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TW202430635A - 用於抑制補體成分C3(C3)表現之RNAi藥劑、其醫藥組合物及使用方法 - Google Patents

用於抑制補體成分C3(C3)表現之RNAi藥劑、其醫藥組合物及使用方法 Download PDF

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TW202430635A
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傑佛瑞 卡爾森
王褘琛
濤 裴
詹姆士 Ｃ 漢彌頓
哈米德 莫拉迪
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美商愛羅海德製藥公司
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Abstract

本發明係關於能夠抑制補體成分C3 (C3)基因表現之RNAi藥劑，例如雙股RNAi藥劑或siRNAs。亦揭示包括C3 RNAi藥劑之醫藥組合物及其使用方法。本文所揭示之C3 RNAi藥劑可與靶向配位體結合以促進遞送至肝細胞，該靶向配位體包括包含N-乙醯基-半乳胺糖之配位體。活體內遞送C3 RNAi藥劑提供對C3基因表現之抑制。該等RNAi藥劑可用於治療部分由C3基因表現介導之疾病、病症或症狀，包括IgA腎病變、C3腎絲球病變、陣發性夜間血紅素尿症及/或其他補體介導之腎病的方法。

Description

用於抑制補體成分C3(C3)表現之RNAi藥劑、其醫藥組合物及使用方法
本發明係關於用於抑制補體成分C3 (C3)基因表現之RNA干擾(RNAi)藥劑，例如雙股RNAi藥劑或干擾RNA分子；包括C3 RNAi藥劑之醫藥組合物；及其使用方法，其係用於治療C3相關疾病及病症，包括補體介導之腎病(CMRD)，諸如IgA腎病變(IgAN)及C3腎絲球病變(C3G)。
補體級聯係先天免疫系統之關鍵部分且已知由三種不同路徑組成：替代路徑、經典路徑及凝集素路徑。補體活性之三種主要路徑中之各者可在各種疾病之發病機制中起重要作用。補體系統之一些主要功能包括協調調理作用、促進細胞毒性破壞及調配膜攻擊複合物，以及釋放促進發炎反應之肽。集中於治療抑制相關之標靶的補體系統之概述描述於例如 Garred等人, Pharmacol. Rev. 73:792-827, 2021年4月(參見例如其中的圖1)中。咸信所鑑別之補體系統標靶中之一者，補體成分C3參與某些疾病之發病機制，該等疾病包括(但不限於)陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及補體介導之腎病(CMRD)，諸如IgA腎病變(IgAN)及C3腎絲球病變(C3G)。
當前，與補體活性失調相關之各種疾病的治療選項極有限或不存在。對於IgAN及C3G，美國尚無批准之藥品可用。對於其他補體相關疾病，如PNH，其治療方法係商業上可獲得的，但由於經批准之治療劑及其各別作用機制之侷限性，許多患者之醫療需求仍未得到實質性滿足。舉例而言，單株抗體托西珠單抗(eculizumab)及雷武珠單抗(ravulizumab)係補體成分C5之抑制劑，其經批准用於治療PNH，但每2週至2個月需要2至3小時靜脈內輸注，且其並不阻斷補體活化之全部效應路徑，因為其在級聯中向遠端更多地起作用(在C5而非C3處)。此外，pegcetacoplan係一種經設計以抑制C3之治療肽，其需要投與20毫升中之大約1公克藥物(藉由皮下輸注泵投與)，其中輸注發生在一小時之過程內且必須各週投與兩次。
在近期臨床試驗中，在改善患有PNH之患者中之血紅素及臨床及血液學結果中，證明pegcetacoplan及因子B抑制劑iptacopan均優於單獨的C5抑制(藉由托西珠單抗) (Hillmen, N Engl J Med. 2021, 384(11):1028-37；Peffault de Latour, Blood 2022, 140(增刊2):LBA-2; Risitano, Lancet Haematol. 2021, 8(5):e344-e354)。此等研究以及對C3之作用及補體之替代路徑在諸如PNH、C3G及IgAN之病狀中之重要性的不斷深入的理解，為靶向近端替代補體路徑(尤其C3)作為此等病狀之治療策略提供強有力的理論基礎。
因此，仍需要能夠更近端抑制C3及補體級聯之高活性、持久且安全的治療劑。雖然各種公開案已提出用於靶向C3之干擾RNA分子，但在本發明之前，無公開案展示出在抑制基因表現以提供治療益處方面之足夠活性的難以理解組合、在人類中作為治療劑可行的適合之安全性概況以及需要不頻繁投與以解決某些對任何現有經批准之療法有困難之患者之順應性問題的適合之耐久性。
本文揭示用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑，其包含： 反義股，其中該反義股之核苷酸1-21包含表2之反義股序列中之一者的核苷酸1-21，及 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列， 其中該反義股及/或該有義股之所有或實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該RNAi藥劑連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。
在一些實施例中，有義股包含至少15個連續核苷酸與表2、表4、表5C、表7B或表8之有義股序列中任一者的15個連續核苷酸相差0或1個核苷酸之核苷酸序列，且其中有義股具有一個15個連續核苷酸與反義股至少85%互補的區域。
在一些實施例中，RNAi藥劑之至少一個核苷酸包括經修飾之核苷間鍵聯。
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2',3'-開環核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2'-F-阿糖(arabino)核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2'-O-甲基核苷酸、反向2'-去氧核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-烷基修飾之核苷酸、𠰌啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸及3'-O-甲基核苷酸。
在其他實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑的所有或實質上所有經修飾之核苷酸為2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸或其組合。
在一些實施例中，反義股由表3之經修飾之反義股序列中之任一者的核苷酸序列組成、基本上由該核苷酸序列組成或包含該核苷酸序列。
在一些實施例中，有義股由表4之經修飾之有義股序列中之任一者的核苷酸序列組成、基本上由該核苷酸序列組成或包含該核苷酸序列。
在一些實施例中，反義股包含表3之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列，且有義股包含表4之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列。
本文所揭示之RNAi藥劑連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。在其他實施例中，靶向配位體連接至有義股。在一些實施例中，靶向配位體連接至有義股之5'末端。
在一些實施例中，有義股之長度為15至30個核苷酸，且反義股之長度為21至30個核苷酸。在其他實施例中，有義股及反義股之長度各自為21至27個核苷酸。在其他實施例中，有義股及反義股之長度各自為21至24個核苷酸。在其他實施例中，有義股及反義股之長度各自為21個核苷酸。
在一些實施例中，RNAi藥劑具有兩個鈍端。
在一些實施例中，有義股包含一或兩個端帽。在其他實施例中，有義股包含一或兩個反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，RNAi藥劑包含有義股及反義股，該有義股及該反義股形成表5A、表5B、表5C或表8中所示之雙螺旋體結構之雙螺旋體序列。
在一些實施例中，有義股在核苷酸序列之3'末端處、核苷酸序列之5'端處或兩者處進一步包括反向無鹼基殘基。
在其他實施例中，靶向配位體包含以下或由以下組成： (NAG37)，或 (NAG37s)。
本文亦揭示包含所揭示之RNAi藥劑之組合物，其中該等組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
另外，本文提供用於活體內抑制人類受試者之肝細胞中C3基因之表現的方法，該等方法包含向受試者中引入有效量之所揭示之C3 RNAi藥劑或所揭示之組合物。
本文進一步提供治療C3相關疾病、病症或症狀之方法，該等方法包含向有需要之人類受試者投與治療有效量之所揭示之組合物。
在一些實施例中，疾病為IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症。
在一些實施例中，RNAi藥劑係以每kg人類受試者之體重約0.05 mg至約5.0 mg/kg的劑量投與。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑係以含有約25 mg、50 mg、約100 mg、約200 mg、約300 mg或約400 mg表8中所描述之C3 RNAi藥劑藥物物質之單次注射之固定劑量投與。
本文亦提供所揭示之RNAi藥劑或所揭示之組合物的用途，其係用於治療與補體失調相關之疾病、病症或症狀。
本文進一步提供所揭示之RNAi藥劑或所揭示之組合物的用途，其係用於製備用於治療至少部分由補體活性失調、C3活性失調或C3基因表現介導之疾病、病症或症狀的醫藥組合物。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2022年10月27日申請之美國臨時專利申請案序號63/381,200、於2023年2月24日申請之美國臨時專利申請案序號63/486,944及於2023年3月31日申請之美國臨時專利申請案序號63/493,564之優先權，該等案中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式提交且以全文引用之方式併入本文中。XML複本命名為30698-WO1_SeqListing.xml，創建於2023年10月25日且大小為49 kb。
所揭示之RNAi藥劑、其組合物及使用方法可參考以下詳細描述更容易地理解，該詳細描述形成本發明之一部分。應理解，本發明不限於本文中所特定描述及/或展示之內容，且本文中所使用之術語僅出於以舉例方式描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的。
應瞭解，雖然為了清楚起見，本文中所包括之揭示內容的某些特徵係在單獨實施例之情形下在本文中予以描述的，但該等特徵亦可組合提供於單一實施例中。相反，為了簡便起見，在單一實施例之情形下描述的所揭示之方法的各種特徵亦可單獨或以任何子組合形式提供。
定義
如本文所使用，「RNAi藥劑」意謂含有RNA或RNA樣(例如經化學修飾之RNA)寡核苷酸分子之組合物，該寡核苷酸分子能夠以序列特異性方式降解或抑制(例如在適當條件下降解或抑制)標靶mRNA之信使RNA (mRNA)轉錄物的轉譯。如本文所使用，RNAi藥劑可經由RNA干擾機制(亦即，經由與哺乳動物細胞之RNA干擾路徑機制(RNA誘導之沉默複合物或RISC)之相互相用誘導RNA干擾)或藉由任何一或多種替代機制或一或多種路徑來起作用。儘管咸信RNAi藥劑(如該術語在本文中所使用)主要經由RNA干擾機制起作用，但所揭示之RNAi藥劑不藉由任何特定路徑或作用機制結合或受限於任何特定路徑或作用機制。本文所揭示之RNAi藥劑包含有義股及反義股，且包括(但不限於)：短(或小)干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微型RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及切丁酶受質(dicer substrate)。本文所描述之RNAi藥劑之反義股與所靶向之mRNA (亦即，C3 mRNA)至少部分互補。RNAi藥劑可包括一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個非磷酸二酯鍵聯。
如本文所使用，當提及既定基因表現時，術語「沉默」、「降低」、「抑制」、「下調」或「減弱」意謂藉由其中基因經轉錄之細胞、細胞組、組織、器官或受試者中自基因轉錄之RNA含量或自mRNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質子單元之含量所量測，當用本文所描述之RNAi藥劑治療細胞、細胞組、組織、器官或受試者時，與未經歷該治療之第二細胞、細胞組、組織、器官或受試者相比，基因之表現降低。
如本文所使用，術語「序列」及「核苷酸序列」意謂使用標準命名法用一系列字母描述之一系列或某種次序的核鹼基或核苷酸。核酸分子可包含未經修飾及/或經修飾之核苷酸。核苷酸序列可包含未經修飾及/或經修飾之核苷酸。
如本文所使用，「鹼基」、「核苷酸鹼基」或「核鹼基」係作為核苷酸組分之雜環嘧啶或嘌呤化合物，且包括主要嘌呤鹼基腺嘌呤及鳥嘌呤以及主要嘧啶鹼基胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。核鹼基可進一步經修飾以包括(但不限於)通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴展鹼基及氟化鹼基。(參見例如Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P.編Wiley-VCH, 2008)。此類經修飾之核鹼基(包括有包括經修飾之核鹼基的胺基亞磷酸酯化合物)之合成係此項技術中已知的。
如本文所使用，術語「核苷酸」具有與此項技術中通常所理解相同的含義。因此，如本文所使用，術語「核苷酸」係指包含糖部分、鹼基部分及共價連接基團(鍵聯基團) (諸如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯基團)的糖苷，且涵蓋天然存在之核苷酸(諸如DNA或RNA)以及包含經修飾之糖及/或鹼基部分的非天然存在之核苷酸，該等非天然存在之核苷酸在本文中亦稱為「核苷酸類似物」。本文中，單核苷酸可稱為單體或單元。
如本文所使用，且除非另外指示，否則在用於相對於第二核鹼基或核苷酸序列(例如RNAi藥劑反義股或單股反義寡核苷酸)描述第一核鹼基或核苷酸序列(例如RNAi藥劑有義股或靶向mRNA)時，術語「互補」意謂包括第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在某些標準條件下與包括第二核苷酸序列之寡核苷酸雜交(在哺乳動物生理條件(或其他適合之活體內或活體外條件)下形成鹼基對氫鍵)及形成雙螺旋體或雙螺旋結構之能力。一般熟習此項技術者將能夠選擇最適合於雜交測試之一組條件。至少在滿足以上雜交要求之範圍內，互補序列包括沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pairs)或非沃森-克里克鹼基對且包括天然或經修飾之核苷酸或核苷酸模擬物。序列一致性或互補性與修飾無關。舉例而言，出於確定一致性或互補性之目的，如本文所定義之a及Af與U (或T)互補，且與A一致。
如本文所使用，「完美互補」或「完全互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中之所有(100%)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中之相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，「部分互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中之至少70% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中之相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，「實質上互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中之至少85% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中之相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，術語「互補」、「完全互補」、「部分互補」及「實質上互補」係關於RNAi藥劑之有義股與反義股之間或RNAi藥劑之反義股與MUC5AC mRNA之序列之間的核鹼基或核苷酸匹配而使用。
如本文所使用，適用於核酸序列之術語「實質上一致」或「實質一致性」意謂與參考序列相比，核苷酸序列(或核苷酸序列之一部分)具有至少約85%或更高的序列一致性，例如至少90%、至少95%或至少99%一致性。序列一致性之百分比係藉由在比較窗內比較兩個最佳比對序列來測定。藉由如下步驟計算百分比：測定兩個序列中存在之相同類型的核酸鹼基的位置數以得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100以得到序列一致性之百分比。本文中所揭示之發明涵蓋與本文中所揭示之核苷酸序列實質上一致的核苷酸序列。
如本文所使用，術語「個體」、「患者」及「受試者」可互換使用以指任何動物物種之成員，包括(但不限於)鳥類、人類及其他靈長類動物，以及包括商業上相關之哺乳動物或動物模型(諸如小鼠、大鼠、猴、牛、豬、馬、綿羊、貓及犬)的其他哺乳動物。較佳地，受試者為人類。
如本文所使用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及其類似術語意謂為提供減輕或緩解受試者中之疾病之一或多種症狀之發生次數、嚴重程度及/或發生頻率而採取的方法或步驟。如本文所使用，「治療(treat)」及「治療(treatment)」可包括預防、控制、防治性治療及/或抑制或減少受試者中之疾病之一或多種症狀的發生次數、嚴重程度及/或發生頻率。
如本文所使用，當提及RNAi藥劑時，片語「向細胞中引入」意謂將RNAi藥劑功能性遞送至細胞中。片語「功能性遞送」意謂以使RNAi藥劑能夠具有預期生物活性(例如基因表現之序列特異性抑制)的方式將RNAi藥劑遞送至細胞中。
除非另外說明，否則使用如本文所用之符號 意謂根據本文所描述的發明之範疇任何一或多個基團可與其連接。
如本文所使用，術語「異構物」係指具有相同分子式，但在性質或其原子結合序列或其原子空間排列方面不同的化合物。原子空間排列不同之異構物稱為「立體異構物」。彼此不為鏡像之立體異構物稱為「非鏡像異構物」且不重疊鏡像之立體異構物稱為「鏡像異構物」或有時稱為光學異構物。結合於四個不相同取代基之碳原子稱為「對掌性中心」。
如本文所使用，除非在結構中特定鑑別為具有特定構形，否則對於其中存在不對稱中心且因此產生鏡像異構物、非鏡像異構物或其他立體異構組態之各結構，本文所揭示之各結構意欲表示所有此類可能的異構物，包括其光學純及外消旋形式。舉例而言，本文中所揭示之結構意欲涵蓋非鏡像異構物之混合物以及單一立體異構物。
如在本文申請專利範圍中所使用，片語「由……組成」不包括申請專利範圍中未說明之任何要素、步驟或成分。當用於本文申請專利範圍時，片語「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限制於所指定材料或步驟及實質上不影響所主張本發明之一或多個基本及新穎特徵的材料或步驟。
