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TWI441646B - 帕妥珠單抗(pertuzumab)用於製備治療人類病患癌症之藥物的用途 - Google Patents

帕妥珠單抗(pertuzumab)用於製備治療人類病患癌症之藥物的用途 Download PDF

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TWI441646B
TWI441646B TW094119913A TW94119913A TWI441646B TW I441646 B TWI441646 B TW I441646B TW 094119913 A TW094119913 A TW 094119913A TW 94119913 A TW94119913 A TW 94119913A TW I441646 B TWI441646 B TW I441646B
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David E Allison
Rene Bruno
Jian-Feng Lu
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Publication date
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Description

帕妥珠單抗(pertuzumab)用於製備治療人類病患癌症之藥物的用途
本發明係關於HER抗體(如帕妥珠單抗，Pertuzumab)之固定劑量。
 HER受體及其抗體
受體酪胺酸激酶之HER家族為細胞生長、分化及存活之重要介質。受體家族包括四個不同成員，包括上皮生長因子受體(EGFR,epidermal growth factor receptor、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu )、HER3(ErbB3)及HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因編碼的EGFR引起人類的惡性腫瘤。特別是，在乳癌、膀胱癌、肺癌、頭頸部癌及胃癌以及神經膠母細胞瘤(glioblastomas)中觀察到增加的EGFR表現。增加的EGFR受體表現常伴隨由自身分泌刺激途徑由造成受體活化的相同腫瘤細胞增加製造EGFR配體(轉化生長因子α(TGF-α,transforming growth factor alpha))。Baselga及Mendelsohn,Pharmac.Ther.64：127-154(1994)。已評估針對EGFR或其配體(TGF-α及EGF)之單株抗體作為治療此等惡性腫瘤之治療藥劑。見如Baselga及Mendelsohn，同前；Masui等人，Cancer Research 44：1002-1007(1984)；及Wu等人，J.Clin.Invest.95：1897-1905(1995)。
HER家族的第二個成員-p185neu 起初被視為來自化學治療的大鼠神經母細胞瘤(neuroblastomas)轉化基因之產物。neu原致癌基因的活化形式係由編碼的蛋白質之跨膜區域 中點突變(纈胺酸至麩胺酸)形成。在乳癌及卵巢癌中觀察到人類neu同源基因的放大及與不良預後有關聯(Slamon等人，Science,235：177-182(1987)；Slamon等人，Science,244：707-712(1989)；及美國專利第4,968,603號)。迄今，人類腫瘤未曾報導有類似於neu原致癌基因的點突變。也於其他癌中觀察到HER2之過度表現(由於基因放大，為經常但非一致地)，包括胃癌、子宮內膜癌、唾腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌及膀胱癌。其中見King等人，Science,229：974(1985)；Yokota等人，Lancet,1：765-767(1986)；Fukushige等人，Mol Cell Biol.,6：955-958(1986)；Guerin等人，Oncogene Res.,3：21-31(1988)；Cohen等人，Oncogene,4：81-88(1989)；Yonemura等人，Cancer Res.,51：1034(1991)；Borst等人，Gynecol.Oncol.,38：364(1990)；Weiner等人，Cancer Res.,50：421-425(1990)；Kern等人，Cancer Res.,50：5184(1990)；Park等人，Cancer Res.,49：6605(1989)；Zhau等人，Mol.Carcinog.,3：254-257(1990)；Aasland等人，Br.J.Cancer 57：358-363(1988)；Williams等人，Pathobiology 59：46-52(1991)；及McCann等人，Cancer,65：88-92(1990)。HER2可能於前列腺癌中過度表現(Gu等人，Cancer Lett.99：185-9(1996)；Ross等人，Hum.Pathol.28：827-33(1997)；Ross等人，Cancer 79：2162-70(1997)；及Sadasivan等人，J.Urol.150：126-31(1993))。
曾說明針對大鼠p185neu 及人類HER2蛋白質產物之抗體。
杜賓(Drebin)及同事已培養針對大鼠neu基因產物(p185neu )之抗體。見例如Drebin等人，Cell 41：695-706(1985)；Myers等人，Meth.Enzym.198：277-290(1991)；及WO94/22478。Drebin等人，Oncogene 2：273-277(1988)報告與p185neu 兩個不同區域反應的抗體混合物造成對植入裸鼠的neu轉化NIH-3T3細胞之協同抗腫瘤效果。也見於1998年10月20日發行的美國專利第5,824,311號。
Hudziak等人，Mol.Cell.Biol.9(3)：1165-1172(1989)說明一組HER2抗體之產生，其係利用人類乳房腫瘤細胞株SK-BR-3而鑑定。在暴露至抗體後SK-BR-3細胞之相對細胞增殖係由72小時後結晶紫染色單層而決定。利用此分析法，得到最大抑制的為稱為4D5之抗體，其抑制細胞增殖56%。於此組中的其他抗體於此分析法中以較少程度降低細胞增殖。進一步發現抗體4D5使過度表現HER2之乳房腫瘤細胞株對TNF-α的細胞毒性作用更加敏感。也見於1997年10月14日發行的美國專利第5,677,171號。於Hudziak等人中討論的HER2抗體進一步於Fendly等人，Cancer Reseach 50：1550-1558(1990)；Kotts等人，In Vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup等人，Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard等人，J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumar等人，Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewis等人，Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras等人，Oncogene 9：1829-1838(1994)；Vitetta等人，Cancer Research 54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.269(20)：14661- 14665(1994)；Scott等人，J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D'souza等人，Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis等人，Cancer Research 56：1457-1465(1996)；及Schaefer等人，Oncogene 15：1385-1394(1997)中鑑定。
鼠科HER2抗體4D5之重組人化形式(huMAb4D5-8,rhuMAb HER2，搓杜滋美(trastuzumab)或HERCEPTINTM ；美國專利第5,821,337號)於已接受大量先前抗癌治療之具有過度表現HER2的轉移性乳癌病患中為臨床上有活性(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。搓杜滋美於1998年9月25日通過食品及藥物管理局核准上市，用以治療具有腫瘤過度表現HER2蛋白質之轉移性乳癌病患。
其他具有不同性質的HER2抗體已說明於Tagliabue等人，Int.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie等人，Oncogene 4：543-548(1989)；Maier等人，Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等人，Molecular Carcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski等人，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等人，Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等人，Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等人，Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等人，Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等人，Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等人，Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth等人，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美國專利第5,783,186號；及Klapper等人， Oncogene 14：2099-2109(1997)。
同源篩選已造成兩個其他HER受體家族成員的鑑定；HER3(美國專利第5,183,884及5,480,968號及Kraus等人，PNAS(USA)86：9193-9197(1989))及HER4(歐洲專利申請案第599,274號；Plowman等人，PNAS(USA)90：1746-1750(1993)；及Plowman等人，Nature,366：473-475(1993))。此二者受體皆於至少一些乳癌細胞株中呈現增加的表現。
HER受體於細胞中一般以許多組合存在且將異體二聚合視為增加細胞對許多HER配體反應之多樣性(Earp等人，Breast Cancer Research and Treatment 35：115-132(1995))。EGFR由六個不同配體結合；上皮生長因子(EGF,epidermal growth factor)、轉化生長因子α(TGF-α,transforming growth factor alpha)、雙調蛋白(amphiregulin)、肝素結合表皮生長因子(HB-EGF,heparin binding epidermal growth factor)、β 細胞素及表皮調節素(epiregulin)(Groenen等人，Growth Factors 11：235-257(1994))。由單一基因的交替接合形成的神經調節素(heregulin)蛋白質家族為HER3及HER4的配體。神經調節素家族包括α 、β 及γ 神經調節素(Holmes等人，Science,256：1205-1210(1992)；美國專利第5,641,869號；及Schaefer等人，Oncogene 15：1385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs,neu differentiation factors)、神經膠質生長因子(GGFs,glial growth factors)；乙醯膽鹼受體活性誘導蛋白(ARIA,acetylcholine receptor inducing activity protein)；及感覺及運動神經元衍生因子(SMDF,sensory and motor neuron derived factor)。文獻回顧見Groenen等人，Growth Factors 11：235-257(1994)；Lemke,G.Molec.& Cell.Neurosci.7：247-262(1996)及Lee等人，Pharm.Rev.47：51-85(1995)。近來確認三個其他HER配體：報導結合HER3或HER4之神經調節素-2(NRG-2,Neuregulin-2)(Chang等人，Nature 387 509-512(1997)；及Carraway等人Nature 387：512-516(1997))；結合HER4之神經調節素-3(Zhang等人，PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；及結合HER4之神經調節素-4(Harari等人，Oncogene 18：2681-89(1999))。HB-EGF、β細胞素及表皮調節素也結合至HER4。
雖然EGF及TGFα 不結合HER2，EGF刺激EGFR及HER2形成異二聚體，其活化EGFR及造成異二聚體中HER2的轉磷酸化。二聚合及/或轉磷酸化似乎活化HER2酪胺酸激酶。見Earp等人，同前。同樣地，當HER3與HER2共同表現時，形成活性信號複合物且針對HER2的抗體能夠瓦解此複合物(Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994))。此外，當與HER2共同表現時，HER3對神經調節素(HRG,heregulin)的親合力增加至較高親合力狀態。關於HER2-HER3蛋白質複合物也見於Levi等人，Journal of Neuroscience 15：1329-1340(1995)；Morrissey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1431-1435(1995)；及Lewis等人，Cancer Res.,56：1457-1465(1996)。如同HER3，HER4與HER2形成活性信號複合物(Carraway及 Cantley,Cell 78：5-8(1994))。
關於HER抗體之專利公告包括：US 5,677,171,US 5,720,937,US 5,720,954,US 5,725,856,US 5,770,195,US 5,772,997,US 6,165,464,US 6,387,371,US 6,399,063,US2002/0192211A1,US 6,015,567,US 6,333,169,US 4,968,603,US 5,821,337,US 6,054,297,US 6,407,213,US 6,719,971,US 6,800,738,US2004/0236078A1,US 5,648,237,US 6,267,958,US 6,685,940,US 6,821,515,WO98/17797,US 6,127,526,US 6,333,398,US 6,797,814,US 6,339,142,US 6,417,335,US 6,489,447,WO99/31140,US2003/0147884A1,US2003/0170234A1,US2005/0002928A1,US 6,573,043,US2003/0152987A1,WO99/48527,US2002/0141993A1,WO01/00245,US2003/0086924,US2004/0013667A1,WO00/69460,WO01/00238,WO01/15730,US 6,627,196B1,US6,632,979B1,WO01/00244,US2002/0090662A1,WO01/89566,US2002/0064785,US2003/0134344,WO 04/24866,US2004/0082047,US2003/0175845A1,WO03/087131,US2003/0228663,WO2004/008099A2,US2004/0106161,WO2004/048525,US2004/0258685A1,US 5,985,553,US 5,747,261,US 4,935,341,US 5,401,638,US 5,604,107,WO 87/07646,WO 89/10412,WO 91/05264,EP 412,116 B1,EP 494,135 B1,US 5,824,311,EP 444,181 B1,EP 1,006,194 A2,US 2002/0155527A1,WO 91/02062,US 5,571,894,US 5,939,531,EP 502,812 B1,WO 93/03741,EP 554,441 B1,EP 656,367 A1,US 5,288,477,US 5,514,554,US 5,587,458,WO 93/12220,WO 93/16185,US 5,877,305,WO 93/21319,WO 93/21232,US 5,856,089,WO 94/22478,US 5,910,486,US 6,028,059,WO 96/07321,US 5,804,396,US 5,846,749,EP 711,565,WO 96/16673,US 5,783,404,US 5,977,322,US 6,512,097,WO 97/00271,US 6,270,765,US 6,395,272,US 5,837,243,WO 96/40789,US 5,783,186,US 6,458,356,WO 97/20858,WO 97/38731,US 6,214,388,US 5,925,519,WO 98/02463,US 5,922,845,WO 98/18489,WO 98/33914,US 5,994,071,WO 98/45479,US 6,358,682 B1,US 2003/0059790,WO 99/55367,WO 01/20033,US 2002/0076695 A1,WO 00/78347,WO 01/09187,WO 01/21192,WO 01/32155,WO 01/53354,WO 01/56604,WO 01/76630,WO02/05791,WO 02/11677,US 6,582,919,US2002/0192652A1,US 2003/0211530A1,WO 02/44413,US 2002/0142328,US 6,602,670 B2,WO 02/45653,WO 02/055106,US 2003/0152572,US 2003/0165840,WO 02/087619,WO 03/006509,WO03/012072,WO 03/028638,US 2003/0068318,WO 03/041736,EP 1,357,132,US 2003/0202973,US 2004/0138160,US 5,705,157,US 6,123,939,EP 616,812 B1,US 2003/0103973,US 2003/0108545,US 6,403,630 B1,WO 00/61145,WO 00/61185,US 6,333,348 B1,WO 01/05425,WO 01/64246,US 2003/0022918,US 2002/0051785 A1,US 6,767,541,WO 01/76586,US 2003/0144252,WO 01/87336,US 2002/0031515 A1,WO 01/87334,WO 02/05791,WO 02/09754,US 2003/0157097,US 2002/0076408,WO 02/055106,WO 02/070008,WO 02/089842 and WO 03/86467。
診斷法
基於HER2過度表現/放大選擇用HER2抗體搓杜滋美做治療之病患。見例如WO99/31140(Paton等人)、US2003/0170234A1(Hellmann,S.)及US2003/0147884(Paton等人)；以及WO01/89566、US2002/0064785及US2003/0134344(Mass等 人)。也見US2003/0152987(Cohen等人)關於免疫組織化學(IHC,immunohistochemistry)及螢光原位雜交法(FISH,fluorescence in situ hybridization)偵測HER2過度表現及放大。
WO2004/053497(Bacus等人)係關於決定或預測對HERCEPTINTM 療法的反應。US2004/013297A1(Bacus等人)關於決定或預測對ABX0303 EGFR抗體療法的反應。WO2004/000094(Bacus等人)係針對決定對GW572016(一種小分子，EGFR-HER2酪胺酸激酶抑制劑)的反應。WO2004/063709(Amler等人)係關於生物標誌物及用以決定對EGFR抑制劑(厄洛替尼(erlotinib)鹽酸鹽)的敏感性之方法。US2004/0209290(Cobleigh等人)關於乳癌預後的基因表現標誌物。
用帕妥珠單抗治療的病患可基於HER活化或二聚合而選擇做治療。關於帕妥珠單抗及以此做治療的病患之選擇之專利公告包括：WO01/00245(Adams等人)；US2003/0086924(Sliwkowski,M.)；US2004/0013667A1(Sliwkowski,M.)；以及WO2004/008099A2及US2004/0106161(Bossenmaier等人)。
Cronin等人，Am.J.Path.164(1)：35-42(2004)說明在儲存的石蠟包埋組織中基因表現的量測。Ma等人，Cancer Cell 5：607-616(2004)說明利用取自儲存的原始切片之腫瘤組織切片分離之RNA藉基因寡核苷酸微陣列之基因圖譜。
抗癌藥物及HER抗體之投藥
討論抗癌藥物投藥之文獻包括：Egorin,M.J.Clin Oncol 2003；21：182-3(2003)；Baker等人，J.Natl Cancer Inst 94：1883-8(2002)；Felici等人，Eur.J.Cancer 38：1677-84(2002)；Loos等人，Clin.Cancer Res.6：2685-9(2000)；de Jongh等人，J.Clin.Oncol.19：3733-9(2001)；Mathijssen等人，J.Clin.Oncol.20：81-7(2002)；及de Jong等人，Clin.Cancer Res 10：4068-71(2004)。
通常，已將市售人化IgG單株抗體(即搓杜滋美、及貝伐單抗(bevacizumab)(Genentech Inc.,South San Francisco)及吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)(Wyreth Pharmaceuticals,Philadelphia))及於腫瘤學中之細胞毒性小分子藥物以重量為基礎(mg/kg)或以體表面積(BSA,body surface area)為基礎投藥方法給予。
西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX®)為結合EGF受體的抗體及經核准治療結腸直腸癌。於結腸直腸癌中，於2小時內藉靜脈內輸注給予西妥昔單抗400毫克/平方米作為載入劑量(loading dose)。之後每週一次於1小時內給予維持劑量250毫克/平方米。見西妥昔單抗藥方資訊。
將搓杜滋美(HERCEPTIN®)以4毫克/公斤首次劑量給予具有轉移性乳癌的病患，之後每週2毫克/公斤劑量。見搓杜滋美藥方資訊。
也見WO99/31140；US2003/0147884A1；US2003/0170234A1；US2005/0002928A1；WO00/69460；WO01/15730及US 6,627,196B1關於搓杜滋美投藥。
帕妥珠單抗(也稱為重組人類單株抗體2C4；OMNITARGTM ， Genentech,Inc.,South San Francisco)代表第一個已知作為HER二聚合抑制劑(HDI,HER dimerization inhibitors)之一類新藥物及作用為抑制HER2與其他HER受體(如EGFR/HER1、HER3及HER4)形成活性異二聚體的能力且無論HER2表現量皆有活性。見例如Harari及Yarden Oncogene 19：6102-14(2000)；Yarden及Sliwkowski,Nat Rev Mol Cell Biol 2：127-37(2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol 10：158-9(2003)；Cho等人，Nature 421：756-60(2003)；及Malik等人，Pro Am Soc Cancer Res 44：176-7(2003)。
已證實於腫瘤細胞中帕妥珠單抗阻擋HER2-HER3異二聚體之形成抑制重要細胞信號傳遞，其造成降低腫瘤增殖及存活(Agus等人，Cancer Cell 2：127-37(2002))。
帕妥珠單抗已經歷臨床第Ia階段試驗於具有晚期癌症病患及第II階段試驗於具有卵巢癌及乳癌以及肺癌及前列腺癌的病患作為單一藥物測試。於第I階段研究中，將具有在標準療法期間或之後已發展成無法治療的、局部嚴重性、復發或轉移性實體腫瘤之病患用帕妥珠單抗每3週靜脈內給予治療。帕妥珠單抗一般為良好耐受性。可評估反應的20個病患中有3個人達到腫瘤退化(tumor regression)。兩個病患已確認部份反應。於21個病患中有六人觀察到維持超過2.5個月穩定疾病(Agus等人，Pro Am Soc Clin Oncol 22：192(2003))。以2.0-15毫克/公斤之劑量，帕妥珠單抗的藥物動力學為線性，平均清除範圍為2.69至3.74毫升/天/公斤及平均末相排除半衰期範圍為15.3至27.6天。未 偵測到對帕妥珠單抗的抗體(Allison等人，Pro Am Soc Clin Oncol 22：197(2003))。於第I階段試驗中將帕妥珠單抗以重量為基礎(mg/kg)投藥。第II階段試驗已利用固定劑量開始。
本發明提供人化IgG1單株抗體固定劑量投藥對藥物動力學及目標藥物濃度的影響及用途之第一個重要評估。此分析HER抗體帕妥珠單抗之主要目的為：1)評估帕妥珠單抗於癌症病患中的群體藥物動力學及預期共變量(covariates)，及2)在固定劑量、或以體重、及以體表面積(BSA,body surface area)為基礎的投藥後檢視穩定狀態最低濃度之變化性及暴露。
因此，於第一個觀點中，本發明提供一種用以治療癌症的方法，包含有以有效治療癌症的劑量給予一或多個固定劑量之HER抗體至人類病患。
於另一個觀點中，本發明提供一種治療人類病患癌症的方法，包含有給予至少一個固定劑量之帕妥珠單抗至病患，其中固定劑量係選自約420毫克、約525毫克、約840毫克及約1050毫克帕妥珠單抗組成之群組。
本發明也關於製造包含有含固定劑量HER抗體之小瓶的物品，其中固定劑量係選自約420毫克、約525毫克、約840毫克及約1050毫克HER抗體組成之群組。
I.定義
治療藥物之「固定」或「均一」劑量於本文中意指不管病患的體重(WT,weight)或體表面積(BSA,body surface area)，將一劑量給予人類病患。所以固定或均一的劑量不提供作為毫克/公斤劑量或毫克/平方米劑量，而是治療藥物的絕對用量。
「載入」劑量於本文中一般包含給予至病患治療藥物之起始劑量，隨後給予其一或多個維持劑量。一般而言，給予單一載入劑量，但於本文中也預期多次載入劑量。通常，給予的載入劑量的量超過給予的維持劑量的量及/或將載入劑量比維持劑量更頻繁給予，以致於比維持劑量能達到的早達到治療藥物之理想穩定狀態濃度。
「維持」劑量於本文中意指於治療期間給予病患的一或多劑量的治療藥物。通常，將維持劑量以間隔的治療間隔給予，如約每週，約每2週，約每3週或約每4週。
「HER受體」為一種受體蛋白酪胺酸激酶，其屬於HER受體家族及包括EGFR、HER2、HER3及HER4受體。HER受體一般將包含有一個細胞外區域，其可結合HER配體及/或與另一個HER受體分子二聚化；親油性跨膜區域；保守的細胞內酪胺酸激酶區域；及羧基端訊息傳遞區域帶有數個可被磷酸化的酪胺酸殘基團。HER受體可為「天然序列」HER受體或其「胺基酸序列變體」。較佳的是，HER受體為天然序列人類HER受體。
於本文中可相互交換地使用用詞「ErbB1」、「HER1」、「上皮生長因子受體」及「EGFR」及意指如例如於 Carpenter等人Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中所揭示的EGFR，包括其自然發生的突變形式(如於Humphrey等人，PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中之缺失突變體EGFR)。erbB1意指編碼EGFR蛋白質產物的基因。
於本文中可相互交換地使用表示法「ErbB2」及「HER2」及意指說明於例如Semba等人PNAS(USA)82：6497-6501(1985)及Yamamoto等人，Nature 319：230-234(1986)之人類HER2蛋白質(基因庫登錄號碼X03363)。用詞「erbB2」意指編碼人類ErbB2的基因及「neu」意指編碼大鼠p185neu 的基因。較佳的HER2為天然序列人類HER2。
HER2的細胞外區域包含有四個區域：「區域I」(胺基酸基團由約1-195；SEQ ID NO：19)、「區域II」(胺基酸基團由約196-319；SEQ ID NO：20)、「區域III」(胺基酸基團由約320-488；SEQ ID NO：21)及「區域IV」(胺基酸基團由約489-630；SEQ ID NO：22)(基團編號無信號胜肽)。見Garrett等人，Mol.Cell.11：495-505(2003),Cho等人，Nature 421：756-760(2003),Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)及Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)，以及本文中的圖1。
AErbB3"及AHER3"表示在例如美國專利第5,183,884號及第5,480,968號及Kraus等人PNAS(USA)86：9193-9197(1989)所揭示之受體多肽。
