TW202438106A - 一種含ｐｄ－１／ｐｖｒｉｇ／ｔｉｇｉｔ結合蛋白的醫藥組成物及其醫藥用途 - Google Patents

Abstract

本揭露涉及一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的醫藥組成物及其醫藥用途。具體地，本揭露涉及的醫藥組成物包含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白和緩衝劑。本揭露的醫藥組成物具有良好的生物活性和穩定性。

Description

一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的醫藥組成物及其醫藥用途

本申請要求2023年03月15日提交的中國專利申請202310250609.3的優先權。

本揭露涉及藥物製劑領域，具體涉及一種包含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的醫藥組成物，及其藥物用途。

免疫治療是癌症治療領域的熱點，以抗PD-1抗體為代表的免疫途徑治療藥物已經在臨床上體現出高有效性和高安全性。

PD-1(Programmed Cell death-1)屬CD28受體家族，是免疫抑制性受體(Riley等人2009，Immunol.Rev.29：114-25)。該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。PD-1是I型跨膜蛋白，與CTLA-4結構很相似，但PD-1缺失了與B7-1和B7-2結合的MYPPPY序列。PD-1主要表達在活化的B細胞、T細胞和骨髓細胞(Chen等人2013，Nat.Rev.Immunol.13：227-42)。

PD-1有兩種細胞表面的糖蛋白配體，分別是PD配體1(PD-L1，又名CD274，B7-H1)和PD配體2(PD-L2，又名B7-DC)。PD-L1和PD-L2均不與其它CD28受體家族成員結合。PD-L1廣泛表達於淋巴細胞(例如CD4⁺T細胞和CD8⁺ T細胞、巨噬細胞等)以及如外周組織、各種腫瘤細胞和病毒感染細胞等。PD-L2主要表達於活化的樹突狀細胞和巨噬細胞(Dong等人1999，Nat.Med.5：1365-9)。PD-1與其配體PD-L1或PD-L2結合後，會下調T細胞的功能，包括降低T細胞的活化、分化增殖和細胞因子的分泌等。

關於PVRIG(Poliovirus receptor-related Ig domain containing protein)又名CD112R，與TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)、CD96和CD226等同屬B7/CD28超家族，在免疫系統中起重要作用。當PVRIG的配體PVRL2(又名CD112)結合PVRIG時，會活化PVRIG胞內區的ITIM結構域，使PVRIG起到免疫抑制的作用。PVRIG主要表達在CD4⁺T細胞，CD8⁺T細胞和NK細胞的表面。PVRIG和其配體PVRL2在多種實體瘤中高表達，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌等。PVRIG在這些癌症中的表達與TIGIT和PD-1有高度相關性。與PD-1和TIGIT相似，PVRIG陽性的T細胞也會呈現Eomes陽性和Tbet陰性，表明PVRIG與T細胞的耗竭有關。因此，PVRIG可能代表了除了PD-1和TIGIT之外的有一個新的免疫檢查點，並起到冗餘(redundancy)的作用。體外細胞實驗和小鼠模型中顯示，對小鼠PVRIG的敲除或抑制，可以有效抑制癌症的生長，並與PD-1和TIGIT抑製劑發生協同作用。TIGIT在淋巴細胞上高度表達，包括浸潤不同類型癌症的癌症浸潤淋巴細胞(TIL)和Treg。已經證明TIGIT與其同源配體PVR(又名CD155)的結合藉由其細胞質ITIM結構域直接抑制NK細胞的細胞毒性。PVR也在癌症中廣泛表達， 表明TIGIT-PVR信號軸可能是癌症的主要免疫逃逸機制。抑制性受體TIGIT、PVRIG與激活型受體DNAM-1結合同樣的配體CD155與CD112，但抑制性受體的親和力更高(Y.Zhu等人2016，J Exp Med.213：167-176)。腫瘤患者體內分離的NK細胞DNAM-1表達下調，導致NK細胞更易受到TIGIT或PVRIG的抑制，阻斷TIGIT與PVRIG的結合，能夠激活NK細胞的細胞殺傷功能(L.Martinet等人2015，Cell Reports.11：85-97)。

雖然PD-1/PD-L1抗體是目前臨床最成功的免疫檢查點抑製劑單抗，但T細胞表面其他免疫檢查點的表達上調會限制其療效。TIGIT和PVRIG除了調控T細胞的功能，還調控NK細胞活性，提示與PD-1/PD-L1在NK細胞中的功能可能產生協同。文獻報導TIGIT與PVRIG的配體CD155與CD112在肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤中的高表達與PD-1/PD-L1治療不良預後顯著相關。如CD155表達高的患者對抗PD-1抗體響應差，而CD155表達低的患者對PD-1響應好(S.Whelan等人2019，Cancer Immunol Res.7：257-268；A.Lepletier等人2020，Clin Cancer Res.26：3671-3681)。

尚未有任何PVRIG抗體、抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物上市。Compugen公司的COM701是全球首個獲FDA批准進入臨床的抗PVRIG人源化抗體，目前處於I期臨床階段，用於治療癌症。Surface Oncology也有抗PVRIG抗體SRF-813在開發。抗TIGIT抗體有Genentech的tiragolumab、Ono Pharmaceutical與BMS合作開發的BMS-986207、默沙東的MK-7684、iTeos Therapeutics的EOS-884448、Arcus Biosciences的AB-154，均在臨床II期階段。

WO2023040945提供了新結構的抗PD-1抗體及相關的抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體，有望增強T細胞和NK細胞激活、克服PD-1/PD- L1耐藥、拓展應答患者人群，從而提高癌症免疫治療的效果。此外，抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體可同時結合同一細胞表面的多個免疫檢查點，潛在具有親和力效應(avidity effect)，因此有潛力在臨床提供比現有PD-1、TIGIT、PVRIG抗體藥物或其聯用更佳的療效。

抗體藥物其分子量大，結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。對於新的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，仍需要研製合適的醫藥組成物。

本揭露提供了一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的醫藥組成物，該組成物具有優異的穩定性。

本揭露提供了一種醫藥組成物，其包含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白和緩沖劑，其中該緩衝劑選自檸檬酸鹽緩衝劑、組胺酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-醋酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-醋酸緩衝劑。

在一些實施方案中，該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域 和特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域，能同時或分別特異性結合PD-1、PVRIG和TIGIT。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含或為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中的各抗原結合結構域選自Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)₂、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體或由其任意組合組成。在具體的實施方案中，特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域為Fab或F(ab’)₂。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為人源化的、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為重組抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含(至少一個)免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：

SEQ ID NO：2、8-10、11-29任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，

該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。

一些實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：

如SEQ ID NO：3、30、31所示。

一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：4、32-34、79任一所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：5、35、36任一所示。

一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、32、35所示。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域包含(至少一個)免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：

SEQ ID NO：38、46-50、74-75任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，。

一些具體實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：如SEQ ID NO：39、40、41所示。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：57、58和59所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：60、61和62所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含如：

SEQ ID NO：2、8-10、11-29任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域包含如：SEQ ID NO：38、46-50、74-75任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：63-65中任一所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：66或67所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：63所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：67所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列。

一些具體實施方案中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含全長重鏈(HC)和全長輕鏈(LC)。

例如，該全長重鏈為IgG1、IgG2或IgG4同種型，該全長輕鏈為Kappa同種型；

又例如，該重鏈序列為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈序列為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接。例如，該連接子為具有如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整；又例如，該連接子為(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄所示的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合PVRIG的抗原結合結構域的N端或C端。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的N端或C端。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PVRIG的抗原結合結構域位於特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的N端或C端。

一些實施方案中，第一抗原結合結構域、第二抗原結合結構域、第三抗原結合結構域彼此在一條多肽鏈上，或不在一條多肽鏈上。

一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中如選自以下的結構所示：

(I)第一多肽鏈：[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]-[連接子1]a-[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

(II)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]-[連接子3]c-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

(III)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc-[連接子4]d-[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

(IV)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ-[連接子5]e-[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]。

以上第一、第二多肽鏈均是從N端到C端順序。

其中，-表示肽鍵，連接子為能夠實現連接功能的多肽，連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5可以相同，也可以不同；a、b、c、d、e可以視需要獨立地為0或1。

例如，各連接子獨立地為EPKSS或為(G_xS)_y連接子，其中，x選自1-5的整數(例如，1、2、3、4、5)，y選自1-6的整數(例如，1、2、3、4、5、6)。

當連接子為(G_xS)_y連接子時，例如為(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄任一所示的連接子。

一些實施方案中，提供PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：70、52所示的胺基酸序列；

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：68、71所示的胺基酸序列；

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：72、52所示的胺基酸序列；

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：68、73所示的胺基酸序列；

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：76、52所示的胺基酸序列；

該第一、第二多肽鏈分别包含如SEQ ID NO：77、52所示的胺基酸序列；

或與前述任一的第一、第二多肽鏈均具有至少80%或均具有至少90%序列同一性的胺基酸序列組合。

一些實施方案中，前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同或不同的第一多肽鏈，包含兩條相同或不同的第二多肽鏈。

一些具體實施方案中，PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。

一些實施方案中，本揭露PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白因為包含本揭露的特異性結合PD-1的抗原結合結構域，而具有其所有或任意的性質和功能。

PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白因為包含PVRIG/TIGIT結合結構域，還有具有下述特徵中的至少一個：

(a)以小於1×10^-7M的K_D值結合人PVRIG；

(b)阻斷PVRIG與其配體(例如，PVRL2)的相互作用；

(c)解除樹突狀細胞(DC)對T細胞的抑制作用，活化T細胞；

(d)解除腫瘤細胞對NK細胞的抑制作用。

一些實施方案中，本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白能够抑制腫瘤生長至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%。

一些實施方案中，本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白涵蓋變體，該變體與前述第一多肽鏈和第二多肽鏈的任一組合相比有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。該突變可以發生在特異性結合PD-1的抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的抗原結合結構域(例如CDR區和/或FR區)。

一些實施方案中，提供了一種PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其與前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白結合或競爭結合相同的PD-1、PVRIG和/或TIGIT或其表位；或阻斷前述本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白與PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合；或其與PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合被前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白阻斷。

本揭露中，涉及PVRIG結合蛋白或特異性結合PVRIG的抗原結合結構域，其均可包含或選自WO2016134333、WO2016134335、WO2018033798、 WO2018220446、WO2019079777、WO2019232484、WO2020018879、WO2021021837、WO2021097294、WO2021091605、WO2021113831中的PVRIG抗體。例如，PVRIG抗體可以為CPA.7.002、CPA.7.005、CPA.7.021和CPA.7.050中的任一種(參見WO2016134333)。此處全文引入上述專利。

本揭露中，涉及TIGIT結合蛋白或特異性結合TIGIT的抗原結合結構域，其均可包含或選自WO2019062832、WO2009126688、WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2016028656、WO2016106302、WO2017053748、WO2017030823、US20160176963、US20130251720、WO2019232484、WO2019062832中的TIGIT抗體。例如，TIGIT抗體可以為CPA.9.083.H4(S241P)、CPA.9.086.H4(S241P)、CHA.9.547.7.H4(S241P)和CHA.9.547.13.H4(S241P)中的任一種(參見WO2019232484)。此處全文引入上述專利。

在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為0.01mg/mL-500mg/mL，例如0.05mg/mL-450mg/mL、0.05mg/mL-400mg/mL、0.05mg/mL-350mg/mL、0.05mg/mL-300mg/mL、0.05mg/mL-250mg/mL、0.05mg/mL-200mg/mL、0.05mg/mL-150mg/mL、0.05mg/mL-140mg/mL、0.05mg/mL-130mg/mL、0.05mg/mL-120mg/mL、0.05mg/mL-110mg/mL、0.05mg/mL-100mg/mL、0.1mg/mL-400mg/mL、0.1mg/mL-350mg/mL、0.1mg/mL-300mg/mL、0.1mg/mL-250mg/mL、0.1mg/mL-200mg/mL、0.1mg/mL-150mg/mL、0.1mg/mL-140mg/mL、0.1mg/mL-130mg/mL、0.1mg/mL-120mg/mL、0.1mg/mL-110mg/mL、0.1mg/mL-100mg/mL、0.5mg/mL-350mg/mL、0.5mg/mL-300mg/mL、0.5mg/mL-250mg/mL、0.5mg/mL-200mg/mL、0.5mg/mL-150mg/mL、 0.5mg/mL-140mg/mL、0.5mg/mL-130mg/mL、0.5mg/mL-120mg/mL、0.5mg/mL-110mg/mL、0.5mg/mL-100mg/mL、1mg/mL-300mg/mL、1mg/mL-250mg/mL、1mg/mL-200mg/mL、1mg/mL-150mg/mL、1mg/mL-140mg/mL、1mg/mL-130mg/mL、1mg/mL-120mg/mL、1mg/mL-110mg/mL、1mg/mL-100mg/mL、1mg/mL-95mg/mL、1mg/mL-90mg/mL、1mg/mL-85mg/mL、1mg/mL-80mg/mL、1mg/mL-75mg/mL、1mg/mL-70mg/mL、1mg/mL-65mg/mL、1mg/mL-60mg/mL、1mg/mL-55mg/mL、1mg/mL-50mg/mL、1mg/mL-45mg/mL、1mg/mL-40mg/mL、1mg/mL-35mg/mL、1mg/mL-30mg/mL、1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-20mg/mL、1mg/mL-15mg/mL、5mg/mL-90mg/mL、5mg/mL-85mg/mL、5mg/mL-80mg/mL、5mg/mL-75mg/mL、5mg/mL-70mg/mL、5mg/mL-65mg/mL、5mg/mL-60mg/mL、5mg/mL-55mg/mL、5mg/mL-50mg/mL、5mg/mL-45mg/mL、5mg/mL-40mg/mL、5mg/mL-35mg/mL、5mg/mL-30mg/mL、5mg/mL-25mg/mL、5mg/mL-20mg/mL、5mg/mL-15mg/mL、8mg/mL-12mg/mL、30mg/mL-250mg/mL、30mg/mL-200mg/mL、30mg/mL-190mg/mL、30mg/mL-180mg/mL、30mg/mL-170mg/mL、30mg/mL-160mg/mL、30mg/mL-150mg/mL、30mg/mL-140mg/mL、30mg/mL-130mg/mL、30mg/mL-120mg/mL、30mg/mL-110mg/mL、30mg/mL-100mg/mL、50mg/mL-200mg/mL、50mg/mL-190mg/mL、50mg/mL-180mg/mL、50mg/mL-170mg/mL、50mg/mL-160mg/mL、50mg/mL-150mg/mL、50mg/mL-140mg/mL、50mg/mL-130mg/mL、50mg/mL-120mg/mL、50mg/mL-110mg/mL、50mg/mL-100mg/mL、70mg/mL-180mg/mL、70mg/mL-170mg/mL、70mg/mL-160mg/mL、70mg/mL-150mg/mL、70mg/mL-140mg/mL、70mg/mL-130mg/mL、70mg/mL-120mg/mL、70mg/mL-110mg/mL、70mg/mL-100mg/mL、90mg/mL-110mg/mL、 95mg/mL-105mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為0.1mg/mL-400mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為0.5mg/mL-200mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為1mg/mL-150mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為5mg/mL-45mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為50mg/mL-110mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為約1mg/mL、約5mg/mL、約10mg/mL、約15mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約30mg/mL、約40mg/mL、約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL、約100mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、或約100mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為至少50mg/mL、至少100mg/mL、至少200mg/mL、至少400mg/mL或至少500mg/mL。

