TW202400786A

TW202400786A - 具有RNAi活性的化學修飾寡核苷酸

Info

Publication number: TW202400786A
Application number: TW112109504A
Authority: TW
Inventors: 小泉誠; 小路貴生; 福永大地
Original assignee: 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2023-03-15
Publication date: 2024-01-01
Also published as: WO2023176863A1; CN118871585A

Abstract

本發明提供一種具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之具有新穎化學修飾樣式的寡核苷酸。本發明提供一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其有義股區域具有配置了3’-修飾核苷的指定修飾樣式，反義股區域在指定的區域具有適宜組合DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA等的修飾樣式。

Description

具有RNAi活性的化學修飾寡核苷酸

本發明係關於具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之包含經化學修飾的核苷的寡核苷酸、該寡核苷酸之用途、使用該寡核苷酸的基因表現抑制方法、含有該寡核苷酸的醫藥等。

作為抑制細胞、組織、或個體內之標的基因的表現的方法，有將雙股RNA導入該細胞、組織、或個體內的手法。藉由雙股RNA之導入，而與該序列具有相同性的mRNA會被分解，標的基因之表現會被阻礙。此效果稱為「RNA干擾」或「RNAi」。已有報告在3’末端有2個核苷酸的外伸(overhang)且有義股、反義股分別由21個核苷酸所構成的雙股RNA(小干擾RNA(small interfering RNA)：siRNA)，係在脊椎動物之培養細胞中具有RNA干擾作用(例如，參照非專利文獻1)。

siRNA雖有用於基因功能的鑑定、適合有用物質生產之細胞株的篩選、參與疾病之基因的控制等，但因容易被RNA分解酵素分解，所以有在體內的活性持續困難、合成成本變高價的缺點。因此，為了開發對抗RNA分解酵素的穩定性高且可廉價地製造之保持著RNAi活性的寡核苷酸，已嘗試各式各樣的化學修飾。

已知將寡核苷酸中之磷酸二酯鍵的磷酸基之非交聯氧原子取代為硫原子的硫代磷酸酯(PS)鍵係成為對核酸酶有耐性。然而，已報告若使寡核苷酸中之PS鍵的數目增加，則會發生雙股RNA之熱力學的不穩定化及與非特異性的蛋白質的結合，所以不佳(例如，參照非專利文獻2)。亦已嘗試藉由將天然型之RNA取代為修飾RNA而取得穩定的siRNA。例如，已報告將RNA之2’-OH基烷基化而作成不會成為RNase之基質的2’-O-烷基核苷的許多衍生物。2’-O-甲基核苷酸係在tRNA中亦可見的天然存在的修飾核苷酸，從反義研究的早期那時就已經被研究(例如，參照非專利文獻3)。

已有報告若將siRNA之有義股或反義股的一者、或兩者以2’-O-甲基核苷酸取代，則RNAi活性會減弱或完全喪失(參照例如，非專利文獻4、非專利文獻5、非專利文獻6、非專利文獻7等)。又有報告若連續地導入3個2’-O-甲基核苷酸，則在向有義股的導入中並無法見到活性降低，但在向反義股的導入中觀察到活性降低，尤其是對有義股之5’末端導入的情形，活性顯著降低(參照例如，非專利文獻8)。

具有為經人工合成之修飾RNA的2’-去氧-2’-氟核苷酸(2’-F、或2’-F RNA)的寡核苷酸，係優先形成與核糖核苷酸相同的N型構形，與RNA的親和性變高，但由磷酸二酯鍵所構成者由於無核酸酶抗性，因此有必要作成硫代磷酸酯鍵，使其具有核酸酶抗性(參照例如，非專利文獻9)。

ENA(2’-O,4’-C-伸乙基-橋接核酸)為具有對抗核酸酶之穩定性的修飾核酸，但已有報告對siRNA之有義股、反義股的一者或兩者之3’末端的外伸部位之2個核苷酸導入ENA的情形，RNAi活性會降低(參照例如，非專利文獻10)。