用詞「ErbB4」及「HER4」於本文中意指如例如於歐洲 專利申請案第599,274號；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：1746-1750(1993)；Plowman等人，Nature,366：473-475(1993)中揭示的受體多胜肽，包括其異構體，如揭示於1999年4月22日公告的世界專利WO99/19488。
由「HER配體」意指結合至及/或活化HER受體之多胜肽。本文中特別有興趣的HER配體為天然序列人類HER配體如上皮生長因子(EGF,epidermal growth factor)(Savage等人，J.Biol.Chem.247：7612-7621(1972))；轉化生長因子α(TGF-α,transforming growth factor alpha)(Marquardt等人，Science 223：1079-1082(1984))；雙調蛋白也稱為雪旺氏瘤(schwanoma)或角質細胞自身分泌生長因子(Shoyab等人，Science 243：1074-1076(1989)；Kimura等人，Nature 348：257-260(1990)；及Cook等人，Mol.Cell.Biol.11：2547-2557(1991))；β細胞素(Shing等人，Science 259：1604-1607(1993)；及Sasada等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝素結合表皮生長因子(HB-EGF,heparin binding epidermal growth factor)(Higashiyama等人，Science 251：936-939(1991))；表皮調節素(Toyoda等人，J.Biol.Chem.270：7495-7500(1995)；及Komurasaki等人，Oncogene 15：2841-2848(1997))；神經調節素(見以下)；神經調節素-2(NRG-2,Neuregulin-2)(Carraway等人Nature 387：512-516(1997))；神經調節素-3(NRG-3,Neuregulin-3)(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562-9567(1997))；神經調節素- 4(NRG-4,Neuregulin-4)(Harari等人，Oncogene 18：2681-89(1999))；及cripto(CR-1)(Kannan等人，J.Biol.Chem.272(6)：3330-3335(1997))。結合EGFR的HER配體包括EGF、TGF-α、雙調蛋白、β細胞素、HB-EGF及表皮調節素。結合HER3的HER配體包括神經調節素。能夠結合HER4的HER配體包括β細胞素、表皮調節素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4及神經調節素。
當於本文中使用「神經調節素」(HRG,heregulin)時意指由神經調節素基因產物編碼的多胜肽，如美國專利第5,641,869號或Marchionni等人，Nature,362：312-318(1993)中所揭示。神經調節素的實例包括神經調節素-α、神經調節素-β1、神經調節素-β2及神經調節素-β3(Holmes等人，Science,256：1205-1210(1992)；及美國專利第5,641,869號)；及neu分化因子(NDF,neu differentiation factor)(Peles等人，Cell 69：205-216(1992))；乙醯膽鹼受體活性誘導(ARIA,acetylcholine receptor inducing activity)(Falls等人，Cell 72：801-815(1993))；神經膠質生長因子(GGFs,glial growth factors)(Marchionni等人，Nature,362：312-318(1993)；感覺及運動神經元衍生因子(SMDF,sensory and motor neuron derived factor)(Ho等人，J.Biol.Chem.270：14523-14532(1995))；γ-神經調節素(Schaefer等人，Oncogene 15：1385-1394(1997))。
於本文中「HER二聚體」為非共價結合的二聚體，包含有至少兩個HER受體。當表現二或多個HER受體的細胞暴 露至HER配體時，此複合物可能及可藉免疫沉澱法分離及藉SDS-PAGE分析，如例如說明於Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)。此HER二聚體的實例包括EGFR-HER2、HER2-HER3及HER3-HER4異二聚體。再者，HER二聚體可包含二或多個HER2受體與不同HER受體結合，如HER3、HER4或EGFR。其他蛋白質如細胞激素受體次單元(如gp130)可與此二聚體結合。
「HER抑制劑」為一種藥劑，其干擾HER活化或作用。HER抑制劑的實例包括HER抗體(如EGFR、HER2、HER3或HER4抗體)；EGFR目標的藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪胺酸激酶抑制劑；HER2及EGFR雙酪胺酸激酶抑制劑如lapatinib/GW572016；反意義分子(見例如WO2004/87207)；及/或結合至或干擾下游信號分子(如MAPK或Akt)的功能之藥劑(見圖5)。較佳的是，HER抑制劑為抗體或結合至HER受體之小分子。
「HER抗體」為結合至HER受體之抗體。視情況，HER抗體更干擾HER活化或作用。較佳的是，HER抗體結合至HER2受體。本文中特別有興趣的HER2抗體為帕妥珠單抗。HER2抗體的另一個實例為搓杜滋美。EGFR抗體的實例包括西妥昔單抗及ABX0303。
「HER活化」異指任何一或多個HER受體之活化或磷酸化。一般而言，HER活化造成訊號傳導(如由HER受體之細胞內激酶區域磷酸化HER受體或受質多胜肽中的酪胺酸基團造成)。HER活化可受HER配體結合至包含有研究的HER 受體之HER二聚體而調節。HER配體結合至HER二聚體可能活化二聚體中一或多個HER受體之激酶區域及因而造成磷酸化一或多個HER受體之酪胺酸基團及/或磷酸化其他受質多胜肽中的酪胺酸基團，如Akt或MAPK細胞內激酶。例如見圖5。
「磷酸化」意指加入一或多個磷酸根基團至蛋白質(如HER受體)或其受質。
「抑制HER二聚合」的抗體為抑制或干擾HER二聚體形成之抗體。較佳的是，此抗體結合至HER2於其異二聚體結合位置。本文中最佳的二聚合抑制抗體為帕妥珠單抗或MAb 2C4。2C4結合至HER2之異二聚體結合位置係說明於圖4中。抑制HER二聚合的抗體之實例包括結合至EGFR及抑制其與一或多個其他HER受體二聚合的抗體(例如EGFR單株抗體806(MAb 806)，其結合至活化或「無束縛」的EGFR；見Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；結合至HER3及抑制其與一或多個其他HER受體二聚合的抗體；及結合至HER4及抑制其與一或多個其他HER受體二聚合的抗體。
「比搓杜滋美更有效抑制HER二聚合」的抗體為比搓杜滋美更有效降低或消除HER二聚體者(例如更有效至少約2倍)。較佳的是，此抗體抑制HER2二聚合至少如由鼠科單株抗體2C4、鼠科單株抗體2C4之Fab片段、帕妥珠單抗及帕妥珠單抗的Fab片段組成的族群選出的抗體一般有效。藉由直接研究HER二聚體或藉由評估HER活化(或由HER二 聚合而產生的下游信號)及/或藉由評估抗體-HER2結合位置等，吾人可評估HER二聚合抑制。篩選具有比搓杜滋美更有效抑制HER二聚合之能力的抗體之分析法係說明於Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)及WO01/00245(Adams等人)。僅作為實例，藉由評估例如抑制HER二聚體形成(見如Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)之圖1A-B；及WO01/00245)；降低HER配體活化表現HER二聚體的細胞(例如WO01/00245及Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)之圖2A-B)；阻止HER配體結合至表現HER二聚體的細胞(例如WO01/00245及Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)之圖2E)；在HER配體存在(或不存在)中表現HER二聚體的癌細胞(如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-1、MD-MB-175、T-47D細胞)之細胞生長抑制(例如WO01/00245及Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)之圖3A-D)；下游信號之抑制(例如抑制HRG-相關的AKT磷酸化或抑制HRG-或TGFα-相關的MAPK磷酸化)(見例如WO01/00245及Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)之圖2C-D)，吾人可分析抑制HER二聚合。藉由研究抗體-HER2結合位置，例如，藉由評估抗體結合至HER2之結構或模型，如結晶結構，吾人也可評估是否抗體抑制HER二聚合(見例如Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004))。
於HER2上的「異二聚體結合位置」意指當與之形成二聚體時和EGFR、HER3或HER4的細胞外區域中的區域接 觸或接合之HER2細胞外區域中的區域。此區域位於HER2的區域II中。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
HER2抗體可比搓杜滋美更有效(例如更有效至少2倍)「抑制HRG-相關的AKT磷酸化」及/或抑制「HRG-或TGFα -相關的MAPK磷酸化」(藉由實例，Agus等人，Cancer Cell 2：127-137(2002)及WO01/00245)。
HER2抗體可為「不抑制HER2胞外區域切斷」者(Molina等人，Cancer Res.61：4744-4749(2001))。
「結合至HER2異二聚體結合位置」的抗體結合至區域II中的基團(及視情況也結合至HER2細胞外區域的其他區域中的基團，如區域I及III)，及可至少某程度上立體阻礙HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4異二聚體之形成。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)鑑定HER2-帕妥珠單抗結晶結構(存放於RCSB蛋白質資料庫(ID碼IS78))，說明結合至HER2異二聚體結合位置之例示抗體。
「結合至HER2區域II」的抗體結合至區域II的基團及視情況HER2的其他區域中的基團，如區域I及III。較佳的是，結合至HER2區域II的抗體結合至HER2的區域I、II及III之間的接合處。
「天然序列」多胜肽為具有與天然衍生的多胜肽(如HER受體或HER配體)相同胺基酸序列者。可將此天然序列多胜肽自大自然分離或可藉重組或合成方式製造。因此，天然序列多胜肽可具有天然發生的人類多胜肽、鼠科多胜 肽、或來自任何其他哺乳類的多胜肽之胺基酸序列。
於本文中用詞「抗體」係以最廣泛的意義使用且明確地涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多專一性抗體(如雙專一性抗體)及抗體片段，其限制條件為其呈現理想生物活性。
如本文中使用的用詞「單株抗體」意指來自實質上同源的抗體群體之抗體，即包含有群體之個別抗體為相同及/或結合相同抗原決定位，除了在單株抗體製造期間可能形成的可能變體，此變體一般以少量存在。此單株抗體一般包括包含有結合目標的多胜肽序列之抗體，其中目標結合多胜肽序列係由包括自多個多胜肽序列選擇單一目標結合多胜肽序列之流程得到。例如，選擇流程可為自多個群落如一片融合瘤群落、噬菌體群落或重組DNA群落選擇單一群落。應了解可將選定的目標結合序列進一步改變，例如以改善對目標的親合力、人化目標結合序列、改善其於細胞培養中的製造、降低其於活體內的致免疫性、建立多專一性抗體等，且包含有改變的目標結合序列之抗體也為本發明之單株抗體。相反於通常包括針對不同決定位置(抗原決定位)的不同抗體之多株抗體製品，單株抗體製品的各單株抗體係針對抗原上的單一決定位置。除了其專一性，單株抗體製品的好處為其通常不受其他免疫球蛋白污染。修飾詞「單株」代表抗體的特性為得自實質上同源的抗體群體，且不應視為需要藉任何特別方法製造抗體。例如，欲根據本發明使用的單株抗體可由許多技術製造，包 括例如融合瘤方法(如Kohler等人，Nature,256：495(1975)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，於：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA方法(見如美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現技術(見如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用以於動物中製造具有部分或所有人類免疫球蛋白基因座或編碼人類免疫球蛋白序列的基因之人類或類人類抗體之技術(見如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.,7：33(1993)；美國專利第5,545,806；5,569,825；5,591,669號(皆屬於GenPharm)；美國專利第5,545,807號；WO 1997/17852；美國專利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；及5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology,10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature,368：856-859(1994)；Morrison,Nature,368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology,14：845-851(1996)； Neuberger,Nature Biotechnology,14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13：65-93(1995))。
本文中的單株抗體明確地包括「嵌合」抗體，其中重及/或輕鏈的部分與衍生自特定種類的抗體中相對應序列相同或同源或屬於特定抗體類別或亞群，而鏈的剩餘部分與衍生自另一個種類的抗體中相對應序列相同或同源或屬於另一個抗體類別或亞群，以及此抗體之片段，只要其呈現理想生物活性(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中有興趣的嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，包含有衍生自非人靈長類(如舊大陸猴、猿等)的可變區域抗原結合序列及人類固定區域序列。
「抗體片段」包含完整抗體的一部份，較佳的是包含其抗原結合區域。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；微型雙功能抗體(diabody)；直線抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成的多專一性抗體。
本文中「完整抗體」為包含有兩個抗原結合區域及Fc區域者。較佳的是，完整抗體具有一或多個作用功能。
視其重鏈固定區域的胺基酸序列而定，可將完整抗體分配至不同「類別」。完整抗體有五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，及此等之數個可在分成「亞群」(同種型(isotypes))，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。相當於抗體不同類別的重鏈固定區域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白不同類別之次單元結構及三度空 間組態為已熟知。
抗體「作用功能」意指可歸因於抗體之Fc區域(天然序列Fc區域或胺基酸序列變體Fc區域)的彼等生物活性。抗體作用功能之實例包括C1q結合；補體相關的細胞毒性；Fc受體結合；抗體相關的細胞調節細胞毒性(ADCC,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)；吞噬作用；細胞表面受體(如B細胞受體(BCR,B cell receptor))之向下調節等。
「抗體相關的細胞調節細胞毒性」及「ADCC」意指一種細胞調節反應，其中表現Fc受體(FcRs)的非專一性細胞毒性細胞(如自然殺手(NK,natural killer)細胞、嗜中性白細胞(Neutrophils)、及巨噬細胞)辨識目標細胞上結合的抗體及隨後造成目標細胞的分解。調節ADCC的主要細胞為NK細胞，其僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。於造血細胞上FcR表現摘要於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)之464頁上的表3。為了評估有興趣的分子之ADCC活性，可進行如說明於美國專利第5,500,362或5,821,337號中的試管內ADCC分析法。此分析法的有用作用細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell)及自然殺手(NK,natural killer)細胞。或者(或此外)，可將有興趣的分子之ADCC活性於活體內評估，如於動物模型如揭示於Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中者。
「人類作用細胞」為表現一或多個FcR及進行作用功能 的白血球。較佳的是，細胞至少表現FcγRIII及進行ADCC作用功能。調節ADCC的人類白血球之實例包括周邊血液單核細胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell)、自然殺手(NK,natural killer)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性白細胞；其中以PBMCs及NK細胞為較佳。可將作用細胞自其天然來源分離，如來自血液或如本文中所述之PBMCs。
使用用詞「Fc受體」或「FcR」來說明結合至抗體Fc區域的受體。較佳的FcR為天然序列人類FcR。再者，較佳的FcR為結合IgG抗體者(γ受體)及包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞群之受體，包括此等受體之對偶變體及交替接合的形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要不同於其細胞質區域之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA於其細胞質區域含有免疫受體酪胺酸為基礎的活化基序(ITAM,immunoreceptor tyrosine-basesd activation motif)。抑制受體FcγRIIB於其細胞質區域含有免疫受體酪胺酸為基礎的抑制基序(ITIM,immunoreceptor tyrosine-basesd inhibition motif)(回顧見M.in Daeron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。將FcR回顧於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其他FcR(包括未來將被鑑定者)於本文中以用詞「FcR」包含。此用詞也包括新生兒受體FcRn， 其負責轉移母親IgG至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))，及調節免疫球蛋白的恆定性。
「補體相關的細胞毒性」或「CDC」意指在補體存在中分子分解目標的能力。補體活化途徑受補體系統第一個成分(C1q)結合至與同源抗原複合的分子(如抗體)而起始。為了評估補體活化，可進行如說明於Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)之CDC分析法。
「天然抗體」通常為約150,000Da之異四聚體醣蛋白，由兩個相同的輕(L,light)鏈及兩個相同的重(H,heavy)鏈組成。由一個共價雙硫鍵將各輕鏈連接至重鏈，而雙硫鍵結的數目在不同免疫球蛋白同種型之重鏈之間改變。各重及輕鏈也具有規律間隔的鏈內雙硫鍵橋。各重鏈在一端具有一個可變區域(VH )接著許多固定區域。各輕鏈在一端具有一個可變區域(VL )及另一端有一個固定區域。輕鏈的固定區域與重鏈的第一個固定區域對齊，及輕鏈的可變區域與重鏈的可變區域對齊。吾人認為特定的胺基酸基團形成輕鏈及重鏈可變區域之間的介面。
用詞「可變」意指在抗體之中可變區域的某部分於序列上廣泛地不同及用於各特定抗體對其特定抗原之結合及專一性之事實。然而，可變性並非平均分布於抗體的可變區域。其集中於輕鏈及重鏈兩者的可變區域中稱為高度可變區域的三段。可變區域的更高度保守的部分稱為骨架區域(FRs,framework regions)。天然重及輕鏈的可變區域各包 含四個FRs，大部分採取β-摺疊組態，由三個高度可變區域連接，其形成環圈連接，及於某些情況中形成部分β-摺疊結構。於各鏈中高度可變區域與來自其他鏈的高度可變區域被FRs拉在一起靠近，造成形成抗體的抗原結合位置(見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。固定區域不直接涉及結合抗體至抗原，但呈現不同作用功能，如於抗體相關的細胞毒性(ADCC,antibody-dependent cellular cytotoxicity)中抗體之參與。
當於本文中使用用詞「高度可變區域」意指負責抗原結合的抗體之胺基酸基團。高度可變區域一般包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸基團(如於輕鏈可變區域中的基團24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及於重鏈可變區域中的基團31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或來自「高度可變環圈」之彼等基團(如於輕鏈可變區域中的基團26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及於重鏈可變區域中的基團26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。「骨架區域」或「FR」基團為除了如本文中定義的高度可變區域基團之彼等可變區域基團。
木瓜酵素(papain)消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各具有單一抗原結合位置，及殘留的「Fc」片段，其名稱反應其可輕易地結晶之能力。木瓜酵素處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原結合位置且仍能夠交聯抗體。
「Fv」為含有完整抗原辨識及抗原結合位置的最小抗體片段。此區域由一個重鏈及一個輕鏈可變區域的二聚體以緊密、非共價結合的方式組成。以此組態，各可變區域的三個高度可變區域交互作用以界定VH -VL 二聚體表面上的抗原結合位置。總合地，六個高度可變區域賦予抗體抗原結合專一性。然而，即使單一可變區域(或僅包含對抗原專一的三個高度可變區域之半個Fv)雖然以比整個結合處較低之親合力，但仍具有辨識及結合抗原的能力。
Fab片段也含有輕鏈的固定區域及重鏈的第一個固定區域(CH1)。Fab'片段不同於Fab片段在於重鏈CH1區域包括來自抗體樞紐區域的一或多個半胱胺酸基團的羧基端加入一些基團。Fab'-SH為Fab'於本文中的命名，其中固定區域的半胱胺酸基團帶有至少一個游離硫醇基。F(ab')2 抗體片段起初製造為成對Fab'片段，其具有樞紐半胱胺酸於其間。抗體片段之其他化學耦合也為已知。
可將來自任何脊椎動物種類的抗體的「輕鏈」基於其固定區域的胺基酸序列分成兩個清楚不同的類型，稱為κ及λ。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH 及VL 區 域，其中此等區域係存在於單一多胜肽鏈中。較佳的是，Fv多胜肽更包含多胜肽連接體於VH 及VL 區域之間，其使得scFv能夠形成抗原結合的理想結構。回顧scFv見Plückthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113冊，Tosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York,269-315頁(1994)。HER2抗體scFv片段係說明於WO93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。
用詞「微型雙功能抗體」意指具有兩個抗原結合位置的小抗體片段，其片段包含可變重鏈區域(VH )連接至可變輕鏈區域(VL )於相同多胜肽鏈中(VH -VL )。藉由利用太短無法使相同鏈的兩區域之間形成配對的連接體，強迫區域與另一鏈的互補區域配對及產生兩個抗原結合位置。更完全地將微型雙功能抗體說明於例如歐洲專利EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)。
非人(如齧齒動物)抗體之「人化」形式為含有衍生自非人免疫球蛋白之最少序列的嵌合抗體。對於大部分，人化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中將接受者的高度可變區域之基團以具有理想專一性、親合力及能力之非人物種(供給者抗體)如小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類的高度可變區域之基團取代。於一些情況中，人類免疫球蛋白的骨架區域(FR,framework region)基團用相對應的非人基團取代。再者，人化抗體可包含不見於接受者抗體及供 給者抗體中的基團。做此等修改以進一步改良抗體性能。一般而言，人化抗體將實質上包含至少一個(通常為兩個)可變區域之整體，其中所有或大體上所有高度可變環圈相當於非人免疫球蛋白的高度可變環圈及所有或大體上所有FRs為人類免疫球蛋白序列的FRs。視情況人化抗體也將包含至少一部份免疫球蛋白固定區域(Fc)，通常為人類免疫球蛋白的Fc。進一步詳情，見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人化HER2抗體包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7及huMAb4D5-8或搓杜滋美(HERCEPTINTM )，如說明於美國專利第5,821,337號的表3，特別以參考資料併於本文中；人化520C9(WO93/21319)；及如本文中所述之人化2C4抗體。
為了本文中的目的，「搓杜滋美」、「HERCEPTINTM 」及「huMAb4D5-8」意指包含有分別為SEQ ID NOS.15及16的輕及重鏈胺基酸序列之抗體。
本文中，「帕妥珠單抗」及「OMNITARGTM 」意指包含有分別為SEQ ID NOS.13及14的輕及重鏈胺基酸序列之抗體。
搓杜滋美及帕妥珠單抗功能之間的不同係說明於圖6中。
「裸抗體」為未連接至異源分子如細胞毒性部分或放射 線標記的抗體。
「分離的」抗體為已經自其天然環境確認及分離及/或回收者。其天然環境之污染成分為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，可包括酵素、荷爾蒙、及其他蛋白質或非蛋白質溶質。於較佳具體實施例中，將抗體純化(1)至大於95重量%之抗體(如由勞里法(Lowry method)決定)，及最佳大於99重量%，(2)至藉由利用轉杯定序儀足以得到N端或內部胺基酸序列之至少15個基團之程度，或(3)至藉SDS-PAGE於還原或非還原條件下利用考麻薩藍(Coomassie blue)或較佳的是銀染呈同質性。分離的抗體包括在重組細胞中原位抗體，因為不會出現至少抗體的天然環境之一個成分。然而，一般分離的抗體將由至少一個純化步驟製備。
「親合力成熟的」抗體為在其一或多個高度可變區域中具有一或多個改變者，相較於未具有彼等改變之母抗體，其造成抗體對抗原的親合力改善。較佳的親合力成熟的抗體將對目標抗原具有十億分之一莫耳濃度或甚至微微莫耳濃度親合力。親合力成熟的抗體係由技藝中已知的程序製造。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)說明藉VH 及VL 區域互換之親合力成熟。CDR及骨架基團的隨機突變係由：Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol. Biol.226：889-896(1992)中說明。
本文中用詞「主要物種抗體」意指於組合物中為組合物中定量上主要的抗體分子之抗體結構。於一個具體實施例中，主要物種抗體為HER2抗體，如結合至HER2的區域II之抗體、比搓杜滋美更有效抑制HER二聚合之抗體及/或結合至HER2的異二聚體結合位置的抗體。本文主要物種抗體之較佳具體實施例為包含於SEQ ID Nos.3及4中可變輕鏈及可變重鏈胺基酸序列者，及最佳的是包含於SEQ ID Nos.13及14中輕鏈及重鏈胺基酸序列(帕妥珠單抗)。
本文中「胺基酸序列變體」抗體為具有胺基酸序列不同於主要物種抗體之抗體。一般胺基酸序列變體將具有與主要物種抗體至少約70%同源性，較佳的是，其將與主要物種抗體具有至少約80%，更佳至少約90%同源性。胺基酸序列變體具有置換、刪除及/或加成於主要物種抗體的胺基酸序列內或相鄰之某些位置。本文中胺基酸序列變體之實例包括酸性變體(如去醯胺的抗體變體)、鹼性變體、抗體具有胺基端前導延伸(如VHS-)於其一或兩個輕鏈上、抗體具有C-端離胺酸基團於其一或兩個重鏈上等，及包括重及/或輕鏈胺基酸序列變化之組合。本文中特別有興趣的抗體變體為包含有胺基端前導延伸於其一或兩個輕鏈上之抗體，視情況更包含相對於主要物種抗體之其他胺基酸序列及/或醣化差異。