在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為0.1mM-50mM，例如0.1mM-45mM、0.1mM-40mM、0.1mM-35mM、0.1mM-30mM、0.1mM-25mM、 0.1mM-20mM、0.1mM-15mM、0.1mM-10mM、0.5mM-45mM、0.5mM-40mM、0.5mM-35mM、0.5mM-30mM、0.5mM-25mM、0.5mM-20mM、0.5mM-15mM、0.5mM-10mM、1mM-40mM、1mM-35mM、1mM-30mM、1mM-25mM、1mM-20mM、1mM-15mM、1mM-10mM、5mM-35mM、5mM-30mM、5mM-25mM、5mM-20mM、5mM-15mM、5mM-10mM、8mM-30mM、8mM-25mM、8mM-20mM、8mM-15mM、8mM-12mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為0.5mM-40mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為1mM-30mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為5mM-20mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約26mM、約27mM、約28mM、約29mM或者約30mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為約10mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM。

在一些實施方案中，醫藥組成物還包含表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑為離子或非離子表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基 -甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯與丙烯二醇的共聚物中的一種或多種。在一些實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯。在一些實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯20和/或聚山梨酯80。在一些實施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯80。

在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.01mg/mL-10mg/mL，例如0.01mg/mL-9mg/mL、0.01mg/mL-8mg/mL、0.01mg/mL-7mg/mL、0.01mg/mL-6mg/mL、0.01mg/mL-5mg/mL、0.01mg/mL-4mg/mL、0.01mg/mL-3mg/mL、0.01mg/mL-2mg/mL、0.01mg/mL-1mg/mL、0.01mg/mL-0.5mg/mL、0.05mg/mL-8mg/mL、0.05mg/mL-7mg/mL、0.05mg/mL-6mg/mL、0.05mg/mL-5mg/mL、0.05mg/mL-4mg/mL、0.05mg/mL-3mg/mL、0.05mg/mL-2mg/mL、0.05mg/mL-1mg/mL、0.05mg/mL-0.5mg/mL、0.1mg/mL-6mg/mL、0.1mg/mL-5mg/mL、0.1mg/mL-4mg/mL、0.1mg/mL-3mg/mL、0.1mg/mL-2mg/mL、0.1mg/mL-1mg/mL、0.1mg/mL-0.5mg/mL、0.2mg/mL-5mg/mL、0.2mg/mL-4.5mg/mL、0.2mg/mL-4mg/mL、0.2mg/mL-3.5mg/mL、0.2mg/mL-3mg/mL、0.2mg/mL-2.5mg/mL、0.2mg/mL-2mg/mL、0.2mg/mL-1.5mg/mL、0.2mg/mL-1mg/mL、0.2mg/mL-0.5mg/mL、0.3mg/mL-4.5mg/mL、0.3mg/mL-4mg/mL、0.3mg/mL-3.5mg/mL、0.3mg/mL-3mg/mL、0.3mg/mL-2.5mg/mL、0.3mg/mL-2mg/mL、0.3mg/mL-1.5mg/mL、0.3mg/mL-1mg/mL、0.3mg/mL-0.5mg/mL、0.7mg/mL-3.5mg/mL、0.7mg/mL-3mg/mL、0.7mg/mL-2.5mg/mL、0.7mg/mL-2mg/mL、0.7mg/mL-1.5mg/mL、0.7mg/mL-1mg/mL、0.7mg/mL- 0.9mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.05mg/mL-5mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.1mg/mL-3mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.2mg/mL-2mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.1mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL、約1mg/mL、約1.1mg/mL、約1.2mg/mL、約1.3mg/mL、約1.4mg/mL、約1.5mg/mL、約1.6mg/mL、約1.7mg/mL、約1.8mg/mL、約1.9mg/mL或者約2mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.2mg/mL、約0.4mg/mL、約0.6mg/mL或者約0.8mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.4mg/mL或者約0.8mg/mL。在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為至少0.4mg/mL、至少0.8mg/mL、至少2mg/mL、至少3mg/mL、至少5mg/mL或至少10mg/mL。

在一些實施方案中，醫藥組成物還包含糖類。在一些實施方案中，該糖類選自蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麥芽糖中的一種或多種。在一些實施方案中，該糖類為蔗糖。

在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為0.1%w/v-20%w/v，例如0.1%w/v-15%w/v、0.1%w/v-14%w/v、0.1%w/v-13%w/v、0.1%w/v-12%w/v、0.1%w/v-11%w/v、0.1%w/v-10%w/v、0.1%w/v-9.5%w/v、0.1%w/v-9%w/v、0.1%w/v-8.5%w/v、0.1%w/v-8%w/v、1%w/v-15%w/v、1%w/v-14%w/v、1%w/v-13%w/v、1%w/v-12%w/v、1%w/v-11%w/v、1%w/v-10%w/v、1%w/v-9.5%w/v、1%w/v-9%w/v、1%w/v-8.5%w/v、1%w/v-8%w/v、2%w/v-13%w/v、 2%w/v-12%w/v、2%w/v-11%w/v、2%w/v-10%w/v、2%w/v-9.5%w/v、2%w/v-9%w/v、2%w/v-8.5%w/v、2%w/v-8%w/v、3%w/v-12%w/v、3%w/v-11%w/v、3%w/v-10%w/v、3%w/v-9.5%w/v、3%w/v-9%w/v、3%w/v-8.5%w/v、3%w/v-8%w/v、5%w/v-11%w/v、5%w/v-10%w/v、5%w/v-9.5%w/v、5%w/v-9%w/v、5%w/v-8.5%w/v、5%w/v-8%w/v、6%w/v-10%w/v、6%w/v-9.5%w/v、6%w/v-9%w/v、6%w/v-8.5%w/v、6%w/v-8%w/v、7%w/v-9.5%w/v、7%w/v-9%w/v、7%w/v-8.5%w/v或者7%w/v-8%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為1%w/v-15%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為3%w/v-12%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為5%w/v-10%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為約3%w/v、約3.5%w/v、約4%w/v、約4.5%w/v、約5%w/v、約5.5%w/v、約6%w/v、約6.5%w/v、約7%w/v、約7.5%w/v、約8%w/v、約8.5%w/v、約9%w/v、約9.5%w/v、約10%w/v、約10.5%w/v、約11%w/v、約11.5%w/v或者約12%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為約8%w/v。在一些實施方案中，醫藥組成物中糖類的濃度為至少為8%w/v、至少為10%w/v、至少為12%w/v、至少為15%w/v或者至少為20%w/v。

在一些實施方案中，醫藥組成物還包含其他胺基酸或其可藥用鹽。在一些實施方案中，該其他胺基酸或其可藥用鹽為精胺酸或其可藥用鹽。在一些實施方案中，該其他胺基酸或其可藥用鹽為精胺酸-鹽酸。

在一些實施方案中，醫藥組成物中該其他胺基酸或其可藥用鹽濃度為1mM-200mM，例如1mM-190mM、1mM-180mM、1mM-170mM、1mM-160mM、1mM-150mM、1mM-140mM、1mM-130mM、1mM-120mM、1mM-110mM、1mM-100mM、1mM-90mM、1mM-80mM、1mM-70mM、1mM-60mM、 1mM-50mM、1mM-40mM、1mM-30mM、1mM-20mM、5mM-180mM、5mM-170mM、5mM-160mM、5mM-150mM、5mM-140mM、5mM-130mM、5mM-120mM、5mM-110mM、5mM-100mM、5mM-90mM、5mM-80mM、5mM-70mM、5mM-60mM、5mM-50mM、5mM-40mM、5mM-30mM、5mM-20mM、10mM-170mM、10mM-160mM、10mM-150mM、10mM-140mM、10mM-130mM、10mM-120mM、10mM-110mM、10mM-100mM、10mM-90mM、10mM-80mM、10mM-70mM、10mM-60mM、10mM-50mM、10mM-40mM、10mM-30mM、10mM-20mM、15mM-160mM、15mM-150mM、15mM-140mM、15mM-130mM、15mM-120mM、15mM-110mM、15mM-100mM、15mM-90mM、15mM-80mM、15mM-70mM、15mM-60mM、15mM-50mM、15mM-40mM、15mM-30mM、15mM-20mM、20mM-150mM、20mM-140mM、20mM-130mM、20mM-120mM、20mM-110mM、20mM-100mM、20mM-90mM、20mM-80mM、20mM-70mM、20mM-60mM、20mM-50mM、20mM-40mM、20mM-30mM、25mM-140mM、25mM-130mM、25mM-120mM、25mM-110mM、25mM-100mM、25mM-90mM、25mM-80mM、25mM-70mM、25mM-60mM、25mM-50mM、25mM-40mM、30mM-140mM、30mM-130mM、30mM-120mM、30mM-110mM、30mM-100mM、30mM-90mM、30mM-80mM、30mmM-70mM、30mM-60mM、30mM-50mM、30mM-40mM、40mM-120mM、40mM-110mM、40mM-100mM、40mM-90mM、40mM-80mM、40mM-70mM、40mM-60mM、40mM-50mM、50mM-110mM、50mM-100mM、50mM-90mM、50mM-80mM、50mM-70mM、50mM-60mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為10mM-80mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為20mM-70mM。在一些實施方 案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為40mM-60mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約55mM、約60mM、約65mM或約70mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的濃度為約50mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為5mM-170mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為10mM-150mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為15mM-120mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約55mM、約60mM、約65mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM、約100mM、約105mM、約110mM、約115mM或約120mM。在一些實施方案中，醫藥組成物中其他胺基酸或其可藥用鹽的濃度為約20mM、約50mM或約100mM。

在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為3.5-9，例如3.5-8.5、3.5-8、3.5-7.5、3.5-7、3.5-6.9、3.5-6.8、3.5-6.7、3.5-6.6、3.5-6.5、3.5-6.4、3.5-6.3、3.5-6.2、3.5-6.1、3.5-6、3.5-5.9、3.5-5.8、3.5-5.7、3.5-5.6、3.5-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4-8.5、4-8、4-7.5、4-7、4-6.9、4-6.8、4-6.7、4-6.6、4-6.5、4-6.4、4-6.3、4-6.2、4-6.1、4-6、4-5.9、4-5.8、4-5.7、4-5.6、4-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4.2-8、4.2-7.5、4.2-7、4.2-6.9、4.2-6.8、4.2-6.7、4.2-6.6、4.2-6.5、4.2-6.4、4.2-6.3、4.2-6.2、4.2-6.1、4.2-6、4.2-5.9、4.2-5.8、4.2-5.7、4.2-5.6、4.2-5.5、4.2-5.4、4.2-5.3、4.2-5.2、4.2-5.1、4.2-5.0、4.5-8、4.5-7.5、4.5-7、4.5-6.9、4.5-6.8、4.5-6.7、4.5-6.6、4.5-6.5、4.5-6.4、4.5-6.3、4.5-6.2、 4.5-6.1、4.5-6、4.5-5.9、4.5-5.8、4.5-5.7、4.5-5.6、4.5-5.5、4.5-5.4、4.5-5.3、4.5-5.2、4.5-5.1、4.5-5.0、4.6-7.5、4.6-7、4.6-6.9、4.6-6.8、4.6-6.7、4.6-6.6、4.6-6.5、4.6-6.4、4.6-6.3、4.6-6.2、4.6-6.1、4.6-6、4.6-5.9、4.6-5.8、4.6-5.7、4.6-5.6、4.6-5.5、4.6-5.4、4.6-5.3、4.6-5.2、4.6-5.1、4.6-5.0、4.8-7、4.8-6.9、4.8-6.8、4.8-6.7、4.8-6.6、4.8-6.5、4.8-6.4、4.8-6.3、4.8-6.2、4.8-6.1、4.8-6、4.8-5.9、4.8-5.8、4.8-5.7、4.8-5.6、4.8-5.5、5-6.5、5-6.4、5-6.3、5-6.2、5-6.1、5-6、5-5.9、5-5.8、5-5.7、5-5.6或者5-5.5。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為3.5-7。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為4.0-6.5。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為4.2-6.2。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為4.5-6.0。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4或者約6.5。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為約5.0、約5.2、約5.3、約5.5、約5.6、約5.8或者約6.0。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為約5.0或者約5.5。在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑的pH為至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.5、至少7或者至少9。

