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TWI484183B - 癌症轉移之評估方法及生物標記、及抑制癌症轉移之ｓｉＲＮＡ化合物 - Google Patents

癌症轉移之評估方法及生物標記、及抑制癌症轉移之ｓｉＲＮＡ化合物 Download PDF

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TWI484183B
TWI484183B TW100142056A TW100142056A TWI484183B TW I484183 B TWI484183 B TW I484183B TW 100142056 A TW100142056 A TW 100142056A TW 100142056 A TW100142056 A TW 100142056A TW I484183 B TWI484183 B TW I484183B
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Pao Chi Liao
Hung Chi Cheng
Ying Hwa Chang
Shu Hui Lee
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Univ Nat Cheng Kung
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Description

癌症轉移之評估方法及生物標記、及抑制癌症轉移之siRNA化合物
本發明係關於一種肺癌轉移之評估方法、肺癌轉移之生物標記、及用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物，尤指一種適用於評估癌症轉移風險之方法與生物標記、以及利用此肺癌生物標記發展出一種抑制肺癌轉移之siRNA化合物。
肺癌位居國人十大死因之首，在肺癌中，導致癌症病患死亡的原因，其係有90%為癌症轉移。一旦腫瘤細胞已經從肺部轉移、散佈到身體其他的組織器官，癌症就變的更加難以控制和治療。癌症轉移係為一種繁複的過程，具有侵犯和移行能力之腫瘤細胞會先從原發病灶處分離，再侵入週邊血管或淋巴管，經由循環系統或淋巴系統轉移到身體其他部位，進一步發展成腫瘤。
此外，肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。近年來，國內肺癌患者大多屬非小細胞肺癌，其又分肺腺癌、鱗狀上皮細胞肺癌(亦稱上皮癌)及大細胞肺癌三大種類，其中以肺腺癌居多數，其次是鱗狀上皮細胞肺癌及小細胞肺癌。
已有研究指出，在癌症轉移中，需要腫瘤細胞與細胞外基質內的特定分子作用，其部份經由具有催化或辨識功能之分泌因子(seretory factors)所調控。因此，在複雜的轉移過程中，分析與分泌相關之調控所扮演的角色，利用各種實驗方法分別對各種蛋白質進行與癌症相關性之探討評估，再從中挑選具有與癌症轉移重大相關之蛋白質，進而研究其與癌症之關聯性，可實行於預防及診斷癌症轉移上。
有鑒於分泌蛋白質與癌症轉移間之重要關聯性，因此，若能利用有效之分泌蛋白質體分析方法，找尋一種與癌症轉移相關之蛋白質，應用於評估或抑制癌症轉移上，以在轉移出去的腫瘤細胞尚未形成腫瘤之前或癌症轉移初期，及早發現並有利於準確評估癌症轉移，協助癌症治療，並減少癌症轉移造成癌症病患死亡的遺憾。
本發明之主要目的係在提供一種肺癌轉移之評估方法，俾能評估受試者是否具有肺癌轉移之風險。
本發明之另一目的係在提供一種肺癌轉移之生物標記，俾能用以判斷受試者肺癌轉移之風險大小。
本發明之再一目的係在提供一種用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物，俾能使用於肺癌基因治療。
為達成上述目的，本發明之肺癌轉移之評估方法，包括下列步驟：(A)提供一受試者之檢體樣品，檢體樣品係包括一正常組織、及一待檢組織；(B)分別檢測正常組織、及待檢組織中之一生物標記之表現量，其中生物標記係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)；以及(C)比較正常組織、及待檢組織中之生物標記之表現量，當待檢組織中之生物標記之表現量高於正常組織中之生物標記之表現量，代表受試者具有癌症轉移之風險。其中，正常組織可為一正常體組織、或一正常血液組織；且待檢組織可為一肺癌病患腫瘤組織、或一肺癌病患血液組織。
此外，本發明之肺癌轉移之生物標記，其係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之一核苷酸序列、核苷酸序列之互補股、寡核苷酸序列之衍生物、一蛋白質序列、蛋白質序列之衍生物、蛋白質序列之片段、蛋白質序列之變異體、及蛋白質序列所對應之抗體所組成之群組。較佳為，生物標記係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質序列、蛋白質序列之衍生物、蛋白質序列之片段、蛋白質序列之變異體、及蛋白質序列所對應之抗體所組成之群組。
