TW202440157A

TW202440157A - 用於治療癌症的組合療法

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Publication number: TW202440157A
Application number: TW112146944A
Authority: TW
Inventors: 詹姆斯艾爾斯; 布拉傑什凱莎; 賽門多維迪
Original assignee: 英商梅迪繆思有限公司
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2023-12-01
Publication date: 2024-10-16
Also published as: WO2024116140A1

Abstract

本揭露提供一種治療受試者的腫瘤的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的T細胞檢查點抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。在一些方面，該方法包括在該T細胞檢查點抑制劑及化療和/或放療的組合之前或與其同時進一步投與CD73抑制劑。

Description

用於治療癌症的組合療法

本文揭露的發明關於治療受試者的腫瘤的方法，該等方法包括投與CD73抑制劑、T細胞檢查點抑制劑、以及化療和/或放療。

細胞外腺苷已成為腫瘤微環境內免疫過程的重要調節因子並且被認為降低T細胞檢查點抑制藥物的效力（Sidders B等人, Clin Cancer Res [臨床癌症研究] 2020, 26:2176–87；Augustin RC等人, J Immunother Cancer [癌症免疫療法雜誌] 2022, 10:e004089）。壞死或受損細胞釋放的三磷酸腺苷（ATP）藉由兩種協同工作的外核苷酸酶CD39（ENTPD1）和CD73（NT5E）的依序作用被水解成腺苷。產生的腺苷充當易於擴散的免疫抑制「煙霧」，且細胞毒性劑和放療可能會加劇該過程。在這一點上，當放療與抗CD73（aCD73）抑制抗體處理組合時，在臨床前模型中觀察到增強的抗腫瘤活性（Wennerberg E等人, Cancer Immunol Res [癌症免疫學研究] 2020; 8:465–78；和Wennerberg E等人, Front Immunol [免疫學前沿] 2017; 8:229.）。該等研究突出顯示了輻射誘導的1型干擾素在驅動腫瘤cDC1浸潤水平升高中的重要作用，以及當輻射活化的1型干擾素水平次優時CD73抑制對該生物標誌物的有益效果。儘管有關於CD73在基於放射的標準護理情況下的作用的新資訊，但對腺苷途徑抑制藥物在化療治療方案情況下的作用瞭解相對較少，儘管越來越多的證據指向該等藥劑的免疫調節軸（Coffelt SB等人, Trends Immunol [免疫學趨勢] 2015; 36:198–216.）。將T細胞檢查點抑制劑納入這個範式內藉由對抗自我調整性免疫抵抗和解除抗腫瘤免疫而為增強細胞介導的活性提供了進一步的機會。

奧來魯單抗（Oleclumab）（抑制CD73的人單株IgG1-TM抗體）（Hay CM等人, Oncoimmunology [腫瘤免疫學] 2016; 5）當前處於臨床開發的2/3期，其與德瓦魯單抗（Durvalumab）組合用於治療患有各種實性瘤的患者。來自德瓦魯單抗與奧來魯單抗的組合在患有不可切除的III期非小細胞肺癌的患者（該等患者在既往放化療後沒有進展）中的II期平臺研究的數據突出顯示了奧來魯單抗組分的顯著益處。目前正在同一患者群體中進行3期臨床試驗。因此，業內仍需要有效的療法。

本揭露關於在有需要的受試者中抑制腫瘤生長的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。

本揭露還關於在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。

本揭露還關於在受試者中產生保護性腫瘤記憶響應的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。

本揭露還關於在有需要的受試者中抑制腫瘤生長的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。

本揭露還關於在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。

本揭露還關於在受試者中產生保護性腫瘤記憶響應的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。

在一方面，PD-L1抑制劑及化療和/或放療係同時投與的。在另一方面，PD-L1抑制劑及化療和/或放療係依序投與的。在另一方面，CD73抑制劑係在投與PD-L1抑制劑及化療和/或放療之前投與的。

在一方面，化療係多西他賽、5-氟尿嘧啶、和/或奧沙利鉑。

在一方面，PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在另一方面，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列的重鏈（HC）CDR1、包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的HC CDR2、以及包含SEQ ID NO:3的胺基酸序列的HC CDR3；以及包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列的輕鏈（LC）CDR1、包含SEQ ID NO:5的胺基酸序列的LC CDR2、以及包含SEQ ID NO:6的胺基酸序列的LC CDR3。在另一方面，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:7的胺基酸序列的HC可變結構域（VH）、以及含有SEQ ID NO:8的胺基酸序列的LC可變結構域（VL）。在另一方面，抗PD-L1抗體係德瓦魯單抗。

在一方面，CD73抑制劑係抗CD73抗體或其抗原結合片段。在另一方面，抗CD73抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列的HC CDR1、包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列的HC CDR2、以及包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列的HC CDR3；以及包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列的LC CDR1、包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列的LC CDR2、以及包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列的LC CDR3。在另一方面，抗CD73抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:15的胺基酸序列的HC可變結構域（VH）、以及含有SEQ ID NO:16的胺基酸序列的LC可變結構域（VL）。在另一方面，抗CD73抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:17的胺基酸序列的HC、以及含有SEQ ID NO:18的胺基酸序列的LC。在另一方面，抗CD73抗體係奧來魯單抗。

在一方面，投與導致腫瘤微環境中CXCR3的上調。

在一方面，CD73蛋白或CD73活性水平係藉由免疫組織化學（IHC）、成像質譜流式（IMC）或質譜成像（MSI）確定的。

在另一方面，腫瘤或癌症係實性瘤或由實性瘤生長引起的癌症。在另一方面，實性瘤係肺腫瘤、乳腺腫瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、前列腺腫瘤、結腸直腸腫瘤、頭頸腫瘤、肝腫瘤或胰臟腫瘤。在另一方面，肺腫瘤係非小細胞肺腫瘤。

在一方面，該受試者係人。

本揭露還關於本文所描述的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療用於在有需要的受試者中治療癌症之用途。

使用小鼠癌症模型和鼠奧來魯單抗替代物（在下文稱為aCD73），探索CD73抑制與化療、或放療及PD-L1阻斷組合的效果。作為推論，探索同樣的方法以確定其是否可被應用於增強放療的效果。如本文所描述的，該等組合在改善腫瘤生長抑制、誘導保護性記憶響應和總生存益處方面非常有效。基於總轉錄本學的藥效學評估突出顯示了腫瘤中細胞毒性淋巴球和免疫支持髓系群體的豐度增加。對代表組合的各種組分的處理組的剖析允許對起作用的各個治療組分進行解摺積；這突出顯示了在組合的化療和PD-L1阻斷情況下由CD73抑制所引起的效果。 1.定義

為了可以更容易地理解本揭露，首先定義某些術語。如本申請中所用，除非本文另有明確規定，否則以下術語中之每一個應具有下文闡述的含義。另外的定義在整個申請中闡述。

在詳細描述本揭露之前，應理解的是本揭露不限於特定組成物或方法步驟，因為該等組成物或方法步驟可以變化。如在本說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確說明，否則單數形式「一個/種（a/an）」和「該（the）」包括複數個指示物。術語「一個/種」以及術語「一個/種或多個/種」和「至少一個/種」在本文可以互換使用。

此外，「和/或」在本文使用時被認為是兩個所指定的特徵或組分中每一者與或不與另一者一起的具體揭露。因此，如本文中在例如「A和/或B」等短語中所用的術語「和/或」意圖包括「A和B」、「A或B」、「A」（單獨）、以及「B」（單獨）。同樣，如在例如「A、B和/或C」等短語中所用的術語「和/或」意圖涵蓋以下方面中之每一個：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；和C（單獨）。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本揭露所屬領域的普通技術者通常理解的相同含義。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology [簡明生物醫學和分子生物學詞典], Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC出版社（CRC Press）；Dictionary of Cell and Molecular Biology [細胞和分子生物學詞典], 第3版, 1999, 學術出版社（Academic Press）；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology [生物化學和分子生物學牛津詞典], 修訂版, 2000, 牛津大學出版社（Oxford University Press）為技術者提供了在本揭露中使用的許多術語的通用詞典。

單位、前標和符號係以它們的國際單位系統（Systeme International de Unites）（SI）接受的形式表示。數值範圍包括限定該範圍的數字。除非另外指示，否則胺基酸序列係以胺基至羧基取向從左向右書寫。本文提供的標題不是對各個方面的限制，其可以藉由參考作為整體的說明書而得到。因此，藉由參考說明書的整體內容，更充分地定義了緊接著在下文中定義的術語。

應理解，無論在什麼情況下在本文用語言「包含」描述方面時，還提供了關於「由……組成」和/或「主要由……組成」描述的其他類似方面。

胺基酸在本文中藉由其通常已知的三字母符號或者由IUPAC-IUB生物化學命名委員會（Biochemical Nomenclature Commission）推薦的單字母符號來提及。同樣地，核苷酸藉由其普遍公認的單字母代碼來提及。

「抗體」（Ab）應包括但不限於糖蛋白免疫球蛋白或其抗原結合片段，其特異性結合抗原並包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈。每條H鏈包含重鏈可變區（本文縮寫為V _H ）和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含三個恒定結構域C _H1 、C _H ₂和C _H ₃。每條輕鏈包含輕鏈可變區（本文縮寫為V _L ）和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含一個恒定結構域C _L 。V _H 和V _L 區可以被進一步細分為稱為互補決定區（CDR）的高度變異區，其間插有稱為框架區（FR）的更保守的區域。每個V _H 和V _L 包含三個CDR和四個FR，從胺基末端到羧基末端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）和經典補體系統的第一組分（C1q））的結合。重鏈可具有或不具有C末端離胺酸。除非本文另有說明，否則可變區中的胺基酸使用Kabat編號系統進行編號，且恒定區中的胺基酸使用EU系統進行編號。

免疫球蛋白可以衍生自任何通常已知的同種型，包括但不限於IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。IgG亞類亦為本領域人員熟知的，包括但不限於人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。「同種型」係指由重鏈恒定區基因編碼的抗體類或亞類（例如，IgM或IgG1）。舉例來說，術語「抗體」包括單株和多株抗體；嵌合和人源化抗體；人或非人抗體；完全合成的抗體；和單鏈抗體。非人抗體可以藉由重組方法進行人源化，以降低其在人體內的免疫原性。在沒有明確說明的情況下，並且除非上下文另外指示，否則術語「抗體」包括單特異性、雙特異性或多特異性抗體以及單鏈抗體。在多個方面，抗體係雙特異性抗體。在其他方面，抗體係單特異性抗體。

如本文所用，「IgG抗體」具有天然存在的IgG抗體的結構，即，其具有與相同亞類的天然存在的IgG抗體相同數量的重鏈和輕鏈以及二硫鍵。例如，抗ICOS IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）組成，其中這兩條重鏈和輕鏈分別藉由與天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗體中存在的相同數量和位置的雙硫鍵連接（除非抗體已經突變以修飾二硫鍵）。

「分離的抗體」係指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體（例如，特異性結合PD-L1的分離的抗體基本上不含特異性結合除PD-1以外的抗原的抗體）。然而，特異性結合PD-L1的分離的抗體可以具有與其他抗原（例如來自不同物種的PD-L1分子）的交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學品。

抗體可為已經改變的抗體（例如，藉由突變、缺失、取代、與非抗體部分綴合）。例如，抗體可以包括改變抗體性質（例如功能性質）的一或多個變體胺基酸（與天然存在的抗體相比）。例如，本領域已知許多這樣的改變，該等改變影響例如半衰期、效應子功能和/或患者對抗體的免疫響應。術語抗體還包括人工多肽構建體，其包含至少一個抗體衍生的抗原結合位點。

術語「單株抗體」（「mAb」）係指具有單一分子組成的抗體分子的非天然存在的製劑，即初級序列基本上相同並且對特定表位表現出單一結合特異性和親和力的抗體分子。mAb係分離的抗體的一個實例。mAb可以藉由融合瘤、重組技術、轉基因技術或熟悉該項技術者已知的其他技術產生。

「人」抗體（HuMAb）係指具有可變區的抗體，在該等可變區中，框架區和CDR區兩者均衍生自人種系免疫球蛋白序列。此外，如果該抗體含有恒定區，則該恒定區也衍生自人種系免疫球蛋白序列。本揭露之人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如在體外藉由隨機或位點特異性誘變或在體內藉由體細胞突變引入的突變）。然而，如本文所用，術語「人抗體」並不旨在包含其中衍生自另一種哺乳動物物種（例如小鼠）的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。術語「人」抗體和「完全人」抗體係同義使用的。

「人源化抗體」係指其中非人抗體CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸被衍生自人免疫球蛋白的對應胺基酸替代的抗體。在人源化形式的抗體的一個方面，CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸已被來自人免疫球蛋白的胺基酸替代，而一或多個CDR區內的一些、大部分或所有胺基酸未改變。胺基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修飾係允許的，只要它們不消除抗體結合特定抗原的能力即可。「人源化」抗體保留了與原始抗體相似的抗原特異性。

「嵌合抗體」係指其中可變區衍生自一個物種並且恒定區衍生自另一物種的抗體，例如其中可變區衍生自小鼠抗體並且恒定區衍生自人抗體的抗體。

「抗抗原」抗體係指與該抗原特異性結合的抗體。例如，抗PD-L1抗體特異性結合PD-L1且抗CD73抗體特異性結合CD73。

抗體的「抗原結合部分」（也稱為「抗原結合片段」）係指抗體的一或多個片段，其保留了與由整個抗體結合的抗原特異性結合的能力。已證明抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段或部分來執行。術語抗體（例如本文所描述的抗CD73抗體）的「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內涵蓋的結合片段的實例包括： (1) Fab片段（來自木瓜蛋白酶裂解的片段）或由VL、VH、LC和CH1結構域組成的類似單價片段； (2) F(ab’)2片段（來自胃蛋白酶裂解的片段）或包含藉由鉸鏈區的雙硫鍵連接的兩個Fab片段的類似二價片段； (3) 由VH和CH1結構域組成的Fd片段； (4) 由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段； (5) 由VH結構域組成的單結構域抗體（dAb）片段（Ward等人, (1989) Nature [自然] 341:544-46）； (6) 由藉由鉸鏈連接的兩個VH結構域組成的雙單結構域抗體（雙親和重靶向抗體（DART））； (7) 雙可變結構域免疫球蛋白； (8) 分離的互補決定區（CDR）；以及 (9) 兩個或更多個分離的CDR的組合，其可視需要地藉由合成連接子連接。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法將這兩個結構域藉由使它們能夠形成為單一蛋白鏈的合成連接子來相連，其中VL區和VH區配對形成單價分子（被稱為單鏈Fv（scFv）；參見例如Bird等人 (1988) Science [科學] 242:423-426；以及Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883）。此類單鏈抗體還旨在涵蓋在術語抗體的「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。該等抗體片段係使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得的，並且該等片段以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選。可以藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白的酶裂解或化學裂解來產生抗原結合部分。

