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TW202402810A - 與ｖｅｇｆ—ａ及ｉｌ６結合之抗體及其使用方法 - Google Patents

與ｖｅｇｆ—ａ及ｉｌ６結合之抗體及其使用方法 Download PDF

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TW202402810A
TW202402810A TW112117457A TW112117457A TW202402810A TW 202402810 A TW202402810 A TW 202402810A TW 112117457 A TW112117457 A TW 112117457A TW 112117457 A TW112117457 A TW 112117457A TW 202402810 A TW202402810 A TW 202402810A
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喬治 班斯
大衛 貝爾托爾多
菲 瑪麗 朵拉奧諾爾
德瑞克 芬史特拉
舍貝斯俊 芬
史蒂芬 弗若斯特
馬龍 辛納
克理斯俊 赫伯特 詹森
丹妮拉 馬茲蓋柯
安娜絲塔西亞 米爾
奧利佛 波拉特納
珍妮娜 史伯克
潘蜜拉 史陶斯伯格
芭芭拉 瑪麗 露薏絲 偉瑟
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Abstract

本發明涉及抗 VEGF-A/抗 IL6 抗體，例如以雙特異性 Fab 片段之形式，及使用該等抗體之方法。

Description

與　VEGF-A　及　IL6　結合之抗體及其使用方法
本發明涉及抗 VEGF-A/抗 IL6 抗體及其使用方法。
與 VEGF 結合之抗體 (例如蘭尼單抗) 被用作治療眼部血管疾病如年齡相關性黃斑退化的治療劑。已建議將與 IL6 結合之抗體 (例如，如 WO2014/074905 中所揭露) 用於治療眼部疾病。
WO2012/163520 揭示了包含在一對 VH 及 VL 域中的兩個互補位的雙特異性抗體 (「DutaFab」)。WO2012/163520 之雙特異性抗體的每個互補位包含來自重鏈及輕鏈 CDR 的胺基酸，其中重鏈 CDR-H1 及 CDR-H3 以及輕鏈 CDR-L2 帶來第一互補位，且輕鏈 CDR-L1 及 CDR-L3 以及重鏈 CDR-H2 帶來第二互補位。從不同 Fab 文庫獨立分離出包含單個互補位的單特異性抗體，該等抗體在第一互補位或第二互補位方面是多樣化的。對該等單特異性抗體之胺基酸序列進行鑑定並合併為雙互補位 VH 及 VL 對。WO2012/163520 中公開了一種例示性 Fab 片段，稱為「VH6L」，具有 SEQ ID NO:01 之 VL 序列及 SEQ ID NO:02 之 VH 序列，與 VEGF 及 IL-6 特異性結合，作為概念證明示例。
然而，需要改善的與 VEGF 及與 IL6 結合的治療性抗體用於眼部疾病中的臨床應用，例如藉由改善與標準護理相比的療效及藉由改善作用持續時間並繼而降低玻璃體內注射頻率以使患者的投予負擔減小來實現。
本發明涉及雙特異性抗 VEGF-A/抗 IL6 抗體及其使用方法。
在一個態樣中，本發明涉及一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；且該抗體包含可變重鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及可變輕鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。
本發明之一個實施例涉及人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其包含 SEQ ID NO:22 之 VH 序列及 SEQ ID NO:21 之 VL 序列。
本發明之一個實施例涉及抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:23 之輕鏈胺基酸序列。
本發明之一個實施例涉及人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體 Fab 片段。
本發明之一個實施例涉及人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之雙特異性抗體 Fab 片段。
在另一態樣中，本發明提供與 IL6 結合之抗體，該抗體與根據本發明之抗體結合至 IL6 上相同之表位。
在另一態樣中，本發明提供與人類 IL6 結合之抗體，其包含： a)            基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、I2、Q3、Y26、E27、F28、T29、H30、Q31、D32、P52a、R94、I96、D97、F98、D101、T102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、S53、N54、Y55、P56、S57、Y91、Y96；或 b)           基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、 P2、Q3、 V26、 L27、F28、 K29、H30、Q31、D32、P52a、R94、 L96、D97、F98、D101、 E102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、 D53、 R54、Y55、P56、 E57、Y91、Y96 (根據 Kabat 編號)。
在另一態樣中，本發明提供一種與 IL6 結合之抗體，其與具有 SEQ ID NO: 35 之 VL 域及 SEQ ID NO: 36 之 VH 域之抗體結合至 IL6 上相同之表位。在一個實施例中，抗體包含具有人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 1、2、3、26、27、28、29、30、31、32、52a、94、96、97、98、101、102，及具有人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 49、50、53、54、55、56、57、91、96。
在一個態樣中，本發明提供分離之核酸，該分離之核酸編碼本發明之抗體。
在一個態樣中，本發明提供宿主細胞，該宿主細胞包含本發明之核酸。在一個實施例中，宿主細胞為 CHO 細胞。在一個實施例中，宿主細胞為大腸桿菌 (E. coli) 細胞。
在一個態樣中，本發明提供表現載體，該表現載體包含本發明之核酸。
在一個態樣中，本發明提供生產與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體之方法，該方法包含培養本發明之宿主細胞，從而生產該抗體。
在一個態樣中，本發明提供由本發明之方法所生產的抗體。
在一個態樣中，本發明提供醫藥調配物，該醫藥調配物包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供預填裝注射器，該預填裝注射器包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供眼部植入物，該眼部植入物包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。在一個實施例中，本發明包含端口輸送裝置，該端口輸送裝置包含本發明之抗體。
在本發明之一個態樣中，端口輸送裝置施用抗體或醫藥調配物。
在一個態樣中，本發明提供本發明之抗體，該抗體用為藥物，在一個實施例中，用於治療血管疾病。
在一個態樣中，本發明提供本發明之抗體或本發明之醫藥組成物在製造藥物中之用途，在一個實施例中，該藥物用於治療血管疾病。
在一個態樣中，本發明提供治療患有血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之本發明之抗體或本發明之醫藥組成物。
在一個態樣中，本發明提供抑制個體中之血管生成的方法，該方法包含向個體投予有效量之本發明之抗體或本發明之醫藥組成物以抑制血管生成。
根據本發明，提供一種治療性抗 VEGF-A/抗 IL6 抗體，該抗體能夠獨立地結合其標靶抗原，即使其以抗體 Fab 片段的形式提供亦如此。它在藥理學相關範圍內表現出與食蟹獼猴標靶的優異的 KD 及物種交叉反應性。本發明之抗體適合治療眼部血管疾病。本發明之抗體提供多個有價值的特性，包括允許其治療應用的良好可表現性及可開發性 (例如高結合效力、高生物物理及生物化學穩定性、高濃度調配物)，特別是對支持低有效劑量的兩個標靶的高親和力，及有利於長持續時間的高穩定性。與非抗體方法相比，本發明之抗體往往更容易接受，因為它具有高度人源性且不含人工域及連接子。此外，本發明之抗體有利於以具有適合眼部應用之黏度的高濃度液體調配物提供。因為其可以以高濃度提供，因此用本發明之抗體進行治療對患者而言更容易接受，因為在一次治療中可應用更高劑量之治療劑，從而允許採用更長的治療週期。由於低得多的分子量，雙特異性 Fab 片段如本發明中描述的片段具有優於雙特異性全長 IgG 抗體的額外優勢。雖然 Fab 具有約 50kDa 的分子量，全長抗體的重量是其三倍 (約 150kDa)，同時提供相同數量的結合位點。因此，對於給定量的藥物，與全長 IgG 抗體相比，雙特異性 Fab 片段將包含多三倍的結合位點。
1. 定義
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。本揭露之方法及技術通常按照本領域所熟知之習用方法來進行。通常，與本文所述之生物化學、酵素學、分子與細胞生物學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學和雜交相關之命名法及技術為本領域熟知且常用的那些。
除非本文另外定義，否則術語「包含」應包括術語「由...組成」。
如本文所用之與具體值 (例如，溫度、濃度、時間等) 關聯使用的術語「約」應指代該術語「約」所指代之具體值的 +/- 1% 之變更。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原-結合活性即可。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
如本文所用的術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即包含群體的個別抗體是相同的和/或結合相同的表位，除了例如含有天然生成之突變或於單株抗體製劑生產過程中產生的可能的變異體抗體之外，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (表位) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有包含本文所定義之 Fc 區域的重鏈之抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在某些實施例中，抗體屬於 IgG1 同型。在某些實施例中，抗體屬於具有 P329G、L234A 及 L235A 突變的 IgG1 同型，以減少 Fc 區效應子功能。在其他實施例中，抗體屬於 IgG2 同型。在某些實施例中，抗體屬於鉸鏈區中具有 S228P 突變的 IgG4 同型，以改善 IgG4 抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在一個實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR) (參見例如：Kindt 等人 Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007))。在本發明之抗體中，一對 VH 域及 VL 域，亦即同源 VH/VL 對，與其兩個標靶特異性結合：VEGF-A 及 IL6。
「DutaFab」為如 WO2012/163520 所揭示之雙特異性抗體。在 DutaFab 中，一對 VH 域及 VL 域與兩個不同的表位特異性結合，其中一個互補位包含來自 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，且另一個互補位包含來自 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。DutaFab 包含同源 VH/VL 對中之兩個不重疊的互補位，並可同時與兩個不同的表位結合。DutaFab 及藉由篩選包含單特異性 Fab 片段的文庫產生 DutaFab 的方法揭示於 WO2012/163520 中。
「人抗體(human antibody)」為一種具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於藉由人或人的細胞所產生的抗體、或衍生自利用人抗體譜系(antibody repertoire)或其他人抗體編碼序列之非人來源所產生的抗體。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列之亞群為如 Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第 1-3 卷中之亞群。在一個實施例中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個實施例中，對於 VH，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’)2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv) 及抗體片段形成的多特異性抗體。
「互補位」或「抗原結合位點」在本文中可互換使用，是指抗體的一部分，其識別並結合抗原。互補位由來自抗體重鏈及輕鏈可變域的多個單獨的胺基酸殘基形成，該等胺基酸殘基在 Fv 區之三級結構中排列為在空間上接近。本發明之抗體包含在一個同源 VH/VL 對中的兩個互補位。
如本文所用，「VEGF-A 互補位」是與 VEGF-A 結合的互補位或抗原結合位點。本發明之抗體的 VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基。
如本文所用，「IL6 互補位」是與 IL6 結合的互補位或抗原結合位點。本發明之抗體的 IL6 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「血管內皮生長因子」或「VEGF」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 VEGF，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 VEGF 以及在細胞處理中得到的任何形式的 VEGF。該術語亦涵蓋天然生成之 VEGF 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類 VEGF 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:27 所示。
術語「抗 VEGF-A 抗體」及「與 VEGF-A 結合之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 VEGF-A，從而使得該抗體可用作靶向 VEGF-A 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗 VEGF-A 抗體與無關、非 VEGF-A 蛋白結合之程度低於該抗體與 VEGF-A 之結合的約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些實施例中，與 VEGF-A 結合之抗體的解離常數 (K D) ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.01 nM。當抗體的 K D為 1μM 或更小時，稱該抗體與 VEGF-A「特異性結合」。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「介白素-6」或「IL6」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 IL6，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 IL6 以及在細胞處理中得到的任何形式的 IL6。該術語亦涵蓋天然 IL6 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 IL6 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:28 所示。
本發明之抗體「同時與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合」意指 (a) 與人類 IL6 結合的本發明之抗體 Fab 片段 (亦) 與人類 VEGF-A 特異性結合，及 (b) 與人類 VEGF-A 結合的本發明之抗體 Fab 片段 (亦) 與人類 IL6 特異性結合。可用本領域已知的方法評估同時結合，例如藉由如本文所述之表面電漿子共振來評估。
如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」是指在序列中高度可變且含有抗原接觸殘基的抗體可變域的各個區域。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 域中 (CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3)，三個在 VL 域中 (CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3)。除非另有說明，否則可變域中之 CDR 殘基及其他殘基 (例如，FR 殘基) 在本文中根據 Kabat 編號系統進行編號 (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。
如本文所用之「骨架」或「FR」是指 CDR 殘基之外的可變域胺基酸殘基。可變域之骨架通常由四個骨架域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 胺基酸序列通常以如下順序出現在 (a) VH 域中：FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；及 (b) 在 VL 域中：FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4 中所示。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體與抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。本文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
術語「表位」表示抗體與之結合的抗原上的位點，無論是蛋白性的還是非蛋白性的。表位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性表位) 或包含非連續的胺基酸 (構象表位)，例如，由於抗原的折疊，即藉由蛋白抗原的三級折疊而在空間上接近。線性表位通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍被抗體結合，而構形表位通常在變性劑處理後被破壞。在獨特空間構象中，表位包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個或 8 個至 10 個胺基酸。
篩選與特定表位結合的抗體 (即與相同表位結合者) 可使用本技術領域的常規方法進行，例如諸如但不限於丙胺酸掃描、肽印漬 (參見 Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463)、肽裂解分析、表位切除、表位萃取、抗原的化學修飾 (參見 Prot. Sci. 9 (2000) 487-496)、及和交叉阻斷 (參見「Antibodies」, Harlow 及 Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)。
基於抗原結構的抗體剖析 (ASAP)，亦稱為修飾輔助剖析 (MAP)，允許根據從眾多化學或酶修飾的抗原表面的各抗體結合剖析，將特異性結合 VEGF-A 或 IL6  的眾多單株抗體進行分箱 (bin) (參見例如 US 2004/0101920)。各分箱中的抗體都與相同表位結合，這個表位可能是獨特的表位，與另一分箱所代表的表位明顯不同或部分重疊。
此外，競爭性結合可用來易於判定抗體是否與 VEGF-A 或 IL6 之相同表位結合，或與本發明之抗體競爭性結合。例如，與參考抗體「結合至 VEGF-A 及 IL6 上相同表位的抗體」是指，在相應的競爭測定中，分別阻斷參考抗體與其抗原結合 50% 或更多的抗體，反之，參考抗體在相應的競爭測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。又例如，為了確定抗體是否與參考抗體結合在相同表位，讓參考抗體在飽和條件下與 VEGF-A 或 IL6 結合。在去除過量的參考抗體後，評估有關抗體與 VEGF-A 或 IL6 結合的能力。如果在參考抗體飽和結合後，有關抗體與能夠與 VEGF-A 或 IL6 結合，則可以斷定該抗體與參考抗體結合至不同的表位。但是，如果在參考抗體飽和結合後，有關抗體不能與 VEGF-A 或 IL6 結合，則該抗體可能與參考抗體結合至相同的表位。為了確認該抗體是否與相同的表位結合，或者只是由於立體原因而阻礙了結合，可以使用常規實驗 (例如，使用 ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀或本技術中可獲得的任何其他定量或定性的抗體結合測定進行胜肽突變和結合分析)。此測定應分兩次設置進行，即以兩種抗體為飽和抗體。如果在兩種設置中，僅第一 (飽和) 抗體能夠與 VEGF-A 或 IL6 結合，則可以斷定有關抗體與參考抗體競爭結合至 VEGF-A 或 IL6。
在一些實施例中，如果一個抗體的 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍的過量抑制另一抗體的結合至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (藉由競爭性結合檢定測量)，則認為兩個抗體與相同或重疊的表位結合 (參見例如 Junghans 等人，Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502)。
在一些實施例中，如果抗原中基本上所有的胺基酸突變減少或消除一個抗體的結合，也減少或消除另一抗體的結合，則認為兩個抗體與相同表位結合。如果只有減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變的次集合 (subset) 減少或消除另一抗體的結合，則認為兩種抗體具有「重疊表位 (overlapping epitope)」。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮出於比對目的將任何保留取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式套件實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。可替代地，可使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2000/005319 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套裝 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式與 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性 % 值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；及 Pearson et. al.(1997) (Genomics 46:24-36)，並可從以下網址公開存取：www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www.  ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言訊息 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生醣、磷酸鹽鍵結或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦包括適於在活體外及/或活體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 及 RNA 分子。該等 DNA (例如 cDNA) 或 RNA (例如 mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或所編碼之分子的表現，使得 mRNA 可被注射入個體活體內以產生抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上發表於 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體的分離核酸」是指編碼抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中的該等核酸分子，且該等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或複數個位置。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變子代細胞。