本文中「醣化變體」抗體為具有一或多個連接至其的碳水化合物部分與連接至主要物種抗體的一或多個碳水化合 物部分不同。本文中醣化變體之實例包括具有G1或G2寡醣結構(取代G0寡醣結構)連接至其Fc區域之抗體、具有一或多個碳水化合物部分連接至其一或兩個輕鏈之抗體、不具碳水化合物部分連接至抗體之一或兩個重鏈之抗體等，及醣化改變之組合。
在抗體具有Fc區域的情況，可將如本文中圖9中所示之寡醣結構連接至抗體的一或多個重鏈，如於基團299(基團之Eu編號為298)。對於帕妥珠單抗，G0為主要的寡醣結構，而於帕妥珠單抗組合物中可見少量之其他寡醣結構如G0-F、G-1、Man5、Man6、G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)及G2。除非另外指明，本文中「G1寡醣結構」包括G-1、G1-1、G1(1-6)及G1(1-3)結構。
本文中「胺基端前導延伸」意指在抗體的任何一或多個重或輕鏈之胺基端處存在的胺基端前導序列之一或多個胺基酸基團。例示胺基端前導延伸包含或由三個胺基酸基團(VHS)組成，存在於抗體變體的一或兩個輕鏈上。
「去醯胺的」抗體為其中一或多個天冬醯胺酸基團已被衍生成如天冬胺酸、琥珀醯亞胺或異天冬胺酸。
用詞「癌症」及「癌」意指或說明典型特徵為不受調控的細胞生長之哺乳類生理狀況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤、母細胞瘤(blastoma)(包括髓母細胞瘤(Medulloblastoma)及視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma))、肉瘤(包括脂肉瘤及滑液細胞肉瘤(synovial cell sarcoma))、神經內分泌腫瘤(包括類癌(carcinoid)、胃激素 瘤(gastrinoma)、及胰島細胞癌)、間皮瘤(mesothelioma)、神經鞘瘤(schwannoma)(包括聽神經瘤(acoustic neuroma))、腦膜瘤(meningioma)、腺癌(adenocarcinoma)、黑色素細胞瘤(melanoma)、及血癌或淋巴癌。此癌症之更特別實例包括鱗狀細胞癌(如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌(SCLC,small-cell lung cancer)、非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)、肺的腺癌及肺的鱗狀細胞癌(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌(包括轉移性乳癌)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤以及頭頸部癌。
本文中，「病患」為人類病患。病患可為「癌症病患」，即患有或有可能罹患癌症之一或多種症狀者，或以HER抗體治療可受益的病患。
「生物樣本」意指一種樣品，一般為自生物來源得到的細胞或組織。
「病患樣本」意指自病患(如癌症病患)得到的樣本。
本文中的「腫瘤樣本」為取自(或包含腫瘤細胞來自)病患的腫瘤之樣本。本文中腫瘤樣本之實例包括(但不限於)腫瘤切片、循環的腫瘤細胞、循環的血漿蛋白質、腹水、初級細胞培養或得自腫瘤或呈現類似腫瘤性質之細胞株、以及保存的腫瘤樣本，如福馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤 樣本或冷凍的腫瘤樣本。
「固定的」腫瘤樣本為利用固定劑已被組織學上保存者。
「福馬林固定的」腫瘤樣本為利用甲醛作為固定劑保存者。
「包埋的」腫瘤樣本為由牢固的及一般為硬的介質如石蠟、蠟、火棉膠、或樹脂圍繞者。包埋使得能夠切割薄切片作為顯微鏡觀察或用以產生組織微陣列(TMAs,tissue microarrays)。
「石蠟包埋的」腫瘤樣本為由衍生自石油之固體碳氫化合物的經純化混合物圍繞者。
於本文中，「冷凍的」腫瘤樣本意指(已)受冷凍的腫瘤樣本。
「呈現HER表現、放大或活化」之癌或生物樣本為在診斷測試中，表現(包括過度表現)HER受體、具有放大的HER基因及/或以其他方式證實HER受體之活化或磷酸化者。可將此活化直接(如藉由測量HER磷酸化)或間接(如藉由基因表現圖譜或如本文中藉由偵測HER異二聚體)決定。
具有「HER受體過度表現或放大」之癌症為相較於相同組織類型之非癌症細胞具有顯著較高量HER受體蛋白質或基因者。此過度表現可能由基因放大或由增加的轉錄或轉譯而造成。HER受體過度表現或放大於診斷或預後分析中藉評估存在於細胞表面上的HER蛋白質之增加量而決定 (如經由免疫組織化學分析法(IHC,immunohistochemistry assay))。或者(或此外)，吾人可測量細胞中編碼HER核酸之量，如經由螢光原位雜交法(FISH,fluorescence in situ hybridization；見1998年10月公告的WO98/45479)、南方轉漬(Southern blotting)或聚合酶鏈反應(PCR,polymerase chain reaction)技術，如定量即時PCR(qRT-PCR,quantitative real time PCR)。藉由測量於生物體液如血清中剝落的抗原(如HER細胞外區域)，吾人也可研究HER受體過度表現或放大(見如1990年6月12日發行的美國專利第4,933,294號；1991年4月18日公告的WO91/05264；1995年3月28日發行的美國專利第5,401,638號；及Sias等人，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述分析法，熟悉苯技藝者也可知道許多活體內試驗。例如，吾人可暴露病患體內的細胞至抗體，將抗體視情況用可偵測標誌如放射線同位素標記，而後可評估抗體與病患中細胞之結合，如藉由外部掃描放射線或藉由分析取自先前暴露至抗體之病患的切片。
相反地，「不過度表現或放大HER受體」之癌症為相較於相同組織類型之非癌症細胞不具有較高於正常量之HER受體蛋白質或基因者。可使用抑制HER二聚合的抗體(如帕妥珠單抗)來治療不過度表現或放大HER受體的癌症。
當於本文中使用「生長抑制劑」意指於試管內或活體內抑制細胞(特別是HER表現癌細胞)生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低HER表現細胞於S階 段的比例者。生長抑制劑之實例包括阻止細胞循環進行(在除了S階段之處)的藥劑，如引發G1停滯及M-階段停滯。傳統M-階段阻止劑包括長春花類(長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine))、紫杉醇類(taxanes)及排列異構酶II(Topo II)抑制劑如小紅莓(Doxorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依託泊苷(Etoposide)及博來霉素(bleomycin)。停滯G1的彼等藥劑也擴溢到S-階段停滯，例如，DNA烷基化藥劑如三苯氧胺(Tamoxifen)、皮質醇(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(Mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)及ara-C。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn及Israel編，第1章，標題「Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs」由Murakami等人著(WB Saunders：Philadelphia,1955)，特別是在13頁。
「生長抑制」抗體之實例為結合至HER2及抑制過度表現HER2的癌細胞生長者。較佳的生長抑制HER2抗體以抗體濃度約0.5至30微克/毫升抑制SK-BR-3乳房腫瘤細胞於細胞培養中的生長超過20%，及較佳超過50%(如約50%至約100%)，於此生長抑制係於暴露SK-BR-3細胞至抗體6天後決定(見1997年10月14日發行的美國專利第5,677,171號)。將SK-BR-3細胞生長抑制分析法於該專利及於下文中更詳細說明。較佳的生長抑制抗體為鼠科單株抗體4D5的 人化變體，如搓杜滋美。
「引發細胞凋亡」的抗體為引發計劃性細胞死亡者，其係由膜聯蛋白V(annexin V)之結合、DNA之斷裂、細胞收縮、內質網擴張、細胞斷裂及/或膜胞囊之形成(稱為凋亡小體(apoptotic body))而決定。細胞通常為過度表現HER2受體者。較佳的是，細胞為腫瘤細胞，如乳房、卵巢、胃、子宮內膜、唾腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰臟或膀胱細胞。於試管內，細胞可為SK-BR-3、BT474、Calu3細胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。可獲得許多方法評估關於細胞凋亡之細胞事件。例如，藉由膜聯蛋白結合可測量磷脂醯絲胺酸(PS,Phosphatidyl serine)易位；經由DNA條帶(DNA laddering)可評估DNA斷裂；及藉由任何亞二倍體(hypodiploid)細胞的增加可評估核/染色質濃縮與DNA斷裂。較佳的是，引發細胞凋亡的抗體為造成相對於未經處理的細胞於膜聯蛋白結合分析中利用BT474細胞約2至50倍，較佳約5至50倍，及最佳約10至50倍引發膜聯蛋白結合(見下)。引發細胞凋亡的HER2抗體之實例為7C2及7F3。
「抗原決定位2C4」為在HER2的細胞外區域中抗體2C4結合的區域。為了篩選結合至2C4抗原決定位之抗體，可進行如說明於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane(1988)中的常規交叉阻礙分析法(cross-blocking assay)。較佳的是，抗體阻礙2C4結合至HER2約50%或以上。或者，可進 行抗原決定位分析(epitope mapping)以評估是否抗體結合至HER2的2C4抗原決定位。抗原決定位2C4包含HER2的細胞外區域中區域II之基團。2C4及帕妥珠單抗結合至區域I、II及III接合處之HER2細胞外區域。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
「抗原決定位4D5」為在HER2的細胞外區域中抗體4D5(ATCC CRL 10463)及搓杜滋美結合的區域。此抗原決定位接近HER2的跨膜區域，及於HER2的區域IV內。為了篩選結合至4D5抗原決定位之抗體，可進行如說明於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane(1988)中的常規交叉阻礙分析法。或者，可進行抗原決定位分析以評估是否抗體結合至HER2的4D5抗原決定位(如在約基團529至約625之區域中任何一或多個基團，包含HER2 ECD，基團編號包括信號胜肽)。
「抗原決定位7C2/7F3」為HER2的細胞外區域之N端處(於區域I內)7C2及/或7F3抗體(各存放於ATCC，見以下)結合的區域。為了篩選結合至7C2/7F3抗原決定位之抗體，可進行如說明於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane(1988)中的常規交叉阻礙分析法。或者，可進行抗原決定位分析以建立是否抗體結合至HER2的7C2/7F3抗原決定位(如在HER2 ECD的約基團22至約53之區域中任何一個或多個基團，基團編號包括信號胜肽)。
「處理」意指治療處及預防或避免方式。需要處理者包括已具有疾病者以及要避免疾病者。因此，本文中欲治療的病患可能已被診斷為具有疾病或可能為有可能或易罹患疾病者。
用詞「有效量」意指藥物之量有效於治療病患的癌症。有效量藥物可降低癌症細胞的數目；降低腫瘤大小；抑制(即減慢至某程度及較佳停止)癌症細胞滲透入周圍器官；抑制(即減慢至某程度及較佳停止)腫瘤轉移；抑制(至某程度)腫瘤生長；及/或減輕至某程度伴隨癌症的一或多種症狀。對於可能避免生長及/或殺死存在的癌症細胞之藥物量，其可能為細胞抑制劑(cytostatic)及/或細胞毒素。有效量可能延長無疾病進展存活(progression free survival)(如由實體瘤治療療效評價標準(RECIST,Response Evaluation Criteria for Solid Tumors)，或CA-125變化測量)，造成客觀反應(objective response)(包括部分反應(PR,partial response)或完全反應(CR,complete response))，增加總體存活時間，及/或改善癌症的一或多個症狀(如由FOSI評估)。
「總體存活」意指病患自診斷或治療之時起保持存活一定時間如1年、5年等。
「無疾病進展存活」意指病患保持存活而無癌症惡化。「客觀反應」意指可測量的反應，包括完全反應(CR,complete response)或部分反應(PR,partial response)。
由「完全反應」或「完全緩解」意指對治療的反應為癌 症的所有症候消失。此不一定意指癌症已經痊癒。
「部分反應」意指對治療的反應為一或多個腫瘤或損害大小減小，或體內癌症的範圍減小。
如本文中使用的用詞「細胞毒性藥物」意指抑制或避免細胞功能及/或造成細胞破壞的物質。此用詞係用來包括放射線同位素(如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu的放射線同位素)、化療藥物、及毒素如小分子毒素或細菌、黴菌、植物或動物來源之酵素活性毒素，包括其片段及/或變體。
「化療藥物」為由用於治療癌症之化學化合物。化療藥物之實例包括烷基化藥物如噻替哌(Thiotepa)及CYTOXANTM 環磷醯胺；烷基磺酸化物如馬利蘭(busulfan)、英丙舒凡(Improsulfan)及哌泊舒凡(Piposulfan)；氮丙啶類(Aziridines)如benzodopa、卡波醌(Carboquone)、meturedopa及uredopa；次乙亞胺(Ethylenimine)及methylamelamines包括六甲蜜胺(Altretamine)、三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷醯胺及三羥甲基醇蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTA)；乙醯精寧(Acetogenins)(特別是泡番荔枝辛(bullatacin)及bullatacinone)；δ-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOLTM )；β-拉帕酮(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素(colchicines)；樺木酸(Betulinic acid)；喜樹鹼 (camptothecin)(包括合成類似物癌康定(Topotecan)(HYCAMTINTM )、CPT-11(依立替康(Irinotecan)，CAMPTOSARTM )、乙醯喜樹鹼、scopolectin及9-胺基喜樹鹼)；珊瑚蟲素(Bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(Carzelesin)及比折來新(Bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(Teniposide)；隱藻素(cryptophycins)(特別是隱藻素1及隱藻素8)；海兔毒肽(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿毒素(spongistatin)；氮芥子氣(Nitrogen Mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(Chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷胺(Ifosfamide)、二氯甲基二乙酸(mechlorethamine)、氧化二氯甲基二乙酸鹽酸鹽、威克瘤錠(Melphalan)、novembichin、phenesterine、潑尼氮芥(Prednimustine)、曲磷胺(Trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)；硝尿(nitrosureas)如卡氮芥(Carmustine)、氯尿霉素(Chlorozotocin)、福莫司汀(Fotemustine)、洛莫司汀(Lomustine)、尼莫司汀(Nimustine)、及雷莫司汀(ranimustine)；雙磷酸鹽類(Bisphosphonate)，如氯屈膦酸鹽(clodronate)；抗生素如烯二炔(enediyne)抗生素(如卡奇霉素(Calicheamicin)，特別是卡奇霉素γII及卡奇霉素ωII)(見如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))及四環黴素(anthracyclines)如 脂質體蒽環霉素(Annamycin)、AD32、alcarubicin、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表阿霉素(Epirubicin)、GPX-100、去甲氧柔紅黴素(idarubicin)、KRN5500、曼諾加利(Menogaril)、dynemicin(包括dynemicin A)、esperamicin、新制癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關的色蛋白(chromoprotein)烯二炔抗生素發色團、aclacinomysins、放線菌素(Actinomycin)、authramycin、重氮乙醯絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素(Cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、地托比星(Detorubicin)、6-重氮-5-氧基-L-正白氨酸、ADRIAMYCINTM 小紅莓(包括嗎啉-小紅莓、氰嗎啉-小紅莓、吡咯啉-小紅莓、微脂粒小紅莓、及去氧小紅莓)、依索比星(Esorubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂酶素(Mitomycins)如絲裂酶素C、霉酚酸(Mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、匹萊霉素(Peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(Puromycin)、三鐵阿霉素(Quelamycin)、羅多比星(Rodorubicin)、鏈黑霉素(Streptonigrin)、鏈尿霉素(Streptozotocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(Zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；葉酸類似物如denopterin、蝶羅呤(Pteropterin)及三甲曲沙(Trimetrexate)；嘌呤類似物如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤(mercaptopurine)、thiamiprine及硫鳥嘌呤；及嘧啶 類似物如環胞苷(Ancitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(Carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、依諾他濱(Enocitabine)及氟脫氧尿苷(Floxuridine)；雄性激素(androgen)如卡普睪酮(Calusterone)、丙酸屈他雄酯酮(Dromostanolone propionate)、環硫雄醇(Epitiostanol)、美雄烷(Mepitiostane)及睪內脂(testolactone)；抗腎上腺如氨基呱啶酮(Aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)及腈環氧雄烷(trilostane)；葉酸補充劑如亞葉酸(folinic acid)(leucovorin)；醋葡醛內酯(Aceglatone)；抗葉酸抗腫瘤藥物如ALIMTA7、LY231514培美曲塞(Pemetrexed)、二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨蝶呤、抗代謝物如5-氟尿嘧啶(5-FU,5-fluorouracil)及其前驅藥物如UFT、S-1及截瘤達(Capecitabine)、及胸腺嘧啶(thymidylate)合成酶抑制劑及甘胺醯胺核苷酸甲醯基轉移酶抑制劑如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXTM ,TDX)；二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase)的抑制劑如乙炔尿嘧啶(eniluracil)；醛磷醯胺(aldophosphamide)糖苷；氨基果糖酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；脫羰秋水仙鹼(Demecolcine)；亞胺醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(Elliptinium acetate)；依託格魯(Etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(Lonidamine)；美登素類(maytansinoids)如美登素(maytansine)及安絲菌素 (ansamitocin)；米托脈宗(mitoguazone)；米托蒽醌(Mitoxantrone)；莫哌達醇(Mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Losoxantrone)；2-乙基(2-ethylhydrazide)；丙卡巴(procarbazine)；PSKTM 多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亞胺(Razoxin)；利索新(Rhizoxin)；西佐糖(Sizofiran)；螺鍺(Spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)(特別是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素(roridin)A及anguidine)；烏拉坦(Urethan)；長春地辛(Vindesine)(ELDISINETM 、FILDESINTM )；達卡巴嗪(Dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(Mitobronitol)；二溴衛矛醇(Mitolactol)；哌泊溴烷(Pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺(Cyclophosphamide)；塞替派(Thiotepa)；紫杉類藥物(Taxoids)及紫杉烷類(taxanes)，如TAXOLTM 紫杉醇(Paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM 紫杉醇的無聚氧乙烯化蓖麻油(Cremophor)、工程白蛋白的奈米粒子(nanoparticle)配方(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)，及TAXOTERETM 多西他賽(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France)；chloranbucil；健擇(Gemcitabine)(GEMZARTM )；6-硫鳥糞嘌呤；6-巰嘌呤(mercaptopurine)；鉑；鉑類似物 或以白金為基礎的類似物如順鉑、草酸鉑(Oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(VELBANTM )；依託泊苷(VP-16)；異環磷胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVINTM )；長春花生物鹼(vinca alkaloid)；溫諾平(vinorelbine)(NAVELBINETM )；米托蒽醌(Novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺蝶砱(aminopterin)；截瘤達(Xeloda)；伊班膦酸(ibandronate)；拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO,difluorometlhylornithine)；維甲酸(retinoid acid)如維甲酸(retinoic acid)；任何上述之醫藥上可接受的鹽類、酸或衍生物；以及上述二或多種之組合，如CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及皮質醇之組合療法的縮寫)，及FOLFOX(用草酸鉑(ELOXATINTM )與5-FU及亞葉酸組合之治療方式之縮寫)。
也包含於此定義的為作用來調節或抑制荷爾蒙作用於腫瘤上的抗荷爾蒙藥物如抗雌激素及選擇性雌激素受體調控劑(SERMs,selective estrogen receptor modulators)，包括例如三苯氧胺(Tamoxifen)(包括NOLVADEXTM 三苯氧胺)、鈣穩(raloxifene)、屈洛昔芬(Droloxifene)、4-羥三苯氧胺、曲沃昔芬(Trioxifene)、雷洛昔芬(Keoxifene)、LY117018、奧納司酮(onapristone)及FARESTONTM 托瑞米芬(toremifene)；抑制酵素芳香酶(aromatase)的芳香酶抑制劑，其調控腎上腺製造雌激素，如例如4(5)-咪唑、氨基呱啶酮、MEGASETM 醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、 AROMASINTM 諾曼癌素(Exemestane)、formestanie、法屈唑(Fadrozole)、RIVISORTM 氟氯唑(vorozole)、FEMARATM 來曲唑(Letrozole)及ARIMIDEXTM 安美達錠(Anastrozole)；及抗雄性激素如拂它邁(Flutamide)、尼魯米特(Nilutamide)、白卡羅他邁(bicalutamide)、亮丙瑞林(Leuprolide)及戈舍瑞林(Goserelin)；以及troxacitabine(一種1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反意義寡核苷酸，特別是抑制關於異常細胞增殖的信息途徑中基因表現者，如例如PKC-α、Raf、H-Ras及上皮生長因子受體(EGF-R,epidermal growth factor receptor)；疫苗如基因療法疫苗，例如，ALLOVECTINTM 疫苗、LEUVECTINTM 疫苗及VAXIDTM 疫苗；PROLEUKINTM γIL-2；LURTOTECANTM 拓樸異構酶1抑制劑；ABARELIXTM rmRH；及任何上述之醫藥上可接受的鹽類、酸或衍生物。
「抗代謝化療藥物」為結構上類似代謝物，但無法以有生產力的方式被身體使用之藥物。許多抗代謝化療藥物干擾核酸(RNA及DNA)的製造。抗代謝化療藥物之實例包括健擇(Gemcitabine)(GEMZARTM )、5-氟尿嘧啶(5-FU,5-fluorouracil)、截瘤達(Capecitabine,XELODATM )、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤、6-硫鳥糞嘌呤、培美曲塞、雷替曲塞、阿拉伯糖胞嘧啶(arabinosylcytosine)ARA-C阿糖胞苷(CYTOSAR-UTM )、達卡巴嗪(DTIC-DOMETM )、azocytosine、去氧胞嘧啶、pyridimidene、氟達拉濱(FLUDARATM )、cladrabine、2-去氧-D-葡萄糖等。較佳的 抗代謝化療藥物為健擇。
「健擇」或「2'-去氧-2',2'-二氟胞苷單鹽酸鹽(b-異構物)」為呈現抗腫瘤活性之核苷類似物。健擇HCl的實驗式為C9 H11 F2 N3 O4 ．HCl。健擇HCl係由禮來(Eli Lilly)以GEMZARTM 商品名販售。
「以鉑為基礎的化療藥物」包含有含鉑作為分子不可缺的部分之有機化合物。以鉑為基礎的化療藥物之實例包括卡鉑、順鉑及草酸鉑。
由「以鉑為基礎的化療」意指具有一或多種以鉑為基礎的化療藥物，視情況與一或多種化療藥物組合之療法。
由「對鉑有抗性的」癌症意指當接受以鉑為基礎的化療時癌症病患仍惡化(即病患為「鉑不反應性」)，或在完成以鉑為基礎的化療療程後12個月內(例如於6個月內)病患仍惡化。
「抗血管新生藥物(anti-angiogenic agents)」意指某程度阻止或干擾血管的發育之化合物。例如抗血管新生因子可為結合至涉及促進血管新生的生長因子或生長因子受體之小分子或抗體。本文中較佳的抗血管新生因子為結合至血管上 皮生長因子(VEGF,vascular endothelial growth factor)之抗體，如貝伐單抗(AVASTINTM )。