如本文所用，術語「CD73多肽」係指CD73（分化簇73）蛋白，文獻中也稱為5’-核苷酸酶（5’-NT）或外-5’-核苷酸酶，由NT5E基因編碼。參見例如Misumi等人, Eur. J. Biochem. [歐洲生物化學雜誌] 191(3): 563- 9 (1990)。CD73的人和鼠形式的相應序列可在Uniprot數據庫分別以登錄號P21589和Q61503獲得。在定義任何CD73抗體表位時，使用的胺基酸編號表示不含訊息序列殘基的成熟CD73蛋白的胺基酸殘基。因此，例如，抗體結合胺基酸Val144、Lys180、以及Asnl85係指訊息序列裂解之後的胺基酸位置，即成熟蛋白質中的胺基酸。

「T細胞檢查點抑制劑」或「免疫檢查點抑制劑」係指抑制免疫檢查點蛋白的功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻斷。特別地，免疫檢查點蛋白係人免疫檢查點蛋白。因此，免疫檢查點蛋白抑制劑特別地是人免疫檢查點蛋白的抑制劑。

「計畫性死亡配體-1（PD-L1）」係PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體中之一種（另一種係PD-L2），該等配體在與PD-1結合時下調T細胞活化和細胞介素分泌。如本文所用，術語「PD-L1」包括人PD-L1（hPD-L1），hPD-L1的變體、同種型和物種同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同表位的5種類似物。完整hPD-L1序列可以在GenBank登錄號Q9NZQ7下找到。

如本文所用，「患者」包括患有癌症（例如，非小細胞肺癌（NSCLC））的任何患者。術語「受試者」和「患者」在本文中可互換使用。

「投與」係指使用熟悉該項技術者已知的任何不同方法和遞送系統將包含治療劑的組成物物理引入受試者。用於本文揭露的配製物的投與途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊髓或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，短語「腸胃外投與」意指除了腸道和局部投與以外的投與模式，通常藉由注射投與，並且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注，以及體內電穿孔。在一些方面，配製物經由非腸胃外途徑投與，在一些方面口服投與。其他非腸胃外途徑包括局部、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、陰道、直腸、舌下或局部。投與也可以進行例如一次、多次和/或持續一或多個延長的時期。

對受試者的「治療」或「療法」係指對受試者進行的任何類型的干預或處理，或向受試者投與活性劑，目的係逆轉、緩解、改善、抑制、減緩或阻止與疾病相關的症狀、併發症或病症或者與疾病相關的生化指標的發作、進展、發展、嚴重程度或復發。

如本文所用，「有效治療」係指產生有益效果的治療，例如，改善疾病或病症的至少一種症狀。有益效果可以呈相對於基線的改進形式，即，相對於在根據該方法開始療法之前所得測量或觀察的改進。有益效果還可以呈以下形式：遏制、減緩、延緩、或穩定實性瘤標誌物的有害進展。有效治療可以指緩解實性瘤的至少一種症狀。此類有效治療可以例如減少患者疼痛，減小病變的大小和/或減少數量，可以減少或預防腫瘤的轉移，和/或可以減緩腫瘤生長。

術語「有效量」係指提供所希望的生物、治療和/或預防結果的藥劑的量。該結果可為降低、改善、緩和、減輕、延遲和/或緩解疾病的體征、症狀、或原因中之一或多個，或者生物系統的任何其他希望的改變。關於實性瘤，有效量包括足以引起腫瘤縮小和/或降低腫瘤生長速率（例如抑制腫瘤生長）或者預防或延遲其他不想要的細胞增殖的量。在一些方面，有效量係足以延遲腫瘤發展的量。在一些方面，有效量係足以預防或延遲腫瘤復發的量。有效量可以在一次或多次投與中投與。有效量的藥物或組成物可以：(i) 減少癌細胞的數量；(ii) 減小腫瘤大小；(iii) 在一定程度上抑制、延緩、減緩並可能阻止癌細胞向外周器官中的浸潤；(iv) 抑制（即在一定程度上減緩並且可能阻止）腫瘤轉移；(v) 抑制腫瘤生長；(vi) 預防或延遲腫瘤形成和/或復發；和/或 (vii) 在一定程度上減輕與癌症相關的症狀中之一或多種。在一個實例中，「有效量」係抗CD73抗體的量與抗PD-L1抗體的量的組合，其臨床上被證明影響癌症的顯著減少或癌症（例如晚期實性瘤）進展的減緩。如本文所用，術語「無進展生存期」（可縮寫為PFS）係指在實性瘤（即，NSCLC）治療期間和之後患者伴隨疾病生存但疾病不惡化的時間長度。

「癌症」係指以體內異常細胞不受控制的生長為特徵的一大類各種疾病。不受調節的細胞分裂和生長導致惡性腫瘤的形成，該等惡性腫瘤侵入鄰近組織並且還藉由淋巴系統或血流轉移到身體的遠處部分。「癌症」或「癌症組織」可以包括腫瘤。

如本文所用，術語「腫瘤」係指由過度的細胞生長或增殖導致的、良性（非癌性）或惡性（癌性）的任何組織腫塊，包括癌前病變。

「免疫響應」係指免疫系統的細胞（例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥胖細胞、樹突狀細胞和嗜中性球）和由該等細胞中之任一種或肝臟產生的可溶性大分子（包括抗體、細胞介素和補體）的作用，該作用導致選擇性靶向、結合、損傷、破壞和/或清除脊椎動物體內侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞，或者在自體免疫或病理性炎症的情況下正常的人細胞或組織。

本揭露之各個方面在以下小節中進一步詳細描述。 2. 本揭露之方法

在一方面，本揭露關於用於抑制受試者中腫瘤生長的方法，該受試者與正常受試者相比具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性水平。T細胞檢查點抑制劑以及化療和/或放療的組合療法產生更好的治療結果（例如，客觀響應率和疾病控制率）。為了改善惡性腫瘤的治療，在一方面，本揭露提供了將患者識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性並且提供T細胞檢查點抑制劑及化療和/或放療的組合療法。

根據本發明多個方面，可使用眾多種化療劑。術語「化療」係指使用藥物來治療癌症。「化療劑」用於指在癌症治療中投與的化合物或組成物。該等藥劑或藥物按其在細胞內的活動模式來分類，例如它們是否影響細胞週期以及在什麼階段影響細胞週期。替代性地，藥劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA中、或藉由影響核酸合成來誘導染色體和有絲分裂畸變的能力來表徵。

化療劑的實例包括烷基化劑，例如噻替派（thiotepa）和環磷醯胺；烷基磺酸酯，例如白消安（busulfan）、英丙舒凡（improsulfan）和哌泊舒凡（piposulfan）；氮丙啶，例如苯佐替哌（benzodopa）、卡波醌（carboquone）、美妥替哌（meturedopa）和烏瑞替哌（uredopa）；乙烯亞胺和甲基胺類（methylamelamines），包括六甲蜜胺（altretamine）、曲他胺、三乙烯磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺、和三羥甲基蜜胺；多聚乙醯（acetogenin）（特別是布拉它辛（bullatacin）和布拉它辛酮（bullatacinone））；喜樹鹼（包括合成類似物拓撲替康（topotecan））；苔蘚蟲素（bryostatin）；卡利抑制素（callystatin）；CC-1065（包括其阿多來新（adozelesin）、卡折來新（carzelesin）和比折來新（bizelesin）合成類似物）；念珠藻素（cryptophycin）（特別是念珠藻素1和念珠藻素8）；尾海兔素（dolastatin）；多卡黴素（duocarmycin）（包括合成類似物KW-2189和CB 1-TM1）；軟珊瑚醇（eleutherobin）；水鬼蕉鹼（pancratistatin）；匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）；海綿抑制素（spongistatin）；氮芥（nitrogen mustard），例如氯芥苯丁酸（chlorambucil）、萘氮芥（chlornaphazine）、氯磷醯胺（cholophosphamide）、雌莫司汀（estramustine）、異環磷醯胺（ifosfamide）、二氯甲基二乙胺（mechlorethamine）、鹽酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride）、美法侖（melphalan）、新恩比興（novembichin）、苯芥膽甾醇（phenesterine）、潑尼氮芥（prednimustine）、曲磷胺（trofosfamide）、和尿嘧啶氮芥（uracil mustard）；亞硝脲（nitrosurea），例如雙氯乙基亞硝脲（carmustine）、氯脲菌素（chlorozotocin）、福莫司汀（fotemustine）、洛莫司汀（lomustine）、尼莫司汀（nimustine）、和雷莫司汀（ranimnustine）；抗生素類，例如烯二炔類抗生素（例如，卡奇黴素（calicheamicin），特別是卡奇黴素γ1I和卡奇黴素ω1I）；達內黴素，包括達內黴素A；二膦酸鹽，例如氯膦酸鹽；埃斯佩拉黴素（esperamicin）；以及新抑癌蛋白發色團和相關有色蛋白質烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素（aclacinomysins）、放線菌素（actinomycin）、安麯黴素（authrarnycin）、偶氮絲胺酸（azaserine）、吉歐黴素（bleomycins）、放線菌素C（cactinomycin）、卡拉黴素（carabicin）、洋紅黴素（carminomycin）、嗜癌素（carzinophilin）、色黴素（chromomycinis）、放線菌素D（dactinomycin）、道諾黴素（daunorubicin）、地托比星（detorubicin）、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿德力黴素（doxorubicin）（包括𠰌啉代-阿德力黴素（morpholino-doxorubicin）、氰基𠰌啉代-阿德力黴素（cyanomorpholino-doxorubicin）、2-吡咯啉基-阿德力黴素及去氧阿德力黴素）、表柔比星（epirubicin）、依索比星（esorubicin）、伊達比星（idarubicin）、麻西羅黴素（marcellomycin）、絲裂黴素（mitomycins）（例如絲裂黴素C）、黴酚酸（mycophenolic acid）、諾加黴素（nogalarnycin）、橄欖黴素（olivomycin）、培洛黴素（peplomycin）、紫菜黴素（potfiromycin）、嘌呤黴素（puromycin）、三鐵阿德力黴素（quelamycin）、羅多比星（rodorubicin）、鏈黑黴素（streptonigrin）、鏈脲菌素（streptozocin）、殺結核菌素（tubercidin）、烏苯美司（ubenimex）、淨司他丁（zinostatin）、和佐柔比星（zorubicin）；抗代謝藥，例如胺甲喋呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；葉酸類似物，例如二甲葉酸（denopterin）、蝶羅呤（pteropterin）、和三甲曲沙（trimetrexate）；嘌呤類似物，例如氟達拉濱（fludarabine）、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤（thiamiprine）、和硫鳥嘌呤（thioguanine）；嘧啶類似物，例如安西他濱（ancitabine）、阿紮胞苷（azacitidine）、6-阿紮尿苷、卡莫氟（carmofur）、阿糖胞苷（cytarabine）、二去氧尿苷、去氧氟尿苷（doxifluridine）、依諾他濱（enocitabine）、和氟尿苷（floxuridine）；雄性素，例如卡普睪酮（calusterone）、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate）、環硫雄醇（epitiostanol）、美雄烷、和睪內酯酮（testolactone）；抗腎上腺藥，例如米托坦（mitotane）和曲洛司坦（trilostane）；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯（aceglatone）；醛磷醯胺糖苷（aldophosphamide glycoside）；胺基乙醯丙酸（aminolevulinic acid）；恩尿嘧啶（eniluracil）；安吖啶（amsacrine）；貝曲布昔（bestrabucil）；比生群（bisantrene）；伊達曲沙（edatraxate）；地磷醯胺（defofamine）；秋水仙胺（demecolcine）；地吖醌（diaziquone）；依氟鳥胺酸（elformithine）；依利醋銨（elliptinium acetate）；埃博黴素（epothilone）；依託格魯（etoglucid）；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖（lentinan）；洛尼達寧（lonidainine）；美登素類（maytansinoids），例如美登素（maytansine）和安絲菌素（ansamitocin）；米托胍腙（mitoguazone）；米托蒽醌（mitoxantrone）；莫哌達醇（mopidanmol）；根瘤菌劑（nitraerine）；噴司他汀（pentostatin）；蛋胺氮芥（phenamet）；吡柔比星（pirarubicin）；洛索蒽醌（losoxantrone）；鬼臼酸（podophyllinic acid）；2-乙基醯肼；丙卡肼（procarbazine）；PSK多糖複合物；雷佐生（razoxane）；根黴素（rhizoxin）；西佐喃（sizofiran）；鍺螺胺（spirogermanium）；細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid）；三亞胺醌（triaziquone）；2,2′,2″-三氯三乙胺；新月毒素（特別是T-2毒素、疣孢黴素A（verracurin A）、桿孢菌素A（roridin A）和蛇形菌素（anguidine））；烏拉坦（urethan）；長春地辛（vindesine）；達卡巴𠯤（dacarbazine）；甘露莫司汀（mannomustine）；二溴甘露醇（mitobronitol）；二溴衛矛醇（mitolactol）；哌泊溴烷（pipobroman）；加賽特辛（gacytosine）；阿拉伯糖苷（「Ara-C」）；環磷醯胺；類紫杉醇（taxoids），例如紫杉醇（paclitaxel）和多西他賽吉西他濱（docetaxel gemcitabine）；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；鉑配位複合物，例如順鉑（cisplatin）、奧沙利鉑（oxaliplatin）、和卡鉑（carboplatin）；長春花鹼（vinblastine）；鉑；依托泊苷（etoposide）（VP-16）；異環磷醯胺；米托蒽醌（mitoxantrone）；長春新鹼（vincristine）；長春瑞濱（vinorelbine）；諾安托（novantrone）；替尼泊苷（teniposide）；依達曲沙（edatrexate）；道諾黴素（daunomycin）；胺基喋呤（aminopterin）；希羅達（xeloda）；伊班膦酸鹽（ibandronate）；伊立替康（irinotecan）（例如，CPT-11）；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸（DMFO）；維生素A酸（retinoid），例如視黃酸；卡培他濱（capecitabine）；卡鉑、丙卡肼、普卡黴素（plicomycin）、吉西他濱、溫諾平（navelbine）、法呢基蛋白轉移酶抑制劑、反鉑（transplatinum）；和上述任一種的藥學上可接受的鹽、酸、或衍生物。

在另一方面，組合包括放療。引起DNA損傷並且已經被廣泛使用的其他因子包括通常被稱為γ射線、X射線、和/或放射性同位素到腫瘤細胞的定向遞送的因子。還涵蓋其他形式的DNA損傷因子，例如微波、質子束輻照（美國專利案號5,760,395和4,870,287）、和UV輻照。很有可能，所有該等因子都對DNA、DNA的前驅物、DNA的複製和修復、染色體的組裝和維持造成廣泛的損傷。X射線的劑量範圍從長時期（3週到4週）的50至200侖琴的日劑量到2000至6000侖琴的單次劑量。放射性同位素的劑量範圍廣泛變化，並且取決於同位素的半衰期、所發射的輻射的強度和類型、和贅生細胞的吸收。