術語「醫藥組成物」或「醫藥調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且其不含對將投予醫藥組成物之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
「受試者」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，受試者或個體為人類。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
如本文中所使用之術語「眼部疾病」包括與病理性血管生成及/或萎縮相關的任何眼部疾病。眼部疾病之特徵可以為經改變或不受調控之新血管增生及/或侵入眼部組織諸如視網膜或角膜之結構內。眼部疾病之特徵可以為視網膜組織 (光受器及下方視網膜色素上皮細胞 (RPE) 及脈絡膜毛細管) 之萎縮。非限制性眼部疾病包括例如 AMD (例如，濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD、及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑部病變、黃斑部水腫、DME (例如，局部性、非中心性 DME 和瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (例如，增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、其他與缺血相關的視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (例如中心 (CRVO) 和分支 (BRVO) 形式)、CNV (例如近視 CNV)、視網膜新血管形成、與視網膜新血管形成相關的疾病、視網膜血管新生、與視網膜/脈絡膜血管新生相關的疾病、中心性漿液視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道病、眼部組織胞漿菌病、FEVR、柯氏症、諾里氏病，與骨質疏鬆-假性神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關的視網膜異常、結膜下出血、紅腫、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤增生、黃斑部毛細血管擴張、虹膜血管新生、眼內血管新生、視網膜病變、黃斑部囊樣水腫 (CME)、管脈炎、視乳頭水腫、視網膜炎，包括但不限於 CMV 視網膜炎、眼黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、結膜炎 (例如，感染性結膜炎和非感染性 (例如，過敏性) 結膜炎)、萊伯先天性黑蒙症 (亦稱為萊伯氏先天性黑蒙症或 LCA)、眼色素層炎 (包括感染性和非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎 (例如多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、眼外傷、修格倫氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或疾病與血管新生、血管滲漏、及/或視網膜水腫或視網膜萎縮有關。另外示例性眼部疾病包括視網膜劈裂症 (視網膜神經感測層之不正常剝離)、與皮膚發紅相關之疾病 (瞼角之新血管形成) 以及由纖維小管或纖維組織之不正常增殖造成之疾病 (包括全部形式之增殖性玻璃體視網膜病變)。與角膜新血管形成相關之示例性疾病包括但不限於，流行性角膜結膜炎、維生素 A 缺乏症、隱形眼鏡過度磨損、過敏性角膜炎、上邊緣性角膜炎、角膜病乾燥性角膜炎 (terygium keratitis sicca)、Sjögren 氏症候群、痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分枝桿菌感染、脂質退化、化學品燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹病毒感染、帶狀皰疹病毒感染、原蟲感染、卡波西肉瘤、蠶蝕性角膜潰瘍、Terrien 氏邊際退化、邊際性角質退化、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、Wegener 類肉瘤病、鞏膜炎、Stevens-Johnson 氏症候群、類天皰瘡放射狀角膜切開術及角膜圖像排斥反應 (corneal graph rejection).與脈絡膜新血管形成及視網膜血管系缺陷 (包括增加之血管滲漏、動脈瘤及毛細血管滴落) 相關的示例性疾病包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、黃斑退化、鐮狀細胞貧血、肉瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、Paget 氏病、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme 氏病、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、視網膜水腫 (包括黃斑水腫)、Eales 病、貝塞特氏病、視網膜炎或脈絡膜炎造成之感染、預設性眼部組織胞漿菌病、Best 氏病 (卵黃狀黃斑退化)、近視、視盤小凹 (optic pits)、睫狀體扁平部炎、視網膜脫落 (例如，慢性視網膜脫落)、血液高度黏稠症、弓蟲症、創傷及雷射後併發症。與視網膜組織 (光受器及下方 RPE) 相關之示例性疾病包括但不限於，萎縮性或非滲出性 AMD (例如，地圖狀萎縮或晚期乾性 AMD)、黃斑萎縮 (例如，與新血管形成相關之萎縮及/或地圖狀萎縮)、糖尿病性視網膜病變、斯特格氏病、Skorsby 眼底萎縮症、視網膜劈裂症及色素性視網膜炎。
術語「藥品仿單」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合療法、禁忌症及/或警告等資訊。 2. 具體實施方式
在一個態樣中，本發明部分地基於提供用於治療應用之雙特異性抗體。在某些態樣中，提供了與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體。本發明之抗體用於例如治療血管疾病 (例如眼部血管疾病)。 A. 與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體
在一個態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體。在一個態樣中，提供了與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之經分離之抗體。在一個態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 IL6 特異性結合之抗體。
在某些態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其中該抗體包含在 VL 域及 VH 域之一個同源對內的 VEGF-A 互補位 (亦即，與 VEGF-A 結合至抗原結合位點) 及 IL6 互補位 (亦即，與 IL6 結合至抗原結合位點)，其中 •        VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 IL6 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基；及/或 •        IL6 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基； •        可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合；及/或 •        抗體與具有 SEQ ID NO:22 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:21 之可變輕鏈域之抗體結合至人類 VEGF-A 上的相同表位及人類 IL6 上的相同表位；及/或 •        該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以藉由表面電漿共振測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以藉由表面電漿子共振測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 IL6；及/或 •        該抗體之抗體 Fab 片段表現出 60℃ 或更高，在一個實施例中為 70℃ 或更高的聚集起始溫度；及/或 •        該抗體之抗體 Fab 片段表現出如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含：VH 域，其包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；且該抗體包含可變重鏈域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含與 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 VH 域。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VH 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保留取代)、插入或缺失，但是與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體包含保留與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之能力的序列。在某些態樣中，在 SEQ ID NO:22 中，共有多達 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在特定態樣中，VH 包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:18；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:19；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:20。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 VL 域。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VL 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保留取代)、插入或缺失，但是與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體包含保留與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之能力的序列。在某些態樣中，在 SEQ ID NO:21 中，共有多達 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在特定態樣中，VL 包含：(d) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:15；(e) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:16；及 (f) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:17。
在另一態樣中，提供與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣的 VH 序列及上文提供的任一態樣的 VL 序列。在一個態樣中，抗體包含分別為 SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:21 之 VH 和 VL 序列，其包括那些序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其中該抗體包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:23 之輕鏈胺基酸序列。
在本發明之又一態樣中，根據上述任一態樣中的與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體為單株抗體。在一個態樣中，與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或 F(ab’) 2片段。在另一態樣中，抗體為全長抗體。
在另一態樣中，本發明提供了一種與 IL6 結合之抗體，該抗體來源於本發明的抗體。為本發明之抗體揭露的 IL6 互補位可用於提供其他抗體，例如與 IL6 及另一種抗原結合之單特異性抗體或雙特異性抗體。如本文所揭露的抗體 6HVL4.1 的 IL6 互補位通過 x 射線晶體學鑑定 (實例 13)。抗體 6HVL4.1 基於具有人類 VH3 骨架的 VH 域及具有人類 Vκ1 骨架的 VL 域。包含抗體 6HVL4.1 的 IL6 互補位的抗體結合至 IL6 上相同之表位。本文揭露的與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合的本發明的抗體的所有實施例也適用於與 IL6 結合之抗體。
因此，在一個實施例中，本發明提供了一種與人類 IL6 結合之抗體，其包含： c)            基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、I2、Q3、Y26、E27、F28、T29、H30、Q31、D32、P52a、R94、I96、D97、F98、D101、T102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、S53、N54、Y55、P56、S57、Y91、Y96；或 d)           基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、 P2、Q3、 V26、 L27、F28、 K29、H30、Q31、D32、P52a、R94、 L96、D97、F98、D101、 E102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、 D53、 R54、Y55、P56、 E57、Y91、Y96 (根據 Kabat 編號)。
在另一態樣中，本發明提供一種與 IL6 結合之抗體，其與具有 SEQ ID NO: 35 之 VL 域及 SEQ ID NO: 36 之 VH 域之抗體結合至 IL6 上相同之表位。在一個實施例中，抗體包含具有人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含與本發明的人類 VEGF-A 及 IL6 結合之抗體之胺基酸殘基 1、2、3、26、27、28、29、30、31、32、52a、94、96、97、98、101、102 及具有人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含與本發明的人類 VEGF-A 及 IL6 結合之抗體之胺基酸殘基 49、50、53、54、55、56、57、91、96。
在一個實施例中，如上所述與 IL6 結合之該抗體是與 IL6 及另一標靶結合之多特異性抗體。
在又一態樣中，根據上述任一態樣中的與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體或根據上述任一態樣中的與人類 IL6 結合之抗體可單獨或組合結合如以下 1-5 部分所述之任意特徵： 1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.01 nM 的解離常數 (K D) 與 VEGF-A 結合。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 VEGF-A 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 VEGFA-121 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 VEGFA-165 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。
在某些實施例中，與 IL6 結合之抗體的解離常數 (K D) ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.03 nM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 IL6 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。在一個態樣中，K D使用表面電漿子共振測定法測得，在一個實施例中，使用 BIACORE ®表面電漿共振測定法。
在另一態樣中，K D使用 KinExA 測定法測得。在一個實施例中，K D使用 KinExA 測定法在下文「材料與一般方法」部分中所述之用於檢測 VEGF-A 結合之 K D或用於檢測 IL6 結合之 K D之條件下測得。
例如，與 VEGF-A 結合之抗體之 K D在使用來自 Sapidyne 儀器 (Boise, ID) 的 KinExA 3200 儀器的測定中測量，其中 PMMA 珠粒根據 KinExA 手冊方案 (吸附塗層，Sapidyne) 使用於 1 ml PBS (pH 7.4) 中之 30 µg 抗 VEGF-抗體 MAB293 (R&D) 以抗原塗布。KinExA 平衡測定於室溫下使用含 0.01 % BSA 及 0.01 % Tween20 的 PBS pH 7.4 作為運行緩衝劑進行，其中樣品及珠粒在 LowCross 緩衝劑 (Candor Bioscience) 中製備。所用流速為 0.25 ml/min。用被測抗體滴定恆定量之的 VEGFA-121-His (50 pM，在第二個實驗中為 500 pM)，並使平衡後之混合物透過 KinExA 系統中之抗 VEGF 抗體 (Mab293) 偶合珠粒的管柱，對於 50 pM 恆定 VEGF，採用 750 µl 的體積；對於 500pM 恆定 VEGF，採用 125 µl 的體積。結合之 VEGFA-121 的檢測使用濃度為 250 ng/ml 的第二生物素化抗 VEGF 抗體 (BAF293)，然後注入樣品緩衝劑中之 250 ng/ml 鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物。使用 KinExA 軟體 (4.0.11 版) 內包含的單點同質結合模型，用「標準分析」方法對資料進行非線性回歸分析，獲得 K D。軟體藉由將資料點擬合至理論 K D曲線來計算 K D並確定 95% 信賴區間。95% 信賴區間以 K D低和 K D高給出。
例如，與 IL6 結合之抗體之 K D在 Biacore 8K 儀器 (Cytiva) 上使用表面電漿子共振 (SPR) 的測定中在 25°C 使用 HBS-EP+ (1x；BR100669；Cytiva) 作為運行緩衝液測得。將人類 Fab 結合物 (28958325，Cytiva) 在 10 mM 乙酸鈉緩衝液 pH 5.0 中稀釋至最終濃度 10 μg/ml，並使用標準胺偶合化學固定在 CM5 感測器晶片上。在蛋白質測量之前，可視情況執行五個啟動循環以用於調節目的，其中在每個循環中 HBS-EP+ 緩衝液流動約 120 s，隨後藉由應用 10 mM 甘胺酸緩衝液 pH2.0 60 s 來再生衍生晶片表面。濃度為 75 nM 的抗體 Fab 片段在 HBS-EP+ 緩衝液中以 10 ul/min 的流速在該表面上捕獲 60 s。沒有 Fab 片段施加至參考通道。接著，在 HBS-EP+ 緩衝液中以 30 µl/min 的流速 (較佳使用 180 s 的接觸時間及 720 s 的解離時間)，以適當的稀釋系列應用人類或食蟹獼猴 IL-6。衍生化晶片表面的再生已實現，如上所述。使用 8K 評估軟體 (Biacore Insight Evaluation 3.0) 評估資料。 2. 抗體片段
在某些態樣中，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個方面，抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’) 2片段，特別是 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌、CHO) 之重組產生。
在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體為 Fab 片段。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 VH 域包含人類 VH3 骨架。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 VL 域包含人類 Vkappa1 骨架。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 CL 域為 κ 同型。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 CH1 域為人類 IgG1 同型。
在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體為包含 κ 同型的 CL 域及人類 IgG1 同型的 CH1 域的 Fab 片段。 3. 熱穩定性
本文所提供之抗體表現出優異的熱穩定性。在某些實施例中，本文所提供之抗體之 Fab 片段表現出 60℃ 或更高，在一個實施例中為 70℃ 或更高的聚集起始溫度。在某些實施例中，本文所提供之抗體之 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 4. 多特異性抗體
在某些態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同表位或同一抗原上之不同表位) 具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。
具有三種或更多種結合特異性之多特異性抗體包含本文所提供之抗體，其可提供為不對稱形式，包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即藉由交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。 5. 抗體變異體
在某些態樣中，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改變抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。
在某些態樣中，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保留取代列於下表之「較佳取代」標題下。表 1 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。 表
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型之取代變異體涉及取代親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之一個或多個 CDR 殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 CDR 殘基發生突變，並且變異抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物活性 (例如，結合親和力)。
在某些態樣中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保留式修改 (例如，本文所提供之保留取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) ( Science，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 arg、asp、his、lys 和 glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否含有所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 a) 醣基化變異體
在某些態樣中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵結附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人， TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個方面中，提供了具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一個方面中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人 Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人 , Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在又一態樣中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 b) Fc 區域變異體
