喃型半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導重組蛋白表現，誘導4小時。

(二)溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之定性與生物活性之評估 1. 硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳分析(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)

將上述誘導表現完成之轉型株菌體(含有溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E)與2倍樣品緩衝液(2X sample buffer；例如含有100mM Tris-HCl pH 6.8,200mM dithiothreitol,4% sodium dodecyl sulfate,0.2% bromophenol blue,20% glycerol)以等體積混合，經100℃、煮沸10分鐘並冷卻後，即置於冰上準備於8%之SDS-PAGE進行分析，以約100伏特，進行約90分鐘之電泳分析，再依標準程序染色及脫色。由於SDS-PAGE可使用市售產品進行，此處 不另贅言。

請參閱第1圖，其係根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E的SDS-PAGE電泳分析圖，其中第M道表示以標準蛋白分子量標記，分別表示“26kDa、34kDa、43kDa、55kDa、72kDa、95kDa”等分子量大小之蛋白處。第1道至第4道分別表示濃度為1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL之牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)的相對位置，而第5道表示利用IPTG誘導實施例一之轉型株4小時後所表現之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)。

由第1圖結果可知，利用IPTG誘導實施例一之轉型株4小時後，可得到溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)，與標準蛋白分子量標記相比，其分子量約63kDa。

2. 西方轉漬法分析(Western blotting assay)

上述SDS-PAGE之電泳膠(含溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E)隨即利用西方轉漬套組(GE Healthcare,WI,U.S.A)，將電泳膠內之蛋白質轉印(利用約300毫安培)到轉印膜(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,U.K.)。由於轉印步驟可使用市售產品進行，此處不另贅述。

之後，將轉印後之PVDF膜利用1X BSA(KPL,Inc.,MD,U.S.A.)或5%脫脂奶粉溶於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline，PBS)中，於37℃下作用約1小時。然後，以PBST(1×phosphate buffer saline,0.5% Tween 20)清洗三次，每次10分鐘。

之後，加入以第1型溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948不活化菌苗免疫之)山羊免疫血清作為一級抗體(first antibody)(1：15,000x)，於4℃下感作隔夜。然後，以PBST清洗三次，每次10分鐘，以洗去非特異性之一級抗體結合。

隨後，加入以稀釋10,000倍(1：10,000)、結合山葵過氧化酶的兔抗山羊IgG(rabbit anti-goat IgG-HRP)(KPL,Inc.,MD,U.S.A.)作為二級抗體(secondary antibody)，於約37℃感作約1小時後，以PBST清洗三次，每次10分鐘。

而後，避光加入冷光呈色劑(例如Enhanced ChemiLuminescence(ECL)Plus Western blotting detection reagent；GE Healthcare,Newcastle,U.K.)，依40：1之比例混合均勻後，滴在PVDF膜上進行呈色反應，再藉由冷光螢光影像分析系統(例如G：Box冷光螢光影像分析系統；Syngene,Frederick,MD)，偵測上述表現之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)，是否可被上述之山羊免疫血清所辨識，其結果如第2圖所示。

請參閱第2圖，其係顯示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)的西方轉漬法分析結果，其中第1道為利用IPTG誘導實施例一之轉型株0小時，第2道至第3道為4小時，所得之rPlpE的大小約63kDa。

由第2圖結果可知，利用IPTG誘導實施例一之轉型株4小時後，確實可得到溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)。

實施例三：評估溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E於動物模式與細胞模式之免疫效果 1. 製備含有溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之動物疫苗

將實施例二所得之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)與雙相油質佐劑混合，製成疫苗，其中rPlpE於此疫苗組成物之含量為約200μg/mL。

另外，取血清型第1型之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)之不活化疫苗與雙相油質佐劑混合，製成陽性對照組之疫苗(以下稱為不活化疫苗)，其中不活化疫苗之含量為約2×10⁹ CFU/mL。

2.安全性效力試驗的評估(一)--小鼠

將實驗小鼠隨機分成試驗組、陽性對照組及陰性對照組，其中每組各為3週齡之印記控制區(Imprinting Control Region；ICR)小鼠9隻。試驗組及陽性對照組分別於第一次免疫進行皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗及不活化疫苗，陰性對照組之則不進行免疫。試驗組與陽性對照組之小鼠於第一次免疫2週後，再分別皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗及不活化疫苗作為補強免疫。並於第一次免疫前、第一次免疫後2週以及補強免疫後2週進行採血，利用間接型(indirect enzyme-linked immunosorbent assay；indirect ELISA)法測定血清中的抗體力價(antibody titers)。

