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TWI241345B - Apoptosis inducing polypeptide - Google Patents

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TWI241345B
TWI241345B TW090105616A TW90105616A TWI241345B TW I241345 B TWI241345 B TW I241345B TW 090105616 A TW090105616 A TW 090105616A TW 90105616 A TW90105616 A TW 90105616A TW I241345 B TWI241345 B TW I241345B
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TW
Taiwan
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ser
chain
gly
leu
val
Prior art date
Application number
TW090105616A
Other languages
English (en)
Inventor
Naoshi Fukushima
Masayuki Tsuchiya
Masayoshi Oh-Eda
Shinsuke Uno
Yasufumi Kikuchi
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Description

1241345 A7 __ B7 五、發明説明（1 ) 技術領域 本發明係關於誘發具有Integrin Associated Proten (整 合組合蛋白質，I A P )的有核血液細胞之凋亡，且具有 不引起紅血球凝集的特性之重建聚肽。更詳細而言，係關 於誘發具有I A P的有核血液細胞之凋亡，含有2個以上 的單株抗體之Η鏈V區域以及L鏈V區域之重建聚肽。該 重建聚肽作爲白血病等血液疾病之治療藥係有用的。 過去技術 特願平9 一 6 7 4 9 9號公報有記載，以開發辨識脾 臟間質細胞所得之特定抗體作爲目標，嘗試製作以該脾臟 間質細胞株作爲敏化抗原之單株抗體，作爲抗原以取得辨 識老鼠Γ A Ρ之新穎單株抗體。又，特願平 9 - 6 7 4 9 9號公報揭示，單株抗體具有誘發骨髓系細 胞凋亡之特性。 W 0 99/12973 係揭示，人類 IAP (. Cell Biol·, 1 23, 4 85-496，1 993 中記載胺基酸序列；Journal of Cell Science, 108, 3419-3425，1995 )作爲抗原之單株抗體，具有 誘發具該I A P的有核血液細胞（骨髓細胞以及淋巴球） 凋亡之特性的單珠抗體M A B L - 1抗體、M A B L - 2 抗體、產生這些的融合瘤、MABL-1(FERM BP — 610 0)以及MABL — 2(FERM BP — 6 10 1)。 特願平1 1 一 6 3 5 5 7號公報則揭示，由人類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） " 一~ -4- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) I A P作爲抗原的單株抗體，取得具有誘發具人類I a p 的有核血液細胞凋亡之特性的具單鎖；F v區之單鎖F v。 然而，IAP作爲抗原的單株抗體之投與，誘發具有 I A P的有核血液細胞凋亡者，於體內會引起紅血球凝集 作用。此爲將I A P作爲抗原的單株抗體大量投與於生物 體內時，顯示會產生紅血球的凝集之缺點。 發明的揭示 本發明的課題爲提供一種可提升誘發具有I A P的有 核血液細胞凋亡之特性，且降低或完全不會引起紅血球的 凝集之重建聚肽。又，本發明的另一課題，提供一種含有 前述所得之誘發具有I A P的有核血液細胞凋亡之物質的 .血液疾病之治療藥。 因此，本發明係關於結合I A P，誘發具有I A P的 有核血液細胞凋亡，且不會引起紅血球的凝集之重建聚肽 〇 本發明又關於改質抗體之重建聚肽。 改質抗體係含有誘發具有I A P (較佳爲人類I A P )的有核血液細胞凋亡之單株抗體（例如M A B L ~ 1抗 體、MABL — 2抗體等）之L鏈V區域以及Η鏈V區域 ，僅可誘發具有I A Ρ (較佳爲人類I A Ρ )的有核血液 細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集的重建聚肽者即可。且 本發明中，亦包含改變這些V區域的胺基酸序列之一部份 的重建聚肽。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公羡） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1241345 A7 B7 五、發明説明（3 ) 本發明又關於前述重建聚肽之人類型化者，人類型化 重建聚肽包含人類型化Η鏈V區域以及/或人類型化L鏈 V區域。詳細而言，人類型化重建聚肽係由，人類單株抗 體L鏈V區域的架構區域（F R )，與含有老鼠單株抗體 的L鏈V區域之C D R的人類型化L鏈V區域以及/或人 類單株抗體Η鏈V區域之F R，與含有老鼠單株抗體的Η 鏈V區域之C D R的人類型化Η鏈V區域所構成。此時 C D R以及F R的胺基酸序列可作一部份的改變（例如， 欠缺、取代或附加）亦可。 且本發明係關於，含有人類單株抗體L鏈C區域，與 老鼠單株抗體的L鏈V區域以及/或人類單株抗體Η鏈C 區域，與老鼠單株抗體的Η鏈V區域所成，可誘發具有 I A Ρ (較佳爲人類I A Ρ )的有核血液細胞凋亡之重建 聚肽。 本發明係又關於，含有相當於上述老鼠C D R，來自 老鼠以外的哺乳動物（例如人類、小白鼠、牛、綿羊、猴 子等）之單株抗體的CDR、或含有該CDR的Η鏈V區 域以及L鏈V區域所成，可誘發具有I A Ρ (較佳爲人類 I A P )的有核血液細胞凋亡之重建聚肽。如此的C D R 、Η鏈V區域以及L鏈V區域亦包含，例如由基因轉移老 鼠等所製造的來自人類單株抗體之C D R、含有該C D R 的來自人類單株抗體之Η鏈V區域以及L鏈V區域。 本發明又關於製造編碼前述種種重建聚肽之D N A、 含有該D N A所成之重組載體的基因工學方法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -6 - 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 本發明又關於藉由該重組載體所成之轉形宿主。宿主 可例如爲人類細胞、老鼠細胞等動物細胞、或大腸桿菌、 枯草菌、酵母菌等微生物。 本發明的又關於培養上述宿主，由培養液中採出重建 聚肽爲特徵之重建聚肽之製造方法。 本發朋又關於一種血液疾病治療藥，含有誘發具有前 述所得I A P的有核血液細胞凋亡之重建聚肽作爲有效成 分者。本發明的血液疾病治療藥，例如有急性骨髓性白血 病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性 白血病、成人T細胞白血病、多發性骨髓瘤、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等白血病、惡性淋巴腫瘤（ Hodgkin病、非-Hodgkin淋巴腫瘤）、再生不良性貧血、骨 髓異形症候群、真性多血性等等血液疾病的治療係有用的 〇 本發明的重建聚肽，較佳爲含有來自單株抗體的2個 Η鏈V區域以及2個L鏈V區域。作爲該重建聚肽的構成 ，較佳可含有1個Η鏈V區域以及1個L鏈V區域之單鎖 F ν之二聚物，或含有2個Η鏈V區域以及2個L鏈V區 的聚肽。該重建聚肽中，Η鏈以及L鏈的V區域以介著1 個以上的胺基酸所成的聚肽所連結者爲佳。這些重建聚肽 ，含有單株抗體的可變區域，且保存互補性決定區域（ complementarity determining region ;以下稱 C D R )，結 合與具有原有的單株抗體相同專一性之抗原。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1241345 經濟部智慧財產局β工消費合作社印製 A7 ______B7 五、發明説明（5 ) Η鏈V區域 關於本發明，來自單株抗體的Η鏈V區域中，改變誘 發具有I A Ρ的有核血液細胞凋亡之單株抗體中的Η鏈V 區域或其Η鏈V區域之一部份胺基酸序列的Η鏈V區域， 較佳爲辨識人類I A Ρ，且包含誘發具有I A Ρ的有核血 液細胞凋亡之單株抗體中，改變其Η鏈V區域或其Η鏈V 區域的部分胺基酸序列之Η鏈V區域，但改變來自 MAB L— 1抗體以及MAB L - 2抗體的Η鏈V區域或 其Η鏈V區域的部分胺基酸之Η練V區域較爲佳。更佳爲 含有人類單株抗體Η鏈V區域的F R與老鼠單株抗體的Η 鏈V區域的C D R之人類型化Η鏈V區域。且，可使用重 組技術獲得，可使用相當於前述老鼠單株抗體的Η鏈V區 域之來自人類單株抗體的Η鏈V區域。又，本發明的Η鏈 V區域爲前述Η鏈V區域片段，亦包含保持抗原結合性之 區域。 L鏈V區域 本發明的L鏈V區域，誘發具有I A Ρ的有核血液細 胞凋亡之單株抗體中，改變其L鏈V區域或其L鏈V區域 的部分胺基酸序列之L鏈V區域，較佳爲辨識人類I A P ，且包含誘發具有I A P的有核血液細胞凋亡之單株抗體 中，改變其L鏈V區域或其L鏈V區域的部分胺基酸序列 之L鏈V區域，但以改變來自M A B L - 1抗體以及 M A B L - 2抗體的L鏈V區域或其L鏈V區域的部分胺 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS) Α4規格（2ΐ〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-8- 1241345 A7 B7 五、發明説明（6 ) 基酸之L鏈V區域較爲佳。更佳爲含有人類單株抗體L鏈 V區域的F R與老鼠單株抗體的L鏈V區域的C D R之人 類型化L鏈V區域。且，可使用重組技術獲得，可使用相 當於前述老鼠單株抗體的L鏈V區域之來自人類單株抗體 的L鏈V區域。又，本發明的L鏈V區域爲前述L鏈V區 域片段，亦包含保持抗原結合性之區域。 互補性決定區域（C D R ) L鏈以及Η鏈的各L區域形成抗原結合部位，保存4 個與L鏈以及Η鏈上可變區域具有共通性之架構區域與3 個可變或互補性決定區域（C D R )連結（Kabat，Ε· Α., 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1 983 )。 前述4個F R區域的大部分爲Θ - sheet構造，其結果 3個CDR形成環，CDR而言亦可形成/3 — sheet構造的 一部份。3個CDR藉由FR保持相互立體且非常近位置 ，於是與形成對比區域的3個C D R同時形成抗原結合部 位。 這些C D R區域係由所得抗體之V區域之胺基酸序列 ，與已知抗體的V區域之已知胺基酸序列作對照，經 Kabat, E. A., 「 Sequences of Proteins of Immunological Interest」的經驗定律所獲得。 單鏈F v 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 -9 - 1241345 A7 Β7 五、發明説明（7 ) 單鏈F v來自單株抗體，其爲含有所連結的η鏈V區 域以及L鏈V區域之聚肽單體，所得單鏈F ν欲含有原先 的單株抗體之可變區域，保存互補性決定區域，結合與原 先單株抗體相同專一性之抗原（特願平1 1 一 6 3 5 5 7 號公報）。且，對於本發明的單鏈F ν，可改變前述可變 區域以及/或C D R的一部份或其胺基酸的一部份（例如 缺失、取代或附加）。構成本發明的單鏈F ν的Η鏈V區 域以及L鏈V區域如上述者，Η鏈V區域與L鏈7區域以 直接或連接體、較佳爲介著聚肽連接體進行連結，其構造 則爲〔Η鏈V區域〕一〔L鏈V區域〕、〔L鏈V區域〕 一〔Η鏈V區域〕之任一種皆可。關於本發明，這些單鏈 F ν可形成二聚物、三聚物或四聚物作爲本發明的重建聚 肽。 單鏈重建聚狀 本發明的含有2個以上Η鏈L區域以及2個以上的L 鏈V區域之單鏈重建聚肽，如上述分別含有2個以上Η鏈 L區域以及L鏈V區域。對此聚肽而言，各區域中該單鏈 重建聚肽以特定立體構造配置、具體而言必須仿效構成單 鏈F ν的二聚物之立體構造進行配置。 以〔Η鏈V區域〕一〔L鏈V區域〕一〔Η鍵V區域 〕一〔L鏈V區域〕 或 〔L鏈V區域〕一〔Η鏈V區域〕、〔L·鏈V區域〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 1241345 A7 B7 五、發明説明（8 ) 一〔Η鏈V區域〕 的順序配置各區域，這些區域介著聚肽進行連結。 連結體 本發明中，作爲Η鏈V區域與L鏈V區域連接的連接 體，可使用以基因工程方法導入所得之任意聚肽連接體， 或合成化合物連接體，例如Protein Engineering，9(3), 299-305, 1 996所揭示的連接體。例如聚肽連接體的情況··可舉 出 S e r G 1 y · S e r G 1 y · G 1 y · S e r S e r · G 1 y · G 1 y
Gly-Gly-Gly-Ser Ser .Gly.Gly.Gly Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Ser - Gly-Gly-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Ser - Gly - Gly-Gly-Gly .Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser Ser 'Gly-Gly-Gly-Gly - Gly-Gly (Gly-Gl y-Gly-Gly.Ser)n (Ser .G1 y.Gly.Gly.Gly)n 〔n表示1以上的整數〕。連接體的長度一般爲1至1 5 胺基酸，但較佳爲2至1 2的胺基酸、更加爲3至1 〇胺 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 11- 1241345 A7 _____ B7 _ 五、發明説明（9 ) 基酸。導入這些連接體的方法以編碼本發明的重建聚肽之 D N A構築方法作說明。 本發明的合成化合物連接體（化學交聯劑），肽的交 聯一般所使用的交聯劑例如可舉出N -羥基琥珀銑酵亞胺 (N H S )雙琥珀銑酵亞胺環庚鹽（d S S )、雙（硫代 琥珀銑酵亞胺基）環庚鹽（B S 3 )、二硫代雙（琥珀銑酵 亞胺基丙酸酯）（D S Ρ )、二硫代雙（硫代琥珀銑酵亞 胺丙酸酯）（D T S S Ρ )、乙二醇雙（琥珀銑酵亞胺琥 珀酸鹽）（E G S )、乙二醇雙（硫代琥珀銑酵亞胺基琥 珀酸鹽（硫代一 E G S )、二琥珀銑酵亞胺基酒石酸鹽（ D S Τ )、二硫代琥珀銑酵亞胺基酒石酸鹽（硫代一 D ST )、雙〔2 -（琥拍銑酵亞胺氧基擬基氧基）乙基 〕碼（B S ◦ C〇E S )、雙〔2 —(硫代號拍銑酵亞胺基氧基 鑛基氧基）乙基〕碼（硫代—BS〇COES)等，這些交聯劑 皆爲販賣品。 特別於形成單鏈F v之二聚物時，以有效率地形成該 二聚物之連接體爲佳，具體而言爲2至1 2胺基酸、較佳 爲3至1 0胺基酸、或相當於此的其他連接體爲佳。 重建聚肽的製作 結合具有人類I A P的細胞之重建聚肽，與對於人類 I A P的單株抗體之Η鏈V區域，與L鏈V區域介由前述 連接體進行連接而得。作爲單鏈F ν的例子，具有來自 M A B L - 1抗體的Η鏈V區域，與L鏈V區域者作爲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210>< 297公釐） ' -12- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A7 B7 五、發明説明（10) MABL1 — s cFv、具有來自MABL - 2抗體的Η 鏈V區域，與L鏈V區域者作爲MABL2 — S cFv。 製造這些重建聚肽中，希望該聚肽爲具有性時，可於 N -末端附加信號（signal )肽。又，欲高效率純化該聚 肽時，對於聚肽純化係爲有用的公知序列，例如可插入 F L A G序列等。此時，使用抗F L A G抗體可高效率地 純化聚肽。 欲製造本發明的重建聚肽時，必須獲得編碼重建聚肽 的D N A，即編碼單鏈F v的D N A或重建聚肽單體之 D N A。這些D N A，使用已經詳細說明的編碼 MABL1 — s cFv 以及/或MABL2 — S cFv 的 Η鏈V區域以及L鏈V區域之DNA，或這些DNA作爲 模版，編碼其序列內所望的胺基酸序列之D Ν Α部分，可 使用兩端已定的引子以P C R法增幅而得。 對於V區域，希望胺基酸序列的一部份作改變時，可 使用P C R法等公知方法改變1個或數個胺基酸，即可獲 得具有1個或數個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序 列之V區域。製作對於特定抗原而言具有充分活性之重建 聚肽時，使用P C R法等公知方法可望改變前述ν區域的 胺基酸序列一部份。 使用P C R決定引子時，必須先決定前述]A B L -1抗體以及/或M A B L - 2抗體的Η鏈以及L鏈的兩鏈 的型，但已知MABL— 1抗體具有&型l鏈以及7 I型 的Η鏈，MABL — 2抗體具有/c型L鏈以及r2a型的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（) Η鏈（特開平1 1 一 6 3 5 5 7號公報）。編碼前述 ΜΑΒ L - 1抗體以及/或ΜΑΒ L — 2抗體的Η鏈V區 域以及L鏈V區域之D N A，使用聚合酶連鎖反應（ P C R )法進f了增幅，可使用 Jones，S.T·，Bio/Technology， 9，8 8 -89，1991所記載引起。 其次，使用聚合酶連鎖反應（P C R )法增幅 M A B L - 1抗體以及M A B L - 2抗體的L鏈V區域時 ，5 ’-末端寡核苷酸引子以及3 ’ -末端寡核苷酸引子如上 述決定。同樣地，增幅M A B L - 1抗體的Η鏈V區域以 及M A B L - 2抗體的Η鏈V區域時，分別決定5 ’ 一末端 引子以及：Τ 一末端引子。 其例子於本發明中，使用5’-末端引子含有於5’-末 端附近提供限制酶Η 1 n f I切斷部位之序列G A N T C ，而3 ’ -末端引子含有於其5 ^ -末端附近提供限制酶 X m a I切斷部位之核苷酸序列C C C G G G者。這些限 制酶切斷部位除使用於將編碼可變區域爲目的之D N A片 段，於純系化載體作再選殖（subclomng)時，亦可使用其 他限制酶切斷部位。 使用特別設計的P C R引子，將編碼M A B L - 1、 MABL — 2抗體的各V區域之cDNA，對這些5’一以 及3 ’ -末端導入適當的鹼基序列，欲使這些表現載體能容 易插入，故將這些於該表現載體中表現其適當功能（例如 ，本發明中經由K 〇 z a k序列的導入上升轉錄’效率）° 其次，使用這些引子以P C R進行增幅所得之M A B L — 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
【衣- 訂
-14- 1241345 A7 B7 五、發明説明（12) 1、MABL—2抗體之各V區域中，插入已含有所望人 類C區域的HE F表現載體（參照w〇9 2/1 9 7 5 9 )。經純系化D N A的序列決定以任意一般方法，例如， 插入適當載體，使用自動DN A定序儀（Applied Biosystems公司製）進行。 本發明的重建聚肽中，連接體，例如肽連接體可如下 導入。即，具有上述關於Η鏈V區域以及L鏈V區域的引 子，與一部份互補性序列，且設計編碼該連接體的Ν -末 端或C -末端之引子，使用此進行P C R可做成編碼具有 所望的胺基酸序列以及長度之肽連接體的D Ν Α。且，僅 獲得1個編碼重建聚肽的D N A，以上述D Ν A作爲模板 ，設計出種種連接用引子，使用其實施P C R，即可容易 獲得所望的胺基酸序列以及編碼具有長度的肽連接體之 D Ν A。因此，僅介由該D Ν A連接編碼Η鏈V區域以及 L鏈V區域之D Ν Α即可，可得到編碼具有所望肽連接體 的本發明重建聚肽之D Ν A。且，僅得到編碼1個重建聚 肽之DNA，前述DN作爲模板，設計種種連接用之引子 ，僅使用此實施P C R，可容易得到編碼不具有所望聚肽 之重建聚肽或連接體之重建聚肽DN A。 又，本發明的重建聚肽之各鏈V區域中，因使用過去 技術（例如參考 Sato, K.，Cancer Res·，53，851-856(1993)) ，可進行人類型化，又一旦製作成編碼人類型化F ν區域 的D Ν A，依常法可容易製得人類型化單鏈F ν、人類型 化單鏈F ν片段、人類型化單株抗體或人類型化單株抗體 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） ^ -15- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（13) 片段。且，因應必須時，這些V區域的胺基酸序列的一部 份可作部份改變。 且，使用基因工學的一般技術，可得到與編碼上述來 自老鼠的Η鏈V區域以及L鏈V區域之D N A相同，相當 於這些的來自其他哺乳類動之D N A，例如來自人類的 D N A。使用所得之D N A，可得到其他哺乳動物，特別 爲來自人類的Η鏈V區域以及L鏈V區域、來自人類的單 鏈F ν以及其片段，以及來自人類的單株抗體與其片段。 如上述，僅製得編碼作爲目的的重建聚肽之各鏈V區 域、人類型化重建聚肽的各鏈V區域之D N A，依常法可 得到含有這些的表現載體、以及經該表現載體的轉形宿主 。又，依常法培養宿主，產生的重建單鏈F ν、重建人類 型化單鏈F ν、人類型化單株抗體以及人類型化單株抗體 片段，可純化至由細胞內或細胞外均一分離。此時，使用 一般分離、純化蛋白質的方法，例如適宜選擇組合各種色 譜法、極限過濾、鹽析、透析等，可進行分離、純化重建 聚肽，但不限於此。 爲製造與具有人類I A P的細胞結合之本發明重建聚 肽，可使用任意表現系統，例如真核細胞、例如動物細胞 、例如已建立的哺乳動物系統、真絲狀菌細胞、以及酵母 細胞、以及原核細胞、例如細菌細胞、例如大腸桿菌細胞 。較佳爲本發明重建聚肽可於哺乳動物、例如於C〇S 7 細胞或C Η〇細胞中表現。 這些狀況，於哺乳類細胞中表現可使用有利用性之常 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 -訂'
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -16 1241345 A7 B7 五、發明説明（14) 用啓動子。例如，較佳爲使用人類•巨大細胞病毒： H CMV )前期（immediate early)啓動子。作爲含有Η CMV啓動子的表現載體的例子，包含HCMV-VM-HCt 1 ' HCMV — VL — HCK 等、來自 p s V 2 n e 〇的質體載體（參照國際公開公報 W092 — 19759) ◦ 又，其他使用於本發明的哺乳類動物細胞中，作爲基 因表現的啓動子可使用逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、 猴病毒4 0 ( S V 4 0 )等病毒啓動子或人類聚肽鏈伸長 因子—1 α ( Η E F - 1 α )等來自哺乳動物細胞的啓動 子。例如使用S V 4 0的啓動子時，Mulligen, R. C·們的方 法（Nature，277，108- 1 14,(1979))，又，使用 Η E F — 1 α 啓動子時，依照M i z u s h i m a，S .們的方法（N u c 1 e 1 c A c i d s
