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TW202434731A - 用於接種豬對抗假性狂犬病毒之方法 - Google Patents

用於接種豬對抗假性狂犬病毒之方法 Download PDF

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劉喬然
李海燕
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Abstract

本揭示提供一種減毒豬疱疹病毒1 ( suid　herpesvirus 1) (假性狂犬病毒)，其中其TK、gI及gE基因相對於親本野生病毒株經修飾，使得所得病毒安全且有效地用作活疫苗，保護豬類動物免受有毒性的假性狂犬病毒之攻擊。

Description

用於接種豬對抗假性狂犬病毒之方法
本發明總體上屬於針對假性狂犬病毒之疫苗領域。
假性狂犬病毒(PRV)為一種感染全世界多種動物之疾病。PRV感染有不同稱謂：感染性延髓麻痺、奧耶斯基氏病(Aujeszky's disease)及瘋癢病。PRV感染之臨床徵象包括母豬流產、高死亡率、仔豬及成年豬咳嗽、打噴嚏、發燒、便秘、抑鬱、癲癇發作、共濟失調、轉圈及流涎過多。小於一月齡之仔豬的死亡率接近100%，但一至六月齡之豬的死亡率低於10%。懷孕的豬可能會發生化胎或產下木乃伊胎、死胎或弱仔。在牛中，症狀包括劇烈搔癢，隨後出現神經病徵及死亡。在犬中，症狀包括劇烈搔癢、鄂部及咽部麻痺、嚎叫及死亡。任何經感染之第二宿主一般僅存活兩至三天。搔癢或發癢被視為幻覺，因為從未在搔癢部位發現病毒。
已知在重要的家畜，諸如豬、牛、犬、貓、綿羊、大鼠及貂中存在感染。宿主範圍非常廣泛且包括大多數哺乳動物，且至少在實驗上包括多種鳥類(有關宿主之詳細清單，參見D. P. Gustafson, 「Pseudorabies」, in Diseases of Swine, 第5版, A. D. Leman等人編, (1981))。然而，成年豬及可能的大鼠不會被該疾病殺死且因此為攜帶者。然而，對於其他物種，該疾病係致命的。
豬群尤其容易感染PRV。儘管成年豬很少表現出症狀或死於該疾病，但仔豬在受感染時病情會加重，且隨之通常會在24至48小時內死亡而往往無特定的臨床症狀(T. C. Jones及R. D. Hunt, Veterinary Pathology, 第5版, Lea & Febiger (1983))。
PRV係疱疹病毒。PRV基因體之特徵在於兩個獨特區域(UL及US)，其中US區域由內部及末端重複序列(分別為IRS及TRS)側接。整個PRV基因體之序列及基因排列係已知的，且已建立了可能的轉錄組織圖譜，且得到實驗資料之充分支持。反向重複序列之間的重組可產生兩種可能的基因體之異構物，其中US區域呈反定向。已鑑別70種不同基因之功能。關於PRV之通用生物學及其作用機制，參見Pomeranz等人, Microbiol . And Mol . Biol . Reviews205, 9月, 462-500。
PRV疫苗已藉由多種技術生產且在歐洲地方流行性區域中之疫苗接種已實踐超過15年。疫苗接種減少了損失，但疫苗接種已使病毒維持在環境中。暴露於有毒性的病毒之經接種之動物可能會在感染中存活下來且隨後排出毒性更強的病毒。因此，經接種之動物可能具有潛伏感染，該潛伏感染可能再次發作。(參見D. P. Gustafson, 見上文)。
PRV之減毒活及滅活疫苗在美國可商購且已經USDA批准(參見C. E. Aronson編, Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, (1983))。
PRV之減毒活及滅活疫苗在美國可商購且已經USDA批准(參見C. E. Aronson編, Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, (1983))。儘管如此，仍需要新穎PRV疫苗，尤其安全且有效的減毒活疫苗。
本申請案提供一種保護豬免受由感染性PRV引起之一或多種PRV感染之症狀的方法，該方法包含向豬投與包含經修飾之活假性狂犬病毒之疫苗，該經修飾之活假性狂犬病毒包含SEQ ID NO: 3之基因體或與其至少95%一致之核酸序列，其中該經修飾之活假性狂犬病毒包含UL23基因核苷酸480-846之缺失，且該感染性PRV屬於基因型I或基因型II譜系。
在某些實施例中，經修飾之活假性狂犬病毒之基因體包含gE基因及gI基因之缺失。在某些實施例中，在該經修飾之活PRV之基因體中，US1、US2及US9基因未經修飾。在最佳實施例中，該經修飾之活PRV之基因體為SEQ ID NO: 3。
在某些實施例中，一個劑量之該疫苗包含10 2TCID 50至10 7TCID 50。較佳地，該疫苗係肌肉投與。在一些實施例中，疫苗保護所免受之PRV症狀可選自以下之群：病毒排出、咳嗽、打噴嚏、發燒、便秘、抑鬱、癲癇發作、共濟失調、轉圈及流涎過多。
在較佳實施例中，在用本文所揭示之經修飾之活假性狂犬病疫苗接種六個月內，至少80%、或至少90%、或至少95%或100%之豬在暴露於該感染性PRV後避免PRV症狀。
在某些實施例中，經接種之豬為仔豬，該仔豬可為至少三週齡或至少7週齡或更大。
在其他實施例中，經接種之豬為母豬。在某些實施例中，母豬係懷孕的。在更特定實施例中，母豬處於妊娠2至3個月。在最佳實施例中，向懷孕母豬投與本文所揭示之活假性狂犬病毒疫苗不影響該懷孕母豬之分娩率、流產率或後代存活率。
以下定義及介紹性事項適用於本說明書中。
除非上下文另外指示，否則單數術語「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個參考物。類似地，除非上下文另外指示，否則字語「或」意欲包括「及」。字語「或」意謂特定清單中之任一個成員且亦包括該清單之成員的任何組合。
術語「佐劑」係指增強疫苗有效性且可添加至包括免疫藥劑之調配物中的化合物。佐劑提供增強的免疫反應，甚至在投與僅單次劑量之疫苗之後。佐劑可包括例如胞壁醯二肽、吡啶、氫氧化鋁、二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDA)、油、水包油乳液、皂素、細胞介素及此項技術中已知的其他物質。適合佐劑之實例描述於美國專利申請公開案第US2004/0213817 A1號中。「有佐劑」係指併入佐劑或與佐劑組合的組合物。
「抗體」係指多株抗體及單株抗體、嵌合抗體及單鏈抗體，以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表現庫之產物。對於抗體而言，術語「免疫特異性」係指結合至所關注蛋白質之一或多個抗原決定基的抗體，但其實質上不識別及結合含有抗原性生物分子之混合群體之樣品中的其他分子。
如本文所用，「減毒」PRV係指能夠在易感宿主中感染及/或複製但對於易感宿主無病原性或病原性較弱的PRV。舉例而言，與相關現場分離之病毒株相比，減毒病毒不會引起可觀測/可偵測的臨床表現，或引起的臨床表現更少或嚴重臨床表現更少，或展現的病毒複製效率及/或感染性降低。PRV感染之臨床表現可包括(但不限於)仔豬及成年豬咳嗽、打噴嚏、發燒、便秘、抑鬱、癲癇發作、共濟失調、轉圈及流涎過多。
「抗原決定基」為具免疫活性之抗原決定子，其意義在於向宿主投與之後，其可引起體液型(B細胞)及/或細胞型(T細胞)之免疫反應。此等物為分子上具抗原性的特定化學基團或肽序列。抗體特異性結合多肽上之特定抗原性抗原決定基。在動物中，大部分抗原將同時呈遞若干個或甚至許多個抗原決定子。此類多肽亦可適合作為免疫原性多肽且可如另外所描述來鑑別抗原決定基。