在一方面，本揭露關於將患者識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性水平和藉由投與T細胞檢查點抑制劑（例如，抗PD-L1抗體）以及化療和/或放療來治療受試者。在一方面，本揭露包括將患者識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性水平並藉由投與抗PD-L1抗體以及化療和/或放療來治療受試者的方法。

在另一方面，本揭露關於用於抑制受試者中腫瘤生長的方法，該方法包括投與CD73抑制劑、T細胞檢查點抑制劑以及化療和/或放療的組合療法。在一方面，藉由投與抗CD73抗體、抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療來抑制該受試者中的腫瘤生長。

CD73係糖基磷脂酸肌醇（GPI）錨定細胞表面蛋白，催化單磷酸腺苷（AMP）水解至腺苷，並且與CD39協同工作，CD39將三磷酸腺苷（ATP）轉化為AMP。所得腺苷充當活化許多不同組織中在細胞表面上表現的P1受體的傳訊分子。四種G蛋白偶合P1或腺苷受體已被選殖並且被命名為A1、A2A、A2B、和A3。腺苷影響廣泛的生理過程，包括神經功能、血管灌流、和免疫響應。在此過程中，該代謝物調節CNS、心血管、和免疫系統功能，僅列舉幾個例子。

越來越多的證據表明，腫瘤細胞與其微環境之間的相互作用對腫瘤形成至關重要。CD73在其中起關鍵作用的嘌呤能傳訊途徑已成為癌症進展中的重要因子。近年來已清楚，腺苷係腫瘤微環境中最重要的免疫抑制調節分子之一，並且助長免疫逃逸和腫瘤進展。

CD73係癌症發展中的關鍵蛋白分子。已發現CD73在許多癌症細胞系和腫瘤類型中過表現，包括例如乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胃癌、膽囊癌、以及與差的預後相關的癌症。

CD73的過表現除了作為癌症患者的預後生物標誌物之外，還發現其與療法（例如，癌症療法）抗性在功能上相關。CD73水平升高最初與對各種化療劑（包括長春新鹼和阿德力黴素）的抗性有關。

還證明CD73與免疫療法抗性有關。該外核苷酸酶藉由以下參與腫瘤免疫逃逸過程：抑制腫瘤特異性T細胞（特別是T輔助細胞和細胞毒性T細胞）的活化、選殖擴增和歸巢；藉由細胞溶解效應T淋巴球削弱腫瘤細胞殺死；經由腺苷的細胞外周生成來驅動Treg和Th17細胞的抑制能力；增強1型巨噬細胞至促腫瘤2型巨噬細胞的轉化；以及促進MDSC的累積。

在本揭露之一些方面，待治療的受試者具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性。在一些方面，該降低係由使用CD73抑制劑的既往治療引起的。在一些方面，CD73抑制劑係抗CD73抗體或其抗原結合片段。

在一些方面，抗CD73抗體或其抗原結合片段係PCT公開案號WO 2016/075099中所描述的抗體。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NO:9-11和12-14的HC CDR1-3和LC CDR1-3。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NOs:15和16的VH和VL。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NO:17和18的重鏈和輕鏈。在一些方面，抗CD73抗體係奧來魯單抗。

在一些方面，該方法包括在T細胞檢查點抑制劑及化療和/或放療之前、或同時投與抗CD73抗體或其抗原結合片段。在一些方面，抗CD73抗體或其抗原結合片段係PCT公開案號WO 2016/075099中所描述的抗體。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NO:9-11和12-14的HC CDR1-3和LC CDR1-3。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NOs:15和16的VH和VL。在一些方面，抗CD73抗體分別包含SEQ ID NO:17和18的重鏈和輕鏈。在一些方面，抗CD73抗體係奧來魯單抗。

在一些方面，可使用先前技術的抗體來降低CD73表現和/或活性。示例性抗CD73抗體描述於PCT公開案號WO 2018/137598；WO 2016/081748；WO 2017/064043、WO 2017/100670、和WO 2018/237157中。

在一方面，本揭露包括選擇人患者中的腫瘤進行免疫療法的方法，該方法包括：(a) 確定腫瘤樣本中CD73蛋白表現或CD73活性的水平；以及 (b) 如果該腫瘤樣本顯示降低的CD73蛋白表現或CD73活性，則選擇該腫瘤進行免疫療法。在一方面，本揭露包括識別人患者中可能對免疫療法有響應的腫瘤的方法，該方法包括：(a) 確定腫瘤樣本中CD73蛋白表現或CD73活性的水平；以及 (b) 如果該腫瘤顯示降低的CD73蛋白表現或CD73活性，則將該腫瘤識別為可能對治療有響應。在一些方面，免疫療法包括使該腫瘤與治療有效量的PD-1途徑抑制劑接觸。在一些方面，免疫療法包括使該腫瘤與治療有效量的抗PD-L1抗體接觸。在一些方面，免疫療法包括使該腫瘤與治療有效量的抗PD-1抗體接觸。在一些方面，免疫療法包括使該腫瘤與治療有效量的抗CTLA-4抗體接觸。在一些方面，免疫療法包括使該腫瘤與治療有效量的PD-1途徑抑制劑以及化療和/或放療接觸。

在另一方面，本揭露包括用於治療有需要的人患者中腫瘤生長的方法，該方法包括向該患者投與T細胞檢查點抑制劑及化療和/或放療，其中該患者在該投與之前被識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性。在一些方面，T細胞檢查點療法包括投與治療有效量的PD-1途徑抑制劑。在一些方面，T細胞檢查點療法包括投與治療有效量的抗PD-L1抗體。

在仍其他方面，本揭露包括用於使患有腫瘤的人患者的腫瘤大小減小至少10%的方法，該方法包括向該患者投與本文所揭露的組合療法（例如，抗CD73抗體、抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療；或抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療）。在一些方面，該患者在該投與之前已被識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性，並且其中與該投與之前的腫瘤大小相比，該投與使該腫瘤大小減小至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或100%。

本揭露還可以包括預防患者的復發和/或誘導緩解的方法，該方法包括向該患者投與本文所揭露的組合療法（例如，抗CD73抗體、抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療；或抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療）。在一些方面，本揭露之方法包括 (i) 將患者識別為具有降低的CD73蛋白表現或CD73活性；(ii) 向該患者投與本文所揭露的組合療法（例如，抗CD73抗體、抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療；或抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療）。

作為投與本文揭露的組合療法的結果，本揭露之方法可以治療惡性腫瘤，減小腫瘤大小，阻止腫瘤生長，從患者中消除腫瘤，防止腫瘤復發，在患者中誘導緩解，或其任何組合。在某些方面，本文所揭露組合療法的投與誘導完全響應。在其他方面，本文所揭露組合療法的投與誘導部分響應。在一些方面，免疫療法包括投與治療有效量的PD-1途徑抑制劑及化療和/或放療。在一些方面，PD-1途徑抑制劑係抗PD-L1抗體。在一些方面，組合療法包括投與治療有效量的CD73抑制劑、T細胞檢查點抑制劑、以及化療和/或放療。在一些方面，組合療法包括投與治療有效量的抗CD73抗體、抗PD-L1抗體、以及化療和/或放療。

在一些方面，藉由接收能夠確定CD73表現/活性的分析的結果來確定CD73表現或CD73活性。 CD73 活性 / 表現的測量

在一方面，為了評估CD73表現/活性，從需要該療法的患者獲得測試樣本。在一些方面，測試樣本包括但不限於任何臨床相關的樣本，例如腫瘤活組織檢查、核芯活組織檢查組織樣本、細針穿刺物，或者體液樣本，例如血液、血漿、血清、淋巴液、腹水、囊液、或尿液。在一些方面，測試組織樣本來自原發性腫瘤。在一些方面，測試樣本來自轉移瘤。在一些方面，測試樣本在多個時間點取自受試者，例如，在處理前、處理期間和/或處理後。在一些方面，測試樣本取自受試者的不同位置，例如，一個樣本來自原發性腫瘤且一個樣本來自遠處位置的轉移瘤。

在一些方面，測試組織樣本係石蠟包埋的經固定組織樣本。在一些方面，測試組織樣本係經福馬林固定的石蠟包埋（FFPE）組織樣本。在一些方面，測試組織樣本係新鮮組織（例如，腫瘤）樣本。在一些方面，測試組織樣本係冷凍組織樣本。在一些方面，測試組織樣本係新鮮冷凍（FF）組織（例如，腫瘤）樣本。在一些方面，測試組織樣本係從流體中分離的細胞。在一些方面，測試組織樣本包括循環腫瘤細胞（CTC）。在一些方面，測試組織樣本包括循環淋巴球。在一些方面，測試組織樣本係歸檔組織樣本。在一些方面，測試組織樣本係具有已知診斷、治療和/或結局歷史的歸檔組織樣本。在一些方面，樣本係組織塊。在一些方面，測試組織樣本係分散的細胞。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約1×10 ⁶個細胞或更多。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約1×10 ⁵個細胞。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約10,000個細胞。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約1,000個細胞。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約100個細胞。在一些方面，樣本大小為約1個細胞至約10個細胞。在一些方面，樣本大小為單個細胞。

在另一方面，對CD73活性/表現的評估可以在不獲得測試組織樣本的情況下實現。在一些方面，選擇合適的患者包括 (i) 視需要地提供該組織的從患有癌症的患者獲得的測試組織樣本，該測試組織樣本包含腫瘤細胞；以及 (ii) 基於測試組織樣本中在細胞表面上表現CD73的細胞比例低於預定閾值水平的評估，來評估該測試組織樣本中在細胞表面上表現CD73的細胞比例。

然而，在包括測量測試樣本中CD73表現的方法的任一種中，應理解，包括提供獲自患者的測試樣本的步驟係視需要步驟。也就是說，在某些方面，該方法包括該步驟，且在其他方面，該步驟不包括在該方法中。還應理解，在某些方面，用於識別測試樣本中表現CD73的細胞、或確定該等細胞的數量或比例的「測量」或「評估」步驟係藉由分析CD73表現的轉換方法進行的，例如藉由進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析、IHC、成像質譜流式（IMC）或質譜成像（MSI）分析。在某些其他方面，不涉及轉換步驟並且CD73表現藉由例如審閱來自實驗室的測試結果報告來評估。在一些方面，CD73活性/表現藉由審閱例如來自實驗室的免疫組織化學分析的結果來評估。在某些方面，提供測試結果的步驟由開業醫師或在開業醫師指導下行事的人來進行。在其他方面，該等步驟由獨立實驗室或由獨立人員（例如實驗室技術人員）來進行。

在本發明方法的任一個的某些方面，藉由進行用以檢測CD73 RNA的存在的分析來評估表現CD73的細胞的比例。在進一步方面，藉由RT-PCR、原位雜交或RNA酶保護來檢測CD73 RNA的存在。在一些方面，藉由基於RT-PCR的分析來檢測CD73 RNA的存在。在一些方面，對基於RT-PCR的分析進行評分包括相對於預定水平來評估測試組織樣本中CD73 RNA表現的水平。

在其他方面，藉由進行用以檢測CD73多肽存在的分析來評估表現CD73的細胞的比例。在進一步方面，藉由IHC、酶聯免疫吸附分析（ELISA）、體內成像、或流動式細胞分析術來檢測CD73多肽的存在。在一些方面，藉由IHC、成像質譜流式（IMC）、或質譜成像（MSI）來分析CD73表現。在所有該等方法的其他方面，使用例如IHC或體內成像來分析CD73的細胞表面表現。 T 細胞檢查點抑制劑

在腫瘤微環境中，癌細胞可藉由改變其表面抗原來逃避免疫監視，由此避免被宿主淋巴球檢測到並破壞。腫瘤誘導的免疫抑制的中心機制係能夠結合抑制性T細胞受體的配體的表現增加。該等配體被稱為T細胞或免疫檢查點並且在生理條件下起作用，以在免疫響應期間的多個步驟中阻止自體免疫的發展。T細胞調節中涉及的主要機制係在淋巴結中在最初階段潛在自身反應性初始T細胞（以針對自身抗原的TCR為特徵）的抑制、或在後期外周組織中的T細胞失活。這個過程被稱為外周耐受並且主要藉由免疫檢查點細胞毒性T淋巴球相關抗原4（CTLA-4）和計畫性死亡蛋白1（PD-1）途徑發揮作用。腫瘤細胞已經發展出藉由誘導T細胞的紊亂免疫檢查點表現來利用外周耐受的方法，來躲避免疫識別。

還發現了其他新的檢查點。下一代免疫檢查點包括例如淋巴球活化基因-3（LAG-3）、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（TIM-3）、B和T細胞淋巴球弱化因子（BTLA）、T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域（TIGIT）、T細胞活化V結構域Ig抑制因子（VISTA）、和B7同源物3蛋白（B7-H3）。 PD-1 途徑抑制劑

在某些方面，本申請涵蓋抗PD-L1抗體作為T細胞檢查點抑制劑之用途。在一方面，抗PD-L1抗體抑制PD-L1受體（即，PD-1）與其配體PD-L1的結合。

適用於本揭露方法的抗人PD-L1抗體（或衍生自該抗體的VH和/或VL結構域）可以使用本領域中熟知的方法來生成。在某些方面，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段係PCT公開案號WO 2011/066389中所描述的抗體。在一些方面，抗PD-L1抗體分別包含SEQ ID NO:1-3和4-6的HC CDR1-3和LC CDR1-3。在一些方面，抗PD-L1抗體分別包含SEQ ID NOs:7和8的VH和VL。在一些方面，抗CD73抗體係德瓦魯單抗。

替代性地，可以使用本領域公認的抗PD-L1抗體。例如，可用於所請求方法中的抗PD-L1抗體揭露於美國專利案號7,943,743中。此類抗PD-L1抗體包括12A4（也稱為BMS-936559）。在一些方面，抗PD-L1抗體係阿替利珠單抗（atezolizumab）（Tecentriq或RG7446）（參見例如Herbst等人, (2013) J Clin Oncol [臨床腫瘤學雜誌] 31（增刊）:3000. 摘要；美國專利案號8,217,149）、或阿維魯單抗（avelumab）（Bavencio）。可使用的其他本領域公認的抗PD-L1抗體包括例如美國專利案號7,635,757和8,217,149、美國公開案號2009/0317368、和PCT公開案號WO 2011/066389和WO 2012/145493中描述的那些，該等文獻藉由援引併入本文。也可以使用與該等本領域公認的抗體或抑制劑中之任一種競爭結合PD-L1的抗體。

在某些方面，與上述參考的PD-L1抗體交叉競爭結合人PD-L1或與該等抗體結合人PD-L1的相同表位區的抗體係mAb。對於投與給人受試者，該等交叉競爭抗體可為嵌合抗體，或者可為人源化或人抗體。這樣的嵌合、人源化或人mAb可以藉由本領域中熟知的方法來製備和分離。