有許多關於組合複數個修飾核酸而成的siRNA之報告。例如，已報告將2’-O-甲基核苷酸與2’-F間隔1個而導入siRNA之有義股、反義股中，而可獲得與未修飾siRNA相比為相同程度以上之RNAi活性，可比較穩定地保持在血清中(參照例如，非專利文獻11)。

已有報告組合DNA、2’-O-甲基RNA、及2’-F而成的雙股寡核苷酸，尤其已有報告從反義股之5’末端起第14號為2’-F的siRNA(參照例如，專利文獻1、2)。又，已有報告組合DNA、2’-O-甲基RNA、2’-F RNA、及LNA(2’-O,4’-C-亞甲基-橋接核酸)而成的雙股寡核苷酸，尤其已有報告從反義股之5’末端起第2號、或第14號為2’-F、DNA、或LNA的siRNA之活性(參照例如，專利文獻1、專利文獻3)。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2012/058210號小冊 [專利文獻2]國際公開第2013/074974號小冊及美國專利第US9,399,775號公報、美國專利第US9,796,974號公報 [專利文獻3]國際公開第2016/028649號小冊、美國專利第US10,612,024號公報 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Nature、2001年、第411卷、p.494-498 [非專利文獻2]Antisense Nucleic Acid Drug Development、2000年、第10卷、p.117-121 [非專利文獻3]Nucleic Acids Research、1987年、第15卷、p.6131-6148 [非專利文獻4]EMBO Journal、2001年、第20卷、p.6877-6888 [非專利文獻5]RNA、第9卷、2003年、p.1034-1048 [非專利文獻6]Biochemistry、2003年、第42卷、p.7967-7975 [非專利文獻7]Nucleic Acids Research、2003年、第31卷、p.2705-2716 [非專利文獻8]Journal of Medical Chemistry、2005年、第48卷、p.4247-4253 [非專利文獻9]Journal of Medical Chemistry、1993年、第36卷、 p.831-841 [非專利文獻10]Antisense and Nucleic Acid Drug Development、2002年、第12卷、p.301-309 [非專利文獻11]Journal of Medicinal Chemistry.、2005年、第48卷、p.901-904

[發明欲解決之課題]

本發明之一個課題係提供一種具有新穎化學修飾樣式的寡核苷酸，其具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用(亦有時將此等之作用稱為弱化(knockdown)作用)。於先前技術中已有報告許多採用修飾核酸的siRNA有RNA干擾作用減弱或消失的情形。因此，尋求為了適用於醫藥品而兼具在體內的穩定性及藥理活性之具有新穎的修飾樣式的寡核苷酸。 [用以解決課題之手段]

本發明人等為了取得對RNA分解酵素具有穩定的RNA干擾作用的寡核苷酸而進行深入研究的結果，發現具有適當組合DNA、LNA、ENA、2’-O-甲基RNA、2’-F RNA、3’-O-甲基RNA而成的寡核苷酸單元之寡核苷酸可解決上述課題，而完成本發明。