有關間接型ELISA的方法係如下例示。首先，於96孔V型微量盤中，每孔利用固定溶液(含有15mM Na₂ CO₃ , 35mM NaHCO₃ ,3mM NaN₃ ,pH 9.6)，將溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948；1.25μ g/mL)塗佈於孔內，於約4℃下作用隔夜。

接著，以PBST清洗三次、每次約5分鐘後，每孔各加入約150μL之包埋液(KPL,Inc.,MD,U.S.A.)於37℃下作用約1小時。然後，以PBST清洗三次，每次約5分鐘。之後，加入不同稀釋倍率之待測血清，於37℃下作用約1-2小時或約90分鐘。再以PBST清洗三次後，加入稀釋2500倍(1：2,500)、結合HRP的山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG-HRP；CALTAG,CA,U.S.A.)作為二級抗體(secondary antibody)，於37℃感作約60分鐘後，以PBST清洗三次，每次約5分鐘。

而後，加入等體積的冷光呈色劑，例如TMB過氧化酶受質(TMB perosidase substrate；KPL,Inc.,MD,U.S.A.)，於室溫避光反應5分鐘後，加入等量的中止液(stop solution；KPL,Inc.,MD,U.S.A.)以中止呈色反應。隨後，利用冷光螢光分析儀，例如Anthos 2020 ELISA判讀儀(Anthos 2020 ELISA reader；Anthos 2020,Cambridge,U.K.)，偵測於波長450nm之吸光值(OD_450nm )，以分析小鼠血清中的抗體力價，其結果如第3圖所示。

請參閱第3圖，其係繪示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗組成物(rPlpE疫苗)於小鼠之ELISA抗體力價圖，其中橫軸表示不同採血時間(0、2、4週)，縱軸表示根據式(I)計算得出的S/P比值(S/P ratio)，空白柱狀代表陰性對照組，斜線柱狀代表接種rPlpE 疫苗的試驗組，圖號＊則表示具有統計學上顯著性差異(p<0.05)。另外，在計算S/P比值時，以利用不活化疫苗免疫ICR小鼠之血清作為陽性對照組。

由第3圖之結果可知，接種實施例三之rPlpE疫苗的試驗組經補強免疫2週後，其抗體力價顯著高於陰性對照組，表示rPlpE疫苗確實可以有效誘發小鼠之體內產生抗體。

3.安全性效力試驗的評估(二)--山羊

將實驗山羊隨機分成試驗組及陰性對照組，其中每組各為健康山羊3頭。試驗組之山羊為肌肉注射1劑量(2mL)之rPlpE疫苗(第一次免疫)，陰性對照組之山羊則不進行免疫。試驗組之山羊於第一次免疫2週後，再以肌肉注射1劑量(2mL)之rPlpE疫苗(補強免疫)。然後，所有山羊再進行為期2-4週的觀察後，於第一次免疫前、第一次免疫後2週以及補強免疫後2、4週進行採血，並利用間接型(indirect ELISA)法分析山羊血清中的抗體力價。

有關間接型ELISA的方法可參酌上述，此處不另贅言。在此例示中，每孔係加入稀釋300倍(1：300)之待測血清進行抗體力價之分析，其結果如第4圖所示。

請參閱第4圖，其係繪示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗組成物(rPlpE疫苗)於山羊之ELISA抗體力價圖，其中橫軸表示不同採血時間 (0、2、4、6週)，縱軸表示根據上述式(I)計算得出的S/P比值(S/P ratio)，空白柱狀代表陰性對照組，斜線柱狀代表接種rPlpE疫苗的試驗組，圖號＊則表示具有顯著性差異(p<0.05)。

由第4圖之結果可知，接種實施例三之rPlpE疫苗的試驗組經第一次免疫2週後、補強免疫2、4週後，其抗體力價均顯著高於陰性對照組，表示rPlpE疫苗確實可以有效誘發山羊之體內產生抗體。

4. 小鼠攻毒試驗的評估(一)

將實驗小鼠隨機分成試驗組、陽性對照組及陰性對照組，其中每組各為3週齡之ICR小鼠5隻。試驗組及陽性對照組之小鼠分別於第一次免疫進行皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗(含有rPlpE，劑量為約200μg/mL)及不活化疫苗(含有溶血性曼哈米亞桿菌BCRC 13948，劑量為2×10⁹ CFU/mL)，陰性對照組之小鼠則不進行免疫。所有小鼠於第一次免疫2週後，為每隻小鼠腹腔注射0.2mL之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)的活菌(劑量為2×10⁹ CFU/mL)，觀察2週後，計算小鼠之存活率，其結果如第3表之所示。

請參閱第3表，其係顯示根據本發明一實施例之實施例三之含有溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗(rPlpE疫苗)對於小鼠之免疫保護力。由第3表之結果可知，利用試驗組與陽性對照組之小鼠在攻毒後，二者之存活率遠高於陰性對照組。這表示rPlpE疫苗以及不活化疫苗對於小鼠的免疫保護力是相當的。