出於本發明之目的，第二聚核苷酸分子(RNA或DNA)之核苷酸序列與第一聚核苷酸分子之核苷酸序列「一致」，其中基於遺傳密碼之簡併，或當第二聚核苷酸分子之核苷酸序列編碼與由第一聚核苷酸分子之核苷酸序列編碼之聚胺基酸足夠類似的聚胺基酸時，其編碼與第一聚核苷酸分子之核苷酸序列相同的聚胺基酸。一般而言，若基於BLASTN演算法(美國國立衛生研究院(the United States National Institute of Health)之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)，亦稱為NCBI，(Bethesda, Md., USA))，第二聚核苷酸分子之核苷酸序列與第一聚核苷酸分子之核苷酸序列具有至少約85%核苷酸序列一致性，則其與第一聚核苷酸分子之核苷酸序列一致。在根據本發明之實踐進行計算的一個特定實例中，參考BLASTP 2.2.6 [Tatusova TA及TL Madden, 「BLAST 2 sequences--a new tool for comparing protein and nucleotide sequences.」 (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]。簡言之，使用空位開放罰分10、空位延伸罰分0.1以及Henikoff及Henikoff之「blosum62」評分矩陣來比對兩個胺基酸序列以使比對分數最佳化(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 325 89:10915-10919. 1992)。接著如下計算一致性百分比：一致匹配之總數×100/除以較長序列之長度+為了比對兩個序列而引入較長序列中之空位數。
術語「經分離」係用於指示細胞、肽或核酸與其原生環境分離。經分離之肽及核酸可為實質上純的，亦即，基本上不含其在自然界中可能存在之其他物質。
片語「缺乏功能蛋白」意謂與由未經修飾之基因編碼的蛋白質相比，由經修飾之基因編碼的蛋白質之量及/或活性降低至少95%。在某些態樣中，由經修飾之基因編碼的蛋白質之量及/或活性降低至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%、或至少99.5%或至少99.9%。在某些態樣中，完全消除由經修飾之基因編碼的蛋白質之量及/或活性。
「醫藥學上可接受之載劑」意謂醫藥學上可接受之任何習知載劑、媒劑或賦形劑，其在此項技術中用於生產及投與疫苗。醫藥學上可接受之載劑通常為無毒、惰性的固體或液體載劑。
術語「豬科動物」及「豬(swine)」在本文中可互換使用且係指作為豬科成員之任何動物，諸如豬(pig)。
如本文所用，「易感」宿主係指可經PEDV感染之細胞或動物。當引入易感動物時，減毒的PEDV亦可誘導針對PEDV或其抗原之免疫反應，且藉此使得動物具有針對PEDV感染之免疫力。
術語「疫苗」係指一種抗原性製劑，其係用於產生針對疾病之免疫力，以便預防或改善感染影響。疫苗通常係使用免疫學上有效量之免疫原與有效增強所接種個體針對免疫原之免疫反應之佐劑的組合來製備。
疫苗調配物將含有「治療有效量」之活性成分，亦即，能夠在投與該組合物之個體中誘導免疫保護反應的量。舉例而言，治療及預防PEDV疾病時，「治療有效量」較佳為增強所接種個體對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重程度的量。此類保護作用的證明為經PRV感染之個體通常所呈現之症狀的減少或缺乏、更快的恢復時間及/或降低的病毒顆粒計數。可在感染之前投與疫苗，作為針對PRV之預防性措施。或者，可在個體已感染疾病之後投與疫苗。暴露於PRV之後給與疫苗能夠減輕疾病，從而引發比天然感染本身更優的免疫反應。
本揭示提供一種PRV之減毒株，其當在疫苗中使用時安全且有效且保護豬免受有毒性的PRV病毒株攻擊。在某些態樣中，相對於親本野生病毒株，PRV之減毒株包含胸苷激酶(TK)、醣蛋白I (gI)及醣蛋白E (gE)基因之修飾。
適合之親本病毒株包括(但不限於) FS18 (SEQ ID NO: 1)；病毒株JS2012 (SEQ ID NO: 2)；病毒株TJ (GenBank登錄號KJ789182)；病毒株HeN1 (GenBank登錄號KP098534)；病毒株HLJ8 (GenBank登錄號KT824771)；病毒株HN1201 (GenBank登錄號KP722022)。其他適合之病毒株為由核苷酸序列編碼之病毒株，該核苷酸序列與全長SEQ ID: NO: 1或SEQ ID NO: 2至少85%一致(亦即，至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.2%一致、至少99.4%一致、至少99.6%一致、至少99.8%一致、至少99.9%一致)。
在某些態樣中，如先前段落中所述，親本病毒株與SEQ ID NO: 1或2至少85%一致，且亦至少一半(例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%)之不同鹼基產生編碼類似胺基酸之密碼子，亦即，以保守胺基酸取代。此類某些保守胺基酸取代一般不被認為使總體蛋白質功能不活化：諸如關於帶正電的胺基酸(且反之亦然)、離胺酸、精胺酸及組胺酸；關於帶負電的胺基酸(且反之亦然)、天冬胺酸及麩胺酸；及關於中性帶電荷胺基酸之某些群組(及在所有情況下，反之亦然)：(1)丙胺酸及絲胺酸；(2)天冬醯胺酸、麩醯胺酸及組胺酸；(3)半胱胺酸及絲胺酸；(4)甘胺酸及脯胺酸；(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸；(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸；(7)苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸；(8)絲胺酸及蘇胺酸；(9)色胺酸及酪胺酸；(10)及例如酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。胺基酸可根據物理特性以及對二級及三級蛋白質結構之貢獻進行分類。因此，認為保守取代在此項技術中為一種胺基酸以另一種具有類似特性之胺基酸的取代，且例示性保守取代可見於WO 97/09433, 第10頁, 1997年3月13日公佈(PCT/GB96/02197, 1996年9月6日申請)中。或者，保守胺基酸可如Lehninger, (Biochemistry, 第二版; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), 第71-77頁)中所描述進行分類。可使用Vector NTI Advance 11.5及CLUSTAL 2.1多重序列比對來比對蛋白質序列。如本文所用，特定胺基酸或核苷酸序列之敍述應包括核酸序列之所有靜默突變及胺基酸序列之任何及所有經保守修飾之變異體。
假性狂犬病毒之gI、gE及TK蛋白之序列及功能係已知的。胸苷激酶係由UL23基因編碼且參與核苷酸合成。醣蛋白I及E分別為由US7及US8基因編碼之病毒體蛋白。Pomeranz等人揭示gI及gE彼此複合。出於本揭示之目的，基因UL23、US7及US8可分別稱為「TK基因」、「gI基因」及「gE基因」。