用詞「細胞激素」為由作用於另一個細胞作為細胞間調控者的一個細胞群體所釋放的蛋白質總稱。此細胞激素的實例為淋巴激素(lymphokine)、單核激數(monokine)及傳統多胜肽荷爾蒙。於細胞激素中包括的是生長荷爾蒙如人 類生長荷爾蒙、N-甲硫胺醯人類生長荷爾蒙及小牛生長荷爾蒙；副甲狀腺荷爾蒙；甲狀腺素；胰島素；胰島素原(Proinsulin)；鬆弛素(relaxin)；鬆弛素原；醣蛋白荷爾蒙如卵泡細胞刺激素(FSH,follicle-stimulating hormone)、促甲狀腺激素荷爾蒙(TSH,thyroid stimulating hormone)、及黃體生成素(LH,luteinizing hormone)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor)；泌乳素(prolactin)；胎盤泌乳素(placental lactogen)；腫瘤壞死因子-α 及-β ；繆勒管(Mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素結合胜肽肽(gonadotropin-associated peptide)；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管內皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO,thrombopoietin)；神經生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF,Transforming Growth Factor)如TGF-α及TGF-β；似胰島素生長因子-I及-II；紅血球生成素(EPO,Erythropoietin)；骨引導生長因子；干擾素如干擾素-α、-β、及-γ；群落刺激因子(CSF,Colony Stimulating Factor)如巨噬細胞-CSF(M-CSF,Macrophage-CSF)；顆粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF,granulocyte-Macrophage-CSF)；及顆粒細胞-CSF(G-CSF,granulocyte-CSF)；介白素(Interleukin,IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-αTNF-β；及其他多胜肽因子包括LIF及Kit配體(KL,Kit ligand)。如本文中使用，用詞細胞激素包括來自天來源然或來自重組 細胞培養及天然序列細胞激素的生物活性相當物之蛋白質。
如本文中使用，用詞「以EGFR為目標的藥物」抑制結合至EGFR及視情況抑制EGFR活化之治療藥物。此藥物之實例包括結合至EGFR之抗體或小分子。結合至EGFR之抗體實例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(見美國專利第4,943,533號，Mendelsohn等人)及其變體，如嵌合的225(C225或西妥昔單抗；ERBUTIXTM )及改造的人類225(H225)(見WO 96/40210,Imclone Systems Inc.)；結合第II型突變體EGFR的抗體(美國專利第5,212,290號)；如說明於美國專利第5,891,996號之結合EGFR的人化及嵌合抗體；及結合EGFR的人類抗體，如ABX-EGF(見WO98/50433,Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto等人，Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；及mAb 806或人化mAb 806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。可將抗-EGFR抗體與細胞毒素藥物結合，因此產生免疫結合體(immunoconjugate)(見如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。結合至EGFR之小分子實例包括ZD1839或吉非替尼(Gefitinib)(IRESSATM ；Astra Zeneca)；CP-358774或厄洛替尼HCl(TARCEVATM ；Genentech/OSI)；及AG1478,AG1571(SU 5271；Sugen)。
「酪胺酸激酶抑制劑」為抑制酪胺酸激酶如HER受體的酪胺酸激酶活性之分子。此抑制劑的實例包括前文中說明 的以EGFR為目標的藥物；小分子HER2酪胺酸激酶抑制劑如可購自Takeda的TAK165；優先地結合EGFR但抑制HER2及EGFR兩者過度表現細胞之雙HER抑制劑如EKB-569(可購自Wyeth)；口服HER2及EGFR酪胺酸激酶抑制劑GW572016(可購自Glaxo)；PKI-166(可購自Novartis)；泛-HER抑制劑如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制劑如可購自ISIS Pharmaceuticals之反意義藥物ISIS-5132，其抑制Raf-1信號；非以HER為目標的TK抑制劑如可購自Glaxo的甲磺酸伊馬替尼(imatinib)(GleevacTM )；MAPK細胞外受調控的激酶I抑制劑CI-1040(可購自Pharmacia)；喹唑啉(quinazolines)，如PD 153035(4-(3-氯苯胺)喹唑啉)；吡啶並嘧啶類(pyridopyrimidines)；嘧啶並嘧啶類；吡咯並嘧啶類，如CGP 59326、CGP 60261及CGP 62706；吡唑並嘧啶類，4-(苯基胺)-7H-吡唑並[2,3-d]嘧啶；薑黃素(Curcumin)(二阿魏醯基甲烷，4,5-雙(氟苯胺)鄰苯二甲硫亞胺)；含硝基一硫二烯伍圜(nitrothiophene)部分之tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反意義分子(如結合至編碼HER的核酸者)；喹諾沙林類(Quinoxalines)(美國專利第5,804,396號)；tryphostins(美國專利第5,804,396號)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛-HER抑制劑如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼(Gleevac；Novartis)；PKI166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)； Semaxinib(Sugen)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或如說明於下列任何專利公告中：美國專利第5,804,396號；WO99/09016(American Cyanimid)；WO98/43960(American Cyanamid)；WO97/38983(Warner Lambert)；WO99/06378(Warner Lambert)；WO99/06396(Warner Lambert)；WO96/30347(Pfizer,Inc)；WO96/33978(Zeneca)；WO96/3397(Zeneca)；及WO96/33980(Zeneca)。
本文中「自體免疫疾病」為起因於及針對個體本身的組織或其共分離或表現或由其產生的症狀之疾病或失調。自體免疫疾病或失調之實例包括(但不限於)關節炎(風濕性關節炎如急性關節炎、慢性風濕性關節炎、痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、感染性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、增生性關節炎、乾癬性關節炎、脊椎關節炎、及幼年啟始風濕性關節炎、骨性關節炎(osteoarthritis)、關節炎慢性progrediente、關節炎畸形、多關節炎慢性primaria、反應性關節炎及僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis))、發炎性高度增殖皮膚病、牛皮癬如斑癬(plaque psoriasis)、滴狀牛皮癬、膿庖型牛皮癬、及指甲的牛皮癬、異位性包括特異過敏症如花粉熱及喬伯症徵群(Job's syndrome)、皮膚炎包括接觸性皮膚炎、慢性接觸性皮膚炎、過敏性皮膚炎、過敏性接觸皮膚炎、皰疹性皮膚炎、及異位性皮膚炎、X-性聯高免疫球蛋白M徵候群(X-linked hyper-IgM syndrome)、蕁麻疹如慢性過敏性蕁麻疹及慢性原發性蕁麻疹，包括慢性自體免疫蕁麻疹、多發性肌炎(Polymyositis)/皮肌炎(Dermatomyositis)、幼年皮肌炎、毒性皮膚壞死(toxic epidermal necrolysis)、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化症如全身性硬化症、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)如脊椎-視力MS、原發進行性多發性硬化(PPMS,primary progressive MS)、及復發-緩解型多發性硬化(RRMS,relapsing-remitting MS)、進行性全身性硬化症、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、動脈纖維性硬化(arteriosclerosis)、散播性硬化、及失調性硬化、發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel disease)(例如克隆氏症(Crohn's disease)、自體免疫調節的胃腸疾病、結腸炎如潰瘍性結腸炎、結腸炎潰瘍、顯微結腸炎、膠原結腸炎、結腸炎息肉、壞死性小腸結腸炎、及透壁性結腸炎、及自體免疫發炎性腸道疾病)、壞疽性膿皮症(Pyoderma gangrenosum)、紅斑性結節(Erythema Nodosum)、原發型硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、上鞏膜炎(Episcleritis))、呼吸窘迫徴候群，包括成人或急性呼吸窘迫徴候群(ARDS,adult or acute respiratory distress syndrome)、腦膜炎、葡萄膜的所有或部分發炎、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免疫血液學失調、風濕性脊椎炎、突然聽力喪失、IgE-調節的疾病如過敏性反應及過敏性及特異過敏性鼻炎、腦炎如羅斯默森氏(Rasmussen's)腦炎及邊緣及/或腦幹腦炎、葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡 萄膜炎、肉芽腫葡萄膜炎、非肉芽腫葡萄膜炎、晶體抗原性(phacoantigenic)葡萄膜炎、後葡萄膜炎、或自體免疫葡萄膜炎、具有或不具腎病變症候群之絲球體腎炎(GN,glomerulonephritis)如慢性或急性絲球體腎炎如原發性GN、免疫調控的GN、膜性GN(膜性腎病)、自發性膜性GN或自發性膜性腎病、膜性或膜性增生性GN(MPGN,membranous proliferative GN)(包括第I型及第II型)、及進行性GN、過敏症狀及反應、過敏反應、濕疹包括過敏性或異位性溼疹、氣喘如氣喘支氣管炎、支氣管氣喘、及自體免疫氣喘、關於T細胞滲透的症狀及慢性發炎反應、對外來抗原的免疫反應如於懷孕期間胎兒A-B-O血液群、慢性肺發炎疾病、自體免疫心肌炎、白血球黏著不足、全身紅斑性狼瘡(SLE,Systemic Lupus Erythematosus)或全身紅斑性狼瘡如皮膚型SLE、亞急性皮膚型SLE、新生兒狼瘡症候群(NLE,Neonatal Lupus Syndrome)、播散性紅斑性狼瘡、狼瘡(包括腎炎、腦炎、小兒科、非腎、腎外、盤狀、掉髮)、幼年啟始(第I型)糖尿病，包括小兒科胰島素依賴型糖尿病(IDDM,insulin dependent diabetes mellitus)，成人啟始糖尿病(第II型)、自體免疫糖尿病、自發性尿崩症(Diabetes Insipidus)、與由細胞激素及T-淋巴球調節的急性及遲發過敏症有關之免疫反應、結核病、類肉瘤病(sarcoidosis)、肉芽腫包括淋巴瘤樣肉芽腫(Lymphomatoid granulomatosis)、韋格內肉芽腫(wegener's granulomatosis)、粒性白血球缺乏症、血管炎，包括血管 炎(包括大血管之血管炎(包括風濕性多發肌痛(polymyalgia rheumatica)及巨細胞(高安氏(Takayasu's))動脈炎)、中等血管之血管炎(包括川崎氏(Kawasaki's)症及結節性多動脈炎/結節性動脈週炎)、顯微多動脈炎、CNS血管炎、壞死、表皮、或過敏性血管炎、全身性壞死血管炎、及ANCA-相關的血管炎，如丘-施二氏血管炎或症候群(CSS,Churg-Strauss syndrome)、顳動脈炎(temporal arteritis)、再生不良性貧血(Aplastic Anemia)、自體免疫再生不良性貧血、抗球蛋白試驗陽性(Coombs postive)貧血、先天性純紅血球再生障礙性貧血(Diamond-Blackfan Anemia)、溶血性貧血或免疫溶血性貧血包括自體免疫溶血性貧血(AIHA,autoimmune hemolytic anemia)、惡性貧血、愛迪生氏症(Addison's disease)、純紅血球貧血或再生不良症(PRCA,pure red cell aplasia)、第八因子缺乏症(Factor VIII deficiency)、血友病A、自體免疫嗜中性白血球減少症、泛血球減少症(pancytopenia)、白血球減少、涉及白血球滲出之疾病、CNS發炎疾病、多重器官傷害症候群如敗血病、外傷或出血繼發者，抗原-抗體複合物調節的疾病、抗絲球體基底膜疾病、抗磷脂抗體徵候群、過敏性神經炎、貝塞特氏病(Behcet's disease)、血管濾泡性淋巴組織增生徵候群(Castleman's syndrome)、古德巴斯德徵候群(Goodpasture's syndrome)、雷諾氏徵候群(Reynaud's syndrome)、修格蘭氏徵候群(Sjogren's syndrome)、史蒂文斯-強生徵候群)(Stevens-Johnson syndrome)、類天皰瘡如 大皰性類皰瘡(Pemphigoid Bullous)及皮膚類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常性天皰瘡(Pemphigus vulgaris)、落葉型天皰瘡(penphigus foliaceus)、天皰瘡黏膜類天皰瘡、及紅斑性天皰瘡(pemphigus erythematosus))、自體免疫多發性內分泌病、來特氏(Reiter's)病或徵候群、免疫復合物性腎炎(immune complex nephritis)、抗體媒介的腎炎、視神經脊髓炎(neuromyelitis optica)、多發性神經炎、慢性神經病症如IgM多發性神經炎或IgM媒介的神經病症、血小板過低症(thrombocytopenia)(例如如由心肌梗塞病患所逐漸產生)，包括血栓性低血小板性紫斑症(TTP,thrombotic thrombocytopenic purpura)、輸血後紫斑症(PTP,Post-transfusion purpura)、肝素-引發的血小板過低症、及自體免疫或免疫媒介的血小板過低症如自發性的血小板減少性紫斑症(ITP,idiopathic thrombocytopenic purpura)(包括慢性或急性ITP)、睪丸及卵巢之自體免疫疾病(包括自體免疫睪丸炎及卵巢炎)、原發性甲狀腺低能症、低副甲狀腺素(hypoparathyroidism)、自體免疫內分泌疾病包括甲狀腺炎如自體免疫甲狀腺炎、橋本氏病(Hashimoto's disease)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)、或亞急性甲狀腺炎、自體免疫甲狀腺疾病、自發性的甲狀腺低能症、葛雷芙氏症(Grave's disease)、多腺體徵候群如自體免疫多腺體徵候群(或多腺體內分泌病變徵候群)、腫瘤附屬徵候群(Paraneoplastic syndrome)，包括神經性腫瘤附屬徵候群如蘭伯伊頓肌無力徵候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或蘭伯伊頓徵候群、筆直人徵候群(stiff-man或stiff-person syndrome)、腦脊髓炎如過敏性腦脊髓炎或腦脊髓炎過敏症及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE,experimental allergic encephalomyelitis)、重症肌無力如有胸腺瘤(thymoma)的重症肌無力、小腦退化、神經肌無力(neuromyotonia)、眼球陣攣(opsoclonus)或眼球肌陣攣徵候群(OMS,opsoclonus myoclonus syndrome)、及感覺神經病變、多發性運動神經病變、席漢氏徵候群(Sheehan's syndrome)、自體免疫肝炎、慢性肝炎、免疫性肝炎(lupoid hepatitis)、巨細胞肝炎、慢性活動肝炎或自體免疫慢性活動肝炎、淋巴間質肺炎(LIP,lymphoid interstitial pneumonitis)、阻塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans)(非移植)與NSIP、吉巴氏徵候群(Guillain-Barré syndrome)、伯傑症(Berger's disease)(IgA腎病)、自發性的IgA腎病、線狀IgA皮膚病(linear IgA dermatosis)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肺硬化、自體免疫腸病變徵候群、乳糜瀉(Celiac Disease)、腹腔疾病、腹部熱帶口瘡(celiac sprue)(麩酸(gluten)腸病變)、頑固性熱帶口瘡、自發性的熱帶口瘡、冷凝球蛋白血症(cryoglobulinemia)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS,Amyotrophic Lateral Sclerosis；葛雷克氏症(Lou Gehrig's disease))、冠狀動脈症、自體免疫耳疾如自體免疫內耳疾病(AIED,autoimmune inner ear disease)、自體免疫聽覺喪失、眼球肌陣攣徵候群(OMS,opsoclonus myoclonus syndrome)、多發性軟骨炎(polychondritis)如頑固性或再發性多發性軟骨炎、肺泡蛋白質沉著症(pulmonary alveolar proteinosis)、鞏膜炎、非癌性淋巴球過多症、原發性淋巴球過多症(其包含單株B細胞淋巴球過多症)(如良性單株免疫球蛋白增多症(monoclonal gammopathy)及未知臨床意義的單株免疫球蛋白增多症(MGUS,Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance))、周邊神經炎(peripheral neuropathy)、腫瘤附屬徵候群、離子通道疾病(channelopathy)如癲癇、偏頭痛、心律不整、肌肉系統疾病、耳聾、失明、週期性麻痺、及CNS之離子通道疾病、自閉症、發炎性肌病、局部部分絲球體硬化症(FSGS,Focal segmental glomerulosclerosis)、內分泌眼病變、葡萄膜視網膜炎(uveoretinitis)、脈絡膜網膜炎(chorioretinitis)、自體免疫肝疾、纖維肌痛(Fibromyalgia)、多發性內分泌衰竭、許密德徵候群(Schmidt's syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老年性失智症(presenile dementia)、髓鞘脫失症如自體免疫髓鞘脫失症及慢性發炎性髓鞘脫失多神經炎、糖尿病腎病變(Diabetic nephropathy)、杜絲勒徵候群(Dressler's syndrome)、圓禿(Alopecia areata)、鈣質沉積-雷諾氏現象-食道功能異常-指(趾)皮硬化-及微血管擴張(CREST,Calcinosis,Raynaud's pheromeron,Esophageal dysmotility,Sclerodactly及Telangiectasia)徵候群、男性及女性自體免疫不育、混合性結締組織疾病、卡格氏病(Chagas' disease)、風濕熱、慣性流產、農夫肺、多形性紅斑(Erythema multiforme)、開心手術後徵候群、庫欣氏徵候群(Cushing's syndrome)、飼鳥者肺病、過敏性肉芽腫性血管炎(granulomatous angiitis)、良性淋巴球血管炎、亞伯特氏徵候群(Alport's syndrome)、肺泡炎如過敏性肺泡炎及纖維性肺泡炎、間質性肺病、輸血反應、痲瘋、瘧疾、利什曼原蟲症(Leishmaniasis)、kypanosomiasis、血吸蟲病(Schistosomiasis)、蛔蟲病、麴菌病(aspergillosis)、阿斯匹林三聯症(Samter's syndrome)、卡普蘭氏徵候群(Caplan's syndrome)、登革熱、心內膜炎、心內膜心肌層纖維化(Endomyocardial fibrosis)、彌漫性間質性肺纖維化(Diffuse Interstitial Pulmonary Fibrosis)、間質性肺纖維化、肺纖維化、自發性肺纖維化、囊胞性纖維症、眼內炎(endophthalmitis)、持久隆起性紅斑(Erythema elevatum diutinum)、胎兒紅血球母細胞過多症(Erythroblastosis fetalis)、嗜伊紅性肌膜炎(eosinophilic fasciitis)、舒爾曼氏徵候群(Shulman' syndrome)、弗耳提徵候群(Felty's syndrome)、flariasis、睫狀體炎(cyclitis)如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(iridocyclitis)(急性或慢性)、或福契氏睫狀體炎(Fuch's cyclitis)、過敏性紫斑症(Henoch-Schonlein Purpura)、人類免疫不全病毒(HIV,Human Immunodeficiency Virus)感染、伊科病毒(Echovirus)感染、心肌症、阿滋海默氏症(Alzheimer's disease)、小病毒(Parvovirus)感染、德國麻疹病毒感染、 接種後徵候群、先天性德國麻疹感染、易普斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr Virus)感染、腮腺炎、埃文氏徵候群(Evan's syndome)、自體免疫性腺衰竭(gonadal failure)、席登罕氏舞蹈症(Sydenham's chorea)、鏈球菌感染後腎炎、血栓閉塞性血管炎(Thromboangiitis obliterans)、甲狀腺毒症、脊髓癆、脈絡叢炎(chorioiditis)、巨細胞多發肌痛(polymyalgia)、內分泌眼病變、慢性過敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)、乾眼症(keratoconjunctivitis sicca)、流行性角膜結膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)、自發性腎臟徵候群、極微變化型腎病變(minimal change nephropathydisease)、家族性良性及缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷、視網膜自體免疫、關節發炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道疾病、矽肺病、鵝口瘡、口腔潰瘍(Aphthous stomatitis)、動脈硬化症、aspermiogenese、自體免疫溶血、伯克氏癢症(Boeck's disease)、冷凝球蛋白血症、迪皮特朗攣縮(Dupuytren's contracture)、眼內phacoanaphylactica、腸炎過敏症、痲瘋結節性紅斑(erythema nodosum leprosum)、自發性顏面麻痺、慢性疲勞徵候群、風濕性熱病(febris rheumatica)、特發性瀰漫性肺間質纖維化(Hamman-Rich's disease)、感覺神經性聽障、血色素尿發作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺功能低下症(hypogonadism)、局限性迴腸炎、白血球減少、感染性單核血球病、橫貫性脊髓炎(transverse myelitis)、原發性自發性黏液水腫、腎病變、交感性眼炎 (ophthalmia symphatica)、肉芽腫性睪丸炎、胰臟炎、急性多發性神經根神經炎(polyradiculitis acuta)、壞疽性膿皮症(Pyoderma gangrenosum)、魁文甲狀腺炎(Quervain's thyreoiditis)、後天脾臟萎縮、由於抗精蟲抗體造成之不育、非惡性胸腺瘤、白斑病、SCID及易普斯坦-巴爾病毒相關的疾病、後天免疫不全徵候群(AIDS,acquired immune deficiency syndrome)、寄生蟲疾病如利什曼原蟲症、中毒性休克徵候群、食物中毒、關於T細胞滲透的症狀、白血球黏著不足、關於由細胞激素及T-白血球媒介的急性及延遲過敏之免疫反應、關於白血球滲出之疾病、多重器官傷害徵候群、抗原-抗體複合物調節的疾病、抗絲球體基底膜疾病、過敏性神經炎、自體免疫多發性內分泌病變、卵巢炎、原發性黏液水腫、自體免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、風濕性疾病、混合性結締組織疾病、腎變病徵候群、胰島炎(insulitis)、多發性內分泌衰竭、周邊神經炎、多腺體徵候群第I型、成人啟始自發性甲狀旁腺機能亢進(AOIH,adult-onset idiopathic hypoparathyroidism)、全禿髮(alopecia totalis)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、後天大皰性表皮鬆解症(EBA,epidermolysis bullosa acquisita)、血色沈著病、心肌炎、腎病變徵候群、原發型硬化性膽管炎、膿性或非膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩骨、額骨、上頜骨、或蝶骨竇炎、嗜伊紅球性相關的疾病如嗜伊紅性紅血球增多(eosinophilia)、肺浸潤性嗜伊紅性紅血球增多、嗜伊紅性紅血球增多-肌痛徵候群、 羅夫勒徵候群(Loffler's syndrome)、慢性嗜伊紅球性肺炎、熱帶肺嗜伊紅性紅血球增多症(tropical pulmonary eosinophilia)、支氣管肺炎麴菌病、麴菌腫(aspergilloma)、或含嗜伊紅血球之肉芽腫、過敏性反應、血清陰性脊椎炎(seronegative spondyarthritides)、多發性內分泌自體免疫疾病、硬化性膽管炎、鞏膜、鞏膜外層(episclera)、慢性皮膚黏膜念珠菌病(chronic mucocutaneous candidiasis)、布魯頓氏徵候群(Bruton's syndrome)、幼年短暫低丙種球蛋白血症(hypogammaglobulinemia)、歐德里徵候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、毛細血管擴張性運動失調(ataxia telangiectasia)、關於膠原疾病之自體免疫疾病、風濕病、神經學疾病、淋巴腺炎、缺血再灌注疾病、血壓反應降低、血管官能不良、血管擴張、組織損害、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血、及伴隨血管化的疾病、過敏性過敏反應疾病、絲球體腎炎、再灌注損害、心肌或其他組織的再灌注損害、具有急性發炎成分之皮膚病、急性膿性腦膜炎或其他中樞神經系統發炎疾病、眼睛及眼窩發炎疾病、顆粒球(granulocyte)輸液相關的徵候群、細胞激素引發的毒性、嗜眠病、急性嚴重發炎、慢性頑固性發炎、腎盂炎、肺纖維化(pneumonocirrhosis)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿病大動脈疾病、動脈內增生(endarterial hyperplasia)、消化性潰瘍、心臟瓣膜炎及子宮內膜組織異位形成。
「良性高增生疾病」意指在病患中關於細胞增殖之狀態及其被醫界成員視為不正常。不正常狀態之特徵為統計上不同於未患疾病的生物體中觀察到的程度之性質程度。細胞增殖意指由細胞的繁殖之生長或擴大及包括細胞分裂。細胞增殖速率可由計算在特定單位時間內製造的細胞數目而測量。良性高增生疾病之實例包括牛皮癬及息肉。
「呼吸疾病」包含呼吸系統及包括慢性支氣管炎、包括急性氣喘及過敏性氣喘之氣喘、囊胞性纖維症、支氣管擴張、過敏性或其他鼻炎或竇炎、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、咳嗽、肺氣腫、肺纖維化或過度反應化氣道、慢性阻塞性肺部疾病及慢性阻塞性肺病。
「牛皮癬」的症狀特徵是局限性(分離的及融合性的)紅色、銀鱗色斑丘疹(maculopapule)之發疹。牛皮癬病灶一般主要發生於肘部、膝蓋、頭皮及軀幹，顯微鏡上顯示特殊的角化不全(parakeratosis)及網脊(rete ridge)之變長。此用詞包括牛皮癬之不同形式，包括紅皮病型、膿皰型、中等-嚴重及頑固的疾病形式。
「子宮內膜組織異位形成」意指子宮內膜組織之異位發生，常形成含改變的血液之囊腫。
本文中用詞「血管疾病或病症」意指影響血管系統的許多疾病或病症，包括心血管系統。此疾病之實例包括動脈纖維性硬化、血管再阻塞、動脈粥樣硬化、手術後血管狹窄、再狹窄、血管閉塞或頸動脈阻塞性疾病、冠狀動脈疾病、心絞痛(angina)、小血管疾病、高膽固醇血症、高血 壓及關於血管上皮細胞的不正常增殖或功能之症狀。
用詞「狹窄」意指體內中空通道(如導管或管道)結構之狹窄。
用詞「血管狹窄」意指血管之閉塞或狹窄。血管狹窄常由脂肪沈積(如於動脈粥樣硬化的情況)或血管平滑肌細胞及內皮細胞之過多遷移及增殖造成。動脈特別容易狹窄。如本文中使用用詞「狹窄」明確地包括初始狹窄及再狹窄。
用詞「再狹窄」意指明顯成功治療初始狹窄後狹窄的復發。例如，在血管狹窄文中的「再狹窄」意指在如藉血管修復術(如心臟冠狀動脈氣球擴張術(percutaneous transluminal coronary angioplasty))、直接冠狀動脈切除術(coronary atherectomy)或支架等，藉由去除脂肪沉積已經明顯成功治療後，血管狹窄的復發。再狹窄造成因素之一為內膜增生(intimal hyperplasia)。用詞「內膜增生」可與「新內膜增生」及「新內膜形成」互相交換使用，意指血管最內層(內膜)之增厚，其為血管平滑肌細胞及內皮細胞之過多增殖及遷移的結果。在再狹窄期間發生的許多改變常通稱為「血管壁重塑」。
用詞「氣球血管修復術」及「心臟冠狀動脈氣球擴張術(PTCA,percutaneous transluminal coronary angioplasty)」常可互相交換地使用，及意指自冠狀動脈去除凝塊之非手術基於導管治療。由於增加的血液流動的阻力，狹窄或再狹窄常導致高血壓。
用詞「高血壓」意指不正常地高血壓，即超過正常範圍的上限值。
「息肉」意指自正常表面高度向外或向上凸起或突出之組織團，因而為肉眼可見自較廣基底或修長的柄生長呈半球體、球體、或不規則小丘狀結構。實例包括結腸、直腸及鼻息肉。