5. 小鼠攻毒試驗的評估(二)

將實驗小鼠隨機各分成2組試驗組、陽性對照組及陰性對照組，其中每組各為3週齡之ICR小鼠5隻。2組試驗組之小鼠為皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗(第一次免疫；含有rPlpE，劑量為約200μg/mL)，陽性對照組之小鼠為皮下注射0.25mL之不活化疫苗(第一次免疫；含有溶血性曼哈米亞桿菌BCRC 13948，劑量為2×10⁹ CFU/mL)，2組陰性對照組之小鼠則不進行免疫。

於第一次免疫2週後，所有小鼠進行攻毒。一組試驗組及陰性對組之小鼠各以腹腔注射0.2mL之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)的活菌培養物(劑量為2×10⁹ CFU/mL；第4表簡稱BCRC 13948)；另一組試驗組及陰性對照組之小鼠則各以腹腔注射0.2mL之溶血性曼哈米亞桿菌B2的活菌培養物(劑量為2×10⁹ CFU/mL；第4表簡稱B2)。陽性對照組之小鼠為以腹腔注射0.2mL之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)的活菌培養物(劑量為2×10⁹ CFU/mL)。

上述溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)屬於血清型第1型，係由受感染的牛隻身上分離而得。目前已知溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)之PlpE基因序列與溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13946)之PlpE基因序列兩者相同。溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13946)屬於血清型第5型，其係由受感染的小羊(lamb)肺部分離而得。另外，溶血性曼哈米亞桿菌B2(本土型)則由受台灣感染的牛隻身上分離而得的，惟其血清型不明。

於接種活菌2週後，計算小鼠之存活率，其結果如第4表之所示。

請參閱第4表，其係顯示根據本發明另一實施例之實施例三之含有溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗(rPlpE疫苗)對於小鼠之交叉免疫保護力。

由第4表之結果可知，試驗組與陽性對照組之小鼠以相同血清型之溶血性巴斯德桿菌攻毒後，二者之存活率相 當且遠高於陰性對照組。其次，以不同血清型之溶血性巴斯德桿菌攻毒之試驗組之小鼠，其存活率又高於以相同血清型之溶血性巴斯德桿菌攻毒的試驗組，這表示rPlpE疫苗更可提供小鼠對抗與抗原血清型不同之溶血性巴斯德桿菌。

6. 小鼠胰臟細胞增生之刺激指數的評估 6.1 小鼠脾臟淋巴細胞之分離及培養

將3週齡之ICR小鼠隨機分成試驗組及陰性對照組，其中每組各為9隻ICR小鼠。試驗組之ICR小鼠為肌肉皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗(第一次免疫)，陰性對照組之ICR小鼠則不進行免疫。試驗組之ICR小鼠於第一次免疫2週後，再以皮下注射0.25mL之rPlpE疫苗(補強免疫)。然後，所有ICR小鼠再進行為期2週的觀察後，於第一次免疫前、第一次免疫後2週以及補強免疫後2週，犧牲ICR小鼠。

之後，利用無菌技術取3週齡之ICR小鼠脾臟淋巴細胞(splenocytes)後，以漢克氏平衡鹽溶液清洗後，置於100μm濾網上輕輕磨細，製成單一細胞懸液，再以漢克氏平衡鹽溶液重複洗滌並離心3次(以900×g之轉速離心10分鐘)。之後，用RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度為1×10⁶ cells/mL且分注於96孔盤中，其中毎孔為100μL之細胞液。

6.2 細胞增生之刺激指數的評估 6.2.1 rPlpE刺激

接著，將10μ g之實施例二之rPlpE加入每孔前述分離並培養之ICR小鼠脾臟淋巴細胞(splenocytes)中，置於37 ℃、5% CO2培養箱中培養72個小時。然後，在各孔中分別加入，置於5% CO2、37℃培養箱中培養72小時。至於陽性對照組為每孔加入5μ g之T細胞裂殖素(mitogen)，例如刀豆素A(Concanavalin A；Con A；Sigma,MO,USA)。陰性對照組則不加rPlpE以及T細胞裂殖素。上述各組樣本具有顯著性差異(p<0.05)。

6.2.2 MTT試驗

在上述每孔細胞中，每孔加入20μ L之MTS試劑，例如CellTiter 96^® 套組試劑內之3-(4，5-二甲基唑-2)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium；MTS四氮唑；5mg/mL；Promega,WI,U.S.A.]混合均勻後，避光於37℃、5% CO2反應4小時，利用例如ELISA判讀儀(Anthos 2020,Cambridge,Austria)，偵測於波長492nm之吸光值(OD_492nm )。