Research，18，5 322，（ 1 990))容易實施。 作爲複製起源（on )，可使用來自S V 4 0、多瘤病 毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤（B P V )等的〇 r i，且宿主 細胞系中的基因複製數增幅等，表現載體作爲選擇標記基 因（maker )，可含有磷酸轉化酶A P Η ( 3 ’）Π或I ( neo )基因、胸苷激素基因、大腸菌黃票令-鳥票令磷酸核 糖轉化酶（Ecogpt )基因，二氫葉酸還原酶（DHFR) 基因等。 如上述做成之重建聚肽之抗原結合活性，對於人類、
I A P之老鼠Μ A B L — 1、Μ A B L — 2抗體的結合阻 斷能可作爲指標進行評價。具體而言，對於老鼠M A B L 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（15) - 2抗體的人類I A P抗原之濃度依賴性阻斷作用的有無 可作爲指標進行評定。 具體而言，使用包含編碼本發明重建聚肽之D N A的 轉形動物細胞，例如培養C 0 S 7細胞或C Η 0細胞，上 述培養的細胞以及/或其培養液，或由這些純化的重建聚 肽，測定對抗員的結合。作爲對照組，使用僅以表現載體 作轉形的細胞之培養上淸液等。表現人類I A Ρ的老鼠白 血病細胞株L 1 2 1 0細胞中.，加入本發明重建聚肽等試 驗試藥或加上對照之培養上淸液，例如實施流體細胞測定 儀對抗原結合性作評價。 體外的細胞凋亡誘發效果，基因導入人類I A P的細 胞中，添加前述的重建聚肽之試驗試藥，對該細胞而言進 行人類I A P抗原特異性是否導致細胞死亡而作評價。 於體內的細胞凋亡誘發效果之評價則如下進行。首先 做成人類骨髓瘤的模板老鼠，該老鼠具有I A P之有核血 液細胞中誘發細胞凋亡的單株抗體、本發明的重建聚肽作 靜脈投與。對照組則僅投與P B S。因此細胞凋亡的誘導 ，作爲抗腫瘤效果，以老鼠血淸中的人類I g G的量變化 以及生存期間作評價。 紅血球的凝集作用，由採取健康人的血液調製出紅血 球懸浮液，於此添加種種濃度的試驗試藥作恆溫培養，以 判定紅血球的凝集而作檢測。 本發明的重建聚狀，係含有2個以上的Η鍵V區域以 及2個以上的L鏈V區域者，含有1個Η鏈V區域以及1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18- 1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（16) 個的L鏈V區域之單鏈F v之二聚物、三聚物或四聚物， 較佳爲二聚物，或連結2個以上的Η鏈V區域以及2個以 上的L鏈V區域之聚肽。因有如此構成，可仿效原單株抗 體的抗原結合部位之立體構造，保持優良的抗原結合性。 本發明的重建聚肽，與whole IgG作比較其對組織、腫 瘤之移動性較爲優，且紅血球凝集之副作用顯著減低或不 產生，故被期待例如作爲急性骨髓性白血病、慢性骨髓性 白血病、急性淋巴性白血病、慢牲淋巴性白血病、成人T 細胞白血病、多發性骨髓瘤、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukimia等白血病、惡性淋巴腫瘤（Hodgkin病、非 Hodgkin淋巴腫瘤）、再生不良性貧血、骨髓異形形成症候 群、真性多血症等血液疾病之治療藥。又，作爲R I標識 的造影劑可望可被利用，藉由結合R I化合物或毒素，可 使效力更增強。 實施發明的最佳狀態 再以以下的實施例對本發明作具體的說明，但本發明 的範圍不限定於此。 本發明的重建聚肽的製造方法，以下述單鏈F v的製 作爲例子作說明。使用於本發明的重建聚肽製造方法，產 生對人類I A P的老鼠M A B L — 1、M A B L — 2抗體 之融合瘤、MABL — 1以及MABL — 2已於1 9 9 7 年9月1 1日分別以寄存號碼FERM B P — 6 1 〇 〇 、F E R Μ Β Ρ — 6 1 0 1作國際寄存於公開微生物寄 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -19- 1241345 A7 B7 五、發明説明（17 ) 存機關之通商產業省工業技術院生命工學工業技術硏究所 (茨城縣筑波市東一 丁目1 一 3號）。 實施例1 (編碼對人類1 A p老鼠單株抗體的v區域 之D N A純系化） 編碼對人類I A P老鼠單株抗體M A B L 一 1以及 M A B L - 2的可變區域之D N A如下進行純系化。 1 訊息 R N )且 1·製作 由融合瘤MAB L — 1以及MAB L — 2的mRNA ，使用 mR ΝΑ 純化 K i t ( Pharmacia Biotech 公司製作 )調製。 1 · 2雙股c D N A的合成一 約 1 β g 的111 R N A 使用 Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH公司製）合成雙股cDNA，以 連結仲介子。 1.3編碼杭體可變區域的基因以PCR法增幅 使用熱循環（Thermal Cycler,PERKIN ELMER 公司製） 進行P C R法。 )編碼M A B L - 1 L鏈V區域之基因的增幅 使用於P C R的引子，使用表示與仲介子的部分序列 作雜交之序列號碼：1的仲介引子1 ( CLONTECH公司製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 1241345 A7 B7 五、發明説明（18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) )、以及與老鼠卡巴粒型L鏈C區域序列作雜交的序列號 碼：2 所示的 Μ K C ( Mouse Kappa Constant )引子（ Bio/Technology，9, 88-89, 1 99 1 )。 PCR 溶液 50//1 中含有，5//1 的 10XPCR 緩衝液 Π、2 m Μ M g C 1 2、0 · 1 6 m Μ dNTPs (dATP，dGTP，dCTP，dTTP )、2 · 5單位的D N A聚合酶AmpliTaq Gold (以上爲 PERKIN ELMER公司製）、0 · 2 A M的序列號碼：1所示 的仲介引子與0 · 2 // M的序列號碼：2所示的Μ K C引 子，以及來自MABL— 1的雙股cDNAO · l"g。 以9 4 °C作爲初期溫度經9分鐘後再以9 4 °C下1分鐘、 6 0 °C下1分鐘以及7 2 °C下1分2 0秒，以此順序加熱 。此溫度循環進行3 5次重複後，反應混合物再以7 2 °C 加熱1 0分鐘。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2 ) 編石馬M A B L — 1 Η鍵V區域白勺c D N A之增幅 作爲P C R的引子，使用序列號碼：1所示的仲介引 子—1、以及序列號碼·· 3所示的Μ H C - 7 1 ( Mouse
Heavy Constant )弓1 子（Bio/Technology，9, 8 8 - 89，1991 ) 〇 cDNA的增幅，代替〇 · 2//M的]VIKC引子使用 〇 · 的MHC — rl引子，其他與上述丄.3 (1 )的L鏈V區域基因的增幅所記載的相同方法進行增幅。 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公餐） 21 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（19) —~3s1編碼M A B L - 2 L鍵V區域的c D N A之增幅 作爲P C R的引子，使用序列號碼：1所示的仲介引 子 1、以及序列號碼：2所示的Μ K C引子。 c D Ν Α的增幅，代替來自M A B L - 1的雙股 c 〇 N A 〇 · l//g使用來自MABL — 2的雙股 c D N A Ο · 1 // g，其他與前述1 · 3 ( 1 )的 M A B L - 1 L鏈V區域基因之增幅所記載的相同方法進 行增幅。 丄編碼M A B L — 2 Η鏈V區域的c D Ν A之增幅 作爲P C R的引子使用序列號碼：1的仲介引子- 1 、以及序列號碼：4所示Μ H C - r 2 a引子（ Bio/Technology, 9, 88-89, 1991 )。 c D Ν A的增幅，代替〇 · 2 // Μ的Μ K C引子使用 0 · 2//M的MHC — r2a引子之外，與前述1 · 3 ( 3 )的L鏈V區域基因的增幅所記載的相同方法進行增幅 〇 一 1 · „4 _P C R牛成物的純化 如前述的P C R法所增幅的D Ν A片段使用QIA qiuck PCR Purification Kit ( QIAGEN公司製）進行純化，溶解於 含有 ImM E DTA 的 l〇mM T r i s - H C 1 ( p Η 8 · 0 )中。 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20) 丄連結以及轉形作用 含有編碼如上述調製的來自M A B L - 1之老鼠卡巴 粒型L鏈V區域的基因所成D N A片段約1 4 0 n g，以 含有5〇ng的pGEN — T Easy載體（Promega公 司製），與 30 m M Tris-HCl (ρΗ7·8) 、1 0 m Μ Μ g C 1 2、1 〇 m Μ 二硫蘇糖醇、1 m Μ Α 丁 Ρ以及3早位Τ 4 DNA連接酶（Promega公司製） 的反應混合液中，於1 5 °C下進行3小時反應使其連接。 再以上述1 // 1的連結混合液加上5 0 // 1的大腸桿 菌D Η 5 α之勝任細胞（東洋紡公司製），再將此細胞於 冰上3 0分鐘後移至4 2 °C下1分鐘再於冰上2分鐘靜置 。再加上1〇〇// 1的S〇C培養基（GIBC0BRL公司製 )，於含有10 0//g/ml的氨苄青黴素（SIGMA公司 製）L B ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Sambrook 們，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 )洋 菜培養基上塗佈此大腸桿菌，於3 7 °C下培養一晚得到大 腸桿菌轉形體。 此轉形體於含有5 0 // g / m 1的氨苄青黴素的L B 培養基3 m 1中於3 7 t徹夜培養，此培養物使用QIAprep SpinMiniprepKit ( QIAGEN 公司製）製作質體 DNA。 含有編碼如此所得的來自融合瘤M A B L - 1的老鼠 卡巴粒型L鏈V區域的基因之引子，命名爲p GEM — MIL。 依照如上述的相同方法，含有編碼來自融合瘤 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-23- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（21 ) M A B L - 1的老鼠Η鏈V區域的基因之引子由純化 DNA片段製得，命名爲PGEN — Μ1Η。 又，含有編碼來自融合瘤M A B L — 2的老鼠卡巴粒 型L鏈V區域的基因之引子由純化D N A片段製得，命名 爲 pGEN — M2L。 又，含有編碼來自融合瘤M A B L - 2的老鼠Η鏈V 區域的基因之引子由純化DN Α片段製得，命名爲 pGEN — M2H。 實施例2 ( D N A的鹼基序列之決定） 前述質體中之c D N A編碼區域的鹼基序列，使用自 動D N A定序儀（Applied Biosystem公司製）以及ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem公司製），依照公司指定的步驟決定 鹼基序列。 編碼含於質體P G E Μ — Μ 1 L的老鼠M A B L - 1 抗體之L鏈V區域的基因之鹼基序列以序列號碼：5表示 〇 又，編碼含於質體P G E Μ — Μ 1 Η的老鼠M A B L - 1抗體之H鏈V區域的基因之鹼基序列以序列號碼：6 表示。 又，編碼含於質體p G E Μ — Μ 2 L的老鼠M A B L - 2抗體之L鏈V區域的基因之鹼基序列以序列號碼：7 表示。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24- 1241345 A7 B7 五、發明説明（22) 又，編碼含於質體P G E Μ - Μ 2 Η的老鼠M A B L 一 2抗體之Η鏈V區域的基因之鹼基序列以序列號碼：8 表示。 實施例3 ( C D R的決定） L鏈以及Η鏈的V區域之全面構造互相具有相似性， 4個架構（frame w〇rk )部分分別以3個超可變化區域， 即互補性決定區域（C D R )而連結。架構的胺基酸序列 雖較能良好地保存，但另一方面，C D R區域的胺基酸序 列之突變性極爲高（Kabat, E. A.們，「Sequences of Proteins of Immunological Interst」US Dept. Health and Human Services， 1983 ) o 以如此事實爲基礎，對人類I A P的老鼠單株抗體之 可變化區域的胺基酸序列，適用於Kabat們所製作的抗體之 胺基酸序列資料庫（database )，藉調查相同性而決定 C D R區域。其結果如表1所示。 表1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 質體 序列號碼 CDR(l) CDR(2) CDR(3) pGEM-MIL 5 45-58 74-80 113-121 pGEM-MlH 6 50-54 69-85 118-125 PGEM-M2L 7 43-58 74-80 113-121 PGEM-M2H 8 50-54 69-85 118-125 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25- 1241345 A7 B7 五、發明説明（23) 實施例4 (純系化c D N A的表現之確定（嵌合μ A B L 一 1抗體以及嵌合ΜΑ B L - 2抗體之製作） 4 · 1嵌合MABL — 1抗體、蠢現載體之製作 爲製作表現嵌合M A B L - 1抗體的載體，分別編碼 老鼠M A B L — 1 L鏈以及Η鏈V區域之c D N A純系（ clone ) pGEM — MIL 以及 pGEM — MlH 以 PCR 法修飾，導入Η E F表現載體（參照國際公開申請案 W 0 92 — 19759)。 爲製得L鏈V區域的前方引子M L S (序列號碼：9 )以及爲製得Η鏈V區域的前方引子Μ H S (序列號碼： 1 0 )，與編碼各別的V區域之前導序列的最初之D N A 進行雜交，且設計成含有Kozak —致（consensus)序列（J. Mol. Biol.， 1 96, 947-95 0，1 9 87 )以及 Η 1 n d ΠΙ 限制酶 位置。爲製得L鏈V區域之後方引子M L A S (序列號碼 :1 1 )以及爲製得Η鏈V區域之後方引子MHAS (序 列號碼：1 2 )，與編碼J區域之末端的D N A序列進行 雜交，且設計成剪接提供（spHce donor )序列以及b a m Η I限制酶位置。 PCR溶液1〇〇β 1爲含有1〇β 1的10XPC R 緩衝液 Π、2 m Μ Μ g C 1 2、0 · 1 6 m Μ dNTPs (dATP，dGTP，dCTP，dTTP )、5單位的DNA聚合酶Amp 1 i T a q G 〇 1 d、各〇 · 4 // M的啓動子、以及8 n g的模板 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貢) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 1241345 A7 B7 五、發明説明（24) DNA (pGEM - MIL 以及 pGEM — M1H)，於 9 4 °C作爲初期溫度經9分鐘，再以9 4 °C下1分鐘， 6 0 °C下1分鐘以及7 2 °C下1分2 0秒，以此順序加熱 。此溫度循環作3 5次重複後，反應混合物再以7 2 °C下 1 0分鐘加熱。 P C R 生成物使用 QIA quick PCR Purification Kit ( QIAGEN公司製）進行純化，以H i n d m以及B a m Η I 分解，對L鏈V區域以HEF表現載體HEF-/c，對H 鏈V區域以Η E F表現載體Η E F -7分別作純系化。決 定D N A序列後，含有具正確D N A序列之D N A片段的 質體，分別命名爲HEF— MIL、HEF-M1H。 4 2 2嵌合MAB L - 2抗體表現載體的製作 c D N A的修飾以及純系化，除取代p G E Μ -M1 L 以及 pGEM — M1H 以 pGEM — M2 L 以及 p G E M - M 2 H將增幅模板D N A外，其他與前述 4 · 1所記載的方法相同進行增幅以及純系化，D N A序 列決定後，含有具正確D N A序列的D N A片段之質體， 分別命名爲 HEF— M2L ' HEF—M2H。 4 3 3 C〇S 7細胞之基因導入 爲觀察嵌合MAB L - 1抗體以及嵌合MAB L〜2 抗體之過渡性表現，.對前述表現載體以C〇S 7細胞作言式 驗。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 衣·
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -27 1241345 A7 B7 五、發明説明（25) (1 )嵌合MABL- 1抗體之基因導入 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) HEF— MIL 與 HEF— M1F 載體，使用 Gene Pulsei*裝置（BioRad公司製）以電穿透作用於C〇S 7細 胞內同時進行轉形作用。各D N A ( 1 〇 // g )與p B S 中1 X 1 0 7細胞/m 1之0 · 8 m 1加入容器內，以 1 . 5 k V , 2 5// F的容量進行脈衝（pulse)。 於室溫下1 0分鐘的回復時間後，電穿透作用處理的 細胞，加入含有1 0 %的r 一球蛋白牛胎血淸的D Μ E Μ 培養液（GIBC〇BRL公司製）。7 2小時培養後，收集培 養液上淸液，以離心分離將細胞碎片除去，取得回收培養 液上淸液。 (2 )嵌合MAB L — 2抗體的基因導入_
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 嵌合MABL-2抗體基因的導入，除取代HEF-M1L與HEF— M1H載體使用HEF— M2L與 HEF - M2H載體之外，如前述4 · 3 (1)所記載的 方法同時於C〇S 7細胞進行轉形作用，得到回收培養液 上淸液。 4 . 4流質細胞測定儀 爲測定對抗原的結合，使用前述C 〇 S 7細胞培養液 上淸液進行流質細胞測定儀。表現人類I A P的老鼠白血 病細胞株L 1 2 1 0細胞4 X 1 0 5個中，加上使嵌合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -28- 1241345 五、發明説明（26) MABL - 1抗體表 或使嵌合ΜΑ B L -上淸液，或作爲對照 公司製），於冰上恆 F I T C標識的抗人 溫培養以及洗淨後， DICKINSON 公司製） 其結果，嵌合Μ 2抗體，因與表現人 現的C〇S 7細胞之培養液上淸$ ’ 2抗體表現的C〇S 7細胞之培養液 組的人類I g G 1抗體（S I G Μ Α 溫培養以及洗淨後，加上進行 類I g G抗體（Cappel公司製） 以 FACScan 裝置（BECTON 螢光強度測定。 AB L — 1抗體以及嵌合MAB L — 類I A P作特異性的結合，顯示這些 恆 C請先閲讀背面之注意事項存填寫本頁)
嵌合抗體具有，老鼠單株抗體MABL-1以及MABL 2各別的V區域之正確構造（圖1至3 、1Τ 實施例5 (重建MAB L - 1抗體以及重建MAB L - 2 抗體單鏈F v ( s c F v )區域的製作） 1重建M A B L - 1抗體單鏈F v區域的製作_ 重建MAB L - 1抗體單鏈F v區域如以下述製得。 重建M A B L — 1抗體Η鏈V區域，以及連接體區域、以 及重建M A B L — 1抗體L鏈V區域分別使用P C R法增 幅，經由連接製得重建M A B L - 1 ί几體單鏈F v區域。 此方法如圖4模式所示。爲製得重建M A B L — 1抗體單 鏈F v區域，使用6個P C R引子（A — F ) ◦引子a、 C以及E爲具有意義（sense )序列，引子B、D以及ρ具 有無意義（unsense )序列。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A7 B7 五、發明説明（27) 爲製得Η鏈V區域的前方引子V H S (引子A、序列 號碼：1 3 )與編碼Η鏈V區域的N末端之D N A雜交， 且設計成具有N c ο I限制酶辨識位置。爲製得Η鏈V區 域的後方引子V H A S (引子Β，序列號碼：1 4 )與編 碼Η鏈V區域的C末端之D N A雜交，且設計成於連接體 成重疊（overlop )。 爲製得連接體的前方引子L S (引子C，序列號碼： 1 5 )，與編碼連接體的N末端之D N A進行雜交，且設 計成編碼Η鏈V區域的C末端的D N A成重疊。爲製得連 接體的後方引子L A S (引子D，序列號碼：1 6 )與編 碼連接體的C末端之D N A進行雜交，且設計成編碼L鏈 V區域的N末端之DNA成重疊。 爲製得L鏈V區域的前方引子V L S (引子E，序列 號碼：1 7 )與編碼連接體的C末_之D N A進f 了 乂， 且設計成編碼L鏈V區域的Ν末端之D Ν Α成重疊。爲製 得L鏈V區域的後方引子V L A S — F L A G (引子F， 序列號碼：1 8 )與編碼L鏈V區域的C末端之D Ν A進 行雜交，且設計成編碼F L A G太之序列（Hopp，T. P.們 ，Bio/Technology, 6, 1 204- 1 2 1 0, 1 988 )，2 個轉錄停止密碼 子以及具有E c 〇 R I限制酶辨識位置。 於第1 P C R階段進行A — B、C 一 D以及E — F的 3個反應，純化各P C R產物。將第1 P C R所得的3個 P C R產物以這些之互補性進行組合。再加上引子A以及 F，增幅編碼重建M A B L - 1抗體單鏈F ν區域之全長 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本·
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -30- Α7 Β7 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（28) D N A ( 第 2 P C R )。 且 5 對 於 第 1 Ρ C R 5 編碼重建 Μ A B L 1 抗 體 Η鏈V 區 域 的 質 體 Ρ G E Μ — Μ 1 Η ( 參 考 嘗 施 例 2 ) 含有編 碼 G 1 y G 1 y G 1 y G 1 y S e r G 1 y G 1 y G 1 y G 1 y S e r G 1 y G 1 y G 1 y G 1 y S e r (序 列 號 碼 1 9 ) 所 成的連 接 體 rJ-ti 區 域 之 D Ν A 序 列 (Huston, J. S. 們 ,Proc. Natl. Acad, ί 5ci .USA, 85, 5879-5883 ，1988 )所 成 之 質 體 Ρ G E Μ -Ml L ( 參 昭 J 實 施 例 2 ) 以及編碼 重 建 Μ A Β L — 1 抗體L 鏈 V 1E 域 的 質 體 Ρ G E M — Μ 1 L ( 參 昭 實 施 例2 ) 分 別作 爲 模 板使 用 〇 第 1 Ρ C R 階 段的溶 液 5 〇 β 1 爲 含有 5 β 1的1〇 X P C R 緩 衝 液 π、2 m Μ Μ g C 1 2 、1 0 .1 6 m Μ d N Τ Ρ S 2 • 5單位 的 D N A 聚 合 酶 AmpliTaq G 0 1 d ( 以 上 爲 PERKIN ： ELMER 公 司 製 ) 、 各 個引子 〇 • 4 β Μ 以 及 5 n g的 各 模 板 D N A 9 4 °c 作爲初期 溫 度 9 分 鐘 後 ， 再 於9 4 °C 下 1 分 鐘 j 6 5 °C 下 1分鐘以 及 7 2 °C 下 1 分 2 0秒， 以 此 順 序 加 熱 〇 此 溫 度 循環進行 3 5 次 重 複 後 y 將 此反應 混 合 物 於 7 2 °C 下 加 熱 7分鐘。 Ρ c R 生 成 物 A — B ( 3 7 1 b Ρ ) C — D ( 6 3 b Ρ ) 、 以 及 E - F ( 3 8 4 b Ρ ) 使 用 QI Aquick P C R 純 化 套 組 ( QIAGEN 公 司 製 ) 進 行 純 化 j 於第2 P C R 進 行 組 合 〇 於第2 P C R ， 作 爲 模 板 的 1 2 0 n g 之 第 1 Ρ C R 生 成 物A — B 2 〇 η g 的 P C R 生成物c 一 D以及120ng的PCR生成物E — F，含有1〇μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、1Τ