在某些實施例中，PRV之減毒株進一步包含US1、US2及US9基因中之一或多者(亦即，一者、兩者或所有三者)之修飾。此等基因分別編碼RSp40/ICP22、11K及28K蛋白。在某些實施例中，US2及US9基因中之至少一者未經修飾。因此，舉例而言，病毒可包含未經修飾之US2、經修飾之US9及經修飾或未經修飾之US1。或者，病毒可包含未經修飾之US9、經修飾之US2及經修飾或未經修飾之US1。
在某些其他實施例中，在本發明之PRV之減毒株中，US1、US2及US9基因未經修飾。
Pomeranz等人揭示US1編碼RSp40/ICP22蛋白。RSp40/ICP22蛋白為一種當前尚不清楚其在PRV中之功能的蛋白質，但Pomeranz揭示其HSV-1同源物充當基因表現之調節因子。US2編碼存在於病毒之外殼中的蛋白質。US9編碼參與軸突中之蛋白質分選且充當II型尾部錨定膜蛋白的包膜蛋白。
編碼TK、gI及gE蛋白之基因的修飾以及視情況選用之US1、US2及US9基因之修飾產生缺乏由此等基因表現之功能蛋白的病毒。
舉例而言，在某些態樣中，缺乏功能gE蛋白之本發明病毒可藉由多種方式製備。舉例而言，吾人可將終止密碼子引入編碼gE蛋白之ORF的近端部分。在不同實施例中，可在N端10個胺基酸或更少，例如9、8、7、6、5、4、3或2個N端胺基酸之後引入終止密碼子。在其他實施例中，可改變轉錄起始位點使得轉錄不起始。在其他實施例中，編碼gE蛋白之ORF中的所有核苷酸均缺失。
本發明之病毒亦缺乏功能gI蛋白。在某些實施例中，至少核苷酸269-1101自編碼gI蛋白之1101-核苷酸-ORF中缺失。在某些實施例中，缺失起始於核苷酸269之上游，例如在核苷酸250、200、150、100、50或甚至更上游處。在某些實施例中，所有1101個核苷酸均缺失。在某些實施例中，在位置269處或其上游引入終止密碼子，而不引入讀框轉移突變。
本發明之病毒亦具有編碼TK蛋白的經修飾之US23基因。UL23基因具有963個核苷酸長的ORF。在某些態樣中，此963個核苷酸長的ORF缺乏至少一個(或至少兩個、或至少三個或所有四個)子序列，該至少一個子序列係選自由此963個核苷酸長的ORF之核苷酸526-607、480-846、280-723及364-615定義之序列。當然，亦可存在更長的缺失，例如由將併入所有四個子序列之位置280-846定義之缺失，或由將含有兩個子序列之位置300-650定義之缺失等。或者，ORF之所有963個核苷酸可均缺失。或者，可在位置526之上游、或位置364之上游或位置480之上游或位置280之上游等處引入終止密碼子(而不引起讀框轉移)。在某些態樣中，轉錄起始位點之突變亦為可能的。
對US1、US2及US9基因中之任一者的視情況選用之修飾較佳使得所得病毒缺乏由經修飾之基因編碼的蛋白質。適合之突變包括基因缺失、插入、取代等。如上文所描述，可引入讀框轉移突變，由此產生與由未經修飾之基因編碼的蛋白質具有最小相似性的蛋白質。框內突變可包括將終止密碼子引入基因之近端部分(例如在N端20、15、10、5、3個胺基酸內)，或轉錄起始位點之突變，使得對應ORF不經轉錄。
在某些態樣中，本發明之減毒病毒具有與SEQ ID NO: 1或2至少85%一致之基因體且具有以下修飾： a) 至少90% (至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之編碼gI蛋白之ORF； b) 至少90% (至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之編碼gE蛋白之ORF； c) 編碼TK蛋白之ORF缺乏至少一個(亦即，至少兩個、至少三個或所有四個)子序列，該至少一個子序列係由此963個核苷酸長的ORF之位置526-607、480-846、280-723及364-615處之核苷酸定義。
在某些其他態樣中，經修飾之活病毒係由SEQ ID NO: 3或與其至少85%一致之序列編碼，其限制條件為編碼病毒之序列包含對UL23基因(編碼TK)、US7基因(編碼gI)、US8基因(編碼gE)之修飾。根據本發明之此態樣的一些經修飾之活病毒可包含未經修飾之US1、US2及US9基因。根據本發明之此態樣的一些其他經修飾之活病毒進一步包含上文所描述之對US1、US2及US9基因之視情況選用之修飾，例如經修飾之US2、未經修飾之US9及經修飾或未經修飾之US1或經修飾之US9、未經修飾之US2及經修飾或未經修飾之US1。在另一態樣中，此等基因(US1、US2、US9)中之所有三者均經修飾。
以使得所得病毒缺乏基因編碼之功能蛋白的方式修飾基因的方法為熟知的。此等方法包括(但不限於)完全或部分缺失、框移突變、核苷酸置換或插入。舉例而言，吾人可修飾調節基因之啟動子或轉錄起始位點。或者(或另外)，吾人可將產生過早終止密碼子之突變插入編碼序列中。其他適合之方法在一般熟習此項技術者之專門知識內。
上文所描述之修飾可藉由多種方法引入病毒之基因體中，該等方法包括(但不限於)靶向突變誘發及同源重組。
此技術之第一步驟包括建構與PrV 基因體DNA重組之重組DNA分子。此類重組DNA分子可來源於任何適合之質體、黏質體或噬菌體，質體為最佳的，且包含PrV DNA之片段，該PrV DNA之片段含有上文所定義之PrV基因體之一部分的DNA。上文所定義之PrV基因體之一部分的DNA序列較佳側接應具有適當長度(例如50-3000 bp)之PrV核酸序列，以允許與病毒PrV基因體發生活體內同源重組。
以此方式獲得之重組DNA分子適用於將突變引入PrV基因體中。
接著，在上文所描述之重組DNA分子存在下，細胞(例如豬腎細胞或Vero細胞)可經PrV DNA轉染或經野生型PrV感染，藉此在重組DNA分子中之序列與PrV基因體中之對應序列之間發生重組。
亦可藉由用含有突變序列之核酸序列共轉染細胞來誘導重組，該突變序列由適當的側接PrV序列側接，而非質體序列側接。隨後在細胞培養物中重組病毒後代產生且可例如根據基因型或表現型進行選擇。另一可能性為偵測突變所定位之核酸序列編碼的多肽之不存在。以相同方式，可偵測由經插入之異源核酸序列編碼之多肽的存在。亦可根據對諸如新黴素(neomycin)、健大黴素(gentamycin)或黴酚酸(mycophenolic acid)之化合物的抗性來積極選擇重組病毒。
所選擇之重組PrV可在細胞培養物中大規模培養，之後可收集其中含有重組PrV之物質或由該PrV表現之異源多肽。
作為重組DNA技術之替代或補充，細胞培養傳代與單株富集及單株選擇組合可用於製備本發明之病毒。舉例而言，可選擇其中一個基因(例如gI或gE)中具有缺失之純系用於進一步繁殖，且已知TK天然基因缺失突變體可能由病毒複製缺陷引起。
適合之細胞株包括(但不限於)豬睾丸細胞株ST、豬腎細胞株PK-15或MRS-2、兔腎細胞株RK、非洲綠猴腎細胞株Vero、猴胚胎腎上皮細胞株Marc-145、牛腎細胞株MDBK、牛睾丸細胞株BT、雞胚胎纖維母細胞(CEF)及幼倉鼠腎細胞株BHK-21。在一個較佳實施例中，適合之細胞株為Vero (ATCC CCL-81)。
將免疫學上有效量之本發明疫苗向需要保護免受病毒感染之豬投與。接種豬之免疫學上有效量或免疫原性量可藉由常規測試容易地確定或容易地滴定。有效量為達到對疫苗之足夠免疫反應以保護暴露於PRV病毒之豬的量。較佳地，豬受到保護至病毒疾病之不良生理學症狀或影響之一至全部均顯著減少、改善或完全預防的程度。