在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG 1、IgG 2、IgG 3或 IgG 4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一種具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體 活體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (例如補體依賴性細胞毒性 (CDC)和抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施 活體外及/或 活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。媒介 ADCC 之初代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 ( Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的活體外分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82: 1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人， J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如Clynes 等人在 Proc. Natl Acad. Sci. USA95: 652-656 (1998) 中公開的動物模型中在 活體內評估目標分子之 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人， J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人， Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie， Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如，美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人， J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區域的位置 234 和 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個態樣中，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG 1Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。參見例如 WO 2012/130831。在另一態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。
在某些態樣中，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 ( 即改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人 J. Immunol.117:587 (1976) 和 Kim 等人 J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區域殘基 434 之取代 (參見例如美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。
通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (EU 索引編號) 參與相互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A., 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。於一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有態樣中中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有態樣中中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。 c) 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。 B. 重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的分離之核酸。
在一個態樣中，提供編碼本發明之抗體的經分離之核酸。
在一個態樣中，提供了一種製備與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體的方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如上所提供之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收抗體。
在重組生產與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體時，將例如上述之編碼抗體之核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可通過常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或通過重組方法或化學合成進行生產。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應子功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經過進一步純化。在一個實施例中，宿主細胞為大腸桿菌細胞。
脊椎動物細胞也可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個較佳的實施例中，宿主細胞為 CHO 細胞。在 CHO 細胞中生產本發明之抗體可改善抗體之可注射性。 C. 醫藥組成物
在又一態樣中，提供了包含本文所提供之任何抗體的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體和醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體及至少一種另外治療劑 (如下文所述)。
藉由混合具有所需純度的與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體與一種或多種視情況的醫藥上可接受之載劑，來製備如本文所述抗體的呈凍乾組成物或水溶液形式的醫藥組成物 ( Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX ®，Halozyme, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及使用方法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種另外的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體組成物如美國專利第 6,267,958 號所述。水溶性抗體組成物包括美國專利號 6,171,586 和 WO 2006/044908 中所述的那些，後者所述之組成物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。該等技術公開於 Remington's Pharmaceutical Sciences(第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。
可製備用於緩釋之醫藥組成物。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式 ,例如膜或微囊。
用於 活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 D. 治療方法及投予途徑
本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體中之任一者皆可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用為藥物。在另外的態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於治療血管疾病。在某些態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於治療方法中。在某些態樣中，,本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於治療患有血管疾病之個體的方法中，該方法包含向個體投予有效量之人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外治療劑) 投予該個體。在另外的態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於抑制血管生成。在某些態樣中，,本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於抑制血管生成的方法中，該方法包含向個體投予有效量之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體以抑制血管生成。根據上述任一態樣中的「個體」較佳地為人。
在另外的態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其用於治療眼部疾病。在一個實施例中，眼部疾病選自 AMD (在一個實施例中為濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD 及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑退化、黃斑部水腫、DME (在一個實施例中為局部性、非中心性 DME 及瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (在一個實施例中為增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、其他與缺血相關的視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (在一個實施例中為中心 (CRVO) 及分支 (BRVO) 形式)、CNV (在一個實施例中為近視 CNV)、視網膜新血管形成、與視網膜新血管形成相關的疾病、視網膜血管新生、與視網膜/脈絡膜血管新生相關的疾病、中心性漿液視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道病、眼部組織胞漿菌病、FEVR、柯氏症、諾里氏病，與骨質疏鬆-假性神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關的視網膜異常、結膜下出血、紅腫、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤增生、黃斑部毛細血管擴張、虹膜血管新生、眼內血管新生、視網膜病變、黃斑部囊樣水腫 (CME)、管脈炎、視乳頭水腫、視網膜炎，包括但不限於 CMV 視網膜炎、眼黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、結膜炎 (在一個實施例中為感染性結膜炎及非感染性 (例如，過敏性) 結膜炎)、萊伯先天性黑蒙症 (亦稱為萊伯氏先天性黑蒙症或 LCA)、眼色素層炎 (包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎 (在一個實施例中為多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、眼外傷、修格倫氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或疾病與血管新生、血管滲漏、及/或視網膜水腫或視網膜萎縮有關。在一個實施例中，眼部疾病選自 AMD (在一個實施例中，為濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD 及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑退化、黃斑部水腫、DME (在一個實施例中，為局部性、非中心性 DME 及瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (在一個實施例中，為增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)。
在又一態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體在製造或製備藥物中之用途。在一個態樣中，藥物用於治療血管疾病。在又一態樣中，藥物用於治療血管疾病的方法中，該方法包含向患有血管疾病之個體投予有效量之藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。
在一個態樣中，藥物用於治療眼部疾病。在又一態樣中，藥物用於治療眼部疾病的方法中，該方法包含向患有眼部疾病的個體投予有效量之藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。
在又一態樣中，本發明提供一種治療血管疾病的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有該等血管疾病的個體投予有效量之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體。於一個此樣態中，如下所述，該方法進一步包含對該個體投予有效量之至少一種另外的治療劑。
在又一態樣中，本發明提供一種治療眼部疾病的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有該等眼部疾病的個體投予有效量之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體。於一個此樣態中，如下所述，該方法進一步包含對該個體投予有效量之至少一種另外的治療劑。
根據上述任一態樣中的「個體」可以是人。
在又一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體的醫藥組成物，其例如用於以上任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體及至少一種其他治療劑 (例如，如下文所述)。
本發明之抗體可藉由玻璃體內投予 (例如，玻璃體內注射) 或使用端口輸送裝置來投予。在一個實施例中，在端口輸送裝置再裝滿之前，本發明之抗體使用端口輸送裝置於六個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 8 個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 9 個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 12 個月或更長時間內投予。在一個實施例中，本發明之抗體使用端口輸送裝置來投予，其中抗體以 150 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置；在一個實施例中，以 200 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置。
本發明之抗體可單獨投予或用於聯合治療。例如，聯合治療包括投予本發明之抗體並投予至少一種另外的治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。
在根據 (或如應用於) 上述任何實施例之某些實施例中，該眼部病症為選自由以下所組成之群組的眼內新血管疾病：增殖性視網膜病變、脈絡膜新血管形成 (CNV)、年齡相關性黃斑退化 (AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫,、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (包括 CRVO 及 BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變 (ROP)。
在一些情況下，本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體可與至少一種其他治療劑組合投予以治療眼部病症，例如本文所述之眼部病症 (例如，AMD (例如，濕性 AMD)、DME、DR、RVO 或 GA)。
任何合適的 AMD 治療劑皆可作為其他治療劑與本文所提供之與人類 VEGF 及人類 IL6 結合之抗體組合投予以用於治療眼部病症 (例如 AMD、DME、DR、RVO 或 GA)，包括但不限於 VEGF 拮抗劑，例如抗 VEGF 抗體 (例如 LUCENTIS® (蘭尼單抗)、RTH-258 (原 ESBA-1008，即抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis) 或雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體，諸如 Faricimab；Roche))、可溶性 VEGF 受體融合蛋白 (例如，EYLEA® (阿柏西普))、抗 VEGF DARPin® (例如 abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan) 或抗 VEGF 適體 (例如MACUGEN® (哌加他尼鈉))；源自血小板之生長因子 (PDGF) 拮抗劑，例如，抗 PDGF 抗體，抗 PDGFR 抗體 (例如，REGN2176-3)、抗 PDGF-BB peg 化適體 (例如 FOVISTA®；Ophthotech/Novartis)、可溶性 PDGFR 受體融合蛋白或雙重 PDGF/VEGF 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，DE-120 (Santen) 或 X-82 (TyrogeneX)) 或雙特異性抗 PDGF/抗 VEGF 抗體))；與光動力治療合用之 VISUDYNE® (維替泊芬)；抗氧化劑；補體系統拮抗劑，例如，補體因子 C5 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，ARC-1905；Opthotech) 或抗 C5 抗體 (例如，LFG-316；Novartis)、備解素拮抗劑 (例如，抗備解素抗體，例如，CLG-561；Alcon) 或補體因子 D 拮抗劑 (例如，抗補體因子 D 抗體，例如，蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)；Roche))；C3 阻斷肽 (例如，APL-2,，Appellis)；視覺週期休試劑 (例如，依米司他鹽酸鹽 (emixustat hydrochloride))；角鯊胺 (例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物質補充劑 (例如，彼等揭示於 Age-Related Eye Disease Study 1 (AREDS1；鋅及/或抗氧化劑) 及 Study 2 (AREDS2；鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃素及/或 ω-3 脂肪酸))；基於細胞之治療，例如，NT-501 (Renexus)；PH-05206388 (Pfizer)、huCNS-SC 細胞移植 (StemCells)、CNTO-2476 (臍帶幹細胞系；Janssen)、OpRegen (RPE 細胞之懸浮液；Cell Cure Neurosciences) 或 MA09-hRPE 細胞移植 (Ocata Therapeutics)；組織因子拮抗劑 (例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-腎上腺素性受體促效劑 (例如，酒石酸溴莫尼定 (brimonidine tartrate)；Allergan)；肽疫苗 (例如，S-646240；Shionogi)；類澱粉蛋白 β 拮抗劑 (例如，抗 β 類澱粉蛋白單株抗體，例如，GSK-933776)；S1P 拮抗劑 (例如，抗 S1P 抗體，例如，iSONEP™；Lpath Inc)；ROBO4 拮抗劑 (例如，抗 ROBO4 抗體，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表現內皮抑素及血管抑素之慢病毒載體 (例如，RetinoStat) 及其組合。於一些情況下，AMD 治療劑 (包括前述任意 AMD 治療劑) 可共同調配。例如，抗 PDGFR 抗體 REGN2176-3 可與阿柏西普 (EYLEA®) 共同調配。在一些情況下，該等共調配物可與本發明之與人類 VEGF 及人類 IL6 結合之抗體聯合投予。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。
任何合適的 DME 及/或 DR 治療劑皆可本發明之與人類 VEGF 及人類 IL6 結合之抗體聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，AMD、DME、DR、RVO 或 GA)，包括但不限於 VEGF 拮抗劑 (例如，LUCENTIS® 或 EYLEA®)、皮質類固醇 (例如，皮質類固醇植入物 (例如，OZURDEX® (地塞米松玻璃體內植入物) 或 ILUVIEN® (丙酮氟洛皮質醇玻璃體內植入物)) 或經調配用於藉由玻璃體內注射投予之皮質類固醇 (例如，丙酮特安皮質醇)) 或其組合。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。
如本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體可與治療或外科方法聯合投予以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)，該治療或外科方法包括，例如，雷射光凝 (例如，全視網膜光凝 (PRP))、隱結雷射作用、黃斑裂孔手術、黃斑轉位手術、可植入袖珍望遠鏡、PHI-運動血管造影 (亦稱為微雷射治療及分支血管治療 (feeder vessel treatment))、光子束治療、微刺激治療、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜屈曲 (scleral buckle)、黃斑下手術、經瞳孔熱療、光系統 I 治療、RNA 干擾 (RNAi) 之使用、體外流變過程 (亦稱為膜差濾及流變治療)、微晶片植入、幹細胞治療、基因替換治療、核糖核酸酵素基因治療 (包括用於缺氧反應元件之基因治療，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及 PDEF 基因治療，GenVec)、光受器/視網膜細胞移植 (包括可移植視網膜上皮細胞，Diacrin, Inc.；視網膜細胞移植物，例如，Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech)、針灸術及其組合。
上文述及之該等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，本發明之與人類 VEGF 及人類 IL6 結合之抗體之投予可在投予其他一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。在一個實施例中，本發明之與人類 VEGF 及人類 IL6 結合之抗體之投予及其他治療劑之投予彼此在約一個、兩個、三個、四個或五個月內或者在約一週、兩週或三週內或者在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。
本發明之抗體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期給藥。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本發明之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和施用。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個別患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他藥劑的有效量取決於醫藥組成物中存在之抗體的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1mg/kg – -10mg/kg) 的抗體可為例如透過一次或多次分開的施用或透過連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約兩種至約二十種或例如約六種劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。 E. 製成品
本發明的另一方面中提供包含能夠有效治療、預防及/或診斷上述疾病材料的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。適當的容器包括例如小瓶、注射器等。容器可以由多種材料諸如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。
此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此態樣中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的包裝說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 F. 裝置