其中，SERPINA1係已知作為一種絲胺酸蛋白抑制酶，然而SERPINA1在癌症中的角色尚未清楚。研究指出，在癌症病患之血清中，SERPINA1的表現量遠高於健康人體之表現量。再者，SERPINA1參與多種癌症轉移，例如卵巢癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、乳癌、以及肺癌，尤其是非小細胞肺癌(NSCLC)。於此，本發明發展出一種肺癌轉移之SERPINA1生物標記，經由此生物標記SERPINA1之表現，其參與調控肺癌細胞(CL1-5)之侵犯和移行能力，並且可調控細胞之纖維連接蛋白(fibronectin,FN1)聚集於細胞表面，以達到促進癌細胞之轉移。藉此，本發明之生物標記SERPINA1可作為有效評估肺癌轉移之生物標記。
於本發明之肺癌轉移之評估方法中，肺癌可為一小細胞肺癌(SCLC)、或一非小細胞肺癌(NSCLC)；較佳為非小細胞肺癌。
此外，絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之核苷酸鏈序列可為一與SEQ ID NO: 1所示之序列具有50%以上一致性之核苷酸鏈序列；較佳為一與SEQ ID NO: 1所示之序列具有70-100%以上一致性之核苷酸鏈序列；更佳為一與SEQ ID NO: 1所示之序列具有90-100%以上一致性之核苷酸鏈序列。又，絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質序列可為一與SEQ ID NO: 2所示之序列具有50%以上一致性之胺基酸序列；較佳為一與SEQ ID NO: 2所示之序列具有70-100%以上一致性之胺基酸序列；更佳為一與SEQ ID NO: 2所示之序列具有90-100%以上一致性之胺基酸序列。於此，所謂之「一致性」則指完全相同成分的百分比，即必須是完全相同的核苷酸鹼基或胺基酸序列。
於本發明之肺癌轉移之評估方法，步驟(B)可為：分別檢測正常組織、及待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之mRNA、蛋白質、蛋白質之衍生物、或蛋白質之胜肽鏈之表現量；較佳為，分別檢測正常組織、及待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質之表現量。
於本發明之肺癌轉移之評估方法，可透過任何本技術領域已知之方法檢測生物標記之表現量，例如：透過西方墨點法、凝膠電泳法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、免疫組織化學法(IHC)、免疫沉澱法(IP)、質譜分析法(MS)、反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)或定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(Real-time Q-PCR)，分別檢測正常組織、及待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質之表現量。較佳為，於本發明之肺癌轉移之評估方法之步驟(B)中，係透過西方墨點法、免疫組織化學法(IHC)、或定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應、凝膠電泳法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、質譜分析法(MS)以偵測該生物標記之表現量。
由於此分泌蛋白質與癌症轉移間之重要關聯性，因此，透過本發明之肺癌轉移之評估方法和生物標記，用於檢測受試者之檢體樣品中絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質之表現量，而可有效評估癌症轉移風險或抑制癌症轉移，以在轉移出去的腫瘤細胞尚未形成腫瘤之前或癌症轉移初期，及早發現並準確評估，進而提升肺癌病患之存活率。此外，更可將此生物標記，應用至臨床轉移預側或預後指標開發與藥物標靶治療上。
再者，本發明更提供一種用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物包括：一目標序列，且此目標序列係選自一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之基因。因此，透過使用本發明之siRNA化合物，可配合RNA干擾(RNAi)之基因療法，以達到抑制肺癌侵犯和移行之潛能，協助癌症治療並使肺癌病患之死亡率降低。