即，本發明提供以下。 [1]一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，係包含有義股區域及反義股區域的寡核苷酸，其中前述有義股區域由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，前述反義股區域由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，且其進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：有義股區域：5’ S _O5-S _a-S ₁₉-S ₁₈-S ₁₇-S ₁₆-S ₁₅-S ₁₄-S ₁₃-S ₁₂-S ₁₁-S ₁₀-S ₉-S ₈-S ₇-S ₆-S ₅-S ₄-S ₃-S ₂-S ₁-S _O33’(I) 反義股區域：5’ A _O5-A ₁-A ₂-A ₃-A ₄-A ₅-A ₆-A ₇-A ₈-A ₉-A ₁₀-A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅-A ₁₆-A ₁₇-A ₁₈-A ₁₉-A _a-A _O33’(II) (a)S ₁為3’-修飾核苷，S ₂～S ₁₉表示1個核苷，且各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S _a表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S _O3及S _O5各自獨立表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (b)A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅表示1個核苷，其中至少1個為DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA，其餘為2’-OMe RNA或2’-F RNA，A ₁～A ₁₀及A ₁₆～A ₁₉表示1個核苷，且各自獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A _a表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A _O3及A _O5各自獨立表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (c)A ₂～A _a之間的核苷酸序列係由與標的序列實質上互補的核苷酸序列所構成，A ₁為具有與標的序列所對應的核苷互補之鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A _O3與A _O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立而與標的序列所對應的核苷為獨立地選擇的核苷酸序列； (d)S ₁～S _a之間的核苷酸序列、與A ₁～A _a之間的核苷酸序列，係彼此實質上互補的核苷酸序列，且形成雙股結構； (e)S _O5與A _O3之兩者存在的情形，S _O5與A _O3為彼此非互補的核苷酸序列； (f)S _O3與A _O5之兩者存在的情形，S _O3與A _O5為彼此非互補的核苷酸序列；以及 (g)有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位或是3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。 [2]如[1]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，S ₁為3’-OMe RNA。 [3]如[1]或[2]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域及反義股區域以各自獨立的寡核苷酸形成雙股寡核苷酸。 [4]如[1]～[3]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷為LNA或ENA。 [5]如[1]～[4]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅之2個以上可相同或各自相異，為DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA。 [6]如[5]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₄為RNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。 [7]如[6]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₃為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-OMe RNA，A ₁₄為RNA。 [8]如[7]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅為以下之任一者﹕ A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、或 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)。 [9]如[6]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₂為DNA，A ₁₄為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。 [10]如[9]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅為以下之任一者﹕ A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、或 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)。 [11]如[1]～[10]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₂、A ₆及A ₁₆為2’-F RNA。 [12]如[11]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，進一步，選自由A ₈、A ₉及A ₁₀所組成之群組的1或2個核苷為2’-F RNA，A ₁、A ₃～A ₅、A ₇、A ₁₇～A ₁₉及A _a之核苷為2’-OMe RNA。 [13]如[12]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₂、A ₆、A ₈、A ₁₀及A ₁₆為2’-F RNA，A ₁、A ₃～A ₅、A ₇、A ₉、A ₁₇～A ₁₉及A _a之核苷為2’-OMe RNA。 [14]如[1]～[13]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)，S ₁₁、S ₁₂、S ₁₃及S ₁₅為2’-F RNA。 [15]如[14]之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)，S ₂～S ₁₀、S ₁₄、S ₁₆～S ₁₉及S _a為2’-OMe RNA。 [16]如[1]～[15]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)採用RNA的情形，該RNA與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。 [17]如[1]～[16]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於前述寡核苷酸之從5’末端及3’末端起2～5個核苷酸中，各核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵。 [18]如[1]～[17]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3、S _O5、A _O5及A _O3之核苷數為0～2。 [19]如[18]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3之核苷數為0。 [20]如[19]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3、S _O5及A _O5之核苷數為0，A _O3之核苷數為2。 [21]如[1]～[20]中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中寡核苷酸之5’末端的核苷之5’位及/或3’末端之核苷的3’位或是3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位的化學修飾為向目的組織之輸送用單元。 [22]如[21]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中向目的組織之輸送用單元為GalNAc單元或脂肪酸單元。 [23]如[22]記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中GalNAc單元為下式所表示的單元﹕

(式中，虛線表示與鄰接的核苷酸之5’末端的磷酸基及/或3’末端的磷酸基(在3’位被修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)磷酸二酯鍵結)。 [發明之效果]

依據本發明，而提供一種在動物體內持續性地具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之新穎修飾樣式的寡核苷酸。該修飾樣式由於適用於針對複數之標的序列的寡核苷酸而確認有同樣之效果，因此能夠使用該寡核苷酸進行各種基因的功能解析，又，提供一種包含該寡核苷酸之針對多種疾病的醫藥品。

[用以實施發明的形態]

＜1.用語之説明＞在本說明書中，「標的基因」係只要在導入其的細胞、組織、或固體(以下有時將其稱為「被導入體」)中為RNA則未特別限制，可為會被轉譯成蛋白質的mRNA，亦可為不會被轉譯成蛋白質的非編碼序RNA。就非編碼序RNA而言，為功能性RNA，可列舉例如mRNA之非轉譯區域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(類mRNA的非編碼RNA)、長鏈ncRNA(長鏈非編碼RNA)、snRNA(小核RNA(small nuclear RNA))、snoRNA(小核仁RNA(small nucleolar RNA))、miRNA(微小RNA(microRNA))等。具體而言，可為對要導入的被導入體為內源性者，亦可為藉由基因導入等之手法所導入的外來性者。又，可為存在於染色體上的基因，亦可為染色體外者。就外來性之基因而言，可列舉例如源自可感染被導入體的病毒、細菌、真菌或原生動物者，但未限制於此等。關於基因之功能，可為已知者，亦可為未知者。