本發明之抗體可使用眼部植入物投予眼部，在一個實施例中，使用端口輸送裝置投予。
端口輸送裝置為可植入、可再裝滿的裝置，其可以在幾個月的時間內 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或更多個月) 釋放治療劑 (例如本發明之抗體)。可以使用的例示性端口輸送裝置包括來自 ForSight Labs、LLC 及/或 ForSight VISION4 的那些，例如，如國際專利申請公開號 WO 2010/088548、WO2015/085234、WO 2013/116061、WO 2012/019176、WO 2013/040247 及 WO 2012/019047 中所述，其全部內容通過引用併入本文。
例如，本發明提供端口輸送裝置，其包括含有本文所述之任何抗體的儲器。端口輸送裝置可進一步包括近端區域、耦合至近端區域並與儲器流體連通的管狀主體以及一個或多個出口，該等一個或多個出口與儲器流體連通並且經組態以將組成物釋放到眼部。管狀主體的外徑可組態為透過眼部約 0.5 mm 或更小的切口或開口插入。裝置長度可為約 1 mm 至約 15 mm (例如，長約 1 mm、約 2 mm、約 4 mm、約 5 mm、約 6 mm、約 7 mm、約 9 mm、約 11 mm、約 13 mm 或約 15 mm)。儲器可具有任何合適的容積。在一些情況下，儲器可具有約 1 µl 至約 100 µl (例如，約 1 µl、約 5 µl、約 10 µl、約 20 µl、約 50 µl、約 75 µl 或約 100 µl) 的容積。裝置或其組成部件可由任何合適的材料 (例如聚醯亞胺) 製成。
在一些情況下，端口輸送裝置包括儲器，該儲器含有本文所述之任何抗體及一種或多種其他化合物。
在一些情況下，端口輸送裝置包括本文所述之任何抗體或抗體結合物及其他 VEGF 拮抗劑。 3. 本發明之具體實施例
下文中列述本發明之具體實施例。 1.    一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含：VH 域，其包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。 2.    一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；且該抗體包含可變重鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及可變輕鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。 3.    一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個、多達 10 個或多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。 4.    一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 SEQ ID NO: 22 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列。 5.    如前述實施例中一者之抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:23 之輕鏈胺基酸序列。 6.    如前述實施例中任一者之抗體，其中 VEGF-A 互補位包含來自抗體的 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 IL6 互補位包含來自抗體的 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基或其中 IL6 互補位包含來自抗體的 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 VEGF-A 互補位包含來自抗體的 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基；及/或 •      可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合；及/或 •      抗體與具有 SEQ ID NO:22 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:21 之可變輕鏈域之抗體結合至人類 VEGF-A 上的相同表位及人類 IL6 上的相同表位；及/或 •      該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以藉由表面電漿共振測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以藉由表面電漿子共振測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 IL6；及/或 •      該抗體之抗體 Fab 片段表現出 60℃ 或更高，在一個實施例中為 70℃ 或更高的聚集起始溫度；及/或 •      該抗體之抗體 Fab 片段表現出如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 7.    一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 特異性結合之抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:23 之輕鏈胺基酸序列。 8.    如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為 Fab 片段。 9.    如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為雙特異性抗體片段。 10. 如前述實施例中任一項之抗體，其為單株抗體。 11. 如前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段表現出 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 12. 如前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段表現出如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 13. 如前述實施例中任一項之抗體，其為單株抗體。 14. 如前述實施例中任一者之抗體，其為與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體片段。 15. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為雙特異性抗體。 16. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為 Fab 片段。 17. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為雙特異性抗體片段。 18. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為多特異性抗體。 19. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體與人類 VEGF-A 特異性結合。 20. 如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體與人類 IL6 特異性結合。 21. 一種與人類 IL6 結合之抗體，其在 IL6 上結合至與具有 SEQ ID NO: 35 之 VL 域及 SEQ ID NO: 36 之 VH 域之抗體相同之表位。 22. 一種與人類 IL6 結合之抗體，其中該抗體包含具有人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含如實施例 1 至 20 中任一者之與人類 VEGF-A 及 IL6 結合之抗體之胺基酸殘基 1、2、3、26、27、28、29、30、31、32、52a、94、96、97、98、101、102，及具有人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含如實施例 1 至 20 中任一者之與人類 VEGF-A 及 IL6 結合之抗體之胺基酸殘基 49、50、53、54、55、56、57、91、96。 23. 一種與人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 a)    基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、I2、Q3、Y26、E27、F28、T29、H30、Q31、D32、P52a、R94、I96、D97、F98、D101、T102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、S53、N54、Y55、P56、S57、Y91、Y96；或 b)    基於人類 VH3 骨架的 VH 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y1、 P2、Q3、 V26、 L27、F28、 K29、H30、Q31、D32、P52a、R94、 L96、D97、F98、D101、 E102，及基於人類 Vκ1 骨架的 VL 域，其中 IL6 互補位包含胺基酸殘基 Y49、D50、 D53、 R54、Y55、P56、 E57、Y91、Y96 (根據 Kabat 編號)。 24. 一種經分離之核酸，其編碼如實施例第 1 項至第 23 項中任一項所述之抗體。 25. 一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例 24 之核酸。 26. 一種生產與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體之方法，其包含培養如實施例 25 之宿主細胞，從而生產該抗體。 27. 如實施例 26 之方法，其中宿主細胞為 CHO 細胞。 28. 一種醫藥調配物，其包含如實施例 1 至 23 中任一者之抗體及醫藥上可接受之載劑。 29. 一種端口輸送裝置，其包含如實施例 1 至 23 中任一者之抗體。 30. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體，其用為藥物。 31. 如實施例第 26 項所述之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。 32. 一種抗體，其藉由如實施例 26 或 31 之方法來生產。 33. 一種醫藥調配物，其包含如實施例 1 至 23 中任一者之抗體及醫藥上可接受之載劑。 34. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體，其用為藥物。 35. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體，其用於治療血管疾病。 36. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體，其用於治療眼部血管疾病。 37. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 65 之醫藥組成物在製造藥物中之用途。 38. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 65 之醫藥組成物在製造用於抑制血管生成之藥物中之用途。 39. 一種治療患有血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物。 40. 一種治療患有眼部血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物。 41. 一種抑制個體中之血管生成的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物以抑制血管生成。 42. 一種端口輸送裝置，其包含如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物。 43. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物藉由端口輸送裝置進行眼部投予。 44. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物藉由如實施例 42 之端口輸送裝置進行眼部投予，其中在端口輸送裝置再裝滿之前，於六個月或更長時間內投予，在一個實施例中，於 8 個月或更長時間內投予，在一個實施例中，於 9 個月或更長時間內投予。 45. 如實施例 1 至 23 中任一者之抗體或如實施例 33 之醫藥調配物用為藥物，其藉由使用端口輸送裝置投予抗體或醫藥調配物，其中抗體以 150 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置，在一個實施例中，以 200 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置。 胺基酸序列說明
SEQ ID NO: 1 VL VH6L-BM (揭露於 WO2012/163520) NIQKTQSPSSLSASVGDRVTITCRALWHISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASHLHYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGLPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 2 VH VH6L-BM (揭露於 WO2012/163520) YYQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAADGFLFSGYAMSWIRQAPGKGLEWIGQISGSGGSTVYNYNVLGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTGYFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 3 VL 6HVL_1 DQMTQSPSSLSASVGDRVTITCNAWWNISNYLAWYQQKPGKAPKLLIFDAKYRAPEVPSRFSGSGSGSQFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGWPFTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 4 VH 6HVL_1 GQLVESGGGLVKPGGSLRLSCKASGFYWGPGAMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGGSEWFNPEIKGRFTISRDNNQDTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 5 VL 6HVL_2 DQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALWEVRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDGEYRAPEVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHYAGWPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 6 VH 6HVL_2 GQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYWGPGQMSWVRQAPGKGLEWVGSIDTKGDDEWYDPKFDGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 7 VL 6HVL_3 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRALWEIRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDGEYRAPEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYAGWPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 8 VH 6HVL_3 GQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYWGPGQMSWVRQAPGKGLEWVGSIDTKGRDEWYDPKFDGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 9 VL VH6L_1 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSSEVAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDVVPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIK
SEQ ID NO: 10 VH VH6L_1 YIQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAGYEFTHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 11 VL VH6L_2 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSSEVAWYQQKPGKAPKLLIYDASSNYPSVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIK
SEQ ID NO: 12 VH VH6L_2 YIQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAGYEFTHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIDFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 13 VL VH6L_3 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSEVAWYQQKPGKAPKLLIYDGDTVYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 14 VH VH6L_3 YPQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIDFFDEWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 15 LCDR-1 6HVL_4 QASYWLNSELA
SEQ ID NO: 16 LCDR-2 6HVL_4 DGDDRYP
SEQ ID NO: 17 LCDR-3 6HVL_4 QQYRYTPYT
SEQ ID NO: 18 HCDR-1 6HVL_4 QDMS
SEQ ID NO: 19 HCDR-2 6HVL_4 SIDPRGDHKYYNTKFID
SEQ ID NO: 20 HCDR-3 6HVL_4 DLDFMDE
SEQ ID NO: 21 VL 6HVL_4 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCQASYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDRYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYTPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 22 VH 6HVL_4 YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSIDPRGDHKYYNTKFIDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 23 LC 6HVL_4 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCQASYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDRYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYTPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 24 HC 6HVL_4 YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSIDPRGDHKYYNTKFIDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 25 VL 6HVL_4 YHE AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDRYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYTPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 26 VH 6HVL_4 YHE YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSIDPRGDHKYYNTKFIDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 27 人 VEGFA-121 MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKCDKPRR
SEQ ID NO: 28 人類 IL6 MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
SEQ ID NO:29 CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 30 CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 31 Fab 0182 VL TPVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGFWDIRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDAKYRAPEVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGWPFTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 32 Fab 0182 VH GQLVESGGGLVKPGGSLRLSCKASGFYWGPGAMSWVRQAPGKGLEWVGSIDLKGEDAWFDHEFSGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 33 Fab 0182 LC TPVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGFWDIRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDAKYRAPEVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGWPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 34 Fab 0182 HC GQLVESGGGLVKPGGSLRLSCKASGFYWGPGAMSWVRQAPGKGLEWVGSIDLKGEDAWFDHEFSGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 35 6HVL4.1 VL AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSEVAWYQQKPGKAPKLLIYDASSNYPSVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 36 6HVL4.1 VH YIQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAGYEFTHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIDFFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 37 6HVL4.1 LC MTMITPSFGAFFLEIFNMKQSTIALALLPLLFTPVSKAAIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSEVAWYQQKPGKAPKLLIYDASSNYPSVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
SEQ ID NO: 38 6HVL4.1 HC YIQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAGYEFTHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIDFFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