在一些實施方案中，醫藥組成物還包含pH調節劑，例如氫氧化鈉和/或鹽酸。

在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH相比其含有的緩衝劑的pH具有不超過±0.5的差異。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為3.5-9，例如3.5-8.5、3.5-8、3.5-7.5、3.5-7、3.5-6.9、3.5-6.8、3.5-6.7、3.5-6.6、3.5-6.5、3.5-6.4、3.5-6.3、3.5-6.2、3.5-6.1、3.5-6、3.5-5.9、3.5-5.8、3.5-5.7、3.5-5.6、3.5-5.5、 4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4-8.5、4-8、4-7.5、4-7、4-6.9、4-6.8、4-6.7、4-6.6、4-6.5、4-6.4、4-6.3、4-6.2、4-6.1、4-6、4-5.9、4-5.8、4-5.7、4-5.6、4-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4.2-8、4.2-7.5、4.2-7、4.2-6.9、4.2-6.8、4.2-6.7、4.2-6.6、4.2-6.5、4.2-6.4、4.2-6.3、4.2-6.2、4.2-6.1、4.2-6、4.2-5.9、4.2-5.8、4.2-5.7、4.2-5.6、4.2-5.5、4.2-5.4、4.2-5.3、4.2-5.2、4.2-5.1、4.2-5.0、4.5-8、4.5-7.5、4.5-7、4.5-6.9、4.5-6.8、4.5-6.7、4.5-6.6、4.5-6.5、4.5-6.4、4.5-6.3、4.5-6.2、4.5-6.1、4.5-6、4.5-5.9、4.5-5.8、4.5-5.7、4.5-5.6、4.5-5.5、4.5-5.4、4.5-5.3、4.5-5.2、4.5-5.1、4.5-5.0、4.6-7.5、4.6-7、4.6-6.9、4.6-6.8、4.6-6.7、4.6-6.6、4.6-6.5、4.6-6.4、4.6-6.3、4.6-6.2、4.6-6.1、4.6-6、4.6-5.9、4.6-5.8、4.6-5.7、4.6-5.6、4.6-5.5、4.6-5.4、4.6-5.3、4.6-5.2、4.6-5.1、4.6-5.0、4.8-7、4.8-6.9、4.8-6.8、4.8-6.7、4.8-6.6、4.8-6.5、4.8-6.4、4.8-6.3、4.8-6.2、4.8-6.1、4.8-6、4.8-5.9、4.8-5.8、4.8-5.7、4.8-5.6、4.8-5.5、5-6.5、5-6.4、5-6.3、5-6.2、5-6.1、5-6、5-5.9、5-5.8、5-5.7、5-5.6或者5-5.5。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為3.5-7。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為4.0-6.5。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為4.2-6.2。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為4.5-6.0。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4或者約6.5。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為約5.0、約5.2、約5.3、約5.5、約5.6、約5.8或者約6.0。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為約5.0者約5.5。在一些實施方案中，醫藥組成物的pH為至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.5、至少7或者至少9。

在一些實施方案中，本揭露提供一種包含的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白(例如第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：76和52的A17m0902-1708-151H7-01-C、或者第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：72和52的A17m0902-1708-151H7-C)的醫藥組成物，其包含以下1)-6)中任一組：

1)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

組胺酸鹽緩衝劑，例如組胺酸鹽酸緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

2)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

組胺酸鹽緩衝劑；

聚山梨酯；

蔗糖；

視需要地，該組成物進一步包含精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

3)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

聚山梨酯；

蔗糖；

視需要地，該組合成物進一步包含精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

4)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

組胺酸醋酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-醋酸緩衝劑；

聚山梨酯；

蔗糖；

視需要地，該組成物進一步包含精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

5)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸鈉鹽緩衝劑，檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

6)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

聚山梨酯；

蔗糖；

視需要地，該組成物進一步包含精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)。

在一些實施方案中，本揭露提供一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白(例如第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：76和52的A17m0902-1708-151H7-01-C、或者第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：72和52的A17m0902-1708-151H7-C)的醫藥組成物，其包含或為以下1)-6)中的任一組：

1)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；組胺酸鹽緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸；

2)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；組胺酸鹽酸鹽緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸；

3)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸；

4)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；組胺酸-醋酸緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸；

5)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；檸檬酸鹽緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸；

6)PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；聚山梨酯；蔗糖；注射用水，視需要的精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)和視需要的氫氧化鈉和/或鹽酸。

在一些實施方案中，本揭露提供一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白(例如第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：76和52的A17m0902-1708-151H7-01-C、或者第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：72和52的A17m0902-1708-151H7-C)的醫藥組成物，其包含以下1)-10)中的任一組：

1)0.01mg/mL-500mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

0.1mM-50mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

0.01mg/mL-10mg/mL聚山梨酯；

0.1w/v-20%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含1mM-200mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為3.5-7；

2)0.1mg/mL-400mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

0.5mM-40mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

0.05mg/mL-5mg/mL聚山梨酯；

1%w/v-15%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含5mM-170mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4-6.5；

3)0.5mg/mL-200mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

1mM-30mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

0.1mg/mL-3mg/mL聚山梨酯；

3%w/v-12%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含10mM-150mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4.2-6.2；

4)1mg/mL-150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

5mM-20mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

5%w/v-10%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含15mM-120mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4.5-6；

5)0.01mg/mL-500mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

0.1mM-50mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

0.01mg/mL-10mg/mL聚山梨酯；

0.1w/v-20%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含1mM-200mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為3.5-7；

6)0.1mg/mL-400mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

0.5mM-40mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

0.05mg/mL-5mg/mL聚山梨酯；

1%w/v-15%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含5mM-170mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4-6.5；

7)0.5mg/mL-200mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

1mM-30mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

0.1mg/mL-3mg/mL聚山梨酯；

3%w/v-12%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含10mM-150mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4.2-6.2；

8)1mg/mL-150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

5mM-20mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

5%w/v-10%w/v蔗糖；

視需要地，該醫藥組成物進一步包含15mM-120mM精胺酸或其可藥用鹽(例如精胺酸鹽酸)；

且該醫藥組成物的pH為4.5-6；

9)為1)-8)中任一醫藥組成物，其中聚山梨酯為聚山梨酯80

10)為1)-9)中任一醫藥組成物，其進一步包含注射用水。

在一些實施方案中，本揭露提供一種含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白(例如第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：76和52的A17m0902-1708-151H7-01-C、或者第一多肽鏈、第二多肽鏈序列分别為SEQ ID NO：72和52的A17m0902-1708-151H7-C)的醫藥組成物，其包含或為以下1)-16)中的任一組：

1)1-150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為4.5-6；

2)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

3)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

4)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

5)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

6)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

7)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結 合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

8)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

9)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

10)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

11)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

約0.4mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

12)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5；

13)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，例如約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL；

約10mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝劑；

約0.8mg/mL聚山梨酯80；

約8%w/v蔗糖；

且該醫藥組成物的pH為約5.5；

14)為1)-13)中的醫藥組成物，其進一步包含20mM、50mM或100mM精胺酸或其鹽酸鹽；

15)為1)-14)中的醫藥組成物，其進一步包含鹽酸和/或氫氧化鈉；

16)為1)-15)中的醫藥組成物，其終體積為1mL；在需要定容的情況下，是採用注射用水定容至1mL。

本揭露的醫藥組成物已具有足夠的成藥穩定性，可以長期穩定放置。

在一些實施方案中，該醫藥組成物於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月，至少24個月或至少36個月。在一些實施方案中，該醫藥組成物於25℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該醫藥組成物於40℃穩定至少 7天，至少14天，至少28天，至少1個月，至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。

本揭露提供了一種製備前述醫藥組成物的方法，包括將該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白溶解的步驟。

為便於藥品運輸的方便，本揭露醫藥組成物可以進一步的做成凍乾製劑。

在某些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該醫藥組成物是液體製劑。在一些實施方案中，該液體製劑的溶劑是水、生理鹽水或葡萄糖溶液。

本揭露還提供了一種凍乾製劑，其特徵在於該凍乾製劑複溶後可形成如上任一項所述的醫藥組成物。

本揭露還提供了一種凍乾製劑，該凍乾製劑藉由將如上任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。

本揭露提供了一種複溶溶液，該複溶溶液是藉由將前述凍乾製劑經複溶製備獲得。在某些實施方案中，該複溶溶液選自但不限於注射用水，生理鹽水或葡萄糖溶液。

本揭露還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有如前述的醫藥組成物、如前述的凍乾製劑或如前述的複溶溶液。在某些實施方案中，該容器為中性硼矽玻璃管製注射劑瓶。在某些實施方案中，該製品中包含藥品說明書。

本揭露還提供醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液，其用於治療或緩解疾病或病症的藥物。

治療疾病的方法和製藥用途

本揭露提供前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液用於治療、緩解、預防、診斷疾病或病症的方法。

一些實施方案中，提供改善、緩解、治療或預防疾病的方法，包括向受試者施用改善、緩解、治療或預防有效量的前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。

一些實施方案中，提供本揭露的前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。

一些實施方案中，前述疾病為增殖性疾病或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症(例如癌症，本揭露中，癌症和腫瘤可互相替代使用)，例如為PD-L1超量表達或與PVRIG、TIGIT異常表達相關的相關疾病(例如癌症)。

一些實施方案中，前述癌症為實體瘤或血液腫瘤。

一些實施方案中，前述癌症為晚期或轉移性的。

一些實施方案中，前述癌症選自以下或其組合：前列腺癌、肝癌(HCC)、結直腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、胃(stomach/gastric)癌、宮頸癌、頭頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌(鱗狀和基底細胞癌)、神經膠質瘤、腎癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、間皮瘤、食道癌、默克細胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。例如，選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、 宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。

一些實施方案中，前述受試者具有與PVRIG和/或TIGIT相關的病況。一些具體方案中，受試者病況包括表達或不表達PVRIG的癌症並且進一步包括非轉移性或非浸潤性以及浸潤性或轉移性癌症，其中免疫細胞、基質細胞或發生病變的細胞的PVRIG表達抑制抗腫瘤反應和抗浸潤性免疫反應。本揭露的方法例如適合於治療血管化癌症。

一些實施方案中，提供治療或預防受試者感染或膿毒症的方法，包括向該受試者施用治療或預防有效量的前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。一些具體方案中，該感染是病原體感染，以病毒特異性T細胞反應的不同程度的功能性障礙為特徵，如HIV、HCV、HBV。一些具體方案中，該膿毒症包括重度膿毒症、膿毒性休克、全身炎症反應綜合症(SIRS)、菌血症、敗血症、毒血症、膿毒性綜合症。

一些實施方案中，提供活化受試者的細胞毒性T細胞(CTL)的方法，提供活化受試者的NK細胞的方法，提供活化受試者的γδT細胞的方法，提供活化受試者的Th1細胞的方法，提供活化、減少或消除受試者體內的調節性T細胞(Treg)中的至少一種的細胞數量和/或活性的方法，提供增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，提供抑制受試者體內的PVRIG和PVRL2的相互作用的方法，提供阻斷或抑制受試者體內PD-1與PD-L1/PD-L2的相互作用的方法，均包括向該受試者施用有效量的前述醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。

本揭露含有PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的醫藥組成物可以藉由胃腸外給藥的方式用於治療需要這種治療的患者。胃腸外給藥途徑可選擇皮下注射、肌肉注射或靜脈注射。

圖1A及圖1B為PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統檢測抗PD-1奈米抗體的活性結果。使用Pembrolizumab作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照；其中，圖1A為A6_IgG4和A17_IgG4結果。圖1B為A17h1_IgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4、A17m0903_hIgG4、A17m0905_hIgG4的結果。

圖2為藉由DC細胞：T細胞混合淋巴反應中細胞因子的釋放檢測A17m09_hIgG4對T細胞激活程度，使用Pembrolizumab作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照。

圖3A及圖3B為A17m09_hIgG4抑制小鼠MC38結腸癌腫瘤生長的體內藥效試驗結果，圖3A為小鼠腫瘤體積結果圖，圖3B為小鼠體重圖，使用Pembrolizumab作為陽性對照，PBS作為陰性對照。

圖4為抗PVRIG奈米抗體30、151的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗結果，使用Tab5作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照。

圖5為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H8的MLR實驗結果，同時檢測151H8、1708、hIgG4、Tab5、Pembrolizumab作為對照。

圖6A及圖6B為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151、1708和151的聯用在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤結果。圖6B為對應的小鼠體重圖。

圖7A及圖7B為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H7和1708-30H2在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤結果。圖7B為對應的小鼠體重圖。

圖8為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的4種抗體構型示意圖。

圖9為A17h1-1708-151H74種構型的抗體結合TIGIT抗原的檢測結果。

圖10為A17h1-1708-151H74種構型的抗體結合PVRIG抗原的檢測結果。

圖11A、圖11B、圖11C分別為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化後與過表達PVRIG、TIGIT、PD-1抗原的細胞的結合能力。

圖12為A17h1-1708-151H74種構型的抗體在PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統中對PD-L1/PD-1結合的阻斷。

圖13為A17h1-1708-151H74種構型的抗體的MLR檢測結果。

圖14為A17h1-1708-151H74種構型的抗體的NK細胞殺傷功能實驗結果。

圖15A及圖15B為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中抗腫瘤作用評估。

圖16A及圖16B為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中抗腫瘤作用評估。

一、術語

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的具有通常知識者通常理解的含義。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中該。

“程序性死亡1”、“細胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互換使用，且包括人PD-1的變體、同種型、物種同源物、以及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。完整的PD-1序列可以從GenBank登錄號U64863找到。“程序性死亡配體-1(PD-L1)”是PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體之一(另一種為PD-L2)，它在與PD-1結合時下調T細胞活化和細胞因子分泌。如本文中使用的“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的變體、同種型、和種間同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同表位的類似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登錄號Q9NZQ7查到。

“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”或“PVRIG多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型，並且尤其是PVRIG的可溶性胞外域(ECD)片段。此處ECD的定義如專利WO2016134333所述。完整的人類PVRIG序列可以GenBank登錄號AAH73861.1找到。

“TIGIT”或“TIGIT蛋白質”或“TIGIT多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野 生型TIGIT，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型。完整的TIGIT序列可以GenBank登錄號AAI01289.1找到。

“與PD-1結合”，指能與PD-1或其表位相互作用，該PD-1或其表位可以是人源的。“與PVRIG結合”，指能與PVRIG或其表位相互作用，該PVRIG或其表位可以是人源的。“與TIGIT結合”，指能與TIGIT或其表位相互作用，該TIGIT或其表位可以是人源的。“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本揭露抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