於本發明之用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物中，此目標序列係包括20-25個寡核苷酸。較佳為，絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之基因序列係為SEQ ID NO: 1。
 肺癌細胞株CL1
本實施例係使用具有不同移行及侵入特性之肺癌細胞株CL1-0及CL1-5，其係由台灣大學醫學院分子醫學研究所所提供。細胞株係在37℃、5% CO2 下，以含有10%胎牛血清(FBS)之RPMI 1640培養基培養。
收集肺癌細胞株所分泌之蛋白質體
當細胞生長至覆蓋組織培養盤八至九成滿後，以不含有血清之培養基清洗三次，以移除培養基中的血清，並在不含有血清之培養基下繼續培養24小時。收集培養基之上清液(conditioned medium,CM)，並離心以移除細胞殘骸或其他雜質。使用超濾離心管(Amicon Ultra-15 tubes，截留分子量(molecular weight cutoff)為3000 Da，Millipore,Billerica,MA)藉由離心以濃縮上清液。同時，使用Bradford蛋白質定量試劑(Bradford protein assay reagent,Bio-rad)測量肺癌細胞株CL1上清液中蛋白質濃度，即分泌蛋白質體之濃度。
分離純化分泌蛋白質體
將上述所得到之濃縮上清液樣本之分泌蛋白質體，以一純化膠體進行純化。其中，純化膠體之製備如下。首先，將0.6 mL水、2.22 mL 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)、90 μL 10% SDS、6 mL 40%雙丙烯醯胺(bis-acrylamide)、90 μL 10%過硫酸銨(ammonium persulfate)、及5 μL TEMED混合均勻，並進行凝固反應1小時，以製得一分離膠體層(即，高密度層)。接著，將2.9 mL水、0.5 mL 1 M Tris-HCl(pH 6.8)、40 μL 10% SDS、520 μL 30%雙丙烯醯胺、40 μL 10%過硫酸銨、及4 μL TEMED混合，置於分離膠體層上待其凝固，以製得一匯集膠體層(即，低密度層)。據此，則可製得一純化膠體，其包括一匯集膠體層(低密度層)、及一分離膠體層(高密度層)，且低密度層係疊置於高密度層上。
將100 μg之分泌蛋白質體與13 μL水、5 μL 4X樣本緩衝溶液、及2 μL 0.5 M DTT混合，置於加熱器內以95℃加熱10分鐘。接著，以55V進行膠體電泳。當樣品進入匯集膠體層與分離膠體層介面後，停止電泳並以考馬司亮藍(Coomassie Brilliant Blue(CBB) R-250)染色。
膠體內水解蛋白質體
取位於低密度層與高密度層介面之分泌蛋白質體，並將膠體切成約1 mm3 大小之片段。將膠體片段分別以25 mM碳酸氫銨(ammonium bicarbonate,ABC,pH 7.9)及25 mM ABC/50%乙腈(acetonitrile)清洗三次。接著，於56℃下與0.5 M DTT反應1小時，再於室溫下以100 μL飽和IAA暗反應45分鐘，使蛋白質氨甲酰甲基化carbamidomethylation。再重覆清洗兩次循環後，使用4 μg(1:25,w/w)胰蛋白酶(sequencing grade modified trypsin,Promega)/25 mM碳酸氫銨覆於膠體，並於37℃水浴槽進行胜肽裂解反應。經16-18小時的胰蛋白酶作用後，再以100 μL之50%乙腈/5%甲酸(formic acid)溶液萃取裂解之分泌蛋白質體(即，分泌蛋白質體之胜肽)兩次，再以碳18 tips(OMIX C18 tips,Varian)先移除水解過程中殘留的化學物質，以防干擾後續同位素標記試劑之訊號。
同位素試劑標記分泌蛋白質體之胜肽鏈
在此，係依照iTRAQ試劑(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)之使用手冊標記分泌蛋白質體之胜肽。
首先，將一單位之iTRAQ試劑回溶於70 μL之乙醇中，其中一單位係指標定100 μg蛋白質所需的量。將上述製備完成的樣本先以20 μL之iTRAQ緩衝溶液進行回溶，再分別在不同樣本中加入70 μL之iTRAQ試劑(iTRAQ115：iTRAQ116為1:1或iTRAQ114：iTRAQ117為1:1)，而後真空乾燥。進一步將乾燥之胜肽混合物樣本以10 μL之緩衝溶液(5 mM K2 HPO4 及25%乙腈[pH 3])回溶，使用AKTATM FPLC系統(GE Healthcare)以SCX層析管柱進行分離(fraction)，以降低樣本分析的複雜性。最後，依照碳18 tips(Varian)之使用手冊，去除分離過程使用之溶液所含鹽類，避免影響分析訊號。