本發明之疫苗可遵循公認的定則調配以包括動物可接受之載劑，諸如標準緩衝液、穩定劑、稀釋劑、防腐劑及/或增溶劑，且亦可經調配以促進持續釋放。稀釋劑包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等張性添加劑尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白。其他適合之疫苗媒劑及添加劑，包括尤其適用於調配經修飾之活疫苗的彼等物，對於熟習此項技術者為已知或將顯而易見的。參見例如Remington's Pharmaceutical Science, 第18版, 1990, Mack Publishing，其以引用之方式併入本文中。
本發明之疫苗可為無佐劑的。或者，本發明之疫苗可進一步包含一或多種額外免疫調節組分，尤其諸如佐劑或細胞介素。可用於本發明之疫苗中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc., Hamilton, Mont.)；明礬；礦物凝膠，諸如氫氧化鋁凝膠；水包油乳液、油包水乳液，諸如弗氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvants)；嵌段共聚物(CytRx, Atlanta Ga.)；QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.)；SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.)；AMPHIGEN®佐劑；皂素、Quil A或其他皂素溶離份；單磷醯基脂質A；離子性多醣；以及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。適用於本發明之疫苗的水包油乳液之非限制性實例包括經修飾之SEAM62及SEAM 1/2調配物。經修飾之SEAM62為一種水包油乳液，其含有5% (v/v)角鯊烯(Sigma)、1% (v/v) SPAN® 85清潔劑(ICI界面活性劑)、0.7% (v/v) TWEEN® 80清潔劑(ICI界面活性劑)、2.5% (v/v)乙醇、200 μg/ml Quil A、100 μg/ml膽固醇以及0.5% (v/v)卵磷脂。經修飾之SEAM 1/2為一種水包油乳液，其包含5% (v/v)角鯊烯、1% (v/v) SPAN® 85清潔劑、0.7% (v/v) Tween 80清潔劑、2.5% (v/v)乙醇、100 μg/ml Quil A以及50 μg/ml膽固醇。可包括於疫苗中之其他免疫調節劑包括例如一或多種介白素、干擾素或其他已知細胞介素。
其他佐劑系統允許實現T輔助細胞與B細胞抗原決定基之組合，產生一或多種類型之共價T-B抗原決定基連接結構，其可另外進行脂質化，諸如WO2006/084319、WO2004/014957及WO2004/014956中所描述之彼等物。
在本發明之一個較佳實施例中，ORFI PEDV蛋白質或其他PEDV蛋白質或其片段係用5% AMPHIGEN®調配，如下文中所論述。 佐劑組分
本發明之疫苗組合物可包括佐劑或可不包括佐劑。特定言之，當基於經口感染性病毒時，本發明之經修飾之活疫苗可在無佐劑之情況下與無菌載劑一起使用。可用於經口投與之佐劑包括基於CT樣免疫調節劑之佐劑(rmLT、CT-B，亦即，大腸桿菌(E. coli)之重組突變體熱不穩定性毒素、霍亂毒素(Cholera toxin)-B次單元)；或經由用聚合物及海藻酸鹽囊封，或用黏膜黏著劑，諸如聚葡萄胺糖囊封，或經由脂質體囊封。有佐劑或無佐劑之較佳疫苗劑量在最小保護劑量下透過疫苗釋放可提供每劑量約10 log 10TCID 50與約10 6log 10TCID 50之間或更高的病毒。「TCID 50」係指「組織培養感染劑量」且定義為感染50%給定批次的接種細胞培養物所需之病毒稀釋度。可使用多種方法來計算TCID 50，該等方法包括在本說明書通篇中採用的斯皮爾曼-卡勃方法(Spearman-Karber method)。關於斯皮爾曼-卡勃方法之描述，參見B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, 第25-46頁(1996)。佐劑(若存在)可以乳液形式提供，若選擇非經口投與，則更常見，但起始效價不應降低超過0.7個對數(80%降低)。
在一個實例中，佐劑組分由輕質礦物油中之卵磷脂與氫氧化鋁組分之組合來提供。關於AMPHIGEN® (作為代表性卵磷脂/礦物油組分)之組合物及調配物之細節如下。
較佳的佐劑可以於緩衝溶液中之2 ML劑量提供，該緩衝溶液進一步包含約5% (v/v) REHYDRAGEL® (氫氧化鋁凝膠)及約25% (v/v)最終濃度之「20% AMPHIGEN®」。AMPHIGEN®一般描述於美國專利第5,084,269號中且提供溶解於輕質油中之脫油卵磷脂(較佳大豆)，接著將其分散於抗原之水溶液或懸浮液中作為水包油乳液。Amphigen已根據美國專利第6,814,971號(參見其第8-9欄)之方案改良，以提供所謂「20% Amphigen」組分用於本發明之最終有佐劑之疫苗組合物中。因此，10%卵磷脂及90%載劑油(DRAKEOL®, Penreco, Karns City, Pa.)之儲備混合物係用0.63%磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液以1:4稀釋，藉此將卵磷脂及DRAKEOL®組分分別減少至2%及18% (亦即，其初始濃度之20%)。向組合物中添加Tween 80及Span 80界面活性劑，其中代表性且較佳的最終量為5.6% (v/v) TWEEN®80及2.4% (v/v) SPAN®80，其中SPAN®最初以儲備液DRAKEOL®組分提供且TWEEN®最初由緩衝生理鹽水組分提供，使得生理鹽水及DRAKEOL®組分之混合物產生最終所需的界面活性劑濃度。DRAKEOL®/卵磷脂及生理鹽水溶液之混合可使用In-Line Slim乳化設備(型號405，Charles Ross and Son, Hauppauge, N.Y., USA)完成。
疫苗組合物亦包括REHYDRAGEL® LV (儲備物質中約2%氫氧化鋁含量)作為額外佐劑組分(可獲自Reheis, N.J., USA及ChemTrade Logistics, USA)。在使用0.63% PBS進一步稀釋之情況下，最終疫苗組合物每2 ML劑量含有以下組成量；5% (v/v) REHYDRAGEL® LV；25% (v/v)之「20% Amphigen」，亦即，其進一步進行4倍稀釋；及0.01% (w/v)之硫柳汞(merthiolate)。
如此項技術中所理解，可改變組分之添加順序以提供等效的最終疫苗組合物。舉例而言，可在緩衝液中製備適當的病毒稀釋液。隨後可添加適量REHYDRAGEL® LV (約2%氫氧化鋁含量)儲備溶液且進行摻合，以便使實際最終產物中之REHYDRAGEL® LV濃度達到所需的5% (v/v)。一經製備，則將此中間儲備物與適量的「20% Amphigen」儲備液(如上文大體上所描述，且已含有必要量之Tween 80及Span 80)組合，由此再次獲得具有25% (v/v)之「20% Amphigen」之最終產物。可最終添加適量的10%硫柳汞。
本發明之疫苗組合物允許所有成分發生變化，使得抗原之總劑量與上述抗原劑量相比較佳可改變100倍(上調或下調)，且最佳改變10倍或更少(上調或下調)。類似地，界面活性劑濃度(不論TWEEN®或SPAN®)可彼此獨立地改變高達10倍，或其可完全缺失，且用適當濃度之類似物質替換，如此項技術中所充分瞭解。