一般熟習此項技術者將容易理解及瞭解，本文中所揭示之化合物及組合物可具有呈質子化或去質子化狀態之某些原子(例如N、O或S原子)，此取決於化合物或組合物置放之環境。因此，如本文所使用，本文所揭示之結構設想，可將諸如OH、SH或NH之某些官能基質子化或去質子化。本文之揭示內容意欲涵蓋所揭示之化合物及組合物，無論其基於環境(諸如pH)之質子化狀態如何，此為一般熟習此項技術者將容易理解的。對應地，本文所描述之具有不穩定質子或鹼性原子之化合物亦應理解為表示對應化合物之鹽形式。本文所描述之化合物可呈游離酸、游離鹼或鹽形式。本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽應理解為在本發明之範疇內。
如本文所使用，在提及兩個化合物或分子之間的連接時，術語「連接」或「結合」意謂藉由共價鍵結合兩個化合物或分子。除非另有陳述，否則如本文所使用之術語「連接」及「結合」可指第一化合物與第二化合物之間在存在或不存在任何插入原子或原子基團之情況下的連接。
如本文所使用，術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與該片語互換使用。除非上下文另有明確指示，否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與其互換地使用。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。儘管在本發明之實踐或測試中可使用與本文所描述之方法及材料類似或等效的方法及材料，但下文描述適合之方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考案均以全文引用之方式併入。在有矛盾之情況下，將以本發明(包括定義)為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
在明確列舉值之情況下，應理解，與所列舉值大約相同數量或量之值亦在本發明之範疇內。在揭示組合之情況下，該組合之要素的各子組合亦經特定揭示且在本發明之範疇內。相反，在個別地揭示不同要素或要素群之情況下，亦揭示其組合。在將本發明之任何要素揭示為具有複數個替代方案之情況下，在此亦揭示本發明之實例，其中各替代方案單獨排除或與其他替代方案以任何組合排除；本發明之超過一個要素可具有此類排除，且在此揭示具有此類排除之要素的所有組合。
本發明之其他目標、特徵、態樣及優點將自以下詳細描述、附圖及申請專利範圍而變得顯而易見。 詳細描述 RNAi 藥劑
本文描述用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑。各C3 RNAi藥劑包含有義股及反義股。有義股之長度可為15至49個核苷酸。反義股之長度可為21至49個核苷酸。有義股及反義股可為相同長度或其可為不同長度。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自獨立地為21至27個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自為21至26個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自為21至24個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約19個核苷酸，而反義股之長度為約21個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約21個核苷酸，而反義股之長度為約23個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為23個核苷酸且反義股之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自為21個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑反義股之長度各自獨立地為21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑有義股之長度各自獨立地為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。有義股及反義股黏接形成雙螺旋體，且在一些實施例中，雙股RNAi藥劑具有約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸之雙螺旋體長度。
用於形成C3 RNAi藥劑之核苷酸序列之實例提供於表2、表3、表4、表5C、表7A、表7B及表8中。包括表2、表3、表4、表5C、表7A及表7B中之有義股及反義股序列的RNAi藥劑雙螺旋體之實例展示於表5A、表5B、表5C及表8中。
在一些實施例中，有義股與反義股之間完美互補、實質上互補或部分互補的區域之長度為15至26 (例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)個核苷酸，且存在於反義股之5'端處或其附近(例如此區域可與反義股之5'端間隔0、1、2、3或4個並非完美互補、實質上互補或部分互補的核苷酸)。
本文所描述之C3 RNAi藥劑之有義股包括與C3 mRNA中具有相同數目個核苷酸之核心延伸段序列(在本文中亦稱為「核心延伸段」或「核心序列」)具有至少85%一致性的至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，有義股核心延伸段序列與反義股中之核心延伸段序列100% (完美)互補或至少約85% (實質上)互補，且因此有義股核心延伸段序列通常與C3 mRNA標靶中存在之具有相同長度之核苷酸序列(有時稱為例如標靶序列)完美一致或至少約85%一致。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為17個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為21個核苷酸。
本文所描述之C3 RNAi藥劑之反義股包括與C3 mRNA中具有相同數目個核苷酸之核心延伸段及對應有義股中具有相同數目個核苷酸之核心延伸段具有至少85%互補性的至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，反義股核心延伸段與C3 mRNA標靶中存在之具有相同長度之核苷酸序列(例如標靶序列) 100% (完美)互補或至少約85% (實質上)互補。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為19個核苷酸。有義股核心延伸段序列可具有與對應反義核心序列相同的長度或其可具有不同的長度。
C3 RNAi藥劑有義股及反義股黏接形成雙螺旋體。C3 RNAi藥劑之有義股及反義股可彼此部分、實質上或完全互補。在互補雙螺旋體區內，有義股核心延伸段序列與反義核心延伸段序列至少85%互補或100%互補。在一些實施例中，有義股核心延伸段序列含有至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25個核苷酸之序列，其與反義股核心延伸段序列之對應15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸序列至少85%或100%互補(亦即，C3 RNAi藥劑之有義及反義核心延伸段序列具有至少85%鹼基配對或100%鹼基配對之至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25個核苷酸之區域)。
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑的反義股與表2、表3、表5C、表7A或表8中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑的有義股與表2、表4、表5C、表7B或表8中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，有義股及/或反義股可視情況且獨立地在核心延伸段序列之3'端、5'端或3'及5'端兩者處含有額外1、2、3、4、5或6個核苷酸(延伸部分)。反義股額外核苷酸(若存在)可與C3 mRNA中之對應序列互補或可不與其互補。有義股額外核苷酸(若存在)可與C3 mRNA中之對應序列一致或可不與其一致。反義股額外核苷酸(若存在)可與對應有義股之額外核苷酸(若存在)互補或可不與其互補。
如本文所使用，延伸部分在有義股核心延伸段序列及/或反義股核心延伸段序列之5'及/或3'端處包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。有義股上之延伸部分核苷酸可與對應反義股中之核苷酸(核心延伸段序列核苷酸或延伸部分核苷酸)互補或可不與其互補。相反，反義股上之延伸部分核苷酸可與對應有義股中之核苷酸(核心延伸段核苷酸或延伸部分核苷酸)互補或可不與其互補。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股及反義股含有3'及5'延伸部分。在一些實施例中，一股之一或多個3'延伸部分核苷酸與另一股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在其他實施例中，一股之一或多個3'延伸部分核苷酸不與另一股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑具有反義股及有義股，該反義股具有3'延伸部分且該有義股具有5'延伸部分。在一些實施例中，一或多個延伸部分核苷酸不配對且形成突出物。如本文及此項技術中所使用，「突出物」係指位於有義股或反義股之末端處的一段一或多個不成對核苷酸之延伸部分，其不形成本文所揭示之RNAi藥劑之雜交部分或雙螺旋部分的一部分。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之3'延伸部分的反義股。在其他實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有長度為1、2或3個核苷酸之3'延伸部分的反義股。在一些實施例中，一或多個反義股延伸部分核苷酸包含與對應C3 mRNA序列互補之核苷酸。在一些實施例中，一或多個反義股延伸部分核苷酸包含不與對應C3 mRNA序列互補之核苷酸。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、或5個核苷酸之3'延伸部分的有義股。在一些實施例中，一或多個有義股延伸部分核苷酸包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸或與C3 mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。在一些實施例中，3'有義股延伸部分包括以下序列中之一者或由以下序列中之一者組成(但不限於此)：T、UT、TT、UU、UUT、TTT、或TTTT (各自以5'至3'列出)。
有義股可具有3'延伸部分及/或5'延伸部分。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之5'延伸部分的有義股。在一些實施例中，一或多個有義股延伸部分核苷酸包含與C3 mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。
用於形成C3 RNAi藥劑之序列之實例提供於表2、表3、表4、表5C、表7A、表7B及表8中。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包括表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的序列。在某些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表3中之任一經修飾之序列或由其組成。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包括表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的核苷酸1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21之序列(自5'端à3'端)。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包括表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列的序列。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包括表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列的核苷酸1-18、1-19、1-20、1-21、2-19、2-20、2-21、3-20、3-21或4-21之序列(自5'端à3'端)。在某些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包含表4中之任一經修飾之序列的經修飾之序列或由其組成。
在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有相同數目個核苷酸。在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有不同數目個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均非鈍端。如本文所使用，「鈍端」係指雙股RNAi藥劑中兩個黏接股之末端核苷酸互補(形成互補鹼基對)的一端。
在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成綻開端(frayed end)。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成綻開端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成綻開端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均非綻開端。如本文所使用，綻開端係指雙股RNAi藥劑的一端中兩個黏接股之末端核苷酸形成對(亦即不形成突出物)但並不互補(亦即形成非互補對)。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑之一股之端處的一或多個不成對核苷酸形成突出物。不成對核苷酸可能位於有義股或反義股上，產生3'或5'突出物。在一些實施例中，RNAi藥劑含有：鈍端及綻開端、鈍端及5'突出端、鈍端及3'突出端、綻開端及5'突出端、綻開端及3'突出端、兩個5'突出端、兩個3'突出端、5'突出端及3'突出端、兩個綻開端或兩個鈍端。通常，當存在突出物時，突出物位於有義股、反義股或有義股及反義股之3'末端處。
本文所揭示之C3 RNAi藥劑亦可包含一或多個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑之有義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸。本文所揭示之C3 RNAi藥劑可進一步包含一或多個經修飾之核苷間鍵聯，例如一或多個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑含有一或多個經修飾之核苷酸及一或多個經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施例中，2'-修飾之核苷酸與經修飾之核苷間鍵聯組合。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑製備為醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑製備為醫藥學上可接受之鈉鹽。此項技術中所熟知之此類形式在本文所揭示之發明的範疇內。 經修飾之核苷酸
當用於各種寡核苷酸構築體中時，經修飾之核苷酸可保存細胞中化合物之活性，同時增加此等化合物之血清穩定性，且亦可最小化在投與寡核苷酸構築體時人類中活化干擾素活性之可能性。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑含有一或多個經修飾之核苷酸。如本文所使用，「經修飾之核苷酸」為除核糖核苷酸(2'-羥基核苷酸)以外的核苷酸。在一些實施例中，至少50% (例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，經修飾之核苷酸可包括(但不限於)去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸、2'-經修飾之核苷酸、反向核苷酸、包含經修飾之核鹼基之核苷酸、橋聯核苷酸、肽核酸(PNA)、2',3'-開環核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物)、鎖定核苷酸、3'-O-甲氧基(2'核苷間連接)核苷酸、2'-F-阿糖核苷酸、5'-Me、2'-氟核苷酸、𠰌啉基核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸及含膦酸環丙酯之核苷酸。2'-經修飾之核苷酸(亦即，在五員糖環之2'位置處具有除羥基以外之基團的核苷酸)包括(但不限於) 2'-O-甲基核苷酸(本文中或此項技術中亦稱為2'-甲氧基核苷酸)、2'-氟核苷酸(本文中或此項技術中亦稱為2'-去氧-2'-氟核苷酸)、2'-去氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(本文中或此項技術中亦稱為2'-MOE核苷酸)、2'-胺基核苷酸及2'-烷基核苷酸。既定化合物之所有位置無需經均一修飾。相反，超過一個修飾可併入單一C3 RNAi藥劑或甚至其單一核苷酸中。C3 RNAi藥劑有義股及反義股可藉由此項技術中已知之方法合成及/或修飾。一個核苷酸上之修飾獨立於另一核苷酸上之修飾。
經修飾之核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及經N-2、N-6及O-6取代之嘌呤(例如2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-異丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-異丙基或2-正丁基)及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫氫基、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(例如5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，反義股之5'及/或3'端可包括無鹼基殘基(Ab)，其亦可稱為「無鹼基位點」或「無鹼基核苷酸」。無鹼基殘基(Ab)為在糖部分之1'位置處不具有核鹼基之核苷酸或核苷。在一些實施例中，無鹼基殘基可置放於核苷酸序列內部。在一些實施例中，Ab或AbAb可添加至反義股之3'端。在一些實施例中，有義股之5'端可包括一或多個額外無鹼基殘基(例如(Ab)或(AbAb))。在一些實施例中，將UUAb、UAb或Ab添加至有義股之3'端。在一些實施例中，可用核糖醇(無鹼基核糖)殘基置換無鹼基(去氧核糖)殘基。