“PD-1結合蛋白”涵蓋任何能夠特異性結合PD-1的蛋白或其表位的任何分子。PD-1結合蛋白可以包括針對PD-1的如本揭露定義的抗體、其抗原結合片段或其綴合物。PD-1結合蛋白還涵蓋免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。本揭露的“PD-1結合蛋白”可以包含至少一個結合PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。在一些實施方案中，“PD-1結合蛋白”可以包含2、3、4或更多個結合PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。本揭露的PD-1結合蛋白除包含PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域外，也可包含連接子和/或具有效應功能的部分，例如半衰期延長部分(如結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域)、和/或融合配偶體(如血清白蛋白)和/或綴合的聚合物(如PEG)和/或Fc區。在一些實施方案中，本揭露的“PD-1結合蛋白”還涵蓋雙/多特異性抗體，其含有結合不同抗原的免疫球蛋白(如結合第一抗原(如PD-1)的第一抗體和結合第二抗原(如PVRIG)的第二抗體，視需要包括結合第三體原(如TIGIT)的第三特異性抗體，進一步可選的，包括結合第四抗原的第四抗體。“PD-1結合蛋白”涵蓋“PD-1/PVRIG結合蛋白”、“PD-1/TIGIT結合蛋白”、“PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白”。

本揭露的“PD-1結合蛋白”或“抗PD-1抗體”可以例如綴合的方式包含一個或多個效應分子。該“效應分子”包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特別地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒和報導基團例如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜分析檢測的化合物。當效應分子是聚合物時，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如視需要地取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化亞烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例如同聚或異聚多糖。可存在於上述合成聚合物上的具體的視需要取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具體實例包括視需要地取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別地視需要地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。在一個實施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。聚合物與PD-1結合蛋白或抗PD-1抗體的綴合方式可以藉由常規方法實現。

“細胞因子”是由一個細胞群體釋放的、作為細胞間介質作用於其它細胞的蛋白質的一般術語。這樣的細胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子、趨化因子和傳統的多肽激素。示例性的細胞因子包括：人IL-2、IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-17和IL-5。

“抗體”涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條重鏈和兩條輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結 構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

“抗原結合片段”涵蓋單鏈抗體(即全長重鏈和輕鏈)；Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、雙鏈抗體(diabody)、三體抗體(tribody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)和上述任意一種的表位結合片段(參見例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3)209-217)。

產生和製備這些抗原結合片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先揭露於WO2009/040562，其二硫鍵穩定化形式Fab-dsFv首先揭露於 WO2010/035012。本揭露的抗原結合片段還包括描述於WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的(參見例如WO92/22583和WO05/113605)，後者的一個示例是描述於WO 92/22583中的Tri-Fab(或TFM)。

“雙特異性抗體”涵蓋對兩個不同抗原或同一抗原的兩個或至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已揭露了各種結構的雙特異性抗體。根據IgG分子的完整性，可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體。根據抗原結合區域的數量，可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體。根據結構左右是否對稱，可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等雙特異性抗體。IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期。典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)₂-CrossMAb、IgG-(scFv)₂、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)₄-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F. Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。

“三特異性抗體”指能特異性結合三個或至少三個不同抗原表位，可以是不同抗原的抗原表位或同一抗原的不同抗原表位。

對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構，來完成對CDR的確定性描繪和對結合位點的殘基的鑑定。這可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。

Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參 見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊。根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，CDR的邊界可縮短或延長。如本揭露使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，示例性地，如下表1中所示。

表1.CDR編號系統之間的關係

本揭露的抗體的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。

本揭露的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式，其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說，本揭露的抗體是重組抗體。

如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾。例如，重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。

多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。

“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈的球形區域。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的折疊特徵。

“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”、“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”組成的免疫球蛋白結構域。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。

“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。

“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbs^TM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的 (單結構域)抗體(諸如dAbs^TM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。

“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、V_HH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該VHH與存在於常規四肽鏈結構抗體中的VH以及VL進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(然而，常規四肽鏈結構抗體中，表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“V_HH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及“Nanobody®結構域”(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露該目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已揭露於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。

如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被占據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。VHH的其它編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。

“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括：在和常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處，將源自駱駝科的VHH結構域藉由存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”(本揭露中亦稱為“序列優化”，除人源化外，“序列優化”也可涵蓋藉由提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其它修飾，例如移除潛在的翻譯後修飾位點)。人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列。在一些具體實施方案中，可含IGHV3的人框架區序列。“人源化”的又一例子包括將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及 抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to auniversal framework)，即將CDR“移植”於其它“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。

“親和力成熟的”抗體指與親本抗體相比，在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。例如，“親和力成熟”的PD-1結合蛋白或PD-1抗體，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對抗原的親和力相比於其親本抗體有所增加。親和力成熟的抗體可藉由例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。

“全人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本揭露的全人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如 藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。“全人抗體”不包括“人源化抗體”。

通常，“特異性結合”、“選擇性結合”是指結合蛋白與抗原上的表位結合。本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10^-7至10^-10莫耳/升(M)、更佳10^-8至10^-10莫耳/升、甚至更佳10^-9至10^-10或更低的解離常數(K_D)，和/或以至少10^-7M、較佳至少10^-8M、更佳至少10^-9M，更佳至少10^-10M的締合常數(KA)結合所要結合的抗原(即PD-1、PVRIG和/或TIGIT)或其表位。任何大於10^-4M的K_D值一般都視為指示非特異性結合。結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及夾心式競爭性測定)。

“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定表位與給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本揭露所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。

“結合親和力”或“親和力”在本揭露中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(K_D)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法 (Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定K_D。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。K_D藉由方程K_D=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且甚至可藉由例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中該那些方法對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中揭露的那種來確定K_D。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本揭露例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用Biacore^TM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/抗原複合物的K_D值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的K_D值與非目的相互作用(例如已知不結合PD-1的對照抗體)的K_D值進行評價。

“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如，賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有鹼性側鏈，並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性，在於它們具有酸性側鏈。此外，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性，在於它們具有不帶電荷極性側鏈，並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性，在於它們具有非極性側鏈。另外，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有芳族側鏈。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見， 甚至當置換如上文該顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時，它將不顯示特性的特定變化。

“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同核苷酸或胺基酸單體占據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被相同核苷酸占據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

“阻止...的生長”或“生長抑制”是指抑制細胞的生長或增殖。

“增殖性疾病”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，增殖性病症指癌症。

“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“腫瘤”在本揭露中提到時並不互相排斥。

“預防癌症”是指在受試者中延遲、抑制或防止癌症發作，該受試者中癌症發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑑定了癌症易感性。該還包括治療具有癌變前病症的受試者以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。

本文所用術語“約”或“大約”是指數值在由本領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多±30%的範圍，例如，約5.5的pH意指pH5.5±1.65。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和請求項中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括三羥甲基胺基甲烷(Tris)、醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。

“組胺酸鹽緩衝劑”是包含組胺酸根離子的緩衝劑。組胺酸鹽緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸-醋酸鹽緩衝劑，組胺酸-醋酸鹽緩 衝劑是組胺酸與醋酸配製而成，組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑是組胺酸與組胺酸鹽酸鹽配製而成，或組胺酸與鹽酸配製而成。

“檸檬酸鹽緩衝劑”是包括檸檬酸根離子的緩衝劑。檸檬酸鹽緩衝劑的實例包括檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鉀、檸檬酸-檸檬酸鈣、檸檬酸-檸檬酸鎂等。較佳的檸檬酸鹽緩衝劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝劑。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是保持活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

本揭露中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。

本揭露中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性，例如醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、至少6個月、至少1年、至少2年、最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃保存包 括1個月、3個月、6個月或在40℃保存1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的抗體單體發生降解。藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、較佳不超過約5%的截短，通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。

“施用”、“給予”和“處理”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當其應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種抗體或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本揭露的受試者可以是動物或人類受試者。

本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。

檢測過程中使用的設備及方法如下：

外觀：

採用目視法，將樣品瓶擦拭乾淨，在1000~1500 lx的光照強度下，分別於澄明度檢測儀白背景和黑背景下觀察樣品顏色、澄清度和可見異物。

外觀檢測儀器：精拓儀器YB-2A澄明度檢測儀。

SEC分子排阻色譜法：

根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離的分析的方法。

SEC單體含量百分比=A單體/A總*100%(A單體為樣品中主峰單體的峰面積，A總為所有峰面積之和。)

SEC測定用儀器：安捷倫1260-Bio；色譜管柱：Waters，XBrige BEH200Å SEC(300×7.8mm 3.5μm)

NR-CE毛細管凝膠電泳：

將凝膠移到毛細管中作為支持介質進行的一種電泳，並在一定的電壓下根據樣品分子量的大小進行分離的方法。

非還原CE純度百分比=A主峰/A總*100%(A主峰為樣品中主峰的峰面積，A總為所有峰面積之和。

CE測定用儀器：Sciex型號PA800 plus

icIEF成像毛細管等點聚焦電泳：

根據蛋白質等電點pI不同進行分離的技術。

icIEF主峰含量百分比=主峰峰面積/總面積*100%(總面積為酸性峰、主峰和鹼性峰面積之和)。

icIEF測定所用儀器廠家Protein Si mple，型號Muarice。

蛋白濃度測定：

蛋白濃度測定儀器：紫外可見分光光度計，型號：Nano Drop 2000，光程為1mm。

示例性抗體醫藥組成物(製劑)製備工藝

第一步：PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白與下述處方量的輔料混合配製成含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的製劑原液，經過濾後中控取樣檢測無菌。將原液過0.22μm濾芯過濾，收集濾液。

第二步：調節裝量至1.15mL，將濾液灌裝於2mL西林瓶中，加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第四步：目檢，確認產品無裝量不准等缺陷。打印、黏貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。

二、實施例與測試例

藉由以下實施例進一步詳細說明本揭露。這些實施例僅用於說明性目的，而並不用於限制本揭露的範圍。

本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例

本申請中PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的製備、純化方法已在申請號為WO2023040945專利文件中記載，其全部內容引入本揭露。

實施例1. 抗PD-1奈米抗體的篩選、製備和功能驗證

本實施例使用帶有His標簽的人PD-1作為免疫抗原，使用帶有生物素標記的人PD-1和食蟹猴PD-1作為篩選抗原，以上均購自AcroBiosystems公司。

實施例1-1. 抗PD-1奈米抗體的篩選和製備

1.免疫抗原、篩選抗原序列和製備

表2.免疫羊駝和篩選用PD-1抗原信息

人PD-1蛋白(NP_005009.2)序列如下，其中下劃線為胞外區域序列，胺基酸起止Leu25-Gln 167。

>人PD-1胺基酸序列

(SEQ ID NO：1)。

2.羊駝免疫、奈米抗體酵母展示文庫構建和抗體篩選

1)羊駝免疫

對2隻健康羊駝(alpaca)進行免疫。第0天初次免疫，將0.25mg人PD-1抗原與弗氏完全佐劑(CFA)1mL混勻後皮下注射。第21、42、63天，將0.125mg人PD-1抗原與弗氏不完全佐劑(IFA)1mL混勻後皮下注射。分別在第28天、49天、70天採血10mL、50mL、50mL。檢測血清滴度，符合建庫標準的羊駝外周淋巴細胞用於構建奈米抗體酵母展示文庫。

2)酵母庫構建

分別採集2隻羊駝第三次和第四次免疫後50mL外周血，分離出外周血中的PBMC，提取PBMC中的RNA，反轉錄，獲取總cDNA。將cDNA作為巢氏PCR第一輪反應模板。經過兩輪巢式PCR擴增，第二輪巢氏PCR產物片段與酵母文庫載體(酵母文庫載體pYDN3)連接，將連接產物電擊轉化進入酵母感受態細胞。採用菌落PCR方法驗證插入率和文庫多樣性。依據庫轉化子數、庫插入率和文庫多樣性分析測序結果表明，一隻羊駝文庫庫容為9.28×10⁷，另一隻羊駝文庫庫容為1.54×10⁸。

3)奈米抗體(VHH)篩選

對此酵母展示系統採用流式細胞(FACS)分選，以及文庫篩選與鑑定進行抗體的篩選。分選採用兩輪分選步驟：第一輪分選採用生物素標記人PD-1蛋白(Avitag-His Tag)磁珠富集，第二輪採用生物素標記猴PD-1蛋白(His,Avitag)流式分選儀進行分選(流式抗體為：Mouse anti-HA tag Dylight 488；streptavidin Dylight 650)。兩輪分選結束後經過單株鑑定、測序、序列分析獲得人、猴PD-1抗原交叉結合的18條VHH獨特序列。以下示出其中A17序列。

>A17可變區

(SEQ ID NO：2)。

表3.抗PD-1奈米抗體的CDR(Kabat編號規則)

將上述序列連接到人IgG4 Fc(包含鉸鏈區，且帶有S228P，根據Eu編號系統)片段上，構建成VHH-Fc抗體。構建質粒，瞬轉HEK293細胞，表達，使用protein A管柱純化，PBS洗管柱，0.1M甘胺酸緩衝液沖提，pH 2.5。透析至PBS pH7.4緩衝液中。其中人IgG4 Fc(包含鉸鏈區)以及基於A17的VHH-Fc抗體序列如下：

>hIgG4

(SEQ ID NO：6)；

>A17_hIgG4

(SEQ ID NO：7)。

實施例1-2. 抗PD-1奈米抗體與抗原PD-1的親和力鑑定

1.ELISA

使用PBS溶解人PD-1蛋白(his tag)至1μg/mL，100uL/孔加入到96孔板中，4℃過夜，包被抗原。使用PBST(PBS+0.05% tween20)溶液洗三次。加入PBST/1%BSA溶液，37℃孵育1h，進行封閉。PBST溶液洗三次後加入不同濃度的候選PD-1 VHH-Fc抗體(PBST/1% BSA溶液稀釋)，37℃孵育1.5小時。PBST溶液洗三次。加入100μL HRP偶聯的抗人IgG4 Fc的二抗(Thermo)溶液，37℃孵育1小時。PBST溶液洗三次後，加入100μL/孔TMB溶液，室溫反應5min後，加入50μL終止液，而後使用酶標儀讀取450nM值，計算EC₅₀，

結果如表4，顯示A17_hIgG4與PD-1抗原有較強的結合力。

表4.ELISA檢測抗PD-1奈米抗體的EC₅₀值

2.FACS

為檢測抗PD-1奈米抗體與細胞膜上表達的PD-1的結合能力，將不同濃度的候選抗PD-1 VHH-Fc抗體加入到10⁵/孔過表達人PD-1的Jurkat細胞(Cat：J1250，Promega)中，室溫孵育20min後，PBS洗兩次後，加入100μL抗人IgG Fc的螢光二抗(Biolegend)，室溫孵育20min後，PBS洗兩次，250μL PBS重新懸浮，使用FACS檢測螢光信號，計算EC₅₀。