在某些方面，PD-L1抗體係德瓦魯單抗（IMFINZI™）。德瓦魯單抗係人IgG1 κ單株抗PD-L1抗體。

在某些方面，PD-L1抗體係阿替利珠單抗（TECENTRIQ®）。阿替利珠單抗係完全人源化IgG1單株抗PD-L1抗體。

在某些方面，PD-L1抗體係阿維魯單抗（BAVENCIO®）。阿維魯單抗係人IgG1 λ單株抗PD-L1抗體。

可在所揭露的方法中使用的抗PD-L1抗體還包括分離的抗體，該等分離的抗體特異性結合人PD-L1並且與本文所揭露的任何抗PD-L1抗體（例如，德瓦魯單抗、阿替利珠單抗、和/或阿維魯單抗）交叉競爭結合人PD-L1。在一些方面，抗PD-L1抗體與本文所描述的抗PD-L1抗體中之任一種（例如，德瓦魯單抗、阿替利珠單抗、和/或阿維魯單抗）結合相同的表位。抗體交叉競爭結合抗原的能力指示該等抗體結合抗原的相同表位區並且在空間上阻礙其他交叉競爭抗體與該特定表位區的結合。該等交叉競爭抗體預期憑藉結合PD-L1的相同表位區來具有與參考抗體的功能性質極相似的功能性質。交叉競爭抗體可以在標準PD-L1結合分析（例如，Biacore分析、ELISA分析或流動式細胞分析術）中基於其與阿替利珠單抗和/或阿維魯單抗交叉競爭的能力容易地被識別（參見例如WO 2013/173223）。

在某些方面，與德瓦魯單抗、阿替利珠單抗、和/或阿維魯單抗交叉競爭結合人PD-L1或與德瓦魯單抗、阿替利珠單抗、和/或阿維魯單抗結合人PD-L1抗體的相同表位區的抗體係單株抗體。對於投與給人受試者，該等交叉競爭抗體係嵌合抗體、工程化抗體、或人源化或人抗體。這樣的嵌合、工程化、人源化或人單株抗體可以藉由本領域中熟知的方法來製備和分離。

可在本揭露之方法中使用的抗PD-L1抗體還包括上述抗體的抗原結合部分。已經充分地證明，抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。

適用於所揭露的方法或組成物的抗PD-L1抗體係以高特異性及親和力結合PD-L1、阻斷PD-1的結合、且抑制PD-1傳訊途徑的免疫抑制效果的抗體。在本文所揭露的任何組成物或方法中，抗PD-L1「抗體」包括結合PD-L1並且在抑制受體結合和上調免疫系統方面展現出與全抗體的功能性質相似的功能性質的抗原結合部分或片段。在某些方面，抗PD-L1抗體或其抗原結合部分與德瓦魯單抗、阿替利珠單抗、和/或阿維魯單抗交叉競爭結合人PD-L1。 3. PD-1 抑制劑

在一些方面，T細胞檢查點抑制劑係PD-1途徑抑制劑，例如抗PD-1抗體。在一些方面，PD-1途徑抑制劑係PD-L2結合劑，例如抗PD-L2抗體。在進一步方面，PD-L1結合劑係可溶性PD-1多肽，例如能夠結合PD-L1的PD-1-Fc融合多肽。在進一步方面，PD-L2結合劑係可溶性PD-1多肽，例如能夠結合PD-L2的PD-1-Fc融合多肽。

適用於本揭露之抗人PD-1抗體（或衍生自該抗體的VH和/或VL結構域）可以使用本領域中熟知的方法來生成。替代性地，可使用本領域公認的抗PD-1抗體。

在其他方面，抗PD-1抗體係WO 2006/121168中描述的納武單抗（Nivolumab）或BMS-936558。其他已知的PD-1抗體包括WO 2008/156712中描述的蘭洛利珠單抗（lambrolizumab）（MK-3475）。進一步已知的PD-1抗體和其他PD-1抑制劑包括例如WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335和WO 2011/161699（該等文獻藉由援引併入本文）中描述的那些。在一方面，抗PD-1抗體係REGN2810。在一方面，抗PD-1抗體係PDR001。另一已知的抗PD-1抗體係匹地利珠單抗（pidilizumab）（CT-011）。

在一些方面，抗PD-1抗體或其片段與派姆單抗（pembrolizumab）交叉競爭。在一些方面，抗PD-1抗體或其片段與派姆單抗結合相同的表位。在某些方面，抗PD-1抗體與派姆單抗具有相同的CDR。在另一方面，抗PD-1抗體係派姆單抗。派姆單抗（也稱為「KEYTRUDA ^®」、蘭洛利珠單抗、和MK-3475）係針對人細胞表面受體PD-1（計畫性死亡蛋白-1或計畫性細胞死亡蛋白-1）的人源化單株IgG4抗體。派姆單抗描述於例如美國專利案號8,354,509和8,900,587中。

在某些方面，第一抗體係抗PD-1拮抗劑。抗PD-1拮抗劑的一個實例係AMP-224，其係B7-DC Fc融合蛋白。AMP-224描述於美國公開案號2013/0017199中。

在其他方面，抗PD-1抗體或其片段與BGB-A317交叉競爭。在一些方面，抗PD-1抗體或其片段與BGB-A317結合相同的表位。在某些方面，抗PD-1抗體與BGB-A317具有相同的CDR。在某些方面，抗PD-1抗體係BGB-A317，其係人源化單株抗體。BGB-A317描述於美國公開案號2015/0079109中。

在一些方面，抗體係匹地利珠單抗（CT-011），其係先前被報告結合PD-1、但認為結合不同靶標的抗體。匹地利珠單抗描述於美國專利案號8,686,119 B2或WO 2013/014668 A1中。

在某些方面，與納武單抗競爭結合人PD-1或與納武單抗結合人PD-1的相同表位區的抗體係mAb。對於投與給人受試者，該等交叉競爭抗體可為嵌合抗體、或人源化或人抗體。這樣的嵌合、人源化或人mAb可以藉由本領域中熟知的方法來製備和分離。

其他抗PD-1單株抗體已經描述於例如美國專利案號6,808,710、7,488,802、8,168,757和8,354,509，美國公開案號2016/0272708，及PCT公開案號WO 2012/145493、WO 2008/156712、WO 2015/112900、WO 2012/145493、WO 2015/112800、WO 2014/206107、WO 2015/35606、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2017/020291、WO 2017/020858、WO 2016/197367、WO 2017/024515、WO 2017/025051、WO 2017/123557、WO 2016/106159、WO 2014/194302、WO 2017/040790、WO 2017/133540、WO 2017/132827、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/106061、WO 2017/19846、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825、及WO 2017/133540中，該等文獻各自藉由援引以其全文併入。

可用於本揭露之組成物的抗PD-1抗體還包括上述抗體的抗原結合部分。已經充分地證明，抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。涵蓋在術語抗體的「抗原結合部分」內的結合片段的實例包括 (i) Fab片段，其為由V _L 、V _H 、C _L 和C _H1 結構域組成的單價片段；(ii) F(ab') ₂片段，其為包含兩個在鉸鏈區處由雙硫鍵連接的Fab片段的二價片段；(iii) 由V _H 和C _H1 結構域組成的Fd片段；以及 (iv) 由抗體的單臂的V _L 和V _H 結構域組成的Fv片段。

可在所揭露的方法中使用的抗PD-1抗體還包括分離的抗體，該等分離的抗體特異性結合人PD-1並且與本文所揭露的任何抗PD-1抗體交叉競爭結合人PD-1。在一些方面，抗PD-1抗體與本文所描述的抗PD-1抗體中之任一種結合相同的表位。抗體交叉競爭結合抗原的能力指示該等單株抗體結合抗原的相同表位區並且在空間上阻礙其他交叉競爭抗體與該特定表位區的結合。該等交叉競爭抗體預期具有與參考抗體的功能性質極相似的功能性質。 4. LAG-3 抑制劑

在一些方面，LAG-3抑制劑係LAG-3結合劑，例如抗LAG-3抗體。在一些方面，LAG-3抑制劑係可溶性LAG-3多肽，例如能夠結合MHC II類的LAG-3-Fc融合多肽。

適用於本揭露之抗人LAG-3抗體（或衍生自該抗體的VH/VL結構域）可以使用本領域中熟知的方法來生成。替代性地，可使用本領域公認的抗LAG-3抗體。在某些方面，LAG-3抑制劑包括抗LAG-3雙特異性抗體。

在一些方面，抗LAG-3抗體係PCT/US13/48999中描述的包含重鏈和輕鏈的瑞拉利單抗（relatlimab）或BMS-986016。

在另一方面，抗體與上文提到的抗體競爭結合和/或與上文提到的抗體結合LAG-3上的相同表位。

在一些方面，本領域公認的抗LAG-3抗體可用於本揭露之治療方法中。例如，可以使用US2011/0150892 A1中所描述且被稱為單株抗體25F7（也稱為「25F7」和「LAG-3.1」）的抗人LAG-3抗體。可以使用的其他本領域公認的抗LAG-3抗體包括US 2011/007023中描述的IMP731（H5L7BW）、WO 2016028672中描述的MK-4280（28G-10）、Journal for ImmunoTherapy of Cancer [癌症免疫療法雜誌], (2016) 第4卷, 增刊1 摘要號: P195中描述的REGN3767、WO2017/019894中描述的BAP050、IMP-701（LAG-525）、Sym022、TSR-033、MGD013、BI754111、FS118、AVA-017和GSK2831781。可用於所主張揭露的該等和其他抗LAG-3抗體可見於例如以下中：WO2016/028672、WO2017/106129、WO2017/062888、WO2009/044273、WO2018/069500、WO2016/126858、WO2014/179664、WO2016/200782、WO2015/200119、WO2017/019846、WO2017/198741、WO2017/220555、WO2017/220569、WO2018/071500、WO2017/015560、WO2017/025498、WO2017/087589、WO2017/087901、WO2018/083087、WO2017/149143、WO2017/219995、US2017/0260271、WO2017/086367、WO2017/086419、WO2018/034227、及WO2014/140180。在一方面，LAG-3抑制劑係IMP321（依替拉莫德α（eftilagimod alpha））。該等參考文獻各自的內容藉由援引以其全文併入本文。

也可以使用與上文提到的本領域公認的抗體競爭結合LAG-3的抗體。 5. CTLA-4 拮抗劑

在某些方面，本申請涵蓋抗CTLA-4抗體之用途。在一方面，抗CTLA-4抗體結合並抑制CTLA-4。在一些方面，抗CTLA-4抗體係伊匹木單抗（ipilimumab）（YERVOY）、曲美木單抗（tremelimumab）（替西木單抗（ticilimumab）；CP-675,206）、AGEN-1884、或ATOR-1015。

在一方面，CTLA-4拮抗劑係可溶性CTLA-4多肽。在一方面，該可溶性CTLA-4多肽係阿巴西普（abatacept）（Orencia）、貝拉西普（belatacept）（Nulojix）、RG2077、或RG-1046。在另一方面，CTLA-4拮抗劑係基於細胞的療法。在一些方面，CTLA-4拮抗劑係抗CTLA-4 mAb RNA/GITRL RNA轉染的自體樹突狀細胞疫苗或抗CTLA-4 mAb RNA轉染的自體樹突狀細胞疫苗。 6. 另外的免疫檢查點抑制劑

在某些方面，免疫檢查點抑制劑係CD80拮抗劑、CD86拮抗劑、TIM-3拮抗劑、TIGIT拮抗劑、CD20拮抗劑、CD96拮抗劑、IDO1拮抗劑、STING拮抗劑、GARP拮抗劑、CD40拮抗劑、A2aR拮抗劑、CEACAM1（CD66a）拮抗劑、CEA拮抗劑、CD47拮抗劑、PVRIG拮抗劑、TDO拮抗劑、VISTA拮抗劑、或KIR拮抗劑。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係KIR拮抗劑。在某些方面，KIR拮抗劑係抗KIR抗體或其抗原結合片段。在一些方面，抗KIR抗體係利瑞魯單抗（lirilumab）（1-7F9、BMS-986015、IPH 2101）或IPH4102。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係TIGIT拮抗劑。在一方面，TIGIT拮抗劑係抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。在某些方面，抗TIGIT抗體係BMS-986207、AB 154、COM902（CGEN-15137）、或OMP-313M32。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係TIM-3拮抗劑。在某些方面，TIM-3拮抗劑係抗TIM-3抗體或其抗原結合片段。在一些方面，抗TIM-3抗體係TSR-022或LY3321367。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係IDO1拮抗劑。在另一方面，IDO1拮抗劑係吲哚昔莫德（indoximod）（NLG8189；1-甲基- _D-TRP）、艾卡哚司他（epacadostat）（INCB-024360、INCB-24360）、KHK2455、PF-06840003、那伏莫德（navoximod）（RG6078、GDC-0919、NLG919）、BMS-986205（F001287）、或吡咯啶-2,5-二酮衍生物。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係STING拮抗劑。在某些方面，STING拮抗劑係2’或3’-單氟取代的環狀二核苷酸；2’,3’-二氟取代的混合鍵聯2’,5’ – 3’,5’環狀二核苷酸；2’-氟取代的,雙-3’,5’環狀二核苷酸；2’,2’’-二F-Rp,Rp,雙-3’,5’環狀二核苷酸；或氟化環狀二核苷酸。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CD20拮抗劑。在一些方面，CD20拮抗劑係抗CD20抗體或其抗原結合片段。在一方面，抗CD20抗體係利妥昔單抗（rituximab）（RITUXAN；IDEC-102；IDEC-C2B8）、ABP 798、奧法木單抗（ofatumumab）、或奧妥珠單抗（obinutuzumab）。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CD80拮抗劑。在某些方面，CD80拮抗劑係抗CD80抗體或其抗原結合片段。在一方面，抗CD80抗體係加利昔單抗（galiximab）或AV 1142742。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係GARP拮抗劑。在一些方面，GARP拮抗劑係抗GARP抗體或其抗原結合片段。在某些方面，抗GARP抗體係ARGX-115。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CD40拮抗劑。在某些方面，CD40拮抗劑係抗CD40抗體或其抗原結合片段。在一些方面，抗CD40抗體係BMS3h-56、盧卡木單抗（lucatumumab）（HCD122和CHIR-12.12）、CHIR-5.9、或達西珠單抗（dacetuzumab）（huS2C6、PRO 64553、RG 3636、SGN 14、SGN-40）。在另一方面，CD40拮抗劑係可溶性CD40配體（CD40-L）。在一方面，該可溶性CD40配體係融合多肽。在一方面，該可溶性CD40配體係CD40-L/FC2或單體CD40-L。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係A2aR拮抗劑。在一些方面，A2aR拮抗劑係小分子。在某些方面，A2aR拮抗劑係 CPI-444、PBF-509、伊曲茶鹼（istradefylline）（KW-6002）、瑞德南特（preladenant）（SCH420814）、托紮南特（tozadenant）（SYN115）、維帕南特（vipadenant）（BIIB014）、HTL-1071、ST1535、SCH412348、SCH442416、SCH58261、ZM241385、或AZD4635。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CEACAM1拮抗劑。在一些方面，CEACAM1拮抗劑係抗CEACAM1抗體或其抗原結合片段。在一方面，抗CEACAM1抗體係CM-24（MK-6018）。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CEA拮抗劑。在一方面，CEA拮抗劑係抗CEA抗體或其抗原結合片段。在某些方面，抗CEA抗體係阿姆白介素-2-瑟妥珠單抗（cergutuzumab amunaleukin）（RG7813、RO-6895882）或RG7802（RO6958688）。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係CD47拮抗劑。在一些方面，CD47拮抗劑係抗CD47抗體或其抗原結合片段。在某些方面，抗CD47抗體係HuF9-G4、CC-90002、TTI-621、ALX148、NI-1701、NI-1801、SRF231、或Effi-DEM。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係PVRIG拮抗劑。在某些方面，PVRIG拮抗劑係抗PVRIG抗體或其抗原結合片段。在一方面，抗PVRIG抗體係COM701（CGEN-15029）。