「纖維性瘤」意指衍生自腺上皮(glandular epithelium)之良性腫瘍，其中有增殖的纖維母細胞及結締組織元件之明顯基質。此通常發生於乳房組織。
「氣喘」為造成呼吸困難的症狀。支氣管氣喘意指一種肺的症狀，其中有氣道的普遍狹窄，其可能由於平滑肌的收縮(痙攣)、黏膜浮腫、或支氣管及細支氣管內腔中的黏液。
「支氣管炎」意指支氣管黏膜之發炎。
為了本文中的目的，「小瓶」意指容納治療藥物的容器。可藉可用針筒刺穿的塞子將小瓶密封。一般而言，小瓶係由玻璃材料形成。於小瓶中的治療藥物可為各種狀態包括液體、凍乾的、冷凍的等。
「說明書(package insert)」意指習慣上包含於治療藥物市售包裝中的用法說明，其含有關於使用此治療產品之適應症、用法、劑量、給予、禁忌症及/或警告之資訊。
II.抗體之製造
下列說明根據本發明使用的HER抗體之例示製造技術。用於製造抗體之HER抗原可為例如含有理想抗原決定位之 HER細胞外區域之可溶形式或其部分。或者，可使用表現HER於其細胞表面之細胞(如轉化為過度表現HER2的NIH-3T3細胞；或癌細胞株如SK-BR-3細胞，見Stancovski等人，PNAS(USA)88：8691-8695(1991))來產生抗體。有用於產生抗體的HER受體之其他形式對於熟悉本技藝者為顯而易見。
(i)多株抗體
較佳將多株抗體藉由多次皮下(sc,subcutaneous)或腹膜內(ip,intraperitoneal)注射相關抗原及佐劑於動物而產生。利用雙官能基或衍生化藥劑，例如，順丁烯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸基團連結)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸基團)、戊二醛、丁二酸酐(succinic anhydride)、SOCl2 或R1 N=C=NR(其中R及R1 為不同烷基基團)，將相關的抗原連結至在接種的動物中為產生免疫性的蛋白質，如鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白(thyroglobulin)或大豆胰蛋白酶可能為有用。
藉由合併如100微克或5微克蛋白質或連結體(分別對於兔子或小鼠)與3倍體積佛氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及在多處皮內注射此溶液，將動物對抗原、產生免疫性的連結體或衍生物接種。一個月之後藉由在多處皮下注射將動物用胜肽或連結體於佛氏完全佐劑之1/5至1/10的原始量補強。7至14天後，將動物採血及分析血清的抗體力價。將動物補強直到力價穩定。較佳的是，將動物用 相同抗原的連結體補強，但結合至不同蛋白質及/或經由不同交聯試劑。也可將連結體於重組細胞培養中以蛋白質融合體製造。同樣地，適當地使用聚集劑如明礬來增強免疫反應。
(ii)單株抗體
於技藝中有許多方法可製造本文中的單株抗體。例如，利用首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)說明的融合瘤方法，藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)可製造單株抗體。
於融合瘤方法中，如上文中所述將小鼠或其他適當宿主動物(如倉鼠)接種以引起產生或能夠產生專一地結合至用來接種的蛋白質之抗體的淋巴球。或者，於試管中可將淋巴球接種。而後利用適當融合試劑(如聚乙二醇)將淋巴球與骨髓癌細胞融合而形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,59-103頁(Academic Press,1986))。
將如此製備的融合瘤細胞植入及生長於適當的培養基中，其較佳含有一或多種抑制未融合母骨髓癌細胞生長或存活的物質。例如，若母骨髓癌細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核醣轉換酶(HGPRT或HPRT,hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)，融合瘤的培養基通常將含有次黃嘌呤、胺蝶砱(aminopterin)及胸腺嘧啶(thymidine)(HAT培養基)，此物質避免缺乏HGPRT的細胞之生長。
較佳的骨髓癌細胞為有效地融合、支持由選定的抗體製造細胞之穩定高量抗體製造及對培養基如HAT培養基為敏感者。於此等之中，較佳的骨髓癌細胞為鼠科骨髓癌細胞，如衍生自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤(可購自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA)及SP-2或X63-Ag8-653細胞(可購自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA)。也曾有報導利用人類骨髓癌細胞及小鼠-人類雜交骨髓癌細胞株製造人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；及Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
將生長融合瘤細胞的培養基分析針對抗原的單株抗體之製造。較佳的是，藉由免疫沉澱法或藉由試管內結合分析法，如放射免疫分析法(RIA,radioimmunoassay)或酵素連結免疫吸附分析法(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)決定由融合瘤細胞製造的單株抗體之結合專一性。
例如，單株抗體的結合親合力可由Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)決定。
在確認融合瘤細胞製造理想的專一性、親合性、及/或活性之抗體後，藉由限數稀釋法(limiting dilution)程序次選殖植株及藉標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,59-103頁(Academic Press,1986))。為此目的之適當培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，可將融合瘤細胞於活體內生長，如動物中的腹水腫瘤。
藉由習見抗體純化程序如例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠(Sepharose)、羥基磷灰石(hydroxylapatite)層析法、膠體電泳、透析或親合力層析法，自培養基、腹水或血清將由次株(subclone)分泌的單株抗體適當地分離。
利用習見程序(如藉由利用能夠專一地結合編碼鼠科抗體之重及輕鏈的基因之寡核苷酸探針)，可輕易地將編碼單株抗體的DNA分離及定序。融合瘤細胞擔任此DNA的較佳來源。一旦分離出來，可將DNA置入表現載體內，而後將其轉染入宿主細胞如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO,Chinese hamster ovary cell)或除此之外不製造抗體蛋白質的骨髓癌細胞，以在重組的宿主細胞中得到單株抗體之合成。關於在DNA編碼抗體的細胞中之重組表現的回顧文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5：256-262(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs.,130：151-188(1992)。
於另一個具體實施例中，可將單株抗體或抗體片段自利用說明於McCafferty等人，Nature,348：552-554(1990)中之技術產生的抗體噬菌體庫分離。Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)分別說明利用噬菌體庫鼠類及人類抗體之分離。隨後文獻說明藉由鏈替換(Chain Shuffling)(Marks等人， Bio/Technology,10：779-783(1992))製造高親合力(nM範圍)人類抗體，以及組合感染及活體內重組作為建立非常大噬菌體庫的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.,21：2265-2266(1993))。因此，此等技術為用以分離單株抗體不同於習見單株抗體融合瘤技術之其他可實行的選擇。
例如，藉由用人類重鏈及輕鏈固定區域之編碼序列取代同源的鼠類序列(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851(1984))，或藉由共價連結至免疫球蛋白編碼序列與所有或部分非免疫球蛋白多胜肽之編碼序列，也可將DNA修改。
通常將此非免疫球蛋白多胜肽取代抗體的固定區域，或將其取代抗體的一個抗原組合位置之可變區域以產生包含有一個具有對抗原有專一性的抗原組合位置及對於不同抗原有專一性的另一個抗原組合位置之嵌合雙價抗體。
(iii)人化抗體
於技藝中已說明人化非人類抗體之方法。較佳的是，人化抗體具有一或多個來源為非人類之胺基酸基團導入其中。此等非人類胺基酸基團常被稱為「引進的」基團，其通常取自「引進的」可變區域。遵照Winter及同仁的方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))，藉由用人類抗體之相對應序列取代高度可變區域序列，基本上可將人化進行。因此，此「人化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中 實質上小於完整人類可變區域受來自非人物種之相對應序列取代。實際上，人化抗體通常為人類抗體，其中一些高度可變區域基團及可能一些FR基團被來自齧齒動物抗體類似位置的基團取代。
用於製造人化抗體之人類可變區域(輕鏈及重鏈兩者)的選擇對於降低抗原性為非常重要。根據所謂「最佳符合」方法，將齧齒動物抗體可變區域的序列針對已知人類可變區域序列之整個資料庫篩選。而後採用最靠近齧齒動物序列之人類序列作為人化抗體的人類骨架區域(FR,framework region)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901(1987))。另一個方法使用衍生自特定子集合輕或重鏈之所有人類抗體共通序列之特別骨架區域。可使用相同骨架於數種不同人化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))。
另外重要的是將抗體人化同時保留對抗原高親合力及其他有益的生物性質。為了達到此目標，根據較佳方法，利用母序列及人化序列之三度空間模型，藉由分析母序列及許多概念人化產品之過程而製備人化抗體。三度空間免疫球蛋白模型對於熟悉本技藝者為普遍可獲得及熟悉。可獲得電腦程式說明及顯示特定候選免疫球蛋白序列之可能三度空間型態結構。檢視此等顯示允許分析基團在候選免疫球蛋白序列功能上可能的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原能力的基團。以此方式，可自接受體及引進 的序列選擇及組合FR基團以便達到理想抗體特性，如對目標抗原增加的親合力。一般而言，高度可變區域基團為直接及大部分實質上涉及影響抗原結合。
世界專利WO01/00245說明例示人化HER2抗體之製造，此抗體結合HER2及阻止HER受體之配體活化。本文中特別有興趣的人化抗體阻止EGF、TGF-α 及/或HRG媒介的MAPK活化如同鼠類單株抗體2C4(或其Fab片段)一般有效及/或結合HER2如同鼠類單株抗體2C4(或其Fab片段)一般有效。本文中人化抗體可例如包含非人類高度可變區域基團併入人類可變重鏈及可進一步包含骨架區域(FR,framework region)置換於由69H、71H及73H組成的族群選出的位置(利用說明於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中可變區域編號系統)。於一個具體實施例中，人化抗體包含有FR置換於69H、71H及73H之二或所有位置。
本文中有興趣的例示人化抗體包含有可變重鏈區域互補決定基團GFTFTDYTMX，其中X較佳為D或S(SEQ ID NO：7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO：8)；及/或NLGPSFYFDY(SEQ ID NO：9)，視情況包含彼等CDR基團的胺基酸修飾，如其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，有興趣的抗體變體可具有約一至約七個或約五個胺基酸置換於上述可變重鏈CDR序列中。此抗體變體可藉親合力成熟製備，如說明於下。最佳的人化抗體包含有 於SEQ ID NO：4中可變重鏈區域胺基酸序列。
人化抗體可包含有可變輕鏈區域互補決定基團KASQDVSIGVA(SEQ ID NO：10)；SASYX1 X2 X3 ，其中X1 較佳為R或L，X2 較佳為Y或E，及X3 較佳為T或S(SEQ ID NO：11)；及/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO：12)，如除了於前段文中彼等可變重鏈區域CDR基團外。此人化抗體視情況包含上述CDR基團的胺基酸修飾，如其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，有興趣的抗體變體可具有約一至約七個或約五個胺基酸置換於上述可變輕鏈CDR序列中。此抗體變體可藉親合力成熟製備，如說明於下。最佳的人化抗體包含有於SEQ ID NO：3中可變輕鏈區域胺基酸序列。
本申請案也考慮親合力成熟的抗體，其結合HER2及阻止HER受體之配體活化。母抗體可為人類抗體或人化抗體，如分別包含SEQ ID Nos.3及4之可變輕及/或重鏈者(即變體574)。親合力成熟的抗體較佳以優於鼠類2C4或變體574之親合力結合至HER2受體(如由約二或約四倍至約100倍或約1000倍改善的親合力，如利用HER2-細胞外區域(ECD,extracellular domain)ELISA評估)。置換的例示可變重鏈CDR基團包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99或二或多者之組合(如此等基團之二、三、四、五、六或七者)。替換的可變輕鏈CDR基團之實例包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97或二或多者之組合(如此等基團之二至三、四、五或高達約十 者)。
考慮人化抗體或親合力成熟抗體之不同形式。例如，人化抗體或親合力成熟抗體可為抗體片段，如Fab，將其視情況與一或多個細胞毒性藥物結合以便產生免疫耦聯體。或者，人化抗體或親合力成熟抗體可為完整抗體，如完整IgG1抗體。較佳的完整IgG1抗體包含有於SEQ ID NO：13中的輕鏈序列及於SEQ ID NO：14中的重鏈序列。
(iv)人類抗體
作為人化的另一個選擇，可產生人類抗體。例如，現在可能產生基因轉殖動物(如小鼠)，其在接種後，能夠產生全套人類抗體而無內生的免疫球蛋白製造。例如，已說明於嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈連結區域(JH)基因之同合子缺失(homozygous deletion)造成內生抗體製造之完全抑制。轉移人類生殖系免疫球蛋白基因陣列於此生殖系突變小鼠中將造成在抗原挑戰時製造人類抗體。見如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.,7：33(1993)；及美國專利第5,591,669、5,589,369及5,545,807號。
或者，可使用噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))由來自未經接種的貢獻者之免疫球蛋白可變(V)區域基因庫於試管內製造人類抗體及抗體片段。根據此技術，將抗體V區域基因同讀框內選殖入絲狀噬菌體之主要或次要鞘蛋白(coat protein)基因內，如M13 或fd，及在噬菌體顆粒的表面上呈現為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單股DNA複製體，基於抗體功能性質的選擇也造成編碼呈現此等性質抗體之基因的選擇。因此，噬菌體類似B細胞的部分性質。可將噬菌體呈現以許多形式進行；回顧見如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可使用V基因片段之數個來源於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)自衍生自免疫的小鼠脾臟之小隨機組合V基因資料庫分離抗噁唑酮(oxazolone)抗體之多變化陣列。基本上遵照由Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)說明的技術，可建立來自未經免疫的人類貢獻者之V基因庫及分離對多變化陣列之抗原(包括自身抗原)的抗體。也見於美國專利第5,565,332及5,573,905號。
如上述，也可將人類抗體藉試管中活化的B細胞而產生(見美國專利第5,567,610及5,229,275號)。
人類HER2抗體係說明於1998年6月30日發行的美國專利第5,772,997號及1997年1月3日出版的世界專利WO 97/00271中。
(v)抗體片段
已發展許多技術製造包含有一或多個抗原結合區域的抗體片段。傳統上，此等片段係經由完整抗體之蛋白質水解消化產生(見如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等人，Science,229：81(1985))。然而，現在藉由重組宿主細胞可直接將此等片段製造。例如，自上述抗體噬菌體庫可將抗體片段分離。或者，由大腸桿菌克直接回收Fab'-SH片段及化學耦合而形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一個方式，自重組宿主細胞培養可直接分離F(ab')2 片段。對於熟悉本技藝者製造抗體片段的其他技術將為顯而易見。於其他具體實施例中，抗體選擇為單鏈Fv片段(scFv)。見世界專利WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。抗體片段也可為「直線抗體」，如例如說明於美國專利第5,641,870號中。此直線抗體片段可為單專一性或雙專一性。
(vi)雙專一性抗體
雙專一性抗體為對至少兩個不同抗原決定位有結合專一性之抗體。例示雙專一性抗體可結合至HER2蛋白質之兩個不同抗原決定位。其他此抗體可組合一個HER2結合位置與EGFR、HER3及/或HER4之結合位置。或者，可將HER2臂與結合至白血球上的驅動分子如T細胞受體分子(如CD2或CD3)、或IgG的Fc受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之臂組合以便集中細胞防衛機制至HER2-表現細胞。也可使用雙專一性抗體來局部化細胞毒性藥物至表現HER2的細胞。此等抗體具有HER2結合臂及結合細胞毒性藥物(如肥皂草毒素(saporin)、抗干擾 素α、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、甲氨蝶呤或放射線同位素半抗原(hapten))之臂。可將雙專一性抗體製備成完整長度抗體或抗體片段(如F(ab')2 雙專一性抗體)。
世界專利WO 96/16673說明一種雙專一性HER2/FcγRIII抗體及美國專利第5,837,234號揭示一種雙專一性HER2/FcγRI抗體IDM1(Osidem)。一種雙專一性HER2/Fcα抗體係示於世界專利WO98/02463中。美國專利第5,821,337號教導一種雙專一性HER2/CD3抗體。MDX-210為雙專一性HER2-FcγRIII抗體。
製造雙專一性抗體的方法為技藝中已知。完整長度雙專一性抗體的傳統製造係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共同表現，在此兩個鏈具有不同的專一性(Millstein等人，Nature,305：537-539(1983))。因為免疫球蛋白重及輕鏈的隨機搭配，此等融合體(四合體)產生10種不同抗體分子之可能混合物，其中僅有一個具有正確的雙專一性結構。正確分子的純化通常由親合力層析法步驟完成，其通常較為麻煩，且產物的產量為低。類似程序係揭示於世界專利WO 93/08829中，及於Traunecker等人，EMBO J.,10：3655-3659(1991)中。
根據不同方式，將具有理想結合專一性的抗體可變區域(抗體-抗原組合位置)融合至免疫球蛋白固定區域序列。融合較佳用免疫球蛋白重鏈固定區域，包含有至少部分樞紐區域、CH2及CH3區域。較佳使第一個重鏈固定區域(CH1) 含有輕鏈結合所需的位置存在於至少一個融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體(及視需要免疫球蛋白輕鏈)的DNA插入分別的表現載體，及共同轉染入適當的宿主生物體內。當於建立時使用不等比例三個多胜肽鏈提供最佳產量時，此提供較大的彈性於調整具體實施例中三個多胜肽片段之彼此比例。然而，當以等比例表現至少兩個多胜肽鏈造成高產量或當比例為不特別重要時，能夠插入二或所有三個多胜肽鏈的編碼序列於一個表現載體中。
於此方法之較佳具體實施例中，雙專一性抗體係由具有第一個結合專一性於一臂之雜交免疫球蛋白重鏈，與另一臂之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二個結合專一性)組成。發現此不對稱結構促進分離理想雙專一性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合，因為免疫球蛋白輕鏈僅存在於雙專一性分子的一半中提供容易的分離方法。此方法係揭示於世界專利WO 94/04690中。產生雙專一性抗體的進一步細節見例如Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據說明於美國專利第5,731,168號中的另一個方法，可設計一對抗體分子之間的界面以最大化自重組細胞培養回收的異二聚體之比例。較佳的界面包括至少部分抗體固定區域之CH 3區域。於此方法中，將來自第一個抗體分子界面的一或多個小胺基酸側鏈用較大的側鏈(如酪胺酸或色胺酸)取代。藉由用較小的胺基酸側鏈(如丙胺酸或羥丁胺酸)取代大胺基酸側鏈將與大側鏈相同或類似大小的補償 性「凹洞」建立於第二個抗體分子的界面上。此提供機制增加異二聚體產量超過不想要的最終產物如同二聚體。
雙專一性抗體包括交聯或「異結合體(heteroconjugate)」抗體。例如，可將於異結合體中的一個抗體連結至親和素(avidin)，另一者連結至生物素(biotin)。例如，已建議此抗體於使免疫系統細胞瞄準不想要的細胞(美國專利第4,676,980號)及用以治療HIV感染(世界專利WO 91/00360、WO 92/200373及歐洲專利EP 03089)。利用任何方便的交聯方法可製造異結合體抗體。適當的交聯藥劑與許多交聯技術為技藝中已熟知及揭示於美國專利第4,676,980號。
由抗體片段產生雙專一性抗體之技術也說明於文獻中。例如，利用化學連結可製備雙專一性抗體。Brennan等人，Science,229：81(1985)說明一個程序，其中將完整抗體蛋白質水解切斷而產生F(ab')2 片段。在雙硫醇複合藥劑亞砷酸鈉(sodium arsenite)存在下將此等片段還原以穩定鄰位雙硫醇及避免分子間雙硫鍵形成。而後將產生的Fab'片段轉變成硫硝基苯甲酸(TNB,thionitrobenzoate)衍生物。而後藉由用巰乙胺(mercaptoethylamine)還原將一個Fab'-TNB衍生物轉變成Fab'-硫醇及與等莫耳量之另一個Fab'-TNB衍生物混合而形成雙專一性抗體。產生的雙專一性抗體可用於作為選擇性固定酵素之藥劑。
最近的發展已促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，可將其化學連結以形成雙專一性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.,175：217-225(1992)說明完全人化雙專一性抗 體F(ab')2 分子之製造。各Fab'片段係由大腸桿菌分別分泌及經過試管內直接化學耦合而形成雙專一性抗體。如此形成的雙專一性抗體能夠結合至過度表現HER2受體的細胞及正常人類T細胞，以及驅動人類細胞毒性白血球對於人類乳房腫瘤目標的分解活性。
也已經說明自重組細胞培養直接製造及分離雙專一性抗體片段之不同技術。例如，利用白胺酸拉鍊結構(leucine zipper)製造雙專一性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)。將來自Fos及Jun蛋白質的白胺酸拉鍊結構胜肽藉由基因融合連接至兩個不同抗體的Fab'部分。將抗體同二聚體於樞紐區域還原而形成單體及而後重新氧化而形成抗體異二聚體。也可使用此方法來製造抗體同二聚體。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA,90：6444-6448(1993)說明的「微型雙功能抗體」技術已提供製造雙專一性抗體片段之另一機制。片段包含有藉連接體連接至輕鏈可變區域(VL )的重鏈可變區域(VH )，此連接體太短而不足以使相同鏈上的兩個區域之間配對。於是，強迫一個片段的VH 及VL 區域與另一個片段的互補VL 及VH 區域配對，因而形成兩個抗原結合位置。也已報導利用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙專一性抗體片段之另一策略。見Gruber等人，J.Immunol,152：5368(1994)。
考慮具有多於兩價的抗體。例如，可製備三專一性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
(vii)其他胺基酸序列修飾
考慮本文中所述抗體之胺基酸序列修飾。例如，可能希望改善抗體的結合親合力及/或其他生物性質。藉由導入適當核苷酸改變於抗體核酸，或藉由胜肽合成，製備抗體之胺基酸序列變體。此修飾包括例如缺失形式、及/或插入至及/或取代抗體胺基酸序列內的基團。若最終構體具有理想特性，使缺失、插入及取代的任意組合在最終構體達到。胺基酸變化也可改變抗體的轉譯後過程，如改變醣化位置的數目或位置。
確認抗體的某些基團或區域為突變的較佳位置之有用方法稱為「丙胺酸掃描突變」，如由Cunningham及Wells Science,244：1081-1085(1989)所述。在此，確認目標基團之基團或族群(如帶電荷的基團如arg、asp、his、lys及glu)及由中性或帶負電的胺基酸(最佳的是丙胺酸或聚丙胺酸)取代以影響胺基酸與抗原的交互作用。而後藉由導入其他或另外的變體於置換的位置，將顯示對於置換有功能敏感性的彼等胺基酸位置修正。因此，當預定導入胺基酸序列變體的位置，不需預定突變性質本身。例如，為了分析特定位置處突變的表現，實施丙胺酸掃描或隨機突變於目標密碼子及將表現的抗體變體篩選理想活性。
胺基酸序列插入包括長度範圍為一個基團至含有一百個或以上基團之多胜肽之胺基-及/或羧基-末端融合，以及單一或多胺基酸基團之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-端甲硫胺基基團的抗體或融合至細胞毒性多胜肽之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體的N-或C-端融合至 酵素(如對ADEPT)或增加抗體的血清半生期之多胜肽。
另一類變體為胺基酸置換變體。此等變體於抗體分子中具有至少一個胺基酸基團被不同基團置換。取代突變最令人感興趣的位置包括高度可變區域，但是也考慮FR改變。將保守性置換示於表1中，標題為「較佳的取代」。若此取代造成生物活性的改變，則可導入更多的改變，於表1中稱為「例示取代」，或參照胺基酸類別如下所述，並將產物篩選。
藉由選擇顯著不同於維持(a)於置換的區域之多胜肽骨架結構，例如，呈摺疊或螺旋組態，(b)在目標位置處分子的電荷或親油性，或(c)側鏈之主體之作用的置換達到抗體生物性質之實質修改。根據其側鏈性質的類似性可將胺基酸分類(於A.L.Lehninger，於Biochemistry，第2版，73-75頁，Worth Publishers,New York(1975))：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，可將天然發生的基團基於共同的側鏈性質區分呈下列族群：(1)親油性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈位相之基團：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置換將需要交換此等類別之一員與另一類別。
可將不涉及維持抗體的適當型態之任何半胱胺酸基團置換(一般與絲胺酸)以改善分子的氧化安定性及避免異常的 交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵結加至抗體以改善其安定性(特別是當抗體為抗體片段如Fv片段)。
特別較佳置換變體的類型包含置換母抗體(如人化或人類抗體)之一或多個高度可變區域基團。一般而言，選擇做進一步發展之形成的變體將相對於其產生的母抗體具有改善的生物性質。產生此置換變體的便利方法包含利用噬菌體呈現之親合力成熟。簡而言之，將數個高度可變區域位置(如6-7個位置)突變以在各位置產生所有可能的胺基置換。將如此產生的抗體變體以單價形式自絲狀噬菌體顆粒呈現為與M13的基因III產物融合包裝於各顆粒內。而後將噬菌體呈現的變體如本文中揭示篩選其生物活性(如結合親合力)。為了確認用以修改的候選高度可變區域位置，可進行丙胺酸掃描突變法以確認顯著幫助抗原結合的高度可變區域基團。或者(或此外)，分析抗原-抗體複合物的結晶結構可能有利於確認抗體及人類HER2之間的接觸點。根據本文中詳細說明的技術，此接觸基團及相鄰基團為置換的候選者。一旦將此變體產生，將變體小組經過如本文中說明的篩選，在一或多個相關分析中可選擇具有優良的性質之抗體做進一步發展。
另一類抗體的胺基酸變體改變抗體的原始醣化形式。由改變意指刪除見於抗體中一或多個碳水化合物部分，及/或加入不存在於抗體中的一或多個醣化位置。
抗體的醣化通常為N-連結或O-連結。N-連結意指連接碳水化合物部分至天冬醯胺酸基團。三胜肽序列天冬醯胺 酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-羥丁胺酸(其中X為除了脯胺酸外的任何胺基酸)為酵素連接碳水化合物部分至天冬醯胺酸側鏈的辨識序列。因此，此等三胜肽序列存在於多胜肽產生可能的醣化位置。O-連結醣化意指連接糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖其中之一至羥胺基酸，最常見的是絲胺酸或羥丁胺酸，雖然也可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。