在一些實施例中，RNAi藥劑之所有或實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，其中所存在的實質上所有核苷酸均為經修飾之核苷酸的RNAi藥劑為在有義股及反義股中有四個或更少個(亦即，0、1、2、3或4個)為核糖核苷酸(亦即，未經修飾)之核苷酸的RNAi藥劑。如本文所使用，其中所存在的實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸的有義股為在有義股中具有兩個或更少個(亦即，0、1或2個)為未經修飾之核糖核苷酸之核苷酸的有義股。如本文所使用，其中所存在的實質上所有核苷酸均為經修飾之核苷酸的反義有義股為在有義股中具有兩個或更少個(亦即，0、1或2個)為未經修飾之核糖核苷酸之核苷酸的反義股。在一些實施例中，RNAi藥劑之一或多個核苷酸為未經修飾之核糖核苷酸。某些經修飾之核苷酸之化學結構闡述於本文表6中。 經修飾之核苷間鍵聯
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑之一或多個核苷酸藉由非標準鍵聯或主鏈(亦即，經修飾之核苷間鍵聯或經修飾之主鏈)連接。經修飾之核苷間鍵聯或主鏈包括(但不限於)硫代磷酸酯基(本文中表示為小寫字母「s」)、對掌性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸烷酯(例如膦酸甲酯或3'-伸烷基膦酸酯)、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(例如3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯或硫羰基胺基磷酸酯)、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、𠰌啉基鍵聯、具有正常3'-5'鍵聯之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物或具有反向極性之硼烷磷酸酯，其中相鄰核苷單元對使3'-5'連接至5'-3'或使2'-5'連接至5'-2'。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵聯或主鏈不具有磷原子。不具有磷原子之經修飾之核苷間鍵聯包括(但不限於)短鏈烷基或環烷基糖間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵聯，或一或多個短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷間主鏈包括(但不限於)矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含烯烴之主鏈、胺基磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈及其他具有混合N、O、S及CH 2組分之主鏈。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵聯，C3 RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵聯，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵聯，C3 RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵聯，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股含有至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵聯在自有義股之3'端開始之位置1-3處的核苷酸之間。在一些實施例中，一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯在有義股核苷酸序列之5'端處，且另一硫代磷酸酯鍵聯在有義股核苷酸序列之3'端處。在一些實施例中，兩個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於有義股之5'端處，且另一硫代磷酸酯鍵聯在有義股之3'端處。在一些實施例中，有義股不包括核苷酸之間的任何硫代磷酸酯核苷間鍵聯，但在5'及3'端上之末端核苷酸及視情況存在之反向無鹼基殘基端帽之間含有一個、兩個或三個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，靶向配位體係經由硫代磷酸酯鍵聯連接至有義股。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯在自反義股之5'端開始之位置1-3處的核苷酸之間及在自5'端開始之位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26處的核苷酸之間。在一些實施例中，三個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於自反義股之5'端開始之位置1-4之間，且第四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於自反義股之5'端開始之位置20-21之間。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑在反義股中含有至少三個或四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 加帽殘基或部分
在一些實施例中，有義股可包括一或多個加帽殘基或部分，在此項技術中時常稱為「帽」、「端帽」或「加帽殘基」。如本文所使用，「加帽殘基」為非核苷酸化合物或可併入本文所揭示之RNAi藥劑之核苷酸序列的一或多個末端處之其他部分。在一些情況下，加帽殘基可為RNAi藥劑提供某些有益特性，諸如防止核酸外切酶降解。在一些實施例中，添加反向無鹼基殘基(invAb) (在此項技術中亦稱為「反向無鹼基位點」)作為加帽殘基。(參見例如F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16；美國專利第5,998,203號)。加帽殘基為此項技術中通常已知的，且包括例如反向無鹼基殘基以及碳鏈，諸如末端C 3H 7(丙基)、C 6H 13(己基)或C 12H 25(十二烷基)基團。在一些實施例中，在有義股之5'末端、3'末端或5'及3'末端兩者處存在加帽殘基。在一些實施例中，有義股之5'端及/或3'端可包括超過一個反向無鹼基去氧核糖部分作為加帽殘基。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之3'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點插入靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。在一些實施例中，在RNAi藥劑之有義股之一或多個末端處或其附近包括一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點允許增強RNAi藥劑之活性或其他所需特性。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基插入靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。反向無鹼基殘基可經由磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯(例如本文中顯示為(invAb)s))或其他核苷間鍵聯連接。在一些實施例中，在RNAi藥劑之有義股之一或多個末端處或其附近包括一或多個反向無鹼基殘基可允許增強RNAi藥劑之活性或其他所需特性。在一些實施例中，反向無鹼基(去氧核糖)殘基可經反向核糖醇(無鹼基核糖)殘基置換。在一些實施例中，反義股核心延伸段序列之3'端或反義股序列之3'端可包括反向無鹼基殘基。反向無鹼基去氧核糖殘基之化學結構展示於下表6中。 C3 RNAi 藥劑
本文所揭示之C3 RNAi藥劑經設計以靶向C3基因(例如SEQ ID NO: 1)上之特定位置。 NM_000064.4智人補體C3，mRNA轉錄物(SEQ ID NO: 1)：
如本文所定義，反義股序列經設計以當與C3基因鹼基配對時，當反義股之5'末端核鹼基與距該基因上之給定位置下游(朝向3'端) 21個核苷酸處的位置對準時靶向該基因上之該給定位置處的C3基因。舉例而言，如本文中表1及表2中所說明，經設計以在位置2566處靶向C3基因之反義股序列需要當與該基因鹼基配對時，該反義股之5'末端核鹼基與C3基因之位置2586對準。
如本文所提供，C3 RNAi藥劑不需要反義股之位置1 (5'à3')處的核鹼基與基因互補，其限制條件為反義股及基因在至少15個連續核苷酸之核心延伸段序列上有至少85%互補性(例如至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補性)。舉例而言，對於本文所揭示之經設計以靶向C3基因之位置2566的C3 RNAi藥劑，C3 RNAi藥劑之反義股之5'末端核鹼基必須與該基因之位置2586對準；然而，反義股之5'末端核鹼基可與C3基因之位置2586互補但並非必需的，其限制條件為反義股及基因在至少15個連續核苷酸之核心延伸段序列上有至少85%互補性(例如至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補性)。如尤其由本文所揭示且如此項技術中所熟知之實例所示，C3 RNAi藥劑之反義股與基因結合之特異性位點(例如無論C3 RNAi藥劑經設計以靶向位置2566處或一些其他位置處之C3基因)對C3 RNAi藥劑達成之抑制程度以及分子達成之毒性概況係至關重要的。(參見例如Kamola等人, The siRNA Non-seed Region and Its Target Sequences are Auxiliary Determinants of Off-Target Effects,PLOS Computational Biology, 11(12), 圖1(2015))。
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑靶向表1中所展示之C3基因序列之位置處或其附近的C3基因。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之反義股包括與表1中所揭示之標靶C3 21-聚體序列完全、實質上或至少部分互補的核心延伸段序列。 表 1.C3 21-聚體mRNA標靶序列(取自智人補體C3，mRNA，GenBank NM_000064.4 (SEQ ID NO: 1))
SEQ ID No. C3 21- 聚體 標靶序列 (5 ' → 3') SEQ ID NO: 1 上序列之對應位置 靶向基因位置 ( 如本文中所提及)
2 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA 2566-2586 2566
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置21 (5'à3')能夠與表1中所揭示之21-聚體標靶序列之位置1形成鹼基對。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置1 (5'à3')能夠與表1中所揭示之21-聚體標靶序列之位置21形成鹼基對。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置2 (5'à3')能夠與表1中所揭示之21-聚體標靶序列之位置20形成鹼基對。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置2至18 (5'à3')能夠與位於表1中所揭示之21-聚體標靶序列之位置18至2處的各別互補鹼基中之各者形成鹼基對。
對於本文所揭示之RNAi藥劑，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處的核苷酸可與C3基因完美互補或可與C3基因不互補。在一些實施例中，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處的核苷酸為U、A或dT。在一些實施例中，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處的核苷酸與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表2、表3、表5C、表7A或表8中之反義股序列中之任一者的核苷酸2-18、2-19、2-20或2-21之序列(自5'端à3'端)。在一些實施例中，C3 RNAi有義股包含表2、表4、表5C、表7B或表8中之有義股序列中之任一者的核苷酸3-21、2-21、1-21、3-20、2-20、1-20、3-19、2-19、1-19、3-18、2-18或1-18之序列(自5'端à3'端)。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表2、表3、表5C、表7A或表8之反義股序列中之任一者的核苷酸2-18、2-19、2-20或2-21之序列(自5'端à3'端)。在一些實施例中，C3 RNAi有義股包含表2、表4、表5C、表7B或表8之有義股序列中之任一者的核苷酸3-21、2-21、1-21、3-20、2-20、1-20、3-19、2-19、1-19、3-18、2-18或1-18之序列(自5'端à3'端)。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含(i)反義股，其包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸2-18或2-19之序列(自5'端à3'端)，及(ii)有義股，其包含表2或表4中之有義股序列中之任一者的核苷酸3-21、2-21、1-21、3-20、2-20、1-20、3-19、2-19、1-19、3-18、2-18或1-18之序列(自5'端à3'端)。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含(i)反義股，其包含表2或表3之反義股序列中之任一者的核苷酸2-18或2-19之序列(自5'端à3'端)，及(ii)有義股，其包含表2或表4之有義股序列中之任一者的核苷酸3-21、2-21、1-21、3-20、2-20、1-20、3-19、2-19、1-19、3-18、2-18或1-18之序列(自5'端à3'端)。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括下表2中所展示之核心21-聚體核苷酸序列。 表 2.C3 RNAi藥劑反義股及有義股核心延伸段鹼基序列(N=任何核鹼基；)
SEQ ID No. 反義股鹼基序列 (5' → 3') ( 顯示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID No. 有義股鹼基序列 (5' → 3') ( 顯示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO: 1 上經 鑑別之序列的對應位置 靶向基因位置
3 UUUCGAACAACAGAGUAGGGU 8 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA 2566-2586 2566
4 AUUCGAACAACAGAGUAGGGU 9 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAU 2566-2586 2566
5 NUUCGAACAACAGAGUAGGGU 10 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAN 2566-2586 2566
6 UUUCGAACAACAGAGUAGGGN 11 NCCCUACUCUGUUGUUCGAAA 2566-2586 2566
7 NUUCGAACAACAGAGUAGGGN 12 NCCCUACUCUGUUGUUCGAAN 2566-2586 2566
包含表2中之序列或由其組成之C3 RNAi藥劑之有義股及反義股可為經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，具有包含表2中之序列或由其組成之有義股及反義股序列的C3 RNAi藥劑全部或實質上全部為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之反義股與表2中之任一反義股序列相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之有義股與表2中之任一有義股序列相差0、1、2或3個核苷酸。
如本文所使用，表2中所揭示之序列中所列的各N可獨立地選自任何及所有核鹼基(包括經修飾之核苷酸及未經修飾之核苷酸上所見的核鹼基)。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置之N核苷酸互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置之N核苷酸不互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置之N核苷酸相同的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置之N核苷酸不同的核鹼基。
某些經修飾之C3 RNAi藥劑反義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表3中。某些經修飾之C3 RNAi藥劑有義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表4中。在形成C3 RNAi藥劑中，表3及表4以及上文表2中所列出之各基礎鹼基序列中之各核苷酸可為經修飾之核苷酸。
本文所描述之C3 RNAi藥劑係藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2或表4中所列序列之有義股可與含有表2或表3中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列具有一個連續15、16、17、18、19、20或21個核苷酸序列至少85%互補性的區域。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之任一序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含以下或由以下組成：具有表2、表3或表4中之任一序列的有義股及反義股之核鹼基序列的雙螺旋體。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含以下或由以下組成：以鈉鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供的雙螺旋體序列。
含有經修飾之核苷酸之反義股之實例提供於表3及表5C中。含有經修飾之核苷酸之有義股之實例提供於表4及表5C中。