在一方面，免疫檢查點抑制劑係TDO拮抗劑。在一方面，TDO拮抗劑係4-(吲哚-3-基)-吡唑衍生物、3-吲哚取代的衍生物、或3-(吲哚-3-基)-吡啶衍生物。在另一方面，免疫檢查點抑制劑係雙重IDO和TDO拮抗劑。在一方面，雙重IDO和TDO拮抗劑係小分子。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的抑制劑係B7-H3的抑制劑。在一些實施方式中，B7-H3的抑制劑係依諾妥珠單抗（enoblituzumab）、MGD009、或8H9。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係OX40、CD27、CD28、GITR、ICOS、TLR7/8、和CD137（也稱為4-1BB）的促效劑。

在一些實施方式中，CD137的促效劑係烏瑞魯單抗（urelumab）。在一些實施方式中，CD137的促效劑係烏托魯單抗（utomilumab）。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係GITR的抑制劑。在一些實施方式中，GITR的促效劑係TRX518、MK-4166、INCAGN1876、MK-1248、AMG228、BMS-986156、GWN323、MEDI1873、或MEDI6469。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係OX40的促效劑，例如OX40促效劑抗體或OX40L融合蛋白。在一些實施方式中，抗OX40抗體係INCAGN01949、MEDI0562（他利昔單抗（tavolimab））、MOXR-0916、PF-04518600、GSK3174998、BMS-986178、或9B12。在一些實施方式中，OX40L融合蛋白係MEDI6383。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係ICOS的促效劑。在一些實施方式中，ICOS的促效劑係GSK-3359609、JTX-2011、或MEDI-570。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係CD28的促效劑。在一些實施方式中，CD28的促效劑係瑟拉珠單抗（theralizumab）。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係CD27的促效劑。在一些實施方式中，CD27的促效劑係伐利魯單抗（varlilumab）。

在一些實施方式中，免疫檢查點分子的促效劑係TLR7/8的促效劑。在一些實施方式中，TLR7/8的促效劑係MEDI9197。 7. 患者群體

本文提供了使用本文揭露的療法（例如，T細胞檢查點抑制劑（例如，抗PD-L1抗體）、CD73抑制劑（例如，抗CD73抗體）以及化療和/或放療）來治療受試者（例如，人患者）的腫瘤的臨床方法。

可以使用本揭露之方法治療的癌症和/或惡性腫瘤的實例包括肝癌、肝細胞癌（HCC）、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、口腔癌、頭頸癌、乳癌、肺癌、小細胞肺癌、NSCLC、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、腎癌、子宮癌、卵巢癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、非何杰金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實性瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS）腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱軸腫瘤、腦幹膠質細胞瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma）、類表皮癌、鱗狀細胞癌、環境誘發的癌症（包括由石棉誘發的癌症）、血液系統惡性腫瘤（包括例如多發性骨髓瘤、B-細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤/原發性縱隔B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、急性髓系淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴樣白血病、濾泡性淋巴瘤、彌漫型大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）、成免疫細胞性大細胞淋巴瘤、前驅B淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞性白血病、蕈狀肉芽腫、間變性大細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、及前驅T淋巴母細胞性淋巴瘤）、和所述癌症的任何組合。本揭露還可以應用於轉移性癌症的治療。在多個方面，癌症係腎細胞癌（RCC）、胃/胃食管結合部癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、肝細胞癌、或尿路上皮癌。

在一方面，人患者患有使用免疫檢查點抑制劑難治的惡性腫瘤。在另一方面，患者患有使用PD-L1抑制劑治療難治的惡性腫瘤。在另一方面，患者患有使用抗PD-L1抗體難治的惡性腫瘤。實例 實驗方法動物研究

使用8-10週齡BALB/cAnNCrl小鼠（英國查理斯河公司（Charles River UK））或C57BL/6進行體內研究。將小鼠圈養在阿斯利康公司（AstraZeneca）飼養室中，可以隨意獲得食物和水，且每天由經培訓的人員照料。使小鼠適應飼養室條件一週，並根據內政部動物科學程序法案（Home Office Animals Scientific Procedures Act）, 1986, 英國進行處置。所有動物工作都在內政部批准的項目許可證（PPL P49077891）和PP3208003（RTx研究）下以及根據機構指南進行。向BALB/c小鼠皮下植入0.5e ⁶個CT26（結腸直腸）腫瘤細胞。向C57BL/6小鼠皮下植入0.5e ⁶個於50% Matrigel®（康寧公司（Corning），目錄號356231）及PBS中的MCA205（纖維肉瘤）腫瘤細胞或0.5e ⁶個於PBS中的MC38細胞。從第-5天開始，利用卡尺每週三次測量腫瘤。荷瘤小鼠使用6 mg/Kg劑量水平的奧沙利鉑（赫士睿公司（Hospira），臨床級，5 mg/mL）及50 mg/Kg劑量水平的5-氟尿嘧啶（赫士睿公司，臨床級，50 mg/mL）的組合或以10 mg/Kg給藥的多西他賽（阿克德公司（Accord），臨床級，20 mg/mL）連同奧來魯單抗（殖株10.3，具有鼠IgG1 Fc序列的抗CD73，10 mg/Kg或20 mg/Kg）和德瓦魯單抗（殖株80，具有IgG1 Fc序列的嵌合大鼠抗小鼠PD-L1抗體，10 mg/Kg）的鼠替代單株抗體一起來處理。所採用的化療的劑量和時間表係基於先前公佈的資訊（Dosset M等人, Oncoimmunology [腫瘤免疫學] 2018; 7；Gao Q等人, J Immunother Cancer [癌症免疫療法雜誌] 2019; 7:42）。為了明確各組分的貢獻，比較組接受單一療法和其他組合迭代。在適當時間點取出各組小鼠用於藥效學分析MSI、和總轉錄本學、以及免疫組織化學（IHC）分析。對於放療實驗，腫瘤使用X射線源自遮罩櫃式輻照器（Xstrahl CIX3）連續每天給予五劑2Gy部分進行處理。體外分析

將細胞（HCT-116、HT-29、CT-26和MCA-205）以1e ⁴個細胞/孔接種在96孔培養板中於40 µl完全培養基中，並在37°C/5% CO ₂培養箱中培養約4小時以使細胞黏附。將10 µl/孔的5x最終濃度的奧來魯單抗（5 nM）添加到細胞，並在37°C/5% CO ₂培養箱中培養過夜，以允許奧來魯單抗預處理。將50 µl/孔的2x最終濃度的連續稀釋化療藥物（5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西他賽）根據治療組添加到細胞並在37°C/5% CO ₂培養箱中培養72 h。細胞活力使用CellTiter-Glo®發光分析（普洛麥格公司（Promega），目錄號G7573）來測量。用於批量定序的RNA製備

在動物單元中收集時，將腫瘤組織在液氮中速凍並且儲存在-80°C，並在乾冰上送到諾禾致源公司（Novogene）。組織處理和RNA提取由諾禾致源公司藉由使用QIAGEN RNeasy Plus通用套組（凱傑公司（Qiagen），目錄號73404）根據製造商方案實施。易言之，將組織樣本在QIAzol裂解試劑中均質化。然後在添加gDNA清除劑溶液和氯仿之後，藉由離心將勻漿分離成水相和有機相。收集含有RNA的上層水相，並使用RNeasy離心柱純化RNA。RNA品質檢查（QC）係藉由1%瓊脂糖凝膠電泳進行的，量和純度係藉由Nanodrop測量的，並且RNA完整值（RIN）係藉由Bioanalyzer Agilent2100獲得的。

使用NEBNext ^®Ultra RNA文庫製備套組（目錄號E7530L）進行文庫製備以供定序。使用Illumina PE150（50M讀段/樣本）批量RNA-seq對樣本進行定序，並進行下游生物資訊學分析。 RNASeq數據的分析

使用Star將讀段映射到小家鼠基因組（mm10）基因組（Dobin A等人, Bioinformatics [生物資訊學] 2013; 29:15–21）。使用htseq-count對唯一映射的讀段進行計數（Putri GH等人, Bioinformatics [生物資訊學] 2022; 38:2943–5）。使用DESeq2（Love MI等人, Genome Biol [基因組生物學] 2014; 15）來利用大小因子對計數進行標準化，並識別在abs(log ₂FC) ＞ 1的閾值和經調整p值＜ 0.05的條件下差異表現的基因。

基因集增濃分析係使用R包「fGSEA」（Korotkevich G等人, bioRxiv 2021; 060012）使用來自小鼠MSigDB的賀曼基因集（hallmark gene set）進行的（Subramanian A.等人 ,Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 2005; 102:15545–50）。如Korotkevich G等人, bioRxiv 2021; 060012中所描述來計算增濃p值且使用本傑明-霍赫貝格（Benjamini-Hochberg）方法來調整p值。基因本體論生物過程增濃係使用R包topGO（生物導體（Bioconductor） – topGO）識別的，其中adj-pval ＜ 0.05。KEGG途徑增濃分析係使用R包clusterProfiler實施的（Wu T.等人, The Innovation [創新] 2021; 2:100141）。使用MCPCounter工具（Becht E.等人 ,Genome Biol [基因組生物學] 2016; 17:1–20）來使用MCPCounter內的免疫基因特徵針對每一樣本和條件估計免疫細胞豐度。用於質譜成像（MSI）的組織準備

腫瘤切除後立即在液氮中快速冷凍並如先前所述將冷凍的組織包埋於HPMC/PVP水凝膠中（Dannhorn A.等人, Anal Chem [分析化學] 2020; 92:11080–8）。切片係在CM3050 S冷凍切片機（徠卡生物系統公司（Leica Biosystems），德國努斯洛赫（Nussloch, Germany））上以10 μm的切片厚度進行的，並且組織切片立即被解凍安裝並在氮氣流下乾燥，並密封在真空袋中以保持切片的代謝完整性。用於DESI-MSI和IMC的組織切片被解凍安裝在Superfrost顯微鏡載玻片（VWR公司，目錄號630-2863）上，而為MALDI-MSI製備的切片被解凍安裝在導電氧化銦錫（ITO）塗布的載玻片（布魯克達爾托尼克公司（Bruker Daltonik），目錄號8237001）上。聚乙烯吡咯啶酮（PVP）和(羥丙基)甲基纖維素（HPMC）購自默克公司（Merck）（目錄號PVP360；H8384）。甲醇（目錄號15624680）、異戊烷（目錄號15692830）和異丙醇（目錄號10674732）獲自飛世爾科技公司（Fisher Scientific）。質譜成像（MSI）

DESI-MSI分析係在Q-Exactive質譜儀（塞默科技公司（Thermo Scientific），德國不來梅（Bremen, Germany））上進行的，該質譜儀配備有以陰離子模式操作的自動2D-DESI離子源（普洛索利亞公司（Prosolia Inc.），美國印第安那州印第安納波利斯（Indianapolis, IN, USA）），覆蓋高達1000的m/z的適用質量範圍，標稱質量解析度為70,000。注入時間被固定為150 ms，這導致3.8個圖元/s的掃描速率。空間解析度被設置為70 µm。自製式Swagelok DESI噴霧器係使用95%甲醇、5%水的混合物操作的，該混合物以272 1.5 μL/min的流速遞送並在6巴的背壓下使用氮氣霧化。所得.raw文件使用ProteoWizard msConvert（3.0.4043版）轉換成.mzML文件並且274隨後編譯成.imzML文件（imzML轉換器，1.3版）（Race AM等人, J Proteomics [蛋白質組學雜誌] 2012; 75:5111–2）。所有後續數據處理都在SCiLS Lab（2021b版，布魯克達爾托尼克公司，德國不來梅）中進行。

MALDI-MSI分析係在以負檢測模式操作的RapifleX Tissuetyper儀器（布魯克達爾托尼克公司，德國不來梅）上進行的。使用在80 : 20甲醇 : 水中製備的9-胺基吖啶（9-AA）作為MALDI基質並且使用自動噴霧系統（M3-噴霧器，HTX技術公司（HTX technologies），美國北卡羅來納州教堂山（Chapel Hill, NC, USA））進行噴霧沈積。MALDI實驗係以50 μm的空間解析度進行的。每個圖元匯總總共400次雷射發射以給出最終光譜。對於所有實驗，雷射係以10 kHz的重複率來操作的。所有原始數據都直接上傳並在SCiLS lab（2021b版）套裝軟體中進行處理。所有DESI及MALDI數據和圖像都被標準化成總離子流（TIC）以補償實驗過程中的訊息變化。在SCiLS lab套裝軟體中進行的數據分析包括基於組織學指導的MSI數據的手動注釋的數據集分類，以識別「腫瘤」及「壞死」，同時去除背景（若適用）。使用偏最小平方判別分析（PLS-DA）進行組織分類。藉由對「腫瘤」組織簇進行逐圖元主成分分析（PCA）來描繪出「壞死邊界」並與「活腫瘤」區分開。提取突出顯示與壞死區域相鄰的組織間室的主成分（PC）負載，並用於創建基於二分K均值分類器的無監督分割的峰列表。所示出的所有數據都是從「活腫瘤」簇提取的。成像質譜流式（IMC）