使用Pembrolizumab(購自百英生物)作為對照，結果如表5所示。並且，A17_hIgG4的EC₅₀值為0.3568nM，顯著優於同步篩選獲得的其它抗體(結果未出示)。

表5.FACS檢測抗PD-1奈米抗體結合細胞表面PD-1的EC₅₀值

實施例1-3. 抗PD-1奈米抗體的序列改造

1.抗PD-1奈米抗體的人源化和回復突變

抗體人源化藉由CDR-grafting方法進行。藉由IMGT或NCBI網站，將親本抗PD-1抗體與IMGT或NCBI/igblast數據庫中的全人源胚系基因進行比對，選擇與PD-1奈米抗體高度同源的人胚系基因IGHV 3-23(IGHV3-23*01；IGHV3-23*04)作為人源化模板。移植CDR，保留奈米抗體的FR2中的4個關鍵殘基(Y37、E44、R45、L47)，並對接近CDR區的關鍵核心殘基，以及與CDR相互 作用的Vernier位置殘基進行回復突變，獲得人源化抗體A17h1、A17h2、A17h3、A6h1。

>A17h1可變區

(SEQ ID NO：8)；

>A17h2可變區

(SEQ ID NO：9)；

>A17h3可變區

(SEQ ID NO：10)。

2.去除TCE(T細胞表位)、降低抗體脫醯胺、降低抗體異構化改造

為降低抗體潛在的免疫原性風險，進行去除TCE改造。為提高抗體的成藥性，進行抗體脫醯胺、抗體異構化位點的改造。獲得如下序列：

>A17m01可變區

(SEQ ID NO：11)

>A17m02可變區

(SEQ ID NO：12)

>A17m03可變區

(SEQ ID NO：13)

>A17m04可變區

(SEQ ID NO：14)

>A17m05可變區

(SEQ ID NO：15)

>A17m06可變區

(SEQ ID NO：16)

>A17m07可變區

(SEQ ID NO：17)

>A17m08可變區

(SEQ ID NO：18)

>A17m09可變區

(SEQ ID NO：19)

>A17m10可變區

(SEQ ID NO：20)

>A17m11可變區

(SEQ ID NO：21)

>A17m12可變區

(SEQ ID NO：22)

>A17m13可變區

(SEQ ID NO：23)

>A17m14可變區

(SEQ ID NO：24)

>A17m15可變區

(SEQ ID NO：25)。

並且，進一步選擇A17m09對抗體序列胚系化改造，以提高人源化程度，獲得如下序列：

>A17m0901可變區

(SEQ ID NO：26)

>A17m0902可變區

(SEQ ID NO：27)

>A17m0903可變區

(SEQ ID NO：28)

>A17m0905可變區

(SEQ ID NO：29)。

即，本揭露的A17具有如下的通式序列：

CDR1：DYSMS(SEQ ID NO：3)

CDR2：IISGSGX₁X₂X₃HYVDSVKG，其中，X₁選自V或G，X₂選自I或S，X₃選自T或A(SEQ ID NO：30)

CDR3：VSDWX₄X₅Y，其中，X₄選自D或E，X₅選自D或E(SEQ ID NO：31)。

具體地，CDR2可以為：

IISGSGVIAHYVDSVKG(SEQ ID NO：4)

IISGSGVITHYVDSVKG(SEQ ID NO：32)

IISGSGGIAHYVDSVKG(SEQ ID NO：33)

IISGSGVSAHYVDSVKG(SEQ ID NO：34)

IISGSGGITHYVDSVKG(SEQ ID NO：79)

具體地，CDR3可以為：

VSDWDDY(SEQ ID NO：5)

VSDWEDY(SEQ ID NO：35)

VSDWDEY(SEQ ID NO：36)。

實施例1-4. PD-1/PD-L1報告基因系統檢測抗PD-1奈米抗體對PD-L1結合PD-1的阻斷

使用PD-1/PD-L1 NFAT基因報告系統(Cat：J1250，Promega)，可以檢測抗PD-1抗體在細胞層面的生物學活性功能。該系統由兩個基因工程細胞系組成：過表達PD-1的效應細胞Jurkat(內含NFAT報告基因螢光素酶)和過表達PD-L1的抗原遞呈細胞CHO-K1細胞。當這兩種細胞共培養時，PD-1/PD-L1相互作用會抑制TCR介導的NFAT活化，進而抑制NFAT報告基因螢光素酶的表達。當PD-1/PD-L1相互作用被破壞時，TCR激活會藉由NFAT通路誘導螢光素酶的表達，可以藉由添加Bio-Glo試劑和使用光度計進行螢光定量檢測，從而測定效應細胞活化程度以及抗體的生物學活性。

將過表達PD-L1的CHO-K1細胞稀釋到4×10⁵/mL，在96孔板中，每孔加入100μL，培養過夜。吸出培養基後，迅速加入40μL 1.25×10⁶/mL的PD-1 Jurkat細胞以及不同濃度的40μL抗PD-1奈米抗體溶液(1640+2%FBS溶液稀釋)。37℃培養6小時，恢復至室溫，每孔加入40μL Bright-glo試劑(Cat：E2620，promega)，350rpm避光震盪5min，避光，室溫靜置5min後，使用酶標儀讀取螢光值，計算IC₅₀。

使用Pembrolizumab和hIgG4 isotype作為對照。如圖1A和表6所示，A17_hIgG4的生物學功能活性IC₅₀值為1.199nM，顯著優於本揭露同步篩選的其它抗體(例如A3_hIgG4為7.62，A13_hIgG4為3.208；A3_hIgG4和A13_hIgG4未示出序列)。其中，A6_hIgG4為本申請篩選獲得的另一種抗體。

表6.PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統檢測抗PD-1奈米抗體的活性IC₅₀值

採用如上方法，對人源化的抗PD-1奈米抗體進行功能驗證，參見圖1B和表7，A17h1_hIgG4的IC₅₀活性與陽性抗體Pembrolizumab相似。經序列改造的候選分子中，A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4抗體的生物學活性IC₅₀值分別為0.5307nM、0.4352nM，優於Pembrolizumab。

表7.PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統檢測經改造的抗PD-1奈米抗體的活性IC₅₀

實施例1-5. 經改造的抗PD-1奈米抗體與抗原PD-1的結合親和力鑑定

使用Biacore 8k(GE Healthcare)儀器，採用表面電漿共振技術(surface plasmon resonance，SPR)檢測抗PD-1奈米抗體與PD-1抗原的親和力。實驗選用CM5傳感器芯片，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05% surfactant P20)。將抗人IgG(Fc)抗體用10mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)，配製成30μg/mL溶液，選擇Immobilization程序自動進行抗人IgG(Fc)抗體通道胺基偶聯固定。用HBS-EP+緩衝溶液分別配製各待測抗體 作為配體，用芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗體進行捕獲。將人或食蟹猴PD-1抗原蛋白(Sino Biological，10377-H08H；90311-C08H)作為分析物，用HBS-EP+緩衝溶液進行配製，分析物進行2倍梯度稀釋，在30μL/min的流速下流過實驗通道和參比通道，結合1min，解離15min。再生緩衝液l0mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)在10μl/min的流速下運行30s，計算結合速率Ka和解離速率Kd，以及解離常數(即親和力K_D)。結果參見表8和表9。

表8.抗PD-1奈米抗體結合人PD-1抗原的SPR親和力數據

表9.抗PD-1奈米抗體結合食蟹猴PD-1抗原的SPR親和力數據

結合人PD-1抗原結果顯示，人源化抗體A17h1_hIgG4及後續改造優化的抗體A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4與Pembrolizumab具有相似的K_D值。A17h1_hIgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4均比Pembrolizumab的解離速率慢。A17h1_hIgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4抗體交叉結合猴PD-1，抗體與人和猴PD-1具有相似的親和力。

實施例1-6. DC：T混合淋巴反應(Mix Lymphocyte Reaction，MLR)檢驗經改造的抗PD-1奈米抗體的體外藥效

成熟的樹突細胞(Dendritic cells，DC)與異體T細胞共培養，可以激活T細胞，促進T細胞分泌細胞因子。該過程受PD-1/PD-L1信號抑制，使用抗PD-1抗體可以解除抑制，促進T細胞活化。因此，使用DC：T混合淋巴反應實驗，可以檢驗抗PD-1抗體的體外藥效。

使用分選試劑盒(cat：19359，stemcell)從一個健康人的新鮮外周血(PBMC)中分選出單核細胞。使用DC細胞誘導試劑盒(cat：10985，stemcell)，培養七天後，誘導單核細胞分化為成熟DC細胞。而後使用分選試劑盒(cat：17951，stemcell)從另一個健康人的新鮮PBMC中分選出異體T細胞。將5000個成熟DC細胞與50000個異體T細胞共培養，並加入相應濃度的候選抗體，共培養六天後，吸取細胞上清，使用Cisbio-HTRF IFN-γ檢測試劑盒(Cat：62HIFNGPEH，Perkinelmer)檢測IFN-γ濃度，計算EC₅₀。

如圖2所示，A17m09_hIgG4在MLR實驗中，顯示出與Pembrolizumab基本一致的體外藥效。其中，A17m09_hIgG4的EC₅₀為0.2931nM，Pembrolizumab的EC₅₀為0.3271nM。

實施例1-7. 抗PD-1奈米抗體抑制小鼠結腸癌模型中腫瘤生長

本實施例在人源化PD-1 C57BL/6小鼠的MC38腫瘤模型上，驗證抗PD-1抗體的體內抗腫瘤藥效。

使用DMEM培養基(10% FBS)培養MC38小鼠結腸癌細胞系，將5×10⁵個MC38細胞接種於人源化PD-1 C57BL/6雌鼠(集萃藥康)皮下，待小鼠平均腫瘤體積達到80mm³左右時，隨機分組，每組8隻，給予腹腔注射抗體或對 照，每週兩次測量腫瘤體積，稱體重，記錄數據。實驗分組與給藥方案參見表10。考慮到A17m09_hIgG4的分子量約75kDa，隻有正常IgG分子量的一半，故給藥劑量調整為Pembrolizumab的一半，以實現等莫耳數劑量。

如圖3A和圖3B所示，在同等莫耳劑量下，A17m09_hIgG4的體內抗腫瘤藥效與Pembrolizumab一致。腫瘤體積與腫瘤抑制率參見表11。

表10.小鼠實驗分組與給藥方案

表11.小鼠腫瘤體積與腫瘤抑制率

實施例2. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體

本實施例中，帶his標簽的人PVRIG(h-PVRIG-his)重組蛋白、帶小鼠IgG2a的Fc標簽的人PVRIG(h-PVRIG-mIgG2a Fc)重組蛋白、帶人IgG1的Fc標簽的小鼠PVRIG(m-PVRIG-hIgG1 Fc)購自Acrobiosystems公司。帶his標簽的PVRL2購自AcroBiosystem(PV2-H52E2)。

實施例2-1. 抗PVRIG奈米抗體的篩選和製備

1.免疫抗原、篩選抗原的序列和製備

表12.重組蛋白質的胺基酸序列

帶his標簽的食蟹猴PVRIG(cyno-PVRIG-his)重組蛋白序列如下：

(SEQ ID NO：37)。

2.羊駝免疫、奈米抗體噬菌體展示文庫構建和抗體篩選

參照實施例1-1的方法，使用帶his標簽的人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-his)免疫羊駝。從第56天的駱駝外周血中分離PBMC，提取RNA，反轉錄成cDNA，構建抗人PVRIG奈米抗體的噬菌體文庫。經過3輪篩選，對400個株測序，其中2株的可變區序列如下所示，CDR如表13所示。

>151可變區

(SEQ ID NO：38)。

表13.抗PVRIG奈米抗體的CDR(Kabat編號規則)

將上述抗體可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P，F234A，L235A，K447A突變(Eu命名系統)，構建全長抗體。

>hIgG4 Fc(S228P/F234A/L235A/K447A)

(SEQ ID NO：42)。

>151全長

(SEQ ID NO：43)。

WO2016134333中所示的抗PVRIG抗體CPA.7.021篩選自抗體噬菌體庫，其亞型為IgG1，能與人PVRIG較好結合，對食蟹猴PVRIG則無結合。 將CPA.7.021的重鏈和輕鏈可變區，分別與人IgG4重鏈恆定區(帶有S228P，F234A，L235A，K447A突變)和人Kappa輕鏈恆定區連接，構建陽性抗體Tab5。

>Tab5重鏈全長

(SEQ ID NO：44)

>Tab5輕鏈全長

(SEQ ID NO：45)。

將表達上述胺基酸序列的核酸序列選殖到pcDNA3.1表達載體，按常規方法進行抗體表達和純化，經檢測，獲得目的抗體。

實施例2-2. 抗PVRIG奈米抗體與抗原PVRIG的親和力鑑定

1.ELISA

用直接包被帶his標簽的PVRIG重組蛋白，加入抗體後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗一抗Fc的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。

人、食蟹猴或小鼠PVRIG蛋白包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液(PBS+0.05% Tween20+1% BSA)室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加100μL用稀釋液稀釋好的抗PVRIG待測抗體。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL HRP標記的抗人IgG二抗(Sigma，A8667)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50mL/孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取OD450，計算抗PVRIG抗體對PVRIG重組蛋白的結合EC₅₀值。表14中所有抗體均對人或食蟹猴的PVRIG重組蛋白有較強的結合能力，但不結合小鼠PVRIG重組蛋白。

表14.抗PVRIG抗體對不同物種PVRIG重組蛋白的結合實驗結果

2.FACS檢測

製備獲得表達人或食蟹猴PVRIG基因的HEK293穩轉細胞株。在96孔板中每孔接種2x10⁵個細胞。300g離心5分鐘，去上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100 μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。所有抗體均對細胞表面表達的人或食蟹猴的PVRIG有較強的結合能力，明顯強於陽性抗體Tab5，而Tab5甚至完全不結合食蟹猴PVRIG。