如表3、表4、表5C、表7A、表7B及表8中所使用，使用以下標記指示經修飾之核苷酸及連接基團： A           =   腺苷-3'-磷酸酯； C           =   胞苷-3'-磷酸酯； G           =   鳥苷-3'-磷酸酯； U           =   尿苷-3'-磷酸酯 a            =   2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯 as           =   2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯 c            =   2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯 cs           =   2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯 g            =   2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯 gs          =   2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯 u            =   2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯 us          =   2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 Af          =   2'-氟腺苷-3'-磷酸酯 Afs         =   2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯 Cf          =   2'-氟胞苷-3'-磷酸酯 Cfs         =   2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯 Gf          =   2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯 Gfs         =   2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯 Uf          =   2'-氟尿苷-3'-磷酸酯 Ufs         =   2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯 (invAb)  =   反向無鹼基去氧核糖核苷酸，參見表6 (invAb)s =   反向無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-硫代磷酸酯，參見表6 cPrpa      =   5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯(參見表6) cPrpas    =   5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯(參見表6) cPrpu     =   5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯(參見表6) cPrpus    =   5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸(參見表6)
如一般熟習此項技術者將容易地理解，除非藉由序列(諸如藉由硫代磷酸酯鍵聯「s」)另有指示，否則當存在於寡核苷酸中時，核苷酸單體藉由5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接。如一般熟習此項技術者將清楚地理解，如包括本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所顯示的硫代磷酸酯鍵聯置換通常存在於寡核苷酸中之磷酸二酯鍵聯。此外，一般熟習此項技術者將容易地理解，離體給定寡核苷酸序列之3'端處的末端核苷酸通常將在給定單體之各別3'位置處具有羥基(-OH)基團而非磷酸酯部分。另外，對於本文所揭示之實施例，當觀察各別股5'à3'時，插入反向無鹼基殘基以使得去氧核糖之3'位置連接在各別股上之前述單體的3'端處(參見例如表6)。此外，如一般技術者將容易地理解及瞭解，雖然本文中所描繪之硫代磷酸酯化學結構通常顯示硫原子上之陰離子，但本文所揭示之發明涵蓋所有硫代磷酸酯互變異構物及共振結構(例如其中硫原子具有雙鍵且陰離子位於氧原子上)。本文中除非另外明確指示，否則在描述本文所揭示之C3 RNAi藥劑及C3 RNAi藥劑之組合物時使用一般熟習此項技術者之此類理解。
與本文所揭示之C3 RNAi藥劑一起使用的靶向配位體、靶向基團及連接基團之某些實例提供於下表6中。更特定言之，靶向基團及連接基團(其共同可形成靶向配位體)包括(NAG37)及(NAG37)s，其化學結構提供於下表6中。各有義股及/或反義股可具有本文所列之任何靶向配位體、靶向基團或連接基團，以及與序列之5'及/或3'端結合的其他基團。 表 3.C3 RNAi藥劑反義股序列
反義股 ID ： 經修飾之反義股 (5' → 3') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5' → 3') ( 顯示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM13561-AS usUfsusCfgAfacaacAfgAfgUfaGfGfgsu 13 UUUCGAACAACAGAGUAGGGU 3
表 4A.C3 RNAi藥劑有義股序列
有義股 ID ： 經修飾之有義股 (5 '→3 ') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5' → 3') ( 顯示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM12489-SS (NAG37)s(invAb)sacccuacuCfUfGfuuguucgaaas(invAb) 14 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA 8
表 4B.C3 RNAi藥劑有義股序列(無靶向配位體或端帽)
有義股 ID ： 經修飾之有義股 (5 '→3 ') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5' → 3') ( 顯示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM12489-SS acccuacuCfUfGfuuguucgaaa 15 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA 8
本文所描述之C3 RNAi藥劑係藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2、表4、表5C、表7B或表8中所列序列之有義股可與含有表2、表3、表5C、表7A或表8中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列在連續15、16、17、18、19、20或21個核苷酸序列上具有至少85%互補性的區域。
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之反義股與表3或表5C中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑之有義股與表4或表5C中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表2、表3或表5C中之任一序列的核苷酸序列。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表2、表3或表5C中之任一序列的核苷酸1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21之序列(自5'端à3'端)。在某些實施例中，C3 RNAi藥劑反義股包含表3或表5C中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列或由其組成。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包含表2、表4或表5C中之任一序列的核苷酸序列。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包含表2、表4或表5C中之任一序列的核苷酸1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21或4-21之序列(自5'端à3'端)。在某些實施例中，C3 RNAi藥劑有義股包含表4或表5C中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列或由其組成。
對於本文所揭示之C3 RNAi藥劑，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處的核苷酸可與C3基因完美互補或可與C3基因不互補。在一些實施例中，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處之核苷酸為U、A或dT (或其經修飾之型式)。在一些實施例中，反義股之位置1 (自5'端à3'端)處的核苷酸與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
含有表2、表4、表5C、表7B或表8中所列序列之有義股可與含有表2、表3、表5C、表7A或表8中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列在連續15、16、17、18、19、20或21個核苷酸序列上具有至少85%互補性的區域。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑具有有義股及反義股，該有義股由表4或表5C中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成，且該反義股由表3或表5C中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成。某些代表性序列對由表5A、表5B、表5C及表8中所展示之雙螺旋體ID編號例示。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含由本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示的雙螺旋體、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含由本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示的任何雙螺旋體之有義股及反義股核苷酸序列。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含由本文中所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示的任何雙螺旋體的有義股及反義股核苷酸序列以及靶向基團及/或連接基團，其中該靶向基團及/或連接基團共價連接(亦即，結合)至有義股或反義股。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包括本文中所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股經修飾之核苷酸序列。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含本文中所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股經修飾之核苷酸序列以及靶向基團及/或連接基團，其中該靶向基團及/或連接基團共價連接至有義股或反義股。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有表2或表5A、表5B及表5C之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含靶向基團或靶向配位體。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有表2或表5A、表5B及表5C之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含去唾液酸糖蛋白受體配位體靶向基團。
具有或不具有連接子之靶向基團可連接至表2、表3、表4或表5C中所揭示之有義股及/或反義股中之任一者的5'或3'端。具有或不具有靶向基團之連接子可連接至表2、表3、表4及表5C中所揭示之有義股及/或反義股中之任一者的5'或3'端。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有表2或表5A、表5B及表5C之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含選自由(NAG37)及(NAG37)s組成之群的靶向配位體，該(NAG37)及(NAG37)s各自如表6中所定義。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有表3或表4中之反義股及/或有義股核苷酸序列中之任一者的經修飾之核苷酸序列的反義股及有義股。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含具有表5A、表5B及表5C中之任一雙螺旋體的反義股及/或有義股核苷酸序列中之任一者的經修飾之核苷酸序列的反義股及有義股，且進一步包含去唾液酸糖蛋白受體配位體靶向基團。
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：表5A、表5B及表5C之雙螺旋體中之任一者。 表 5A.具有對應有義股及反義股ID編號以及經修飾及未經修飾之核苷酸序列之序列ID編號的C3 RNAi藥劑雙螺旋體。
雙螺旋體 AS ID 經 AS 修飾之 SEQ ID NO: 未經 AS 修飾之 SEQ ID NO: SS ID 經 SS 修飾之 SEQ ID NO: 未經 SS 修飾之 SEQ ID NO:
AD09546 AM13561-AS 13 3 AM12489-SS 14 8
表 5B.具有參考C3基因(SEQ ID NO: 1)上靶向位置之對應有義股及反義股ID編號的C3 RNAi藥劑雙螺旋體
雙螺旋體 ID 反義股 ID 有義股 ID 靶向C3 基因位置(SEQ ID NO: 1 中)
AD09546 AM13561-AS AM12489-SS 2566
表 5C.展示經化學修飾之反義股及有義股序列的C3 RNAi藥劑雙螺旋體
雙螺旋體 ID ： 經修飾之反義股 (5 '→3 ') SEQ ID NO. 經修飾之有義股 (5 '→3 ') SEQ ID NO.
AD09546 usUfsusCfgAfacaacAfgAfgUfaGfGfgsu 13 (NAG37)s(invAb)sacccuacuCfUfGfuuguucgaaas(invAb) 14
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。本文所描述之RNAi藥劑在遞送至表現C3基因之細胞後可在活體內及/或活體外抑制或減弱一或多個C3基因之表現。 靶向配位體或基團、連接基團及遞送媒劑
在一些實施例中，C3 RNAi藥劑與一或多個非核苷酸基團結合，該一或多個非核苷酸基團包括(但不限於)靶向基團、連接基團、靶向配位體、遞送聚合物或遞送媒劑。非核苷酸基團可增強RNAi藥劑之靶向、遞送或連接。靶向基團及連接基團之實例提供於表6中。非核苷酸基團可共價連接至有義股及/或反義股之3'及/或5'端。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑含有與有義股之3'及/或5'端連接之非核苷酸基團。在一些實施例中，非核苷酸基團與C3 RNAi藥劑有義股之5'端連接。非核苷酸基團可經由連接子/連接基團直接地或間接地連接至RNAi藥劑。在一些實施例中，非核苷酸基團經由不穩定、可裂解或可逆鍵或連接子連接至RNAi藥劑。
在一些實施例中，非核苷酸基團增強其所連接之RNAi藥劑或結合物的藥物動力學特性或生物分佈特性，以改良RNAi藥劑或結合物之細胞特異性或組織特異性分佈及細胞特異性吸收。在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi藥劑之胞吞作用。
靶向基團或靶向部分增強其所連接之結合物或RNAi藥劑的藥物動力學特性或生物分佈特性，以改良結合物或RNAi藥劑之細胞特異性(在一些情況下包括器官特異性)分佈及細胞特異性(或器官特異性)吸收。靶向基團可為單價、二價、三價、四價或對於其所針對之標靶具有更高價數。代表性靶向基團包括(但不限於)對細胞表面分子具有親和力之化合物、細胞受體配位體、半抗原、抗體、單株抗體、抗體片段及對細胞表面分子具有親和力之抗體模擬物。
在一些實施例中，靶向基團使用連接子連接至RNAi藥劑，該連接子諸如PEG連接子或一個、兩個或三個無鹼基及/或核糖醇(無鹼基核糖)殘基，該等殘基在一些情況下可充當連接子。在一些實施例中，靶向配位體包含半乳糖衍生物簇。
本文所描述之C3 RNAi藥劑可合成為在5'端及/或3'端具有反應性基團，諸如胺基(在本文中亦稱為胺)。反應性基團隨後可用於使用此項技術中典型之方法連接靶向部分。
在一些實施例中，靶向基團包含去唾液酸糖蛋白受體配位體。如本文所使用，去唾液酸糖蛋白受體配位體為含有對去唾液酸糖蛋白受體具有親和力之部分的配位體。如本文所提及，去唾液酸糖蛋白受體在肝細胞上高度表現。在一些實施例中，去唾液酸糖蛋白受體配位體包括一或多種半乳糖衍生物或由其組成。如本文所使用，術語半乳糖衍生物包括半乳糖及對去唾液酸糖蛋白受體之親和力等於或大於半乳糖的半乳糖之衍生物。半乳糖衍生物包括(但不限於)：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基半乳胺糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖(參見例如：S.T. Iobst及K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686)。適用於將寡核苷酸及其他分子活體內靶向肝的半乳糖衍生物及半乳糖衍生物簇為此項技術中已知的(參見例如Baenziger及Fiete，1980，Cell, 22, 611-620；Connolly等人，1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945)。
半乳糖衍生物已經由其結合於肝細胞表面上所表現之去唾液酸糖蛋白受體而用於將分子活體內靶向肝細胞。去唾液酸糖蛋白受體配位體與一或多個去唾液酸糖蛋白受體之結合促進細胞特異性靶向肝細胞以及將分子胞吞至肝細胞中。去唾液酸糖蛋白受體配位體可為單體(例如具有單一半乳糖衍生物，亦稱為單價或單齒)或多聚體(例如具有多種半乳糖衍生物)。半乳糖衍生物或半乳糖衍生物簇可使用此項技術中已知之方法連接至RNAi藥劑之有義股或反義股的3'端或5'端。
諸如半乳糖衍生物簇之靶向配位體的製備描述於例如Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2018/044350號及Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2017/156012號中，該等國際專利申請公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文所使用，半乳糖衍生物簇包含具有兩至四個末端半乳糖衍生物的分子。末端半乳糖衍生物經由其C-1碳連接至分子。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇為半乳糖衍生物三聚體(亦稱為三觸角型半乳糖衍生物或三價半乳糖衍生物)。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含N-乙醯基-半乳胺糖部分。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含三個N-乙醯基-半乳胺糖部分。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇為半乳糖衍生物四聚體(亦稱為四觸角型半乳糖衍生物或四價半乳糖衍生物)。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含四個N-乙醯基-半乳胺糖部分。