成像質譜流式係在已藉由DESI-MSI分析的載玻片上進行的。用於IMC染色的抗體示於表1。

標籤	殖株	通道	稀釋度	銷售商	產品代碼
αSMA	多株	Pr(141)	1 : 100	標準生物工具公司（Standard BioTools）	3141017D
波形蛋白	D21H3	Nd(143)	1 : 100	標準生物工具公司	3143027D
CD68	FA-11	Nd(145)	1 : 100	伯樂抗體公司（Bio Rad antibodies）	MCA1957GA
F4/80	CI:A3-1	Gd(155)	1 : 100	細胞傳訊公司（Cell Signaling）	#70076
CD163	TNKUPJ	Gd(156)	1 : 50	賽默飛世爾公司	14-1631-82
CD31	390	Dy(164)	1 : 100	賽默飛世爾公司	14-0311-82
CD206	CD68C2	Tm(169)	1 : 50	標準生物工具公司	3169021B
DNA	嵌入劑	Ir(191)	1 : 400	標準生物工具公司	201192A
膠原 IV	多株	Bi(209)	1 : 100	諾為泰實驗室公司（Novotec Labs）	20451

購買預先綴合重金屬標籤的抗體，且未加標籤的抗體由內部根據製造商說明書使用Fluidigm Maxpar抗體標記套組進行綴合。將載玻片利用於磷酸鹽緩衝液（PBS）中的4%多聚甲醛固定10分鐘。將載玻片在PBS中洗滌3 x 5分鐘，用酪蛋白溶液中1 : 1000稀釋的Triton X-100透化5分鐘，在PBS中洗滌3 x 5分鐘，並用酪蛋白溶液阻斷30分鐘。將抗體稀釋到適當濃度且載玻片與抗體溶液一起在4°C下孵育過夜。將載玻片在PBS中洗滌3 x 5分鐘且細胞核使用於PBS中的1 : 400稀釋的DNA嵌入劑-銥染色30分鐘。將載玻片在PBS中洗滌3 x 5分鐘，在去離子水中洗滌30秒，然後乾燥以在室溫下儲存直至分析。用於IMC分析的區係使用連續H&E染色切片和MSI結果來選擇的。選擇大約1.5×1.5 mm至2.0×2.0 mm的區域進行分析，以包括壞死、壞死邊界和活腫瘤區。IMC分析係使用Hyperion儀器（流達公司（Fluidigm Corporation），美國加利福尼亞州三藩市（San Francisco, CA, USA））使用4 db的消融能量和100 Hz的消融頻率進行的。

IMC數據使用Halo v.3.3.2541.366（印迪卡實驗室（Indica Laboratories），美國新墨西哥州阿布奎基（Albuquerque, NM, USA））進行分析。組織區使用隨機森林（Random Forest）分類為活腫瘤、壞死、壞死邊界和脫組織（off-tissue）。分析係使用Highplex FL v4.0.4進行的。細胞分割和閾值係經人工優化的。核分割係使用193Ir DNA嵌入劑通道進行的。使用內置的圖形製作工具對IMC圖像進行調整和提取。免疫組織化學

將每個腫瘤的一部分在10%中性緩衝福馬林中浸泡固定，然後使用常規方法加工成石蠟。將組織以4 mm厚度進行切片，並使用CD73的兔單株抗體（D7F9A，細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology））以0.5 ug/ml的稀釋度，在自動Leica Bond-RX免疫染色器上使用DAB作為發色體且蘇木精作為背景染色進行免疫組織化學染色。該抗體先前被示出了在先前用奧來魯單抗處理的組織中沒有結合抑制（未發表的觀察結果）。

使用Aperio掃描器（徠卡生物系統公司）以20倍放大率對所得載玻片進行數字掃描。為了分析，使用Halo圖像分析軟體（印迪卡實驗室）進行陽性CD73面積和蘇木精陽性面積的測量。易言之，對腫瘤區域進行人工注釋，並使用適於組織染色特點的Halo面積量化演算法測量經注釋區域內陽性DAB和蘇木精面積。獲得總腫瘤區域內CD73陽性面積和蘇木精陽性面積的百分比。所使用的最終數據輸出係CD73與蘇木精面積的比率，蘇木精面積被認為是細胞結構的代表性指標（因為它主要染色細胞核），這允許將CD73陽性面積標準化成腫瘤的整體細胞結構。統計分析

所有體內數據都被整理在Excel試算表中，並轉移到GraphPad Prism 9.00（GraphPad軟體公司（GraphPad Software Inc.））進行圖形表示和統計分析。在離群值識別和夏皮羅-維爾克（Shapiro–Wilk）正態分布檢驗後，如果數據呈正態分布，則藉由單因子變異數分析確定統計顯著性，隨後藉由鄧尼特（Dunnett）多重比較對多於兩個組進行比較。如果數據不是正態分布，則使用帶有鄧尼特多重比較檢驗的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗，如圖例中所詳細描述的。生存研究係使用對數秩（曼特爾-考克斯（Mantel-Cox））檢驗進行分析的，一次僅比較兩條生存曲線。p值沒有針對多重檢驗進行調整。實例 1 ：在同基因小鼠模型中，組合的抗 CD73 、抗 PD-L1 抗體和 5FU+OHP 處理增強完全響應

在兩個小鼠同基因癌症模型——CT26（p = 0.005）和MCA205（p = 0.008）中（如圖1B和1C所示（克魯斯卡爾-沃利斯檢驗）），抗CD73（aCD73）和抗PD-L1（aPD-L1）抗體以及5-氟尿嘧啶（5FU） + 奧沙利鉑（OHP）的組合處理實現增強的功效和完全響應。使用aCD73作為單一療法處理CT26或MCA205腫瘤荷瘤小鼠在腫瘤生長抑制方面產生的益處微不足道。抗PD-L1處理在一部分CT26腫瘤荷瘤小鼠中延緩腫瘤生長速率，但是在MCA205模型中顯示極小活性（圖2）。5FU+OHP化療在兩個模型中都抑制腫瘤生長速率，但將5FU+OHP與任一種免疫腫瘤（IO）劑（抗CD73或抗PD-L1）組合在功效方面發揮極小的進一步提升。利用抗CD73和抗PD-L1抗體的組合處理（aCD73+aPD-L1）提供了與單獨抗PD-L1相似的腫瘤生長控制水平，這突出顯示了化療組分在化療+IO組合中的重要性（圖1和2）。實例 2 ： aCD73 對細胞培養中化療誘導的細胞毒性的影響

與此同時，藉由確定抗CD73是否可以增強5FU+OHP對細胞系自身的直接細胞毒性效果來研究在體內觀測到的效果是否是腫瘤微環境（TME）驅動的。然而，沒有發現這種情況在體外環境中發生的證據（圖4）。還研究了多西他賽對培養的CT26細胞的細胞毒性效果是否受aCD73存在的影響。未檢測到抗體的影響。實例 3 ： CD8 細胞耗竭損害四聯組合（ aCD73+aPD-L1+5FU+OHP ）在 MCA205 腫瘤荷瘤小鼠中的功效

為測試CD8 T細胞在組合的增強功效中發揮作用的假設，從腫瘤植入後第17天開始使用殖株53-6.7的IP注射來選擇性耗竭MCA205模型中的CD8 T細胞（示意性圖5A）。該實驗證實了組合（5FU+OHP+aCD73+aPD-L1）處理組中顯著降低的腫瘤控制和長期生存（降低＞ 50%）（對數秩檢驗，p = 0.026，圖5C）。該等CD8耗竭數據表明細胞介導的免疫在所觀察到的化療-IO組合活性中起關鍵作用。這並不能排除其他免疫系統組分或由5FU+OHP介導的「常規」細胞毒性或細胞生長抑制效果的貢獻。實例 4 ：在鼠 CT26 腫瘤模型中， aCD73+5FU+OHP 關於 CD73 表現、腺苷途徑代謝物和基質細胞群體的「早期」 藥效學效果

使用免疫組織化學（IHC）和成像質譜流式（IMC）評估aCD73及aPD-L1加上5FU+OHP化療組合的藥效學活性，以理解由CD73阻斷所介導的早期變化。如所預計的，奧來魯單抗的鼠替代抗體降低CT26腫瘤中的CD73水平。CD73的基於IHC的檢測採用不與奧來魯單抗的鼠替代抗體競爭的抗體；因此，CD73蛋白水平下降與奧來魯單抗的已知內化CD73的能力一致。IMC突出顯示了經aCD73處理小鼠的CT26腫瘤往往具有更低頻率的如下細胞，該等細胞表現已知與癌症相關纖維母細胞以及抑制性腫瘤相關巨噬細胞相關的標誌物。質譜成像（MSI）揭示，在抗CD73處理小鼠的CT26腫瘤中腺苷、肌苷和黃嘌呤抑制的明顯趨勢（圖3和圖5）。相反地，在化療和抗CD73組合處理小鼠的腫瘤組織中，單磷酸腺苷（AMP）（CD73的主要亞態）相對於其他處理組出現升高。該等藥效學數據在CD73靶向、酶抑制和腺苷途徑調節方面與所提出的奧來魯單抗作用機制一致。實例 5 ： aCD73+aPD-L1+5FU+OHP 關於 CT26 總轉錄本的藥效學效果

為了進一步深入理解四聯組中活性增強的機制基礎，使用RNAseq來探索CT26總轉錄本內的變化。使用DEseq2和fGSEA包，在aCD73或aPD-L1處理作為單一療法後，發現CT26總轉錄本的微小變化（參見下表2）。另一方面，5FU+OHP係高度擾動的；相對於對照腫瘤，導致277個基因的顯著上調且其他158個基因的下調。基因本體論（GO BP）鹼基對增濃和該等數據的KEGG途徑分析突出顯示了對如下基因的顯著影響，該等基因與免疫響應，白血球、NK和T細胞活化，T細胞受體傳訊和干擾素（1型和2型）產生相關（經調整p值＜ 0.05）。與此一致的上調的各個基因包括：CCL3、4、8、17，CXCL10，GDF15，CD8a，IFNγ、穿孔素，顆粒酶，Lag-3和PD-1。CXCL2表現降低（圖11）。該等RNAseq數據突出顯示了在鼠CT26小鼠癌症模型中，5FU+OHP處理對與免疫功能相關的基因有顯著擾動。

與使用成分單一療法處理所觀測到的輕微總轉錄本學變化相比較，aCD73和aPD-L1的組合導致1236個差異表現的基因。利用5FU+OHP+aCD73+aPD-L1組合實現了最顯著且廣泛的總轉錄本學變化；與未經處理的腫瘤相比，造成1490個基因上調且128個基因下調（表2）。

	DE 基因的數量	基因本體論（BP）增濃（經調整p值＜ 0.05）	KEGG途徑增濃（經調整p值＜ 0.05）
aPDL1	無DE基因	-	-
aCD73	1個DE基因：1個上調	-	-
FF	435個DE基因：277個上調且 158個下調	免疫響應、淋巴球活化、白血球活化、T細胞活化、干擾素-γ產生	自然殺傷細胞介導的細胞毒性 T細胞受體傳訊途徑 Th1和Th2細胞分化細胞介素-細胞介素受體相互作用
aCD73.aPDL1	1236個DE基因：1049個上調且 187個下調	炎症響應、髓系白血球遷移、細胞趨化性	細胞介素-細胞介素受體相互作用造血細胞譜系趨化介素傳訊途徑補體與凝血級聯
FF.aCD73	964個DE基因：902個上調且 62個下調	免疫響應、淋巴球活化、白血球活化、T細胞活化、干擾素-γ產生	細胞介素-細胞介素受體相互作用造血細胞譜系趨化介素傳訊途徑 T細胞受體傳訊途徑 Th1和Th2細胞分化 NF-κ B傳訊途徑補體與凝血級聯
FF.aPDL1	457個DE基因：333個上調且 124個下調	免疫響應、淋巴球活化、白血球活化、T細胞活化、干擾素-γ產生	T細胞受體傳訊途徑細胞介素-細胞介素受體相互作用 Th1和Th2細胞分化自然殺傷細胞介導的細胞毒性
FF.aCD73.aPDL1	1618個DE基因：1490個上調且 128個下調	免疫響應、白血球活化、T細胞活化、淋巴球活化	T細胞受體傳訊途徑， Th1和Th2細胞分化，補體與凝血級聯，趨化介素傳訊途徑，自然殺傷細胞介導的細胞毒性

KEGG途徑和基因本體論增濃分析突出顯示了趨化性動員、T細胞活化、T細胞受體傳訊、Th1和Th2細胞分化和自然殺傷細胞介導的細胞毒性。受影響最大的免疫相關基因在圖11中列出。對於因5FU+OHP處理上調的基因，還存在多個值得注意的基因，包括（但不限於）CD38、CD39、CXCL1、CXCL3、CXCL5、CD163、CTLA4、CXCR3、顆粒酶A、ICAM1、Il6、P2RY1、TNF-a、IL2a、Il1a、ALOX15、SLC7a2、Ear2、Havc2。

將代表組合的各種組分的處理組納入允許對各個治療組分的貢獻進行解摺積（圖7A、7B和11，表2）。該分析突出顯示了5FU+OHP在驅動干擾素途徑（1型和2型）活化以及T細胞和NK細胞活化、細胞毒性活性及IL2/STAT5途徑傳訊中的關鍵作用。5FU+OHP納入的效果在很大程度上差異於藉由將任一種IO藥物組分添加到處理中所介導的效果，如藉由5FU+OHP組分獨特上調的360個基因和下調的122個所證明的。在組合的aCD73+aPD-L1處理方法中納入5FU+OHP用於提高關鍵免疫相關基因（例如干擾素-γ、TRIM6、CCL17、顆粒酶B、GDF15、穿孔素和Lag3）的表現。相反地，在納入5FU+OHP時，IL-10、IL-1b、CXCL2、S100A8被下調。

在5FU+OHP及aPD-L1的組合中加入CD73阻斷使510個基因上調並使8個基因下調，該等基因在其他組合迭代中未被調節，如圖7A所示。明顯受影響的基因包括CXCR3、H2-AB1、Itgae、CXCL3、Mgl2、CXCR5、CD4和Cybb。這還驅動了CCL17（一種主要腫瘤浸潤淋巴球（TIL）吸引趨化介素）和CCL24（一種已知優先化學吸引M1巨噬細胞的趨化介素）的甚至更高表現（Xuan W等人, J Leukoc Biol [白血球生物學雜誌] 2015; 97:61–9）。該等數據突出顯示了腺苷途徑抑制在化療/檢查點抑制劑組合中新穎且有效的作用，特別地關於與髓系細胞及B細胞生物學相關的各個基因和特徵。當化療加抗PD-L1組用抗CD73增強時，CD38和P2Y1（兩個已知與腺苷途徑自身相關的基因）也被顯著上調。在5FU+OHP加aCD73組合處理中不給予aPD-L1在上調與炎症、免疫響應和干擾素γ途徑活化有關的基因方面係有害的。明顯地，ALOX15（一種與巨噬細胞功能和胞葬相關的基因）和IL-1b都受到影響。