表15.抗PVRIG抗體對不同物種PVRIG的細胞結合實驗結果

3.Fortebio檢測

將Protein A生物傳感器(Fortebio，#18-5010)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將抗PVRIG抗體稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中，待讀數為1.2nm時停止。將傳感器浸泡於KB緩衝液中100秒，以沖提多餘的抗體。將帶有his標簽的人PVRIG用KB緩衝液以2倍梯度稀釋至64nM-4nM之間。將傳感器置於該溶液中結合300秒，再置於KB緩衝液中解離600秒。採用動態1：1結合方式擬合，則抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力如表16所示。

結果顯示，所有檢測抗體均具有與人PVRIG的高親和力。

表16.抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力

實施例2-3. 抗PVRIG奈米抗體的功能和活性驗證

1.抗PVRIG奈米抗體阻斷PVRIG和PVRL2結合實驗

人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-mIgG2a Fc)包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加50μL稀釋好的抗PVRIG待測抗體和50μL帶his標簽的配體PVRL2，37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL按1：2000倍稀釋的用HRP標記的抗his標簽的二抗(Genscrpit)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50μL每孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗PVRIG抗體對PVRIG與PVRL2結合阻斷的IC₅₀值。

表17結果顯示，所檢測抗體均可以強烈抑制人PVRIG與人PVRL2的結合。

表17.抗體對人PVRIG/PVRL2結合的阻斷實驗

2.抗PVRIG奈米抗體報告基因細胞活性實驗

首先，構建plvx-OS8(G418抗性)質粒，轉染293F細胞，G418篩選，用流式細胞儀檢測株細胞OS8的表達同時檢測OS8對Jurkat細胞的激活，選擇激活程度中等的株，得到293F-OS8細胞株；構建plvx-PVRL2質粒，用它感染293F-OS8細胞，用流式細胞儀篩選出PVRL2表達量最高的株，從而得到293F-OS8-PVRL2細胞株。

其次，構建plvx-NFAT-Luc(Hygromycin抗性)，包裝成慢病毒，感染Jurkat E6.1細胞，加Hygromycin篩選出有抗性的株，用OKT3去刺激株，篩選出Luciferase信號中等的株，得到Jurkat-NFAT-Luc細胞系；構建plvx-PVRIG(Puromycin抗性)載體，包裝成慢病毒，感染Jurkat-NFAT-Luc細胞，經流式細胞儀篩選出PVRIG表達量最高的株，從而得到Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞株。

將1E4個Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞與待測抗體在37℃孵育20分鐘。加入1E5個293F-OS8-PVRL2細胞，37℃孵育5小時。離心去除上清，加入Luciferase緩衝液(Promega，E6130)裂解細胞，檢測螢光值。計算EC₅₀值評價抗PVRIG抗體的體外細胞活性。實驗結果如表18所示。

結果顯示，所檢測抗體有較強的激活Jurkat細胞中Luciferase的能力，活性是陽性抗體的至少10倍以上，證明這些抗體可以結合PVRIG並阻斷PVRL2與PVRIG的結合。

表18.抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗結果

3.抗PVRIG奈米抗體的NK細胞殺傷實驗

PVRIG在NK細胞上表達，而PVRL2在很多腫瘤細胞(包括K562細胞)中表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除腫瘤細胞對NK細胞活性的抑制作用。

在96孔板中每孔加入50μL(總計1×10⁵個)人惡性非霍奇金淋巴瘤NK92細胞。加入50μL 20nM或100nM待測抗體，37℃孵育30分鐘。用洗液洗滌兩次，重新懸浮至2×10⁵個/mL的密度。加入50μL(總計1×10⁴個)的人慢性髓系白血病K562細胞，使得NK92細胞與K562細胞個數的比例為10：1。37℃孵育4小時。使用CytoTox-Glo細胞毒性系統(Promega，G9292)對殺傷活性進行測量。首先加入50μL AAF-Glo試劑，室溫孵育15分鐘，測量被NK92細胞殺死的K562細胞的螢光。再加入50μL裂解液，室溫孵育15分鐘，裂解細胞，測量所有細胞的螢光。準備三種對照組，分別是只包括培養液的樣品(對照組一)，只包括NK92細胞的樣品(對照組二)，只包括K562細胞的樣品(對照組三)，進行同樣的操作。

根據如下公式，計算殺傷活性：

殺傷活性(%)={[(R-BG)-(T-BG)-(E-BG)]/[(TL-BGL)-(T-BG)]}×100；

其中，R為加入AAF-Glo後的螢光值，BG為對照組一在加入AAF-Glo的螢光值，E為對照組二在加入AAF-Glo的螢光值，T為對照組三在加入AAF-Glo的螢光值；TL為對照組三在加入裂解液後的螢光值，BGL為對照組一再加入裂解液後的螢光值。

實驗結果如表19所示，表明所有檢測的抗PVRIG抗體均可以明顯的激活NK92細胞、殺傷K562細胞。

表19.抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗

4.抗PVRIG奈米抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗

PVRIG在T細胞上表達，而PVRL2在DC細胞上表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除DC細胞對T細胞的抑制，活化T細胞。

從第一個體來源的外周血中分離PBMC，將細胞培養於含10% FBS的RPMI 1640培養基中，以50ng/mL GM-CSF(Peprotech，300-03-100UG)和50ng/mL IL-4(Peprotech，200-04-100UG)的終濃度添加，每2-3天添加含細胞因子的新鮮培養基；培養6天後，加入1μg/mL LPS(Sigma，L2880-25MG)孵育24小時，收集分化成熟得到的DC細胞。從第二個體來源的外周血中分離PBMC，使用EasySep人CD3⁺T細胞分離試劑盒(Stemcell，17952)從中分離CD3⁺ T細胞。調整CD3⁺T細胞和DC細胞的密度，使得每孔加入1×10⁵個CD3⁺T細胞和2×10⁴個DC細胞。加入待測抗體，37℃孵育120小時，取上清，用ELISA試劑盒(R&D，DY202)檢測上清中的IFNγ含量。

如表20和圖4所示，相比對照抗體IgG4，所有檢測抗PVRIG抗體均可以明顯的激活T細胞分泌IFNγ。並且，在低劑量(如4nM、20nM)時，本揭露的抗體151較之陽性對照Tab5的效果更優。其中，30抗體為本申請篩選獲得的另一種抗體。

表20.抗PVRIG抗體混合淋巴細胞反應IFNγ分泌量

實施例2-4. 抗PVRIG奈米抗體的序列改造

藉由對選定的抗PVRIG抗體分子進行三維結構同源建模，將抗PVRIG抗體序列與抗體GermLine數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板IGHV3-7 *01。將CDR移植到相應的人源模板中。對移植後的奈米抗體再次進行三維結構模擬並分析，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對可變區的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，產生一系列人源化奈米抗體。各個奈米抗體的人種系模板以及人源化抗體重鏈可變區序列如下所示。

>151H2可變區

(SEQ ID NO：46)

>151H4可變區

(SEQ ID NO：47)

>151H7可變區

(SEQ ID NO：48)

>151H8可變區

(SEQ ID NO：49)

>151H9可變區

(SEQ ID NO：50)。

將上述人源化抗體重鏈可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，構造形成全長抗PVRIG抗體。其中重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P/F234A/L235A/K447A，或S228P/K447A突變。按常規方法進行抗體的表達和純化，經檢測，得到目的抗體。

實施例2-5. 人源化抗PVRIG抗體的活性和功能驗證

1.人源化抗PVRIG抗體與表達PVRIG的細胞結合實驗

依照實施例2-2的方法，FACS檢測抗PVRIG抗體與人或食蟹猴PVRIG的結合。實驗結果如表21所示。

表21.抗PVRIG奈米抗體對不同物種PVRIG的FACS結合實驗結果

2.人源化抗PVRIG抗體與PVRIG的親和力測定

依照實施例2-2的Fortebio檢測方法，檢測人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG蛋白的親和力。如表22所示，所有抗體均具有與人PVRIG蛋白的高親和力。

表22.人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力

3.人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗

依照實施例2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體在報告基因細胞中的活性。實驗結果如表23所示。表中列出的抗體均具有激活Jurkat細胞的能力。

表23.人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗

4.人源化抗PVRIG抗體的活化NK細胞殺傷能力實驗

依照實施例2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體對NK細胞的活化能力。實驗結果如表24所示。結果顯示，所測抗體都有明顯的活化NK細胞的能力，促進NK細胞對於靶細胞K562的殺傷。

表24.人源化抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗

實施例2-6. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的製備

為探索不同構造的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對抗體功能的影響，將抗PVRIG奈米抗體151藉由GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：78)連接子與抗TIGIT抗體1708的重鏈或輕鏈的N端或C端相連。形成4個抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，命名為1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，分別對應151被連接在1708的重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端和輕鏈C端。抗TIGIT抗體1708採用人IgG4亞型，並帶有S228P(Eu命名系統)的突變。抗TIGIT抗體1708和其與151形成的雙特異性抗體序列如下表25所示。抗TIGIT抗體序列信息如表26和表27所示。TIGIT抗體已經在WO2019062832A中揭露，藉由引用全文併入。

表25.抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的第一、第二多肽鏈序列

表26.抗TIGIT抗體重鏈及輕鏈CDR區序列(Kabat編號規則)

表27抗TIGIT抗體重鏈VH及輕鏈VL序列

將不同的人源化抗PVRIG抗體可變區(151H7，151H8)連接到抗TIGIT抗體1708的重鏈N端，即採用1708-151-1類似的雙特異性抗體構造，構建雙特異性抗體。以下序列中雙下劃線為連接子序列。

>1708-151H7第一多肽鏈

(SEQ ID NO：68)

>1708-151H8第一多肽鏈

(SEQ ID NO：69)。

1708-30H2、1708-151H7、1708-151H8的第二多肽鏈均與1708的轻鏈相同(SEQ ID NO：52)。

按常規方法進行抗體的瞬時轉染、表達和純化，經鑑定，得到本揭露的全長抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，其均顯示了良好的表達量和純度。

實施例2-7. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的活性和功能驗證

1.雙特異性抗體與人PVRIG的結合及對配體PVRL2的阻斷

依照實施例2-2和2-3的方法，進行實驗。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，與人PVRIG重組蛋白和過表達人PVRIG細胞的結合，以及對PVRL2結合PVRIG的阻斷，無統計學顯著差異。

2.雙特異性抗體與人TIGIT的結合及對配體PVR的阻斷

依照實施例2-2和2-3的方法(相應的受體和配體換為人TIGIT和人PVR)，進行實驗，結果如表28所示。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4和抗TIGIT抗體，與人TIGIT重組蛋白和過表達人TIGIT細胞的結合，以及對TIGIT結合其配體PVR的阻斷，無統計學顯著差異。

可見，抗PVRIG抗體無論是連接到抗TIGIT抗體的重、輕鏈的N端或C端，都保持了對PVRIG和TIGIT的結合和配體的阻斷，並且都顯示了良好的表達量、純度。

3.人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與PVRIG和TIGIT的結合以及對相應配體的阻斷

依照實施例2-2和2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴PVRIG的結合，對人PVRIG的配體阻斷。結果如表28所示。結果表明，各雙特異性抗體均可以結合人PVRIG，阻斷PVRIG結合PVRL2。

表28.人源化雙特異性抗體對PVRIG的結合和配體阻斷

與實施例2-2和2-3類似地，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴TIGIT的結合，對人TIGIT與配體結合的阻斷，其中將PVRIG蛋白替換為TIGIT，並將PVRL2替換為PVR。結果如表29所示。結果表明，各雙特異性抗體均可以結合人的TIGIT，阻斷TIGIT結合PVR。

表29.人源化雙特異性抗體對TIGIT的結合和配體阻斷

利用Biacore檢測雙特異性抗體與人PVRIG、與人TIGIT的親和力。將人源化雙特異性抗體捕獲於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的Protein A生物傳感芯片(GE lifesciences，29127557)上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人PVRIG抗原(AcroBiosystem，PVG-H52H4)或人TIGIT抗原(AcroBiosystem，TIT-H52H3)，獲得結合和解離曲線。結果見表30。

表30.人源化雙特異性抗體與人PVRIG、人TIGIT的親和力

4.抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗

依照實施例2-3第4部分的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對T細胞的活化能力。實驗結果如圖5和表31所示。結果顯示，人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H8具有明顯的活化T細胞的能力，促進T細胞分泌IFNγ。重要的是，雙特異性抗體的活性強於單用抗PVRIG抗體151H8，單用抗TIGIT抗體1708。

表31.人源化雙特異性抗體混合淋巴細胞反應IFNγ分泌量

實施例2-8. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估

為進一步探究雙特異性抗體亞型在動物藥效中的作用，進行動物藥效試驗。其中，1708-IgG1的重鏈可變區與1708相同，只是重鏈恆定區亞型換為IgG1；1708-IgG1的輕鏈全長和1708-151-IgG1的第二多肽鏈均與與1708的輕鏈相同。

NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有的NCG小鼠按照SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件培養。

A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養所用的A375細胞需經過Mitomycin C處理2h後，PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL2和10% FBS)將PBMC重新懸浮至3×10⁶個/mL的濃度，與Mitomycin C處理後的A375細胞共培養。共培養6天後，收取PBMC，同時收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻老鼠接種：PBMC 5×10⁵個，A375細胞4×10⁶個；接種體積：0.2mL/隻(含50% Matrigel)；接種於雌性NCG小鼠右側皮下。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表32，分組給藥當天為第0天。由於抗PVRIG抗體和抗TIGIT抗體的分子量不同，該給藥劑量保證了抗PVRIG抗體與抗TIGIT抗體擁有同樣的起始莫耳濃度。

表32.給藥方案

給藥開始後，小鼠每週2次測量腫瘤體積及體重。實驗結果分別見表33和圖6A、圖6B。

表33.抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果

實驗結束時(給藥後第26天)，與對照組相比，抗PVRIG抗體151-IgG4單藥組沒有明顯差異。抗TIGIT抗體1708-IgG1單藥組，抗PVRIG抗體151-IgG4與抗TIGIT抗體1708-IgG1聯用組，腫瘤體積下降。而1708-151-IgG4 雙特異性抗體組甚至可以完全抑制腫瘤的生長，與其它組間具有顯著性差異(見圖6A)。