如本文所使用，半乳糖衍生物三聚體含有三種半乳糖衍生物，其各自連接至中央分支點。如本文所使用，半乳糖衍生物四聚體含有四種半乳糖衍生物，其各自連接至中央分支點。半乳糖衍生物可經由醣中之C-1碳連接至中央分支點。在一些實施例中，半乳糖衍生物經由連接子或間隔子連接至分支點。在一些實施例中，連接子或間隔子為可撓性親水性間隔子，諸如PEG基團(參見例如美國專利案第5,885,968號；Biessen等人，J. Med. Chem. 1995.第39卷.第1538-1546頁)。在一些實施例中，PEG間隔子為PEG 3間隔子。分支點可為允許三種半乳糖衍生物連接且進一步允許分支點連接至RNAi藥劑的任何小分子。分支點基團之實例為二-離胺酸或二-麩胺酸。分支點連接至RNAi藥劑可經由連接子或間隔子發生。在一些實施例中，連接子或間隔子包含可撓性親水性間隔子，諸如(但不限於) PEG間隔子。在一些實施例中，連接子包含剛性連接子，諸如環狀基團。在一些實施例中，半乳糖衍生物包含N-乙醯基-半乳胺糖或由其組成。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含半乳糖衍生物四聚體，其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖四聚體。
本發明之實施例包括用於將C3 RNAi藥劑活體內遞送至肝細胞之醫藥組合物。此類醫藥組合物可包括例如與半乳糖衍生物簇結合之C3 RNAi藥劑。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含半乳糖衍生物三聚體(其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖三聚體)或半乳糖衍生物四聚體(其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖四聚體)。
靶向配位體或靶向基團可連接至本文所揭示之C3 RNAi藥劑之有義股或反義股的3'或5'端。
靶向配位體包括(但不限於)如表6中所定義之(NAG37)及(NAG37)s。其他靶向基團及靶向配位體(包括半乳糖簇靶向配位體)為此項技術中已知的。
在一些實施例中，連接基團與RNAi藥劑結合。連接基團有助於藥劑與靶向基團、遞送聚合物或遞送媒劑之共價連接。連接基團可連接至RNAi藥劑有義股或反義股之3'及/或5'端。在一些實施例中，連接基團連接至RNAi藥劑有義股。在一些實施例中，連接基團與RNAi藥劑有義股之5'或3'端結合。在一些實施例中，連接基團與RNAi藥劑有義股之5'端結合。連接基團之實例可包括(但不限於)：反應性基團，諸如一級胺及炔烴、烷基、無鹼基核苷酸、核糖醇(無鹼基核糖)及/或PEG基團。
在一些實施例中，靶向基團內部連接至RNAi藥劑之有義股及/或反義股上之核苷酸。在一些實施例中，靶向基團經由連接子連接至RNAi藥劑。
連接子或連接基團為兩個原子之間的連接，其使一個所關注化學基團(諸如RNAi藥劑)或區段經由一或多個共價鍵連接至另一所關注化學基團(諸如靶向基團或遞送聚合物)或區段。不穩定鍵聯含有不穩定鍵。鍵聯可視情況包括使兩個結合原子之間的距離增加之間隔子。間隔子可進一步增加鍵聯之可撓性及/或長度。間隔子包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基；其各自可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣類。間隔基團在此項技術中已熟知且前述清單不意謂限制本發明之範疇。
在一些實施例中，當在單一組合物中包括兩種或更多種RNAi藥劑時，RNAi藥劑中之各者可連接至同一靶向基團或兩個不同的靶向基團(亦即，具有不同化學結構之靶向基團)。在一些實施例中，靶向基團在不使用額外連接子之情況下連接至本文所揭示之C3 RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向基團本身經設計成具有連接子或其他位點以促進容易存在的結合。在一些實施例中，當在單分子中包括兩種或更多種C3 RNAi藥劑時，RNAi藥劑中之各者可利用相同的連接子或不同的連接子(亦即，具有不同化學結構之連接子)。
表2、表3、表4、表5C、表7A、表7B或表8中所列之任何C3 RNAi藥劑核苷酸序列(無論經修飾或未經修飾)可含有一或多個3'及/或5'靶向基團或連接基團。表3或表4中所列或在本文中以其他方式所描述之含有3'或5'靶向基團或連接基團的任何C3 RNAi藥劑序列或者可不含3'或5'靶向基團或連接基團，或可含有不同的3'或5'靶向基團或連接基團，包括(但不限於)表6中所描繪之靶向基團或連接基團。表5A、表5B、表5C及表8中所列之任何C3 RNAi藥劑雙螺旋體(無論經修飾或未經修飾)可進一步包含靶向基團或連接基團，包括(但不限於)表6中所描繪之靶向基團或連接基團，且靶向基團或連接基團可連接至C3 RNAi藥劑雙螺旋體之有義股或反義股之3'或5'端。
靶向基團及連接基團(當該等靶向基團及連接基團組合時可形成靶向配位體)之實例提供於表6中。表4、表5C及表8提供具有靶向基團或連接基團之C3 RNAi藥劑有義股的某些實施例，該靶向基團或連接基團連接至5'或3'端。 表 6.表示各種經修飾之核苷酸、靶向配位體或靶向基團、加帽殘基及連接基團之結構
                                                                                                          cPrpus                                                                         cPrpu
                                                                                 cPrpas                                                                               cPrpa
當位於內部時： (invAb)
當位於內部時： (invAb)s
當位於3'末端處時： (invAb)
(NAG37)
(NAG37)s
在以上表6中之結構中之各者中，NAG包含N-乙醯基-半乳胺糖。在一些實施例中，如上表6中所描繪之NAG可包含對肝細胞上存在之去唾液酸糖蛋白受體具有親和力的另一半乳糖衍生物，如一般熟習此項技術者將理解為鑒於以上結構及本文所提供之描述而連接。可使用此項技術中已知的其他連接基團。
在一些實施例中，遞送媒劑可用於將RNAi藥劑遞送至細胞或組織中。遞送媒劑為使RNAi藥劑遞送至細胞或組織改良之化合物。遞送媒劑可包括(但不限於)以下或由以下組成：聚合物，諸如兩性聚合物、膜活性聚合物、肽、蜂毒素肽、蜂毒素樣肽(MLP)、脂質、經可逆修飾之聚合物或肽或經可逆修飾之膜活性多胺。在一些實施例中，RNAi藥劑可與脂質、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC或此項技術中可用之其他遞送系統組合。RNAi藥劑亦可以化學方式與靶向基團、脂質(包括(但不限於)膽固醇及膽固醇基衍生物)、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC (參見例如WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其中各者以引用之方式併入本文中)、水凝膠、環糊精、可生物降解奈米膠囊及生物黏附微球、蛋白質載體或此項技術中已知及可用的適用於核酸或寡核苷酸遞送的其他遞送系統結合。 醫藥組合物
本文所揭示之C3 RNAi藥劑可製備為醫藥組合物或調配物(在本文中亦稱為「藥劑」)。在一些實施例中，醫藥組合物包括至少一種C3 RNAi藥劑。此等醫藥組合物尤其適用於抑制標靶細胞、細胞組、組織或生物體中之標靶mRNA之表現。
醫藥組合物可用於治療患有疾病、病症或病狀之受試者，該疾病、病症或病狀將得益於標靶C3 mRNA之含量降低或標靶基因表現之抑制。醫藥組合物可用於治療處於罹患疾病、病症、症狀或病狀之風險下的受試者，該疾病、病症、症狀或病狀將得益於標靶mRNA之含量降低或標靶基因表現之抑制。在一個實施例中，該方法包括向所治療之受試者投與連接至如本文所描述之靶向配位體的C3 RNAi藥劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(包括媒劑、載劑、稀釋劑及/或遞送聚合物)添加至包括C3 RNAi藥劑之醫藥組合物中，藉此形成適用於活體內遞送至受試者(包括人類)的醫藥調配物或藥劑。
本文所揭示之包括C3 RNAi藥劑之醫藥組合物及方法降低細胞、細胞組、組織、器官或受試者中之標靶mRNA之含量，包括藉由向受試者投與治療有效量之本文所描述之C3 RNAi藥劑，從而抑制受試者中之C3 mRNA之表現或轉譯。在一些實施例中，受試者先前已經鑑別為在肝細胞中具有標靶基因之病原性上調。在一些實施例中，受試者先前已經鑑別或診斷為患有IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症。在一些實施例中，受試者已患有與IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症相關之症狀。在一些實施例中，受試者將得益於受試者之肝臟中C3基因表現之降低。
在一些實施例中，所描述之包括C3 RNAi藥劑的醫藥組合物係用於治療或控制與IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症(PNH)相關之臨床表現。C3 RNAi藥劑可適用之其他疾病或病狀包括狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)及/或自體免疫溶血性貧血(AIHA)/冷凝集素病(CAD)。在一些實施例中，向需要此類治療之受試者投與治療(包括預防)有效量之一或多種醫藥組合物。在一些實施例中，投與所揭示之C3 RNAi藥劑中之任一者可用於降低受試者中之疾病之症狀的發生次數、嚴重程度及/或發生頻率。
所描述之包括C3 RNAi藥劑的醫藥組合物可用於治療患有疾病或病症之受試者中之至少一種症狀，該疾病或病症將得益於C3 mRNA表現之降低或抑制及/或C3蛋白含量之降低。量測C3含量可根據此項技術中已知之現有方法進行。
在一些實施例中，向受試者投與治療有效量之一或多種包括C3 RNAi藥劑之醫藥組合物，藉此治療症狀。在其他實施例中，向受試者投與預防有效量之一或多種C3 RNAi藥劑，藉此預防或抑制至少一種症狀。
投與途徑為藉以使C3 RNAi藥劑與身體接觸之路徑。一般而言，投與藥物及寡核苷酸及核酸來治療哺乳動物之方法為此項技術中所熟知的，且可應用該等方法來投與本文所描述之組合物。本文所揭示之C3 RNAi藥劑可經由任何適合途徑以根據特定途徑適當定製的製劑形式投與。因此，本文所描述之醫藥組合物可藉由注射(例如靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、關節內或腹膜內)投與。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物係經由皮下注射投與。
包括本文所描述之C3 RNAi藥劑的醫藥組合物可使用此項技術中已知的寡核苷酸遞送技術遞送至細胞、細胞組、組織或受試者。一般而言，此項技術中公認用於遞送核酸分子(活體外或活體內)之任何適合方法均適合與本文所描述之組合物一起使用。舉例而言，遞送可藉由以下實現：局部投與(例如直接注射、植入或表面投與)、全身投與或皮下、靜脈內、腹膜內或非經腸途徑，包括顱內(例如室內、腦實質內及鞘內)、肌肉內、經皮、氣管(氣霧劑)、經鼻、經口、經直腸或表面(包括經頰及舌下)投與。在某些實施例中，組合物係藉由皮下或靜脈內輸注或注射投與。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。本文所描述之醫藥組合物經調配以用於向受試者投與。
如本文所使用，醫藥組合物或藥劑包括藥理學有效量之至少一種所描述之治療性化合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為除活性醫藥成分(API、治療性產品，例如C3 RNAi藥劑)以外之物質，該等物質有意包括於藥物遞送系統中。賦形劑在預期劑量下不發揮或不意欲發揮治療作用。賦形劑可用於a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支援或增強API之穩定性、生物可用度或患者接受性，c)有助於產物鑑別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括(但不限於)：吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、清潔劑、聚葡萄糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油狀物、聚合物、防腐劑、生理鹽水、鹽、溶劑、糖、界面活性劑、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、防水劑及濕潤劑。
適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。適合之載劑應在製造及儲存條件下穩定，且應能經保存而不會受到諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇)及其適合之混合物的溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持就分散液而言所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)及氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
無菌可注射溶液可藉由以下方法來製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一種或組合併入適當溶劑中，且視需要繼而進行過濾滅菌。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及上文所列舉之彼等成分之所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的散劑。
在一些實施例中，包括本文所揭示之C3 RNAi藥劑之適用於皮下投與的醫藥調配物可在水性磷酸鈉緩衝液中製備(例如C3 RNAi藥劑在0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉於水中調配)。在一些實施例中，包括本文所揭示之適用於皮下投與之C3 RNAi藥劑的醫藥調配物可在注射用水(無菌水)中製備。本文所揭示之適用於皮下投與之C3 RNAi藥劑可在等張鹽水(0.9%)中製備。
適用於關節內投與之調配物可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質體調配物或可生物降解聚合物系統亦可用於呈現用於關節內及經眼投與之藥物。
亦可製備適用於經口投與本文所揭示之C3 RNAi藥劑的調配物。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑係經口投與。在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑調配於膠囊中經口投與。
活性化合物可用將保護化合物免於自體內快速排出之載劑(諸如控制釋放調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統)製備。可使用可生物降解的生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法將係熟習此項技術者顯而易見的。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。其可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如美國專利第4,522,811號中所描述。
C3 RNAi藥劑可在組合物中調配呈單位劑型以易於劑量之投與及均一性。單位劑型係指適合作為單位劑量用於所治療個體的物理離散單位；各單位含有經計算以產生所需治療效果之預定量的活性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格由以下規定且直接視以下而定：活性化合物之獨特特徵及欲達成之治療效果，及混配此活性化合物用於治療個體之此項技術中固有的限制。
醫藥組合物可含有常見於醫藥組合物中之其他額外組分。該等額外組分包括(但不限於)：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑、鎮痛劑、抗組織胺劑或抗炎劑(例如乙醯胺苯酚、NSAID、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設想表現或包含本文所定義之RNAi藥劑的細胞、組織或經分離之器官可用作「醫藥組合物」。如本文所使用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡稱「有效量」係指該可產生藥理學、治療或預防結果之RNAi藥劑的量。
在一些實施例中，除了投與本文所揭示之RNAi藥劑以外，本文所揭示之方法進一步包含投與第二治療劑或治療之步驟。在一些實施例中，第二治療劑為另一C3 RNAi藥劑(例如靶向C3標靶內之不同序列的C3 RNAi藥劑)。在其他實施例中，第二治療劑可為小分子藥物、抗體、抗體片段或適體。
在一些實施例中，所描述之一或多種C3 RNAi藥劑視情況與一或多種額外治療劑組合。C3 RNAi藥劑及一或多種額外治療劑可以單一組合物之形式投與或該C3 RNAi藥劑及一或多種額外治療劑可分開投與。在一些實施例中，一或多種額外治療劑以單獨劑型與RNAi藥劑分開投與(例如C3 RNAi藥劑係藉由皮下注射投與，而治療給藥方案之方法中所涉及的額外治療劑係經口投與)。在一些實施例中，所描述之一或多種C3 RNAi藥劑係經由皮下注射向有需要之受試者投與，且一或多種視情況選用之額外治療劑係經口投與，其共同提供了與IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症相關之疾病及病狀的治療方案。在一些實施例中，所描述之一或多種C3 RNAi藥劑係經由皮下注射向有需要之受試者投與，且一或多種視情況選用之額外治療劑係經由另一皮下注射投與。在一些實施例中，將C3 RNAi藥劑及一或多種額外治療劑組合成單一劑型(例如調配成用於皮下注射之單一組合物的「混合物」)。C3 RNAi藥劑在具有或不具有一或多種額外治療劑之情況下可與一或多種賦形劑組合以形成醫藥組合物。