以LC-ESI-MS/MS分析分泌蛋白質體之胜肽
將經iTRAQ試劑標記且分離後之分泌蛋白質體胜肽溶於緩衝溶液A(0.1%(v/v) FA之水溶液)中，再以串聯式液相層析質譜儀(LC-MS/MS)進行分析。於2分鐘內拉升0%至5%濃度梯度之緩衝溶液B(0.1%(v/v) FA之ACN溶液)，再於140分鐘內提升至37%，而儀器流速設定為200-300 nL/min。
經碰撞所導致分離之胜肽片段係使用Analyst QS v1.1(Biosystems)軟體之訊號相關收集(information-dependent acquisition)分析。於質譜儀分析中，先使用一次1-s TOF MS掃描；當目標離子強度高於20計數(count)時，進行三次2-s產物離子掃描(product ion scans)(MS/MS)。TOF MS掃描係在400-2000 m/z範圍下進行，而產物離子掃描設定係在低解析度且100-2000 m/z範圍下進行。
資料庫比對
將上述過程所鑑定出之蛋白質，使用MASCOT搜尋軟體(v2.1.0,Matrix Science,London,UK)與Swiss-Prot人類序列資料庫(20090616版本，468851條序列)進行比對。於ESI-Q-TOF所產生之MS/MS圖譜中之訊號，係於不同電荷狀態下(2+、3+、4+)以Analyst QS v1.1(Biosystems)分析。MS及MS/MS質量中心(centroid)參數係設為10高度百分比，且合併距離(merge distance)為0.1 amu。圖譜中低於5個訊號或前驅離子少於10計數/s所組成之平均參數，係設為MS/MS群組。胰蛋白酶切割失誤位置設訂為兩次、修飾選項設定為Aln與Gln具脫醯胺作用(deamidation)、Met具氧化作用、N端具iTRAQ、及Lys具iTRAQ修飾，將MS及MS/MS質量誤差(mass tolerance)之搜尋參數係分別設為1與0.5 Da。依據MASCOT鑑定結果，胜肽之離子分數需高於20時，以做為鑑定胜肽之標準。
經由上述分析後，於分泌蛋白質體之樣品中，共鑑定出331個蛋白質。
蛋白質量化
在此，係使用Multi-Q軟體對iTRAQ實驗數據進行蛋白質量化。將QSTAR Pulsar I所得之初步數據以mzFAST軟體轉換成mzXML格式，並將MASCOT數據以XML格式輸出。經Multi-Q軟體設定後，輸入以上數據後，Multi-Q可針對已鑑定到之胜肽(MASCOT分數高於20分)之iTRAQ標定訊號進行定量。
計算平均蛋白質含量比例係依照胜肽之訊號強度來對整體蛋白質訊號做一調整。
生物資訊分析
在此，係使用SignalP、SecretomeP、及TMHMM軟體分析所鑑定出之蛋白質，以判斷此些蛋白質係透過典型或非典型分泌途徑分泌，並判斷蛋白質序列中是否具有穿膜結構(transmembrane domain)。此外，蛋白質分子功能亦依照人類蛋白質資料庫(Human Protein Reference Database,HPRD)進行判定(http://www.hprd.org/)。
經分析結果顯示，有高達77.3%的蛋白質會藉由多種不同分泌路徑而分泌至細胞外。此外，經上述軟體分析後，可篩選出六十六種蛋白質，其在CL1-0及CL1-5中皆具有差異性之表現量，可能與肺癌轉移相關。
統計分析
以下實驗皆重複進行三次，且結果以平均值±SD表示，並利用以無參數之曼一惠特尼U考驗法(nonparametric Mann-Whitney U test)進行兩組間的比較分析，p<0.05表示具有顯著性的差異。
西方墨點法試驗
將上述所鑑定出六十六種與肺癌轉移相關之蛋白質，挑選出十二種蛋白質(Nidogen-1、MAGE-A4、PRDX1、CKB、PLAU、SERPLA1、TIMP、FN1、HSPA5、COL6A1、THBS1、及CTSL1)以西方墨點法試驗分析，以驗證此些蛋白質是否確實與肺癌轉移相關。
首先將5-30 μg之CL1細胞分泌蛋白質體以12%SDS-PAGE進行分離，並使用iBlot(Invitrogen)將蛋白質轉漬至PVDF膜(Millipore)上。以5%無脂牛奶於室溫下作用1小時(blocking)，而後以上述蛋白質之抗體(Santa Cruz Biotechnology)及抗-α-微管蛋白(anti-α-tubulin,Calbiochem)抗體反應3小時。之後，以TBST進行清洗三次，並以1：5000稀釋之二級抗體於室溫下反應1小時，再以TBST進行清洗五次。最後使用增強化學發光系統(Enhanced Chemiluminescence System)判讀所連接之抗體，並使用富士LAS3000系統(Fujifilm)擷取化學發光訊號。