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -31 - 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（29) 1 的 Γ 〇 X P C R 緩衝液 π、2 m Μ M g C 1 2、 〇 · 1 6 m M dNTPs 、5單位的DNA聚合酶 AmpHTaq G o 1 d (以上爲PERKINELMER公司製）的 9 8//1 P C R混合液，9 4 °C作爲初期溫度8分鐘後 ，再於9 4 °C下2分鐘，6 5 °C下2分鐘以及7 2 °C下2 分，以此順序加熱。此溫度循環進行2次重複後，分別加 入0 · 4 β Μ的引子A以及F。9 4 °C作爲初期溫度1分 鐘後，再於9 4 °C下1分鐘，6 5 °C下1分鐘以及7 2 °C 下1分2 0秒，此溫度循環進行3 5次重複後，反應混合 物於7 2 °C下7分鐘加熱。 純化第2 P C R所生成的8 4 3 b p之D N A片段進 行純化，經N c ο I以及E c 〇 R I消化所得之D N A片 段以p S C F V T 7載體作純系化。且，本發明載體 p S C F VT 7含有適合大腸桿菌周邊漿液（PenPlasma ) 分泌表現系的p e 1 B信號序列（L e i，S . P ·們，J. Bacteriology, 1 69, 4379-43 83, 1 987 ) 。D N A 序列決疋後 ，含有編碼重建M A B L - 1抗體單鏈F v區域的正確胺 基酸之DNA片段的質體，命名爲P s cMl (參考圖5 所示）。含於本質體pscMl的重建MABL - 1抗體 單鏈F v區域之鹼基序列以及胺基酸序列以序列號碼： 2〇所示。 其次，製作哺乳動物細胞中使表現重建M A B L - 1 抗體單鏈F v區域之載體，p s c Μ 1載體以P C R法修 飾。所得的D N A片段導入p C H〇1表現載體內。且， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、w
本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -32- 1241345 Μ — _ Β7 _ 五、發明説明（30) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明載體pCHOl係由DHFR— ΛΕ—r νΗ — PM1 — f (參考W 0 92/19759)，以 E c 〇 R i以及S m a I分解刪除抗體基因，因連接 E c 〇R I — N o t I — BamHI Adaptor (寶酒造公司製 )而構築載體。 使用於PCR的引子，與編碼作爲前方引子Η鏈V區 域的Ν末端之D Ν Α進行雜交，且使用具有S a 1 I限制 酶辨識位置之序列號碼2 1所示的S a 1 - V H S引子， 以及作爲後方引子與編碼第1架構序列的最後之D Ν Α進 行雜交的序列號碼：2 2所示的FRH1 anti引子。 P C R溶液1 0 0 // 1，含有1〇μ 1的1 0 X P C R 緩衝液 Π、2 m Μ M g C 1 2、0 · 1 6 m Μ dNTPs、5 單位的 DNA 聚合酶 AmpliTaq Gol d ，0 · 4 // M之各引子，以及8 n g的模板D N A ( P s c M 1 )， 9 5 °C作爲初期溫度9分鐘後，再於9 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 °C下1分鐘，6 0 °C下1分鐘以及7 2 °C下1分2 0秒， 以此順序加熱。此溫度循環進行3 5次重複後，，反應混 合物於7 2 °C下7分鐘加熱。 P c R 生成物以 QIAquick PCR Purification Kit ( QIAGEN公司製）進行純化，以S a 1 I以及M b ο Π分解 ，得到編碼N末端面重建Μ A B L — 1抗體單鏈F ν區域 之DNA片段。又，pscMl載體以Mbon以及 E c 〇 R I分解，得到編碼C末端面重建Μ A B L - 1抗 體單鏈Fv區域之DNA片段。因此，Sail- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -33- 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（31)
Mbo Π DNA片段以及Mb ο Π— EcoR I DNA片段以 p C Η〇1 一 I g s載體作純系化。D N A序列決定後， 含具有正確的D NA序列之D N A片段的質體命名爲 p C Η〇Μ 1。（參照圖6 )。且，本發明的載體 p C Η〇1 一 I g s含有適合哺乳動物細胞分泌表現系之 老鼠 I g G 1 信號序列（Nature，322, 323-327，1 98 8 )。含 於本質體P CH0M1的重建MAB L— 1抗體單鏈F v 區域之鹼基序列以及胺基酸序列以序列號碼·· 2 3表示。 5 · 2重建MABL - 2抗體單鏈Fv區域的製作 重建MA B L — 2抗體單鏈F v區域如前述5 . 1製 作。對第1 P C R，使用取代p G E Μ — Μ 1 Η使用編碼 重建MAB L - 2抗體Η鏈V區域之質體p G ΕΜ -Μ 2 Η (參考實施例2 )、以及取代p G Ε Μ - Μ 1 L使 用編碼重建MAB L — 2抗體L鏈V區域之質體p GEM 一 Μ 2 L (參考實施例2 )、得到含有編碼重建M A B L - 2抗體單鏈F v區域的正確胺基酸之D N A片段的質體 p s c Μ 2。 含於本質體P s cM2的重建MABL - 2抗體單鏈 F v區域之鹼基序列以及胺基酸序列以序列號碼：2 4表 不0 又，藉p s c Μ 2載體的修飾，取得含有編碼重建 M A B L - 2抗體單鏈F ν區域的正確胺基酸序列之 D N A片段，的哺乳動物細胞表現用p C Η〇Μ 2載體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 34- 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32) 含於本質體P CH0M2的重建MAB L — 2抗體單鏈 F v區域之鹼基序列以及胺基酸序列以序列號碼：2 5表 示。 5 · 3 C〇S 7細胞的基因導入 爲觀察重建M A B L - 2抗體單鏈F v區域的過渡性 表現，以p C Η〇Μ 2載體對C 0 S 7細胞作試驗。 p C ΗΟΜ 2載體使用Gene Pulser裝置（Bi〇Rad公司 製）以電穿透作用於C〇S 7細胞作轉形作用◦ D N A ( l〇#g)與PBS中lxl〇7細胞/ ml的〇 . 8ml 加入容器內，以Γ · 5 k V、2 5 // F的容量進行脈衝。 於室溫下1 0分鐘的回復期間後，‘經電穿透作用處理 的細胞，加入含有1 0 %的牛胎血淸之I M D Μ培養液（ GIBCO BRL公司製）中。7 2小時培養後，收集培養上淸 液，進行離心使細胞碎片除去得到回收培養液上淸液。 5 · 4 C 0 S 7細胞培養液上淸液中重建M A B L — 2抗 體單鏈F v區域之檢測 對以p C Η〇Μ 2載體導入基因的C〇S 7細胞培養 液上淸液之重建M A B L - 2抗體單鏈F ν以蛋白質印跡 法作確認，以p C Η〇Μ 2載體導入基因的c〇S 7細胞 培養液上淸液以及作爲對照組的以p C Η〇1載體導入基 因之C 0 S 7細胞培養上淸液作S D S電泳，以 REINFORCED NC 膜（Schleichei* & Schuell 製）轉印。5 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-35- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（33) 乳淸（森永乳業公司製）中進行覆蓋、以0 · 0 5 % Tween 2 0 — P B S洗淨後，加上抗F L A G抗體（SIGMA 公司製）。於室溫下恆溫培養以及洗淨後，加上鹼性磷酸 化酶結合抗老鼠I g G抗體（Zymed公司製），於室溫下 恆溫培養以及洗淨後，添加基質溶液（KirkegaardPen-y !^]30131；01^5公司製），使其顯色（圖7)。 其結果，僅於p C Η〇Μ 2載體導入的c〇S 7細胞 培養液上淸液中，檢測出F L A G肽特異性蛋白質。顯示 此培養液上淸液中有重建M A B L - 2抗體單鏈F v區域 分泌出。 5 . 5流質細胞測定儀 爲測定對抗原的結合，使用前述C 0 S 7細胞培養液 上淸液進行流質細胞測定儀。表現人類I A P之老鼠白血 病細胞株L 1 2 1 0細胞，或作爲對照組以P c 0 s 1載 體轉形作用的L 1 2 1 0細胞2 X 1 0 5個中，添加表現重 建M A B L - 2抗體單鏈F v區域的C 0 S 7細胞培養液 上淸液或，添加作爲對照組以P C Η 0 1載體轉形作用的 C〇S 7細胞培養液上淸液，於冰上進行恆溫培養以及洗 淨後，加入老鼠抗F L A G抗體（S I G Μ Α公司製）。 恆溫培養以及洗淨後，加上以F I T C標識的抗老鼠 I g G抗體（BECTON DICKINSON公司製），再次®、溫培 養以及洗淨後，於FACS can裝置（BECTON DICKINSON公 司製）測定螢光強度。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 、11
-36- 1241345 A7 B7 五、發明説明（34) 其結果，重建MABL-2抗體單鏈Fv區域，因與 表現人類I A P的L 1 2 1 0細胞行特異結合，故顯示此 重建MABL—2抗體單鏈Fv區域對人類IAP具有親 和性。
5 •競爭型（Competitive ) ELISA 以對老鼠單株抗體的抗原結合之阻斷活性作爲指標， 測定重建M A B L - 2抗體單鏈F v區域的抗原結合性活 性。 調整成1 β g/m 1的抗F LAG抗體加入9 6穴培 養皿中各穴中，於3 7 °C下進行2小時的恆溫培養。洗淨 後，進行於1 % B S A - P B S中的覆蓋。室溫下恆溫培 養以及洗淨後，導入分泌型人類I A P抗原基因（序列號 碼：2 6 )之C〇S 7細胞培養液上淸液，以P B S稀釋 成2倍者加入各穴中。室溫下恆溫培養以及洗淨後，將調 整成 1 00ng/m 1 生物素（biotin )化 M A B L — 2 抗 體5 0 // 1以及順序稀釋重建M A b l - 2抗體單鏈F v 區域表現C 0 S 7細胞培養液上淸液5 0 // 1混合而成者 加入各穴中。室溫下恆溫培養以及洗淨後，加入鹼性磷酸 化酶結合鏈黴素蛋白（streptavidin ) ( Zymed公司製）。 室溫下恆溫培養以及洗淨後，加入基質溶液（SIGMA公司 製），再以4 0 5 n m測定吸光度。 其結果，重建M A B L - 2抗體單鏈F v區域（ MABL2— scFv)，與對照組的pCHOl導入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -37- 1241345 A7 B7 五、發明説明（35) C〇S 7細胞培養液上淸液作比較，顯示隨著濃度局低老 鼠M A B L - 2抗體對人類I A P抗原的結合具有阻斷性 ，（圖12)。由此可知，重建MABL — 2抗體單鍵 F v區域，顯示其具有老鼠單株抗體M A B L· - 2各個V 區域的正確構造。 5 · 7體外（In vitro )中細胞凋亡的誘發 使用人類I A P以基因導入的L 1 2 1 〇細胞，以及 作爲對照組P C〇S 1載體以基因導入的L 1 2 1 〇細胞 ，以及CCRF - CEM細胞，對重建MABL — 2抗體 單鏈F v區域的細胞凋亡誘發作用以Annexin — V ( velingermanhaim公司製）染色作檢討。 1 X 1 0 5個的各細胞中，添加重建M A B L — 2抗體 單鏈F v區域表現C〇S 7細胞培養液上淸液或，作爲對 照組p C Η〇1載體導入C〇S 7細胞培養液上淸液最終 濃度爲5 0 % ，培養2 4小時。其後進行Annex in — V染色 ，以FACScan裝置(BECTON DICKINS〇N公司製）測J定螢 光強度。 藉Annexm — V染色的解析結果分別以圖1 3至1 8表 示。於此，圖左下區域的點爲生細胞、右下的區域爲細胞 凋亡的細胞、右上區域爲細胞凋亡的後期細胞。其結果重 建MABL - 2抗體單鏈Fv區域（MABL2 -s c F v )係對L 1 2 1 0細胞而言，人類I A P抗原特 異性地顯著誘導細胞死亡（圖1 3至1 6 )。又，對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -38- A7 B7 1241345 五、發明説明（36) C C R F - C E Μ細胞而言亦比對照組有著顯著的誘導細 胞死亡現象（圖1 7至1 8 )。 5 · 8對來自C Η〇細胞產生的M A B L - 2抗體之單鏈 f v聚肽 欲建立來自M A B L - 2抗體的單鏈F v (聚肽）的 恆定表現C Η〇細胞株，導入基因p C Η〇Μ 2載體於 C Η〇細胞中。 將p C Η〇Μ 2載體使用Gene Pulser裝置（BioRad公 司製）以電穿透作用將C Η〇作進行轉形。混合D N A ( 1〇// g )與懸濁於0 · 7 m 1之P B S的C Η〇細胞（ 1 X 1 0 7細胞/m 1 )者放入培養器中，以1 · 5 k V、 2 5 // F的容量進行脈衝。於室溫下作1 〇分鐘的回復時 間後，經電穿透作用處理的細胞，加入1 〇 %的含有牛胚 胎血淸之不含核酸α - Μ E Μ培養基（GIBCO BRL公司製 )進行培養。對於所得的純系，以S D S - P A G Ε確認 目的蛋白質的表現，選擇出較高表現量的純系爲產生來自 M A B L - 2抗體的單鏈F v細胞株。於含有1 〇 η Μ methotrexate ( SIGMA公司製）的無血淸培養基CH〇 —S —S F Μ Π ( GIBCO BRL公司製）進行培養後，收集上 淸液，以離心法分離除去細胞破片獲得回收培養上淸液。 5 · 9純化來自C Η〇細朐產生的M A B L — 2抗體之單 鏈F v 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -39 1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（37) 5 . 8所得之產生單鏈F v表現C Η 0株的培養上淸 液，使用人工透析用筒（PAN130SF、旭medical ) 濃縮至2 0倍◦濃縮液保存於一 2 0 °C下，純化再進行解 凍。 由C Η 0細胞培養上淸液純化單鏈F v，進行B1 u e -sepharose、羥基磷灰石以及膠體過濾等三種柱色譜分析。 (1 ) Blue-sepharose 柱色譜 以培養上淸液的濃縮液以2 0 m Μ醋酸緩衝液（p Η 6 .〇）稀釋1 0倍，以離心分離（1 0 0 0 0 r p m X 3 0分鐘）除去不溶物。添加與上淸液相同緩衝液作平衡 化之Blue -s e p h a r 〇 s e柱（2 0 πι 1 )，以相同緩衝液洗淨後 ，同緩衝液中N a C 1濃度以0 · 1 、〇· 2 、〇· 3 、 0 · 5以及1 · 0M做階段式上升，溶離出吸著於柱子的 蛋白質。通過SDS-PAGE以及分析各溶離部分，取 出確認單鏈F v部分（〇 · 1至0 · 3 Μ N a C 1溶離 部分），使用CentnPrep — 1 0 ( Amicon )濃縮至約2〇 倍。 (2 )羥基磷灰石 (1 )的濃縮液以1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 0 )稀釋1 0倍，添加於羥基磷灰石柱（2 0 m 1 、 B 1 〇 R a d )。以6 0 m 1的1〇m Μ磷酸緩衝液（ ρ Η 7 · 0 )洗淨柱子後，磷酸緩衝液濃度直接上升至 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
-40- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A7 B7 五、發明説明（38) 2 0 0 m Μ，溶離出吸著於柱子的蛋白質（圖1 9 )。以 S D S - P A G Ε分析各部分的結果、確認部分Α以及部 分B的單鏈F v。 (3 )膠體過濾 (2 )的部分A以及B分別使用CentriPrep — 1 0作濃 縮，添加於以含有0 · 1 5 Μ N a C 1的2 0 m Μ醋酸 緩衝液（Ρ Η 6 · Ο )作平衡化之TSKgelG3000SWG柱（ 2 1 · 5 x 6 Ο 0 m m )。色譜如圖2 0所示。所得之部 分以S D S - P A G Ε分析的結果，任一的主要波峰（ A I、B I )皆爲目的的單鏈F v，以膠體過濾分析的結 果，溶離出部分A分子量約爲3 6 k D、部分B則約7 6 k D。經純化單鏈F v ( A I、B I )使用1 5 % - 5 D S -聚丙烯醯胺膠體進行分析。於試樣品中添加還原 劑、與非添加處理，以L a e m m 1 1的方法爲準進行電 泳，電泳後的蛋白質以科麥曲豔藍染色。如圖2 1所示， A I 、B I與是否添加還原劑無關皆表現於分子量約3 5 k D的單一帶上。由以上的結果，判斷A I爲單鏈F v的 單體，B I爲單鏈F v的非共鍵結二聚物。部分A I以及 BI 使用 TSKgel G3000SW柱（7· 5X 6 0 m m )以膠體過濾所分析的結果，檢測出部分a I僅 爲單體的波峰、部分B I則僅爲二聚物的波峰（參考圖 2 2)。 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -41 - 1241345 A7 _____B7 五、發明説明（39) 5.10構築來自大腸桿菌細胞的Μ A B L· — 鏈F v聚吐表現載體 欲製作來自M A B L - 2抗體的單鏈F v能有效率表 現於大腸桿菌體內之載體，將p s c Μ 2載體以P C R法 作修飾，所得之D Ν Α片段導入p s C F V Τ 7表現載體 中 。 ' 使用於P c R的引子，作爲前方引子使用，編碼Η鏈 V區域的Ν末端之D Ν Α經雜交，且具有起始密碼以及 N d e I限制酶辨識位置的序列號碼：2 7所示之N d e 一 V H S m Ο 2引子；作爲後方引子使用，編碼L鏈V區 域的C末端之D Ν A經雜交，且具有停止密碼以及 E c 〇 R I限制酶辨識位置的序列號碼：2 8所示之 VLAS引子。且因前方引子的Nd e — VHSmO 2於 大腸桿菌體內可有效率地表現，故編碼Η鏈V區域的N末 端之D Ν Α經雜交部分含有5個點突變。 1 〇 〇 // 1的P C R溶液中含有1〇// 1的1 〇 X PCR Buffer #l、lmM MgCl2、 Ο · 2mM dNTPs 、5單位的K〇D DNA聚合 酶（以上東洋紡公司製）、各引子爲1 // Μ、以及1〇〇 n g 的模板 D N A ( p s c Μ 2 )、於 9 8 °C 下 1 5 秒、 6 5 °C下2秒以及7 4 °C下3 0秒，依此順序加熱。此溫 度循環進行2 5次重複。 P C R 生成物使用 QIAquick PCR Purification K 1 t ( QIAGEN公司製）進行純化，以N d e I以及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -42- 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（40) EcoRI分解，所得之DNA片段以PSCFVT7載 體進行純系化。且，本表現載體P s c F v τ 了經 N d e I以及E c o R I分解而消除P e 1 B訊息序列。 決定D N A序列後，含有具有正確D N A序列的D N A片 段之質體命名pscM2DEm02 (參考圖23)。含 於質體p s cM2DEm〇2的來自MABL - 2抗體的 單鏈F v之鹼基序列以及胺基酸序列如序列號碼：2 9所 示。 _5 · 1 1對來自大腸桿菌細胞的M A B L — 2抗體之單鏈 F v聚Hie表現 欲得到表現來自M A B L — 2抗體的單鏈F v聚肽之 大腸桿菌，以p s cM2DEm0 2載體於大腸桿菌 BL21 ( D E 3 ) pLysS ( STRATAGENE 公司製） 作轉形。所得的純系，以S D S — P A G E檢討作爲目的 蛋白質之表現，選擇表現量較高的純系作爲來自M A B L - 2抗體的單鏈F v聚肽之細胞株。 _5_二1_2純化來自大腸桿菌細胞產生的M A B L - 2 之單鏈F v聚肽 經轉形所得之大腸桿菌之單一菌落於3 m 1 L B培 養基於2 8 °C下培養7小時，將此傳代培養於7 0 m 1的 L B培養基中，於2 8 °C下作一夜培養。此預培養再傳代 培養至7 L的L B培養基中，使用發酵罐於2 8 °C下擅梓
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
-43- 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___ Wl______五、發明説明（41) 速度3 0 0 r p m進行培養。0 . d . = 1 · 5時以1 m Μ I P T G進行誘導，之後再進行3小時培養。 培養液經離心分離（1 〇 0 0 〇 X g，1 0分鐘）， 回收沈澱菌體，加入含有5 m M e D T A、0 · 1 Μ NaCl 、 l%Tr i ton χ— l〇〇 的 T r ]_ s鹽酸緩衝液（p H 8 · 〇 )，以超音波（〇 u t put :4 、duty cycle :7〇％、1 分鐘 x 1〇次）將菌體破碎，此懸濁液以離心分離（1 2 0 〇 〇 X g，1 0分鐘）沈澱回收內含體加入含有5 0 m Μ EDTA、〇.lM NaCl、 4% Triton X —100之5〇mM Tr i s鹽酸緩衝液（pH8 ·〇 )，再度作超音波處理（〇ut put : 4、duty c y c Γ e : 5 〇 %、3 〇秒χ 2次），經離心分離（ 1 2 0 〇 〇 x g， 1 〇分鐘）目的蛋白質以沈澱回收，除 去存在於上淸液所夾雜的蛋白質。 含有目的蛋白質的內含體溶解於含有6M Urea 、5mM EDTA、0.1M NaCl 之 5〇mM T r i s鹽酸緩衝液（p Η 8 · 〇 )，以流速5 m 1 /分 添加於經含有4M Urea、5mM EDTA、 〇 · 1 Μ Ν a C 1 、1〇m Μ氫硫乙醇之5 0 m Μ T r 1 s鹽酸緩衝液（ρ Η 8 · 0 )平衡化的SephacrylS —3 〇 〇 ( 5 x9 〇 cm、amasham · falmasia)膠體過濾 柱，除去締合的局分子量之單鏈F v ◦各部分以S D S -P A G E作分析，對於純度較高的部分，以使用於膠體過 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -JW.