接下來，我們研究了這種規模的基因擾動是否也導致了細胞群體計數的變化。為此，我們使用MCP-Counter工具估計了在經處理CT26腫瘤中免疫細胞群體的豐度（Becht E等人, Genome Biol [基因組生物學] 2016; 17:1–20）。該計算分析突出顯示了奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶化療在增加淋巴球表現方面的突出效果；這與該處理後顯著升高的促炎和趨化性趨化介素/細胞介素基因表現水平一致（圖7C）。淋巴球對使用單一療法和不包括化療組分的組合處理的小鼠的CT26腫瘤的浸潤明顯減少。5FU+OHP+aCD73+aPD-L1處理在淋巴球（細胞毒性T細胞、NK、B細胞）和髓系細胞群體（包括單核樹突狀細胞）二者的腫瘤中豐度升高方面表現突出；該特徵在癌症模型中對於改善腫瘤控制和增加總生存時間有利（Petitprez F等人, Nature [自然] 2020 577:7791；Voss MH等人, JCO20203815_suppl5025 2020; 38:5025–5025；Chambers AM等人, Front Immunol [免疫學前沿] 2018; 9:2533；Mastelic-Gavillet B等人, J Immunother Cancer [癌症免疫療法雜誌] 2019; 7:1–16）。實例 6 ：組合的 aCD73 、 aPD-L1 和多西他賽處理在 CT26 同基因小鼠模型中增強完全響應

重要的是，發現使用5FU+OHP所注意到的協同組合效果擴展到第二化療類別；即，多西他賽（DTX）。該組合方法疊加在已經建立的對該化療的耐受給藥方案上。在這種情況下，DTX、aPD-L1和aCD73的組合顯著改善腫瘤生長抑制並且12個中有7個（58%）完全響應（p = 0.0001），相比之下，在aPD-L1加多西他賽組合組中，12個中最多3個（25%）完全響應（p = 0.001），克魯斯卡爾-沃利斯檢驗，如圖8所示。實例 7 ：在 MC38 同基因小鼠模型中，組合的 aCD73 、 aPD-L1 增強分割放療

先前公開的臨床前數據突出顯示了CD73在癌症的放療響應性中的作用（Wennerberg E等人, Cancer Immunol Res [癌症免疫學研究] 2020 8:465–78；Tsukui H等人, BMC Cancer [BMC癌症] 2020; 20；和Nguyen AM等人, Molecular & Cellular Proteomics [分子與細胞蛋白質組學] 2020; 19:375–89）。探索了aCD73+aPD-L1處理的添加是否與化療數據一致也將增強放療響應。使用結腸直腸癌的MC38模型來測試分割放療方案已經確立的效果，在該實驗中採用同步方法，即，所有處理在同一天開始（示意性圖9A）。一旦腫瘤在70-120 mm ³之間，該等腫瘤就入組進行干預處理。數據證實了RTx+aCD73+aPD-L1處理MC38腫瘤荷瘤小鼠的有力效果（p = 0.0001，克魯斯卡爾-沃利斯檢驗），如圖9B所示。實例 8 ： aCD73 、 aPD-L1 在 MC38 同基因小鼠模型中的最優時間安排

還使用MC38同基因小鼠模型確定aCD73、aPD-L1和放療時間的影響。向六組小鼠植入5×10 ⁵個細胞，如圖12所示。如圖13所示，同時使用aCD73、aPD-L1和RTx處理的小鼠示出了最高水平的腫瘤抑制和後續的生存概率。這還與使用B16F10和MC38小鼠模型再攻擊時保護性記憶響應的誘導相關（圖14）。

為了確定投與單獨的aCD73、aPD-L1和放療的時間時對腫瘤體積是否有影響，如前所述植入MC38細胞並繪製各個療法的時間，如圖15所示。有趣的是，在aPD-L1和RTx之前投與aCD73療法顯示腫瘤體積的最大減小，這與最高的生存概率相關（圖16）。

越來越多的證據支持細胞外腺苷在腫瘤微環境內的免疫抑制作用；其中腺苷相關的基因特徵在多種適應症中與差的結果和對T細胞檢查點抑制藥物的降低的響應相關（Sidders等人；和Allard D等人, Immunol Lett [免疫學快報] 2019; 205:31–9）。靶向腺苷生成途徑內的細胞外節點的分子已在臨床開發空間中獲得關注，其中現在處於臨床開發的Ph3奧來魯單抗的與德瓦魯單抗組合用於先前使用化療-放療治療的3期NSCLC（非小細胞肺癌）患者中（一項在III期不可切除非小細胞肺癌患者中評估在同步放化療之後德瓦魯單抗與奧來魯單抗或德瓦魯單抗與莫那利珠單抗的效果的全球研究（A Global Study to Assess the Effects of Durvalumab With Oleclumab or Durvalumab With Monalizumab Following Concurrent Chemoradiation in Patients With Stage III Unresectable Non-Small Cell Lung Cancer） - 全文流覽 - ClinicalTrials.gov）。

儘管普遍假設CD73抑制將與藉由細胞死亡促進細胞外ATP釋放的細胞毒性治療有益地結合，但支持這一點的已發表臨床前數據甚少。本文所呈現的探索CD73抑制與化療和PD-L1抑制聯合效果的數據突出顯示了藉由納入CD73阻斷所介導的加性和新穎生物效果。為此，包括aCD73+aPD-L1+5FU+OHP的組合在兩個小鼠癌症模型（結腸直腸和肉瘤）中提供了增強的功效。組合療法活性取決於CD8 T細胞，如藉由MCA205模型中CD8耗竭抗體的效果所判斷的。該等數據推斷出鼠免疫系統的細胞介導臂在所引發的抗腫瘤效果中的關鍵貢獻。與此一致，RNAseq分析證實了aCD73+aPD-L1+5FU+OHP驅動細胞毒性淋巴球和其他關鍵免疫細胞（例如髓系樹突狀細胞和B細胞）的腫瘤中豐度升高。還探索了利用紫杉烷骨架（即，DTX）代替OHP+5FU並且證實在CT26模型中獲得了類似的增強功效特徵。該等數據支持奧來魯單抗及aPD-L1抗體與基於鉑和紫杉烷的化療骨架的互補性。該等數據還突出顯示了MC38模型中與放療的加性作用；這擴展了Wennerberg等人（Cancer Immunol Res [癌症免疫學研究] 2020; 8:465–78）對結腸直腸模型的發現，並增強PD-1/PD-L1軸抑制的干預策略。

機制上，aCD73抗體快速降低CT26腫瘤內的CD73表現，並以與其提出的作用機制一致的方式調節細胞外腺苷水平。然而，對相同樣本的成像質譜流式確實發現了CAF和TAM標誌物的變化，這可能反映了aCD73處理的直接或下游效果。該等觀察結果與其他將CD73抑制與腫瘤巨噬細胞和纖維母細胞表現聯繫起來的出版物一致（Magagna I等人, Cancers (Basel) [癌症（巴塞爾）] 2021; 13.；Yu M等人, Nat Commun [自然·通訊] 2020; 11）。

單一療法5FU+OHP處理在一部分攜帶CT26/MCA205腫瘤的藥物接受者中延緩了腫瘤生長。當前研究值得注意的發現係5FU+OHP治療CT26腫瘤之後免疫途徑基因調節的廣度。該等包括1型和2型干擾素、與細胞毒性淋巴球和效應分子及其相關受體相關的基因特徵。該等觀察結果與該等化療在體外模型系統中的許多已知免疫調節效果一致（Siew YY等人, Int Immunol [國際免疫學] 2015; 27:621–32）並且現在擴展了關於體內效果的發現（Dosset M等人，Oncoimmunology [腫瘤免疫學] 2018; 7）。特別地，本文所呈現的數據已經識別出5FU+OHP驅動I型干擾素途徑，已知該等途徑在腫瘤微環境中對免疫和癌細胞發揮廣泛效果（Zitvogel L等人, Nat Rev Immunol [自然免疫學評論] 2015; 15:405–14）。藉由單一療法5FU+OHP處理調節的特定基因包括IFN-γ、CCL3、CCL8、Lag-3和顆粒酶B（上調）以及CXCL2、IL-1b、CD103和XCR1（下調）。5FU+OHP處理提高了ARORA2基因表現，儘管當aPD-L1或aCD73 Mab與5FU+OHP處理組合時，ARORA2上調被抵消。與促炎、STAT5途徑活化和趨化性相關的基因特徵只有將CD73阻斷應用於OHP+5FU處理時才被顯著上調（表2）。GDF-15係在癌症中新出現的令人感興趣的多效性細胞介素（Wischhusen J等人, Front Immunol [免疫學前沿] 2020; 11）並且CT26腫瘤中的GDF15轉錄水平因含5FU+OHP的處理而顯著升高；這與其他小鼠模型和人癌症患者針對鉑療法的發現相似（Breen DM等人, Cell Metab [細胞代謝] 2020; 32:938-950.e6）。

與從單獨用任一種IO試劑（例如，作為單一療法）處理的小鼠獲得的腫瘤RNAseq數據相比，aCD73和aPD-L1的組合產生1236個差異表現的基因；這突出顯示了與腫瘤微環境內抗體介導的多個抑制性檢查點的靶向相關的更廣泛的總轉錄本學變化。該IO「雙聯體」因其活化與炎症、髓系白血球遷移、細胞趨化性、細胞介素-細胞介素受體相互作用（包括TNF）、趨化介素傳訊途徑以及補體與凝血級聯相關的途徑和基因家族而聞名。受IO組合（aCD73+aPD-L1）影響的途徑和過程大多不同於受5FU+OHP處理影響的途徑和過程；該等途徑和過程如果在組合治療範式中疊加，則具有互補的可能。值得注意的是，「雙聯體」IO組合（aCD73+aPD-L1）提供較低的1型干擾素途徑基因的活化效率；已知這與患有多種形式癌症的患者的有利疾病結果相關，並且在腫瘤微環境二級介導一系列有益的免疫調節效果（Zitvogel L等人, Nat Rev Immunol [自然免疫學評論] 2015; 15:405–14）。

儘管檢測到總轉錄本學變化，但很明顯，「純粹的」小/大分子方法（5FU+OHP化療或IO組合）未能達到藉由5FU+OHP與aCD73和aPD-L1的組合使用所提供的相同水平的功效。因此，深入研究可以解釋這一點的總轉錄本的具體差異係有益的，因為該等基因和該等特徵在腺苷途徑調節的背景之外可能有用。明顯地，將aCD73添加到5FU+OHP + aPD-L1顯著上調CT26腫瘤微環境中的CXCR3。CXCR3係活化T細胞上IFN誘導的趨化介素CXCL9-11的同源受體；其上調與接受5FU+OHP或含有該化療的組合的小鼠的CT26腫瘤中T細胞豐度的升高和干擾素活化的趨化介素表現的增加一致。最近的出版物突出顯示了攜帶CXCR3的T細胞的腫瘤趨化性對於T細胞檢查點抑制劑的臨床前和臨床響應性的重要性（Marcovecchio PM等人, J Immunother Cancer [癌症免疫療法雜誌] 2021; 9；Qu Y等人, Cell Rep [細胞報導] 2020; 32；Chow MT等人, Immunity [免疫] 2019; 50:1498-1512.e5）。升高的Pdcd1（PD-1）的表現推斷出在那些CT26腫瘤荷瘤小鼠中腫瘤T細胞可能被活化和/或耗竭，並且強烈支持納入aPD-L1以對抗抗腫瘤效果的適應性免疫抵抗。值得注意的是，含有aPD-L1和IO的組合顯著上調15-脂氧合酶（15-LOX），該等酶與各種巨噬細胞功能有關，包括胞葬和鐵死亡。這令人感興趣，因為Snodgrass等人（Front Immunol [免疫學前沿] 2018; 9）識別了ALOX15在人巨噬細胞CCL17產生中的新作用；鑒於在最具保護性的治療形式中，CCL17表現明顯增加，這值得注意。

與樹突狀細胞生物學和抗原呈現相關的基因（MHC II、Itgae、Itgax、DCstamp、TARM1、CD301）的調節特別令人感興趣，並且與其他人通常在放療4和腺苷途徑阻斷的背景下探索CD73抑制的工作一致。Wennerberg等人（Cancer Immunol Res [癌症免疫學研究] 2020）已經強調了放療誘導的1型干擾素用於改變腫瘤微環境、特別地關於cDC1的關鍵作用。同一組強調了CD73阻斷與放療的互補性，以及aCD73處理在放療誘導的1型干擾素的次優誘導的腫瘤中具有關鍵作用。本文所呈現的數據似乎與他們的發現大體一致。與此一致，在DC上表現的MHCII分子和巨噬細胞半乳糖C型凝集素（MGL/CD301）的基因在CT26 TME中上調。CD301因其針對Gal和N-乙醯半乳胺糖30的單糖特異性被認為參與來自改變的自身和病原體的分子的識別。T細胞相互作用、活化髓系細胞受體-1（TARM1；基因符號Tarm1）係最近識別的在白血球受體複合物中編碼的LILR家族成員。TARM1係由DC表現的，並且係DC活化所必需的；Tarm1+/–小鼠31在CIA誘導後，Tarm1在引流LN（dLN）中的炎症型（I-A/I-E+Ly6C+CD11b+CD11c+）DC中高度表現。另一個新的發現係含有aCD73的組合獨特地驅動高水平的Ear2表現的能力。Ear2係RNA酶並且還形成由非經典單核細胞表現的14基因特徵的一部分（Ma RY等人, Trends Immunol [免疫學趨勢] 2022; 43:546–63）。新出現的證據表明細胞外RNA酶分子的免疫調節作用，從而起到警報素的作用（Lu L等人, Front Immunol [免疫學前沿] 2018; 9:1012）。類似地，腫瘤RNA酶2a表現因組合療法而顯著增加。還注意到對NOX2（基因Cybb）的影響，並且考慮到其在賦予巨噬細胞響應細胞外ATP刺激的能力以及細胞氧化的強烈變化中的重要作用（Moore SF等人，Journal of Immunology [免疫學雜誌] 2009; 183:3302–8）以及其在調節巨噬細胞中ATM激酶活化和放療效果中的作用（Wu Q等人, Cell Death Differ [細胞死亡與分化] 2017; 24:1632–44），這種影響可能是值得注意的。巨噬細胞凝集素樣氧化LDL受體-1（LOX-1 / OLR1）在用5FU+OHP+aCD73+aPD-L1處理的小鼠的CT26腫瘤中也上調。已知這種受體感知熱休克蛋白，並被TLR促效劑和其他促炎刺激顯著上調。