SEQ ID NO: 39 VL 6HVL_5 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCQASYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIYDGDTNYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYTPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 40 VH 6HVL_5 YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSIDPRGDHKYYNTKFIDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 41 VL 6HVL_6 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCQASYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDTYPEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYTPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 42 VH 6HVL_6 YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPRGDHKYYNTKFIDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 43 VL VH6L_4 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRALWEIRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDGEYRAPEVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHYAGWPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 44 VH VH6L_4 GQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYWGPGQMSWVRQAPGKGLEWVGSIDTKGDDEWYDPKFDGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 45 VL VH6L_5 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRALWEIRDYLAWYQQKPGKAPKLLIFDGEYRAPEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYAGWPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 46 VH VH6L_5 GQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYWGPGQMSWVRQAPGKGLEWVGSIDTKGRDEWYDPKFDGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGFFDTWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 47 LC 6HDL2.05 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGDDRYPEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 48 HC 6HDL2.05 YPQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASVLFKHQDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPSGGSTYYNDNVLGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLDFMDEWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
實例
提供以下實例以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。 實例 1 ： 雙特異性抗 VEGF/ 抗 6 Fab 片段之產生
藉由提供具有單獨的、不重疊的互補位的抗體來產生雙特異性抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段，該互補位使用類似於之前描述的方法 (例如在 WO2012/163520 中) 與 VEGF 及 IL-6 結合。
此處利用兩個不同的合成 Fab 片段之噬菌體展示文庫，其中在第一噬菌體展示文庫中，Fab 片段之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 區內的殘基多樣化，且其中在第二噬菌體展示文庫中，Fab 片段之 CDR-L1、CDR-L3 及 CDR-H2 區內的殘基多樣化。在每個文庫中，相應的其他三個 CDR 區保持非多樣化，並且——與 WO2012/163520 的方法相反，該方法使用不變的非結合、種系樣 (「虛擬」) 序列——代表能夠與 VEGF-A 結合的互補位。
在 第一文庫的情況下，能夠與 VEGF-A 結合的互補位來源於 WO 2021/198034 中描述的 VEGF-A 結合互補位。
在 第二文庫的情況下，VEGF-A 結合互補位係如下獲得：
對於初始選擇，使用 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 已多樣化的文庫進行噬菌體文庫淘選，如 WO2012/163520 中所述。使用非結合、種系樣序列保持剩餘的 CDR 序列恆定。在 4 輪中，其中使用預固定在 Dynabeads M-280 鏈黴親和素 (Thermofisher 目錄號 11206D) 上的 100 nM 生物素化 VEGF-121 或 VEGF-165 進行第一輪。分別使用溶液中的 75、15 及 3 nM 生物素化標靶進行第 2 至 4 輪淘選，隨後在 Dynabeads M-280 鏈黴親和素上捕獲噬菌體上的 Fab/標靶複合體。用 PBST 及 PBS 緩衝液洗滌噬菌體/標靶/珠粒複合體多次。根據標準方案，使用 100mM DTT 從 M-280 珠粒上洗脫捕獲的帶有標靶特異性 Fab 的噬菌體複製，用於感染對數期 TG1 大腸桿菌細胞，並使用 M13 K07 輔助噬菌體拯救。
為了篩選選擇輸出，從感染的 TG1 大腸桿菌細胞中製備了相應選擇輪次的多複製質體小量製備物。質體被重新格式化以在 Fab CH1 域的 C 末端帶有 T7 標記的大腸桿菌上清液中產生可溶性 Fab。將編碼 T7 標記的 Fab 的連接多複製質體轉化到 TG1 大腸桿菌細胞 (Zymo Research 目錄號 T3017) 中，並將單菌落挑到微量滴定盤中。可溶性 Fab 在微量滴定盤中表現，並且藉由離心來澄清上清液。藉由針對 VEGF 的 ELISA 測量以及針對 VEGF 受體 2 的競爭性 ELISA 來評定標靶結合。基於對 VEGF 的高結合訊號以及對受體結合的良好抑制來選擇候選結合物。
接著以更大的體積表現及純化結合物，並使用 SPR 測量來評定與 VEGF 的結合。藉由迭代蛋白質工程及測試策略對獲得的複製之一來進一步優化，並作為 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的不變序列整合到噬菌體展示文庫中。簡而言之，蛋白質工程工作流由初始輪次的偵察突變組成以識別相關的有益突變，隨後是基於基於寡核苷酸生成突變體文庫及基於噬菌體展示的選擇的連續兩輪親和力成熟，隨後是篩选及進一步測試。
在兩個文庫中，Fab 片段之 CH1 域通過連接子與截短之基因 III 蛋白融合，以促進噬菌體展示。因此，一個文庫旨在篩選雙特異性 Fab 片段，其中 IL6 互補位包含來自 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基 (本文稱為「6HVL」文庫)，且另一文庫旨在篩選對於雙特異性 Fab 片段，其中 IL6 互補位包含來自 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基 (本文稱為「VH6L」文庫)。
藉由噬菌體文庫淘選來富集針對人類 IL-6 的結合物的每個文庫。淘選後，針對兩個富集的噬菌粒載體池生成質體小量製備物。將小量製備物用限制酶消化以切除編碼截短的基因-III 蛋白之區域，並藉由連接重新環化以獲得編碼富集 IL-6 結合物的可溶性 Fab 片段的表現載體池。將這些載體池轉化到 TG1 大腸桿菌細胞中，挑取並培養單個菌落，以便在微量滴定板中可溶性表現單個 Fab 選殖株。使用標準 ELISA 方法篩選包含可溶性 Fab 片段的上清液以用於結合 IL-6 及 VEGF-A。
基於篩選資料，選擇雙特異性抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段，並對產生特異性結合物的 TG1 複製進行 DNA 質體製備及測序，以獲得 VH 及 VL 序列對，該序列對共同編碼一個分別與來自每個文庫的 IL-6 及與 VEGF-A 特異性結合的雙特異性 Fab 片段：
複製是 6HVL_1，其特徵在於 SEQ ID NO:03 之重鏈及 SEQ ID NO:04 之輕鏈，以及 VH6L_1，其特徵在於 SEQ ID NO:09 之重鏈及 SEQ ID NO:10 之輕鏈。 實例 2 ： 雙特異性抗 VEGF/ 抗 IL-6 Fab 片段 6HVL_1 及 VH6L_1 之表現及表徵
對所得雙特異性抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段進行了表徵。將如實例 1 所述獲得的載體轉化到 TG1 大腸桿菌細胞中，並且針對 6HVL_1 及 VH6L_1 培養單獨的菌落用於雙特異性抗體 Fab 片段的可溶性表現。藉由親和力層析從 TG1 培養物上清液中純化雙特異性抗體。評定了雙特異性抗體 6HVL_1 及 VH6L_1 與來自人類及食蟹獼猴 IL6、人類 VEGF121 及人類 VEGF165 的 IL-6 的結合。 實例 3 ： 雙特異性抗 VEGF/ 抗 IL-6 Fab 片段 6HVL_1 及 VH6L_1 之表徵 藉由表面電漿子共振 (SPR) 評定的 IL-6 結合動力學：
表面電漿子共振 (SPR) 用於測量代表性 VEGF-IL-6 Fab 片段對本文揭露的人類及食蟹獼猴 IL-6 的結合動力學及親和力。
使用 HBS-EP+ (1x；BR100669；Cytiva) 作為運行緩衝液，在 25°C 在 Biacore 8K 儀器 (Cytiva) 上對來自人類及食蟹獼猴的相應 Fab 片段 IL-6 的結合進行 SPR 分析。將人類 Fab 結合物 (28958325，Cytiva) 在 10 mM 乙酸鈉緩衝液 pH 5.0 中稀釋至最終濃度 10 μg/ml，並使用標準胺偶合化學固定在 CM5 感測器晶片上。這種固定程序導致配體密度為約 5000 共振單位 (RU)。相應地處理了參考通道。
在蛋白質測量之前，為了調節目的進行了五個啟動循環。在每個循環中，HBS-EP+ 緩衝液流動 120 s，隨後藉由應用 10 mM 甘胺酸緩衝液 pH2.0 60 s 來再生衍生晶片表面。在 HBS-EP+ 緩衝液中以 10 ul/min 的流速在該表面上捕獲濃度為 75 nM 的 Fab 片段 60 s。沒有 Fab 片段施加至參考通道。接著，在 HBS-EP+ 緩衝液中以 30 ul/min 的流速 (接觸時間 180 s，解離時間 720 s)，以適當的稀釋系列應用人類或食蟹獼猴 IL-6。衍生化晶片表面的再生已實現，如上所述。使用 8K 評估軟體 (Biacore Insight Evaluation 3.0) 評估資料。使用雙重引用並使用 1:1 綁定模型來擬合原始資料。
圖 1顯示了為測試的 Fab 片段判定的代表性 SPR 軌跡和擬合曲線，圖中提供了相應的 Fab 名稱。描述了與人類及食蟹獼猴 IL-6 以及作為陰性對照的 IL-1α (IL-1a) 結合的資料。圖中提供的親和力對應於三個獨立實驗的平均值和標準偏差。
我們觀察到 6HVL_1 及 VH6L_1 與人類 IL-6 的明確結合。只有 VH6L_1 顯示出對 cyIL-6 的顯著親和力，儘管解離速率顯然非常快。未觀察到與陰性對照標靶 IL-1a 的結合。SPR 資料擬合的結果如 表 1所示。對三個實驗的資料進行平均，並為解離常數 KD 提供標準偏差。對於 6HVL_1，我們觀察到 KD=0.9nM 的親和力，而對於 VH6L_1，親和力為 KD=10.7nM。 表 1 ：人類及食蟹獼猴 IL6 的指定抗體的親和力
人類 IL6 食蟹獼猴 IL6
K D[nM] SD [nM] K D[nM] SD [nM]
6HVL_1 0.93 0.04 210 17
VH6L_1 10.7 0.3 - -
藉由競爭性 ELISA 評定的 VEGF 結合：
為了測試需要哪種抗體濃度來阻斷 VEGF121 及 VEGF165 與其受體的相互作用，對 6HVL_1 及 VH6L_1 進行了競爭性 ELISA 實驗。結合 VEGF 的 Fab 片段蘭尼單抗用作陽性對照，僅使用緩衝液的實驗用作陰性對照。簡而言之，將所有樣品的 1:3 稀釋系列 - 從 20nM 開始 - 與恆定濃度的 10 pM VEGF121 (Humanzyme HZ-1206) 或 10 pM VEGF165 (Humanzyme HZ-1153) 混合併培育 90 min。在用 2% MPBST 封閉 Maxisorp 盤表面後，將該混合物轉移到已塗有 VEGF 受體 1 (VEGF-R1、R&D 系統、NaHCO3 中 1µg/ml、pH 9.4) 的 Maxisorp 盤。Fab-抗原混合物與受體包被盤之間的接觸時間在室溫下限制為 10 min，以盡量減少對結合平衡的干擾。在培育及 2 個洗滌步驟後，使用生物素化抗 VEGF mAb (BAF203，R&D 系統) 及辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素 (HRP-鏈黴親和素) 檢測 VEGFR1 包被盤上的 VEGF121/VEGF165。後者利用 HRP 底物 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 TMB 向 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺二胺的顯色轉化進行檢測，隨後可在 450nm 處發生吸光度變化。在添加 1N H 2SO 4進行淬火之前，將 TMB 預熱至室溫並在盤上培育 5 min。
標靶 VEGF165 的結果如 圖 2以及 表 5及 表 6所示。顯然，與蘭尼單抗 (臨床上公認的 VEGF-A 拮抗劑) 相比，VH6L_1 及 6HVL_1 都展示出大大改善的 VEGF165 及 VEGF121 與 VEGFR1 結合競爭的能力。 實例 4 ： 雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 IL6 Fab 片段之改善
如上所示，兩種抗體均未表現出與食蟹獼猴 IL6 的交叉反應性或表現出較低的交叉反應性，然而，這是臨床開發所需要的。除此之外，眼部血管疾病的治療需要將治療劑注射到眼睛中，因此最佳的治療劑應該對標靶抗原展示出高親和力及高濃度，以最大化治療效果的持久性及患者便利性。因此，出於預期目的，需要進一步改進最初鑑定的分子。
藉由在 VH 及 VL 域中引入不同的胺基酸取代進行多輪熟化。在成熟過程中，根據在產率、親和力、同時抗原結合、親水性、穩定性、黏度及其他參數等方面所需的特性，篩選並選擇來源於兩種「親本」抗體 6HVL_1 及 VH6L_1 的候選抗體。
改善的候選抗體 6HVL_2、6HVL_3 及 6HVL_4 以及 VH6L_2 及 VH6L_3 選自每輪成熟的多個測試候選抗體分子。候選者的選擇係基於所需的特性，特別是改善人類 IL6 結合及食蟹獼猴 IL6 交叉反應性，同時確保高濃度下的可注射性並保持其他有利特性，例如 VEGF-A 親和力及熱穩定性。
從多種經測試之候選抗體分子中選擇改善之候選抗體 6HVL_4 作為較佳候選。 表 2 ：指定雙特異性 Fab 片段之胺基酸序列 ( 編號是指如本文所用之 SEQ ID NO)
VL VH 輕鏈 重鏈
6HVL_2 5 6      
6HVL_3 7 8      
VH6L_2 11 12      
VH6L_3 13 14      
6HVL_4 21 22 23 24
6HVL_4_YHE 25 26      
所有 Fab 片段都包含與抗體 VH6L_4 的全長輕鏈及重鏈胺基酸序列中包含的相同的恆定區，即具有 SEQ ID NO:29 的 CL 及具有 SEQ ID NO:30 的 CH1。
候選抗體之表現如實例 2 所述。 實例 5 ： 經改善之抗 VEGF-A/ 抗 IL6 Fab 片段之抗原結合動力學
使用指定的 Fab 片段 (如 表 2及 實例 2中所示的胺基酸序列) 如上所述評定與人類及食蟹獼猴 IL6 的結合動力學及 VEGF/VEGFR1 競爭候選抗體的競爭性 IC50。為了判定本發明的抗體相對於現有技術的效力，採用以下對照：雙特異性抗體 VH6L (WO2012/163520 中公開的VH/VL序列，本文稱為「VH6L-BM」)，抗 VEGF 抗體蘭尼單抗 (INN) 及抗 IL6 抗體在人類與食蟹獼猴 IL6 之間發生交叉反應，如 WO2014/074905 中所揭露 (陽性對照)。藉由重組表現來製備上述現有技術抗體。
圖 3以及 表 3 及表 4顯示了人類及食蟹獼猴 IL6 結合的評定結果。6HVL_4 及 6HVL_4-YHE 是 6HVL_4 的變體，具有三個進一步的框架胺基酸突變，與最初選擇的親本分子相比，表現出改善的人類 IL6 結合以及藥理學相關範圍內的食蟹猴 IL6 交叉反應性。 表 3 ： SPR 人類 IL6
K D[nM] SD [nM]
6HVL_1 0.927 0.042
6HVL_2 0.036 0.003
6HVL_3 0.043 0.013
6HVL_4 0.069 0.002
6HVL_4_YHE 0.065 0.002
VH6L_1 10.7 0.3
VH6L_2 0.157 0.003
VH6L_3 0.191 0.027
VH6L_BM 3.5 0.6
位置控制 0.035 0.007
表 4 ： SPR 食蟹獼猴 IL6
K D[nM] SD [nM]
6HVL_1 210 16.57
6HVL_2 23.37 0.84
6HVL_3 0.98 0.07
6HVL_4 1.48 0.09
6HVL_4_YHE 1.39 0.04
VH6L_1 n.s.*   
VH6L_2 1.3E-03 0.29
VH6L_3 5.3E-03 0.51
VH6L_BM n.s.*   
位置控制 1.8E-04 0
*沒有可評估的訊號
圖 4以及 表 5及表 6 顯示了 VEGF 結合的評定結果，如藉由使用人類 VEGF121 及人類 VEGF165 的競爭性 ELISA 評定的。圖 4 說明了現有技術分子 6HVL_BM 表現出的親和力太低而無法在測定條件下檢測到，因此肯定比本發明的抗體的親和力低得多。 表 5 ： IC50 VEGF121
IC50 [pM] SEM [nM]
6HVL_1 173 12
6HVL_2 194 13
6HVL_3 171 11
6HVL_4 458 30
6HVL_4_YHE 528 35
VH6L_1 26 2
VH6L_2 38 3
VH6L_3 20 1
蘭尼單抗 503 25
表 6 ： IC50 VEGF165
IC50 [pM] SEM [nM]
6HVL_1 182 17
6HVL_2 143 13
6HVL_3 114 11
6HVL_4 111 10
6HVL_4_YHE 135 13
VH6L_1 65 6
VH6L_2 62 6
VH6L_3 32 3
蘭尼單抗 1184 81
實例 6 ： 抗 VEGF/ 抗 IL-6 Fab 片段的同時結合
本發明的抗體與其標靶的同時結合係藉由使用固定化抗 Fab 抗體的表面電漿子共振捕獲本發明的抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段如下評定：
使用標準胺偶合化學將大約 5000 個共振單位 (RU) 的抗 Fab 抗體 (Cytiva 28958325) 固定到 S 系列感測器晶片 CM5 (Cytiva BR100530) 上。作為運行及稀釋緩衝液，使用 HBS-P+ (10 mM HEPES、150 mM NaCl pH 7.4、0.05% 表面活性劑 P20) 並將流動池的溫度設置為 25°C。
通過 κ 鏈捕獲抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段，以 5 μL/min 的流速注射 10 μg/mL 溶液 30 sec，形成抗 Fab 抗體/抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 複合體。順序或同時添加兩種抗原，人類 VEGFA121 (內部生產，P1AA1779-010) 及人類 IL-6 (商業，Peprotech #200-06)，以允許形成包含抗 Fab 抗體、抗 VEGF/抗 IL-6 Fab、人類 VEGFA 及人類 IL-6 的複合體。監測相應的 SPR 反應單位曲線 (Biacore T200，Cytiva)。對於順序結合，注射濃度為 300 nM 的人類 VEGFA 180 sec，隨後額外注射濃度為 300 nM 的人類 IL-6 180 sec。同樣的濃度也以相反的順序注射 (首先是人類 IL-6，隨後是人類 VEGFA)。類似地，將兩種抗原的混合物以每種 300 nM 的濃度注射 180 s。在每個實驗之後，藉由在 60 sec 內以 5 µL/min 的流速注射 10 mM 甘胺酸 pH 2.1 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含經捕獲之 Fab 的對照流動池獲得之反應，校正本體折射率差。
結果如 圖 7所示。將人類 VEGF-A 添加到抗 Fab/抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 複合體中導致結合及抗 Fab/Fab/VEGF-A 複合體形成。順序添加人類 IL-6 導致形成抗 Fab/DutaFab/VEGF-A/IL-6 複合體 (虛線曲線)。這清楚地表明了人類 VEGF-A 及人類 IL-6 與抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 的同時結合是可能的。
以相反的順序，首先添加人類 IL-6，隨後順序添加人類 VEGF-A，同時結合的減少是顯而易見的 (虛線)。這表明人類 IL-6 的結合首先在空間上乾擾人類 VEGF-A 的結合，導致抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 與人類 VEGF-A 之間的結合能力降低，但仍有可能。
在兩種標靶都存在的情況下，人類 IL-6 結合似乎是首選，而與人類 VEGF-A 的結合減少 (實線)。由於與人類 VEGF-A 相比，抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 對人類 IL-6 具有更高的固有親和力，因此這種效果是合理的。
在另一項測定中，藉由使用固定化 VEGF-A 的表面電漿子共振 抑制測定評定了在IL-6 存在下抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段對 VEGF-R2 的阻斷：
為了顯示人類 VEGF-A 及人類 IL-6 與抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段的同時結合，使用標準胺偶合化學將人類 VEGF 受體 2 (VEGFR2，商業 R&D 系統 357-KD) 固定到 S 系列感測器晶片 CM5 (Cytiva BR100530)，導致大約 11000 個共振單位 (RU) 的表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液。
作為參考，使用了 50 nM 人類 VEGFA 溶液中的 0-200 nM 抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段的 1:2 稀釋系列，並測試了 VEGFA 及 VEGFR2 抑制。將抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段/VEGFA 混合物以 5 µL/min 的流速注射到固定化的 VEGFR2 表面上 30 sec。在 60 sec 的解離期之後，藉由在 30 sec 內以 5 µL/min 的流速注射 5 mM NaOH 來再生 VEGFR2 表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自空白對照流動池獲得之反應，校正本體折射率差。在評估時，取注射結束後五秒的結合反應。在沒有雙特異性 Fab 的情況下，RU 中的衍生反應被轉化為相對於對應於配體的初始訊號的結合反應。使用 4 參數邏輯模型 (XLfit，ID Business Solutions Ltd.) 計算 IC50 值
除了參考之外，0-200 nM 抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段在存在具有 10 nM 人類 IL-6 的溶液中的稀釋液預培育 15 分鐘並進行測試以計算 IC50 值 (圖3).