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-44 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（42) 濾之溶媒稀釋至〇· D · 2 8。= 0 · 2 5後，對5 m Μ E D T A > 〇 . 1 M NaCl、0.5M Arg、2 m M還原型谷胱甘肽、〇 . 2 m M氧化型谷胱甘肽的5〇 m Μ T r i s鹽酸緩衝液（ρ Η 8 · Ο )進行3次透析 ，並進行解鏈操作。且對含有〇 . 1 5 Μ N a C 1的 2 0 m M醋酸緩衝液（p Η 6 . Ο )進行3次透析，進行 溶媒交換。 欲分離除去極少的含於分子間以S - S鍵結之交聯的 高分子，添加於經含有Ο · 1 5 Μ N a C 1的2 0 m Μ 醋酸緩衝液（ρ Η 6 · Ο )平衡之Superdex 2 Ο Ο P g (2 · 6 x 60 c m、amasham · falmacia 公司製）膠體過 濾柱。如圖2 4所示，於被判定爲高分子量的締合體之寬 波峰後，檢測出主要波峰與次波峰之2個波峰。由以 S D S - P A G E作分析（參考圖2 1 )以及膠體過濾之 溶離位置，判定主要波峰爲單鏈F v聚肽之單體、次波峰 爲非共鍵結性之二聚物。 5 . 1 3來自M A B L — 2抗體的純化單鏈F v聚肽於體 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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'澡 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 外之細胞凋亡誘發效果 使用經基因導入人類I A P的L 1 2 1 0細胞（ h I A P / L 1 2 1 0 )，來自C Η〇細胞以及大腸桿菌 細胞產生之M A B L - 2抗體的單鏈F ν聚肽（ M A B L 2 — s c F v )的細胞凋亡誘發作用，以以下2 種步驟作 Annexin — V ( BOEHRINGER MANNHEIM 公司製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） -45- 1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) )染色後作檢討。 第一種實驗步驟爲，於5 X 1 〇 個之h I A P / L 1 2 1 0細胞中，添加抗體試料至最終濃度爲3 V g / m 1，經2 4小時培養。作爲抗體試料，對於5 · 9所得 之來自CHO細胞的MAB L 2單鏈F v之單體以及二聚 物、且由5 · 1所得之來自大腸桿菌細胞的同單體以及二 聚物，而對照組則使用老鼠1 g G抗體進行檢討。培養後 ，進行 Annexm — V 染色，以 FACScan 裝置（BECTON DICKINSON公司製）進行螢光強度的測定。 又，第2種實驗步驟爲，於5 X 1 0 4個之h I A P / L 1 2 1 0細胞中，添加抗體試料至最終濃度爲3 // g / _ m 1，經2小時培養後添加抗F L A G抗體（SIGMA公司 製）至最終濃度爲1 5 // g / m 1，再培養2 2小時。作 爲抗體試料，對於5 · 9所得之來自C Η〇細胞的 M A B L 2單鏈F ν之單體，以及作爲對照組則使用老鼠 1 g G抗體進行檢討◦培養後，進行Annexin - V染色，以 FACS can裝置進行螢光強度的測定。 以Annexin — V染色作解析的結果分別如圖2 5至3 1 所示◦其結果，C Η 0細胞以及大腸桿菌細胞產生之 M A B L — 2抗體的單鏈F ν聚肽之單體與對照組（圖 2 5 )作比較，顯示明顯的細胞死亡誘發現象（圖2 6、 2 7 )，但對於C Η〇細胞以及大腸桿菌細胞產生之單鏈 F ν聚肽的單體則無被認定有細胞凋亡誘發作用（圖2 8 、2 9 )。又，因添加抗F L A G抗體，C Η〇細胞以及 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 衣. 、11
本紙張尺度適用中國國家標參（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A7 B7 五、發明説明（44) 大腸桿菌細胞產生之單鏈F v聚肽的單體與對照組（圖 3 0 )作比較顯示顯著的細胞死亡誘發現象（圖3 1 )。 5 · 1 4對s c Fv/CH〇聚肽的單體以及二聚物之人 類骨髓瘤老鼠模型之抗腫瘤效果 (1 )老鼠血淸人類I g G定量法 對於老鼠血淸中，產生人類骨髓瘤細胞的人類I g G (Μ蛋白質）的定量，以下述E L I S A進行。以〇 . 1 %碳酸氫鹽緩衝液（P Η 9 . 6 )稀釋至1 // g / m 1的 羊抗人類I g G抗體（BI〇SOURCE公司製， L〇t #790 2)其1 0〇// 1加入9 6格的培養皿中 (Nunc公司製），4 °C下經一晚的恆溫培養，將抗體固相 .化。經封閉步驟後，經階段式稀釋的老鼠血淸或作爲標本 ，添加100//1的人類IgG (Cappe 1公司製， L 〇 t # 0 0 9 1 5 )，於室溫下作2小時的恆溫培養。 洗淨後，加入1 0 0 // 1經5 0 0 0倍稀釋的鹼磷酸酶標 識抗人類I g G抗體（BI0S0URCE公司製，L 〇 t # 6 2 0 2 )，室溫下恆溫培養1小時。洗淨後，加入基質 溶液進行恆溫培養後，使用MICRO PLATE READER Model 3550 ( BioRad公司製）測定4 0 5 n m的吸光度，由標本 的人類I g G之吸光度所得之校正曲線，算出老鼠血淸中 人類IgG(M蛋白質）濃度。 (2 )投與抗體的調製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） ~ -47- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（45) s c F v / C Η〇聚肽的單體以及二聚物，於投與當 日使用過濾滅菌的P B S (-），調製如〇 · 4 m g / m 1 、Ο · 2 5 m g / m 1作爲投與試藥。 (3 )人類骨髓瘤老鼠模型的製作 人類骨髓瘤模型如以下製作。使用含有S C I D老鼠 (日本clear )作體內傳代培養的Κ Ρ Μ Μ 2細胞（特開平 7 — 2 3 6 47 5號公報）之RPMI 1 6 4〇培養基（ GIBCO BRL公司製）調製至3 X 1 0 7個/ m 1 。另外以 1 0 0 // 1的抗asialoGMI抗體（和光純藥公司製，1管中 溶解5 m 1 )作皮下投與的S C I D老鼠（雄，6週）（ 日本clear )注入上述Κ Ρ Μ Μ 2細胞懸濁液2 0 0 // 1 ( 6 X 1 0 6個/老鼠）於尾靜脈上。 (4 )抗體投與 對（3 )所製作的人類骨髓瘤老鼠模型，移植 Κ Ρ Μ Μ 2細胞後3天、1天2次、進行3天、上述（2 )所調製的投與試藥、單體爲2 5 0 // 1 、二聚物爲 4 0 0 // 1作尾靜脈的投與◦作爲對照組，過濾滅菌的 Ρ B S (-）同樣地1天2次、進行3天，2 0 0 // 1作 尾靜脈投與。兩群皆爲7隻老鼠。 (5 )對s c F ν / C Η〇聚肽的單體以及二聚物之人類 骨髓瘤移植老鼠模型之抗腫瘤效果作評價 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -48- 1241345 A7 B7 五、發明説明（46) 對s c F v / C Η〇聚肽的單體或二聚物之人類骨髓 瘤老鼠模型之抗腫瘤效果，產生該骨髓瘤細胞的人類 1 g G ( Μ蛋白質）之老鼠血淸中量的變化、以及生存時 間作評價。對於老鼠血淸中人類I g G量的變化，採出移 植Κ Ρ Μ Μ 2細胞後第2 4天的血淸，如上述（1 )使用 E L I S Α測定人類I g G量。其結果，P B S (-）投 與群中，對血淸人類I g G ( Μ蛋白質）量上升至約 8 5 0 〇 // g / m 1而言，s c F v / C Η〇二聚物投與 群其爲對照組的1 / 1 0以下顯示相當低値，由此可知s c F ν / C Η〇二聚物對於Κ Ρ Μ Μ 2細胞的增殖具有非 常強的抑制（圖3 2 )。另一方面，對於生存時間亦如圖 3 3所示，可知8〇?7/(：11〇二聚物投與群中與 P B S (-）投與群作比較顯示明顯的生存時間的延長。 由上述可知，s c F ν / C Η〇二聚物對於人類骨髓 瘤老鼠模型，顯示具有抗腫瘤效果。本發明的重建聚肽之 s c F ν / C Η〇二聚物之抗腫瘤效果，被考慮爲以該重 建聚肽所具有的細胞凋亡誘發作用爲基準。 i . 1 5紅血球凝集試驗 紅血球凝集試驗以及紅血球凝集的判定法，可以續生 化學試驗講座的免疫生化學硏究法（日本生化學會編、東 京化學同人）爲準實施。 健康人的血以肝素處理的注射筒採血，以P B S (-)作3次洗淨後，以P B S (-）調製至最終濃度爲2 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -49- 1241345 A7 ____ B7 五、發明説明（47) 之紅血球浮游液。檢測用樣品則使用作爲對照組的老鼠 I g G ( Zymed公司製），使用MABL — 2抗體、 C Η 0細胞產生的單鏈F v聚肽單體、二聚物、大腸桿菌 產生的單鏈F ν聚肽之單體與二聚物L ◦欲檢討紅血球的 凝集作用，使用falcon公司製的U底9 6格皿，添加50 // 1 /格的上述抗體樣品，再添加5 0 // 1的2 %紅血球 浮游液，經混合，於3 7 °C下恆溫培養2小時後於4 °C下 保存一晚，判斷其凝集。又，作爲對照組，添加P B S ( 一）5 0 // 1 /格，與抗體樣品相同進行凝集試驗。抗體 的最終濃度爲老鼠I g G、M A B L - 1抗體爲0 . 0 1 、0 · 1、1、10、100//g/ml 、單鏈 Fv 爲 〇.〇〇4、〇.〇4、0.4、4、40、80//g/ m 1，而僅大腸桿菌產生的單鏈F v聚肽之二聚物則設定 1 6 0 β g /m 1的用量。其結果，如下述表2所不， M A B L - 2抗體中0 . 1 // g / m 1以上發現有紅血球 凝集現象，而單鏈F v聚肽中單體、二聚物則無發現紅血 球凝集現象。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -50- 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（48) 产~\ 6 =L 、^〆 a =L 〇 i^ s n S i i S i i 2 | ： ? I I 5 1 1 Ξ I ΐ + I I 1 1 + -Η I + + 寸 ο I I 寸 ο 1 1 r—Η o I + 寸 ° I I o 寸 ° 1 1 o r~" Η ° I I ο 寸 o 〇 I I 〇 寸 〇 〇 1 1 〇 酵' I I iS Si 1 _ 1 1 4—> Ο a 4—» r-H CNI I 〇 m ^ < a s 酹1 1 〇 ο u u > > (¾ (¾ 〇 o 〇0 0〇 m Qnn nml nmf -i—1 · i-Η r—H r—H 〇 〇 o 〇 W W > > Ph P^h o o oo 〇〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -51 - 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明说明（49) 〆 實施例6含有2個Η鍵V區域以及2個L鍵V區域的 重建聚肽s c ( F ν ) 2以及具有種種長度肽連接體之 MABL - 2 抗體 s cFv 6.1 B L - 2抗體s c ( F v ) 2表現質體之構築_ 欲製作表現含有來自M A B L 一 2抗體的2個Η鏈V 區域以及2個L鏈V區域之重建聚肽〔s c ( F ν ) 2〕的 質體，前述P C Η Ο Μ 2 (含有編碼來自M A B L — 2抗 體的s c F ν之D N A )如下述以P C R法修飾，所得之 DNA片段導入P CH0M2中。 使用於P C R的引子，作爲有意引子，使用與編碼 E F 1 α的D Ν A雜交之E F 1引子（序列號碼：3 0 ) ，作爲無意引子，使用與編碼L鍵V區域的C末端之 D Ν A雜交且編碼連接區域之D Ν A序列（序列號碼： 1 9 )以及具有S a 1 I限制酶辨識位置的V L L A S引 子（序列號碼：3 1 )。 PCR溶液100//1中含有，10//1的l〇x p c R 緩衝液 Π、1 m Μ M g C 1 2、Ο . 2 m Μ dNTPs (dATP， dGTP， dCTP， dTTP) 、5單位的K〇D DNA聚合酶（以上爲東 洋紡公司製）、1 // M的各引子，以及1 〇 〇 n g的模板 D N A ( p C Η〇Μ 2 ) 。P C R溶液以9 4 °C下3〇秒 、5 0 °C下3 0秒以及7 4 °C下1分鐘，以此順序加熱。 此溫度循環進行3 0次重複。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· ,ιτ
-52- 1241345 A7 B7 五、發明説明（50) P C R 生成物使用 QIAquik PCR Purification Kit ( QIAGEN公司製）純化，以S a 1 I消化，所得的D N A片 段以p B1 u e s c r i p t K S 1載體（東洋紡公司製）純系化。 D N A序列決定後，含有正確D N A序列的D N A片段之 質體以S a 1 I消化，所得之D N A片段與經S a 1 I消 化的 p C Η 〇 Μ 2 使用 Rapid DNA Ligation Kit ( BOEHRINGER MANNHEIM公司製）作連糸吉。D N A序歹i]決 定後，含有正確DNA序列的DNA片段命名爲 ?(：11〇¥2 (?7)2(參考圖34)。含於質體 p C Η〇Μ 2 ( F v ) 2區域的鹼基序列以及胺基酸序列以 序列號碼：3 2表示。 6 · 2具有種種長度肽連接體的M A B L - 2抗體s c F v表現質體的製作 具有種種長度的肽連接體，以〔Η鏈〕一〔L鏈〕（ 以下爲HL) 、 〔L鏈〕一〔Η鏈〕（以下爲LH)方式 與V區域連接的s c F ν，來自M A B L — 2的Η鏈以及 L鏈c D Ν Α作爲模板如下述製作。 製作HL型的s cFv時，首先以pCH〇M2 ( F ν ) 2作爲模板以C F H L — F 1 (序列號碼：3 3 )
以及C F H L — R 2 (序列號碼：3 4 )引子、C F H L 一 F 2 (序列號碼：3 5 )以及C F H L — R 1引子（序 列號碼·· 3 6 )，使用Κ〇D聚合酶進行9 4 °C下3 0秒 、6 0 °C下3 0秒以及7 2 °C下1分鐘的反應作5次重複 本紙張尺度適用中國國家標车（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -53- 1241345 A7 B7 五、發明説明（51) PCR反應，CFHL — F1以及CFHL — R1引子則 再做3 0次循環反應至做出不含連接體的H L 一 〇型之 c D N A。 製作LH型的s cFv時，首先以含有MABL — 2 的L鏈以及Η鏈V區域之c DNA的質體P G EM — M2 L以及PGEM — M2H (參考特願平1 1 — 6 3 5 5 7 )作爲模板，分別使用τ 7 (序列號碼·· 3 7 )以及 C F L Η — R 2 (序列號碼：3 8 )引子、c F L H — F 2 (序列號碼：3 9 )以及C F L· Η - R 1 (序列號碼 :4 〇 )引子，以K〇D聚合酶（東洋紡）進行9 4 °c下 3〇秒、6 0 °C下3 0秒以及7 2 t：下1分鐘的反應作 3 0次重複P C R反應。此反應產物作爲模板，使用 C F L Η — F 4 (序列號碼：4 1 )以及 c F L H — R 1 引子進行9 4 °C下3 0秒、6 0 °C下3 0秒以及7 2 °C下 1分鐘的反應作3 0次重複P CR反應，製造未含連接體 的LH— 0型之cDNA。 如此製作出的LH— 0、HL· — 0型的cDNA以限 制酶E c 〇 R I 、B a m Η I (寶酒造）處理，將不含 X h ο I限制酶切斷部位之哺乳動物表現質體 I N P E P 4使用L1 g a 11 η Η1 g h (東洋紡）導入，轉形勝任 細胞大腸桿菌J M 1 〇 9 ( NlPP〇n2ene )。經轉形的大腸 桿菌使用q〗AGEN Plasmid Maxi Kit ( QIAGEN )純化質體 。如此製得質體p C F 2 LH— 〇以及p C F2HL-0 本紙張尺度適用中國國家標奉（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -54- 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（52) 在欲製得相異連接體尺寸的表現質體，H L型以 p C F 2 H L — 0作爲模板，作爲C F H L - X 3 (序列 號碼：4 2 ) 、C F H L — X 4 (序列號碼：4 3 )、 CFHL — Χ5 (序列號碼：44) 、CFHL - Χ6 ( 序列號碼：4 5 )、或C F H L - X 7 (序列號碼：4 6 )的有意引子以及無意引子，使用與載體序列互補的 B G Η — 1 (序列號碼·· 4 7 )引子，以Κ〇D聚合酶（ 東洋紡）進行9 4 〇C下3 0秒、6 0 °C下3 0秒以及7 2 。(：下1分鐘的反應作3 〇次重複P C R反應，所得的反應 產物以限制酶X h ◦ I、B a m Η I (寶酒造）處理。所 得之片段於P C F 2 H L — 0的X h ο I 、B a m Η I位 置使用Ligation High (東洋紡）作導入，轉形勝任細胞大 腸桿菌J Μ 1 0 9。經轉形的大腸桿菌使用Q1 AGEN Plasmid Maxi Kit純化質體。如此製得質體P C F 2 H L -3、pCF2HL — 4、PCF2HL — 5、 pCF2HL — 6以及PCF2HL — 7。且欲製造使用 於C〇S 7細胞的過渡性表現之表現質體，P C F 2 H L 一〇、PCF2HL — 3、PCF2HL — 4、 PCF2HL — 5、PCF2HL — 6 以及 PCF2HL 一 7以限制酶E c 〇 R I以及B a m Η I (寶酒造）處理 ，由約8 0 0 b ρ的片段以瓊膠電泳法由膠體中回收而純 化。所得的片段以哺乳動物細胞表現負體P C 0 S 1的 E c 〇 R I以及B a mH I位置使用LigationHigh導入， 轉形勝任細胞大腸桿菌D Η 5 α (東洋紡）。如製作得表 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -55- 1241345 A7 B7 五、發明説明（53) 現質體 CF2HL — 0/pC〇Sl 、CF2HL — 3/ pC〇Sl 、 CF2HL — 4/ pC〇Sl 、 CF2HL —5/pC〇Sl 、CF2HL — 6/pC〇Sl 以及 CF2HL — 7/pC〇Sl。做爲代表例子，質體 CF2HL — 0/pC〇Sl的構造如圖35所示，含於 此的M A B L 2 — s c F v〈 H L — 〇〉的鹼基序列以及 胺基酸序列如序列號碼：4 8所示。又，各質體的連接體 部分之鹼基序列以及胺基酸序列如圖3 6所示。 又，在欲製得相異連接體尺寸的L Η型的表現質體， 以PCF2LH— 0作爲模板，作爲CFLH — Χ3 (序 列號碼·· 4 9 ) 、C F L Η - X 4 (序列號碼·· 5 0 )、 CFLH — Χ5 (序列號碼：51) 、CFLH — Χ6 ( 序列號碼：5 2 )、或C F L Η - X 7 (序列號碼：5 3 )的有意引子以及無意引子，使用與載體序列互補的 B G Η — 1 (序列號碼：4 7 )引子，以Κ〇D聚合酶進 行9 4 °C下3 0秒、6〇°C下3〇秒以及7 2 °C下1分鐘 的反應作3 0次重複P C R反應，所得的反應產物以限制 酶X h ο I 、B a m Η I處理。所得之片段於 ?〇?2匕11—〇的111〇1、88 111^^位置使用 L1 g a 11 ο η Η1 g h作導入，轉形勝任細胞大腸桿菌D Η 5 α ( 東洋紡）。經轉形的大腸桿菌使用QIAGEN Plasmid Maxi Kh純化質體。如此製得質體p C F 2 L Η - 3、 PCF2LH— 4、PCF2LH - 5、PCF2LH — 6以及p C F 2 L Η — 7。且欲製造使用於c〇s 7細胞 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -56- 1241345 濟 部 智 慧 財 產 局 員 X 消 f 合 作 社 印 製 Α7 Β7 五、發明説明（54) 的過渡性表現之表現質體，P C F 2 L Η - 0、 PCF2LH-3、pCF2LH— 4、p C F 2 L Η -5、pCF2LH— 6以及pCF2LH— 7以限制酶 E c 〇 R I以及B a m Η I (寶酒造）處理，由約8〇〇 b ρ的片段以瓊膠電泳法由膠體中回收而純化。所得的片 段以哺乳動物細胞表現質體p C〇S 1的E c ◦ R I以及 B a m Η I位置使用Ligation High導入，轉形勝任細胞大 腸桿菌D Η 5 α (東洋紡）。如製作得表現質體 CF2LH — 〇/pC〇Sl 、 CF2LH— 3/ pC〇Sl 、 CF2LH— 4/pC〇Sl 、 CF2LH —5/pC〇Sl 、CF2LH— 6/pC〇Sl 以及 CF2LH— 7/pC〇Sl。做爲代表例子，質體 CF2LH— 〇/pC〇Sl的構造如圖37所示，含於 此的M A B L 2 — s c F v〈 L Η — 〇〉的鹼基序列以及 胺基酸序列如序列號碼：5 4所示。又，各質體的連接體 部分之鹼基序列以及胺基酸序列如圖3 8所示。 6 · 3對C〇S 7細胞的s c F ν以及s c ( F ν ) 2之： (1 )含血淸培養基之培養上淸液的調製 欲使HL型、LH型s cF ν以及s c (F ν) 2之表 現，進行C〇S 7細胞（JCRB9127、human science振興財 團）的過渡性表現。C 0 S 7細胞於含有1 0 %牛胚胎血 淸（HyClone )的D Μ E Μ培養基（GIBCO BRL公司製） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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-57- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（55) 中進行3 7 °C的碳酸氣恆溫槽之傳代培養。 6.2所構築的〇?2^11^ — 〇，3〜7/ pCOSl，或 CF2LH —〇，3 〜7/pC〇Sl 或 pCH〇M2 (Fv) 2 載體，使用 Gene pulser 裝置（ BioRad公司製）以電穿透作用於c 〇 S 7細胞中作轉移感 染。 DNAClO/zg)與 DMEM(1〇％FBS， 5 m Μ B E S C S I G Μ Α公司））培養基中2 X 1〇7細 胞/ m L的〇 · 2 5 m L加入培養槽中。經1 〇分鐘靜置 後，將經電穿透作用的細胞與D Μ E Μ ( 1 0 % F B S ) 培養基混合，加入7 5 c m 3錐形瓶中。經7 2小時培養後 收集培養上淸液，經離心分離除去細胞破片，且以 0 · 2 2 μ m瓶頂過濾器（f A L C〇N )過濾，將此做 爲培養上淸液（C Μ )。 (2 )無血淸培養基下的培養上淸液之調製 與上述（1 )相同方法經電穿透作用的細胞加入D Μ Ε Μ ( 1 〇 % F B S )培養基於7 5 c m 3錐形瓶中，經 一夜培養後捨去培養上淸液，以P B S洗淨後，添加 (：11〇一8 — 8卩減11培養基（0130〇3尺1^公司製）。 經7 2小時培養後收集培養上淸液，經離心分離除去細胞 破片，且以0 · 2 2 // m瓶頂過濾器過濾，得到C Μ ◦ 6 . 4 C 0 S 7 CM 中的 scFv 以及 sc (Fv)2 的 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
-58- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（56) 檢測 前述6·3 (2)中調製出的C0S7之CM中，種 種MABL2— scFv以及sc (Fv)2之聚肽如下述 以蛋白質印跡術進行檢測。 對各C〇S7 CM進行SDS — PAGE，轉印至 REINFORCED NC 膜（Schleicher & Schuell 公司製）。進行 5 %脫脂牛奶（森永乳業公司製）的封鎖步驟，以T B S 洗淨後加入抗F L A G抗體（SIGMA公司製）。於室溫下 恆溫培養以及洗淨後，加入過氧化酶標識抗老鼠I g G抗 體（Jackson Immuno Reserch公司製），室溫下恆溫培養以 及洗淨後，添加基質溶液，使其發色（圖3 9 )。 6 . 5流體細胞測定儀 欲測定對M A B L 2 - s e F v以及s c ( F v ) 2之 人類I A P抗原的測定，使用前述6 . 3 ( 1 )所調製出 的C 0 S 7細胞培養上淸液進行流體細胞測定。表現人類 I A P的老鼠白血病細胞株L 1 2 1 0細胞2 X 1 0 5個中 ，由實施例6 . 3 ( 1 )所得之培養上淸液作爲對照組， 加入C 0 S 7細胞的培養上淸液，於冰上作恆溫培養以及 洗淨後，加入1 0 // g / m L的老鼠抗F L A G抗體（ SIGMA公司製），經恆溫培養以及洗淨後，加入F I T C 標識抗老鼠I g G抗體（BECTQN DICKINSON公司製）。 再次恆溫培養以及洗淨後，以FACScan裝置（BECTON DICKINSON公司製）測定螢光強度。其結果，顯示具有各 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