上述西方墨點法試驗結果顯示，可觀察到高侵入能力之CL1-5中轉移能力較高的PLAU、SERPLA1、TIMP、FN1、HSPA5、COL6A1、THBS1、及CTSL1之表現量，以及低侵入能力之CL1-0中轉移能力較高的Nidogen-1、MAGE-A4、PRDX1、及CKB之表現量。其中，SERPLA1之實驗結果如圖1所示，SERPINA1在CL1-5細胞中之表現量遠高於在CL1-0細胞中之表現量，兩者具有顯著差異性。因此，西方墨點法試驗之實驗結果證實，本實施例之結合純化膠體、同位素試劑標記、及質譜儀分析，確實可鑑定出與肺癌轉移高度相關之蛋白質，尤其是本發明之SERPINA1。
siRNA干擾實驗
目前文獻均未報導SERPINA1會與癌症轉移相關。在此，係透過siRNA干擾實驗以證明SERPINA1與癌症轉移之相關性。
於本實驗中，係提供一SERPINA1 siRNA，其包括三組不同的siRNA複合體：SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6、及SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示序列之組合；及一FN1 siRNA，其包括三組不同的siRNA複合體：SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12、及SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示序列之組合，並使用siRNA轉殖試劑(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，依照使用手冊將上述siRNA轉殖至CL1-5細胞中。將80 pmol上述siRNA或亂序SERPINA1 siRNA與6 μL siRNA轉殖試劑添加至100 μL之siRNA轉殖培養基。將上述混合溶液與CL1-5細胞混合，並反應24小時。而後，去除培養基並將轉殖後之CL1-5細胞(3x105 )種殖在六孔盤中，以2 mL之含有10% FBS之無抗生素RPMI 1640培養基進行培養。將細胞置於37℃、5% CO2 之培養箱中培養至80%覆蓋培養盤。在此，實驗組係為以SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞；控制組係為以亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞；對照組係為以FN1 siRNA處理之CL1-5細胞。而後，以與上述西方墨點法試驗相同之測試方法，檢測siRNA干擾實驗之結果。此外，更以上述siRNA干擾實驗處理之CL1-5細胞進行後續實驗。
實驗結果證實，使用SERPINA1 siRNA確實可抑制CL1-5細胞中SERPINA1蛋白質表現；FN1 siRNA亦可抑制CL1-5細胞中FN1蛋白質表現。因此，本發明之SERPINA1 siRNA，確實可達到抑制SERPINA1蛋白質表現。
細胞傷口癒合試驗(wound-healing assay)
依照使用手冊(Ibidi,BioPhysics,USA)於CL1-5細胞上製作刻痕以觀察細胞移行狀況，並於含有10% FBS之RPMI 1640培養基中培養細胞。在此，係設計使細胞刻痕於24小時後癒合。以顯微鏡100倍放大下觀察細胞癒合情形，並使用Image-Pro Plus軟體(version 6.0)定量細胞移行面積。
實驗結果顯示，相較於亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，而使得細胞移行能力係大幅降低；而轉殖有FN1 siRNA之CL1-5細胞，細胞移行能力亦大幅降低，如圖2所示。
細胞移行試驗(migration assay)
在此，係使用細胞穿膜小室(transwell membrane)(孔洞尺寸8-μm,BD Bioscience)進行細胞移行試驗。將CL1-5細胞胰蛋白酶處理(trypsinized)、清洗、並懸浮在不含有FBS之培養基中。將每個培養槽之上層中置入1x105 個細胞(不含血清之培養基)，而於下層中置入含有10% FBS之RPMI 1640培養基，以誘導細胞進行移行。於24小時後，移除上層之培養基以停止反應，並取下小室上的膜。將此膜以甲醇進行固定，而後再以Giemsa染劑染色。最後，於顯微鏡200倍放大下觀察膜上之細胞數目，並在每個膜上隨機挑選6個區域以進行統計分析。
實驗結果如圖3所示，相較於亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，而使得細胞移形能力係大幅降低；而轉殖有FN1 siRNA之CL1-5細胞，細胞轉移能力亦大幅降低，如圖3所示。
細胞侵入試驗(Matrigel Invasion Assay)