一般而言，有效量之C3 RNAi藥劑將在每公斤體重/劑量約0.1至約100 mg，例如每公斤體重/劑量約1.0至約50 mg之範圍內。在一些實施例中，活性化合物之有效量將在每劑量每公斤體重約0.25至約5 mg之範圍內。在一些實施例中，活性成分之有效量將在每劑量每公斤體重約0.5至約4 mg之範圍內。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑之有效量可為固定劑量。在一些實施例中，固定劑量在約5 mg至約1,000 mg之C3 RNAi藥劑之範圍內。在一些實施例中，固定劑量在50至400 mg之C3 RNAi藥劑之範圍內。視所投與之C3 RNAi藥劑之劑量、特定C3 RNAi藥劑之活性含量及特定受試者之所需抑制程度而定，給藥可為每週、每兩週、每月、每季、或以任何其他時間間隔進行。本文中之實例展示在某些動物物種中之適合的抑制程度。所投與之量將視諸如患者或受試者之整體健康狀況、所遞送之化合物之相關生物學功效、藥物之調配物、調配物中賦形劑之存在及類型及投與途徑的變數而定。此外，應理解，所投與之初始劑量可增加超過上述上限含量而快速達到所需血液含量或組織含量，或初始劑量可小於最佳劑量。
為了治療疾病或形成用於治療疾病的藥劑或組合物，本文所描述之包括C3 RNAi藥劑的醫藥組合物可與賦形劑或與第二治療劑或治療組合，該第二治療劑或治療包括(但不限於)：第二或其他RNAi藥劑、小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。
當添加至醫藥學上可接受之賦形劑或佐劑中時，所描述之C3 RNAi藥劑可封裝於套組、容器、封裝物或分配器中。本文所描述之醫藥組合物可封裝於預填注射筒、筆式注射器、自動注射器、輸注袋/裝置或小瓶中。 C3 RNAi 藥劑藥物物質及調配物
在一些實施例中，本文所揭示之C3 RNAi藥劑具有下表8中所展示之C3 RNAi藥物物質之核苷酸序列。C3 RNAi藥物物質中發現之C3 RNAi藥劑的核苷酸序列包括下表7A中所闡述之反義股核苷酸序列及下表7B中所闡述之有義股核苷酸序列。
表 7A.C3 RNAi藥劑反義股序列
SEQ ID NO. 反義序列( 經修飾) (5' → 3') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5' → 3')
13 usUfsusCfgAfacaacAfgAfgUfaGfGfgsu 3 UUUCGAACAACAGAGUAGGGU
表 7B.C3 RNAi藥劑有義股核苷酸序列(顯示為C3 RNAi藥物物質中不存在反向無鹼基殘基或NAG靶向基團的經修飾之型式)
SEQ ID NO. 有義序列( 經修飾) (5' → 3') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5' → 3')
15 acccuacuCfUfGfuuguucgaaa 8 ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA
如本文表7A、表7B及表8中所使用，使用以下標記指示經修飾之核苷酸、靶向基團及連接基團：A、C、G及U分別表示腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鳥苷及2'-O-甲基尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、2'-氟胞苷、2'-氟鳥苷及2'-氟尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵聯；(invAb)表示反向無鹼基去氧核糖殘基(參見表6)；且(NAG37)s表示以下結構(描繪為鈉鹽及游離酸)： ((NAG37)s以鈉鹽形式展示) ((NAG37)s以游離酸形式展示)
各有義股及/或反義股可具有上文所列之任何靶向基團或連接基團，以及與序列之5'及/或3'端結合的其他靶向或連接基團。
C3 RNAi藥劑反義股序列經設計以靶向來自人類受試者中C3基因之mRNA轉錄物，藉此對具有C3之人類受試者使用RNA干擾機制使C3蛋白之轉譯沉默。
在一些實施例中，本文所揭示之方法使用下表8中所闡述之C3 RNAi藥物物質：
表 8.C3 RNAi藥物物質
有義股及反義股(有義股及反義股黏接形成雙螺旋體)：
有義股(經修飾之序列) (5' →3')： (NAG37)s(invAb)sacccuacuCfUfGfuuguucgaaas(invAb) (SEQ ID NO:14)
反義股(經修飾之序列) (5' →3')：                         usUfsusCfgAfacaacAfgAfgUfaGfGfgsu (SEQ ID NO:13)
表 8.1表8中所描述之C3 RNAi藥物物質之特性
化學式： C 493H 611F 11Na 43N 164O 311P 43S 7(Na +形式)
C 493H 654F 11N 164O 311P 43S 7(H +形式)
分子量： 16563.98 (Na +形式)
15618.77 (H +形式)
物理外觀： 白色至灰白色散劑
溶解度 可溶於水及調配物緩衝液(0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉)中
在一些實施例中，C3 RNAi藥物物質係以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。在一些實施例中，形式為鈉鹽。
在一些實施例中，如表8中所提供之C3 RNAi藥物物質係與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑一起調配以形成適合於向人類受試者投與之醫藥組合物。在一些實施例中，表8中所描述之C3 RNAi藥物物質係以200 mg/mL (游離酸/無鹽基礎)在水性磷酸鈉緩衝液(0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉)中調配，該C3 RNAi藥物物質適用於在人類中皮下投與。 治療方法及表現抑制
本文所揭示之C3 RNAi藥劑可用於治療患有疾病或病症之受試者(例如人類或其他哺乳動物)，該疾病或病症將得益於RNAi藥劑之投與。在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑可用於治療將得益於C3 mRNA表現及/或C3蛋白含量之降低及/或抑制的受試者(例如人類)，例如已經診斷患有或正患有與IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症相關之症狀的受試者。
在一些實施例中，向受試者投與治療有效量之任何一或多種C3 RNAi藥劑。受試者之治療可包括治療性及/或預防性治療。向受試者投與治療有效量之本文所描述之任何一或多種C3 RNAi藥劑。受試者可為成人、青年、兒童或嬰兒。本文所描述之醫藥組合物可向人類或動物投與。
本文所描述之C3 RNAi藥劑可用於治療患有C3相關疾病或病症之受試者中之至少一種疾病之症狀或表現，該C3相關疾病或病症諸如係至少部分由失調的補體活性、失調的C3活性或C3基因表現介導之疾病或病症。在一些實施例中，C3 RNAi藥劑係用於治療或控制患有疾病或病症之受試者的臨床表現，該疾病或病症將至少部分藉由C3 mRNA或C3蛋白含量降低而受益。向受試者投與治療有效量之本文所描述之一或多種C3 RNAi藥劑或含C3 RNAi藥劑之組合物。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含向所治療之受試者投與包含本文所描述之C3 RNAi藥劑的組合物。在一些實施例中，向受試者投與預防有效量之任何一或多種所描述之C3 RNAi藥劑，從而藉由預防或抑制至少一種疾病之症狀或表現來治療受試者。
在某些實施例中，本發明提供用於治療有需要之患者中之至少部分由C3基因表現、補體級聯失調或失調的補體活性介導之疾病、病症、病狀或病理狀態的方法，其中該等方法包括向患者投與本文所描述之任何C3 RNAi藥劑。
在一些實施例中，相對於在投與C3 RNAi藥劑之前的受試者或未接受C3 RNAi藥劑之受試者，投與所描述之C3 RNAi藥劑的受試者中之C3基因之基因表現量及/或mRNA含量減少至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在受試者之細胞、細胞組及/或組織中，受試者中之C3 mRNA含量可能減少。在一些實施例中，相對於在投與C3 RNAi藥劑之前的受試者或未接受C3 RNAi藥劑之受試者，C3基因表現在肝細胞中抑制至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或大於65%。
在一些實施例中，相對於在投與C3 RNAi藥劑之前的受試者或未接受C3 RNAi藥劑之受試者，已投與所描述之C3 RNAi藥劑的受試者中之C3蛋白含量減少至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在受試者之細胞、細胞組、組織、血液及/或其他體液中，受試者中之蛋白質含量可能減少。
C3 mRNA含量及C3蛋白含量之降低可藉由此項技術中已知之任何方法來評估。如本文所使用，C3 mRNA含量及/或蛋白質含量之降低或減少在本文中統稱為C3之降低或減少或C3之基因表現之抑制或降低。本文所闡述之實例說明用於評估C3基因表現之抑制的已知方法。一般熟習此項技術者將進一步知曉用於評估活體內及/或活體外C3基因表現之抑制的適合之方法。
在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或預防性治療)由IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症所引起之疾病、病症或症狀的方法，其中該等方法包括向有需要之受試者投與治療有效量之C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括與具有表1中之序列的C3 mRNA之部分至少部分互補的反義股。在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或預防性治療)由補體介導之腎病(CMRD)所引起之疾病、病症或症狀的方法，其中該等方法包括向有需要之受試者投與治療有效量之C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括與具有表1中之序列的C3 mRNA之部分至少部分互補的反義股。在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或預防性治療)由IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症所引起之疾病或症狀的方法，其中該等方法包括向有需要之受試者投與治療有效量之C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括反義股及有義股，該反義股包含表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的序列，且該有義股包含與反義股至少部分互補的表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列。在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或預防性治療)由IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症所引起之疾病或症狀的方法，其中該等方法包括向有需要之受試者投與治療有效量之C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括有義股及反義股，該有義股包含表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列，且該反義股包含與有義股至少部分互補的表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的序列。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中C3基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投與C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括與具有表1中之序列的C3 mRNA之部分至少部分互補的反義股。在一些實施例中，本文揭示抑制細胞中C3基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投與C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括反義股及有義股，該反義股包含表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的序列，且該有義股包含與反義股至少部分互補的表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列。在一些實施例中，本文揭示抑制細胞中C3基因表現之方法，其中該等方法包括投與C3 RNAi藥劑，該C3 RNAi藥劑包括有義股及反義股，該有義股包含表2、表4、表5C、表7B或表8中之任一序列，且該反義股包括與有義股至少部分互補的表2、表3、表5C、表7A或表8中之任一序列的序列。
C3 RNAi藥劑之用途提供用於治療性(包括預防性)治療與補體失調相關之疾病/病症的方法，該等疾病/病症包括(但不限於)IgA腎病變、C3腎絲球病變、陣發性夜間血紅素尿症及/或C3基因表現升高。所描述之C3 RNAi藥劑介導RNA干擾以抑制產生C3蛋白所需的一或多種基因之表現。C3 RNAi藥劑亦可用於治療或預防各種疾病、病症或病狀，包括IgA腎病變、C3腎絲球病變及/或陣發性夜間血紅素尿症。此外，描述用於活體內將C3 RNAi藥劑遞送至肝臟細胞，且尤其遞送至肝細胞的組合物。 細胞、組織、器官及非人類生物體
涵蓋包括至少一種本文所描述之C3 RNAi藥劑的細胞、組織、器官及非人類生物體。細胞、組織、器官或非人類生物體係藉由將RNAi藥劑遞送至細胞、組織、器官或非人類生物體而製得。 實施例
以下非限制性實施例說明本文所描述之發明。
實施例 1.一種用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑，其包含： 反義股，其中該反義股之核苷酸1-21包含表2、表3、表5C、表7A或表8之反義股序列之核苷酸1-21；及 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列， 其中該反義股及/或該有義股之所有或實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且該RNAi藥劑連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。
實施例 2.一種用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑，其中有義股包含至少15個連續核苷酸與表2、表4、表5C、表7B或表8之有義股序列中任一者的15個連續核苷酸相差0或1個核苷酸之核苷酸序列，且其中該有義股具有一個至少15個連續核苷酸與反義股至少85%互補的區域。
實施例 3.如實施例1至2中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑之至少一個核苷酸包括經修飾之核苷間鍵聯。
實施例 4.如實施例1至3中任一項之RNAi藥劑，其中該等經修飾之核苷酸係獨立地選自由以下組成之群：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2',3'-開環核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2'-F-阿糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2'-O-甲基核苷酸、反向2'-去氧核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-烷基修飾之核苷酸、𠰌啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸及3'-O-甲基核苷酸。
實施例 5.如實施例4之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有該等經修飾之核苷酸為2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸或其組合。
實施例 6.如實施例1至5中任一項之RNAi藥劑，其中該反義股由以下組成或基本上由以下組成：表3、表5C、表7A或表8之經修飾之反義股序列中之任一者的核苷酸序列。
實施例 7.如實施例1至6中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：表4、表5C、表7B或表8之經修飾之有義股序列中之任一者的核苷酸序列。
實施例 8.如實施例1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3、表5C、表7A或表8之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列，且該有義股包含表4、表5C、表7B或表8之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列。
實施例 9.如實施例1至8中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含： 。
實施例 10.如實施例1至9中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接至該有義股。
實施例 11.如實施例10之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接至該有義股之5'末端。
實施例 12.如實施例1至11中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股之長度為15至30個核苷酸，且該反義股之長度為21至30個核苷酸。
實施例 13.如實施例12之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21至27個核苷酸。
實施例 14.如實施例13之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21至24個核苷酸。
實施例 15.如實施例14之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21個核苷酸。
實施例 16.如實施例1至15中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑具有兩個鈍端。
實施例 17.如實施例1至16中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個端帽。
實施例 18.如實施例1至17中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個反向無鹼基殘基。
實施例 19.如實施例1之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑包含有義股及反義股，該有義股及該反義股形成表5A、表5B、表5C或表8中所闡述之雙螺旋體中之任一者的雙螺旋體序列。
實施例 20.如實施例1至19中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為醫藥學上可接受之鹽。
實施例 21.如實施例20之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為鈉鹽。
實施例 22.一種包含如實施例1至21中任一項之RNAi藥劑的組合物，其中該組合物包含醫藥學上可接受之賦形劑。