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-59- 1241345 A7 ___B7 五、發明説明（57) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) C〇S 7培養上淸液的種種長度肽連接體之M A B L 2 -s c F v以及s c ( F v ) 2顯示對人類I A P的較高親和 性（圖4 0 a以及b )。 6 · 6體外的細胞凋亡誘發效果 前述1 · 3 ( 1 )所調製出的C〇S 7細胞培養上淸 液，對人類I A P經基因導入的L 1 2 1 0細胞（ h I A P / L 1 2 1 0 )之細胞凋亡誘發作用經Annexm — V ( BOEHRINGER MANNHEIM公司製）染色而檢討。 h I A P / L 1 2 1 0細胞5 X 1 0 4個中，添加各載 體作轉形之C 〇 S 7細胞培養上淸液，或作爲對照組添加 C〇S 7細胞培養上淸液至最終濃度爲1 0 %，經2 4小 時培養。其後進行Annexin — V/P I染色，以FACScan裝 置（BECTON DICKINSON公司製）測定螢光強度。其結果 ，C 0 S 7 CM 中的 scFv〈HL3， 4， 6， Ί、 LH3，4，6，7> 以及 sc (Fv)2 對 hlAP/ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 L 1 2 1 0細胞顯示明顯的細胞死亡誘發現象。所得結果 分別如圖4 1所示。 6 , 7 C 0 S 7 CM 中的 scFv 以及 sc(Fv)2 的C Η〇細胞用表現載體之構築 以培養上淸液純化前述M A B L 2 — _ s c F v以及 s c ( F v ) 2爲目的，欲表現於這些C Η〇細胞中之表現 載體如下述構築。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -60 - 1241345 A7 --- — B7___ 五、發明説明（58) 將如前述1·2所調製出的PCF2HL-0， 3- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 7 以及 pCF2LH —〇，3 〜7 的 EcoRI — BamHI片斷，CH〇細胞用表現載體PCH〇1之 E c 〇 R I以及B a mH I部位使用Ligation high導入， 轉形勝任細胞大腸桿菌D Η 5 α。轉形後的大腸桿菌以 QIAGEN Plasmid Midi Kit ( QIAGEN )純化質體◦如上述製 得表現質體pCH〇M2HL-〇， 3〜7以及 PCH0M2LH —〇，3 〜7 。 U MABL2-SCFV (HL-Q, 3 〜7〉、 M—A BL2 — scFv〈LH— 0，3 〜7〉以及 sc ( F_v ) 2表現C Η 0細胞之製作與其培養上淸液的調製 前述1·7構築的表現質體PCH0M2HL—〇， 3〜7以及pCH〇M2LH —〇，3〜7與 P C Η〇Μ 2 ( F v ) 2載體如下述於C Η〇細胞中進行轉 形，製作可恆定表現各重建聚肽之C Η 0細胞。作爲其代 表例子的MABL2 — scFv〈HL - 5〉、使 sc ( 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 F v ) 2能恆定表現之C Η〇細胞的製作如下述。 表現質體P CHOM2HL — 5以及P CH0M2 (F ν ) 2以限制酶Ρ ν u I消化成直鏈狀，將這些使用 Gene Pulser裝置（BioRed公司製）作電穿透作用使CH〇 細胞作轉移感染。D N A ( 1 〇 // g )與P B S中1 X 1〇7細胞/m 1的〇 · 7 5 m 1加入培養槽中，於1 · 5 k V、2 5 // F的容量中施於脈衝。室溫下經1 0分鐘的 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -61 - 1241345 A7 _ B7 五、發明説明（59) 回復時間後，將經電穿透作用處理的細胞，加入含有i 〇 %的牛胚胎血淸之不含核酸的α - Μ E Μ培養基（GIBC〇 BRL公司製）進行培養。約2星期的培養後，以含有最終 濃度爲1 Ο nM的methotrexate ( SIGMA公司製）之培養 基中進一步培養，其後繼續以5 0 η Μ、1 0 〇 n M的濃 度依序上升而培養。此所得之細胞於旋轉瓶中以無血淸培 養基CH〇一S — SFMI Γ ( GIBC〇BRL公司製）培養 後，收集培養上淸液，經離心分離除去細胞破片，且以 2 0 // m過濾器過濾，分別得到0減。 同樣地，得到可恆定表現M A B L 2 - s c F v〈 HL —〇，3， 4， 6， 7〉以及〈LH— 0， 3， 4， 5， 6，7〉的C Η ◦細胞以及其C Μ。 6 · 9MABL2— scFv〈HL — 5〉的二聚物以及 s c ( F v ) 2的純化 依據實施例5 · 9，濃縮前述6 · 8所得之C Μ，以 Blue-sepharose、羥基磷灰石以及膠體過濾的三種色譜分析 法進行MABL2 — scFv〈HL — 5〉以及 sc ( F v ) 2的純化。 6 · 1 0純化s c F v〈 H L — 5〉的二聚物以及s c ( F ν ) 2的抗原結合活性評價 測定純化的M A B L 2 — s c F ν 〈 H L — 5〉的二 聚物以及s c ( F ν ) 2對人類I A Ρ抗原之結合，進行流 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' " -62- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A7 B7 五、發明説明（60) 體細胞測定。表現人類1 A P的老鼠白血病細胞株 L 1 2 1〇細胞（h I A P / L· 1 2 1 0 )，或做爲對照 組，以p C〇S 1載體轉移感染後的L 1 2 1 0細胞（ PCOS1/L1210) 2X105 個中，加入 l〇"g / m L 的純化 M A B L 2 — s c F v〈 H L 5〉之二聚物 、M A B L 2 — s c ( F v ) 2、作爲陽性對照組爲單株 抗體M A B L - 2、作爲陰性對照組爲老鼠1 S G (
Zymed公司製），於冰上作恆溫培養以及洗淨後加入1 〇 // g / m L的老鼠抗F L A G抗體（S I G Μ A公司製） 。經恆溫培養以及洗淨後加入F 1 T c標識抗老鼠 I g G抗體（BECTON DICKINSON公司製）。再次恆溫培 養以及洗淨後，以FACScan裝置（BECTON DICKINSON公 司製）測定螢光強度。 其結果，因純化的M A B L 2 — s c F v〈 H L — 5 〉的二聚物以及MABL2— sc (Fv)2 與 hlAP/ L 1 2 1 0細胞作專一性結合，s c F v〈 H L - 5〉的 二聚物以及s c ( F ν ) 2對人類I A Ρ抗原顯示較高的親 和性（圖4 2 )。 6 · 1 1 純化 M A B L 2 — s c F v〈 H L — 5 > 的二聚 物以及s c ( F ν ) 2的體外細胞凋亡誘發效果 純化M A B L 2 — s c F v〈 H L - 5〉的二聚物以 及sc (Fv)2，對基因導入之人類ΙΑΡ的L12 10 細胞（h I A P / L 1 2 1 0 )以及人類白血病細胞株 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -63 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（61) C C R F — C E Μ之細胞凋亡誘發作用以Annexin — V ( BOEHRINGER MANNHEIM公司製）染色作檢討。 h IAP/L1 2 1〇細胞5乂104個或〇〇尺？一 C E Μ細胞1 X 1 〇 5個中，添加種種濃度的純化 MABL2 — scFv〈HL5〉之二聚物、MABL2 一 s c ( F ν ) 2、作爲陽性對照組爲單株抗體μ A B L -2、作爲陰性對照組爲老鼠Γ g G，經2 4小時培養◦其 後以 Annexin-V 染色，以 FACScan 裝置（BECTON DICKINSON公司製）測定螢光強度，其結果M A B L 2 — scFv〈HL — 5〉的二聚物以及 sc (Fv)2，對 h I A P / L 1 2 1 0、C C R F — C E M 的兩細胞隨濃 度誘導細胞死亡（圖4 3 )。 6 · 12純化s cFv〈HL — 5〉的二聚物以及s c ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
、1T F v 的紅血球凝集試驗 依據實施例5
施行種種濃度的s c F v
H L % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一 5〉的二聚物以及s c ( F ν ) 2之血液凝集試驗。 對單株抗體M A B L - 2 (陽性對照）中引起血液凝 固現象，而單鏈抗體MABL2 — S c (Fv) 2以及 MABL2-sc (Fv) 〈HL5〉並無凝集現象。又 ，使用M A B L — 2抗體的緩衝液亦幾乎無差異。其結果 如下述表3所示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -64- 1241345 A7 B7 五、發明説明（62) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〇〇 τ-< 〇 c3 , ^Γ) cn Ο Ο 1 i-i 〇 O , o o r—Η Ο Ο 1 ί' "Ή 寸 τ—Η c3 . CSI οο S ο . S S ο . τ—Η τ—< οο ΙΤΊ CS! C<l ο . J-ί ο . oo o o . τ—H S , cn S O . s 〇 寸 s r-H O . oo oo O . o , r-H S Ον Ο . oo c5 . cn \〇 § Τ—< 1 ί i 1 CNl S cn i un … ， ^Γ) C<i CS 〇 寸· l~~1 1 p ^t- τ—H | ON 〇6 CSI 1 〇 oo CN] , 〇 O 1 〇 Ο 1 CNl ¥ 1 Cj PQ < Λ 2 乂 ¥ 1 PQ < 6 寸 00ΌΟΟ600Ό S6I0.0 I6SO I_ostnro^is §Ό 3 ατ £ 2 ο 寸 oooi _ _ _ _ - _ I I I _+ + + + + + + + + - (pss)nPQvs 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (Irl) jgjjng 31233V:嫠·it 6 寸 00Ό868Ό S6SO I6SO Ι8/ΌΌ$ςΙΌ ςζΙΓΟυηδΌ S.I ς.ζ + + (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 、1Τ ς 01 0CNI§0001U8 + + + + + +
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-65 - 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（63) 6 · 1 3純化s c F v〈 H L — 5〉的一聚物以及s工_ F ν ) 2對人-類骨髓瘤老鼠模型之抗腫瘤-效果 經實施例6 · 8以及6 · 9製作、純化之s c F ν〈 H L — 5〉的二聚物以及s c ( F ν ) 2，施行抗腫瘤效果 試驗。具體而言使用實施例5 · 1 4 ( 3 )所製作的人類 骨髓瘤老鼠模型，對老鼠血淸中以E L 1 S Α定量產生人 類骨髓腫瘤細胞之M蛋白質，且記錄老鼠生存日數。因此 以血淸中Μ蛋白質質量的變化以及生存曰數評價純化之 s c F ν〈 H L - 5〉的二聚物以及s c ( F ν ) 2的抗腫 瘤效果。 且，對於本試驗H L — 5以及s c ( F v ) 2係以 vehicle ( 1 5 0 m Μ N a C 1 , 0-02% Tween 以 及2〇m M醋酸緩衝液，p Η 6 .〇）中〇·〇1 、 0 · 1或1 m g /m L的溶液，投與量爲0 · 1、1或 1 0 m g / k g投與於老鼠。又，對照組爲僅投與vehicle 〇 採取人類骨髓腫瘤移植後第2 6天的血淸，血淸中的 Μ蛋白質以E L I S A依據實施例5 · 1 4進行測定。其 結果，H L - 5投與群、二聚物以及s c ( F v ) 2投與群 同時出現血淸中的Μ蛋白質質量隨者投與量而減少（參照 僵4 4 )。又，對於其生存期間，H L - 5投與群（圖 4 5 )以及s c ( F ν ) 2投與群（圖4 6 )同時與對照組 (vehicle投與群）作比較觀察到生存期間延長。其結果表 示對於本發明的H L - 5以及s c ( F v ) 2於體內亦具有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -66- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（64) 優良的抗腫瘤作用。 產業上可利用件 本發明的重建聚肽，由彼具有誘發具有人類I A P的 有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集的特性 得知，可作爲急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急 性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、成人T細胞白血病 、多發性骨髓瘤、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia 等 白血病、惡性淋巴腫瘤（Hodgkin病、非Hodgkin淋巴腫瘤 )、再生不良性貧血、骨髓異形形成症候群、真性多血症 等血液疾病之治療藥係爲有用的。 圖面簡單說明 圖1 ·表示人類I g G抗體未與表現人類I A P之 L 1 2 1 0細胞（h I A P / L 1 2 1 0 )結合之流體細 胞測定結果圖。 圖2 .表示嵌合MAB L— 1抗體與表現人類1 AP 之L 1 2 1〇細胞（h I A P / L 1 2 1〇）作專一性結 合之流體細胞測定結果圖。 圖3·表示嵌合MABL-2抗體與表現人類1AP 之L 1 2 1 0細胞（h I A P / L 1 2 1 〇 )作專一性結 合之流體細胞測定結果圖。 圖4 .表示本發明的單鏈f v製作方法以模型方式表 示之圖。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、11
本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67- 1241345 A7 B7 五、發明説明（65) 圖5 ·表示編碼本發明的單鏈f v之D N A可表現於 大腸桿菌中而使用的表現質體之一例子構造圖。 圖6 ·表示編碼本發明的單鏈F v之D N A可表現於 哺乳類動物細胞中而使用的表現質體之一例子構造圖。 圖7 ·表示實施例5 · 4所得之蛋白質印跡術所得之 結果照片。由左邊爲分子量標識（由上表示9 7 . 4、 66、45、31、21.5、14.5kDa)、 p C Η〇1導入C〇S 7細胞培養上淸液、p C Η〇Μ 2 導入細胞培養上淸液。顯示p C Η Ο Μ 2導入細胞培養上 淸液含有重建MABL - 2抗體單鏈Fv (箭頭）。 圖8 ·表示作爲對照組的p C Η〇1 / C〇S 7細胞 培養上淸液之抗體，不與作爲對照組的p C〇S 1 / L 1 2 1 0細胞結合之流體細胞測定儀結果圖。 圖9 ·表示MABL2— scFv/C〇S7細胞培 養上淸液之抗體，表示不與作爲對照組的p C〇S 1 / L 1 2 1 0細胞結合之流體細胞測定儀結果圖。 圖1 0 ·表示作爲對照組的P C〇S 1 / C〇S 7細 胞培養上淸液之抗體，表示不與作爲對照組的h I A P / L 1 2 1 0細胞結合之流體細胞測定儀結果圖。 圖 11 •表不MABL2— SCFV/COS7 細胞 培養上淸液之抗體與h I A P / L 1 2 1 0細胞作專一性 結合之流體細胞測定儀結果圖。 圖1 2 .表示實施例5 . 6所示競爭（competitive ) E L I S A的結果圖，本發明的單鏈F v ( M A B L 2 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 -68- 1241345 A7 B7 五、發明説明（66) s c F v )的抗原結合活性，與作爲對照組的p C Η〇1 / C 0 S 7細胞培養上淸液作比較，以對老鼠單株抗體 M A B L - 2的抗原結合阻斷作爲指標所不圖。 圖1 3 .表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，作爲對照組的p C〇S 1 / L 1 2 1 0細胞中，作 爲對照組的p C Η〇1 / C〇S 7細胞培養上淸液抗體並 未誘發細胞凋亡現象。 圖1 4 ·表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，作爲對照組的p C〇S 1 / L 1 2 1 0細胞中， M A B L 2 — s c F ν / C〇S 7細胞培養上淸液抗體並 未誘發細胞凋亡現象。 圖1 5 ·表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，h I A P / L 1 2 1 0細胞中，作爲對照組 p C Η〇1 / C〇S 7細胞培養上淸液抗體並未誘發細胞 凋亡現象。 圖1 6 ·表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，對於h I A P / L 1 2 1 0細胞，M A B L 2 - s c F v / C〇S 7細胞培養上淸液抗體誘發專一性細胞 凋亡現象。 圖1 7 ·表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，C C R F — C E Μ細胞中，作爲對照組P C Η〇1 / C〇S 7細胞培養上淸液抗體未誘發細胞凋亡現象。 圖1 8 ·表示實施例5 · 7的細胞凋亡誘發效果之結 果圖，對於C C R F — C Ε Μ細胞，M A B L 2 — 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -69 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（67) s c F v / C〇S 7細胞培養上淸液抗體誘發專一性細胞 凋亡現象。 圖1 9 ·表示實施例5 · 9的來自C Η〇細胞產生之 M A B L - 2抗體單鏈F ν純化步驟中，Blue-sepharose柱 子所得部分使用羥基磷灰石進行純化時之色譜分析圖，得 到主要波峰部分A、部分B。
圖2 0 ·表示對於實施例5 · 9 ( 2 )所得之部分A 、部分B經膠體過濾而純化的結果圖，部分A由外觀看之 分子量約3 6 k D、部分B則爲7 6 k D的位置可溶出主 要波峰（分別爲A I以及B I )。 圖2 1 ·表示對於實施例5 · 9的來自C Η〇細胞產 生之M A B L — 2抗體的單鏈F ν純化步驟，其所得部分 以S D S - P A G E分析圖，皆爲分子量約爲3 5 k D的 單一帶。 圖2 2 ·表示對於來自C Η〇細胞產生的M A B L -2抗體之單鏈F ν純化，其所得之部分A I以及B I以膠 體過濾法分析結果圖，部分A I爲單體所成，部分B I爲 二聚物所成。 圖2 3 ·表示將編碼本發明的單鏈F ν之D Ν A，欲 於大腸桿菌的菌體內表現可使用的表現質體的一例子構造 圖。 圖2 4 ·表示實施例5 · 1 2的來自大腸桿菌產生的 M A B L - 2抗體之單鏈F ν聚肽的純化中，所得粗製物 使用膠體過濾柱子之純化結果圖。各波峰分別爲大腸桿菌 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -70- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（68) 細胞產生的單鏈F v之單體、二聚物。 圖2 5 ·表示實施例5 . 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中h I A P / L 1 2 1 0細胞中，作爲對照組 的老鼠I g G抗體未誘發細胞凋亡現象（最終濃度爲3 μ g / m 1 )。 圖2 6 ·表示實施例5 . Γ 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中對h I A P / L 1 2 1 0細胞中，C Η〇細 胞產生的M A B L 2 — s c F ν二聚物顯示顯著的誘發細 胞凋亡現象（最終濃度爲3 // g / m 1 )。 圖2 7 ·表示實施例5 . 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中對h I A P / L 1 2 1 0細胞中，大腸桿菌 細胞產生的M A B L 2 - s c F ν二聚物顯示顯著的誘發 細胞凋亡現象（最終濃度爲3 μ g /m 1 )。 圖2 8 ·表示實施例5 . 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中h I A P / L 1 2 1 0細胞中，C Η〇細胞 產生的MABL2 - s cFv單體之細胞凋亡誘發作用與 對照組同程度（最終濃度爲3 // g / m 1 )。 圖2 9 ·表示實施例5 · 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中對h I A P / L 1 2 1 0細胞中，大腸桿菌 細胞產生的M A B L 2 - s c F ν單體之細胞凋亡誘發作 用與對照組同程度（最終濃度爲3 // g / m 1 )。 圖3 0 ·表示實施例5 . 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中對h I A P / L 1 2 1 0細胞中，作爲對照 組的老鼠I g G抗體，既使添加抗F L A G抗體亦無顯示 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、1Τ Φ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -71 - 1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（69) 細胞凋亡誘發現象（最終濃度爲3 μ g /m 1 ) ° 圖3 1 ·表示實施例5 · 1 3的細胞凋亡誘發效果之 結果圖，其中對h I A P / L 1 2 1 0細胞中，C Η〇細 胞產生的MABL2-scFv單體，因添加抗FLAG 抗體而顯示顯著的細胞凋亡誘發現象（最終濃度爲3 // g /ml)。 圖3 2 ·表示定量移植人類骨髓瘤細胞株Κ Ρ Μ Μ 2 的老鼠血淸中之人類I g G量者，測定對老鼠的人類骨髓 瘤所產生之人類I g G量的結果圖，s c F v / C Η〇二 聚物顯示非常強的Κ Ρ Μ Μ 2細胞增殖之抑制作用。 圖3 3 ·表示腫瘤移植後老鼠之生存日數，對於 s c F ν / C Η〇二聚物投與群其生存時間顯著延長。 圖3 4 ·表示表現含有來自ΜΑ B L - 2抗體的2個 Η鏈V區域以及2個L鏈V區域之重建聚肽 〔s c ( F ν ) 2〕的質體例子構造圖。 圖3 5 ·表示欲表現如〔Η鏈〕一〔L鏈〕方式連結 V區域，且不含聚肽連接體之s cFv (HL型）的質體 例子構造圖。 圖3 6 ·表示H L型的聚肽構造以及聚肽連接體之胺 基酸序列。 圖3 7 ·表示欲表現如〔L鏈〕一〔Η鏈〕方式連結 V區域，且不含聚肽連接體之s cFv (LH型）的質體 例子構造圖。 圖3 8 ·表示L Η型的聚肽構造以及聚肽連接體之胺 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、11 #· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -72- 1241345 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（70) 基酸序列。 圖3 9 ·表示實施例6 · 4的蛋白質印跡術之結果圖 ，顯示表現含有2個Η鏈V區域以及2個L鏈V區域之重 建聚肽s c ( F ν ) 2以及具有種種長度的聚肽連接體之 MABL — 2 抗體 scFv〇 圖4 0 a以及b表示使用實施例6 · 3 ( 1 )所調製 出的C 0 S 7細胞培養上淸液之流體細胞測定儀結果圖， 其中具有種種長度的聚肽連接體之M A B L 2 — s c F v 以及s c ( F v ) 2，顯示具有對人類I A P較高之親和性 ο 圖4 1 ·表示實施例6 · 6的細胞凋亡誘發效果結果 圖，其中scFv〈HL3，4， 6， 7、LH3， 4， 6，7〉以及 s c ( F v ) 2 對於 h I A P / L 1 2 1 0 細 胞顯示顯著的細胞死亡誘發作用。 圖4 2 .表示實施例6 · 1 0的抗原結合評價之結果 圖，其中scFv〈HL5〉的二聚物以及sc (Fv)2 對於人類I A P具有較高親和性。 圖4 3 .表示實施例6 · 1 1的體外細胞凋亡誘發效 果之結果圖，其中MABL2—scF 〈HL5〉的二聚 物以及 M A B L 2 — s c ( F v ) 2 對於 h I A P / L 1 2 1 0、C C R F — C E M的兩細胞顯示隨濃度之細 胞死亡誘發作用。 圖4 4 ·表示對移植人類骨髓瘤細胞株Κ Ρ Μ Μ 2之 老鼠，其人類骨髓瘤所產生的血淸中之Μ蛋白質量的測定 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -訂 Φ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -73- 1241345 A7 B7 五、發明説明（71 ) 結果圖，其中顯示s c F v 〈 H L — 5〉以及 s c ( F ν ) 2對於Κ Ρ Μ Μ 2細胞的增殖具有非常強的抑 制作用。 圖4 5 .表示經腫瘤移植後的老鼠生存日數，對於 s c F ν〈 H L — 5〉投與群顯示顯著的生存時間之延長 〇 圖4 6 .表示經腫瘤移植後的老鼠生存日數，對於 s c ( F ν ) 2投與群顯示顯著的生存時間之延長。