最終產物中之REHYDRAGEL®濃度可首先藉由使用可獲自許多其他製造商(亦即，ALHYDROGEL®, Brenntag；丹麥)之等效物質，或藉由使用REHYDRAGEL®產品系列之額外變化，諸如CG、HPA或HS而改變。使用LV作為實例，其最終使用濃度包括0%至20%，其中2-12%為更佳且4-8%為最佳。類似地，雖然AMPHIGEN®之最終濃度(以「20% Amphigen」之%表示)較佳為25%，但此量可為5-50%不等，較佳為20-30%且最佳為約24-26%。
根據本發明之實踐，本發明之佐劑調配物中所用之油較佳為礦物油。如本文所用，術語「礦物油」係指經由蒸餾技術自石蠟脂獲得之液態烴之混合物。該術語與「液化石蠟」、「液體石蠟脂」及「白色礦物油」同義。該術語亦意欲包括「輕質礦物油」，亦即，類似地藉由石蠟脂之蒸餾獲得，但比重略低於白色礦物油的油。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版(Easton, Pa.: Mack Publishing公司, 1990, 第788頁及第1323頁)。礦物油可自各種商業來源獲得，例如J. T. Baker (Phillipsburg, Pa.)、USB公司(Cleveland, Ohio)。較佳礦物油為可以名稱DRAKEOL®商購之輕質礦物油。
本發明之免疫原性及疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2005, Lippincott Williams)，其呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者係無毒的，且可包含緩衝液，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如汞((鄰羧基苯基)硫基)乙基鈉鹽(THIOMERSAL®)、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)、TWEEN®或PLURONICS®。
本發明之疫苗可視情況經調配用於持續釋放本發明之病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體。此類持續釋放型調配物之實例包括病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體與生物相容性聚合物(諸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、玻尿酸、膠原蛋白及其類似物)之複合物的組合。藥物遞送媒劑中可降解聚合物之結構、選擇及使用已綜述於若干出版物中，包括A. Domb等人, 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292，該文獻以引用之方式併入本文中。關於在醫藥調配物中選擇及使用聚合物之額外指導可見於此項技術中已知之文本中，例如M. Chasin及R. Langer (編), 1990, 「Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems」 in Drugs and the Pharmaceutical Sciences, 第45卷, M. Dekker, NY，該文獻亦以引用之方式併入本文中。或者或另外，病毒、質體或病毒載體可經微囊封以改良投與及功效。用於微囊封抗原之方法為此項技術中熟知的，且包括例如以下文獻中所描述之技術：美國專利第3,137,631號；美國專利第3,959,457號；美國專利第4,205,060號；美國專利第4,606,940號；美國專利第4,744,933號；美國專利第5,132,117號；及國際專利公開案WO 95/28227，該等文獻皆以引用之方式併入本文中。
脂質體亦可用於提供病毒、質體、病毒蛋白質或病毒載體之持續釋放。關於如何製備及使用脂質體調配物之細節尤其可見於美國專利第4,016,100號；美國專利第4,452,747號；美國專利第4,921,706號；美國專利第4,927,637號；美國專利第4,944,948號；美國專利第5,008,050；以及美國專利第5,009,956中，該等文獻皆以引用之方式併入本文中。
任何上述疫苗之有效量可藉由習知方式確定，自低劑量的病毒、病毒蛋白質質體或病毒載體起始，且接著增加劑量，同時監測效果。可在單次投與疫苗之後或在多次投與疫苗之後獲得有效量。確定每隻動物之最佳劑量時，可考慮已知因素。此等因素包括動物之物種、體型、年齡及一般狀況、動物中其他藥物之存在及其類似因素。較佳在考慮其他動物研究之結果之後選擇實際劑量。
偵測是否已達成足夠免疫反應的一種方法為在疫苗接種之後測定動物中的血清轉化及抗體效價。疫苗接種之時機及加打次數(若存在)較佳將由醫生或獸醫基於所有相關因素之分析來確定，其中一些因素已描述如上。
在與豬之接種相關的本發明之一個較佳實例中，動物之最佳年齡目標係在約1天與21天之間，在斷奶前，此亦可與其他計劃的疫苗接種相對應，諸如針對豬肺炎支原體( Mycoplasma Hyopneumoniae)或豬繁殖與呼吸症候群病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus)。另外，育種母豬之較佳疫苗接種時程包括類似劑量，及每年再接種時程。 給藥
在一個尤其較佳實施例中，揭示一種保護豬免受由感染性PRV引起之一或多種PRV感染之症狀的方法，該方法包含向豬投與包含經修飾之活假性狂犬病毒之疫苗，該經修飾之活假性狂犬病毒包含SEQ ID NO: 3之基因體或與其至少95%一致之核酸序列，其中該經修飾之活假性狂犬病毒包含UL23基因核苷酸480-846之缺失，且該感染性PRV屬於基因型I或基因型II譜系。
劑量之實際量取決於疫苗之調配方式，其中實際給藥量在0.05至5 ML之範圍內，亦考慮動物之體型。單次劑量疫苗接種亦為適當的。疫苗中假性狂犬病毒之量為每劑量10 2TCID 50至10 8TCID 50，較佳每劑量10 2TCID 50至10 7TCID 50，或更佳每劑量10 3 . 5TCID 50至10 5 . 5TCID 50。投與途徑可變化，且疫苗投與之較佳途徑為肌肉內投與。
在不同實施例中，該一或多種症狀係選自以下之群：病毒排出、咳嗽、打噴嚏、發燒、便秘、抑鬱、癲癇發作、共濟失調、轉圈及流涎過多。
經修飾之活假性狂犬病毒可針對廣泛的感染性PRV病毒株(諸如PRV病毒株FS21PF1115、或PRV病毒株AV25或PRV病毒株Rong A)進行交叉保護。
較佳臨床指示為育種母豬與分娩前小母豬之治療、控制及預防，隨後對仔豬進行疫苗接種。在一個代表性實例(適用於母豬及小母豬)中，使用單次劑量之疫苗，但當然若需要，亦設想兩次劑量疫苗接種方案。在某些實施例中，在用包含該經修飾之活假性狂犬病毒之該疫苗接種六個月內，至少80%之豬在暴露於該感染性PRV後避免PRV症狀。
應注意，仔豬接著可早在生命之第1天接種。舉例而言，仔豬可在第1天接種，在3週齡時接種或不接種加打劑量，尤其若親本母豬雖然在育種前已接種，但在分娩前未接種時。若親本母豬先前由於天然或計劃感染而不為初始動物，則仔豬疫苗接種亦可為有效的。當母豬先前既未暴露於病毒，亦未在分娩前接種時，對仔豬接種疫苗亦可能為有效的。
在其他實施例中，豬為三週至約七週齡之仔豬，例如三週齡仔豬、四週齡仔豬、五週齡仔豬、六週齡仔豬或七週齡仔豬。在大齡仔豬，例如七週齡仔豬中，疫苗提供100%保護。
在另一組實施例中，豬為母豬，較佳為懷孕的母豬。最佳地，懷孕母豬處於妊娠2至3個月。本文所描述之疫苗在向懷孕母豬投與時不影響該懷孕母豬之分娩率、流產率或後代的存活率。