藉由改變胺基酸序列使其含有一或多個上述三胜肽序列(為了N-連結醣化位置)，便利地達到加入醣化位置至抗體。藉由加入或用絲胺酸或羥丁胺酸基團取代原始抗體的序列(為了O-連結醣化位置)，也可做此改變。
當抗體包含Fc區域，可將連接於其上的碳水化合物改變。例如，具有缺乏岩藻糖(fucose)連接至抗體的Fc區域之成熟碳水化合物結構的抗體係說明於美國專利申請案第2003/0157108 A1號(Presta,L.)。也見美國專利2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。抗體具有平分的N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)於連接至抗體的Fc區域之碳水化合物中係於Jean-Mairet等人的世界專利WO03/011878及Umana等人的美國專利第6,602,684號中提及。抗體具有至少一個半乳糖基團於連接至抗體的Fc區域之寡醣中係報導於Patel等人的世界專利WO97/30087中。也見世界專利WO98/58964(Raju,S.)及WO99/22764(Raju,S.)關於抗體具有改變的碳水化合物連接至其Fc區域。
可能希望修改本發明的抗體關於作用功能，如以便增強 抗體的抗原相關的細胞調節細胞毒性(ADCC,antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity)及/或補體相關的細胞毒性(CDC,complement dependent cytotoxicity)。藉由導入一或多個胺基酸置換於抗體的Fc區域可將此達成。或者或此外，可將半胱胺酸基團導入Fc區域中，因而允許於此區域中鏈間雙硫鍵形成。如此產生的同二聚體抗體可能具有改善的內質化(internalization)能力及/或增加的補體媒介的細胞致命及抗體相關的細胞毒性(ADCC,antibody-dependent cellular cytotoxicity)。見Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)及Shopes,B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可利用說明於Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中之異雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性之同二聚體抗體。或者，可設計具有雙Fc區域的抗體及可因而具有增強的補體分解及ADCC能力。見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
世界專利WO00/42072(Presta,L.)說明在人類作用細胞存在中具有改善的ADCC功能之抗體，其中抗體包含有胺基酸置換於其Fc區域。較佳的是，具有改善的ADCC之抗體包含有置換於Fc區域的位置298、333及/或334。較佳的是，改變的Fc區域為人類IgG1 Fc區域，包含有或由此等位置之一、二或三個置換組成。
具有改變的C1q結合及/或補體相關的細胞毒性(CDC,complement dependent cytotoxicity)之抗體係說明於世界專 利WO99/51642、美國專利第6,194,551B1號、美國專利第6,242,195B1號、美國專利第6,528,624B1號及美國專利第6,538,124號(Idusogie等人)。抗體包含有胺基酸置換於其Fc區域之胺基酸位置270、322、326、327、329、313、333及/或334之一或多者。
為了增加抗體的血清半生期，吾人可將解救受體結合抗原決定位併入抗體(特別是抗體片段)，如例如美國專利第5,739,277號中所述。如本文中使用，用詞「解救受體結合抗原決定位」意指IgG分子(如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )的Fc區域之抗原決定位，其負責增加IgG分子活體內血清半生期。
世界專利WO00/42072(Presta,L.)揭示對新生兒Fc受體(FcRn)具有改善的結合及增加的半生期之抗體。此等抗體包含有具有一或多個置換的Fc區域，其改善Fc區域對FcRn的結合。例如，Fc區域可具有取代於位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434之一或多者。較佳的具有改善的FcRn結合之Fc區域組成的抗體變體包含有胺基酸置換於其Fc區域之位置307、380及434之一、二或三者。
也考慮具有三或多個(較佳為四個)功能性抗原結合位置之人工抗體(美國專利申請案第2002/0004587 A1，Miller等人)。
編碼抗體胺基酸序列變體的核酸分子係由技藝中已知的 許多方法製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然發生的胺基酸序列變體的情況中)或由寡核苷酸媒介的(或定點)突變、PCR突變及盒式誘變(cassette mutagenesis)抗體之先前製備的變體或非變體形式而製備。
(viii)具有理想性質的抗體之篩選
以上已經說明產生抗體的技術。視需要，吾人可進一步選擇具有某些生物特性的抗體。
為了確認阻止HER受體之配體活化的抗體，可決定抗體阻止HER配體結合至表現HER受體(如另一個HER受體與研究的HER受體連結而形成HER異寡聚體)之細胞的能力。例如，可將天然表現或經轉染而表現HER異寡聚體之HER受體的細胞與抗體培養及而後暴露至標誌的HER配體。而後可評估抗體阻擋配體結合至HER異寡聚體中HER受體的能力。
例如，基本上如世界專利WO01/00245中所述利用單層MCF7培養於冰上24孔盤形式中，可進行由HER2抗體抑制HRG結合至MCF7乳房腫瘤細胞株。可將HER2單株抗體加至各孔及培養30分鐘。而後可將125 I標誌的rHRGβ1177-224 (25pm)加入，並將培養持續4至16小時。可製備劑量反應及對於研究的抗體可計算IC50 值。於一個具體實施例中，阻止配體活化HER受體之抗體於此分析法中將具有抑制HRG結合至MCF7細胞的IC50 約為50nM或以下，更佳為10nM或以下。當抗體為抗體片段如Fab片段時，此分析法中抑制 HRG結合至MCF7細胞的IC50 可約為100nM或以下，更佳為50nM或以下。
或者(或此外)，可評估抗體阻止HER配體刺激的酪胺酸磷酸化存在於HER異寡聚體中HER受體之能力。例如，可將內生表現HER受體或經轉染而表現之的細胞與抗體一起培養，而後利用抗磷酸酪胺酸單株抗體(將其視情況與可偵測的標誌連結)分析HER配體相關的酪胺酸磷酸化活性。也可使用說明於美國專利第5,766,863號中之激酶受體活化分析法來決定HER受體活化及由抗體阻止此活性。
於一個具體實施例中，基本上如世界專利WO01/00245中所述，吾人可篩選於MCF7細胞中抑制HGR刺激p180酪胺酸磷酸化之抗體。例如，可將MCF7細胞植入24孔盤中及可將對HER2的單株抗體加至各孔並於室溫培養30分鐘；而後可將rHRGβ1177-244 加至各孔至0.2nM最終濃度，可將培養繼續8分鐘。可將培養基自各孔吸出，及藉由加入100微升SDS樣品緩衝液(5%SDS,25mM DTT及25mM Tris-HCl,pH 6.8)可將反應停止。可將各樣品(25微升)在4-12%梯度膠體(Novex)上電泳及而後電泳轉移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride)膜。可將抗磷酸酪胺酸(以1微克/毫升)免疫轉漬(immunoblot)顯影，及可將於Mr -180,000的主要反應帶強度用反射式感光密度計定量。選擇的抗體較佳將顯著地於本分析中抑制HRG刺激p180酪胺酸磷酸化至約控制組的0-35%。可製備由反射式感光密度計決定之HRG刺激p180酪胺酸磷酸化之抑制的劑量反應曲 線及可計算研究的抗體之IC50 。於一個具體實施例中，阻止配體活化HER受體之抗體於此分析法中將具有抑制HRG刺激p180酪胺酸磷酸化的IC50 約為50nM或以下，更佳為10nM或以下。當抗體為抗體片段如Fab片段時，此分析法中抑制HRG刺激p180酪胺酸磷酸化的IC50 可約為100nM或以下，更佳為50nM或以下。
如基本上如Schaefer等人，Oncogene 15：1385-1394(1997)中所述，吾人也可評估抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用。根據此分析法，MDA-MB-175細胞可用HER2單株抗體(10微克/毫升)處理4天並用結晶紫染色。與HER2抗體培養可顯示類似於由單株抗體2C4呈現之對此細胞株的生長抑制作用。於另一個具體實施例中，外生的HRG將不會顯著地推翻此抑制。較佳的是，在外生HRG存在及不存在下兩者，抗體將能夠比單株抗體4D5更大程度(及視情況比單株抗體7F3更大程度)抑制MDA-MB-175細胞的細胞增殖。
於一個具體實施例中，如世界專利WO01/00245中所述的共同免疫沉澱實驗中決定，研究的HER2抗體於MCF7及SK-BR-3細胞兩者中可比單株抗體4D5大體上更有效(及更佳的是大體上比單株抗體7F3更有效)阻止神經調節素相關的HER2與HER3的結合。
為了確認生長抑制性HER2抗體，吾人可篩選抑制過度表現HER2之癌細胞生長的抗體。於一個具體實施例中，生長抑制性抗體之選擇能夠以抗體濃度約0.5至30微克/毫 升抑制細胞培養中的SK-BR-3細胞生長約20-100%及較佳約50-100%。為了確認此抗體，可進行說明於美國專利第5,677,171號中的SK-BR-3分析法。根據此分析法，將SK-BR-3細胞生長於F12及DMEM培養基補充10%胎牛血清、麩胺醯胺酸及青黴素鏈黴素之1：1混合物中。將SK-BR-3細胞以20,000個細胞植入35毫米細胞培養皿(2毫升/35毫米培養皿)。將0.5至30微克/毫升HER2抗體加入每個培養皿中。六天後，利用電子COULTER細胞計數器計算細胞的數量與未處理的細胞比較。可選擇抑制SK-BR-3細胞生長約20-100%或約50-100%之彼等抗體作為生長抑制性抗體。見美國專利第5,677,171號之篩選生長抑制性抗體(如4D5及3E8)的分析法。
為了選擇引發細胞凋亡的抗體，可利用BT474細胞之膜聯蛋白結合分析法。如前文中所述，將BT474細胞培養及植入培養皿中。而後將培養基移除及換成單獨新鮮培養基或含10微克/毫升單株抗體之培養基。三天培養期間後，將單層用PBS清洗及用胰蛋白酶消化分離。而後將細胞離心、重新懸浮於Ca2+ 結合緩衝液中及如上述分入試管中做細胞死亡分析。而後試管接受標誌的膜聯蛋白(如膜聯蛋白V-FTIC)(1微克/毫升)。利用FACSCAN流式細胞儀(flow cytometer)及FACSCONVERT CellQuest軟體(Becton Dickinson)可將樣品分析。選擇相較於控制組引發統計學上顯著量膜聯蛋白結合之彼等抗體作為引發細胞凋亡的抗體。除了膜聯蛋白結合分析法，可利用BT474之DNA染色 分析法。為了進行此分析，如前面兩段所述，將已用研究的抗體處理的BT474細胞與9微克/毫升HOECHST 33342於37℃培養2小時，而後在EPICS ELITE流式細胞儀(Coulter Corporation)上利用MODFIT LT軟體(Verity Software House)分析。利用此分析法可選擇引發細胞凋亡的細胞比例改變比未經處理的細胞大2倍或以上(較佳3倍或以上)(高達100%細胞凋亡的細胞)之抗體作為促進細胞凋亡的抗體。見世界專利WO98/17797之篩選引發細胞凋亡的抗體(如7C2及7F3)的分析法。
為了篩選結合至由研究的抗體結合於HER2上的抗原決定位之抗體，可進行如說明於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow及David Lane編著(1988)的常規交叉阻礙分析法以評估是否抗體交叉阻礙抗體如2C4或帕妥珠單抗結合至HER2。或者(或此外)，藉由技藝中已知的方法可進行抗原決定位分析及/或吾人可研究抗體-HER2結構(Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004))以看HER2的何區域被抗體結合。
(ix)帕妥珠單抗組合物
於HER2抗體組合物的一個具體實施例中，組合物包含有主要物種帕妥珠單抗抗體及其一或多個變體之混合物。本文中帕妥珠單抗主要物種抗體之較佳實施例為包含有於SEQ ID Nos.3及4中的可變輕鏈及可變重鏈胺基酸序列者，更佳的是包含有由SEQ ID No.13及17選出的輕鏈胺基酸序列及由SEQ ID No.14及18選出的重鏈胺基酸序列(包 括彼等序列之去醯胺及/或氧化變體)。於一個具體實施例中，組合物包含有主要物種帕妥珠單抗抗體及包含有胺基端前導延伸之其胺基酸序列變體的混合物。較佳的是，胺基端前導延伸係於抗體變體的輕鏈上(如於抗體變體的一或兩個輕鏈上)。主要物種HER2抗體或抗體變體可為全長抗體或抗體片段(如F(ab')2片段之Fab)，但較佳兩者為全長抗體。本文中的抗體變體可包含有胺基端前導延伸於其重或輕鏈之任何一或多個上。胺基端前導延伸較佳包含或由VHS-組成。藉由許多分析技術包括(但不限於)N端序列分析、電荷異質性分析(例如，陽離子層析法或毛細管區帶電泳法(Capillary zone electrophoresis))、質譜儀等可偵測組合物中胺基端前導延伸的存在。組合物中抗體變體的量一般範圍為組成用來偵測變體的任何分析法(較佳為N端序列分析)之偵測極限的量至少於主要物種抗體量之量。一般而言，組合物中抗體分子的約20%或以下(如約1%至約15%，例如由5%至約15%)包含有胺基端前導延伸。此比例值較佳利用定量N端序列分析或陽離子交換分析(較佳利用高解析度、弱陽離子交換管柱，如PROPAC WCX-10陽離子交換管柱)決定。除了胺基端前導延伸變體外，考慮主要物種抗體及/或變體的其他胺基酸序列改變，包括但不限於包含有在其重鏈之一或兩者上C端離胺酸基團之抗體、去醯胺抗體變體等。
再者，主要物種抗體或變體可更包含醣化變體，其非限制性實例包括包含有G1或G2寡醣結構連接至其Fc區域的 抗體、包含有碳水化合物部分連接至其輕鏈之抗體(如一或兩個碳水化合物部分(如葡萄糖或半乳糖)連接至抗體的一或兩個輕鏈，例如連接至一或多個離胺酸基團)、包含有一或多個非醣化重鏈之抗體或包含有sialidated寡醣連接至其一或兩個重鏈等。
組合物可由基因改造的細胞株如表現HER2抗體之中國倉鼠卵巢(CHO,Chinese hamster ovary)細胞株回收，或由胜肽合成而製備。
(x)免疫結合體
本發明也有關於免疫結合體，包含有抗體結合至細胞毒素藥物如化療藥物、毒素(如細菌、黴菌、植物或動物來源之小分子毒素或酵素活性的毒素，包括其片段及/或變體)或放射線同位素(即放射線結合體)。
已將有用於產生此免疫結合體的化療藥物說明於上。本文中也考慮抗體及一或多個小分子毒素(如卡奇霉素、美登素(美國專利第5,208,020號)、單端孢霉烯族化合物及CC1065)之結合體。
於本發明的一個較佳具體實施例中，將抗體結合至一或多個美登素分子(如每抗體分子結合約1至10個美登素分子)。例如，可將美登素轉變成May-SS-Me，可將其還原成May-SH3及與改質的抗體反應(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))以產生美登素類-抗體免疫結合體。
另一個有興趣的免疫結合體包含有結合至一或多個卡奇 霉素分子的抗體。卡奇霉素抗生素家族能夠以次微微莫耳濃度產生雙股DNA斷裂。可使用的卡奇霉素結構類似物包括但不限於γ1 I 、α2 I 、α3 I 、N-乙醯基-γ1 I 、PSAG及θ1 I (Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)及Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。也見於美國專利第5,714,586、5,712,374、5,264,586及5,773,001號，特意地以參考資料併於本文中。
可使用的酵素活性的毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(Modeccin)A鏈、α-八疊球菌(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、痲瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、sapaonaria officinalis抑制劑、gelonin、mitogellin、restrictocin、酚霉素(phenomycin)、enomycin及單端孢霉烯族化合物。見例如發表於1993年10月28日的世界專利WO 93/21232。
本發明更考慮在抗體及具有核酸分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶(endonuclease)如去氧核糖核酸酶、DNase)之間形成的免疫結合體。
可得到許多放射線同位素用於製造放射線結合的HER2抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu的放射線同位素。
利用許多雙官能基蛋白質耦合藥劑如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP,N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯、巰醇亞胺(IT,iminothiolane)、亞胺酸酯之雙官能基衍生物(如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(如戊二醛(glutaraldehyde)、雙-疊氮化合物(如雙-(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙-偶氮鹽衍生物(如雙-(對-偶氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，可製成抗體及細胞毒性藥物的結合體。例如，如說明於Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中可製備蓖麻毒素免疫毒素。碳14標誌的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五醋酸(MX-DTPA,1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid)為用以結合放射性核種至抗體的例示螯合劑。見世界專利WO94/11026。連結劑可為「可切斷的連結劑」幫助釋放細胞毒性藥物於細胞中。例如，可使用酸不安定的連結劑、胜肽酶敏感的連結劑、二甲基連結劑或含雙硫連結劑(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))。
或者，可製造含有抗體及細胞毒性藥物之融合蛋白質，如藉由重組技術或胜肽合成。
本文中也考慮其他免疫結合體。例如，可將抗體連接至許多非蛋白質聚合物之其中之一者，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯類、或聚乙二醇及聚丙二醇的共聚物。也可 將抗體包入藉凝聚作用(coacervation)技術或藉由界面聚合製備的微膠囊中(例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、於膠體藥物傳遞系統中(例如微脂粒、白蛋白微球、微乳化液、奈米顆粒及奈米膠囊)或於巨乳化液中。此技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo,A.編著(1980)。
也可將本文中揭示的抗體配製成免疫微脂粒。藉由技藝中已知的方法，如說明於Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)、Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4030(1980)、美國專利第4,485,045及4,544,545號及發表於1997年10月23日的世界專利WO97/38731中，將含有抗體的微脂粒製備。具有增加的循環時間之微脂粒係揭示於美國專利第5,013,556號中。
藉由逆相蒸發法與包含有磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、膽固醇及PEG-衍生化的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE,PEG-derivatized phosphatidylethanolamine)之脂質組成份可產生特別有用的微脂粒。將微脂粒擠壓通過明確孔徑大小的過濾器而產生具有理想直徑的微脂粒。可將本發明的抗體之Fab'片段經由雙硫互換反應連結至微脂粒，如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述。視情況將化療藥物包含於微脂粒內。見Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
III.選擇治療的病患
視情況使本文中的病患於治療前經過診斷試驗。例如， 診斷試驗可評估HER(如HER2或EGFR)表現(包括過度表現)、放大及/或活化(包括磷酸化或二聚合)。
一般而言，若進行診斷試驗，可由需要治療的病患得到樣本。當主題為癌症，樣本通常為腫瘤樣本。於較佳具體實施例中，腫瘤樣本係來自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、轉移性乳癌(MBC,metastatic breast cancer)、非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)、前列腺癌或結腸直腸癌腫瘤樣本。
然而應注意將HER抗體之許多其他非惡性治療適應症說明於本文中。當要治療病患之非惡性適應症時，適當的樣本可自病患取得及經過如本文中所述之診斷分析。
本文中的生物樣本可為經過固定的樣本，如福馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE,formalin fixed,paraffin-embedded)樣本，或冷凍樣本。
根據本文中發明的一個具體實施例，選擇做治療的病患具有顯現HER(較佳為HER2)活化的腫瘤。於一個具體實施例中，於癌細胞中HER(或HER2)活化的程度顯著超過在相同組織類型的非癌細胞中該受體的活化程度。此過度活化可能起因為癌症細胞中HER受體的過度表現及/或可得到超過正常量用以活化HER受體之HER配體。此過度活化可為癌症細胞的惡性狀態的結果或原因。於一些具體實施例中，將使癌症經過診斷或預後分析以決定是否發生HER受體的放大及/或過度表現，其造成HER受體之此過度活化。或者或此外，可將癌症經過診斷或預後分析以決定是否於 癌細胞中發生放大及/或過度表現HER配體，其造成受體的過度活化。在此癌症的子集合中，受體的過度活化可能起因於自身分泌刺激途徑。用以決定HER活化之許多分析法將於下更詳細說明。
(i)HER二聚體
可將腫瘤樣本評估HER二聚體之存在作為代表HER或HER2活化。可使用技藝中已知的任何方法來偵測腫瘤中的HER2二聚體，如EGFR-HER2、HER2-HER3。將數種較佳的方法說明於下。此等方法偵測非共價蛋白質-蛋白質交互作用或者指出研究的蛋白質間的接近。
可使用以免疫親合力為基本的方法，如免疫沉澱法或ELISA來偵測HER二聚體。於一個具體實施例中，使用HER2抗體來免疫沉澱包含來自腫瘤細胞的HER2的複合物，而後藉由免疫轉漬偵測形成的免疫沉澱物之EGFR或HER3的存在。於另一個具體實施例中，可使用EGFR或HER3抗體於免疫沉澱步驟及而後用HER2抗體偵測免疫沉澱物。於再另一個具體實施例中，可使用對EGFR、HER3、EGFR/HER2複合物或HER2/HER3複合物專一的HER配體來沉澱複合物，而後偵測HER2的存在。例如，可將配體連結至親和素及將複合物於生物素管柱上純化。
於其他具體實施例中，如ELISA或抗體「三明治」類型分析法中，將對HER2的抗體固定於固體載體上，與腫瘤細胞或腫瘤細胞分解液接觸，清洗，及而後暴露至對抗EGFR或HER3的抗體。後者抗體的結合(可直接或藉由二級 抗體連接至可偵測的標記而偵測)代表異二聚體的存在。於某些具體實施例中，將EGFR或HER3抗體固定，而使用HER2抗體於偵測步驟。於其他具體實施例中，可使用HER配體代替HER抗體或與其組合使用。
也可使用化學或UV交聯來共價地結合活細胞表面上的二聚體。Hunter等人，Biochem.J.,320：847-53。化學交聯劑之實例包括二硫代雙(琥珀醯亞胺基)丙酸酯(DSP,dithiobis(succinimidyl)propionate)及3,3'-二硫代雙(琥珀磺醯亞胺基)丙酸酯(DTSSP,3,3'-dithiobis(sulphosuccinimidyl)propionate)。於一個具體實施例中，藉SDS-PAGE分析來自化學交聯的腫瘤細胞之細胞萃取物及用對EGFR及/或HER3的抗體免疫轉漬。適當分子量之超遷移(supershifted)帶最可能代表EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體，因為HER2為EGFR及HER3的較常見二聚合搭檔。藉由隨後用HER2抗體免疫轉漬可將此結果證實。
也可使用螢光共振能量傳遞(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)來偵測EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體。FRET基於自供給者螢光團(fluorophore)傳遞能量至接受者螢光團於活體內及試管內偵測蛋白質形態改變及蛋白質-蛋白質交互作用。Selvin,Nat.Struct.Biol.,7：730-34(2000)。僅當供給者螢光團足夠靠近接受者螢光團才會發生能量傳遞。於典型FRET實驗中，將兩個蛋白質或單一蛋白質上的兩處用不同螢光探針標記。將其中一個探針(供給者探針)用特定波長的入射光激發至較高能量 狀態。而後供給者探針傳送其能量至第二個探針(接受者探針)造成供給者螢光強度降低及接受者螢光發射的增加。為了測量能量傳遞的程度，將用供給者及接受者探針標記的樣本之供給者強度與僅用供給者探針標記的樣本之其強度比較。視情況，於供給者/接受者及僅接受者樣本中比較接受者強度。適當的探針為技藝中已知及包括例如膜通透染料(如螢光素及若丹明(rhodamine))、有機染料(如花青染料(cyanine dyes))及鑭原子。Selvin，同前。偵測及測量能量傳遞的方法及儀器也為技藝中已知。Selvin，同前。
適用於偵測及測量獨立細胞中蛋白質-蛋白質交互作用的以FRET為基礎的技術也為技藝中已知。例如，可使用供給者光漂白螢光共振能量傳遞(pbFRET,photobleaching fluorescence resonance energy transfer)顯微鏡及螢光生命期造影顯微術(FLIM,fluorescence lifetime imaging microscopy)來偵測細胞表面受體之二聚合。Selvin，同前；Gadella & Jovin,J.Cell Biol.129：1543-58(1995)。於一個具體實施例中，使用pbFRET於「懸浮」或「原位」的細胞以偵測及測量EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體的形成，如Nagy等人，Cytometry 32：120-131(1998)中所述。此等技術測量供給者由於能量傳遞而降低之螢光生命期。於特別的具體實施例中，可使用流式細胞儀佛斯特(Foerster)型FRET技術(FCET,flow cytometric energy transfer)來研究EGFR-HER2及HER2-HER3二聚合，如Nagy 等人，同前，及Brockhoff等人，Cytometry,44：338-48(2001)中所述。
較佳一起使用FRET及標準免疫組織化學標記技術。Kenworthy,Methods,24：289-96(2001)。例如，可使用連結至適當螢光染料的抗體作為標記兩個不同蛋白質的探針。若蛋白質為彼此靠近，螢光染料作用為FRET的供給者及接受者。藉標準方式偵測能量傳遞。藉由流式細胞儀方式或藉數位顯微鏡系統，如共焦顯微鏡或廣視野螢光顯微鏡連接至電荷耦合裝置(CCD,charge-coupled device)照相機可偵測能量傳遞。
於本發明的一個具體實施例中，將HER2抗體及EGFR或HER3抗體直接用兩個不同螢光團標記，例如如Nagy等人，同前所述。使腫瘤細胞或腫瘤細胞分解液與不同標記的抗體接觸，其作用為在EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體存在中FRET的供給者及接受者。或者，將未標記的抗HER2及EGFR或HER3抗體與作為供給者及接受者之不同標記的二級抗體一起使用。見例如Brockhoff等人，同前。若發現標記為緊密接近，偵測到能量傳遞及決定二聚體之存在。
於其他具體實施例中，將對HER2及HER1或HER3專一的HER受體配體螢光標記及使用於FRET研究中。
於本發明的再其他具體實施例中，腫瘤細胞表現上二聚體的存在係由利用標準直接或間接免疫螢光技術及共焦雷射掃描顯微鏡HER2與EGFR或HER3之位置重疊而證實。 或者，使用雷射掃描造影(LSI,laser scanning imaging)於高產量形式如微孔盤中直接偵測抗體結合及HER2與EGFR或HER3的位置重疊，如說明於Zuck等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11122-27(1999)中。
於其他具體實施例中，EGFR-HER2及/或HER2-HER3二聚體之存在係由確認靠二聚體成分之接近的酵素活性而決定。將HER2抗體與一個酵素連結而將EGFR或HER3抗體與第二個酵素連結。此導致與另一個分子之反應而產生可偵測化合物如染料。另一個化合物的存在分解第二個受質，所以除非第一個及第二個酵素(及因此兩個抗體)為緊密靠近，第二個酵素的反應被制止。於特別的具體實施例中，使腫瘤細胞或細胞分解液與和葡萄糖氧化酶連結的HER2抗體及和山葵過氧化酶(conjugate horse radish peroxidase)連結的HER3或HER1抗體。將葡萄糖與染料前驅物(如DAB)及過氧化氫酶(catalase)一起加至反應。二聚體之存在係由DAB的染色時顏色呈現而決定。