結果如 圖 8所示。該圖顯示了依賴於競爭性抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 濃度的 VEGFR2/VEGF-A 相互作用的抑制。在不存在抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 的情況下，實現了 100% VEGFR2/VEGF-A 結合 (0% 抑制)，而增加抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 濃度增加抑制 (帶十字的實線)。添加人類 IL-6 模擬治療相關條件不影響 VEGFR2/VEGF-A 的抑製程度，並導致非常相似的 IC50 值 (IC50 = 33 nM，沒有人類 IL-6 (帶三角形的虛線)，IC50 = 37 nM，帶有額外的人類 IL-6 (帶三角形的黑色虛線))。
在第三個測定中，VEGF 結合對 IL6 活性的影響係藉由 基於細胞的 IL-6 特異性報告基因測定如下評定：
為了評定人類 VEGFA 及人類 IL-6 與抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 的同時結合，使用報告細胞系 HEK-Blue™ IL-6 細胞進行基於 IL-6 特異性細胞的報告基因測定 (InvivoGen)。將細胞與抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 及人類 IL-6 在不存在及存在過量人類 VEGF-A 的情況下，藉由同時添加 ( 圖 9) 或預培育雙特異性 Fab 及人類 IL-6 後 ( 圖 10) 培育 20 +/- 1 小時。人類 IL-6 與其在 HEK-Blue™ IL-6 細胞表面上的受體 IL-6R 的結合通過 Janus 家族 (JAK1、JAK2 及 Tyk2) 的酪胺酸激酶觸發訊號級聯，從而激活訊號轉導及轉錄激活因子 3 (STAT3) 以及隨後分泌的 SEAP (分泌性胚胎鹼性磷酸酶)。在抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 與人類 IL-6 結合的情況下，訊號被抑制並且不產生 SEAP。隨後藉由將 QUANTI-Blue SEAP 底物添加到上清液的等分試樣中來量化細胞培養上清液中的 SEAP 水平。SEAP 將 QUANTI-Blue 底物轉化為可使用酶標儀在 650 nm 吸光度下測量的產物。然後藉由繪製平均吸光度與抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 濃度的關係圖來評定人類 VEGFA 及人類 IL-6 的同時結合，並將資料擬合到受約束的 4 參數曲線。使用 4 參數邏輯曲線擬合計算樣品的相對效力 (抑制濃度)。
結果示於 圖 9 及圖 10中。
圖 9顯示了沒有預培育的結果。增加抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 量的滴定顯示出清晰的劑量反應曲線，計算的 IC 50值為 1.134 ng/mL (~22.5 pM)，表明藉由增加抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 的量對人類 IL-6 反應的明顯抑制。為了解決人類 IL-6 及 VEGFA 與雙特異性 Fab 同時結合，同時培育兩種靶分子並測量人類 IL-6 效應。無論選擇何種比率，人類 VEGFA : 人類 IL-6 (1 : 1 / 2.5 : 1 / 5 : 1) 僅注意到有效 IC 50值略有下降。當人類 VEGF-A 以 5 倍過量存在時，不存在人類 VEGFA 的值從 IC 50= 1.134 ng/mL 略微變化到 IC 50= 1.724 ng/mL，這種情況密切反映了活體內相關條件。
圖 10顯示了預培育的結果，說明 IL6 的結合不影響 IL6 結合。 實例 7 ： 如藉由 X 射線晶體學及擬議的作用模式所判定的抗 VEGF/ 抗 IL-6 Fab 片段與 IL-6 的結合
IL-6 訊號由 IL6 與其非訊號輔助受體 IL6R 及細胞因子受體 gp130 形成六聚體複合體啟動。此處已定義了三個表位 (位點 1、2 及 3) 以鑑定複合體中形成的接觸表面 (Boulanger MJ 等人，Science 2003，27;300(5628):2101-4.)。IL-6 首先通過稱為「位點 1」的相互作用表面與 IL-6R 結合。「位點 2」是由 IL-6 及 IL-6R 的二元複合體形成的表位，它與 gp130 的域 2 及 3 相互作用。IL6 的「位點 3」與 gp130 的域 1 之間的後續相互作用導致形成 IL6/IL6R/gp130 三聚體的二聚體，從而形成六聚體訊號複合體。
為了了解 IL6 的哪些表位與我們的兩個系列 Fab (6HVL 及 VH6L) 結合，我們對 IL-6 與分別代表本發明的抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 片段的抗體 Fab 之間的複合體進行了結構分析。使用的 Fab 6HVL4.1 與 Fab 6HVL_2 密切相關，僅相差兩個突變，而 Fab 0182 與 Fab VH6L_1 的關係最密切。由於所有 6HVL 複製都來源於相同的 Fab (6HVL_1)，同樣所有 VH6L 複製都分別來源於 Fab VH6L_1，因此可以安全地假設以下獲得的結構結果適用於個別 Fab 系列中的每個系列。Fab 及 IL-6 的複合體的形成及複合體結構的分析通過 X 射線晶體學如下進行：
藉由分別將等摩爾量的 Fab 片段 0182 (輕鏈胺基酸序列 SEQ ID NO：33，重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO：34)或 6HVL4.1 (輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：37，重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO：38) 與 IL-6 (PeproTech，Lot#031316-2) 混合來製備 IL6-Fab 複合體。
在冰上培育 90 分鐘後，蛋白質複合體濃縮至 Fab 片段 0182 的 23.1 mg/ml 及 6HVL4.1 的 21.3 mg/ml。初始結晶試驗於 21℃ 在坐滴蒸汽擴散裝置中進行。
對於 Fab 片段 0182，在 0.1M MgCl 2、0.1M 檸檬酸鈉 pH 5、15% (w/v) PEG 4000 中的兩天內出現針狀晶體。隨後將晶體用於接種實驗，並且可以從 0.1 M 乙酸鈣、12% (w/v) PEG 8000、0.1 M 二甲胂酸鈉、pH 5.5 中獲得大的四方晶體。
對於 6HVL4.1，在 0.2 M 硫酸銨、0.1 M Tris、pH 7.5 pH 及 20% (w/v) PEG MME 5000 中的一天內出現菱形晶體。
為了資料收集，將收集晶體在補充有 15% 乙二醇的結晶溶液中閃冷至 100K。使用 PILATUS 6M 檢測器以 Swiss 光源 (Villigen, Switzerland) 的光束線 X10SA 在 Fab 片段 0182 的 0.9999 Å 及 6HVL4.1 的 0.9982 Å 的波長下收集 X 射線衍射資料。資料已使用 XDS 處理(Kabsch, W., XDS.Acta Cryst .D66, 125-132 (2010))，使用 AIMLESS 縮放(P.R.Evans 及 G.N.Murshudov 「我的資料有多好，解析度是多少？」Acta Cryst.(2013)。D69, 1204–1214) 並使用 STARANISO 分析各向異性(Tickle, I.J., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Sharff, A., Vonrhein, C., Bricogne, G. (2018)).STARANISO ( http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi).Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.)。
包含 Fab 0182 的複合體的晶體屬於空間群 P2 1，晶胞軸為 a= 65.93 Å，b= 65.46 Å，c= 159.30 Å，β=91.65°，且衍射解析度為 2.18 Å。
包含 6HVL4.1 的複合體的晶體屬於空間群 P2 12 12 1，晶胞軸為 a= 57.56 Å，b= 64.98 Å，c= 203.68 Å，且衍射解析度為 1.94 Å。
結構使用 PHASER 藉由分子置換來判定 (McCoy, A.J，Grosse-Kunstleve, R.W.，Adams, P.D.，Storoni, L.C., 及 Read, R.J.Phaser 晶體學軟體。J Appl Cryst.40, 658-674 (2007))，使用內部 Fab 及 IL-6 (pdb 條目 1alu) 的坐標作為搜索模型。差異電子密度用於根據序列差異改變胺基酸。使用 CCP4 套件中的程序對結構進行了改進 (Winn，M.D. 等人Overview of the CCP4 suite and current developments.Acta.Cryst.D67, 235-242 (2011)) 及 BUSTER (Bricogne,  Blanc, G.E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O.Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd. (2011))。使用 COOT 進行手動重建 (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G., Cowtan, K. Features and Development of Coot。Acta Cryst.  D66, 486-501 (2010))。
資料收集及精化統計總結於 表 7中。所有圖形演示均使用 PYMOL (Pymol 分子圖形系統，1.7.4 版Schrödinger，LLC) 製備 表 7 資料收集及細化統計
   Fab0182 – IL-6 複合體 Fab 6HVL4.1 – IL6 複合體   
資料收集         
空間群 P2 1 P2 12 12 1   
細胞尺寸          
    a, b, c(Å) 65.930、65.46、159.30 57.56、64.98、203.68   
    α、β、γ (°) 90、91.65、90 90、90、90   
解析度 (Å) 2.18 1.94   
R meas 0.12 0.10   
I/ σ I 9.98 (1.87) 10.00 (0.85)   
CC(1/2) 完整性橢圓整體 (%) 完整性橢圓內殼 (%) 完整性橢圓外殼 (%)    0.996 (0.579) 48.1 99.7 6.0    99.2 (98.6)   
冗餘 3.80 (3.55) 7.34 (7.55)   
        
精化         
解析度 (Å) 79.62 – 2.18 38.80 – 1.94   
反射號 34236 57144   
R work/ R free 17.70/24.80 19.80/23.10   
原子數         
    蛋白質 8774 4502   
    水 411 347   
B因子         
    蛋白質 49.37 48.57   
    水 30.70 56.30   
R.m.s 偏差         
    鍵長 (Å) 0.010 0.010   
    鍵角 (°) 編號 1.22 1txqc c   
*圓括號中之值為針對具有最高解析度之外殼。
Fab 0182 的結構 – IL-6 複合體
Fab 0182 複合體 (Fab 的 VH6L 系列的代表) 與具有 IL-6 的複合體的晶體結構以 2.18 Å 的解析度判定 ( 圖 5)。該結構顯示 Fab 0182 藉由 重鏈的 CDR2 及輕鏈的 CDR1 、 CDR3的貢獻與 IL-6 結合。Fab 0182 輕鏈的 N 端殘基 Val3 及 Gln4 維持與 IL-6 的進一步相互作用。IL-6 貢獻的界面係藉由螺旋 A 及螺旋 C 的殘基形成。
圖 16說明了 Fab 0182 與 IL6 的結合模式。為了說明的目的，我們生成了兩個結構的疊加：首先，Fab 與 IL6 的複合體結構，其次，IL6R 與 IL6 的複合體結構 (取自 IL6、IL6R 及 gp130 的共晶結構，pdb 登記碼為 1p9m，參見 Boulanger MJ 等人，Science 2003，27;300(5628):2101-4)。將其與 IL6 與 IL6R 及 gp130 的三聚體複合體進行比較，顯然 Fab 以與 gp130 非常相似的方式與 IL6 結合，即它與 IL6 的位點 2 結合。預期這種結合模式允許 Fab 及 IL6R 與 IL6 同時結合，即 IL6 與 IL6R 的相互作用應該仍然是可能的，並且此等 IL6 拮抗劑先驗預期藉由通過與 IL6 的位點 2 結合抑制 IL6/IL6R 複合體與 gp130 的相互作用來工作。
Fab 6HVL4.1 的結構 – IL-6 複合體
我們以 1.94 Å 的解析度判定了 Fab 6HVL4.1 複合體與具有 IL-6 的複合體的晶體結構 ( 圖 6)。該結構顯示 Fab 6HVL4.1 藉由 重鏈的 CDR1 、 CDR3 及輕鏈的 CDR2 、 CDR3的主要貢獻與 IL-6 結合。Fab 6HVL4.1 重鏈的前三個 N 端殘基維持與 IL-6 的進一步相互作用。IL-6 貢獻的界面係藉由螺旋 A 及螺旋 C 的殘基形成。
與對 Fab 0182 所做的類似，我們使用結構疊加並藉由分析如上所述的相互作用殘基來分析 Fab 6HVL4.1 與 IL6 的結合模式。 圖 17表明 6HVL4.1 也以與 gp130 非常相似的方式與 IL6 結合，因此從結構的角度來看，必須將其視為位點 2 結合物。
與 IL6 結合的模式的實驗研究
複製如 6HVL4.1 及其衍生物是 IL6 位點 2 結合物這一事實可以藉由利用表面電漿子共振的測定在功能上得到證實。
在一個此等測定中，代表包含 6HVL4.1 (抗體「P1AE2421」) 的 6HVL 系列複製的 Fab 片段通過抗 Fab 抗體在 SPR 晶片表面捕獲，以及三種不同濃度的 IL6 及隨後的 IL6R (250、500、1000nM) 流過晶片表面。此處如果 IL6 能夠與 Fab 及 IL6R 結合，我們預期兩步連續訊號增加。事實上，對於 Fab 測試，這是觀察到的 ( 圖 18)：在 SPR 訊號軌跡中，添加 IL6 導致訊號強烈增加，添加 IL6R 後進一步增強。這清楚地表明 IL6R 及 Fab 與 IL6 的同時結合是可能的。這一發現得到以下事實的進一步證實：IL6 及 IL6R 的共價嵌合體 (稱為「超-IL6」)，其中 IL6 的位點 1 被完全屏蔽且不可接近，當包被到 SPR 晶片上時，仍然促進了相應 Fab 分子的結合，並且用濃度為 26nM 的 Fab 進行探測 ( 圖 19)。