對CT26腫瘤內B細胞表現的影響也值得關注（圖7A和7C）。當aCD73包含在5FU+OHP + aPD-L1組合中時，B細胞相關基因（例如JChain、CXCR5和CXCL13）明顯被調節（圖11）。儘管與CD8相比，對B細胞生物學在癌症中的影響瞭解較少，但對B細胞在人腫瘤微環境中的作用越來越感興趣（Fridman WH等人, Journal of Experimental Medicine [實驗醫學雜誌] 2021; 218.；Griss J等人, Nature Communications [自然·通訊] 2019; 10:1–14.；Bruni D等人, Nature Reviews Cancer [自然評論：癌症] 2020; 20:662–80）。鼠B細胞相關數據也與最近關於CD73抑制抗體對人B細胞的直接效果的出版物一致（Hair J等人, Cancer Res [癌症研究] 2021; 81:1695–1695；Luke J等人, J Immunother Cancer [癌症免疫療法雜誌] 2021; 9:A729–A729）。該等機制數據與用5FU+OHP + aCD73 + aPD-L1給藥的動物中增強的生存率和腫瘤生長控制特徵非常一致。序列 SEQ ID NO:1重鏈CDR1胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 GFTFSRYWMS SEQ ID NO:2重鏈CDR2胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 NIKQDGSEKYYVDSVKG SEQ ID NO:3重鏈CDR3胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 EGGWFGELAFDY SEQ ID NO:4輕鏈CDR1胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 RASQRVSSSYLA SEQ ID NO:5輕鏈CDR2胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 DASSRAT SEQ ID NO:6輕鏈CDR3胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 QQYGSLPWT SEQ ID NO:7重鏈可變結構域（VH）胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 SEQ ID NO:8輕鏈可變結構域（VL）胺基酸序列；抗PD-L1抗體德瓦魯單抗 SEQ ID NO:9重鏈CDR1胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 SYAYS SEQ ID NO:10重鏈CDR2胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 AISGSGGRTYYADSVKG SEQ ID NO:11重鏈CDR3胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 LGYGRVDE SEQ ID NO:12輕鏈CDR1胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 SGSLSNIGRNPVN SEQ ID NO:13輕鏈CDR2胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 LDNLRLS SEQ ID NO:14輕鏈CDR3胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 ATWDDSHPGWT SEQ ID NO:15重鏈可變結構域（VH）胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 SEQ ID NO:16輕鏈可變結構域（VL）胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 SEQ ID NO:17重鏈胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗 SEQ ID NO:18輕鏈胺基酸序列；抗CD73抗體奧來魯單抗

無

[圖1A-1C]示出了組合的抗CD73、抗PD-L1和5FU+OHP處理在同基因小鼠模型中產生增強的完全響應。(A) 實驗設計的示意圖。向 (B) BALB/c小鼠（CT26細胞於PBS中）和 (C) C57BL/6J小鼠（MCA205細胞於50% Matrigel + PBS中）右脅腹植入5×10 ⁵個細胞並如示意圖中所示進行處理。生長曲線係根據每週進行三次的卡尺測量來繪製的。將aCD73和aPD-L1添加到5FU+OHP促使每個模型系統中完全響應者（CR）的數量顯著增加——在CT26中為50%（p = 0.005，相對於5FU+OHP處理組）並且在MCA205中為61.5%（p = 0.008，相對於5FU+OHP處理組）；克魯斯卡爾-沃利斯檢驗（Kruskal Wallis test）。

[圖2A-2B]示出了在同基因小鼠模型中對aCD73和aPD-L1單獨或組合處理的響應。向BALB/c小鼠（CT26細胞於PBS中（圖2A））和C57BL/6J小鼠（MCA205細胞於50% Matrigel + PBS中（圖2B））右脅腹植入500,000個細胞並如圖1A中示意圖所示進行處理。生長曲線係根據每週進行三次的卡尺測量來繪製的。在CT26和MCA205兩個模型中，與對照處理的小鼠相比，抗CD73單一療法沒有顯示任何效果。抗PD-L1單一療法僅在CT26中具有極溫和的響應（1/13 CR）。使用aCD73和aPD-L1的組合處理也未揭示任何增強的響應率，其中在每個CT26和MCA205腫瘤模型中觀察到1/13 CR小鼠。

[圖3A-3B]示出了，質譜成像（MSI）證實了藉由將抗CD73添加到5FU+OHP的腺苷途徑調節。(3A) 腺苷生成途徑的示意圖。(3B) MSI圖像，其示出了CT26腫瘤中腺苷途徑中ATP以及不同代謝物的豐度。與對照處理的腫瘤相比，5FU+OHP使ATP和AMP豐度適度增加，然而將aCD73添加到5FU+OHP導致腺苷以及肌苷和黃嘌呤大量減少。

[圖4A-4E]示出了將抗CD73添加到5FU+OHP和多西他賽並未增強體外細胞毒性。將HT-29（4A）、HCT-116（4B）、CT26（4C和4E）和MCA-205（4D）細胞各自的10,000個細胞接種在96孔板中，並用所指示的連續稀釋的化療劑以及抗CD73進行處理。細胞毒性係與藥物一起孵育72小時之後藉由CellTiter-Glo®發光分析來測量的。如不同的結果小圖中所示，所測試的細胞系均未顯示抗CD73對5FU+OHP和多西他賽的任何加性作用。

[圖5A-5C]示出了在同基因小鼠模型MCA205中，CD8耗竭導致在組合的aCD73、aPD-L1和5FU+OHP處理中所觀察到的功效喪失。(5A) 實驗設計的示意圖。(5B) MCA205腫瘤模型（於50% Matrigel + PBS中的5×10 ⁵個細胞）的C57BL/6J小鼠的生長曲線係根據每週進行三次的卡尺測量來繪製的。如 (5C) 所示，與沒有進行CD8細胞耗竭的那些相比，CD8 T細胞的選擇性耗竭導致組合處理的功效降低，進而導致顯著縮短的生存期（卡普蘭-邁耶（Kaplan Meier）圖，對數秩檢驗，p = 0.02）。

[圖6A-6D]示出了，IHC和MSI分析藉由將aCD73添加到5FU+OHP證實了靶標（CD73）參與和腺苷途徑調節。(6A) 實驗設計的示意圖。(6B) 免疫組織化學分析揭示在aCD73與5FU+OHP的組合組中較低水平的表面結合CD73蛋白。結果表示為特異性染色與背景染色（蘇木精）的面積比。(6C) 質譜成像示出了在使用含抗CD73的三聯組合組處理的小鼠的CT26腫瘤中腺苷、肌苷和黃嘌呤抑制作為早期PD生物標誌物的明顯趨勢。結果報告為以任意單位計的相對豐度。(6D) 成像質譜流式突出顯示了來自aCD73+5FU+OHP組合處理的小鼠的CT26腫瘤呈現更低頻率的如下細胞，該等細胞表現巨噬細胞標誌物（如CD68、F4/80）以及抑制性腫瘤相關巨噬細胞標誌物（如CD163和CD206 [左側小圖]）、以及已知與癌症相關纖維母細胞相關的標誌物（如膠原-iv、α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白以及CD31）。結果表示為陽性細胞%的平均值 ± SEM。

[圖7A]示出了aCD73+aPD-L1+5FU+OHP關於CT26總轉錄本的藥效學效果。使用RNAseq分析來觀察CT腫瘤總轉錄本的變化。上部小圖示出了實驗設計的示意圖。下部小圖示出了在組合的aCD73、aPD-L1和5FU+OHP處理組與aCD73 + aPD-L1組中各個組分的貢獻。如左下小圖中所觀察到，aCD73的添加具有最顯著的效果，其導致589個差異表現（DE）基因，而aPD-L1僅導致35個DE基因（右下小圖）。將化療組分添加到抗體雙聯體（aCD73 + aPD-L1）產生546個DE基因。所使用的DE截止值係Abs(log2FC) ＞= 1和Adj-pval ＜ 0.05。

[圖7B]示出了由組合介導的關鍵效果的基於總轉錄本的解摺積。RNAseq分析的解摺積揭示，受aCD73和5FU+OHP的添加影響的關鍵途徑係免疫響應活化途徑。示出了上調基因的增濃途徑，即KEGG（京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes））途徑增濃（KEGG，綠色）和基因本體論生物過程（GO BP，紅色）（所使用的DE截止值係log2FC ＞= 1 和Adj-pval ＜ 0.05）。

[圖7C]示出了將aCD73添加到aPD-L1 + 5FU+OHP驅動CT26腫瘤中腫瘤浸潤淋巴球（細胞毒性T細胞、NK、B細胞）和髓系樹突狀細胞的升高。使用MCP計數工具來估計不同細胞群體的豐度。如熱圖所示，添加aCD73對驅動相關免疫細胞（如細胞毒性T細胞、NK細胞、B細胞和髓系樹突狀細胞（DC））具有最顯著效果。DC浸潤效果僅藉由將aCD73添加到5FU+OHP來介導，因為將aPD-L1添加到5FU+OHP中不會使腫瘤中DC浸潤增加。

[圖8A-8B]示出了在CT26同基因腫瘤模型中，組合的aCD73、aPD-L1和多西他賽（DTX）處理增強完全響應。(8A) 實驗設計的示意圖。(8B) 向BALB/c植入5×10 ⁵個於PBS中的CT26細胞並如示意圖中所示進行處理。生長曲線係根據每週進行三次的卡尺測量來繪製的。將aCD73和aPD-L1添加到多西他賽中使得完全響應者（CR）數量顯著（p = 0.0001，相對於溶媒）增加（58%），相比之下aPD-L1單獨添加到多西他賽時觀察到25% CR（p = 0.001）；克魯斯卡爾-沃利斯檢驗。

[圖9A-9B]示出了在MC38同基因腫瘤模型中，使用aCD73、aPD-L1和放療（RTx）的同時處理增強完全響應。(9A) 實驗設計的示意圖。(9B) 向C57BL6/J植入5×10 ⁵個於PBS中的MC38細胞並如示意圖中所示進行處理。生長曲線係根據每週進行三次的卡尺測量來繪製的。使用aCD73、aPD-L1和放療的同時處理導致58%的顯著（p = 0.0001，相對於NT）數量的完全響應者（CR），相比之下在僅RTx組中未觀察到完全響應（p = 0.5，相對於NT），克魯斯卡爾-沃利斯檢驗。

[圖10]示出了藉由將aCD73添加到5FU+OHP所觀察到的藥效學變化的成像質譜流式（IMC）。用對照、5FU+OHP和aCD73+5FU+OHP處理的CT26腫瘤荷瘤小鼠的IMC圖像。aCD73+5FU+OHP組合處理的小鼠腫瘤呈現更低頻率的如下細胞，該等細胞表現巨噬細胞標誌物（如CD68、F4/80）以及抑制性腫瘤相關巨噬細胞標誌物（如CD163和CD206 [左側小圖]）、以及已知與癌症相關纖維母細胞相關的標誌物（如膠原-iv、α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白以及CD31）。

[圖11]示出了識別出三聯藥物與對照相比的前50個差異表現基因並示出了不同比較的log ₂倍數變化。右側小圖上的熱圖示出了在不同條件下所選免疫相關基因的表現變化。

[圖12]示出了使用MC38同基因小鼠模型所確定的按aCD73、aPD-L1和放療的時間劃分的處理組的示意圖。向六組小鼠植入5×10 ⁵個細胞，如所示出的。

[圖13]示出了使用aCD73、aPD-L1和RTx同時處理的小鼠顯示最高腫瘤抑制水平和後續生存概率。

[圖14]示出了使用aCD73、aPD-L1和RTx同時處理的小鼠還顯示在使用B16F10和MC38小鼠模型再攻擊時誘導保護性記憶響應。

[圖15]示出了按單獨的aCD73、aPD-L1和放療的時間劃分的處理組的示意圖。如前文，MC38細胞如前所述植入並繪製各個療法的時間。

[圖16]示出了在aPD-L1和RTx之前投與aCD73療法實現腫瘤體積的最大減小，這與最高生存概率相關。

無

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Claims

一種在有需要的受試者中抑制腫瘤生長的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。
一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。
一種在受試者中產生保護性腫瘤記憶響應的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的PD-L1抑制劑與化療和/或放療的組合；其中與正常受試者相比，該受試者具有降低的CD73蛋白或CD73活性水平。
一種在有需要的受試者中抑制腫瘤生長的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。
一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。
一種在受試者中產生保護性腫瘤記憶響應的方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的CD73抑制劑、PD-L1抑制劑、以及化療和/或放療。
如請求項1-6中任一項所述之方法，其中該PD-L1抑制劑及該化療和/或放療係同時投與的。
如請求項1-6中任一項所述之方法，其中該PD-L1抑制劑及該化療和/或放療係依序投與的。
如請求項4-6中任一項所述之方法，其中該CD73抑制劑係在投與該PD-L1抑制劑以及該化療和/或放療之前投與的。
如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該化療係多西他賽、5-氟尿嘧啶、和/或奧沙利鉑。
如請求項1-10中任一項所述之方法，其中該PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
如請求項11所述之方法，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列的重鏈（HC）CDR1、包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的HC CDR2、以及包含SEQ ID NO:3的胺基酸序列的HC CDR3；以及包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列的輕鏈（LC）CDR1、包含SEQ ID NO:5的胺基酸序列的LC CDR2、以及包含SEQ ID NO:6的胺基酸序列的LC CDR3。
如請求項11或12所述之方法，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:7的胺基酸序列的HC可變結構域（VH）、以及含有SEQ ID NO:8的胺基酸序列的LC可變結構域（VL）。
如請求項11-13中任一項所述之方法，其中該抗PD-L1抗體係德瓦魯單抗。
如請求項4-14中任一項所述之方法，其中該CD73抑制劑係抗CD73抗體或其抗原結合片段。
如請求項15所述之方法，其中該抗CD73抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列的HC CDR1、包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列的HC CDR2、以及包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列的HC CDR3；以及包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列的LC CDR1、包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列的LC CDR2、以及包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列的LC CDR3。
如請求項15或16所述之方法，其中該抗CD73抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:15的胺基酸序列的HC可變結構域（VH）、以及含有SEQ ID NO:16的胺基酸序列的LC可變結構域（VL）。
如請求項15-17中任一項所述之方法，其中該抗CD73抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:17的胺基酸序列的HC、以及含有SEQ ID NO:18的胺基酸序列的LC。
如請求項11-13中任一項所述之方法，其中該抗CD73抗體係奧來魯單抗。
如請求項1-19中任一項所述之方法，其中投與導致腫瘤微環境中CXCR3的上調。
如請求項1-3和7-20中任一項所述之方法，其中CD73蛋白或CD73活性水平係藉由免疫組織化學（IHC）、成像質譜流式（IMC）或質譜成像（MSI）確定的。
如請求項1-21中任一項所述之方法，其中該腫瘤或癌症係實性瘤或由實性瘤生長引起的癌症。
如請求項22所述之方法，其中該實性瘤係肺腫瘤、乳腺腫瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、前列腺腫瘤、結腸直腸腫瘤、頭頸腫瘤、肝腫瘤或胰臟腫瘤。
如請求項23所述之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺腫瘤。
如請求項1-24中任一項所述之方法，其中該受試者係人。
如請求項1-25中任一項所述之CD73抑制劑、PD-L1抑制劑以及化療和/或放療用於在有需要的受試者中治療癌症之用途。