利用基於eTagTM 分析系統(Aclara Bio Sciences,Mountain View,CA)之方法，如說明於2001年12月6日出版的美國專利申請案第2001/0049105號(將其兩者全文以參考資料併於本文中)，也可偵測二聚體。eTagTM 或「電泳標籤」包含有可偵測的報告者部分，如螢光基團。其也包含「移動性修飾劑」，其基本上由具有獨特電泳移動性的部分組成。此等部分允許在特定電泳條件下如毛細管電泳(CE,capillary electrophoresis)自複合混合物分離及偵測 eTagTM 。將含有報告者部分的eTagTM 及視情況移動性修飾劑之部分藉由可切斷的連接基團連接至第一個目標結合部分而產生第一個結合化合物。第一個目標結合部分專一地辨識特定的第一個目標，如核酸或蛋白質。第一個目標結合部分無論如何不受限制，及可為例如聚核苷酸或多胜肽。較佳的是，第一個目標結合部分為抗體或抗體片段。或者，第一個目標結合部分可為HER受體配體或其能夠結合的片段。
連接基團較佳包含有可切斷的部分，如酵素受質，或於特定條件下可被切斷的任何化學鍵。當第一個目標結合部分結合至其目標時，將切斷劑導入及/或活化，及將連接基團切斷，因此釋放含有報告者部分及移動性修飾劑之eTagTM 的部分。因此，「游離」eTagTM 的存在代表目標結合部分結合至其目標。
較佳的是，第二個目標結合化合物包含有切斷劑及專一地辨識第二個目標之第二個目標結合部分。第二個目標結合部分無論如何不受限制，及可為例如抗體或抗體片段或HER受體配體或能夠結合的片段。切斷劑為若第一個結合化合物與第二個結合化合物為緊密靠近時其將僅切斷第一個結合化合物中的連接基團。
於本發明的一個具體實施例中，第一個結合化合物包含有eTagTM ，其中對HER2的抗體作為第一個目標結合部分。第二個結合化合物包含有對EGFR或HER3的抗體結合至能夠切斷eTagTM 的連接基團的切斷劑。較佳的是，必須 將切斷劑活化以便能夠切斷連接基團。使腫瘤細胞或腫瘤細胞分解液與eTagTM 接觸(其結合至HER2)及與經修飾的EGFR或HER3的抗體接觸(其結合至細胞表面上的EGFR或HER3)。較佳將未結合的結合化合物移除，視需要將切斷劑活化。若EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體存在，由於切斷劑與連接基團接近，切斷劑將切斷連接基團及釋放eTagTM 。而後可藉技藝中已知的任何方法如毛細管電泳偵測游離eTagTM 。
於一個具體實施例中，切斷劑為作用於連接基團上的一種可活化化學品物種。例如，切斷劑可由暴露樣品至光而活化。
於另一個具體實施例中，利用對EGFR或HER3的抗體作為第一個目標結合部分建構eTagTM ，及自對HER2的抗體建構第二個結合化合物。
於再另一個具體實施例中，利用當與結合至二聚體中任一個HER受體相較專一地或優先地結合至二聚體的抗體或其他試劑偵測HER二聚體。
(ii)HER2磷酸化
如前面段落中討論的用EGFR、HER2或HER3抗體之免疫沉澱法後可視情況接著做二聚體的功能分析作為免疫轉漬的另一選擇或補充。於一個具體實施例中，用HER3抗體之免疫沉澱法後接著做免疫沉澱物中受體酪胺酸激酶活性之分析。因為HER3不具有本身的酪胺酸激酶活性，免疫沉澱物中受體酪胺酸激酶活性之存在代表HER3極可能 與HER2結合。Graus-Porta等人，EMBO J.,16：1647-55(1997)；Klapper等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96：4995-5000(1999)。可將此結果以用HER2抗體之免疫轉漬而證實。於另一個具體實施例中，用HER2抗體之免疫沉澱法後接著做EGFR受體酪胺酸激酶活性之分析。於此分析中，將免疫沉澱物與放射線ATP及模仿活體內HER2受EGFR轉磷酸化位置之胜肽受質接觸。胜肽之磷酸化代表共同免疫沉澱及因而EGFR與HER2二聚合。受體酪胺酸激酶活性分析為技藝中已熟知及包括偵測目標受質的磷酸化(例如藉由磷酸酪胺酸抗體)及同源信號傳導途徑的活化(如MAPK途徑)。
HER受體的磷酸化可由一或多個HER受體(如HER2受體)的免疫沉澱法及西方轉漬分析而評估。例如，利用抗-磷酸酪胺酸抗體偵測免疫沉澱的HER受體中磷酸化的酪胺酸基團，陽性係由膠體上磷酸-HER2帶之出現而決定。抗-磷酸酪胺酸抗體市面上可購自PanVera(Madison,WI)Invitrogen,Chemicon International Inc.(Temecula,CA)之子公司或Upstate Biotechnology(Lake Placid,NY)。陰性係由帶的不存在而決定。
於另一個具體實施例中，HER2受體的磷酸化係由利用磷酸專一的HER2抗體(clone PN2A；Thor等人，J.Clin.Oncol,18(18)：3230-3239(2000))之免疫組織化學而評估。
用以偵測HER受體磷酸化的其他方法包括(但不限於)KIRA ELISA(美國專利第5,766,863、5,891,650、 5,914,237、6,025,145及6,287,784號)、質譜儀(比較磷酸化及未經磷酸化的HER2之大小)、及用HER(如HER2)抗體及磷酸專一的或磷酸酪胺酸專一的抗體之e-標籤接近分析(如利用可購自Aclara Bio Sciences(Mountain View,CA)的eTagTM 分析系統)。ETag分析的細節係於上文中詳述。
吾人也可使用磷酸專一的抗體於細胞分析中以偵測細胞樣品中信號傳導蛋白質之磷酸化狀態(美國專利第US2003/0190689號)。
(iii)基因表現圖譜
於一個具體實施例中，基因表現分析可作為直接測量HER磷酸化或活化之代替法。當樣本為經固定的樣本(如石蠟包埋的、福馬林固定的腫瘤樣本)，可能難以確實地定量HER磷酸化的情況，此法特別有用。根據此法，評估樣本中二或多個HER受體及一或多個HER配體之表現，其中二或多個HER受體及一或多個HER配體之表現代表樣本中陽性HER磷酸化或活化。於此方法的一個具體實施例中，可測量樣本中β細胞素及/或雙調蛋白之表現，其中β細胞素及/或雙調蛋白之表現代表樣本中陽性HER磷酸化或活化。
根據此法，將來自病患的樣本測試二或多個HER受體(較佳的是選自EGFR、HER2及HER3)及一或多個HER配體(較佳的是選自β細胞素、雙調蛋白、表皮調節素及TGF-α，最佳的是β細胞素或雙調蛋白)之表現。例如，二或多個HER受體可為EGFR及HER2、或HER2及HER3。較佳的 是，決定HER2及EGFR或HER3，以及β細胞素或雙調蛋白之表現。可將樣本單獨測試β細胞素或雙調蛋白表現，或與測試二或多個HER受體之表現一起。確認的基因之陽性表現代表病患為用HER抗體如帕妥珠單抗治療的候選人。再者，基因之陽性表現代表相較於不具有此陽性表現的病患，此病患更可能對用HER抗體的治療有適宜的反應。
用以決定mRNA或蛋白質表現的許多方法包括(但不限於)基因表現圖譜、包括定量即時PCR(qRT-PCR,quantitative real time PCR)之聚合酶鏈反應(PCR,polymerase chain reaction)、微陣列分析、基因表現之連續分析(SAGE,serial analysis of gene expression)、MassARRAY、由大量平行標誌定序(MPSS,Massively Parallel Signature Sequencing)之基因表現分析、蛋白質體學(Proteomics)、免疫組織化學(IHC,immunohistochemistry)等。較佳的是定量mRNA。此mRNA分析較佳利用聚合酶鏈反應(PCR,polymerase chain reaction)之技術，或藉由微陣列分析進行。當使用PCR，PCR的較佳形式為定量即時PCR(qRT-PCR,quantitative real time PCR)。於一個具體實施例中，若相較於相同腫瘤類型之其他樣本，一或多個上述說明的基因之表現為中等或高，則將其視為陽性表現。中等表現程度可與測量基因表現基本上同時決定，或可先前已決定。
用以決定基因表現的許多例示方法、用以表示基因表現的代表性方法之步驟利用經固定的、石蠟包埋的組織作為 RNA來源，包括mRNA分離、純化、引子延伸及放大係提供於許多發表的雜誌文章中(例如：Godfrey等人，J.Molec.Diagnostics 2：84-91(2000)；Specht等人，Am.J.Pathol.158：419-29(2001))。簡而言之，代表性流程開始於切割石蠟包埋的腫瘤組織樣本之約10微克厚切片。而後將RNA萃取，及將蛋白質及DNA去除。RNA濃度分析後，視情況可包括RNA修復及/或放大步驟，利用基因專一的啟動子將RNA反轉錄後做PCR。最後，分析數據以基於在檢查的腫瘤樣本中鑑定的特殊基因表現模式確認對病患可得到的最佳處理選擇。
(iv)HER表現及放大
為了於癌中決定HER表現或放大，可得到許多診斷/預後分析法。於一個具體實施例中，藉IHC可分析HER過度表現，如利用HERCEPTEST®(Dako)。可使來自腫瘤切片的石蠟包埋的組織切片經過IHC分析及給予HER2蛋白質染色強度標準如下：0分：沒有觀察到染色或小於腫瘤細胞的10%觀察到膜染色。
1+分：在多於10%腫瘤細胞中偵測到微弱/勉強可辨的膜染色。細胞僅於其膜的部分被染色。
2+分：在多於10%腫瘤細胞中觀察到弱至中等完整膜染色。
3+分：在多於10%腫瘤細胞中觀察到中等至強完整膜染色。
可將具有0或1+分之HER2過度表現評估之腫瘤認定為未過度表現HER2，而可將具有2+或3+分之腫瘤認定為過度表現HER2。
過度表現HER2的腫瘤可藉相當於每個細胞表現的HER2分子之複製體數目之免疫組織化學分數分級，及可生化地決定：0=0-10,000個複製體/細胞，1+=至少約200,000個複製體/細胞，2+=至少約500,000個複製體/細胞，3+=至少約2,000,000個複製體/細胞。
以3+程度過度表現HER2(其導致酪胺酸激酶之配體無關活化(Hudziak等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：7159-7163(1987)))發生於約30%乳癌，及於此等病患中，無復發存活及總體存活變小(Slamon等人，Science,244：707-712(1989)；Slamon等人，Science,235：177-182(1987))。
或者或此外，可實施FISH分析如INFORMTM (由Ventana,Arizona販賣)或PATHVISIONTM (Vysis,Illinois)於福馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤組織以決定腫瘤中HER2放大之程度(若有的話)。
於一個具體實施例中，癌症將為表現(及可能過度表現)EGFR者，可將此表現如上述評估HER2表現之方法評估。
利用活體內診斷分析，如藉由給予結合欲偵測的分子及用可偵測標誌(如放射線同位素)標示之分子(如抗體)及外 部掃描病患以定位標誌，也可評估HER受體或HER配體過度表現或放大。
IV.醫藥配方
藉由混合具有理想純度的抗體與醫藥上可接受的載體、賦形劑或安定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))，以凍乾的配方或水溶液的形式製備用以儲存之根據本發明使用的抗體治療配方。可接受的載體、賦形劑、或安定劑為以使用的劑量及濃度對接受者無毒性，及包括緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨(hexamethonium chloride)；氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)；氯化苯銨松寧(Benzethonium Chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；烷基安息香酸酚酯(parabens)如甲基或丙基安息香酸酚酯；鄰苯二酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個基團)多胜肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、麩胺醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣、及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖(mannose)或葡聚糖；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、漏蘆糖或山梨醇；成鹽相反離子如鈉；金屬錯合物(如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG,polyethylene glycol)。凍乾的抗體配方係說明 於世界專利WO 97/04801中，將其以參考資料併於本文中。
治療用途之較佳的帕妥珠單抗配方包含30毫克/毫升帕妥珠單抗於20mM組胺酸醋酸鹽、120mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酐脂肪酸酯20(Polysorbate20)，於pH 6.0中。另一個帕妥珠單抗配方包含25毫克/毫升帕妥珠單抗、10mM組胺酸-HCl緩衝液、240mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酐脂肪酸酯20，pH 6.0。
本文中的配方也可含有超過一種活性化合物，視欲治療的適應症所需，較佳為具有不彼此有害影響的互補活性者。可與HER抗體組合的許多藥物係說明於以下治療方法段落中。此類分子適當地以預期目的有效之量組合存在。
也可將活性成分包入藉凝聚作用技術或藉由界面聚合製備的微膠囊中(例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、於膠體藥物傳遞系統中(例如微脂粒、白蛋白微球、微乳化液、奈米顆粒及奈米膠囊)或於巨乳化液中。此技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編著(1980)。
可製備持續釋放的製品。持續釋放的製品之適當實例包括含有抗體之固體親油性聚合物的半滲透基質，此基質係為成某種形狀的物品之形式，如膜、或微膠囊。持續釋放的基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基乙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及γ-乙基-L-麩胺酸的共聚物、不可分解的 乙烯-醋酸乙烯、分解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)組成的可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
於活體內給予所使用的配方必須為無菌。藉由通過無菌過濾膜過濾可將此輕易地達成。
V.HER抗體之治療及投藥
可用固定劑量HER抗體治療的許多癌症之實例係列於上述定義段落中。較佳的癌症適應症包括卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、乳癌，包括轉移性乳癌(MBC,metastatic breast cancer)、肺癌，包括非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)、前列腺癌、結腸直腸癌及/或顯現HER表現、放大及/或活化的癌症。於一個具體實施例中，治療的癌症為耐化療癌症或耐鉑癌症。給予固定劑量抗體將造成癌症症候或症狀的改善。
除了癌症，可使用如本文中揭示的固定劑量HER抗體來治療許多非惡性疾病或不適。此非惡性疾病或不適包括自體免疫疾病(如牛皮癬；見上述定義)；子宮內膜組織異位形成；硬皮病；再阻塞(restenosis)；息肉如結腸息肉、鼻息肉或胃腸息肉；纖維性瘤；呼吸疾病(見上述定義)；膽囊炎；神經線纖維瘤病(neurofibromatosis)；多囊性腎病；發炎性疾病；皮膚病包括牛皮癬及皮膚炎；血管疾病(見上述定義)；關於血管上皮細胞不正常增殖的症狀；胃腸潰瘍；蒙尼柴爾症(Menetrier's disease)，分泌腺瘤或蛋白 質喪失徵候群；腎病變；血管生成疾病；眼疾如老化相關的黃斑退化、擬眼組織胞漿菌徵候群(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、來自增殖性糖尿病視網膜病變之視網膜新生血管、視網膜血管化、糖尿病視網膜病變、或老化相關的黃斑退化；骨頭相關的病理學如骨關節炎、軟骨病及骨質疏鬆；大腦缺血性事件後之損害；纖維化或水腫疾病如肝硬化、肺纖維化、carcoidosis、throiditis、高黏度徵候群組織、遺傳性出血性毛細血管擴張症(Osler Weber-Rendu disease)、慢性閉塞性肺疾或灼傷、外傷、輻射、中風、組織缺氧或局部缺血後的水腫；皮膚的過敏反應；糖尿病視網膜病變及糖尿病腎病；吉巴氏徵候群(Guillain-Barre syndrome)；移植物對抗宿主疾病或移植排斥；佩吉特氏病(Paget's disease)；骨頭或關節發炎；光老化(如由UV照射人類皮膚引起)；良性前列腺肥大；某些微生物感染包括選自腺病毒、漢他病毒(hantaviruses)、伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)、鼠疫菌(Yersinia spp.)及百日咳桿菌(Bordetella pertussis)之微生物病原體；由血小板聚集造成的血栓；生殖疾病如子宮內膜組織異位形成、卵巢過度刺激徵候群、子癇前症(preeclampsia)、不正常子宮出血、或不規則月經過多(menometrorrhagia)；滑膜炎；粉瘤；急性及慢性腎病(包括增殖性絲球體腎炎及糖尿病引發的腎病)；溼疹；肥大性疤痕形成；內毒素性休克及黴菌感染；家族性腺瘤病息肉；神經退化性疾病(如阿滋海默氏症、AIDS-相關的痴呆、帕金森氏病、肌萎縮 性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、視網膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、脊髓肌肉萎縮及小腦退化)；骨髓異生徵候群(myelodysplastic syndrome)；再生不良性貧血(aplastic anemia)；缺血性受傷；肺、腎或肝的纖維化；T細胞媒介的過敏疾病；嬰兒肥大性幽門狹窄症；泌尿阻塞徵候群；乾癬性關節炎；及橋本氏甲狀腺炎(Hasimoto's thyroiditis)。本文中治療的較佳非惡性適應症包括牛皮癬、子宮內膜組織異位形成、硬皮病、血管疾病(如再阻塞、動脈粥樣硬化(artherosclerosis)、冠狀動脈疾病或高血壓)、結腸息肉、纖維性瘤或呼吸疾病(如氣喘、慢性支氣管炎、支氣管擴張或囊胞性纖維症)。
根據已知方法，如靜脈內給予，如以大丸藥或藉經一段時間連續灌注、藉肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑液內、脊髓內、口服、局部或吸入途徑將HER抗體給予人類病患。抗體之靜脈內給予為較佳。
為了疾病之預防或治療，HER抗體之固定劑量將視欲治療的疾病類型(如上述定義)、疾病之嚴重性及進程、給予抗體作為預防或治療目的、先前療法、病患的病歷及對抗體的反應及主治醫生的判斷而定。較佳將固定劑量一次給予病患或經過一連串治療。較佳的是，固定劑量為約20毫克至約2000毫克HER抗體之範圍內。例如，固定劑量可為約420毫克、約525毫克、約840毫克或約1050毫克HER抗體。
在給予一系列固定劑量的情況中，例如，可將其約每 週、約每2週、約每3週或約每4週給予，但較佳的是約每3週。例如，固定劑量可持續給予直到疾病發展、副作用或由醫師決定的其他時候。例如，可給予由約二、三或四，直至約17或更多固定劑量。
於一個具體實施例中，給予抗體之一或多個載入劑量後，接著抗體之一或多個維持劑量。於另一個具體實施例中，將多個相同固定劑量給予病患。
根據本發明的一個較佳具體實施例，給予約840毫克之HER抗體(如帕妥珠單抗)之固定劑量(載入劑量)後，接著給予一或多個劑量之約420毫克抗體(維持劑量)。較佳將維持劑量約每3週給予一次，總計至少兩次投藥，至17次或以上給藥。
根據本發明的另一個較佳具體實施例，給予一或多次約1050毫克之HER抗體(如帕妥珠單抗)之固定劑量，例如每3週一次。根據此具體實施例，給予一、二或多次固定劑量，如達一年(17次循環)，及視需要延長。
於另一個具體實施例中，給予約1050毫克HER2抗體(如帕妥珠單抗)之固定劑量作為載入劑量後，接著給予一或多次約525毫克抗體之維持劑量。根據此具體實施例，可將約一、二或多次維持劑量每3週給予病患。
因此，本發明提供治療人類病患癌症的方法，包含有給予病患至少一個固定劑量帕妥珠單抗，其中固定劑量為約420毫克、約525毫克、約840毫克或約1050毫克帕妥珠單抗。
當疾病為癌症時，較佳用HER抗體及一或多種化療藥物治療病患。較佳的是，至少一種化療藥物為抗代謝化療藥物如健擇。組合的給予包括共同給予或同時給予，利用分開的配方或單一醫藥配方及以任一次序連續給予，其中較佳的是當兩者(或所有)活性藥物同時發揮其生物活性時有一段時間。因此，可將抗代謝化療藥物在給予HER抗體之前或之後給予。於此具體實施例中，抗代謝化療藥物的至少一次給予及HER抗體的至少一次給予之間的時間較佳約為1個月或以下，最佳的是約2週或以下。或者，同時於單一配方或分開的配方中將抗代謝化療藥物及HER抗體給予病患。用化療藥物(如抗代謝化療藥物如健擇)及HER抗體(如帕妥珠單抗)組合之治療可造成協同的(或比加成大的)治療作用於病患。
若給予抗代謝化療藥物，通常將其以已知劑量給予，或視情況降低，因為藥物的合併作用或可歸因於給予抗代謝化療藥物之負面副作用。根據製造商的指示或由熟悉的醫生憑經驗決定，可使用此化療藥物之製品及投藥計劃表。當抗代謝化療藥物為健擇，較佳的是將其以約600mg/m2 至1250mg/m2 之間的劑量(例如約1000mg/m2 )例如於3週循環之第1天及第8天給予。
除了HER抗體及抗代謝化療藥物外，可將其他治療法與之合併。例如，可給予第二種(第三、第四種等)化療藥物，其中第二種化療藥物為另一種不同的抗代謝化療藥物或不是抗代謝的化療藥物。例如，第二種化療藥物可為紫 杉醇類(如紫杉醇(paclitaxel)或多西他賽)、截瘤達、或以鉑為基本的化療藥物(如卡鉑、順鉑或草酸鉑)、四環黴素(如小紅莓，包括微脂粒的小紅莓)、癌康定、培美曲塞、長春花生物鹼(如溫諾平)及TLK 286。可給予不同化療藥物之「雞尾酒」。
可與HER抗體合併的其他治療藥物包括任何一或多種：第二種不同的HER抗體(例如，生長抑制性HER2抗體如搓杜滋美，或引發HER2過度表現細胞凋亡之HER2抗體，如7C2、7F3或其人化變體)；針對不同的腫瘤相關抗原如EGFR、HER3、HER4之抗體；抗荷爾蒙化合物，如抗雌激素化合物如三苯氧胺，或芳香酶抑制劑；心臟保護劑(以避免或降低任何與治療相關的心臟機能受損(myocardial dysfunction))；細胞激素；以EGFR為目標的藥物(如TARCEVATM 、IRESSATM 或西妥昔單抗)；抗血管新生藥物(特別是由Genentech以商品名AVASTINTM 出售的貝伐單抗)；酪胺酸激酶抑制劑；COX抑制劑(例如COX-1或COX-2抑制劑)；非類固醇抗發炎藥物，塞來考昔(celecoxib)(西樂葆(CELEBREXTM ))；金合歡基(farnesyl)轉移酶抑制劑(例如，可購自嬌生公司的Tipifarnib/ZARNESTRATM R115777或可購自Schering-Plough的Lonafarnib SCH66336)；結合癌胚胎(oncofetal)蛋白質CA125之抗體如Oregovomab(MoAb B43.13)；HER2疫苗(如來自Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或來自Dendreon的APC80242蛋白質疫苗，或來自GSK/Corixa的 HER2胜肽疫苗)；另一種HER目標療法(如搓杜滋美、西妥昔單抗、吉非替尼、厄洛替尼、CI1033、GW2016等)；Raf及/或ras抑制劑(見例如世界專利WO 2003/86467)；小紅莓鹽酸鹽微脂粒注射；拓樸異構酶I抑制劑如癌康定；紫杉醇類；HER2及EGFR雙酪胺酸激酶抑制劑如lapatinib/GW572016；TLK286(TELCYTA)；EMD-7200；治療噁心的藥物如血清胺拮抗製劑(serotonin antagonist)、類固醇或苯二氮平(Benzodiazepine)；預防或治療皮膚疹或標準痤瘡療法之藥物，包括局部或口服抗生素；降低體溫的藥物如乙醯基氨基苯(Acetaminophen)、二苯胺明(Diphenhydramine)或佩西汀(meperidine)；造血生長因子等。
任何上述共同給予藥物之合適劑量為目前使用的劑量及由於藥物及HER抗體之合併作用(協同作用)而可降低劑量。
除了上述療法，可使病患經過癌細胞之手術移除及/或放射線療法。
較佳的是，給予的抗體為裸抗體。然而，給予的抗體可與細胞毒素藥物連結。較佳的是，免疫結合體及/或其連結的抗原被細胞內化，造成免疫結合體增加殺死其結合的癌細胞之治療功效。於較佳具體實施例中，細胞毒素藥物針對或干擾癌細胞中的核酸。此細胞毒素藥物之實例包括美登素類、卡奇霉素、核糖核酸酶及DNA核酸內切酶。
除了給予病患抗體蛋白質，本申請案考慮藉基因療法給 予抗體或蛋白質抑制劑。見例如1996年3月14日公告的世界專利WO96/07321關於利用基因療法來產生細胞內抗體。
使核酸(視情況包含於載體中)進入病患細胞中有兩個主要方法：活體內及活體外。對於活體內傳遞，將核酸直接注射入病患，通常於需要抗體之位置。對於活體外治療，將病患的細胞取出，將核酸導入此等分離的細胞及將此等改質的細胞直接給予病患或例如包入植入病患內的多孔膜內(見如美國專利第4,892,538及5,283,187號)。有許多導入核酸進入活細胞的技術。視將核酸轉移入於試管內的培養細胞或於活體內的目標宿主之細胞內而定有不同技術。適於轉移核酸進入試管內哺乳類細胞的技術包括利用微脂粒、電穿孔法、微注射法、細胞融合、DEAE-葡萄聚糖、磷酸鈣沉澱法等。活體外傳遞基因最常使用的載體為反轉錄病毒。
目前較佳的活體內核酸轉移技術包括用病毒載體(如腺病毒、單純疱疹(Herpes simplex)I病毒或腺相關病毒)轉染及以脂質為基本的系統(用於脂質媒介的基因轉移之有用脂質為例如DOTMA、DOPE及DC-Chol)。於一些情況中，希望提供核酸來源具有針對目標細胞的藥物，如針對細胞表面膜蛋白或目標細胞之抗體、目標細胞上受體之配體等。當使用微脂粒時，可使用結合至與內噬作用(endocytosis)相關的細胞表面膜蛋白的蛋白質作為目標及/或以促進攝入，如趨向於特定細胞類型之外殼蛋白(capsid proteins)或其片段、針對進行循環內化蛋白質之抗體、及針對細胞內局部化及增加細胞內半生期之蛋白質。受體媒介的內噬作用之技術係說明於例如Wu等人J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；及Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)。回顧目前已知基因標誌及基因療法步驟，見Anderson等人，Science 256：808-813(1992)。也見世界專利WO93/25673及其中引用的參考資料。
VI.製造物件
於本發明之另一個具體實施例中，提供含有有用於治療癌症或其他上述疾病之材料的製造物件。製造物件包含有固定劑量HER抗體包含於其中之小瓶，及視情況說明書。小瓶可由許多材料製成如玻璃或塑膠，及可由針筒可穿刺的塞子密封。例如，小瓶可為formal vitrum第I型玻璃瓶(如20cc瓶裝420毫克固定劑量或50cc瓶裝1050毫克固定劑量)，具有DAIKYO GREYTM 氟樹脂層壓的塞子及20mm翻頂鋁蓋。製造物件可進一步包括商業及使用者觀點希望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、填料、針頭及針筒等。
於較佳具體實施例中，製造物件包含含有固定劑量HER抗體(如帕妥珠單抗)之小瓶，其中固定劑量為約420毫克、約525毫克、約840毫克或約1050毫克HER抗體。
製造物件較佳更包含說明書。說明書可提供給予固定劑量至癌症患者的用法說明，包括但不限於具有卵巢癌、腹 膜癌、輸卵管癌、轉移性乳癌(MBC,metastatic breast cancer)、非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)、前列腺癌、結腸直腸癌的病患，及/或給予固定劑量至癌症顯示HER表現、放大及/或磷酸化的癌症病患。
於一個具體實施例中，製造物件包含有兩個小瓶，其中第一個小瓶含有約840毫克帕妥珠單抗之固定劑量，而第二個小瓶含有約420毫克帕妥珠單抗之固定劑量。
於另一個具體實施例中，製造物件包含有兩個小瓶，其中第一個小瓶含有約1050毫克帕妥珠單抗之固定劑量，而第二個小瓶含有約525毫克帕妥珠單抗之固定劑量。
VII.材料之存放
下列融合瘤細胞株已存放於美國菌種保藏中心(ATCC,American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,USA)：
將本發明的進一步細節以下列非限制性實例舉例說明。於專利說明書中所有引用的揭示皆以參考資料併於本文中。
實例1
本實例評估HER抗體帕妥珠單抗之群體藥物動力學(PK,pharmacokinetic)及預期共變量，及檢視在固定、以體重為 基本或以BSA為基礎的投藥方法後穩定狀態最低血清濃度之變化性。將帕妥珠單抗以體重為基本的劑量(0.5-15毫克/公斤)或固定劑量(420毫克或1050毫克)藉IV灌注給予(q3週)。將包含有153個病患及1458個濃度-時間點之來自一個第Ia階段及兩個第II階段試驗(卵巢及乳房)的帕妥珠單抗血清濃度資料彙整利用NONMEMTM 與一階條件估計(FOCE,first-order conditional estimation)及交互作用法分析。線性雙室模型最佳說明數據。體重、血清白蛋白及血清鹼性磷酸酶為影響清除(CL,clearance)之重要共變量，而體表面積(BSA,body surface area)為影響中心室體積(Vc,volumn at the central compartment)分布之重要變數。於最終模型中，CL及Vc分別為0.214L/天及2.74L。體重僅解釋8.3%之CL病患間變化性。利用後來的預期檢查評估最終群體PK模型顯示良好表現。利用最終模型自原始資料集抽樣的1000個刺激的對象中，相較於固定投藥，以體重及BSA為基本的投藥僅分別降低穩定狀態最低濃度之群體變化性6.2%及5.8%。刺激也顯示在固定、以體重或BSA為基本的投藥後，具有預期穩定狀態最低濃度低於目標20mcg/mL之對象百分比為類似。結論為雖然通常以體重為基礎將人化抗體投藥，於此實驗中的分析證實較佳利用固定劑量給予HER抗體(帕妥珠單抗)來治療癌症。
方法
研究及病患
於本分析中使用的所有三個研究係由參與中心之適當倫 理委員會核准。書面的告知同意書自所有病患取得。