6.2.3 細胞增生指數(stimulation index；SI)之計算

有關細胞增生指數(stimulation index；SI)之計算可根據下式(II)得出：

在式(II)中，上述背景值為細胞只添加RPMI-1640培養基與20μL之MTS反應後，所偵測之OD_492nm 值。其結果如第5圖所示。

請參閱第5圖，其係繪示免疫本發明一實施例之rPlpE疫苗於小鼠之細胞性免疫反應試驗結果圖，其中橫軸代表 抗原，縱軸代表細胞增生指數(SI)，空白柱狀代表陰性對照組，斜線柱狀代表rPlpE疫苗試驗組，圖號＊則表示具有統計學上顯著性差異(p<0.05)。

由第5圖之結果可知，試驗組較對照組具有差異，代表經由rPlpE疫苗免疫小鼠後，其脾臟淋巴細胞由rPlpE刺激，具有細胞增殖的效果。

需補充的是，本發明雖以特定的質體、表現系統、反應條件、受免疫動物、分析方法、誘導條件或特定儀器作為例示，說明本發明之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(PlpE)可應用於疫苗組成物，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(PlpE)可使用其他質體、表現系統、反應條件、受免疫動物、分析方法、誘導條件或儀器進行。

舉例而言，利用原核生物表現系統大量表現rPlpE作為抗原，除了可有效誘發羊隻與小鼠體內產生抗體，以對抗血清型第1型之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)及溶血性曼哈米亞桿菌B2之外，亦可使羊隻與小鼠體內產生抗體，進而對抗血清型第5型之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13946)。其次，本發明之rPlpE是從血清型第1型之溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)分離而得的，除了可有效誘發羊隻體內產生抗體之外，也可有效誘發牛隻體內產生抗體，以對抗溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13948)、溶血性曼哈米亞桿菌(BCRC 13946)及溶血性曼哈米亞桿菌B2。

由上述發明可知，溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白 E(rPlpE)疫苗，其優點在於利用原核生物表現系統大量表現溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)作為抗原，因此有利於大量生產本土化疫苗。其次，此疫苗組成物使用之雙相油質佐劑屬於水包油包水型雙相油質乳劑，可有效延長抗原於動物體內的釋放時間，亦有助於提升疫苗接種之動物的抗體反應及細胞性免疫反應。再者，更可有效提供至少一種免疫動物具有對抗不同血清型之效力。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為顯示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E的硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳分析SDS-PAGE)圖。

第2圖為顯示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E(rPlpE)的西方轉漬法分析結果。

第3圖為繪示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗(rPlpE疫苗)於小鼠之ELISA抗體力價圖。

第4圖為繪示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿 菌重組外膜脂蛋白E之疫苗(rPlpE疫苗)於山羊之ELISA抗體力價圖。

第5圖為繪示根據本發明一實施例之溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E之疫苗(rPlpE疫苗)於小鼠之細胞性免疫反應試驗結果圖。

<110> 國立屏東科技大學

<120> 溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E及含此之疫苗組成物

<130> 無

<160> 4

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica )外膜脂蛋白 E(PlpE)

<400> 1

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

Claims (6)

1. 一種疫苗組成物，包含：溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E，其中該溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E包括如序列辨識編號1所示之胺基酸序列，且該巴氏桿菌重組外膜脂蛋白E於該疫苗組成物之濃度為200μg/mL；以及一雙相油質佐劑，其中該雙相油質佐劑之劑型為一水包油包水(water-in-oil-in-water；w/o/w)型雙相油質乳劑(double oil emulsion)，且其中該疫苗組成物係誘發至少一種動物體內產生抗體，且該抗體係專一性對抗溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica ；寄存編號為BCRC 13948與BCRC 13946)以及溶血性曼哈米亞桿菌B2。
2. 根據申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該免疫動物為牛、羊或鼠。
3. 根據申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E係由一重組表現質體於一原核生物表現系統內表現而得。
4. 根據申請專利範圍第3項所述之疫苗組成物，其中該重組表現質體包括如序列辨識編號2所示之核苷酸序列。
5. 根據申請專利範圍第3項所述之疫苗組成物，其中 該原核生物表現系統為大腸桿菌(E.coli )。
6. 根據申請專利範圍第3項所述之疫苗組成物，其中該溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白E更與一標記蛋白相連，且該標記蛋白所組成之一族群組氨酸標記(histidine tag；his-tag)蛋白、S抗原表現基標記(s-epitope tag；s-tag)蛋白以及硫醇氧化還原蛋白標記(thioredoxin tag；trx-tag)蛋白所組成之一族群。