公豬(通常為育種目的而飼養)應每6個月接種一次。劑量之變化完全屬於此項技術之實踐範圍內。應注意，本發明之疫苗安全用於懷孕動物(所有三月期(trimesters))及新生豬。本發明之疫苗減毒至甚至最敏感動物，再包括新生豬，亦可接受的安全水平(亦即無死亡，新生豬僅短暫輕度臨床徵象或正常徵象)。當然，由保護豬群免受PRV流行病及持續低水平PRV發生之角度來看，母豬持續接種疫苗之規劃非常重要。應瞭解，經PRV MLV免疫之母豬或小母豬被動地將免疫力轉移至仔豬，包括PRV特異性IgA，將保護仔豬免受PRV相關疾病及死亡。另外，一般而言，經PRV MLV免疫之豬將減少PRV量及/或持續時間或受到保護而不排出PRV於糞便中，且另外，經PRV MLV免疫之豬將受到保護而免於PRV之臨床症狀，包括(但不限於)死亡、PRV之繁殖、神經及呼吸表現，且另外，PRV MLV將有助於停止或控制PEDV傳播週期。
亦應注意，接種本發明疫苗之動物對於人類食用亦立即為安全的，而無任何顯著的屠宰制止，諸如21天或更短。
當以治療提供時，在偵測到實際感染徵象時，提供有效量的疫苗。若投與組合物可為接受者所耐受，則該組合物稱為「藥理學上可接受的」。若投與量係生理學上顯著的，則將此組合物稱為以「治療或預防有效量」投與。
至少一種本發明之疫苗或免疫原性組合物可藉由實現預期目的之任何方式，使用本文所描述之醫藥組合物投與。舉例而言，此類組合物之投與途徑可為非經腸、經口、口鼻、鼻內、氣管內、局部、皮下、肌肉內、經皮、皮內、腹膜內、眼內及靜脈內投與。在本發明之一個實施例中，組合物係肌肉內投與。非經腸投與可藉由推注注射或藉由隨時間推移逐漸灌注進行。可使用任何適合之裝置來投與組合物，包括注射器、滴管、無針注射裝置、貼劑及其類似裝置。選擇使用的途徑及裝置將視佐劑之組成、抗原及個體而定，且此已為熟習此項技術者所熟知。較佳經口或皮下投與。經口投與可為直接的、經由水或飼料(固體或液體飼料)。當以液體形式提供時，疫苗可藉由重構而凍乾，或作為糊劑提供，用於直接添加至飼料中(拌種機內或頂部混合)或以其他方式添加至水或液體飼料中。
以下實例意欲說明上述發明且不應理解為縮窄其範疇。熟習此項技術者將容易地認識到，實例提出可實踐本發明之許多其他方式。應理解，可進行眾多變化及修改，同時保持在本發明之範疇內。 實例 1
將對於PRV抗原及抗體呈陰性之仔豬分配至組中，其中各組中有7隻仔豬。為仔豬提供商業飲食且讓其隨意取水。
將病毒株M1707 (包含SEQ ID NO: 3，且其中編碼TK之UL23基因之核苷酸480-846缺失)與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)一起調配。
將第二組豬接種病毒株Bartha K61。將第三組豬接種DMEM。疫苗接種方法為在頸部肌肉內注射。處理組之接種量均為每隻仔豬1 mL。在接種之後，每天進行臨床觀測，包括量測豬之直腸溫度。 表 1
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 7 3至4週齡 M1707病毒株 ＞10 6.5TCID 50，1 ml
T02 7 7週齡 M1707病毒株 ＞10 6.5TCID 50，1 ml
T03 7 7週齡 M1707病毒株 ＞10 6.5TCID 50，1 ml
T04 7 7週齡 Bartha K61病毒株 ＞10 6.5TCID 50，1 ml
T05 7 7週齡 DMEM 1 ml
資料顯示，F35實驗室產品水平下之病毒株M1707對於3至4週齡仔豬(7隻豬接受處理)以及每隻豬接受＞10 6 . 5TCID 50且用3種不同批次實驗室產品處理的7週齡目標年齡仔豬(14隻豬接受處理)係安全的。包括對照豬在內的所有豬之體溫均正常，在14天之觀測期內無臨床徵象顯示。 實例 2
將PRV抗原及抗體呈陰性之仔豬分組，其中各組中有7隻仔豬。為仔豬提供商業飲食且讓其隨意取水。
製備PRV病毒株M1707之三個批次(批次A、批次B及批次C)。將該病毒與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素一起調配。
屬於T01至T03組之豬在第0天用每劑量10 5 . 0TCID 50之量的其中一批調配物進行處理，肌肉內注射。T04豬接種市售疫苗Bartha K61；T05豬接種市售疫苗C；T06豬接種DMEM。在接種之後，每天量測豬之直腸溫度。臨床症狀之觀測發現，在21天之觀測期內，所有豬體溫正常、食慾良好、精神狀態正常、無呼吸及胃腸症狀且無神經症狀。在第21天，三個接種組及對照組鼻內用2 mL (10 50TCID 50)病毒株FS21PF1115攻擊。
保護作用係根據症狀之嚴重程度(或不存在)來確定。結果顯示，T01/T02/T03/T05組中之所有豬受到保護，且T04組中之一隻豬發病。在對照組(T06)中，5隻豬中有0隻受到保護且全部被確認發病。 表 2
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 5 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T02 5 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T03 5 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T04 5 7週齡 Bartha-K61病毒株 1次劑量，2 ml
T05 5 7週齡 C病毒株 1次劑量，2 ml
T06 5 7週齡 DMEM 1 ml
第0天，T01至T03豬用每劑量10 5 . 0TCID 50之量的其中一批調配物進行處理，肌肉內注射。T04至T05豬用每劑量2 ml處理，肌肉內注射。T06對照組僅用DMEM處理。在接種之後，每天量測豬之直腸溫度。臨床症狀之觀測發現，在21天之觀測期內，所有豬體溫正常、食慾良好、精神狀態正常、無呼吸及胃腸症狀且無神經症狀。所有組在第21天鼻內用2 ml (10 50TCID 50)病毒株FS21PF1115攻擊。
保護作用係根據症狀之嚴重程度(或不存在)來確定。在經病毒株M1707免疫之三個組中，15隻豬中有15隻受到保護。在經病毒株Bartha K61免疫之組中，5隻豬中有4隻受到保護。在經病毒株C免疫之組中，5隻豬中有4隻受到保護。在對照組中，5隻豬中有零隻受到保護。 表 3
組 保護 患病
T01 5/5 0/5
T02 5/5 0/5
T03 5/5 0/5
T04 4/5 1/5
T05 5/5 0/5
T06 0/5 5/5
實例 3
將對於PRV抗原及抗體呈陰性之仔豬分配至4個組中，其中各組中有5隻仔豬。為仔豬提供商業飲食且讓其隨意取水。
將PRV病毒株1707與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素一起調配。各經接種之豬接受每劑量10 5 . 0TCID 50之抗原。對照組用DMEM處理。藉由肌肉內注射投與調配物。在疫苗接種之後六個月，三個接種組及對照組用2 mL (10 6 . 0TCID 50)病毒株FS21PF1115經鼻內攻擊。 表 4
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 7 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T02 7 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T03 7 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T04 7 7週齡 DMEM 1 ml