根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表34，分組給藥當天為第0天。

表34.給藥方案

給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表35和圖7A及圖7B。

表35.抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果

實驗結束時(給藥後第28天)，與對照組相比，1708-151H7雙特異性抗體組均可以在低劑量下有效抑制腫瘤生長，與對照組間具有顯著性差異(見圖7A、圖7B)。其中，1708-30H2為本申請篩選獲得的另外一種抗體。

實施例3. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體

實施例3-1. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的設計和製備

四種類型的三特異性抗體分為A，B，C，D四種類型，示意如圖8。

A型：抗PD-1奈米抗體藉由連接子(如GGGGSGGGGS)連接抗PVRIG奈米抗體，再經連接子連接在抗TIGIT抗體的重鏈N端(圖8的A)。

B型：抗PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端，而抗PD-1抗體經連接子連接在抗TIGIT抗體的輕鏈N端(圖8的B)。

C型：抗PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子(GGGGSGGGGS)連接在抗TIGIT抗體的重鏈C端(圖8的C)。

D型：抗-PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子連接在抗TIGIT抗體輕鏈C端(圖8的D)。

本揭露中三特異性抗體命名如表36。例如A17m0902-1708-151H7-A，代表使用的抗PD-1、TIGIT和PVRIG抗體的株分別為A17m0902、1708和151H7，三特異性抗體類型為A型。

表36.抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體命名

表36中A17h1相關分子，均為在對應的A17m0902相關分子的基礎上，將A17m0902(SEQ ID NO：27)序列替換為A17h1(SEQ ID NO：8)序列。

序列如下(下劃線為連接子，斜體為Fc或輕鏈Cκ)：

>A17m0902-1708-151H7-A第一多肽鏈

(SEQ ID NO：70)

A17m0902-1708-151H7-A第二多肽鏈如SEQ ID NO：52所示。

A17m0902-1708-151H7-B第一多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。

>A17m0902-1708-151H7-B第二多肽鏈

(SEQ ID NO：71)。

>A17m0902-1708-151H7-C第一多肽鏈

(SEQ ID NO：72)

A17m0902-1708-151H7-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：52所示。

A17m0902-1708-151H7-D第一多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。

>A17m0902-1708-151H7-D第二多肽鏈

(SEQ ID NO：73)。

經常規方法轉染細胞，表達，純化，檢測後能夠獲得目的抗體。

實施例3-2. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體與抗原的結合親和力

採用ELISA進行檢測。PBS溶解人TIGIT或PVRIG蛋白(his tag，Acrobiosystems，PVG-H52H4)至1μg/mL，將100μL/孔該溶液加入到96孔板中，4℃過夜，包被抗原。用PBST溶液洗三次。加入PBST/1% BSA溶液，37℃孵育1h，進行封閉。PBST溶液洗三次後加入不同濃度的三特異性抗體(PBST/1% BSA溶液稀釋)，37℃孵育1.5h。PBST溶液洗三次。加入100μL HRP耦聯的抗人IgG4 Fc的二抗(Thermo)溶液，37℃孵育1h。PBST溶液洗三次後，加入100μL/孔TMB溶液，室溫反應5min後，加入50μL終止液，使用酶標儀讀取OD450值，計算EC₅₀。

1.與TIGIT的結合

四種構型的A17h1-1708-151H7三特異性抗體與TIGIT均有較強結合，結合能力差異較小，且與1708-151H7雙特異性抗體對TIGIT的結合能力相似。結果參見圖9和表37。因此，所有三特異性抗體構型不影響其結合TIGIT的結合。

表37.三特異性抗體結合TIGIT抗原的EC₅₀值

2.與PVRIG的結合

四種構型的A17h1-1708-151H7三特異性抗體與PVRIG均有較強結合，結合能力差異較小，且與1708-151H7雙特異性抗體對PVRIG的結合能力相似。參見表38和圖10。因此，所有三特異性抗體構型不影響其結合PVRIG的結合。

表38.三特異性抗體結合PVRIG抗原的EC₅₀值

實施例3-3：抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化

PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體A17m0902-1708-151H7-C設計中，原PVRIG抗體序列(151H7)的第一位胺基酸為組胺酸(單字母縮寫為H)，位於三特異性抗體分子序列N端的組胺酸在實際抗體生產過程中可能會發生磷酸吡哆醛的修飾和脫磷酸後的吡哆醛修飾，基於此問題的考慮需要對原PVRIG序列第一位組胺酸進行突變。由於谷胺酸(單字母縮寫為E)和穀胺醯胺(單字母縮寫為Q)為奈米抗體序列中第一位出現頻率最高的兩個胺基酸，因此將H突變為E或者Q。PVRIG抗體151H7的突變序列如下：

>151H7 H1E

(SEQ ID NO：74)。

>151H7 H1Q

(SEQ ID NO：75)。

將PVRIG抗體(151H7)序列第一位胺基酸由H變為E的三特異性抗體分子命名為A17m0902-1708-151H7-01-C；將PVRIG(151H7)序列第一位胺基酸由H變為Q的三特異性抗體分子命名為A17m0902-1708-151H7-02-C。

A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C分子類型為C型：即抗PVRIG抗體經連接子1連接在抗TIGIT抗體的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子2連接在抗TIGIT抗體的重鏈C端(圖8的C)。

A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C多肽鏈序列如下：

>A17m0902-1708-151H7-01-C第一多肽鏈

(SEQ ID NO：76)。

A17m0902-1708-151H7-01-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：52所示。

>A17m0902-1708-151H7-02-C第一多肽鏈

(SEQ ID NO：77)。

A17m0902-1708-151H7-02-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：52所示。

實施例3-4. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化後與抗原的結合親和力

分別使用表達人PVRIG基因的HEK293F穩轉細胞株，表達人TIGIT基因的CHO-K1穩轉細胞株和表達人PD-1的Jurkat細胞。在96孔板中每孔接種2x10⁵個細胞。300g離心5分鐘，去上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。

1.與PVRIG的結合

PVRIG抗體第一位胺基酸突變後的兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-C和突變前的雙特異性抗體分子1708-151H7對細胞表面表達的人PVRIG有較一致的結合活性，EC50值相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於PVRIG的結合。結果參見表39和圖11A。

表39.抗體對表達人PVRIG的細胞結合實驗E_MAX和EC₅₀結果

2.與TIGIT的結合

兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-C抗體對細胞表面表達的人TIGIT有較一致的結合活性，EC50相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於TIGIT的結合。結果參見表40和圖11B。

表40.三特異性抗體對表達人TIGIT細胞結合實驗E_MAX和EC₅₀結果

3.與PD-1的結合

兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的A17m0902-1708-151H7-C抗體對細胞表面表達的人PD-1有相近的結合活性，EC50相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於PD-1的結合。結果參見表41和圖11C。

表41.三特異性抗體對表達人PD-1的細胞結合實驗EMAX和EC₅₀結果

總結上述結合活性實驗結果，PVRIG抗體第一位胺基酸突變後的兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7- 02-C與細胞表面表達的PVRIG、TIGIT、PD-1抗原的親和力與母本A17m0902-1708-151H7-C抗體相當，這些突變不影響三特異性抗體對於PVRIG，TIGIT和PD-1的結合。

實施例3-5. PD-1/PD-L1報告基因系統檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對PD-1的阻斷

採用實施例1-4中的方法進行檢測。如圖12，A17h1作為PD-1端組成的四種構型的三特異性抗體均能實現對PD-1阻斷，但B型和C型三特異性抗體的報告基因活性相對更好。

實施例3-6. MLR檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對T細胞的活化

按實施例1-6的方法，將來自人受試者的細胞進行DC：T混合淋巴反應實驗，結果參見圖13和表42。結果顯示，4種構型的三特異性抗體均能有效促進T細胞活化，解除PD-1/PD-L1的抑制，促進T細胞分泌細胞因子，均具有較強的體外藥效活性。

表42.四種構型三特異性抗體的MLR結果

實施例3-7. NK92殺傷檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對NK細胞的活化

使用NK細胞殺傷實驗，可以檢驗抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體外藥效。使用NK92細胞作為效應細胞，K562細胞作為靶細胞，進行細胞殺傷實驗。先將不同濃度的候選抗體與NK92細胞在37℃共孵育30分鐘，再將經過抗體預孵育的NK92細胞按照10：1的效靶比與經過CTV(Cat：C34557，Thermo)標記的K562細胞進行混合，培養條件為1640+10%FBS+10ng/mL IL-2，37℃共孵育4小時。離心去上清後，使用10μg/mL碘化丙啶溶液重新懸浮細胞，進行死細胞染色標記。室溫標記10分鐘後，FACS檢測CTV標記的K562細胞中，死細胞(PI陽性)的比例，計算殺傷活性。

如圖14所示，三特異性抗體保留了抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體促進NK細胞殺傷的生物學功能，並且各構型的IC₅₀值相似，參見表43。

表43.4種構型三特異性抗體的NK細胞殺傷功能

實施例3-8. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在對PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估

本實施例在對PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC體內腫瘤模型上，驗證PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體內藥效。

NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g(小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司)。小鼠放置在SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件下飼養。

從凍存PBMC中篩選獲得在體內藥效模型中響應PD-1單抗的供體PBMC，計數。用含IL-2和10% FBS的RPMI 1640培養液重新懸浮PBMC到一定的濃度。將PBMC加入經Mitomycin C處理2h後的A375細胞中。與A375共培養5天後，收取PBMC。A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻鼠接種：PBMC 5×10⁵個，A375細胞4×10⁶個；接種體積為0.2mL/隻(含50% Matrigel)；接種於NCG小鼠右側皮下。接種當天為第0天，第1天時根據小鼠體重隨機進行分組給藥。

考慮到A17m0902_hIgG4分子量為76kDa；1708-151H7分子量為173.5kDa；A17m0902-1708-151H7-C分子量為200kDa。設計等莫耳濃度的給藥方案。詳細的給藥方案、給藥劑量和給藥途徑見表44。

表44.小鼠實驗分組和給藥方案

給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。

給藥第21天後，與對照組相比，1708-151H7(11.5mg/kg)給藥組、A17m0902_hIgG4(5mg/kg)給藥組、A17m0902-1708-151H7-C(13.3mg/kg)給藥組和1708-151H7(11.5mg/kg)+A17m0902_hIgG4(5mg/kg)給藥組的腫瘤生長抑制率(TGI)分別為7.05%、79.91%、91.63%和88.25%。三特異性抗體A17m0902-1708- 151H7-C給藥組的藥效明顯優於抗PD-1單抗A17m0902_hIgG4給藥組，以及優於PVRIG/TIGIT雙特異性抗體+PD-1單抗聯用的組。

給藥後第21天後結束實驗，對所有小鼠實行安樂死，剝離其腫瘤並稱重拍照，計算瘤重TGI，與瘤體積TGI趨勢一致，結果也顯示三特異性抗體A17m0902-1708-151H7-C給藥組的藥效明顯優於PD-1單抗A17m0902_hIgG4給藥組，以及優於PVRIG/TIGIT雙特異性抗體+PD-1單抗聯用的組。實驗結果分別見表45和圖15A、圖15B。

表45.抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗響應的小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果

實施例3-9. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估

本實施例在抗PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC體內腫瘤模型上，驗證抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體內藥效。

NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g(購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司)，放置在SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件下飼養。

從凍存PBMC中篩選獲得在體內藥效模型中不響應抗PD-1單抗的供體PBMC。實驗方案同實施例3-8描述的方法。小鼠實驗分組和給藥方案見表46。

表46.小鼠實驗分組和給藥方案

給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。

給藥第17天後，根據測定各組小鼠腫瘤平均體積，實驗組與IgG對照組相比，1708-151H7、A17m0902_hIgG4、A17m0902-1708-151H7-C、1708-151H7+A17m0902_hIgG4腫瘤生長抑制率(TGI%)分別為4.53%、20.75%、36.70%和31.95%。

給藥後第17天後結束實驗，對所有小鼠實行安樂死，剝離其腫瘤並稱重拍照。根據測定各組小鼠腫瘤重量，實驗組與IgG對照組相比，1708-151H7、A17m0902_hIgG4、A17m0902-1708-151H7-C、1708-151H7+A17m0902_hIgG4腫瘤生長抑制率(TGI%)瘤重TGI分別為0%、16.8%、38.2%和33.4%。瘤重TGI與瘤體積TGI趨勢一致。實驗結果分別見表47和圖16A、圖16B。

與IgG對照組相比，A17m0902-1708-151H7-C給藥組和1708-151H7+A17m0902_hIgG4給藥組的腫瘤體積與重量均顯著性減小(圖16A、圖16B，P<0.05)，表現出顯著的抑瘤效果。本次實驗過程中，所有小鼠均未出現明顯的體重下降和行為異常，表明小鼠在該實驗條件下，對受試藥物具有較好的耐受性。

表47.抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗不響應的人源A375腫瘤小鼠模型中的抑瘤效果

實施例4. PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體製劑緩衝體系、pH值和輔料的篩選

所使用的PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體為前述A17m0902-1708-151H7-C，其第一多肽鏈、第二多肽鏈胺基酸序列分別為SEQ ID NO72和52。配製下列緩衝液，添加對應輔料和表面活性劑，製備PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體濃度為50mg/mL的抗體製劑，進行穩定性研究。實驗結果見表48。

1)F1 10mM檸檬酸-檸檬酸二鈉緩衝液pH5.0，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80；

2)F2 10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液pH5.5，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80；

3)F3 10mM組胺酸-醋酸緩衝液pH5.0，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80；

4)F4 10mM組胺酸-醋酸緩衝液pH5.5，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80；

5)F5 10mM組胺酸-醋酸緩衝液pH6.0，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80；

6)F6 10mM組胺酸-醋酸緩衝液pH5.0，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80，50mM精胺酸；

7)F7 10mM組胺酸-醋酸緩衝液pH5.5，加入8%w/v蔗糖，0.04mg/mL聚山梨酯80，50mM精胺酸。

表48.影響因素(凍融與振搖)篩選結果

表49.40℃外觀結果-1

表50.40℃純度篩選結果-2

實驗結果：

處方F1出現明顯渾濁，且蛋白在檸檬酸體系中不穩定。

凍融和振搖實驗結果顯示(表48)：在振搖3天後，處方F3(組胺酸-醋酸鹽緩衝體系pH5.0)與F4(組胺酸-醋酸鹽緩衝體系pH5.5)無乳光，澄明狀態，其他處方從T0開始就出現乳光；重複凍融後所有處方外觀穩定性良好；振搖或重複凍融後SEC、CEX和NR-CE檢測結果上，F2~F7處方沒有明顯差異，展示出較好的穩定性。