第1個研究為第Ia階段、開放藥物標示、多中心、劑量逐步上升的研究以評估帕妥珠單抗作為單一藥物靜脈給予具有重度實體癌症的對象之安全性、可耐受性、及藥物動力學概況。此等病患在第1個循環時每3週接受以IV途徑呈90分鐘IV灌注給予的帕妥珠單抗劑量，而後於隨後的循環中呈30分鐘灌注。在3或6個對象群中將劑量逐步上升(0.5、2、5、10及15毫克/公斤)直到確認最大容忍劑量(MTD,maximum tolerated dose)或達到最高劑量程度。在治療的第一個循環期間，在連續時間點收集血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度：給藥前、IV灌注終了時、在1.5、4及9小時，及於第2、5、8及15天時。在第二個循環期間，在給藥前、IV灌注開始後29分鐘、及在第8天時收集血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度。
第2個研究為第II階段、開放藥物標示、單臂、多中心試驗以評估帕妥珠單抗於具有重度卵巢癌的病患中之整體功效、安全性、可耐受性及以腫瘤為基本的HER2活化對功效之影響，其中其疾病為難治或在先前化療後復發。此等女性在第1個治療循環時接受IV灌注以單一藥物90分鐘期間給予固定劑量840毫克帕妥珠單抗，而後於隨後的治療循環中每3週以30分鐘灌注傳遞420毫克維持劑量。於第一及第二個治療循環期間，在給藥前、IV灌注結束後15分鐘、及在第8及15天時收集血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度。於隨後治療循環期間，在給藥前及IV灌注結束後15分 鐘收集另外的血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度。
第3個研究為第II階段、開放藥物標示、單臂、多中心隨機研究以評估以單一藥物給予之兩個不同劑量帕妥珠單抗於具有低表現HER2的轉移性乳癌病患中之功效及安全性。於第一個劑量群中，病患在第1個循環時接受IV灌注以840毫克載入劑量經90分鐘期間給予帕妥珠單抗，而後於隨後的治療循環中每3週以30分鐘灌注給予420毫克維持劑量。於第二個劑量群中，病患在第1個循環時接受IV灌注經90分鐘期間之1050毫克劑量帕妥珠單抗，而後於隨後的治療循環期間每3週以30分鐘灌注給予1050毫克劑量。於第3個研究中，於前兩個治療循環期間，在給藥前、灌注結束後15分鐘及在第8及15天時收集血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度。於隨後治療循環期間，在給藥前及灌注結束後15分鐘收集另外的血清樣本以決定帕妥珠單抗濃度。
藥物分析
藉由經確效受體結合、酵素連結的免疫吸附分析法(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)決定帕妥珠單抗血清濃度。此分析利用p185HER2細胞外區域來自血清樣本捕捉帕妥珠單抗。用小鼠抗人類Fc-山葵過氧化酶(HRP,horseradish peroxidase)偵測結合的帕妥珠單抗，及使用四甲基聯苯胺(TMB,tetramethyl benzidine)作為顯色受質以定量血清帕妥珠單抗。此分析法具有最小可定量濃度為0.25mcg/mL帕妥珠單抗於人類血清。
群體藥物動力學分析
利用具有NM-TRAN及PREDPP的NONMEMTM (Boeckmann and Beal NONMEMTM User Guide.San Francisco：NONMEMTM Project Group,University of California,San Francisco(1994))軟體(第V版，1.0階)及Compaq Visual Fortran compiler編譯器(6.5版)進行群體非線性混合作用模擬。將兩個不同基本結構模型-用IV灌注的一室及雙室線性PK模型符合至血清帕妥珠單抗濃度-時間曲線。使用具有η -ε 交互作用的一階條件估計(FOCE,first-order conditional estimation)法於整個模型建立程序中。
使用指數誤差模型來描述PK參數之個體間變化性：
執行倍數共變數回歸模型如下列： 其中ηip 代表第i個個別病患之「真正」參數(Pi)及群體中典型值()之間的比例差異，為調整共變數值等於此個別病患之彼等值。ηip 為平均零及變化ω2 之隨機作用。θx 及θD 為估計連續(如體重)或分成兩個的(如性別及種族)共變數之回歸係數。將連續變數集中於其中位數(med(X))值，因此允許θ1 代表具有中位數共變數之典型病患的清除估計。將分成兩個的共變數編碼為0或1(如女性為性別=0，男性為性別=1；白種人為種族=0；其他為種族=1)。將殘餘的可變性(residual variability)模擬為比例加成誤差模型：Cpij =(1+εij,prop )+εij,add ，其中Cpij 及分別為對第i個個體第j個測量的及模型預測的濃度，而ε ij,prop 及ε ij,add 代表以平均零及變化σprop 2 及σadd 2 之比例及加成殘餘個體內隨機誤差分布。
將以結構模型為基礎的貝氏(Bayesian)估計PK參數及個別共變數之間的關係通過圖表探究。基於初步探究分析，測試各共變數對PK參數之作用。一開始，檢查共變數對個別PK參數(如清除及中心室體積)的影響。而後，藉由加入重要共變數進入模型而建立個別PK參數的完整共變數模型。使用反向消除程序藉僅保留模型中重要的共變數來決定各個別PK參數的最終共變數模型。當高度相關的共變數具有類似藥理學意義時(如體重及BSA)，僅有最重要的因素保留於模型中。而後將此為各PK參數得到的最終共變數模型合併而形成新的完整模型並將最終群體PK模型利用反向消除程序精心製作。
其他結構模型的比較及共變數模型之建立係基於典型配適度(goodness-of-fit)診斷圖及概似比(likelihood ratio)測試。當比較其他等級體系模型，目標函數的值中差異大約為具有n自由度的卡方(chi-square)分布(n為完整及減少的模型之間參數數目的差異)。已證實此近似值對於FOCE-交互作用估計法為可靠(Wahlby等人，J.Pharmacokinet Pharmacodyn 28：231-52(2001))。為了區分兩個等級體系模型，使用目標函數中差異大於7.9(1自由度)，其相當於顯著水準(significance level)p<0.005。
計算一特定PK參數(如CL)由回歸模型中的共變數解釋的個體間變化分率(%變化)如下列：
其中ω2 CL,BASED 及ω2 CL,FINAL 分別代表於基本的及最終的PK模型中清除的個體間變化。
群體藥物動力學模型評估
於此研究中模型評估利用重新抽樣(bootstrap resampling)技術來評估最終模型的穩定性及估計參數的信賴區間(confidence interval)。此模型評估技術包含利用套裝軟體NONMEMTM (N Holford,404版，2003年6月，Auckland,New Zealand)的Wings中抽樣選項首先建立資料組合而後對各複製的資料組合得到參數估計值。得到來自1000個成功的運作之結果，決定群體參數之平均值及第2.5及97.5百分位數(記為95%信賴區間)及與原始資料估計值比較。
此外，使用後來的預期模型檢查來評估最終模型描述觀察的資料之能力(Yano等人，J.Pharmacokinet Pharmacodyn 28：171-92(2001)；Gelman及Meng,Model checking and model improvement.於Gilks WR,Richardson S,Spiegelhalter DJ編著，Markov Chain Monte Carlo in Practice.Boca Raton：Chapman & Hall/CRC,189-202(1996)；Gelman等人，Bayesian Data Analysis.Boca Raton：Chapman & Hall/CRC(2004))。於此等分析中，計算觀察的資料之第2.5、5、10、25、50(中位數)、75、90及95百分位數及選擇作為後來的預期模型檢查之測試統計。使用最終群體PK 模型(包括最終固定的及隨機的作用參數)來模擬觀察的資料組合之1000個複製及由各彼等模擬資料組合計算測試統計。而後將來自模擬資料組合的測試統計之後來的預期分布與觀察的測試統計比較，根據下列方程式(Gelman及Meng,(1996)同前)藉由計算來自模擬資料組合的測試統計超過觀察的測試統計之實現值之比例，可估計p值(pPPC )。
其中I(.)為指示函數，當其變元(argument)為正確時為1，反之為0。T(y,θ)為觀察的測試統計之「實現值」因為其由觀察的資料y實現。T(yi rep ,θ)為來自模擬資料組合i(範圍為1至1000)的測試統計(Gelman及Meng,(1996)同前)。
此外，對個別病患於各時間點計算模擬資料的第2.5、5、95及97.5量。決定彙整的模擬資料介於第2.5及95.5量邊界內(95%區間)、第5及95量邊界內(90%區間)之觀察的資料數目。
固定、以BSA-及體重-為基本的投藥後之帕妥珠單抗暴露
使用最終群體PK模型來決定穩定狀態最低濃度及固定、以BSA-及體重-為基本的投藥後之暴露。利用具有藉抽樣(有替換)原始PK資料集合所得的資料集合之最終模型模擬固定、以BSA為基本或以體重為基本的投藥法於1000個對象之血清濃度-時間數據及帕妥珠單抗清除。所有模擬的對象於第0天接受840毫克、12.2毫克/公斤或485毫克/平方米iv灌注90分鐘，而後於第21、42及63天接受420毫克、6.1毫克/公斤或242.5毫克/平方米iv灌注30分鐘。而後 在不同投藥法後評估在第84天得到的穩定狀態最低濃度(Csstrough )。此外，計算在固定、以BSA為基本或以體重為基本的投藥後具有低於目標濃度(20mcg/ml)之穩定狀態最低濃度的病患比例。根據下列方程式使用模擬的清除值來決定穩定狀態平均暴露(AUCss0-τ )：
結果
人口統計學資料 將包含於此PK分析中的病患之人口統計學特徵列於表2中。
於三個研究中自153個病患收集總計1458個帕妥珠單抗血清濃度時間點。全部之中，18個病患係來自第Ia階段試 驗，60個來自第II階段卵巢癌試驗，及75個來自第II階段乳癌試驗。因此，於此分析中大部分(94.8%)病患為女性及對應於1110個(76%)血清帕妥珠單抗濃度資料。所有病患具有由螢光原位雜交法(FISH,fluorescence in situ hybridization)分析證實的低HER2表現腫瘤及具有由美國東部腫瘤合作組織(ECOG,Eastern Cooperative Oncology Group)表現狀態為0或1所指示的良好生理功能狀態。具有遺漏的共變數之病患數目極少(身高及BSA兩者共4.6%)並將遺漏的共變數用中位數值輸入。於僅具有紀錄取樣日期之384個(20.8%)血清帕妥珠單抗濃度樣本中，將取樣時間歸屬於發生在中午12點。進行來評估此等歸屬的時間對於模型中群體參數估計值的作用之敏感度分析顯示無明顯影響。
群體PK分析： 基於目標函數的變化(δ=736.2)及診斷圖，雙室模型比單室模型更好地說明數據。於圖9A-B中說明代表性帕妥珠單抗血清濃度-時間曲線符合單室及雙室模型。將K12之個體間之變化性項目(η)自雙室模型去除，因為此η項的去除不造成目標函數中統計學上明顯增加(δ<7.88)。所以，僅ηCL 、ηVc 及ηK21 保留於最終基本模型中。
接下來評估ηCL 、ηVc 及ηK21 之中共變數項目存在之作用。於ηCL 、ηVc 及ηK21 之中加入共變數項目改善符合度(δ=-23.2,df=3)。然而，發現共變數項目難以估計(%CV>100)、具有小的估計關聯(rCL-Vc =0.37；rCL-K21 =0.27； rVc-K21 =0.42)、及對於參數估計有極少影響(資料未示)。所以，未保留共變數項目於共變數作用模型建造。於利用最終基本模型之探索分析中，沒有發現可能共變數及η K21 之間明顯關係。所以，在用共變數發展最終模型期間未檢查共變數作用於ηK21 。
對於具有共變數的最終模型，於圖10A-B中顯示預測的相對於觀察到的帕妥珠單抗血清濃度及加權殘差相對於預測的血清濃度圖。於最終模型中，血清白蛋白(ALB)、體重(BW)及血清鹼性磷酸酶(ALKP)為解釋帕妥珠單抗清除(CL)之個體間變化性之最重要共變數。BSA為解釋帕妥珠單抗中心室體積分布(VC )之個體間變化性之最重要共變數。於ηCL 、ηVc 及ηK21 之中加入共變數項目改善符合度(δ=-14.0,df=3)。然而，估計的關聯不大(rCL-Vc =0.45；rCL-K21 =0.28；rVc-K21 =0.39)及參數估計值不受影響(資料未示)。因此，未將共變數項目包含於最終模型中。將最終模型說明如下：
將最終模型之參數估計值摘要於表3中。
a.%RSE：估計值之相對標準誤差百分比=SE/參數估計值×100
分析群體中估計血清帕妥珠單抗之CL為0.214L/天及Vc為2.74升。K12 及K21 分別為0.203及0.258天-1 。於最終模型中CL及Vc之個體間變化性(計算為個體間變化(ω 2 )的平方根及表示為%CV)分別為31.1%及16.2%，相較於基本模型無共變數的38.0%及20.8%。所以於最終模型中ALB、WT及ALKP的共變數作用解釋約33%之CL的個體間變化。然而，體重單獨僅解釋8.3%之CL的病患間變化性。於最終模型中BSA的共變數作用解釋約39%之Vc的個體間變化。如圖11A-B中顯示，以基本模型之CL對WT及Vc對BSA的 依賴性說明於最終模型中。估計的t1/2α 及t1/2β 分別為1.4及17.2天。
模型評估： 由原始資料集合，得到1000個成功抽樣運作及與原始觀察的資料比較。由抽樣程序得到的平均群體pk估計值類似於原始資料集合的參數估計值(表3)，代表發展的模型為穩定。固定作用參數的95%信賴區間為窄，其代表良好準確性。
使用後來的預期模型檢查以評估最終模型說明觀察到的資料之能力。使用最終群體藥物動力學模型(包括最終固定及隨機作用參數)來模擬1000個複製。而後對各彼等1000個模擬的資料集合計算測試統計。圖12A-F呈現特定測試統計之1000個模擬值之直方圖，以垂直線代表觀察到的測試統計之「實現值」。後面預測分布接近於觀察值，其對於各測試統計，估計的p值大於0.05。此外，觀察到的帕妥珠單抗濃度在彙整的模擬資料之90%及95%分位範圍內之百分比分別為89.3及94.7%。此等結果建議此模型能夠相當良好地說明及預測資料。
固定、以BSA-及體重-為基本的投藥後之帕妥珠單抗暴露
根據方法段落中描述的投藥計劃，利用固定、以BSA-及體重-為基本的投藥，由原始PK資料集合及最終模型抽樣1000個模擬對象估計第84天時預測的帕妥珠單抗穩定狀態最低血清濃度(Css,trough )。此等資料顯示當與固定投藥相比，用以體重為基本及以BSA為基本的投藥，Css,trough 之群體變化性分別降低6.17及5.76%(圖13及表4)。
*利用下列方程式計算由固定投藥改變之變化百分比：
具有Csstrough 低於目標血清濃度20mcg/ml之對象百分比為類似，對於固定、以BSA-及體重-為基本的投藥分別為8.3%、8.7%及8.3%(表4)。由分析1000個模擬對象之帕妥珠單抗血清穩定狀態AUCss0-τ 得到類似結果，當與固定投藥相比，以體重及以BSA為基本的投藥僅分別降低群體變化性2.2%及4.2%。使用相同的模擬資料集合來決定對於具有極端體重(即WT≦第10百分位數及≧第90百分位數)的群體於固定投藥、以體重及以BSA為基本的投藥後之 Css,trough (圖14A-B)。以固定投藥、以體重及以BSA為基本的投藥，對於具有體重小於或等於第10百分位數的群體之中位數帕妥珠單抗Css,trough 分別為72.3(範圍：8.7至166.5)、52.8(範圍：6.8至125.7)及63.2(範圍：7.8至150.1)mcg/ml。於此群體中具有Csstrough 低於目標血清濃度20mcg/ml之對象百分比於固定、以BSA-及體重-為基本的投藥分別為5.4%、12.6%及9.0%。以固定投藥、以體重及以BSA為基本的投藥，對於具有體重大於或等於第90百分位數的群體之中位數帕妥珠單抗Css,trough 分別為42.1(範圍：7.0至119.8)、62.8(範圍：14.4至167.3)及52.9(範圍：10.2至133.3)mcg/ml。於此群體中具有Csstrough 低於目標血清濃度20mcg/ml之對象百分比為類似，於固定、以BSA-及體重-為基本的投藥分別為7.4%、2.8%及5.6%。分析由1000個模擬的對象之此等子集合之帕妥珠單抗血清穩定狀態AUCss0-τ 得到類似結果。
討論
通常，已將人化IgG單株抗體及於腫瘤學中的細胞毒性小分子藥物以體重為基本(毫克/公斤)或以BSA為基本投藥準則給予。帕妥珠單抗已進行臨床試驗，第Ia階段試驗於具有嚴重癌症的病患及第II階段試驗於具有卵巢癌、乳癌、肺癌及前列腺癌的病患。於第I階段試驗中將帕妥珠單抗以體重為基本(毫克/公斤)投藥，及而後於第II階段試驗開始利用固定劑量。利用於此等三個試驗中收集的人口統計學及血清帕妥珠單抗濃度-時間資料，於本文中建立 具有帕妥珠單抗PK預測的共變數之群體PK模型。而後使用此模型來檢查固定投藥、以體重及以BSA為基本的投藥方法後的穩定狀態濃度。
由此分析得到的帕妥珠單抗PK非常類似於用於腫瘤學中的其他人化單株IgG1藥物所報導者(Harris等人，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.21：488a(2002)；Leyland-Jones等人，J.Clin Oncol.21：3965-71(2003)；及Lu等人，Clin.Pharmacol.Ther 75：91(2004))。
線性雙室線性PK模型最佳說明數據且於最終模型中帕妥珠單抗CL為0.214L/天。典型帕妥珠單抗之Vc為2.74L或大約40毫升/公斤，其等於人類血漿體積且與其他單株IgG1藥物所報導的值相符(Harris等人(2002)同前；及Lu等人(2004)同前)。帕妥珠單抗CL受體重及白蛋白及鹼性磷酸酶血清濃度明顯影響，而Vc受BSA明顯影響。性別對於帕妥珠單抗PK的影響無法評估，因為小量男性對象(5.2%)包含於分析中。由抽樣程序及後來的預期模型檢查之結果建議最終模型為穩定及能夠相當良好地說明及預測資料。
體重對CL及BSA對Vc的作用建議可將帕妥珠單抗基於體重或BSA而投藥。然而，於模型中單獨體重或單獨BSA的共變數作用僅分別解釋約8.3%及40%CL及Vc的個體間作用。此建議雖然體重為CL的預測者及BSA為Vc的預測者，體重及BSA對投藥後帕妥珠單抗暴露之作用可能為可測量但非非常有影響。
所以，下一步利用模擬評估不投投藥方法對帕妥珠單抗暴露之影響。在自原始資料集合抽樣的1000個對象中，發現以體重為基本或以BSA為基本的投藥，當與固定投藥比較，僅分別減少在第84天模擬的穩定狀態最低血清濃度之群體變化性6.2及5.8%。此外，用所有三種投藥方法，具有預測的穩定狀態最低血清濃度低於選定的目標20mcg/mL之對象百分比為類似。由在具有極端體重(即WT≦第10百分位數及≧第90百分位數)的群體中的子集合分析得到類似結果。
因此，結論為帕妥珠單抗PK與WT及BSA有關。然而，WT及BSA僅解釋小比例之CL及Vc的個體間變化性，且以體重及以BSA為基本的投藥似乎未改善帕妥珠單抗穩定狀態暴露之可預測性。建議於癌症病患中運用帕妥珠單抗之固定投藥療法。
吾人相信本發明代表評論評估人化IgG1單株抗體以體重或以BSA為基本的投藥對癌症病患的穩定狀態藥物濃度影響之第一個揭示。實現均一固定投藥具有幾個重要病患照顧及經濟意義：i)較低成本，因為單一單位劑量之製造、儲存及運送之較大效率，ii)有效準備單一劑量於藥房及醫院而無須病患特殊化，iii)醫生開單一單位劑量藥方之較大效率，及iv)較低由於劑量計算錯誤而病患接受到錯誤劑量之可能性。雖然人化抗體同常憑體重或BSA投藥，本文中的分析證實利用固定劑量於癌症病患給予HER抗體帕妥珠單抗之可行性。
圖1提供HER2蛋白質結構的略圖，及其細胞外區域之區域I-IV(分別為SEQ ID Nos.19-22)之胺基酸序列。
圖2A及2B描繪鼠科單株抗體2C4之可變輕鏈(VL )(圖2A)及可變重鏈(VH )(圖2B)區域之胺基酸序列排列(分別為SEQ ID Nos.1及2)；人化2C4形式574之VL 及VH 區域(分別為SEQ ID Nos.3及4)；及人類VL 及VH 區域共有骨架(hum κ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別為SEQ ID Nos.5及6)。星號識別人化2C4形式574及鼠科單株抗體2C4之間或人化2C4形式574及人類骨架之間的差異。互補決定區(CDRs,Complementarity Determining Regions)係於括弧中。
圖3A及3B顯示帕妥珠單抗輕鏈及重鏈之胺基酸序列(分別為SEQ ID Nos.13及14)。將CDRs以粗體顯示。輕鏈及重鏈的計算分子量為23,526.22Da及49,216.56Da(半胱胺酸以還原形式)。將醣部份連接至重鏈的Asn 299。
圖4概略地描繪2C4結合於HER2的異二聚體結合位置，因而避免與活化的EGFR或HER3異體二聚合。
圖5描繪HER2/HER3連結至MAPK及Akt途徑。
圖6比較搓杜滋美及帕妥珠單抗的各種活性。
圖7A及7B分別顯示搓杜滋美輕鏈(圖7A；SEQ ID No.15)及重鏈(圖7B；SEQ ID No.16)之胺基酸序列。
圖8A及8B分別描繪變體帕妥珠單抗輕鏈序列(圖8A；SEQ ID No.17)及變體帕妥珠單抗重鏈序列(圖8B；SEQ ID No.18)。
圖9A及9B為單一對象的PK數據符合單室(圖9A)或雙室(圖9B)模型之代表曲線。圓圈代表觀察到的濃度。實線及虛線分別代表群體預測及個體預測的濃度。
圖10A及10B代表模型診斷圖。圖10A描繪觀察到的相對於預測的帕妥珠單抗濃度。實線為一致的線。圖10B描繪加權殘差相對於預測的帕妥珠單抗濃度。破折線為數據之LOESS平滑函數。
圖11A及11B描繪對於基本模型(圖11A)及最終模型(圖11B)由重量(WT,weight)之清除(CL,clearance)及由體表面積(BSA,body surface area)於中心室體積(Vc,volumn at the central compartment)之隨機作用(η )。
圖12A-F顯示利用後面模型檢查之帕妥珠單抗最終群體藥物動力學模型之模型評估。後面預測分布及對測試統計之觀察值：圖12A-第2.5；圖12B-第5；圖12C-第50；圖12D-第90，圖12E-第95，圖12F-第97.5。各直方圖上的垂直線代表測試統計的觀察值。
圖13說明對根據最終模型自原始藥物動力學(PK,pharmacokinetic)資料集抽樣的1000個刺激的對象於固定劑量、以重量(WT)或BSA-為基本投藥後預測的帕妥珠單抗穩定狀態最低濃度(第84天)。
圖14A及14B顯示對於具有≦第10(50.4公斤)(圖14A)或≧第90(88.5公斤)(圖14B)WT值之病患群體於固定劑量、以重量(WT)或BSA-為基本投藥後預測的帕妥珠單抗穩定狀態最低濃度(第84天)。
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<400> 1
<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 2<210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 3 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 4 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 5<210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 6 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<220> <221> Xaa <222> 10 <223> Xaa較佳為D或S <400> 7<210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 8<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 9<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列nce <220> <223> 序列為合成的<400> 10<210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<220> <221> Xaa <222> 5 <223> Xaa較佳為R或L <220> <221> Xaa <222> 6 <223> Xaa較佳為Y或E <220> <221> Xaa <222> 7 <223> Xaa較佳為T或S <400> 11<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列nce <220> <223> 序列為合成的<400> 12<210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 13 <210> 14 <211> 448 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 14 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 15 <210> 16 <211> 449 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 16 <210> 17 <211> 217 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 17 <210> 18 <211> 449 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列為合成的<400> 18 <210> 19 <211> 195 <212> PRT <213> 現代人<400> 19 <210> 20 <211> 124 <212> PRT <213> 現代人<400> 20<210> 21 <211> 169 <212> PRT <213> 現代人<400> 21<210> 22 <211> 142 <212> PRT <213> 現代人<400> 22

Claims (25)

  1. 一種帕妥珠單抗(pertuzumab)之用途，其係用於製備治療人類病患癌症之藥物，其中帕妥珠單抗係採約420毫克或約840毫克之一個或多個固定劑量。
  2. 如請求項1之用途，其中固定劑量為約420毫克帕妥珠單抗。
  3. 如請求項1之用途，其中固定劑量為約840毫克帕妥珠單抗。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該藥物係以約每週、約每2週、約每3週或約每4週投予病患。
  5. 如請求項4之用途，其中該藥物係以約每3週投予病患。
  6. 如請求項1之用途，其中該藥物包含約840毫克帕妥珠單抗之載入劑量(loading dose)及一或多個約420毫克帕妥珠單抗之維持劑量，且其中投予帕妥珠單抗載入劑量之後，接著投予一或多個帕妥珠單抗維持劑量。
  7. 如請求項6之用途，其中該維持劑量係以約每3週投予。
  8. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症顯現HER表現、放大或活化。
  9. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症為卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌。
  10. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症為乳癌。
  11. 如請求項10之用途，其中該癌症為轉移性乳癌(MBC,metastatic breast cancer)。
  12. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症為非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)。
  13. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症為前列腺癌。
  14. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該癌症為結腸直腸癌。
  15. 如請求項1至3、6及7中任一項之用途，其中該藥物進一步包含第二種治療藥物。
  16. 如請求項15之用途，其中第二種治療藥物係選自由化療藥物、不同的HER抗體、針對不同的腫瘤相關抗原之抗體、抗荷爾蒙化合物、心臟保護劑、細胞激素、以EGFR為目標的藥物、抗血管新生藥物、酪胺酸激酶抑制劑、COX抑制劑、非類固醇抗發炎藥物、金合歡基(farnesyl)轉移酶抑制劑、結合癌胚胎(oncofetal)蛋白質CA 125之抗體、HER2疫苗、另一種HER目標療法、Raf或ras抑制劑、小紅莓鹽酸鹽微脂粒注射、癌康定、紫杉醇類、雙酪胺酸激酶抑制劑、TLK286、EMD-7200、治療噁心的藥物、預防或治療皮膚疹或標準痤瘡療法之藥物、降低體溫的藥物及造血生長因子組成的族群。
  17. 如請求項16之用途，其中第二種治療藥物為化療藥物。
  18. 如請求項17之用途，其中化療藥物為抗代謝化療藥物。
  19. 如請求項18之用途，其中抗代謝化療藥物為健擇(gemcitabine)。
  20. 如請求項16之用途，其中第二種治療藥物為搓杜滋美 (trastuzumab)、厄洛替尼鹽酸鹽(erlotinib HCL)或貝伐單抗(bevacizumab)。
  21. 一種醫藥套組，包含一或多個固定劑量之帕妥珠單抗，其中固定劑量係約420毫克或約840毫克帕妥珠單抗。
  22. 如請求項21之醫藥套組，另包含說明書指導使用者給予癌症病患固定劑量。
  23. 如請求項22之醫藥套組，其中癌症係選自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、乳癌、轉移性乳癌(MBC,metastatic breast cancer)、非小細胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)、前列腺癌及結腸直腸癌之群組。
  24. 如請求項22之醫藥套組，其中該說明書更指導使用者給予固定劑量至癌症呈現HER表現、放大或活化的癌症病患。
  25. 如請求項21之醫藥套組，包含有兩個組合，其中第一個組合含有約840毫克帕妥珠單抗之固定劑量，而第二個組合含有約420毫克帕妥珠單抗之固定劑量。
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