然而，當利用 ELISA 實驗研究捕獲的 Fab 片段是否與 IL6 與 IL6R 的結合競爭時，我們獲得了一個令人驚訝的結果。測定設置如下：首先，將恆定濃度的 IL6 與 Fab 片段 P1AE2421 的滴定系列一起預培育，該片段也用於 SPR 實驗並且代表 6HVL 系列複製。然後將其在直接用 IL6R 包被的 ELISA 盤上培育。洗滌後，利用辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素 (Strep-HRP)，用生物素化抗 IL6 抗體檢測與盤結合的 IL6R 結合的 IL6。在此測定中 ( 圖 20)，我們觀察到的結果非常表明 Fab 幾乎完全抑制了 IL6/IL6R 相互作用。
鑑於我們從可用的晶體結構及 SPR 實驗中知道 IL6 的位點 1 仍然可用於結合，我們必須解釋這些結果，使得本專利中描述的 IL6 抗體不僅能夠在空間上阻斷 IL6/IL6R 複合體與 gp130 的結合，而且也強烈 變構地降低 IL6 與 IL6R 的結合親和力，即另外在功能上充當 IL6 位點 1 拮抗劑。
由於以下原因，預期此等作用方式具有最佳特性： 1.            由於是 IL6 位點 2 結合物，IL6 拮抗劑能夠藉由 IL6 與結合膜 IL6R 及 gp130 (順式訊號) 結合或 IL6 及 IL6R (反式訊號) 的預形成複合體同樣有效地阻斷訊號複合體的形成。相反，IL6 位點 1 結合物不能與 IL6 及 IL6R 的預形成複合體結合，但只能在複合體解離時拮抗它。 2.            由於變構降低了 IL6 對 IL6R 的親和力，與不表現出這種效應的位點 2 結合物相比，此處描述的 IL6 拮抗劑預期藉由不利於形成訊號的第一步，即形成 IL6/IL6R 複合體來展示增加的效力。不變構干擾位點 1 結合的位點 2 結合物預期有一個缺點，特別是對於順式訊號，即當必須阻斷細胞表面上的 IL6/IL6R-gp130 複合體形成的第二步時，相對有效的 IL6/IL6R 及 gp130 濃度預期非常高。 3.            IL6 位點 1 結合物當作為抗體全身使用時，已知會導致 IL6 與抗體的複合體大量積累，因為與單獨的 IL6 相比，複合體的半衰期大大增加。相反，預期 IL6 位點 2 結合物仍可藉由與膜結合的 IL6R 結合以及隨後吸收複合體的細胞的內化和降解來允許消除 IL6/抗體複合體。在這方面，此處描述的 IL6 拮抗劑預期組合位點 1 及位點 2 結合物的期望特性：雖然在功能上能夠阻斷 IL6/IL6R/gp130 訊號複合體形成的第一步，但它們仍然允許 IL6/mAb 複合體通過 IL6R 與細胞結合而降解。 4.            在眼科適應症中並用作 Fab 分子，此等結合物的預期行為可能仍然更有益：與 IL6 位點 1 結合物類似，Fab/IL6 複合體可以使眼部空間相對不受 IL6R 結合的阻礙，並且可以藉由腎臟過濾快速全身清除。 實例 8 ： 經改善的抗 VEGF/ 抗 IL6 Fab 片段的熱穩定性
產生了改善的抗 VEGF/抗 IL-6 抗體的其他序列變體，包含表 8 中確定的胺基酸序列。 表 8 ：指定雙特異性 Fab 片段之胺基酸序列 ( 編號是指如本文所用之 SEQ ID NO)
VL VH
6HVL_5 39 40
6HVL_6 41 42
VH6L_4 43 44
VH6L_5 45 46
如下評定指定雙特異性抗體的熱穩定性。
熱穩定性：
在 20 mM 組胺酸/組胺酸氯化物、140 mM NaCl (pH 6.0) 中製備濃度為 1 mg/mL 的雙特異性抗體 Fab 片段樣品，並將其轉移至 10 µL 微量比色皿陣列。使用 UNcle 儀器 (Unchained Labs)，記錄 266 nm 激發後之靜態光散射以及螢光資料，同時樣品以 0.1℃/min 的速率從 30℃ 加熱至 90℃。樣品重複測量三次。
藉由 UNcle 分析軟體完成對起始溫度的評估。聚集起始溫度定義為散射光強度開始增加的溫度。藉由螢光訊息之重心均值 (BCM) 隨溫度之變化來監測蛋白質之變性。解構溫度定義為 BCM (nm) vs. 溫度曲線之反曲點。 表 9 ：熱穩定性
Tagg (℃) Tm
6HVL_4 64.7 70.1
6HVL_5 64.9 71.3
6HVL_6 63.4 66.8
VH6L_3 65.8 77.0
VH6L_4 66.6 76.3
VH6L_5 66.6 77.0
實例 9 ： 經改善之雙特異性抗 VEGF/ 抗 IL6 Fab 片段之生物物理特性 ( 藉由動態光散射 (DLS) 評定黏度 )
如前文所述的抗體 Fab 片段藉由標準方法在 CHO 細胞中表現。
用前文所述的乳膠-珠粒 DLS 方法測量黏度 (He F 等人；Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1):141-3)。具體而言，按照以下方案使用指定材料進行評估。
黏度評估：
儀器及材料 •     Wyatt DLS 酶標儀，配備 Greiner Bio-One 微孔板 •     3000 系列 Nanosphere™ 尺寸標準品 (Thermofisher 型錄號碼 3300A) •     Tween 20 (Roche，型錄號碼11332465001) 及矽油 (例如 Alfa Aesar 型錄號碼A12728) •     用於濃度測定的紫外光度計 (例如 Nanodrop 8000)。
樣品製備
將抗體樣品重新緩衝並用 20 mM His/HCl (pH 5.5) (緩衝劑) 及 0.02% Tween 20 (最終濃度) 稀釋。添加固體濃度為 0.03% 的珠粒。製備至少三種不同的濃度，在可能的情況下，最高濃度為約 200 mg/mL。需要兩個空白樣品作為無抗體對照：一個空白樣品包含重懸於水中的 Nanosphere 珠粒，另一個空白樣品包含重懸於緩衝劑中的 Nanosphere 珠粒。將樣品轉移至微孔板中，每孔皆覆蓋矽油。
用 Wyatt DLS 酶標儀進行測量
所有樣品及空白皆於 15℃ 至 35℃ 的不同溫度下 (步長為 5℃) 進行分析。採集時間為 30 s，每個樣品及溫度的採集次數為 40 次。
資料分析
在軟體 (Microsoft Dynamics 7.10 或更高版本) 模板概覽中顯示了以 nm 為單位的原始資料 Dapp (表觀半徑)。黏度計算公式為 (ηreal = Dapp * ηH2O / Dreal)。Dreal 為空白樣品中實測珠粒尺寸，其等於珠粒尺寸 (300 nm)。計算出的黏度顯示於 Excel 曲線中。使用 Mooney 曲線擬合 (在 Excel 中)，可外推給定濃度下之黏度。此處計算出黏度超過 20 cP 時的最大蛋白質濃度。
在 20℃ 下達到 20 cP 的黏度的指定抗體的最大濃度如下所示。 表 10 ：藉由 DLS 珠粒方法所測得之黏度。顯示了指定抗體於 20℃ 下達到 20 cP 時的最大可行濃度。
濃度 [mg/ml]
6HVL_4 195.4
6HVL_5 192.4
VH6L_3 220.0
VH6L_4 226.8
VH6L_5 240.4
結果表明，本發明之抗體可以高濃度配製，其包含低於可注射性之可接受黏度限值的黏度。因此，本發明之抗體非常適合眼部應用，因為它們允許以有限之注射體積提供高摩爾劑量，與高效力相結合，可產生高耐久性，從而降低給藥頻率，這對於增加患者便利性及治療合規性是所需的。 實例 10 ： 基於原代細胞的測定表明由 VEGF/IL6 雙特異性抗體 6HVL_4 (HRMEC) 介導的 IL6 抑制
為了測量 HRMEC 中的 IL-6 訊號活性，建立了量化 HRMEC 中 ICAM-1 表面表現的測定法。用等摩爾濃度 (2 nM) 的人類 IL-6 及人類 IL-6R 組合刺激 HRMEC 72 小時。藉由流式細胞術評定 ICAM-1 表面表現。為了測量 6HVL_4 的抑制活性，IL-6/IL-6R 混合物在應用於細胞之前與增加濃度的抗體一起預培育。
細胞培養基：HRMEC (目錄號 PEL-PB-CH-160-8511；PELOBiotech Gmbh；Bayern，Germany) 在 175 cm2 燒瓶中在內皮生長培養基 (EGM-MV) 中解凍並培養，該內皮生長培養基包含內皮基礎培養基 (EBM) (目錄號 CC-3156；Lonza；Basel，Switzerland) 及 5% 胎牛血清 (FBS)、氫化可的松、人成纖維細胞生長因子 B、VEGF、R3-IGF-1 (胰島素樣生長因子-I 的重組類似物 3 位 Glu 的 Arg)、抗壞血酸、人表皮生長因子及 GA-1000 (均包含在 EGM-2 MV 微血管內皮 SingleQuotsTM 試劑盒中；目錄號 CC-4147；Lonza)，製造商推薦的濃度。接種後二十四小時，將培養基更換為新鮮的 EGM-MV，並在測定前讓細胞再生長 3 天。針對不同傳代次數及 IL-6/可溶性 IL-6R 濃度優化了測定條件。使用第 6 代 HRMEC 及濃度為 2 nM 的 IL-6/可溶性 IL-6R 的等摩爾刺激進行最終測定。
流式細胞術測定：通過用不含 Ca2+ 及 Mg2+ 的磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) (目錄號 10010023；Life Technologies) 洗滌兩次並用細胞解離試劑 Accutase (目錄號 A1110501；Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA) 洗滌一次，從燒瓶中分離 HRMEC。洗滌後，向細胞中加入 5 mL 細胞解離試劑，並將燒瓶在 5% CO2 培養箱中於 37℃ 下培育 3 分鐘。從燒瓶中收集分離的細胞並置於 50 mL 錐形離心管中。用含有 2% FBS 的 EBM 將管填充至 50 mL，並以 300 g 離心 6 分鐘。棄去上清液，將沉澱重懸於 5 mL 飢餓培養基 (含 2% FBS 的 EBM) 中。使用 TC20 自動細胞計數器 (Bio-Rad；Hercules，CA) 對細胞數量進行量化，並使用飢餓培養基調整至 300,000 個細胞/mL。然後，將 100 µL 細胞懸液添加到 Costar 96 孔盤 (目錄號 3596；Corning；Corning，NY) 的每個孔中，每孔產生 30,000 個細胞。然後，將盤在 5% CO2 培養箱中於 37℃ 下再培育 24 小時。
重組人類 IL-6 (目錄號 206-IL/CF；R&D Systems；Minneapolis，MN) 及重組人類 IL-6R (目錄號 227-SR-025；R&D Systems) 在飢餓培養基中以等摩爾濃度混合並在室溫培育 1 小時，以允許形成 IL-6-I/L-6R 複合體。接下來，將 50 L 的 6HVL_4 稀釋系列 (3 倍，7 點稀釋) 添加到細胞中，並在 37°C、5% CO2 下培育 1 小時。最後，將 50 µL IL-6-I/L-6R 複合體添加到細胞中，IL-6 及 IL-6R 的最終濃度各自為 2 nM，且 6HVL_4 的最終濃度為 200.009 nM。還包括未刺激的細胞及用不含 6HVL_4 的 IL-6-I/L-6R 複合體刺激的細胞，以分別判定背景 ICAM-1 表面表現及 100% 反應水平。將細胞在 5% CO2 培養箱中於 37℃ 下培育 72 小時。
為了分析 ICAM-1 表面表現，用 PBS (Ca 2+、Mg 2+；Life Technologies) 洗滌細胞兩次，並用細胞解離試劑 Accutase (目錄號 A1110501；Thermo Fisher Scientific) 洗滌細胞一次。使用 50 µL 細胞解離試劑 (3 分鐘、37°C) 將細胞從盤上分離，並轉移至流式細胞儀 Falcon 96 孔儲存盤 (目錄號 353263；Corning)。用含 2% FBS 及 2 mM EDTA 的 100 µL PBS 洗滌原孔一次，並將含有剩餘細胞的洗滌液添加到流式細胞儀盤中。藉由以 300 g 離心 6 分鐘沉澱細胞，棄去上清液。將沉澱重懸於含有 10 µg/mL 人類 IgG (目錄號 I2511；MilliporeSigma；Burlington；MA) 的 100 µL PBS、2% FBS、2 mM EDTA 中以阻斷非特異性結合位點，並在室溫下培育 15 分鐘。封閉後，將 0.5 µg 熒光素標記的抗 ICAM-1 抗體 (目錄號 BBA20；R&D Systems) 添加到細胞中，並將反應在 28°C 下培育 45 分鐘。染色後，藉由以 300 g 離心 6 分鐘沉澱細胞，並將沉澱重懸於含有 2% FBS 及 2 mM EDTA 的 150 µL PBS 中。使用 Attune NxT 流式細胞儀 (Thermo Fisher Scientific) 測量螢光素螢光。
資料分析：對於所有 3 項測定，每個獨立實驗中的每個條件都一式四份進行。對於每個實驗，從實驗孔的結果中扣除未經刺激之細胞的背景訊號並計算每種條件下的平均訊息。從用不含 6HVL_4 的 IL-6/IL-6R 刺激的細胞計算 100% 反應水平，然後將 6HVL_4 的抑制潛力表現為 100% 反應的抑制百分比。在 3 個獨立實驗中測量每個濃度的 6HVL_4 的抑制百分比，併計算平均值及 SEM。3 個獨立實驗的平均值用於使用 ExcelXLfit 軟體 5.5.0 版 (IDBS；Guildford，UK) 來計算平均 IC50 及 SE。使用 5 參數邏輯模型 (A+((B-A) / (1+(((B-E)*((C/x)^D)) / (E-A)))) 藉由非線性回歸分析來擬合濃度-反應曲線)。 表 11 ：計算的 6HVL_4 對 HRMEC 表面上 IL-6 誘導的 ICAM-1 表現的抑制百分比
濃度 抑制 [ ％ ] SEM [%]
20 97.60 1.48
6.667 97.77 1.46
2.222 80.01 17.29
0.741 6.76 5.77
0.247 -0.63 1.79
0.082 -1.25 2.86
0.027 -0.42 3.20
6HVL_4 導致 HRMEC 中 IL-6 訊號的劑量依賴性抑制，50% 抑制濃度 (IC50) 為 1.52 +/- 0.04 nM ( 圖 11)。 實例 11 ： 基於原代細胞的測定，以表明由 VEGF/IL6 雙特異性抗體 6HVL_4 (HUVEC) 介導的 VEGF 抑制
測定：
HUVEC 獲自 Lonza (目錄號 00191027；Basel，Switzerland)。內皮基礎培養基 (EBM-2；目錄號 CC-3156) 及 EGM-2 內皮 SingleQuots 試劑盒 (目錄號 CC4176)，它們共同構成了內皮生長培養基 (EGM-2) 及測定培養基 (具有 0.5 % 胎牛血清 [FBS] 的 EBM-2)，也購自 Lonza。
塗有附接因子 (AF) (目錄號 S-006-100；Gibco，Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA) 的 T175 細胞培養瓶 (目錄號 353112；Corning；Corning，NY) 用於維持 HUVEC。StemProAccutase (目錄號 A11105-01；Gibco) 用於分離細胞。
使用阿爾瑪藍 (alamarBlue) (目錄號 DAL1100；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific) 在 96 孔纖連蛋白包被盤 (目錄號 354409；Corning) 中進行細胞活力/增殖測定。