實施例 23.如實施例22之組合物，其中該醫藥學上可接受之賦形劑為磷酸鈉緩衝液。
實施例 24.如實施例22之組合物，其中該醫藥學上可接受之賦形劑為等張生理鹽水或注射用水。
實施例 25.一種用於抑制肝細胞中C3基因之表現之方法，該方法包含向該細胞中引入有效量之如實施例1至21中任一項之RNAi藥劑或如實施例22至24中任一項之組合物。
實施例 26.如實施例25之方法，其中在該肝細胞中C3 mRNA減少至少約50%。
實施例 27.如實施例25至26中任一項之方法，其中在該肝細胞中C3蛋白減少至少約50%。
實施例 28.一種用於抑制受試者中C3基因表現之方法，該方法包含向該受試者投與有效量之如實施例1至21中任一項之RNAi藥劑或如實施例22至24中任一項之組合物。
實施例 29 .如實施例28之方法，其中該受試者為人類受試者。
實施例 30.如實施例28或29之方法，其中在該受試者中C3 mRNA減少至少約50%。
實施例 31.如實施例28至30中任一項之方法，其中在該受試者中C3蛋白減少至少約50%。
實施例 32.一種治療C3相關疾病、病症、症狀或其他疾病表現之方法，該方法包含向有需要之人類受試者投與治療有效量之如實施例22至24中任一項之組合物。
實施例 33.如實施例32之方法，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)、C3腎絲球病變(C3G)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)、自體免疫溶血性貧血/冷凝集素病(AIHA/CAD)及/或另一類型之補體介導之腎病。
實施例 34.如實施例25至33中任一項之方法，其中在該受試者中血清C3蛋白之含量降低。
實施例 35.如實施例25至34中任一項之方法，其中在該受試者中替代補體路徑溶血性活性(AH50)減少至少約50%。
實施例 36.如實施例35之方法，其中該AH50減少至少大約75%。
實施例 37.如實施例36之方法，其中該AH50減少大約90%或更多。
實施例 38 .如實施例25至37中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以每kg人類受試者之體重約0.05 mg至約5.0 mg之劑量向該人類受試者投與。
實施例 39.如實施例25至37中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以約25 mg、約50 mg、約100 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg之劑量向人類受試者投與。
實施例 40.如實施例39之方法，其中該RNAi藥劑係以約100 mg、約200 mg或約400 mg之劑量向人類受試者投與。
實施例 41.如實施例1至21中任一項之RNAi藥劑或如實施例22至24中任一項之組合物，其係用於治療至少部分由失調的補體活性、失調的C3活性或C3基因表現介導之疾病、病症或症狀。
實施例 42.如實施例41之RNAi藥劑或組合物，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)、C3腎絲球病變(C3G)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)、自體免疫溶血性貧血/冷凝集素病(AIHA/CAD)及/或另一類型之補體介導之腎病。
實施例 43.如實施例1至21中任一項之RNAi藥劑或如實施例22至24中任一項之組合物，其係用於製備用於治療至少部分由失調的補體活性、失調的C3活性或C3基因表現介導之疾病、病症或症狀的醫藥組合物。
實施例 44.如實施例41至43中任一項之RNAi藥劑或組合物，其中該RNAi藥劑係以每kg人類受試者之體重約0.05 mg至約5.0 mg之劑量向該人類受試者投與。
實施例 1a.一種治療有需要之人類受試者中之C3相關疾病、病症或症狀的方法，該方法包含向該人類受試者投與包含治療有效量之用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑的醫藥組合物，其中該RNAi藥劑包含反義股及有義股，其中該反義股包含核苷酸序列(5'à3') UUUCGAACAACAGAGUAGGGU (SEQ ID NO: 3)，且其中該有義股包含核苷酸序列(5'à3') ACCCUACUCUGUUGUUCGAAA (SEQ ID NO: 8)，其中該有義股及該反義股之所有或實質上所有經修飾之核苷酸為2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸或其組合，且其中該RNAi藥劑連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。
實施例 2a.一種治療有需要之人類受試者中之C3相關疾病、病症或症狀的方法，該方法包含向該人類受試者投與包含治療有效量之用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑的醫藥組合物，其中該RNAi藥劑包含反義股及有義股，其中該反義股包含核苷酸序列(5'à3') usUfsusCfgAfacaacAfgAfgUfaGfGfgsu (SEQ ID NO: 13)，且該有義股包含核苷酸序列(5'à3') (NAG37)s(invAb)sacccuacuCfUfGfuuguucgaaas(invAb) (SEQ ID NO: 14)，其中a為2'-O-甲基腺苷；c為2'-O-甲基胞苷；g為2'-O-甲基鳥苷；u為2'-O-甲基尿苷；Af為2'-氟腺苷，Cf為2'-氟胞苷；Gf為2'-氟鳥苷；Uf為2'-氟腺苷；s為硫代磷酸酯鍵聯；(invAb)為反向無鹼基去氧核糖殘基；且(NAG37)s包含以下化學結構： 。
實施例 3a.如實施例2a之方法，其中該RNAi藥劑為醫藥學上可接受之鹽。
實施例 4a.如實施例2a之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為鈉鹽。
實施例 5a.如實施例2a之方法，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)、C3腎絲球病變(C3G)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)、自體免疫溶血性貧血/冷凝集素病(AIHA/CAD)及/或另一類型之補體介導之腎病。
實施例 6a.如實施例5a之方法，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)或C3腎絲球病變(C3G)。
實施例 7a.如實施例2a之方法，其中該醫藥組合物包含磷酸鈉緩衝液。
實施例 8a.如實施例2a之方法，其中該醫藥組合物包含等張生理鹽水。
實施例 9a.如實施例2a之方法，其中該醫藥組合物包含注射用水。
實施例 10a .如實施例2a之方法，其中該RNAi藥劑係以每kg人類受試者之體重約0.05 mg至約5.0 mg之劑量向該人類受試者投與。
實施例 11a.如實施例2a之方法，其中該RNAi藥劑係以約25 mg、約50 mg、約100 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg之劑量向人類受試者投與。
實施例 12a.如實施例10a之方法，其中該RNAi藥劑係以約100 mg、約200 mg或約400 mg之劑量向人類受試者投與。
實施例 13a.如實施例2a之方法，其中在該受試者中血清C3蛋白之含量降低。
實施例 14a.如實施例2a之方法，其中在該受試者中替代補體路徑溶血性活性(AH50)減少至少約50%。
實施例 15a.如實施例13a之方法，其中該AH50減少大約90%或更多。
實施例 16a.如實施例6a之方法，其中該RNAi藥劑係以200 mg/mL在水性磷酸鈉緩衝液中調配，其中該水性磷酸鈉緩衝液具有濃度為約0.5 mM之磷酸二氫鈉及濃度為0.5 mM之磷酸氫二鈉。
實施例 17a.如實施例11a之方法，其中該RNAi藥劑係以每十二週不超過一次之頻率向該人類受試者投與。
實施例 18a.如實施例11a之方法，其中該RNAi藥劑係以一年內不超過四次之頻率向該人類受試者投與。
上文所提供之實施例及項目現藉由以下非限制性實例說明。 實例 實例 1. 合成 C3 RNAi 藥劑 .
根據以下通用程序合成上文表5A、表5B、表5C及表8中所展示之C3 RNAi藥劑雙螺旋體： A. 合成 .
根據寡核苷酸合成中使用之固相上的胺基亞磷酸酯技術合成RNAi藥劑之有義及反義股。此類標準合成一般為此項技術中已知的。視規模而定，使用MerMade96E® (Bioautomation)、MerMade12® (Bioautomation)或OP Pilot 100 (GE Healthcare)。 對由受控微孔玻璃(CPG，500 Å或600 Å，獲自Prime Synthesis, Aston, PA, USA)製成之固體支撐物進行合成。將位於各別股之3'端處的單體連接至固體支撐物作為合成起點。所有2'-經修飾之RNA胺基亞磷酸酯均購自Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA)或Hongene Biotech (Shanghai, PRC)。2'-O-甲基胺基亞磷酸酯包括以下：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N 6-(苯甲醯基)-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N 4-(乙醯基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基-胺基)胺基亞磷酸酯、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N 2-(異丁醯基)-2'-O-甲基-鳥苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯及5'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯。2'-去氧-2'-氟-胺基亞磷酸酯帶有與2'-O-甲基胺基酸酯相同之保護基。5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-開環-尿苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯亦購自Thermo Fisher Scientific或Hongene Biotech。5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-肌苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯購自Glen Research (Virginia)或Hongene Biotech。根據國際專利申請公開案第WO 2017/214112號合成膦酸環丙酯胺基亞磷酸酯( 亦參見Altenhofer等人, Chem. Communications (Royal Soc. Chem.), 57(55):6808-6811 (2021年7月))。反向無鹼基(3'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-去氧核糖-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯購自ChemGenes (Wilmington, MA, USA)或SAFC (St Louis, MO, USA)。5'-O-二甲氧基三苯甲基-N 2,N 6-(苯氧基乙酸酯)-2'-O-甲基-二胺基嘌呤-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)胺基亞磷酸酯獲自ChemGenes或Hongene Biotech。
將含靶向配位體之胺基亞磷酸酯溶解於無水二氯甲烷或無水乙腈(50 mM)中，同時將所有其他胺基酸酯溶解於無水乙腈(50 mM)中，或添加無水二甲基甲醯胺及分子篩(3Å)。使用5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT，250 mM於乙腈中)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT，250 mM於乙腈中)作為活化劑溶液。偶合時間為12分鐘(RNA)、15分鐘(靶向配位體)、90秒(2'OMe)及60秒(2'F)。為了引入硫代磷酸酯鍵聯，使用100 mM 3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，獲自PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA)於無水乙腈中之溶液。以下實例中合成且測試之C3 RNAi藥劑雙螺旋體中之各者使用N-乙醯基-半乳胺糖作為表6中所表示之靶向配位體化學結構中之「NAG」。可根據Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2018/044350號合成(NAG37)及(NAG37)s靶向配位體胺基亞磷酸酯化合物。 B. 支撐物結合之寡聚物的裂解及脫除保護 .
在完成固相合成之後，在30℃下用40 wt.%甲胺水溶液與28%氫氧化銨溶液(Aldrich)之1:1體積溶液處理經乾燥之固體支撐物1.5小時。蒸發溶液且將固體殘餘物在水中復原(參見下文)。 C. 純化 .
使用TSKgel SuperQ-5PW 13 µm管柱及Shimadzu LC-8系統，藉由陰離子交換HPLC純化粗寡聚物。緩衝液A為20 mM Tris、5 mM EDTA，pH 9.0且含有20%乙腈；且緩衝液B與緩衝液A相同，其中添加有1.5 M氯化鈉。在260 nm下記錄UV跡線。合併適當溶離份，接著用經過濾之去離子水或100 mM碳酸氫銨，pH 6.7及20%乙腈之操作緩衝液，使用封裝有Sephadex G-25細粒之GE Healthcare XK 26/40管柱在尺寸排阻HPLC上操作。 D. 退火 .
藉由在1×磷酸鹽緩衝生理鹽水(Corning，Cellgro)中組合等莫耳RNA溶液(有義及反義)來混合互補股，以形成RNAi藥劑。將一些RNAi藥劑凍乾且儲存於-15℃至-25℃下。藉由在1×磷酸鹽緩衝生理食鹽水中，在UV-Vis光譜儀上量測溶液吸光度來測定雙螺旋體濃度。隨後將260 nm下之溶液吸光度乘以換算因數及稀釋因數以測定雙螺旋體濃度。所使用之換算因數為0.050 mg/(mL∙cm)或由以實驗方式測定之消光係數計算。 實例 2. 石蟹獼猴中 C3 RNAi 藥劑之活體內測試 .
在石蟹獼猴(cynos)中評估C3 RNAi藥劑AD09546。在第1天及第29天，對各組(n=3)之三隻雄性cynos投與0.3 mL/kg (大約1.5 mL體積，視動物質量而定)之皮下注射，該皮下注射含有以等張生理鹽水調配之0.5 mg/kg (mpk)、1.5 mg/kg或4.5 mg/kg C3 RNAi藥劑。 表 9.實例2之靶向位置及給藥組
組 靶向基因位置 ( 在 SEQ ID NO: 1 內 ) RNAi 藥劑及劑量 給藥方案 ( 在第 1 天及第 29 天 )
1 2566 0.5 mg/kg AD09546 兩次皮下注射
2 2566 1.5 mg/kg AD09546 兩次皮下注射
3 2566 4.5 mg/kg AD09546 兩次皮下注射
C3 RNAi藥劑包括在有義股之5'末端處結合至靶向配位體的經修飾之核苷酸，該靶向配位體包括具有如本文雙螺旋體結構中所闡述之經修飾之序列的三個N-乙醯基-半乳胺糖基團(三齒配位體)。(關於與C3 RNAi藥劑相關之特定修飾及結構資訊參見表3、表4、表5A、表5B、表5C、表6、表7A、表7B及表8，包括(NAG37)s配位體)。C3 RNAi藥劑包括經設計以抑制人類C3基因在位置2566處之表現的核苷酸序列。(參見例如SEQ ID NO: 1)。
在第-7天(給藥前)，第1天(給藥前)、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天、第57天、第64天、第71天、第78天及第85天收集血清。圖1展示相對於給藥前經標準化之血清石蟹獼猴C3蛋白含量，其中各血清收集日期按週量測(例如在圖1中，第0週為第1天，第4週為第29天，且第12週為第85天)。
另外，評估溶血活性。溶血活性對補體系統之關鍵組分的減少、不存在及/或失活敏感。如所指出，存在三種補體活化之路徑：替代路徑、經典路徑及凝集素路徑。由於補體系統之所有三種活化路徑需要C3之參與才能在活體內引起組織損傷(參見例如Thurman, J. & Holers, V.M., J. Immunol. 2006年2月1日, 176(3) 1305-1310)，因此量測補體之替代路徑(AP)之活化以評估C3減弱對補體系統之影響。AP僅需要Mg 2+離子，而經典路徑及凝集素路徑需要Ca 2+及Mg 2+。此差異用於在經典路徑蛋白及凝集素路徑蛋白存在下僅分析AP。已知兔紅血球在大部分哺乳動物物種中會自發活化AP，因此將該等兔紅血球用於進行該分析。
為進行溶血活性分析，首先將10 µL石蟹獼猴血清稀釋於10 µL GVB緩衝液(目錄號B103，Complement Technology, Inc)中，且隨後用另一50 µL相同緩衝液進一步稀釋。向該經稀釋之石蟹獼猴血清中添加5 µL 0.1 M MgEGTA (目錄號B106，Complement Technology, Inc)及25 µL兔紅血球(目錄號B302，Complement Technology, Inc)。因此，混合物使用各所收集之血清樣品之10×稀釋液(最終血清濃度之10%；在此步驟總體積為100 µL，1.25×10 7個兔紅血球)。在37℃下與血清一起培育15分鐘之後評估兔紅血球之溶解。在反應結束時，添加100 µL冷GVBE (目錄號B104，Complement Technology, Inc)以停止反應(最終體積=200 µL)。最大溶解係藉由用2%吐溫20 (Tween 20)在37℃下培育60分鐘之情況下完全溶解之相同數目的兔紅血球來測定。將各反應之上清液轉移至新ELISA盤且在412 nm下讀取。使用以下方程式測定溶血活性：(讀數背景)/(最大溶血讀數背景)×100%。圖2展示給藥前溶血活性(AP)至第8週(第57天)之百分比。對於各個別動物，在此研究中自所有時間點所收集之樣品之剩餘溶血活性的百分比藉由同一對應動物之第-7天及第1天之平均溶血含量進行標準化。
如圖1及圖2中所展示，獲得大約84.3%之最大血清C3減少與溶血性活性降低有關。此外，可見效果持續時間較長，證實每三個月或每六個月投與AD09546可為可能的。
另外，對所收集之血清樣品進行C3a之評估。補體C3a係由75個胺基酸殘基構成且在補體系統活化時自補體C3釋放以刺激免疫系統(Yoshikawa, Handbook of Biologically Active Peptides, 第二版, 2013, 第214章: 1570-1576)。因此，血清C3a含量為補體C3相關活性之指標。使用BD OptEIA人類C3a ELISA套組(目錄號：550499，BD Biosciences)經由ELISA定量血清C3a含量。遵循BD Biosciences提供之標準分析程序。對於樣品稀釋液，製備500×及2000×稀釋液。
圖5展示隨時間推移之絕對C3a含量。圖6展示相對C3a含量占給藥前C3a含量之百分比。如圖6中所展示，在注射4.5 mg/kg RNAi藥劑AD09546後7週時獲得大約85%之最大血清C3a減少與C3相關活性有關。 實例 3. C3 RNAi 藥物物質在健康人類志願者及成人受試者 IgA 腎病變 (IgAN) 及 C3 腎絲球病變 (C3G) 中之 I/IIa 期臨床試驗 .