在此，係使用膜侵入培養系統(membrane invasion culture system)檢測癌細胞侵入情形，其中細胞穿膜小室(transwell membrane)(孔洞尺寸8-μm,BD Bioscience)係塗覆有細胞基底膜基質(Matrigel basement membrane matrix,2mg/mL,BD Biosciences)。將每個培養槽之上層中置入1x105 個細胞(RPMI 1640培養基)，而於下層中置入含有10% FBS之RPMI 1640培養基。於37℃培養室內反應24小時。而後，將小室上的膜以甲醇固定，並以Giemsa染劑染色，於顯微鏡200倍放大下以觀察膜上之細胞數目。
實驗結果顯示，相較於亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，而使得細胞侵入能力係大幅降低；而轉殖有FN1 siRNA之CL1-5細胞，細胞侵入能力亦大幅降低，如圖4所示。
流式細胞儀分析(Flow cytometry)
利用螢光激活細胞分選儀(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)定量細胞表面之FN1蛋白表現量。首先，將CL1-0細胞和CL1-5細胞以胰蛋白酶切下並於20% FBS之培養液培養2小時後，以PBS清洗一次。接著，將兔子抗-FN1抗體(rabbit anti-FN1,Sigma)使用含1% BSA之PBS以1：600稀釋，加入細胞中於4℃下培養1小時，再加入螢光異硫氰酸酯-結合之猴子抗-兔子抗體(fluorescein isothiocyanate-conjugated donkey anti-rabbit antibody)於4℃下染色1小時，並以2%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定。最後，使用FACS(Coulter Epics Profile,BD Biosciences)進行分析。
實驗結果顯示，圖5為低侵入能力之CL1-0，只有9.09%之細胞表面上有FN1表現；圖6為高侵入能力之CL1-5，有98.26%之細胞表面上有FN1聚集表現；相較於圖7之亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞有76.14%細胞有FN1聚集表現，圖8之使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，僅有18.16%FN1之細胞表面上有FN1表現。藉此，SERPINA1確實可調控細胞周圍之FN1聚集於細胞表面，以達到促進癌細胞之轉移。
小鼠肺部腫瘤轉移試驗
將轉殖後的細胞於20% FBS之培養液懸浮培養2小時，接著，從八週大裸鼠(nude mice)的尾靜脈注射入2×106 個腫瘤細胞，其懸浮於0.2 mL RPMI-1640基礎培養液。注射腫瘤細胞後八週將小鼠犧牲，取出肺臟秤重並以3.7%福馬林(formalin)固定。另外，肺部腫瘤立即以實臘包埋，切成4-mm厚度的切片，以蘇木色素(hematoxylin)和伊紅(eosin)進行H&E染色，用以分析肺腫瘤之組織狀態。
實驗結果顯示，以小鼠肺重量比上小鼠體重來看，相較於亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，而使肺部轉移之腫瘤細胞較少，所以肺重量也較輕；而轉殖有FN1 siRNA之CL1-5細胞，肺部轉移之腫瘤細胞亦較少，如圖9所示。另外，肺部腫瘤切片染色中，亂序SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，其小鼠之肺組織中，肺泡的空間幾乎都被轉移之腫瘤組之填滿；而使用上述SERPINA1 siRNA處理之CL1-5細胞，因RNA干擾降低了SERPINA1蛋白質表現，所以其小鼠肺組織之肺泡空間充足，少有腫瘤細胞填滿；而轉殖有FN1 siRNA之CL1-5細胞，其小鼠肺組織亦有充足空間之肺泡。
綜合上述實驗結果，抑制SERPINA1蛋白質表現確實可降低CL1-5肺癌細胞之移行及侵入能力，且可以減少聚集在細胞表面之FN1蛋白表現。據此，SERPINA1蛋白質與肺癌細胞移行/侵入有極高的關聯性；故若透過本發明之RNAi基因療法，可有效抑制SERPINA1蛋白質表現，進而達到抑制肺癌細胞轉移之目的。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
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圖1係本發明之西方墨點法試驗之SERPINA1結果圖。
圖2係本發明之細胞傷口癒合細胞移行試驗結果圖。
圖3係本發明之細胞移行試驗結果圖。
圖4係本發明之細胞侵入試驗結果圖。
圖5係本發明之流式細胞儀分析之CL1-0結果圖。
圖6係本發明之流式細胞儀分析之CL1-5結果圖。
圖7係本發明之流式細胞儀分析之控制組結果圖。
圖8係本發明之流式細胞儀分析之實驗組結果圖。