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -74- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ 序列表 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120〉誘發細胞凋亡的聚肽 <130> FOP-415 <141〉 2001-3- <150> US 09/523,095 <151〉 2000-3-10 <150〉 JP2000-115246 <151〉 2000-04-17 <150> JP2000-321822 <151〉 2000-10-20 <160〉 54 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 弓 |子 <400> 1 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210〉 2 <211> 27 <212〉 DNA<213>人造序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 -75- [241345 A7 B7 五、發明説明（分 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <223〉PCR 弓[子 <400> 2 ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27 <210〉 3 <211> 28 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223〉PCR 弓[子 <400〉 3 ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 弓仔---------- <400> 4 ggatcccggg agtggataga ccgatg 26 <210> 5 <211> 394 <212> DNA <213> Mus <220> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 -76- 1241345 A7 A7 B7 五、發明説明（3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <221> CDS <222> (1)... (393) <223〉 pGEM-MlL. 1-57;signal <400> 5 atg aag ttg cct gtt agg ctg Met Lys Leu Pro Val Arg Leu 5 gcg tcc age agt gat gtt gtg Ala Ser Ser Ser Asp Val Val 20 cct gtc agt ett gga gat caa Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin 35 cag age ett eta cac agt aaa Gin Ser Leu Leu His Ser Lys 50 eta cag aag cca ggc cag tet Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 65 tcc aac ega ttt tet ggg gtc Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 80 tca ggg aca gat ttc aca etc Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 95 gat ctg gga gtt tat ttc tgc Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 110 peptide, 58-394；mature peptide ttg gtg Leu Val atg acc Met Thr gcc tcc Ala Ser gga aac Gly Asn cca aag Pro Lys cca gac Pro Asp aag ate Lys lie tet caa Ser Gin ctg atg Leu Met 10 caa act Gin Thr 25 ate tet lie Ser 40 acc tat Thr Tyr 55 etc ctg Leu Leu 70 agg ttc Arg Phe 85 age aga Ser Arg 100 agt aca Ser Thr 115 ttc tgg Phe Trp cca etc Pro Leu tgc aga Cys Arg tta caa Leu Gin ate tac lie Tyr agt ggc Ser Gly gtg gag Val Glu cat gtt His Val att cct 45 lie Pro 15 tcc ctg 90 Ser Leu 30 tet agt 135 Ser Ser 45 tgg .tac 180 Trp Tyr 60 aaa gtt 225 Lys Val 75 agt gga 270 Ser Gly 90 get gag 315 Ala Glu 105 ccg tac 360 Pro Tyr 120 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（jlOX297公釐） 1241345 A7 B7 五、發明説明（7¾ acg tcc gga ggg ggg acc aa弩，ctg gaa ata aaa c 394 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 125 130 <210〉 6 <211> 409 <212> DNA <213> Mus
經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 <221〉 CDS <222〉⑴…（408) <223> pGEM-MIH. 1~57；signal peptide, 58-409imature peptide <400〉 6 atg gaa tgg age tgg ata ttt etc ttc etc ctg tea gga act gca 45 Met Glu Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala 5 10 15 ggt gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gac ctg 90 Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp Leu 10 25 30 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tcc tgc aag get tet gga 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca 180 Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gin Lys Pro 50 55 60 ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 225 Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -78 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（ ggt act aag tac aat gag aag ttc Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 80 吖· tea gag aaa tee tee age gca gcc Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ala 95 gcc tet gag gac tet geg gtc tac Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 110 tat agt tac gac gac tgg ggc caa Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gin 125 tea g 409 Ser aag ggc Lys Gly 85 tac atg Tyr Met 100 tac tgt Tyr Cys 115 ggc acc Gly Thr 130 aag gcc Lys Ala gag etc Glu Leu gca aga Ala Arg act etc Thr Leu aca ctg Thr Leu age age Ser Ser ggg ggt Gly Gly aca gtc Thr Val act 270 Thr 90 ctg 315 Leu 105 tac 360 Tyr 120 tee 405 Ser 135 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 <210〉 7 <211> 394 <212〉 DNA <213> Mus <220〉 <221> CDS <222〉 （1)··. (393) <223> pGEM~M2L. 1~57；signal peptide, 58-394imature peptide <400〉 7 - atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct 45 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro 5 10 15 ggt tee age agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca etc tee ctg 90 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 79 1241345 A7 B7 五、發明説明（7)
Gly Ser cct gtc Pro Val cag age Gin Ser ctg cag Leu Gin tcc aac Ser Asn tea gtg Ser Val gat ctg Asp Leu aeg ttc Thr Phe
Ser Ser Asp 20 agt ett gga Ser Leu Gly 35 ett gtg cac Leu Val His 50 aag cca ggc Lys Pro Gly 65 ega ttt tet Arg Phe Ser 80 aca gat ttc Thr Asp Phe 95 gga gtt tat Gly Val Tyr 110 gga ggg ggg Gly Gly Gly 125
Val Val Met gat caa gcc Asp Gin Ala agt aat gga Ser Asn Gly cag tet cca Gin Ser Pro ggg gtc cca Gly Val Pro aca etc atg Thr Leu Met ttc tgc tet Phe Cys Ser acc aag ctg Thr Lys Leu
Thr Gin 25 tcc ate Ser lie 40 aag acc Lys Thr 55 aaa etc Lys Leu 70 gac agg Asp Arg 85 ate age lie Ser 100 caa agt Gin Ser 115 gaa ata Glu lie 130
Ser Pro Leu tet tgc aga Ser Cys Arg tat tta cat Tyr Leu His ctg ate tac Leu lie Tyr ttc agt ggc Phe Ser Gly aga gtg gag Arg Val Glu aca cat gtt Thr His Val aaa c 394 Lys
Ser Leu 30 tea agt 135 Ser Ser 45 tgg tac 180 Trp Tyr 60 aaa gtt 225 Lys Val 75 agt gga 270 Ser Gly 90 get gag 315 Ala Glu 105 ccg tac 360 Pro Tyr 120 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 <210> 8 <211> 409 <212> DNA <213> Mus 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~80 1241345 A7 B7 五、發明説明（7、8 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 <220> <221> CDS 〈222> (1)··· (408) <223> pGEM~M2H. 1-57；signal peptide, <400> 8 atg g玆a tgg age tgg ata ttt etc ttc Met Glu Trp Ser Trp lie Ph^JLeu Phe 5 ggt gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin 20 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 35 tac acc ttc get aac cat gtt att cac Tyr Thr Phe Ala Asn His Val lie His 50 ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr 65 ggt act aag tat aat gag aag ttc aag Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 80 tea gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 95 gcc tet gag gac tet geg gtc tat tac Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 58-409；mature peptide etc ctg tea Leu Leu Ser 10 cag tet gga Gin Ser Gly 25 tcc tgc aag Ser Cys Lys 40 tgg gtg aag Trp Val Lys 55 att tat cct lie Tyr Pro 70 gac aag gcc Asp Lys Ala 85 atg gac etc Met Asp Leu 100 tgt gca aga Cys Ala Arg gga act Gly Thr cct gaa Pro Glu get tet Ala Ser cag aag Gin Lys tac aat Tyr Asn act ctg Thr Leu age age Ser Ser ggg ggt Gly Gly gca 45 Ala 15 ctg 90 Leu 30 gga 135 Gly 45 cca 180 Pro 60 gat 225 Asp 75 act 270 Thr 90 ctg 315 Leu 105 tac 360 Tyr (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -81 - [241345 A7 B7 五、發明説明（火 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
110 115 120 tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act etc aca gtc tee 405 Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 125 130 135 tea g 409 Ser <210> 9 <211〉32 <212> DNA<213〉人造序列 <220> , <223〉PCR 引子 <400〉 9 cccaagcttc caccatgaag ttgcctgtta gg 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA<213〉人造序列 <220〉 <223> PCR primer <400> 10 cccaagcttc caccatggaa tggagctgga ta 32 ' <210> 11 <211〉 34 <212> DNA (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -82- 1241345 A7 B7 五、發明説明（.ab n <213> Artificial Sequence <220> <223〉 PCR primer <400> 11 cgcggatcca ctcacgtttt atttccagct tggt 34 <210> 12 <211〉 34 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 12 cgcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt 34 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. <210> 13 <211〉 30 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 13 catgccatgg cgcaggtcca gctgcagcag 30 <210〉 14 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -83- 1241345 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（3) <220> <223〉PCR 引子 <400> 14 accaccacct gaggagactg tgagagt 27 <210〉 15 <211> 27 <212> DNA^：) <213>人造序列 〈220> <223〉PCR 引子 <400〉 15 gtctcctcag gtggtggtgg ttcgggt 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 16 cacaacatcc gatccgccac cacccga 27 <210〉 17 <211〉 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -84 - 1241345 A7 B7五、發明説明（必 <223〉PCR 引子 <400〉 17 ggcggatcgg atgttgtgat gacccaa 27 <210〉 18 <211> 57 <212〉 DNA <213〉人造序列
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <223〉PCR 引子 <400> 18 ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57 〈210〉 19 <211〉 45 h，Ji，' <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>連接體胺基酸序列與核苷酸 <400> 19 ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 5 10 15 <210〉 20 <211〉 828 <212〉 DNA ' <213> Mus (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -85- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ <220> <221> CDS <222〉⑴…（826) <223> pscMl. MABLl-scFv <400> 20 atg aaa tac eta ttg cct Met Lys Tyr Leu Leu Pro 5 get gee caa cca gee atg Ala Ala Gin Pro Ala Met 20 cct gac ctg gta aag cct Pro Asp Leu Val Lys Pro 35 get tet gga tac acc ttc Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 50 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 lb aeg gca Thr Ala geg cag Ala Gin ggg get Gly Ala gtt aac Val Asn cag aag Gin Lys tac aat Tyr Asn aca ctg Thr Leu age age Ser Ser cca ggg Pro Gly gat ggt Asp Gly act tea Thr Ser ctg gee Leu Ala cag ggc Gin Gly 65 act aag Thr Lys 80 gag aaa Glu Lys 95 tet gag Ser Glu 卜:r， Ctt gag Leu Glu tac aat Tyr Asn tee tee Ser Ser gac tet Asp Ser gee get Ala Ala 10 gtc cag Val Gin 25 tea gtg Ser Val 40 cat gtt His Val 55 tgg att Trp lie 70 gag aag Glu Lys 85 age gca Ser Ala 100 geg gtc Ala Val gga ttg Gly Leu ctg cag Leu Gin aag atg Lys Met atg cac Met His gga tat Gly Tyr ttc aag Phe Lys gee tac Ala Tyr tac tac Tyr Tyr tta tta Leu Leu cag tet Gin Ser tee tgc Ser Cys tgg gtg Trp Val att tat lie Tyr ggc aag Gly Lys atg gag Met Glu tgt gca Cys Ala etc 45 Leu 15 gga 90 Gly 30 aag 135 Lys 45 aag 180 Lys 60 cct 225 Pro 75 gee 270 Ala 90 etc 315 Leu 105 aga 360 Arg 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -86- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ώ ggg ggt Gly Gly aca gtc Thr Val ggt ggc Gly Gly cct gtc Pro Val cag age Gin Ser eta cag Leu Gin tee aac Ser Asn tea ggg *Ser Gly gat ctg Asp Leu tac tat Tyr Tyr tee tea Ser Ser gga teg Gly Ser agt ett Ser Leu ett eta Leu Leu aag cca Lys Pro ega ttt Arg Phe aca gat Thr Asp gga gtt Gly Val 110 agt tac Ser Tyr 125 ggt ggt Gly Gly 140 gat gtt Asp Val 155 gga gat Gly Asp 170 cac agt His Ser 185 ggc cag Gly Gin 200 tet ggg Ser Gly 215 ttc aca Phe Thr 230 tat ttc Tyr Phe 245 gac gac tgg Asp Asp Trp ggt ggt teg Gly Gly Ser gtg atg acc Val Met Thr caa gee tee Gin Ala Ser aaa gga aac Lys Gly Asn tet cca aag Ser Pro Lys w ’ gtc cca gac Val Pro Asp etc aag ate Leu Lys lie tgc tet caa Cys Ser Gin 115 ggc caa Gly Gin 130 ggt ggt Gly Gly 145 caa act Gin Thr 160 ate tet lie Ser 175 acc tat Thr Tyr 190 etc ctg Leu Leu 205 agg ttc Arg Phe 220 age aga Ser Arg 235 agt aca Ser Thr 250 ggc acc Gly Thr ggt ggt Gly Gly cca etc Pro Leu tgc aga Cys Arg tta caa Leu Gin ate tac lie Tyr agt ggc Ser Gly gtg gag Val Glu cat gtt His Val 120 act etc 405 Thr Leu 135 teg ggt 450 Ser Gly 150 tee ctg 495 Ser Leu 165 tet agt 540 Ser Ser 180 tgg tac 585 Trp Tyr 195 aaa gtt 630 Lys Val 210 agt gga 675 Ser Gly 225 get gag 720 Ala Glu 240 ccg tac 765 Pro Tyr 255 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） - 87- 1241345 Α7 Β7 五、發明説明（ά acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac 810 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Asp Tyr Lys Asp 260 265 270 gat gac gat aaa taa tga 828 Asp Asp Asp Lys <210> 21 <211> 31 <212> DNA 〈213〉人造序列 <220> <223〉PCR 引子 <400〉 21 acgcgtcgac tcccaggtcc agctgcagca g 31 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝.