重組人類 VEGF-A 獲自 R&D (目錄號 293-VE；Minneapolis，MN)，並溶解在不含 Ca 2+及 Mg 2+的磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) 中 (目錄號 14190-094；Gibco)，原液濃度為 100 µg/mL。
阿爾瑪藍含有可滲透細胞的化合物天青素 (Resazurin)。由於健康細胞內的還原環境，這種化合物會改變其顏色。產生的粉紅色是活細胞的比例標記，並且可用於藉由測量 570 nm 處的吸光度來檢測增殖。VEGF-A 誘導在細胞飢餓條件下生長的 HUVEC 增殖。因此，可以藉由使用 VEGF-A 中和抗體或 Fab 來抑制 VEGF-A 誘導的 HUVEC 增殖。
HUVEC 保持在塗有 AF 的 T175 燒瓶中的 EGM-2 中，直到第 5 代。對於活力測定，使用 Accutase 分離 HUVEC，並在測定培養基 (EBM-2 0.5% FBS) 中以 1:1.66 稀釋。然後，將細胞離心並重懸於含有 0.5% FBS 的 EBM-2 中，達到 100,000 個細胞/mL 的細胞密度。然後，將 100µL 細胞懸液接種在塗有纖連蛋白的 96 孔盤上，從而產生 10,000 個細胞/孔的細胞密度。外孔未接種細胞，然後僅填充測定培養基。將細胞在 5% CO2 培養箱中於 37℃ 下培育過夜。
第二天，使用 VEGF-A 儲備溶液 (100,000 ng/mL 於 PBS (Ca2+、Mg2+) 中) 以在測定培養基 (EBM 0.5% FBS) 中製備 10 倍工作溶液 (750 ng/mL)。
6HVL_4 儲備溶液也在測定介質中稀釋以製備 10 倍工作溶液。這用於製備從 30,000 ng/mL 開始到 14 ng/mL 結束的 3 倍 8 點稀釋系列。
接下來，將 12.5 μL 的 10 預稀釋的 6HVL_4 溶液及 12.5 μL 的 10 VEGF-A 溶液 (750 ng/mL) 按順序添加到每個盤中一式四份的細胞中。VEGF-A 以恆定的最終濃度 (75 ng/mL) 使用，且 6HVL_4 以從 3000 ng/mL 到 1.4 ng/mL 的最終濃度範圍的劑量反應形式使用。將細胞在 37 ℃、5% CO2 下培育 72 小時。為了分析，將 12 µL 阿爾瑪藍添加到每個孔中，隨後在細胞培養箱中培育 3 小時。使用來自分子裝置的 FlexStation 3 酶標儀，在 570 nm 處測量吸光度，參考波長為 600 nm。
資料分析：
對於每個實驗，每個條件一式四份進行。總共進行了 4 次獨立實驗。獨立實驗被認為是在同一天處理 2 個單獨的盤。因此，使用 8 個單獨的盤進行分析。從實驗孔的結果中扣除未經刺激之細胞的背景訊號並計算每種條件下的平均訊息。根據經 VEGF-A (75 ng/mL) 刺激且未經額外化合物暴露的細胞計算 100% 反應水平，且來自 6HVL_4 暴露的孔的訊號表現為 100% 反應的抑制百分比。
使用 ExcelXLfit 軟體 5.5.0 版 (IDBS；Guildford，UK)，由每種抗體濃度的平均資料計算 IC50 值。使用相對於基礎和最大抑制活性計算的 4 參數邏輯模型 (A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，藉由非線性回歸分析擬合濃度-反應曲線。資料展示為 4 次獨立實驗的平均值，均值為標準誤差 (SEM)。 表 12 ：計算的 6HVL_4 對 VEGF-A 誘導的 HUVEC 增殖的抑制百分比
濃度 抑制 [ ％ ] SEM [%]
62.4 87.8 5.3
20.8 87.8 6.5
6.9 90.9 5.3
2.3 58.4 8.5
0.77 6.6 6.3
0.26 7.1 3.1
0.09 7.0 2.0
6HVL_4減少了 VEGF-A 誘導的 HUVEC 增殖，50% 抑制濃度 (IC50) 為 2.06 +/- 0.30 nM ( 圖 12)。 實例 12 ： 在 VEGF-A 及 IL6 以及 VEGF/IL6 雙特異性抗體 6HVL_4 存在的情況下，屏障功能的恢復顯示了該分子的生物學活性
為了評定本發明抗體的雙重生物學活性，即同時阻斷兩種靶向細胞因子——VEGF-A 及 IL6 (與 IL6R 複合)——進行了跨內皮細胞抗性 (TER) 測定。在此測定中，電緊密的內皮細胞層藉由屏障功能的喪失響應 VEGF-A 及 IL6 添加。VEGF/IL6 雙特異性抗體 6HVL_4 在兩種細胞因子 VEGF 及 IL6 存在下恢復屏障功能的評定如下：
測定：
人類視網膜微血管內皮細胞進一步命名為 HRMVEC (PELOBiotech；目錄號 PEL-PB-CH-160-8511) 在 T175 燒瓶 (Falcon 目錄號 353112) 中維持在完全 MV-內皮細胞生長培養基 (MV-EGM-2 Lonza，目錄號 CC-3202) 中，塗有附接因子 (Ginco，目錄號 S-006-100)，直至第 5 代。對於跨內皮細胞抗性測定，使用 StemPro® Accutase® (Gibco，目錄號 A11105-01) 分離細胞。此後，將細胞在 100 µl MV-EGM-2 生長培養基中以 120.000 個細胞/孔的細胞密度接種到塗有纖連蛋白 (目錄號 354008，Corning) Transwell 過濾器 (24 孔 Corning，目錄號 3470) 的上室中。Transwell 過濾器的下室填充有 600 µl MV-EGM-2 培養基。將細胞在 37℃ 及 5% CO2 下培育 3 天。之後，將培養基更改為測定條件(MV-EGM-2，不含 VEGF，含有 2% FBS)，將 Transwell 過濾器轉移到細胞顯微鏡 (cellZcope) 系統，上室使用 280 µl 培養基，下室使用 810 µl。然後將細胞用 5% CO 2於 37℃ 下培育 24小時，同時藉由細胞顯微鏡測量 TER。第二天，用終濃度為 10ng/ml VEGF (R&D 系統，目錄號 293-VE/CF)、50ng/ml IL6 (R&D 系統，目錄號 206-IL/CF) 及 100ng/ml 的組合處理細胞IL6R (R&D 系統，目錄號 227-SR-025/CF) 及 10ng/ml VEGF 或等量的測定培養基 (每種條件八倍)，直到第二天才測量 TER。此後，將終濃度分別為 1µg/ml 及 2.3µg/ml 的 6HVL_4 或阿柏西普或測定培養基添加到細胞中，隨後測量下一個 24 小時的 TER。因此每個條件出現四次。
資料分析：
為一個孔產生的資料集被標準化為在添加細胞因子混合物之前不久獲得的 TER 值。對於每個條件，均值訊號及標準偏差是從歸一化資料計算的。
結果：
結果如 圖 12(6HVL_4) 及 圖 13(阿柏西普) 所示。
單獨使用細胞因子 VEGF 以及與 IL6/IL6R 聯合使用時，HRMVEC 的屏障功能會降低。使用抗體 6HVL_4，破壞的屏障在 24 小時後恢復到 100%。 實例 13 ： IL6 互補位區域的鑑定
從 6HVL4.1 與 IL6 之間的複合體的晶體結構中鑑定出與 IL6 接觸的胺基酸殘基。VH 及 VL 域內的互補位胺基酸殘基位置示意圖見 圖 15。出於此目的，使用 PyMOL 的「byres」功能及 5 埃的截止距離鑑定可能與 Fab/IL6 複合體中的 IL6 相互作用的殘基。此處我們將分析限制在 IL6 的殘基 48-215 (如 Uniprot ID P05231 中所定義)，這些殘基被發現通常在 IL6 單獨的結構中被解析 (參見 pdb 登錄號 1alu 及 1IL6)。在 圖 15中，還顯示了 6HVL4.1 與基於本發明抗體的單特異性抗 IL6 抗體 6HdL2.05 之間的比對，其中 VEGF-互補位被非結合區替代。具有 SEQ ID NO: 48 之 VH 域及 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的 6HdL2.05。當如實例 2 中所述表達及純化並進行與實例 3 類似的人類 IL6 或食蟹獼猴 IL6 的 SPR 測定時，抗體表現出如 圖 20所示的 SPR 感測器圖。在擬合實驗資料後，6HdL2.05 展示出與相應 6HVL 系列 VEGF/IL6 雙特異性抗體獲得的最高親和力相當的親和力 (參見 表 3及 表 4)，與人類 IL6 的擬合 KD 為 22pM 及與食蟹獼猴 IL6 的擬合 KD 為 1.3nM。
鑑定出的有助於抗原結合的胺基酸殘基見 表 13(對於可變重鏈域胺基酸殘基) 及 表 14(對於可變輕鏈域胺基酸殘基)。胺基酸位置的編號是根據 Kabat 編號系統 (在 圖 1+5中使用相同的編號)。參與抗原結合的胺基酸位置藉由它們在 VH 或 VL 域中的 Kabat 位置來鑑定。 表 13 ：藉由晶體結構分析確定的參與 IL6 結合的可變域胺基酸殘基，6HdL2.05 顯示了相同 Kabat 位置的胺基酸殘基
域 6HVL4.1 6HdL2.05
VH Y1、I2、Q3， Y26、E27、F28、T29、H30、Q31、D32， P52a， R94、I96、D97、F98、D101、T102 Y1、 P2、Q3， V26、 L27、F28、 K29、H30、Q31、D32， P52a， R94、 L96、D97、F98、D101、 E102
VL Y49、D50、S53、N54、Y55、P56、S57， Y91、Y96 Y49、D50、 D53、 R54、Y55、P56、 E57， Y91、Y96
圖 1 ：藉由表面電漿子共振判定的親本雙特異性抗體 6HVL_1 及 V6HL_1 與人類及食蟹獼猴 IL6 的結合 圖 2 ：使用人類 VEGF-165 的親本雙特異性抗體 6HVL_1 及 V6HL_1 的 VEGF IC50 圖 3 ：藉由表面電漿子共振判定的改善的雙特異性抗體與人類及食蟹獼猴 IL6 的結合。 圖 4 ：使用人類 VEGF-121 及 VEGF-165 的改善的雙特異性抗體的 VEGF IC50。 圖 5 ：Fab0182 – IL-6 複合體的晶體結構。與 Fab 0182 結合的 IL-6 結構上的整體視圖。IL-6 呈橙紅色，Fab 0182 的輕鏈及重鏈分別呈青色及藍色。 圖 6 ：聯合投予Fab 6HVL4.1 - IL-6 複合體的晶體結構。與 Fab 6HVL4.1 結合的 IL-6 結構上的整體視圖。IL-6 呈橙紅色，Fab 6HVL4.1 的輕鏈及重鏈分別呈小麥色及藍色。 圖 7 ：藉由具有固定化抗 Fab 抗體的 SPR 評定的抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 與其標靶的同時結合 圖 8 ：在 IL-6 存在的情況下藉由具有固定化 VEGF-A 的 SPR 評定的抗 VEGF/抗 IL-6 Fab 阻斷 VEGF-R2 結合 圖 9 ：VEGF 結合對 IL6 活性的影響係藉由基於細胞的 IL-6 特異性報告基因測定 (無預培育) 如下評定 圖 10 ：VEGF 結合對 IL6 活性的影響係藉由基於細胞的 IL-6 特異性報告基因測定 (有預培育) 如下評定 圖 11 ：6HVL_4 對 HRMEC 中 IL-6 訊號的抑制 圖 12 ：6HVL_4 對 VEGF-A 誘導的 HUVEC 增殖的抑制百分比的劑量依賴性變化 圖 136HVL_4 對 IL6/IL6R/VEGF 誘導的 HRMVEC 屏障破壞的恢復 圖 14阿柏西普對 IL6/IL6R/VEGF 誘導的 HRMVEC 屏障破壞的恢復 圖 15指定抗體的 VH 及 VL 域的胺基酸序列。指出了胺基酸位置的 Kabat 編號。如實例 13 中鑑定的有助於 IL6 互補位的胺基酸位置係由黑框突出顯示。 圖 16IL6/IL6R/gp130 複合體的影像 (頂部；pdb-acc.#1p9m) 與結合到 IL6 的 Fab 0182 及來自 pdb-acc. 1p9m (底部) 的 IL6/IL6R 複合體的結構的疊加比較。 圖 17IL6/IL6R/gp130 複合體的影像 (頂部；pdb-acc.#1p9m) 與結合到 IL6 的 Fab 6HVL4.1 及來自 pdb-acc. 1p9m (底部) 的 IL6/IL6R 複合體的結構的疊加比較。 圖 18SPR 橋接實驗研究 IL6R 在與 Fab P1AE2421 預形成複合體時結合 IL6 的能力。 圖 19SPR 結合實驗研究 Fab P1AE2421 結合人「超-IL6」(人 IL6 及 IL6R 的嵌合體) 的能力。 圖 20ELISA 競爭實驗判定 Fab P1AE2421 以阻斷 IL6 與 IL6R 結合的方式結合 IL6 的能力。 圖 21藉由表面電漿子共振判定的 IL6 結合抗體 6HdL2.05 與人類及食蟹獼猴 IL6 的結合
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Claims (16)

  1. 一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；且該抗體包含可變重鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及可變輕鏈域，其包含具有多達 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列。
  2. 如請求項 1 之抗體，其中該等多達 5 個胺基酸取代發生在個別可變域之 FR 區中。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體，其包含 SEQ ID NO: 22 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:23 之輕鏈胺基酸序列。
  5. 一種與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體，其包含 SEQ ID NO: 22 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列。
  6. 一種與人類 IL6 結合之抗體，其與具有 SEQ ID NO: 35 之 VL 域及 SEQ ID NO: 36 之 VH 域之抗體結合至 IL6 上相同之表位。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為 Fab 片段。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體片段。
  9. 一種分離之核酸，其編碼如請求項 1 至 8 中任一項之抗體。
  10. 一種宿主細胞，其包含如請求項 9 之核酸。
  11. 一種生產與人類 VEGF-A 及人類 IL6 結合之抗體之方法，該方法包含培養如請求項 10 之宿主細胞，從而生產該抗體。
  12. 如請求項 11 之方法，其中該宿主細胞為 CHO 細胞。
  13. 一種醫藥調配物，其包含如請求項 1 至 8 中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  14. 一種端口輸送裝置，其包含如請求項 1 至 8 中任一項之抗體。
  15. 如請求項 1 至 8 中任一項之抗體，其用為藥物。
  16. 一種端口輸送裝置，其包含如請求項 1 至 8 中任一項之抗體或如請求項 13 之醫藥調配物。
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