圖9係本發明之肺部腫瘤轉移試驗結果圖。

Claims (12)

  1. 一種肺癌轉移之評估方法，包括：(A)提供一受試者之檢體樣品，該檢體樣品係包括一正常組織、及一待檢組織；(B)分別檢測該正常組織、及該待檢組織中之一生物標記之表現量，其中該生物標記係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)；以及(C)比較該正常組織、及該待檢組織中之該生物標記之表現量，當該待檢組織中之該生物標記之表現量高於該正常組織中之該生物標記之表現量，代表該受試者具有癌症轉移之風險；其中該絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之核苷酸鏈序列係為一與SEQ ID NO：1所示之序列具有100%一致性之核苷酸鏈序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之評估方法，其中該正常組織係為一正常體組織、或一正常血液組織；且該待檢組織係為一肺癌病患腫瘤組織、或一肺癌病患血液組織。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之評估方法，其中於步驟(B)中，係分別檢測該正常組織、及該待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之mRNA、或蛋白質之表現量。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之評估方法，其中於步驟(B)中，係分別檢測該正常組織、及該待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質之表現量。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之評估方法，其中係透過西方墨點法、凝膠電泳法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、免疫組織化學法(IHC)、免疫沉澱法(IP)、或質譜分析法(MS)分別檢測該正常組織、及該待檢組織中之絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質之表現量。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之評估方法，其中該絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質序列係為一與SEQ ID NO：2所示之序列具有100%一致性之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之評估方法，其中該肺癌係為一非小細胞肺癌。
  8. 一種生物標記於評估肺癌轉移上之用途，該生物標記係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之一核苷酸序列、該核苷酸序列之互補股、及一蛋白質序列所組成之群組；其中該絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之核苷酸鏈序列係為一與SEQ ID NO：1所示之序列具有100%一致性之核苷酸鏈序列。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，該生物標記係為一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之該蛋白質序列。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之蛋白質序列係為一與SEQ ID NO：2所示之序列具有100%一致性之胺基酸序列。
  11. 一種siRNA化合物於製造抑制肺癌轉移藥物上之用途，該siRNA化合物包括：一目標序列，該目標序列係選自一絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之基因；其中該目標序列係SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之組合、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之組合、或SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之組合。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該絲胺酸蛋白抑制酶A亞型α1-抗胰蛋白酶之基因序列係為SEQ ID NO：1。
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