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 22 <211〉 18 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉PCR 弓 f子 <400> 22 gaaggtgtat ccagaagc 18 <210> 23 <211〉 819 <212> DNA <213〉 Mus 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -88- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ώ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220〉 <221〉 CDS <222〉⑴…（813) <223> pCHOMl. MABLl-scFv <400> 23 atg gga.tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca 45 Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 5 10 15 ggt gtc gac tee cag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gac ctg 90 Gly Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp Leu 20 25 30 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tee tgc aag get tet gga 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca 180 Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gin Lys Pro 50 55 60 ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 225 Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 ggt act aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gee aca ctg act 270 Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 80 85 90 tea gag aaa tee tee age gca gee tac atg gag etc age age ctg 315 Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 95 100 105 gee tet gag gac tet geg gt〇vTi:ac tac tgt gca aga ggg ggt tac 360 Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 等 訂 -89- 1241345 〆 A7 B7 五、發明説明（8) 110 115 120 tat agt tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act etc aca gtc tee 405
Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 125 130 135 tea ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga 450
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 140 145 150 teg gat gtt gtg atg acc caa act cca etc tee ctg cct gtc agt 495 I Ser Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 155 160 165 ett gga gat caa gee tee ate tet tgc aga tet agt cag age ett 540
Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 170 175 180 eta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac eta cag aag 585
Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gin Trp Tyr Leu Gin Lys 185 190 195 cca ggc·cag tet cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tee aac ega 630 Pro Gly Gin Ser Pr'o Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg 200 205 210 TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA 675
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 215 220 225 gat ttc aca etc aag ate age aga gtg gag get gag gat ctg gga 720 - Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 230 235 240 gtt tat ttc tgc tet caa agt aca cat gtt ccg tac aeg tee gga 765
Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly 245 250 255 卜,,，r丨· 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝.
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -90- [241345 Α7 Β7 五、發明説明（8έ 卜:r， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 810 Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 aaa taa tga 819 Lys <210> 24 <211〉 828 〈212〉 DNA <213> MUs <220> <221〉 CDS <222〉（1)· ·· (822) <223> pscM2. MABL2~scFv <400> 24 atg aaa tac eta ttg cct aeg gca gee get gga ttg tta tta etc 45 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu 5 10 15 get gee caa cca gee atg geg cag gtc cag ctg cag cag tet gga 90 Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly 20 25 30 cct gaa ctg gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tee tgc aag 135 Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 35 40 45 get tet gga tac acc ttc get aac cat gtt att cac tgg gtg aag 180 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val lie His Trp Val Lys 50 55 60 cag aag cca ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat att tat cct 225 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 、11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -91 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（8》
Gin Lys Pro Gly tac aat Tyr Asn act ctg Thr Leu age age Ser Ser ggg ggt Gly Gly aca gtc Thr Val ggt ggc Gly Gly cct gtc Pro Val cag age Gin Ser ctg cag Leu Gin gat ggt Asp Gly act tea Thr Ser ctg gee Leu Ala tac tat Tyr Tyr tee tea Ser Ser gga teg Gly Ser agt ett Ser Leu ett gtg Leu Val aag cca Lys Pro
Gin Gly 65 act aag Thr Lys 80 gac aaa Asp Lys 95 tet gag Ser Glu 110 act tac Thr Tyr 125 ggt ggt Gly Gly 140 gat gtt Asp Val 155 gga gat G\y Asp 170 cac agt His Ser 185 ggc cag Gly Gin
Leu Glu ΚΓ， tat aat Tyr Asn tee tee Ser Ser gac tet Asp Ser gac gac Asp Asp ggt ggt Gly Gly gtg atg Val Met caa gee Gin Ala aat gga Asn Gly tet cca Ser Pro
Trp lie Gly 70 gag aag ttc Glu Lys Phe 85 acc aca gee Thr Thr Ala 100 geg gtc tat Ala Val Tyr 115 tgg ggc caa Trp Gly Gin 130 teg ggt ggt Ser Gly Gly 145 acc caa agt Thr Gin Ser 160 tee ate tet Ser lie Ser 175 aag acc tat Lys Thr Tyr 190 aaa etc ctg Lys Leu Leu
Tyr lie aag gac Lys Asp tac atg Tyr Met tac tgt Tyr Cys ggc acc Gly Thr ggt ggt Gly Gly cca etc Pro Leu tgc aga Cys Arg tta cat Leu His ate tac lie Tyr
Tyr Pro 75 aag gee 270 Lys Ala 90 gac etc 315 Asp Leu 105 gca aga 360 Ala Arg 120 act etc 405 Thr Leu 135 teg ggt 450 Ser Gly 150 tee ctg 495 Ser Leu 165 tea agt 540 Ser Ser 180 tgg tac 585 Trp Tyr 195 aaa gtt 630 Lys Val 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -92- 1241345 A7 B7 19/41 205 gac agg ttc Asp Arg Phe 220 ate age aga lie Ser Arg 235 caa agt aca Gin Ser Thr 250 gaa ata aaa Glu lie Lys 265 五、發明説明（9ά tcc aac cga ttt Ser Asn Arg Phe tea gtg aca gat Ser Val Thr Asp gat ctg gga gtt Asp Leu Gly Val aeg ttc gga ggg Thr Phe Gly Gly gat gac gat aaa Asp Asp Asp Lys 200 tet ggg Ser Gly 215 ttc aca Phe Thr 230 tat ttc Tyr Phe 245 ggg acc Gly Thr 260 taa tga gtc cca Val Pro，汀，’ etc atg Leu Met tgc tet Cys Ser aag ctg Lys Leu 828 agt ggc Ser Gly gtg gag Val Glu cat gtt His Val gac tac Asp Tyr 210 agt gga 675 Ser Gly 225 get gag 720 Ala Glu 240 ccg tac 765 Pro Tyr 255 aaa gac 810 Lys Asp 270 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 25 〈211〉 819 <212> DNA <213〉 Mus <220> <221> CDS <222〉（1). . · (813) <223〉 pCH0M2. MABL2_scFv <400〉 25 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca 45 Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 5 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公董） -93- 1241345 A7 B7 五、發明説明（9) ggt gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg 90
Gly Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tcc tgc aag get tct gga 135
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly k〆 35 40 45 tac acc ttc get aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca 180
Tyr Thr Phe Ala Asn His Val lie His Trp Val Lys Gin Lys Pro
ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 225
Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act 270
Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 80 85 90 tea gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac etc age age ctg 315
Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu 95 100 105 gcc tct gag gac tct geg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac 360
Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr 110 115 120 tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act etc aca gtc tcc 405
Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 125 - 130 135 tea ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga 450
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 140 145 150 teg gat gtt gtg atg acc caa agt cca etc tcc ctg cct gtc agt 495 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一 94- 1241345 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（9) Ser Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 155 160 165 ctt gga gat caa gcc tcc ate tet tgc aga tea agt cag age ett 540 Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 170 175 180 gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag 585 Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys 185 ’ 190 195 • \ cca ggc cag tet cca aaa etc ctg ate tac aaa gtt tcc aac ega 630 Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg 200 205 210 ttt tet ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tea gtg aca 675 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr 215 220 225 gat ttc aca etc atg ate age aga gtg gag get gag gat ctg gga 720 Asp Phe Thr Leu Met lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 230 235 240 gtt tat ttc tgc tet caa agt aca cat gtt ccg tac aeg ttc gga 765 Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255 ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 810 Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 aaa taa tga 819 Lys <210〉 26 <211> 456 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 lb -95- 1241345 A7 B7 五、發明説明（9¾ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222〉⑴…（450) <223〉pCHO-shlAP.可溶人類 IAP <400> 26 atg tgg ccc ctg gta gcg gcg ctg ttg ctg ggc teg geg tgc tgc 45 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys 5 10 15 gga tea get cag eta eta ttt aat aaa aca aaa tet gta gaa ttc 90 Gly Ser Ala Gin Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe 20 25 30 aeg ttt tgt aat gac act gtc gtc att cca tgc ttt gtt act aat 135 Thr Phe Cys Asn Asp Thr Val Val lie Pro Cys Phe Val Thr Asn 35 40 45 gag gca caa aac act act gaa gta tac gta aag tgg aaa ttt 180 Met Glu Ala Gin Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe 50 55 60 aaa gga aga gat att tac acc ttt gat gga get eta aac aag tee 225 Lys Gly Arg Asp lie Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser 65 70 75 act gtc ccc act gac ttt agt agt gca aaa att gaa gtc tea caa 270 Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser Ser Ala Lys lie Glu Val Ser Gin 80 85 90 tta eta aaa gga gat gee tet ttg aag atg gat aag agt gat get 315 Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala 95 100 105 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -96- 1241345 A7 B7 五、發明説明（d gtc tea cac aca gga aac tac act tgt gaa gta aca gaa tta acc 360 Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr 110 115 120 aga gaa ggt gaa aeg ate ate gag eta aaa tat cgt gtt gtt tea 405 Arg Glu Gly Glu Thr lie lie Glu Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser 125 130 135 tgg ttt tet cca aat gaa aat gac tac aag gac gac gat gac aag 450 Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 140 145 150 tga tag 456 <210> 27 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉人造序列 <220> <223〉PCR 引子 <400〉 27 ggaattccat atgcaagtgc aacttcaaca gtctggacct gaactg 46 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213〉人造序列 * <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 28 ggaattetea ttattttatt tccagcttgg 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -97- [241345 A7 B7 五、發明説明（9¾ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 29 <211> 741 <212> DNA <213〉 Mus <220〉 〈221> CDS <222〉（1) ...(735) <223> pscM2DEm02. MABL2~scFv <400〉 29 atg caa gtg caa ctt caa cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct 45 Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 5 10 15 ggg get tea gtg aag atg tcc tgc aag get tct gga tac acc ttc 90 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 20 25 30 get aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc 135 Ala Asn His Val lie His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly 35 40 45 ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag 180 Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 50 55 60 tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tea gac aaa 225 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys 65 70 75 tcc tcc acc aca gcc tac atg gac etc age age ctg gcc tct gag 270 Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu 80 85 9〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
、1T
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） -98- 1241345 A7 B7 五、發明説明（9i 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gtc tat Val Tyr 95 ggc caa Gly Gin 110 ggt ggt Gly Gly 125 caa agt Gin Ser 140 ate tct lie Ser 155 acc tat Thr Tyr 170 etc ctg Leu Leu 185 agg ttc Arg Phe 200 age aga Ser Arg 215 agt aca tac tat Tyr Tyr tec tea Ser Ser gga teg Gly Ser agt ett Ser Leu ett gtg Leu Val aag cca Lys Pro ega ttt Arg Phe aca gat Thr Asp gga gtt Gly Val gga ggg gac tct gcg Asp Ser Ala gac gac tgg Asp Asp Trp ggt ggt teg Gly Gly Ser gtg atg acc Val Met Thr caa gcc tcc Gin Ala Ser aat gga aag Asn Gly Lys tct cca aaa Ser Pro Lys gtc cca gac Val Prc^Asp etc atg ate Leu Met lie tgc tct caa tac tgt gca Tyr Cys Ala ggc acc act Gly Thr Thr ggt ggt teg Gly Gly Ser cca etc tec Pro Leu Ser tgc aga tea Cys Arg Ser tta cat tgg Leu His Trp ate tac aaa 卜,τ· lie Tyr Lys agt ggc agt Ser Gly Ser gtg gag get Val Glu Ala cat gtt ccg aga ggg ggt Arg Gly Gly 100 etc aca gtc Leu Thr Val 115 ggt ggt ggc Gly Gly Gly 130 ctg cct gtc Leu Pro Val 145 agt cag age Ser Gin Ser 160 tac ctg cag Tyr Leu Gin 175 gtt tec aac Val Ser Asn 190 gga tea gtg Gly Ser Val 205 gag gat ctg Glu Asp Leu 220 tac aeg ttc act tac 315 Thr Tyr 105 ggt ggt 360 Gly Gly 120 gat gtt 405 Asp Val 135 gga gat 450 Gly Asp 150 cac agt 495 His Ser 165 ggc cag 540 Gly Gin 180 tct ggg 585 Ser Gly 195 ttc aca 630 Phe Thr 210 tat ttc 675 Tyr Phe 225 ggg acc 720 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） -99- 1241345 A7 B7 五、發明説明（9)
Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 230 235 240 aag ctg gaa ata aaa taa tga 741 Lys Leu Glu lie Lys <210> 30 <211〉 18 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉PCR 引子 <400> 30 cagacagtgg ttcaaagt 18 <210> 31 ‘
〈211〉 72 <212> DNA 〈213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子、 <400> 31 ，，’ cgcgtcgacc gatccgccac cacccgaacc accaccaccc gaaccaccac caccttttat 60 ttccagcttg gt 72 <210> 32 〈211〉 1605 <212> DNA '. <213〉 Mus 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -100- 1241345 A7 B7 五、發明説明（9$ <220>
<221〉 CDS <222> (1)... (1599) <223〉pCH0M2(Fv)2. MABL2-sc(Fv)2 <400> 32 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca 45
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 5 10 15 ，、 ggt gtc gac tee cag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gaa ctg 90
Gly Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tee tgc aag get tet gga 135
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc get aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca 180
Tyr Thr Phe Ala Asn His Val lie His Trp Val Lys Gin Lys Pro 50 55 60 ggg cag ggc ett gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 225 ' Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gee act ctg act 270
Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 80 85 90 tea gac aaa tee tee acc aca gee tac atg gac etc age age ctg 315
Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu 95 100 105 gee tet gag gac tet geg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac 360
Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -101 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（θ tat act tac Tyr Thr Tyr tea ggt ggt Ser Gly Gly teg gat gtt Ser Asp Val ett gga gat Leu Gly Asp gtg cac agt Val His Ser cca ggc cag Pro Gly Gin ttt tet ggg Phe Ser Gly gat ttc aca Asp Phe Thr gtt tat ttc Val Tyr Phe 110 gac gac Asp Asp 125 ggt ggt Gly Gly 140 gtg atg Val Met 155 caa gcc Gin Ala 170 aat gga Asn Gly 185 tet cca Ser Pro 200 gtc cca Val Pro 215 etc atg Leu Met 230 tgc tet Cys Ser 245 tgg ggc caa Trp Gly Gin teg ggt ggt Ser Gly Gly acc caa agt Thr Gin Ser tee ate tet Ser lie Ser aag acc tat Lys Thr Tyr aaa etc ctg Lys Leu Leu gac agg ttc Asp Arg Phe ate age aga lie Ser Arg caa agda Gin Ser Thr 115 ggc acc Gly Thr 130 ggt ggt Gly Gly 145 cca etc Pro Leu 160 tgc aga Cys Arg 175 tta cat Leu His 190 ate tac lie Tyr 205 agt ggc Ser Gly 220 gtg gag Val Glu 235 cat gtt His Val 250 act etc Thr Leu teg ggt Ser Gly tee ctg Ser Leu tea agt Ser Ser tgg tac Trp Tyr aaa gtt Lys Val agt gga Ser Gly get gag Ala Glu ccg tac Pro Tyr aca gtc Thr Val ggt ggc Gly Gly cct gtc Pro Val cag age Gin Ser ctg cag Leu Gin tee aac Ser Asn tea gtg Ser Val gat ctg Asp Leu aeg ttc Thr Phe 120 tee 405 Ser 135 gga 450 Gly 150 agt 495 Ser 165 ett 540 Leu 180 aag 585 Lys 195 ega 630 Arg 210 aca 675 Thr 225 gga 720 Gly 240 gga 765 Gly 255 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 等
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -102- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ιή〇 ggg ggg acc Gly Gly Thr ggt ggt teg Gly Gly Ser cag cag tet Gin Gin Ser atg tee tgc Met Ser Cys cac tgg gtg His Trp Val tat att tat Tyr lie Tyr aag gac aag Lys Asp Lys tac atg gac Tyr Met Asp tac tgt gca Tyr Cys Ala ggc acc act aag ctg gaa Lys Leu Glu 260 ggt ggt ggc Gly Gly Gly 275 gga cct gaa Gly Pro Glu 290 aag get tet Lys Ala Ser 305 aag cag aag Lys Gin Lys 320 cct tac aat Pro Tyr Asn 335 gee act ctg Ala Thr Leu 350 etc age age Leu Ser Ser 365- aga ggg ggt Arg Gly Gly 380 etc aca gtc ata aaa lie Lys gga teg Gly Ser ctg gta Leu Val gga tac Gly Tyr cca ggg Pro Gly gat ggt Asp Gly act tea Thr Ser ctg gee Leu Ala tac tat Tyr Tyr tc^tca ggt ggt Gly Gly 265 gtc gac Val Asp 280 aag cct Lys Pro 295 acc ttc Thr Phe 310 cag ggc Gin Gly 325 act aag Thr Lys 340 gac aaa Asp Lys 355 tet gag Ser Glu 370 act tac Thr Tyr 385 ggt ggt ggt ggt Gly Gly tee cag Ser Gin ggg get Gly Ala get aac Ala Asn ett gag Leu Glu tat aat Tyr Asn teg ggt Ser Gly gtc cag Val Gin tea gtg Ser Val cat gtt His Val tgg att Trp lie gag aag Glu Lys ggt 810 Gly 270 ctg 855 Leu 285 aag 900 Lys 300 att 945 lie 315 gga 990 Gly 330 ttc 1035 Phe 345 gee 1080 Ala 360 tat 1125 Tyr 375 caa 1170 Gin 390 ggt 1215 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 tee tee acc aca Ser Ser Thr Thr gac tet Asp Ser gac gac Asp Asp geg gtc Ala Val tgg ggc Trp Gly ggt ggt teg ggt 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -103- 1241345 五、發明説明（ Gly Thr Thr ggt ggt teg Gly Gly Ser cca etc tee Pro Leu Ser ;:·》 tgc aga tea Cys Arg Ser tta cat tgg Leu His Trp ate tac aaa lie Tyr Lys agt ggc agt Ser Gly Ser gtg gag get Val Glu Ala cat gtt ccg His Val Pro gac tac aaa Asp Tyr Lys ιέι
Leu Thr 395 ggt ggt Gly Gly 410 ctg cct Leu Pro 425 agt cag Ser Gin 440 tac ctg Tyr Leu 455 gtt tee Val Ser 470 gga tea Gly Ser 485 gag gat Glu Asp 500 tac aeg Tyr Thr 515 gac gat Asp Asp
Val Ser Ser Gly ggc gga Gly Gly gtc agt Val Ser age ett Ser Leu cag aag Gin Lys aac ega Asn Arg gtg aca Val Thr ctg gga Leu Gly ttc gga Phe Gly gac gat Asp Asp teg gat Ser Asp ett gga Leu Gly gtg cac Val His cca ggc Pro Gly ttt tet Phe Ser gat ttc Asp Phe gtt tat Val Tyr ggg ggg Gly Gly aaa taa Lys
Gly Gly Gly Ser 400 gtt gtg atg acc Val Val Met Thr 415 gat caa gee tee Asp Gin Ala Ser 430 agt aat gga aag Ser Asn Gly Lys 445 cag tet cca aaa Gin Ser Pro Lys 460 ggg gtc cca gac Gly Val Pro Asp 475 aca etc atg ate Thr Leu Met lie 490 ttc tgc tet caa Phe Cys Ser Gin 505 acc aag ctg gaa Thr Lys Leu Glu 520 tga 1605
Gly Gly 405 caa agt 1260 Gin Ser 420 ate tet 1305 lie Ser 435 acc tat 1350 Thr Tyr 450 etc ctg 1395 Leu Leu 465 、 agg ttc 1440 Arg Phe 480 age aga 1485 Ser Arg 495 agt aca 1530 Ser Thr 510 ata aaa 1&75 lie Lys 525 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝.