啟動了一項1/2a期、單次遞增劑量及多次遞增劑量研究以評估表8中所描述之在磷酸鈉緩衝液中調配之C3 RNAi藥物物質在成人健康志願者中以及在患有IgA腎病變(IgAN)及C3腎絲球病變(C3G)之受試者中之安全性、耐受性、藥物動力學及藥效學作用。表8中所描述之C3 RNAi藥物物質係以200 mg/mL在水性磷酸鈉緩衝液(0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉)中調配(「經調配之C3 RNAi藥物物質」)。圖3展示成人健康志願者群組之初步臨床試驗設計，且圖4展示患有C3G及IgAN之成人受試者之初步臨床試驗設計。如圖7、圖8、圖9及圖10中所展示修正臨床試驗設計。在向任何患者給藥之前，確定此時不包括患有陣發性夜間血紅素尿症(PNH)之患者。
五個單次遞增劑量(SAD)群組各入選6名正常健康志願者(NHV)受試者(隨機2:1藥物:安慰劑)以便以25 mg、50 mg、100 mg、200 mg或400 mg之劑量接受經調配之C3 RNAi藥物物質或安慰劑(亦即，在各群組中，4名受試者接受C3 RNAi藥物物質及2名受試者接受安慰劑)。在多次遞增劑量(MAD)群組中進一步檢查兩個劑量水平(200 mg及400 mg)，各群組中入選6名NHV受試者(隨機2:1藥物:安慰劑)以在第1天及第29天接受經調配之C3 RNAi藥物物質或安慰劑。
在NHV中，認為經調配之C3 RNAi藥物物質具有一般良好的耐受性，其中未發生藥物相關嚴重不良事件(SAE)，在任何臨床實驗室參數中未報導由於不良事件(AE)引起之研究中斷、臨床上顯著之實驗室發現及不良變化之模式。
藉由濁度測定法量測血清樣品中之總C3蛋白含量。已知量之抗C3抗體包括於分析基質中，且隨後藉由使用Beckman Immage 800免疫化學系統量測懸浮於溶液中之粒子因在抗原-抗體反應期間形成之複合物而導致的光散射增加速率，從而測定C3。
亦藉由使用典型的溶血性分析對替代補體路徑溶血性活性(AH50)進行評估，該典型的溶血性分析係基於細胞表面上之補體之活化引起的兔紅血球(RA)溶解。藉由添加限制量之測試樣品測定各組分之AH50 (50%補體溶血性劑量)。將測試樣品之連續稀釋液與等體積之RA混合。量測當標靶細胞藉由補體之作用溶解時釋放的血紅素之量，且由此計算已溶解之細胞的百分比。在此實例中所使用細胞濃度之情況下，所使用之最敏感波長為415 nm，即血紅素光譜之主峰。對於各分析，用五點經標準化及五點經表徵之QC對照物來檢驗運作。
另外，C3之減少亦可與補體活性之替代路徑(AP)受損相關，且藉由Wieslab ®AP分析量測。Wieslab ®AP分析為偵測補體攻膜複合物(MAC)之基於ELISA之分析，其為補體級聯之最終步驟之具有免疫性的細胞溶解效應物。由於盤塗佈有替代路徑之特定活化劑，因此市售套組(COMPLAP330RUO，SVAR Life Sciences, Sweden)為替代路徑特定的。根據製造商之方案，使用陰性及陽性對照樣品計算本文所描述之結果。
NHV中初步資料顯示所有SAD群組中C3血清蛋白含量一致減少，其中在400 mg群組中在第29天實現平均減少80.7%持續至第16週(參見例如圖11)。亦評估AH50，400 mg群組顯示AH50平均減少高達68.8% (參見圖13)。亦評估Wieslab ®AP，其顯示400 mg組平均減少大約85%至90%，持續至第16週(參見圖15)。
在NHV MAD群組中，在最後一次給藥之後4週，在200 mg及400 mg下分別實現平均C3減少79.5%及87.8% (參見例如圖12)。此與AH50平均減少67%及91.3%相關，且在4名受試者中之3名中，在400 mg群組中觀測到AH50減少超過95%。在任何單個受試者中，血清C3蛋白含量之最大減少為在200 mg群組中之受試者中大約86%減少及在400 mg群組中之受試者中大約92%減少。亦在MAD群組中評估Wieslab ®AP，且在第8週時，200 mg群組顯示大約87.2%平均減少且400 mg群組在第8週時顯示大約99%平均減少(參見圖15)。鑒於所觀測到的抑制作用之持續時間延長，每季或甚至可能更低頻繁給藥(尤其在400 mg劑量下)似乎係合理的。
此等資料表示在具有任何C3基因表現抑制劑之人類受試者中首次報導之臨床資料，且更特定言之，為有史以來首次在人類中報導之藉由C3基因表現抑制來顯示替代路徑之臨床抑制的資料。 其他實施例
應理解，雖然本發明已結合其詳細描述來進行描述，但前述描述意欲說明且不限制本發明之範疇，本發明之範疇由所附申請專利範圍之範疇界定。其他態樣、優點及修改在以下申請專利範圍之範疇內。
圖 1.展示依照實例2中所描述之研究，相對於給藥前經標準化之血清石蟹獼猴(cynomolgus monkey) C3蛋白含量的圖。
圖 2.展示依照實例2中所描述之研究，石蟹獼猴中給藥前溶血活性之百分比的圖。
圖 3.實例3中所描述之I/II期臨床研究之正常健康志願者部分(第1部分)的初步臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 4.實例3中所描述之I/II期臨床研究之患者群組(第2部分)的初步臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 5.展示依照實例2中所描述之研究，絕對血清石蟹獼猴C3a蛋白含量的圖。
圖 6.展示依照實例2中所描述之研究，石蟹獼猴中給藥前C3a蛋白含量之百分比的圖。
圖 7.實例3中所描述之I/II期臨床研究之單次遞增劑量(SAD)正常健康志願者(NHV)部分(第1部分)的更新臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 8.實例3中所描述之I/II期臨床研究之多次遞增劑量(MAD) NHV部分(第1部分)的更新臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 9.實例3中所描述之I/II期臨床研究之PNH患者群組(第2部分)的更新臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 10.實例3中所描述之I/II期臨床研究(第2部分)之C3G及IgAN患者群組(第2部分)的更新臨床試驗研究設計及劑量遞增計劃。「ARO-C3」係指經調配之C3 RNAi藥物物質。
圖 11.展示在正常人類志願者(NHV)中，來自實例3中所描述之I/II期臨床研究之單次遞增劑量(SAD)部分的受試者中之血清人類C3蛋白含量的圖。
圖 12.展示在正常人類志願者(NHV)中，來自實例3中所描述之I/II期臨床研究之多次遞增劑量(MAD)部分的受試者中之血清人類C3蛋白含量的圖。
圖 13.展示在正常人類志願者(NHV)中，來自實例3中所描述之I/II期臨床研究之多次遞增劑量(MAD)部分的在第1天及第29天接受400 mg經調配之C3 RNAi藥物物質或安慰劑之個別受試者中之AH50 (U/mL)的圖。
圖 14.展示在正常人類志願者(NHV)中，實例3中所描述之I/II期臨床研究之單次遞增劑量(SAD)部分之Wieslab® AP分析結果的圖。根據製造商之方案，使用陰性及陽性對照樣品計算結果。
圖 15.展示在正常人類志願者(NHV)中，實例3中所描述之I/II期臨床研究之多次遞增劑量(MAD)部分之Wieslab® AP分析結果的圖。根據製造商之方案，使用陰性及陽性對照樣品計算結果。
圖 16A 至圖 16D.以游離酸形式展示之C3 RNAi藥物物質之化學結構(參見例如表8；RNAi藥劑AD09546 (SEQ ID NO: 14/13))。
圖 17A 至圖 17D.以鈉鹽形式展示之C3 RNAi藥物物質之化學結構(參見例如表8；RNAi藥劑AD09546 (SEQ ID NO: 14/13))。
圖 18.具有AD09546結構之C3 RNAi藥劑之經修飾之有義股及反義股(參見例如表3、表4A及表5C)的示意圖，該AD09546結構在有義股之5'末端處具有三齒N-乙醯基-半乳胺糖靶向基團。以下縮寫用於圖16中：a、c、g及u為經2'-O-甲基修飾之核苷酸；Af、Cf、Gf及Uf為經2'-氟修飾之核苷酸；o為磷酸二酯鍵聯；s為硫代磷酸酯鍵聯；invAb為反向無鹼基殘基(參見例如表6)，且NAG37s為具有以下化學結構之三齒N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體： (以鈉鹽形式展示)， (以游離酸形式展示)。
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Claims (44)

  1. 一種用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑，其包含： 反義股，其中該反義股之核苷酸1-21包含表2、表3、表5C、表7A或表8之反義股序列之核苷酸1-21；及 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列， 其中該反義股及/或該有義股之所有或實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且該RNAi藥劑連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。
  2. 一種用於抑制C3基因表現之RNAi藥劑，其中有義股包含至少15個連續核苷酸與表2、表4、表5C、表7B或表8之有義股序列中任一者的15個連續核苷酸相差0或1個核苷酸之核苷酸序列，且其中該有義股具有一個至少15個連續核苷酸與該反義股至少85%互補的區域。
  3. 如請求項1至2中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑之至少一個核苷酸包括經修飾之核苷間鍵聯。
  4. 如請求項1至3中任一項之RNAi藥劑，其中該等經修飾之核苷酸係獨立地選自由以下組成之群：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2',3'-開環(seco)核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2'-F-阿糖(arabino)核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2'-O-甲基核苷酸、反向2'-去氧核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-烷基修飾之核苷酸、𠰌啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸，及3'-O-甲基核苷酸。
  5. 如請求項4之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有該等經修飾之核苷酸為2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸，或其組合。
  6. 如請求項1至5中任一項之RNAi藥劑，其中該反義股由以下組成或基本上由以下組成：表3、表5C、表7A或表8之經修飾之反義股序列中任一者的核苷酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股由以下組成、基本上由以下組成，或包含以下：表4、表5C、表7B或表8之經修飾之有義股序列中任一者的核苷酸序列。
  8. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3、表5C、表7A或表8之經修飾之序列中任一者的核苷酸序列，且該有義股包含表4、表5C、表7B或表8之經修飾之序列中任一者的核苷酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含： ，或 。
  10. 如請求項1至9中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接至該有義股。
  11. 如請求項10之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接至該有義股之5'末端。
  12. 如請求項1至11中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股之長度為15至30個核苷酸，且該反義股之長度為21至30個核苷酸。
  13. 如請求項12之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21至27個核苷酸。
  14. 如請求項13之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21至24個核苷酸。
  15. 如請求項14之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21個核苷酸。
  16. 如請求項1至15中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑具有兩個鈍端。
  17. 如請求項1至16中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個端帽。
  18. 如請求項1至17中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個反向無鹼基殘基。
  19. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑包含有義股及反義股形成表5A、表5B、表5C或表8中所述之雙螺旋體中任一者的雙螺旋體序列。
  20. 如請求項1至19中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為醫藥學上可接受之鹽。
  21. 如請求項20之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為鈉鹽。
  22. 一種組合物，其包含如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑，其中該組合物包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  23. 如請求項22之組合物，其中該醫藥學上可接受之賦形劑為磷酸鈉緩衝液。
  24. 如請求項22之組合物，其中該醫藥學上可接受之賦形劑為等張鹽水或注射用水。
  25. 一種用於抑制肝細胞中C3基因表現之方法，該方法包含向該細胞中引入有效量之如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑或如請求項22至24中任一項之組合物。
  26. 如請求項25之方法，其中在該肝細胞中C3 mRNA減少至少約50%。
  27. 如請求項25至26中任一項之方法，其中在該肝細胞中C3蛋白減少至少約50%。
  28. 一種用於抑制個體中C3基因表現之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑或如請求項22至24中任一項之組合物。
  29. 如請求項28之方法，其中該個體為人類個體。
  30. 如請求項28或29之方法，其中在該個體中C3 mRNA減少至少約50%。
  31. 如請求項28至30中任一項之方法，其中在該個體中C3蛋白減少至少約50%。
  32. 一種治療C3相關疾病、病症、症狀或其他疾病表現之方法，該方法包含向有需要之人類個體投與治療有效量之如請求項22至24中任一項之組合物。
  33. 如請求項32之方法，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)、C3腎絲球病變(C3G)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)、自體免疫溶血性貧血/冷凝集素病(AIHA/CAD)，及/或另一類型之補體介導之腎病。
  34. 如請求項25至33中任一項之方法，其中在該個體中血清C3蛋白之含量降低。
  35. 如請求項25至34中任一項之方法，其中在該個體中替代補體路徑溶血活性(AH50)減少至少約50%。
  36. 如請求項35之方法，其中該AH50減少至少大約75%。
  37. 如請求項36之方法，其中該AH50減少大約90%或更多。
  38. 如請求項25至37中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以每kg人類個體之體重約0.05 mg至約5.0 mg之劑量投與該人類個體。
  39. 如請求項25至37中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以約25 mg、約50 mg、約100 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg之劑量投與人類個體。
  40. 如請求項39之方法，其中該RNAi藥劑係以約100 mg、約200 mg或約400 mg之劑量投與人類個體。
  41. 如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑或如請求項22至24中任一項之組合物，其係用於治療至少部分由補體活性失調、C3活性失調或C3基因表現介導之疾病、病症或症狀。
  42. 如請求項41之RNAi藥劑或組合物，其中該疾病為IgA腎病變(IgAN)、C3腎絲球病變(C3G)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡性腎炎、原發性膜性腎病變(PMN)、自體免疫溶血性貧血/冷凝集素病(AIHA/CAD)，及/或另一類型之補體介導之腎病。
  43. 如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑或如請求項22至24中任一項之組合物，其係用於製備用於治療至少部分由補體活性失調、C3活性失調或C3基因表現介導之疾病、病症或症狀的醫藥組合物。
  44. 如請求項41至43中任一項之RNAi藥劑或組合物，其中該RNAi藥劑係以每kg人類個體之體重約0.05 mg至約5.0 mg之劑量投與該人類個體。
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