免疫力之持續時間係由症狀之嚴重程度(或不存在)來確定。結果顯示，在三個疫苗接種/攻擊組中，15隻豬中有15隻受到保護，且無發病。在對照組中，5隻豬中有0隻受到保護，且5隻經確定為發病。 實例 4
將處於2至3個月妊娠之母豬(對於PRV抗原及抗體呈陰性)分成2組，其中各組中有5隻母豬。為母豬提供商業飼料且讓其隨意飲水。
將第1組母豬接種由M1707病毒株(包括SEQ ID NO: 3，且編碼TK之UL23基因之核苷酸480-846缺失)與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素一起製備之混合物。將第2組豬接種DMEM。接種方法為在頸部肌肉內注射。
在接種之後，每天定期量測且記錄測試母豬之直腸溫度，且對包括食慾、精神狀態、呼吸狀況及由假性狂犬病毒引起之其他特定臨床症狀的多項指標進行臨床觀測14天。在母豬之預期分娩日期之前，重要的是，觀測母豬是否具有繁殖障礙，諸如流產、死產及產木乃伊胎。當母豬分娩時，記錄是否存在弱仔、死胎、木乃伊胎及其對應數目，記錄分娩情況及分娩後兩週內仔豬之存活率。
結果顯示，在免疫之後，在14天的觀測期期間，所有豬體溫正常、食慾良好、精神狀態正常、無呼吸及胃腸症狀且無神經症狀。未觀測到流產。
在分娩當天，計算母豬之幼仔數、健康幼仔數、弱幼仔數、流產胎兒數及死胎數，且計算健康幼仔率。免疫組(T01組)之平均健康幼仔率為86.0%。對照組(T02組)之平均健康率為91.9%。統計結果顯示，免疫母豬與對照母豬之間的分娩率無顯著差異。 表 5
組 母豬之耳標 分娩之仔豬的數目 健康仔豬之數目 弱仔豬之數目 流產 死胎 木乃伊胎 健康仔豬之百分比
T01 412 13 12 1 0 0 0 92.3% (12/13)
492 11 9 2 0 0 0 81.8% (9/11)
420 11 8 2 0 1 0 72.7% (8/11)
405 17 17 0 0 0 0 100% (17/17)
423 12 10 2 0 0 0 83.3% (10/12)
T02 493 11 11 0 0 0 0 100% (11/11)
426 16 13 3 0 0 0 81.3% (13/16)
471 11 11 0 0 0 0 100% (11/11)
490 11 10 1 0 0 0 90.9% (10/11)
424 13 12 1 0 0 0 92.3% (12/13)
實例 5
將仔豬(對於PRV抗原及抗體呈陰性)分成5組，其中各組中有5隻仔豬。為仔豬提供商業飼料且讓其隨意飲水。將第1至4組的豬接種M1707病毒株(包括SEQ ID NO: 3，且編碼TK之UL23基因之核苷酸480-846缺失)與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素之混合物。將第5組豬接種DMEM。接種方法為在頸部肌肉內注射。 表 6
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 5 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T02 5 7週齡 M1707病毒株 10 4.0TCID 50，1 ml
T03 5 7週齡 M1707病毒株 10 3.0TCID 50，1 ml
T04 5 7週齡 M1707病毒株 10 2.0TCID 50，1 ml
T05 5 7週齡 DMEM 1 ml
在第0天，T01至T04組接受肌肉內注射1 ml，劑量分別為10 5 . 0TCID 50、10 4 . 0TCID 50、10 3 . 0TCID 50及10 2 . 0TCID 50。對照組T05僅接種DMEM。在接種之後，每天量測豬之直腸溫度。臨床觀測顯示，在21天的觀測期期間，所有豬體溫正常、食慾良好、精神狀態正常、無呼吸及胃腸症狀且無神經症狀。在第21天，使用2 mL (含有10 5 . 0TCID 50) FS21PF1115 PRV強毒株經鼻內攻擊組及對照組。結果顯示，在T01/T02/T03/T04組中，所有豬受到超過4/5之保護。在對照組中，5隻豬中有0隻受到保護且全部發病。 表 7
組 保護 發病
T01 4/5 1/5
T02 4/5 1/5
T03 5/5 0/5
T04 5/5 0/5
T05 0/5 5/5
實例 6
將仔豬(對於PRV抗原及抗體呈陰性)分成2組，其中各組中有5隻仔豬。為仔豬提供商業飼料且讓其隨意飲水。將第1組豬接種由M1707病毒株(包括SEQ ID NO: 3，且編碼TK之UL23基因之核苷酸480-846缺失)與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素一起製備之混合物。將第2組豬接種DMEM。接種方法為在頸部肌肉內注射。 表 8
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 5 7週齡 M1707病毒株 10 5.0TCID 50，1 ml
T02 5 7週齡 DMEM 1 ml
第0天，T01組接受肌肉內注射1 ml，劑量為105.0 TCID50。對照組T02僅接種DMEM。在接種之後第21天，使用2 mL (含有10 7 . 0TCID 50)經典PRV強毒株(Rong A病毒株)經鼻內攻擊接種組及對照組。結果顯示，在T01組中，仔豬受到5/5之保護。在對照組中，5隻仔豬中有0隻受到保護，且全部發病。 表 9
組 保護 發病
T01 5/5 0/5
T02 0/5 5/5
此等資料指示經修飾之活PRV病毒株M1707能夠進行廣泛的交叉保護。 實例 7
將PRV抗原及抗體呈陰性之綿羊分成2組，其中各組中有5隻綿羊。為綿羊提供商業飼料且讓其隨意飲水。第1組綿羊接種由M1707病毒株(包括SEQ ID NO: 3，且編碼TK之UL23基因之核苷酸480-846缺失)與MEM、明膠、NZ胺、麩醯胺酸、蔗糖、聚葡萄糖40、乳糖、山梨糖醇及青黴素-鏈黴素一起製備之混合物。第2組綿羊接種DMEM。接種方法為頸部肌肉內注射。 表 10
組 動物數目 動物年齡 接種物 劑量
T01 5 5至7月齡 M1707病毒株 10 6.0TCID 50，1 ml
T02 5 5至7月齡 DMEM 1 ml
第0天，T01組接受肌肉內注射1 ml，劑量為10 6 . 0TCID 50。對照組T02僅接種DMEM。在接種之後，每天定期量測且記錄綿羊之直腸溫度，且臨床觀測多項指標14天，包括食慾、精神狀態、呼吸狀況及由假性狂犬病毒引起之特定臨床症狀。結果顯示，在免疫之後，在14天之觀測期期間，所有綿羊顯示體溫正常、食慾良好、精神狀態正常、無呼吸及胃腸症狀且無神經症狀。
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Claims (20)

  1. 一種包含SEQ ID NO: 3之基因體或與其至少95%一致之核酸序列的經修飾之活假性狂犬病毒的用途，其係用於製備保護豬免受傳染性PRV引起之一或多種PRV症狀的疫苗，其中該經修飾之活假性狂犬病毒包含UL23基因核苷酸480-846之缺失，且該傳染性PRV屬於基因型I或基因型II譜系。
  2. 如請求項1之用途，其中該經修飾之活假性狂犬病毒之基因體包含gE基因及gI基因之缺失。
  3. 如請求項1之用途，其中在該經修飾之活PRV之該基因體中，US1、US2及US9基因未經修飾。
  4. 如請求項1之用途，其中該經修飾之活PRV之基因體為SEQ ID NO: 3。
  5. 如請求項1之用途，其中該傳染性PRV屬於基因型II譜系。