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格Η2ΪΟΧ297公釐） -104- 1241345 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（1卜τ， 530 <210〉 33 <211〉 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 ^ <400> 33 tgaggaattc ccaccatggg atg 33 <210> 34 <211〉 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 34 cacgacgtca ctcgagactg tgagagtggt gccttggccc 40 <210> 35 - <211> 40 <212〉 DNA <213>人造序列 · <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 35 agtctcgagt gacgtcgtga tgacccaaag tccactctcc 40 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 等
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 105- 1241345 A7 B7 五、發明説明（化3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 36 <211〉 31 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 <220> <223〉 PCR 弓f子 <400〉 36 gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt c 31 <210〉 37 <211> 22 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 ' 〈223〉PCR 引子 <400〉 37 cgcgtaatac gactcactat ag 22 <210> 38 <211> 46 <212〉 DNA <213〉人造序列 、 <220> - ’ <223〉PCR 引子 <400〉 38 gcaattggac ctgttttatc tcgagcttgg tcccccctcc gaacgt 46 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 等
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -106 1241345 A7 B7五、發明説明（— <210〉 39 〈211〉 45 <212〉 DNA <213〉人造序列 卜下， <220> <223〉PCR引子… <400〉 39 • gctcgagata aaacaggtcc aattgcagca gtctggacct gaact 45
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 40 <211〉 60 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉PCR 引子 * <400> 40 gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt ctttgtagtc tgaggagact gtgagagtgg 60 <210> 41 <211> 32 <212〉 DNA <213>人造序列 <220> * <223〉PCR 引子 ' <400〉 41 , gactgaattc ccaccatgaa gttgcctgtt ag 32 〈210〉 42 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·
、1T 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 107- 1241345 A7 B7五、發明説明（化5 <211〉 40 <212> DNA <213>人造序列 <220〉<223〉PCR 引子 <400> 42 卜:r，’ cagtctcgag tggtggttcc gacgtcgtga tgacccaaag 40
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <211> 43 〈212〉 DNA 〈213〉人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 43 cagtctcgag tggtggtggt tccgacgtcg tgatgaccca aag 43 <210〉 44 <211> 46 <212> DNA <213〉人造序歹〇 <220〉<223〉PCR 引子 <400> 44 ’ cagtctcgag tggtggtggt ggttccgacg tcgtgatgac ccaaag 46 <210> 45 ' <211> 49 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -108- A7 1241345 B7 五、發明説明（— <212> DNA 〈213>人造序列 <220> <223〉 PCR 弓f子 <400> 45 cagtctcgag tggtggtggt ggtggttccg acgtcgtgat gacccaaag 49 <210〉 46 h，〆
<211〉 52 <212〉 DNA 〈213>人造序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 46 cagtctcgag tggtggtggt ggtggtggtt ccgacgtcgt gatgacccaa ag 52
<210〉 47 〈211〉 20 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉PCR 引子 <400> 47 ggccgcatgt tgtcacgaat 20
<210> 48 <211〉 780 <212> DNA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -109- 1241345 A7 B7 五、發明説明（1^)7 <213> Mus <220〉 <221> CDS <222> (1). . . (768) <223〉 CF2HL-0/pC0Sl. MABL2-scFv<HL-0> <400> 48 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg MET Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu .X 5 10 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) aca ggt gtc 51 Thr Gly Val 15 aag cct ggg 102 Lys Pro Gly get aac cat 153 Ala Asn His 50 tgg att gga 204 Trp lie Gly ttc aag gac 255 Phe Lys Asp 85 atg gac etc 306 MET Asp Leu -100 tat tac tgt gca aga ggg ggt 357 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly 115 ' acc act etc aca gtc teg agt 408 gta gca Val Ala gac tee cag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gaa Pro Glu
Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly 20 25 get tea gtg aag atg tee tgc aag get tet Ala Ser Val Lys MET Ser Cys Lys Ala Ser 35 40 gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg Val lie His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly 55 60 tat att tat cct tac aat gat ggt act aag Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 70 75 aag gee act ctg act tea gac aaa tee tee Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 90 95 age age ctg gee tet gag gac tet geg gtc Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 105 110 tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc gga tac Gly Tyr 45 . cag ggc Gin Gly tat aat Tyr Asn 80 acc aca Thr Thr aca get Thr Ala ctg gta Leu Val 30 acc ttc Thr Phe ett gag Leu Glu 65 gag aag Glu Lys gee tac Ala Tyr 裝·
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐）-no- [241345 A7B7 五、發明説明（ Tyr Tyr Thr 120 gac gtc gtg Asp Val Val caa gcc tcc Gin Ala Ser 155 aag acc tat Lys Thr Tyr ctg ate tac Leu lie Tyr 190 ggc agt gga Gly Ser Gly 205 gag gat ctg Glu Asp Leu 1^8 Tyr Asp atg acc MET Thr 140 ate tet lie Ser tta cat Leu His 175 aaa gtt Lys Val tea gtg Ser Val gga gtt Gly Val 225
Gin Gly Thr Thr Leu 130 etc tcc ctg cct gtc Leu Ser Leu Pro Val 145 agt cag age ett gtg Ser Gin Ser Leu Val 165 cag aag cca ggc cag Gin Lys Pro Gly Gin 180 ttt tet ggg gtc cca Phe Ser Gly Val Pro 200 ate age lie Ser aca cat Thr His tac aaa Tyr Lys 250
Asp Trp Gly 125 caa agt cca Gin Ser Pro tgc aga tea Cys Arg Ser 160 tgg tac ctg Trp Tyr Leu tcc aac ega Ser Asnr^Alrg 195 aca gat ttc Thr Asp Phe 210 tat ttc tgc Tyr Phe Cys aag ctg gaa Lys Leu Glu 245 780
Thr Val Ser 135 agt ett gga Ser Leu Gly 150 cac agt aat His Ser Asn tet cca aaa Ser Pro Lys 185 gac agg ttc Asp Arg Phe
Ser gat 459 Asp gga 510 Gly 170 etc 561 Leu agt 612 Ser 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 ttc gga ggg ggg acc Phe Gly Gly Gly Thr 240 aaa taa tga gga tcc Lys aca etc atg Thr Leu MET 215 tet caa agt Ser Gin Ser 230 ata aaa gac lie Lys Asp aga gtg gag get 663 Arg Val Glu Ala 220 gtt ccg tac aeg 714 Val Pro Tyr Thr 235 gac gat gac gat 765 Asp Asp Asp Asp 255 <210> 49 <211> 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1T1 - 1241345 A7 B7 五、發明説明（1必 <212> DNA <213〉人造序列<220> <223〉PCR 弓 f子' <400〉 49 caagctcgag ataaaatccg gaggccaggt ccaattgcag cagtc 45 〈210〉 50
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
<212> DNA〈213>人造序列 <220><223〉PCR弓丨子 <400〉 50 caagctcgag ataaaatccg gaggiitgcca ggtccaattg cagcagtc 48 <210〉 51 <211> 51 <212> DNA 〈213>人造序列 <220〉〈223〉PCR 引子 <400〉 51 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg ccaggtccaa ttgcagcagt c 51 <210> 52 <211〉 54 <212> DNA (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _1ΐ2- 1241345 A7 B7 五、發明説明（〈213>人造序列<220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 52 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggccaggtc caattgcagc agtc 54 <210〉 53 <211> 57 广） <212〉DNA〈213>人造序列<220〉 <223〉PCR 弓[子 <400〉 53 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggtggccag gtccaattgc agcagtc 57 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 54 <211〉780 叩. <212> DNA 〈213〉 Mus <220〉 <221> CDS <222〉 （1)…（768) 〈223〉 CF2LH-0/pC0Sl. MABL2-scFv<LH-0> <400> 54 * atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt tcc 51 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp lie Pro Gly Ser 5 10 15 age agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca etc tcc ctg cct gtc agt ett 102 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -113- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ Ser Ser Asp 20 gga gat caa Gly Asp Gin 35 aat gga aag Asn Gly Lys rr，） aaa etc ctg Lys Leu Leu 70 ttc agt ggc Phe Ser Gly gag get gag Glu Ala Glu 105 tac aeg ttc • Tyr Thr Phe 120 cag tet gga Gin Ser Gly aag get tet Lys Ala Ser 155 aag cca ggg Lys Pro Gly 171 Val Val gee tee Ala Ser acc tat Thr Tyr 55 ' ate tac lie Tyr agt gga Ser Gly 90 gat ctg Asp Leu gga ggg Gly Gly cct gaa Pro Glu 140 gga tac Gly Tyr cag ggc Gin Gly MET Thr Gin 25 ate tet tgc lie Ser Cys 40 tta cat tgg Leu His Trp aaa gtt tee Lys Val Ser 75 tea gtg aca Ser Val Thr gga gtt tat Gly Val Tyr 110 ggg acc aag Gly Th^Lys 125 ctg gta aag Leu Val Lys acc ttc get Thr Phe Ala 160 ett gag tgg Leu Glu Trp
Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 30 age ett Ser Leu aga tea Arg Ser gtg cac agt 153 Val His Ser 50 cag tet cca 204 Gin Ser Pro cca gac agg 255 Pro Asp Arg 85 age aga gtg 306 Ser Arg Val 100 cat gtt ccg 357 His Val Pro caa ttg cag 408 Gin Leu Gin 135 atg tee tgc 459 MET Ser Cys gtg aag cag 510 Val Lys Gin 170 tac aat gat 561 Tyr Asn Asp agt cag Ser Gin 45 cag aag Gin Lys ttt tet Phe Ser 80 aca etc Thr Leu tet caa Ser Gin ata aaa lie Lys 130 get tea Ala Ser gtt att Val lie 165 tat att Tyr lie 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· tac ctg Tyr Leu 60 aac ega Asn Arg gat ttc Asp Phe 95 ttc tgc Phe Cys etc gag Leu Glu cct ggg Pro Gly 145 aac cat Asn His att gga lie Gly cca ggc Pro Gly 65 ggg gtc Gly Val atg ate MET He agt aca Ser Thr 115 cag gtc Gin Val gtg aag Val Lys 150 cac tgg His Trp tat cct Tyr Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -114- 1241345 A7 B7 五、發明説明（ ggt act aag Gly Thr Lys 190 aaa tcc tcc Lys Ser Ser 205 tct gcg gtc Ser Ala Val ggc caa ggc Gly Gin Gly 240 aaa taa tga Lys lib 175 tat aat Tyr Asn acc aca Thr Thr tat tac Tyr Tyr 225 acc act etc aca Thr Thr Leu Thr 245 gga tcc 780 gag aag Glu Lys gcc tac Ala Tyr 210 tgt gca Cys Ala ttc aag Phe Lys 195 atg gac MET Asp aga ggg Arg Gly 230 gtc tcc Val Ser 180 gac aag gcc Asp Lys Ala etc age age Leu Ser Ser 215 ggt tac tat Gly Tyr Tyr tea gac tac Ser Asp Tyr 250 act ctg Thr Leu 200 ctg gcc Leu Ala act tac Thr Tyr 235 aaa gac Lys Asp 185 act tea gac 612 Thr Ser Asp tct gag gac 663 Ser Glu Asp 220 gac gac tgg 714 Asp Asp Trp gat gac gat 765 Asp Asp Asp 255 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 115-

Claims (1)

1241345 sa ：> i A8 B8 • C8 D8 、申請專利範圍 第90 1 056 1 6號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閲-1¾背面之注意事項再填寫本頁) 民國93年1 1月1〇日修正 1.一種重建聚肽，其爲結合於整合組合蛋白質（IAP， Integrin Associated Protein)，誘發具有IAP的有核血液細 胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現象者，其特徵爲 含有含序列號碼5中43 -58所記載的胺基酸序列之L鏈 CDR1、含序列號碼5中74-80所記載的胺基酸序列之L鏈 CDR2 '含序歹!1號碼5中1 1 3 -1 2 1所記載的胺基酸序列之L 鏈CDR3的L鏈V區域、含序列號碼6中50-54所記載的 胺基酸序列之Η鏈CDR1、含序列號碼6中69-8 5所記載的 胺基酸序列之Η鏈CDR2 '含序列號碼6中118-125所記載 的胺基酸序列之Η鏈CDR3的Η鏈V區域。 序列號碼5 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct 45 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro 5 10 15 gcg tcc age agt gat gtt gtg atg acc csa act cca etc tcc ctg 90 Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 25 30 cct gtc sgt ett gga gat esa gcc tcc ate tet tgc aga tet agt 135 Pro Vsl Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 cag age ett eta cac agt asa gga aac acc tat tta caa tgg tac -180 Gin Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gin Trp Tyr 50 55 60 1241345 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 _ D8六、申請專利範圍 eta csg aag cca ggc cag tet cca aag etc ctg ate tac aaa gtt 225 Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val 65 70 75 tee aac ega ttt let ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga 270 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 80 85 90 tea ggg aca gat ttc aca etc aag ate age aga gtg gag get gag 3]5 Ser Gly 丁hr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu 95 100 105 gat ctg gga gtt tat ttc tgc tet caa agt aca cat gtt ccg tac 360 Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr 110 115 120 aeg tee gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa c 394 Thr Se2· Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 125 130 序列號碼6 atg gaa tgg age tgg ata ttt etc ttc etc ctg tea gga act gca 处 Met Glu Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala 5 10 15 ggt gtc cac tee cag gtc cag ctg cag csg tet gga cct gac ctg 90 Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp 10 25 30 ^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度顧中國國家標準（CNS ‘驗（21GX297公董）—~r-2-r 1241345 A8 B8 C8 D8 K、申請專利範圍 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tee tgc aag get tet gga 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tac see ttc gtt sac cat git atg cac tgg gtg aag cag aag cca 180 丁yr Thr Phe Va] Asn His Val Met His Trp Val Lys Gin Lys Pro 50 55 60 ZEg cag ggc ell gag tgg att gga tat att tat cct tac ast gal 225 Gly G]n Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 ggt act aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gee aca ctg act 270 Gly 丁hr Lys 了yr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 80 85 90 tea gag aaa tee tee age gca gee tac atg gag etc age age ctg 315 Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 95 100 105 gee tet gag gac tet geg gtc tac tac tgt gca aga ggg ggt tac 360 Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 了yr 丁yr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr 110 115 120 tat agt tac gac gac tgg ggc caa ggc see act etc aca gtc tee 405 丁yr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gin Gly 丁hr Thr Leu Thr Val Ser 225 130 135 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tea g 409 Ser 2.—種重建聚肽，其爲結合於整合組合蛋白質（IAP， Integrin Associated Protein)，誘發具有IAP的有核血液細 胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現象者，其特徵爲 含有含序列號碼7中43-58所記載的胺基酸序.列之L鏈 CDR1、含序列號碼7中74_8〇所記載的胺基酸序列之L鏈 本紙張尺度適用中國國家樵準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1241345 ABCD 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) CDR2、含序歹[J號碼7中1 1 3、1 2 1所記載的胺基酸序列之乙 鏈CDR3的L鏈V區域 '含序列號碼8中50-54所記載的 胺基酸序列之Η鏈CDR1、含序列號碼8中69-85所記載的 胺基酸序列之Η鏈CDR2、含序列號碼8中U8」25所記載 的胺基酸序列之Η鏈CDR3的Η鏈V區域。 序列號碼7 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct 45 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro 5 l〇 15 ggt tcc age agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca etc tcc ctg 90 Gly Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu 20 25 30 cct gtc agt ett gga gat caa gcc tcc ate tet tgc aga tea agt 135 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 cag age ett gtg C3C agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 180 . Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr 50 55 60 ctg cag aag cca ggc cag tet cca aaa etc ctg ate tac aaa gtt 225 Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 65 70 75 tcc aac ega ttt tet ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga 270 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 80 85 90 tea gtg aca gat ttc aca etc atg ate age aga gtg gag get gag 315 Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met lie Ser Arg Val Glu Ala Glu 95 ]00 105 本紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4聽^ ( 210X297公釐) ：Γ7^ ' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1241345 A8 B8 C8 _ D8 六、申請專利範圍 gst ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac 360 Asp Leu Gly Val 丁yr Phe Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr ]]〇 Π5 3 20 acg Uc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa c. 394 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys ).25 130 序列號碼8 atg gaa tgg age tgg ata ttt etc ttc etc ctg tea gga act gca 45 Met Glu Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala 5 10 15 ggt gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg 90 Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 gta aag cct ggg get tea gtg aag atg tcc tgc aag get tct gga 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc get aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca 180 丁yr Thr Phe Ala Asn His Val lie His Trp Val Lys Gin Lys Pro 50 55 60 ggg cag ggc ett gag tgg stt gga tat stt tat cct tac aat gat 225 Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Asp 65 70 75 ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act 270 Gly 丁hr Lys 丁yr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala 丁hr Leu Thr 80 85 90 tea gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac etc age age ctg 315 Ser Asp Lys Ser Ser 丁hr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu 95 100 ]〇5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A#規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1241345 A8 B8 C8 D8 ____ 六、申請專利範圍 gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac 360 AJa Ser Glu Asp Ser AJa Val Tyr Tyr Cys Ala Arg GJy Gly Tyr no 115 120 1st act tac gac gac t.gg ggc css ggc acc act etc aca gtc tcc 405 (請先閱脅背面之注意事項再填寫本頁) Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp G]y Gin Gly 丁hr Thr Leu Tlu Val Ser 】25 ]30 135 tea g 409 Ser 3 .如申請專利範圍第1項或第2項的重建聚肽，其中該 重建聚肽爲含有2個以上的Η鏈V區域以及2個以上的L 鏈V區域者。. 4.如申請專利範圍第3項的重建聚肽，其中該重建聚肽 爲含有1個的Η鏈V區域以及1個的L鏈V區域之單鏈Fv 二聚物。 5 .如申請專利範圍第1項或第2項的重建聚肽，其中該 重建聚肽爲經純化的單鏈Fv二聚物。 6 .如申請專利範圍第1項或第2項的重建聚肽，其中該 重建聚肽爲含有1個Η鏈V區域以及1個L鏈V區域之單 鏈Fv 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7 .如申請專利範圍第〗項或第2項的重建聚肽，其中Η 鏈V區域以及L鏈V區域係介著至少1個以上的胺基酸所 成之聚肽連接體所連結者。 8 .如申請專利範圍第1項或第2項的重建聚肽，其中Η 鏈V區域以及/或L鏈V區域爲人類型化Η鏈V區域以及/ 或L鏈V區域。 9. 一種重建聚肽的L鏈ν區域，其爲結合於整合組合 本紙張尺度適用中國國家祿準（CNS ) Α4規格（210X297公策) '^ ~ 1241345 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein )，誘發具有 IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現 象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第i項之序列號碼5 中43_58所記載的胺基酸序列之L鏈CDR1、含該序列號碼 5中74_8〇所記載的胺基酸序列之L鏈CDR2、含該序列號 碼5中113-121所記載的胺基酸序列之L鏈CDR3。 I 〇 · —種重建聚肽的Η鏈V區域，其爲結合於整合組合 蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein )，誘發具有 IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現 象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第i項之序列號碼6 中5 0-5 4所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR1、含該序列號碼 6中69_85所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR2、含該序列號 碼6中118-125所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR3。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 II . 一種重建聚肽的L鏈V區域，其爲結合於整合組合 蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein )，誘發具有 IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現 象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第2項之序列號碼7 中43 -5 8所記載的胺基酸序列之L鏈CDR1、含該序列號碼 7中74-80所記載的胺基酸序列之L鏈CDR2、含該序列號 碼7中1 1 3 -1 2 1所記載的胺基酸序列之L鏈CDR3。 1 2 . —種重建聚肽的Η鏈V區域，其爲結合於整合組合 蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein )，誘發具有 IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅血球凝集現 象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第2項之序列號碼8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1241345 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 中5 0-54所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR1、含該序列號碼 8中69- 85所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR2、含該序列號 碼 8中1 1S-125所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR3。 1 3 . —種編碼重建聚肽的L鏈V區域之DN A，其爲結合 於整合組合蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein)， 誘發具有IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅 血球凝集現象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第1項 之序列號碼5中43 -5 8所記載的胺基酸序列之L鏈CDR1、 含該序列號碼5中74- 80所記載的胺基酸序列之L鏈CDR2 、含該序列號碼5中1 1 3 -1 2 1所記載的胺基酸序列之L鏈 CDR3 〇 ! 4.如申請專利範圍第13項之DNA，其中含有編碼含 該序列號碼5中127- 1 74所記載的鹼基序列之L鏈CDR1 的DNA、編碼含該序列號碼5中22〇-24〇所記載的鹼基序 列之L鏈CDR2的DNA、編碼含該序列號碼5中3 3 7-3 63 所記載的鹼基序列之L鏈CDR3的DNA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 5 . —種編碼重建聚肽的Η鏈V區域之DN A，其爲結 合於整合組合蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein) ，誘發具有IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起 紅血球凝集現象者，其特徵爲含有含如申請專利範圍第1 項之序列號碼6中5 0- 54所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR1 、含該序列號碼6中69_85所記載的胺基酸序列之Η鏈 CDR2、含該序列號碼6中1 1L 125所記載的胺基酸序列之 Η 鏈 CDR3。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1241345 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 6 .如申請專利範圍第1 5項之DN A，其中含有編碼含 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該序列號碼6中1 48- 1 62所記載的鹼基序列之Η鏈CDR1 的DNA、編碼含該序列號碼6中205-25 5所記載的鹼基序 列之Η鏈CDR2的DNA、編碼含該序列號碼6中3 52-375 所記載的鹼基序列之Η鏈CDR3的DNA。 17. —種編碼重建聚肽的L鏈V區域之DNA，其爲結合 於整合組合蛋白質（IAP，Integrin Associated Protein)， 誘發具有ΙΑΡ ·的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起紅 血球凝集現象者，其特徵爲如申請專利範圍第2項之序列 號碼7中43 -58所記載的胺基酸序列之L鏈CDR1、含該序 列號碼7中74-80所記載的胺基酸序列之L鏈CDR2、含該 序列號碼7中1 1 3 - 1 2 1所記載的胺基酸序列之L鏈CDR3。 18. 如申請專利範圍第17項之DNA，其中含有編碼含 該序列號碼7中1 27- 1 74所記載的鹼基序列之L鏈CDR1 的DNA、編碼含該序列號碼7中220-240所記載的鹼基序 歹U之L鏈CDR2的DNA、編碼含該序列號碼7中3 3 7-3 63 所記載的鹼基序列之L鏈CDR3的DNA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 19. 一種編碼重建聚肽的Η鏈V區域之DNA，其爲結 合於整合組合蛋白質（ΙΑΡ，Integrin Associated Protein) ，誘發具有IAP的有核血液細胞之細胞凋亡，且不會引起 紅血球凝集現象者，其特徵爲如申請專利範圍第2項之序 列號碼8中5〇-54所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR1、含該 序列號碼8中69-85所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR2、含 該序列號碼8中1 1 8-125所記載的胺基酸序列之Η鏈CDR3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1241345 A8 B8 C8 D8 _____ 六、申請專利範圍 〇 20.如申請專利範圍第19項之DNA，其中含有編碼含 該序列號碼8中1 48- 1 62所記載的鹼基序列之Η鏈CDR1 的DNA、編碼含該序列號碼8中2〇5-25 5所記載的鹼基序 列之Η鏈CDR2的DNA、編碼含該序列號碼8中3 5 2-3 75 所記載的鹼基序列之Η鏈CDR3的DNA。 2 1。一種使用於治療血液疾病之醫藥組成物，其特徵爲 含有如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之重建聚肽 作爲有效成分者。 2 2.—種使用於治療白血病之醫藥組成物，其特徵爲含 有如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之重建聚肽作 爲有效成分者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) -
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