高溫實驗結果(表49-50)：

外觀結果顯示：處方F2~F7經40℃存放4週後，外觀均未發生明顯變化。

SEC結果顯示：40℃高溫存放4週後，所有處方SEC純度均有所下降，其中F2(組胺酸鹽酸鹽體系pH5.5)、F3(組胺酸醋酸鹽緩衝體系pH5.0)和F4(組胺酸醋酸鹽緩衝體系pH5.5)的下降程度小於F5~F7處方。

CEX結果顯示：經40℃存放4週後，各處方CEX主峰均有下降趨勢，處方之間差別不大。

NR-CE結果顯示：經40℃存放4週後，各處方主峰純度都保持在90%以上，處方之間差別不大。

綜上所述，在製劑外觀、SEC、CEX和NR-CE檢測結果上，處方F3-F4較其他處方略優，展示出較好的穩定性。因此選用F3(組胺酸-醋酸緩衝液，pH 5.0)和F4(組胺酸-醋酸緩衝液，pH 5.5)作為下一輪蛋白濃度篩選。

實施例5. PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體濃度的篩選

所使用的PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體為前述A17m0902-1708-151H7-C，其第一多肽鏈、第二多肽鏈胺基酸序列分別為SEQ ID NO：72和52。選擇10mM組胺酸-醋酸pH5.0和pH5.5的緩衝體系，製備8%w/v蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，不同抗體濃度的PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體製劑：

1)F8 10mM組胺酸-醋酸pH5.0，50mg/mL抗體；

2)F9 10mM組胺酸-醋酸pH5.5，50mg/mL抗體；

3)F10 10mM組胺酸-醋酸pH5.0，100mg/mL抗體；

進行穩定性研究。

表51抗體濃度篩選振搖和凍融結果

表52.抗體濃度篩選高溫實驗結果

實驗結果

凍融和振搖實驗結果(表51)顯示：振搖或凍融後F8-F10處方外觀穩定性良好，SEC、CEX和NR-CE檢測結果上各處方沒有明顯差異，展示出較好的穩定性。

高溫實驗結果(表52)顯示：

外觀結果表明：不同抗體濃度的處方在40℃放置4週後，均出現淺黃色，無可見顆粒；在2-8℃和25℃放置4週，外觀與T0相比沒有變化。

SEC結果表明：在40℃放置4週後，各處方單體均有明顯下降，在醋酸-組胺酸緩衝體系，同一抗體濃度(50mg/mL)下，F8(pH5.0)較F9(pH5.5)的單體含量和聚體含量略好；隨著處方濃度的增加，聚體含量增加，但F10(pH5.0抗體濃度100mg/mL)單體也在91.23%左右，2~8℃長期穩定數據良好，可以支持高濃度的製劑開發。

CEX結果表明：在40℃放置4週後，F8~F10處方主峰下降明顯，各處方趨勢保持一致；在醋酸-組胺酸pH5.0緩衝體系，F8(抗體濃度50mg/mL)與F10(100mg/mL)主峰分別是22.97%和21.74%，抗體濃度對CEX主峰下降影響不大；

NR-CE結果表明：經40℃存放4週後，處方F10(100mg/mL)下降最多，但主峰也在91.49%，其他處方純度也略有下降，但下降幅度相當。三個處方在2~8℃與25℃放置4週與T0點主峰相差不大。

結合振搖和重複凍融以及高溫實驗可得，抗體在醋酸-組胺酸緩衝體系穩定性良好，當濃度開發到100mg/mL時在pH在5.0時穩定性也較好。

實施例6. PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體pH值和濃度的篩選

所使用PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體為前述A17m0902-1708-151H7-01-C，其第一多肽鏈、第二多肽鏈胺基酸序列分別為SEQ ID NO：76和52。

選擇10mM組胺酸-醋酸pH5.0和pH5.5的緩衝體系，製備8%w/v蔗糖，0.8mg/mL聚山梨酯80，不同抗體濃度的PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體製劑：

1)F11 10mM組胺酸-醋酸pH5.0，50mg/mL抗體；

2)F12 10mM組胺酸-醋酸pH5.0，80mg/mL抗體；

3)F13 10mM組胺酸-醋酸pH5.0，100mg/mL抗體；

4)F14 10mM組胺酸-醋酸pH5.5，50mg/mL抗體；

5)F15 10mM組胺酸-醋酸pH5.5，100mg/mL抗體；

進行穩定性研究，包括高溫(40℃)、25℃、2-8℃、凍融和震盪。

表53.抗體pH值和濃度篩選振搖和凍融結果

表54.抗體pH值和濃度篩選振搖和凍融結果

實驗結果：凍融和振搖實驗結果(表53)顯示：振搖或凍融後F11-F15處方外觀穩定性良好，SEC、CEX和NR-CE檢測結果上各處方沒有明顯差異，展示出較好的穩定性。

高溫實驗結果(表54)顯示：

外觀結果表明：不同抗體濃度的處方在40℃放置2週後，均無可見顆粒，F12~F15乳光有所加強；在2-8℃和25℃放置2週，各處方外觀與T0相比沒有變化。

SEC結果表明：在40℃放置2週後，各處方單體均有明顯下降，在醋酸-組胺酸緩衝體系，同一抗體濃度(50mg/mL)下，F11(pH5.0)較F14(pH5.5)的單體含量和聚體含量略好；隨著處方濃度的增加，聚體含量增加。

CEX結果表明：在40℃放置2週後，F11~F15處方主峰下降明顯，各處方趨勢保持一致；在醋酸-組胺酸pH5.0緩衝體系，F11(抗體濃度50mg/mL)與F13(100mg/mL)主峰分別是59.58%和59.32%，抗體濃度對CEX主峰下降影響不大；

NR-CE結果表明：經40℃存放2週後，各處方主峰均有下降，但下降幅度相當。五個處方在2~8℃與25℃放置2週與T0點主峰相差不大。

結合振搖和重複凍融以及高溫實驗2W數據可得，抗體在醋酸-組胺酸緩衝體系穩定性良好，在pH5.0和pH5.5純度數據都在可接受範圍之內；隨著濃度的提高，聚體有小幅度的增加，但在可接受範圍之內。

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Claims (22)

1. 一種醫藥組成物，其包含PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白和緩衝劑，其中該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含：

   特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、

   特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域、和

   特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域，

   該第一抗原結合結構域包含或是免疫球蛋白單一可變結構域，其包含：

   SEQ ID NO：27、2、8-10、11-26、28-29任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

   較佳地，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、30、31所示，或如SEQ ID NO：3、32、35所示；

   其中該緩衝劑選自檸檬酸鹽緩衝劑、組胺酸鹽緩衝劑，較佳為組胺酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸-醋酸鹽緩衝劑，最佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑。
2. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體。
3. 如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中，

   (B)該第二抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：SEQ ID NO：74-75、38、46-50任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該 CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

   較佳地，該CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：39、40、41所示；

   和/或，

   (C)該第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，該VH包含分別如SEQ ID NO：57、58和59所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含分別如SEQ ID NO：60、61和62所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4. 如請求項1至3中任一項所述的醫藥組成物，其中，

   (A)該第一抗原結合結構域包含：如SEQ ID NO：27、2、8-10、11-26、28-29任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

   較佳為SEQ ID NO：27或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

   和/或，

   (B)該第二抗原結合結構域包含：如SEQ ID NO：74-75、38、46-50任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

   較佳為SEQ ID NO：74、48任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。

   和/或，

   (C)該第三抗原結合結構域包含VH和VL，其中，

   該VH包含如SEQ ID NO：63-65中任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該VL包含如SEQ ID NO：67或66所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

   較佳為該VH包含SEQ ID NO：63或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：67或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
5. 如請求項4所述的醫藥組成物，其中該第三抗原結合結構域包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)；

   該HC序列為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該LC序列為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
6. 如請求項1至5中任一項所述的醫藥組成物，其中該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含：

   第一多肽鏈、和

   第二多肽鏈，

   其中，按從N端到C端順序：

   (I)第一多肽鏈是以下結構所示：[第一抗原結合結構域]-[連接子1]a-[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和

   第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

   (II)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和

   第二多肽鏈是以下結構所示：[第一抗原結合結構域]-[連接子3]c-[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

   (III)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc-[連接子4]d-[第一抗原結合結構域]，和

   第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或

   (IV)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和

   第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ-[連接子5]e-[第一抗原結合結構域]；

   其中，-表示肽鍵，

   該連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5可以相同，也可以不同；a、b、c、d、e視需要獨立地為0或1；

   較佳地，該連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5獨立地為(G_xS)_y，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；更佳地，獨立地為(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄任一所示的連接子。
7. 如請求項1至6中任一項所述的醫藥組成物，其中該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其選自以下的任一組：

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：76、52所示的胺基酸序列；

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：77、52所示的胺基酸序列；

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：70、52所示的胺基酸序列；

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：68、71所示的胺基酸序列；

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：72、52所示的胺基酸序列；

   該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：68、73所示的胺基酸序列；

   或，與該第一、第二多肽鏈的分別具有至少90%序列同一性的胺基酸序列組合；

   較佳地，該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白具有兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
8. 如請求項1至7中任一項所述的醫藥組成物，其中還包含表面活性劑，較佳地，該表面活性劑為聚山梨酯，更佳地，該表面活性劑為聚山梨酯80或聚山梨酯20，最佳地，該表面活性劑為聚山梨酯80。
9. 如請求項1至8中任一項所述的醫藥組成物，其中還包含糖類，較佳地，該糖類為蔗糖。
10. 如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物，其還包含其他胺基酸或其可藥用鹽，較佳地為精胺酸或其可藥用鹽，更佳地為精胺酸-鹽酸。
11. 如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物的pH為3.5-7，較佳地為4-6.5，更佳地為4.2-6.2，最佳地為4.5-6。
12. 如請求項1至11中任一項所述的醫藥組成物，其中該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白的濃度為0.01mg/mL-500mg/mL，較佳地為0.1mg/mL-400mg/mL，更佳地為0.5mg/mL-200mg/mL，最佳地為1mg/mL-150mg/mL。
13. 如請求項1至12中任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為0.1mM-50mM，較佳地為0.5mM-40mM，更佳地為1mM-30mM，最佳地為5mM-20mM。
14. 如請求項8至13中任一項所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑的濃度為0.01mg/mL-10mg/mL，較佳地為0.05mg/mL-5mg/mL，更佳地為0.1mg/mL-3mg/mL，最佳地為0.2mg/mL-2mg/mL。
15. 如請求項9至14中任一項所述的醫藥組成物，其中該糖類濃度為0.1%w/v-20%w/v，較佳地為1%w/v-15%w/v，更佳地為3%w/v-12%w/v，最佳地為5%w/v-10%w/v。
16. 如請求項10至15中任一項所述的醫藥組成物，其中該其他胺基酸或其可藥用鹽濃度為1mM-200mM，較佳地為5mM-170mM，更佳地為10mM-150mM，最佳地為15mM-120mM。
17. 一種醫藥組成物，其包含：

    如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    組胺酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    聚山梨酯；

    蔗糖；

    視需要地，該組成物進一步包含精胺酸或其可藥用鹽。
18. 如請求項17所述的醫藥組成物，其包含以下1)-13)中任一組：

    1)0.01mg/mL-500mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    0.1mM-50mM組胺酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    0.01mg/mL-10mg/mL聚山梨酯；

    0.1%w/v-20%w/v蔗糖；

    視需要地，該醫藥組成物進一步包含1mM-200mM精胺酸或其可藥用鹽；

    且該醫藥組成物的pH為3.5-7；

    2)0.1mg/mL-400mg/mL如請求項1至7任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    0.5mM-40mM組胺酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    0.05mg/mL-5mg/mL聚山梨酯；

    1%w/v-15%w/v蔗糖；

    視需要地，該醫藥組成物進一步包含5mM-170mM精胺酸或其可藥用鹽；

    且該醫藥組成物的pH為4-6.5；

    3)0.5mg/mL-200mg/mL如請求項1至7任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    1mM-30mM組胺酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    0.1mg/mL-3mg/mL聚山梨酯；

    3%w/v-12%w/v蔗糖；

    視需要地，該醫藥組成物進一步包含10mM-150mM精胺酸或其可藥用鹽；

    且該醫藥組成物的pH為4.2-6.2；

    4)1mg/mL-150mg/mL如請求項1至7任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    5mM-20mM組胺酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，更佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

    5%w/v-10%w/v蔗糖；

    視需要地，該醫藥組成物進一步包含15mM-120mM精胺酸或其可藥用鹽；

    且該醫藥組成物的pH為4.5-6；

    5)1-150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑或組胺酸醋酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或組胺酸-醋酸緩衝劑；

    0.2mg/mL-1mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為4.5-6；

    6)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

    約0.4mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5；

    7)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

    約0.4mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5.5；

    8)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

    約0.8mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5；

    9)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸鹽酸鹽緩衝劑，較佳地為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；

    約0.8mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5.5；

    10)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

    約0.4mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5；

    11)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

    約0.4mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5.5；

    12)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

    約0.8mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5；

    13)約10mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約50mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL或約150mg/mL如請求項1至7中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；

    約10mM組胺酸-醋酸緩衝劑；

    約0.8mg/mL聚山梨酯80；

    約8%w/v蔗糖；

    且該醫藥組成物的pH為約5.5。
19. 一種凍乾製劑，該凍乾製劑複溶後可形成如請求項1至18中任一項所述的醫藥組成物，或該凍乾製劑藉由將如請求項1至18中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
20. 一種複溶溶液，其中該複溶溶液是藉由將如請求項19所述的凍乾製劑經複溶製備獲得。
21. 一種製品，其包括容器，該容器中裝有如如請求項1至18中任一項所述的醫藥組成物，如請求項19所述的凍乾製劑，或如請求項20所述的複溶溶液。
22. 一種如請求項1至19中任一項所述的醫藥組成物、如請求項19所述的凍乾製劑或如請求項20的複溶溶液在製備治療癌症的藥物中的用途；較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。

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