  6. 如請求項1之用途，其中該傳染性PRV屬於基因型I譜系。
  7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中一個劑量之該疫苗包含10 2至10 7TCID 50。
  8. 如請求項1之用途，其中該一或多種症狀係選自以下之群：病毒排出(shedding)、咳嗽、打噴嚏、發燒、便秘、抑鬱、癲癇發作、共濟失調、轉圈，及流涎過多。
  9. 如請求項7之用途，其中該疫苗係肌肉內投與。
  10. 如請求項1之用途，其中該傳染性PRV為PRV病毒株FS21PF1115或PRV病毒株AV25。
  11. 如請求項10之用途，其中該傳染性PRV為10 5 . 0TCID 50或10 6 . 0TCID 50之量的PRV病毒株FS21PF1115，或10 7 . 0TCID 50之量的PRV病毒株AV25。
  12. 如請求項1之用途，其中在用包含該經修飾之活假性狂犬病毒之疫苗接種六個月內，在暴露於該傳染性PRV時，至少80%之該等豬經保護免於PRV症狀。
  13. 如請求項1之用途，其中該豬為仔豬。
  14. 如請求項13之用途，其中該仔豬為至少3週齡。
  15. 如請求項13之用途，其中該仔豬為至少7週齡。
  16. 如請求項15之用途，其中100%之該等豬受到保護。
  17. 如請求項1之用途，其中該豬為母豬。
  18. 如請求項17之用途，其中該母豬係懷孕的。
  19. 如請求項18之用途，其中該母豬處於妊娠2至3個月。
  20. 如請求項18之用途，其中該疫苗之投與不影響該懷孕母豬的分娩率、流產率，或後代存活率。
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Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3137631A (en) 1959-12-01 1964-06-16 Faberge Inc Encapsulation in natural products
US3959457A (en) 1970-06-05 1976-05-25 Temple University Microparticulate material and method of making such material
JPS5186117A (en) 1975-01-27 1976-07-28 Tanabe Seiyaku Co Johoseibiryushiseizainoseiho
US4205060A (en) 1978-12-20 1980-05-27 Pennwalt Corporation Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use
US4452747A (en) 1982-03-22 1984-06-05 Klaus Gersonde Method of and arrangement for producing lipid vesicles
US4744933A (en) 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4921706A (en) 1984-11-20 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Unilamellar lipid vesicles and method for their formation
US4606940A (en) 1984-12-21 1986-08-19 The Ohio State University Research Foundation Small particle formation and encapsulation
US5084269A (en) 1986-11-06 1992-01-28 Kullenberg Fred W Adjuvant for dose treatment with antigens
US5009956A (en) 1987-02-24 1991-04-23 Univ Minnesota Phospholipase A2-resistant liposomes
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4944948A (en) 1989-02-24 1990-07-31 Liposome Technology, Inc. EGF/Liposome gel composition and method
US5132117A (en) 1990-01-11 1992-07-21 Temple University Aqueous core microcapsules and method for their preparation
EP0804283B1 (en) 1994-04-15 2003-04-02 Temple University Aqueous solvent encapsulation method and microcapsules
GB9518220D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Checkpoint gene
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
WO2004014956A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes
CN101113178A (zh) 2002-08-12 2008-01-30 昆士兰医学研究所理事会 包含辅助t细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽
EP1549135A4 (en) 2002-09-20 2006-01-11 Us Agriculture VACCINE COMPOSITIONS AND AUXILIARY
CN101151280A (zh) 2005-02-08 2008-03-26 昆士兰医学研究学院委员会 免疫原性分子
CN108251382B (zh) * 2016-12-29 2021-08-20 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN107815441B (zh) * 2017-08-31 2020-05-12 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
AU2020103651A4 (en) * 2020-11-25 2021-02-04 Yangzhou Uni-Bio Pharmaceutical Co., Ltd A vaccine composition of porcine pseudorabies virus variant strain, preparation method and application thereof
CN115216451A (zh) * 2021-04-16 2022-10-21 硕腾服务有限责任公司 伪狂犬病病毒疫苗
CN113502275A (zh) * 2021-06-21 2021-10-15 江西正邦科技股份有限公司 猪伪狂犬病变异病毒毒株及其应用

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