就該種標的基因之例而言，可列舉在具有特定之疾病的患者中其表現特異性地上升及/或特異性地變異的基因，就疾病而言，可列舉中樞疾病(例如阿茲海默氏症、痴呆、飲食障礙等)、炎症性疾病(例如過敏、風濕病、變形性關節症、紅斑狼瘡等)、循環器官疾病(例如，高血壓症、心臟肥大、心絞痛、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等)、呼吸器疾病(例如肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性閉塞性肺疾病等)、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血(例如伴隨慢性疾病的貧血、鐵不應性缺鐵性貧血等)、年齡相關性黃斑變性、免疫系疾病(例如，克隆氏病(Crohn’s disease)、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、免疫不全、白血病等)、肝臟・膽囊疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎、肝臟衰竭、膽汁鬱積、結石等)、消化道疾病(例如潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維症(肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症、骨髓纖維化等)，就此等之疾病的原因基因而言，可列舉例如，紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein(KSP))、血管內皮生長因子(VEGF)、運甲狀腺素蛋白(transthyretin (TTR))、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型(proprotein convertase subtilisn/kexin type 9(PCSK9))、polo樣激酶(polo-like kinase(PLK))、ApoB-100、核糖核苷酸還原酶M2次單元(ribonucleotide reductase M2 subunit (RRM2))、叢生蛋白(clusterin)、熱休克蛋白27(Hsp27)、存活素(survivin)、真核起始因子-4E (eukaryotic initiation factor-4E (eIF-4E))、細胞間附著分子1(intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1))、介白素4受體之α次單元(alpha subunit of the interleukin 4 receptor (IL-4R-alpha))、因子XI、因子VII、N-ras、H-ras、K-ras、bcl-2、bcl-xL、Her-1、Her-2、Her-3、Her-4、MDR-1、人類β-鏈蛋白(catenin)基因、DDX3(DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box多肽3，X性聯)、骨髓性細胞白血病序列1(Myeloid Cell Leukemia Sequence 1(MCL1))基因、PKR(Eif2ak2)、Hsp47(Serpinh1)、鐵調素(Hepcidin)、活化蛋白質C(APC)、存活素、轉錄之訊息傳導子及活化子(signal tranducer and activator of transcription(STAT3))，但未限定於此等。

在本說明書中，核酸或核酸分子係指核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸之總稱。

「核苷」係意指對遺傳資訊重要的鹼基部分與對分子之物理化學性質重要的糖部分結合而成的化學結構部分。

「核苷酸」係指核苷之糖部分的3’位(在3’位被修飾的情形為2’位)之羥基與磷酸基形成酯的化合物。

「寡核苷酸」係指由2個以上之核苷酸之中的1個核苷酸之磷酸基部分與另外的核苷酸之糖部分的5’位之羥基結合的結構(磷酸二酯鍵)所構成的寡聚物。惟，3’末端之核苷酸的3’位(在3’位被修飾的核苷酸則為2’位)、及/或5’末端之核苷酸的5’位可為羥基亦可為磷酸基，亦可為彼等經化學修飾的結構。又，核苷間的磷酸二酯鍵可經化學修飾。在本說明書中，寡核苷酸與多核苷酸係以相同的意義使用。

核酸之鹼基部分為腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)，A與U或T、G與C係各自藉由氫鍵而形成沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pair)，將為會形成鹼基對之關係的鹼基彼此的關係稱為「互補」。各自的鹼基部分有經化學修飾的情形，但即使是經修飾的鹼基，亦有通常顯示與原本鹼基相同的鹼基對形成能力的情形。就代表的修飾鹼基而言，已知有5-甲基胞嘧啶(5C)、5-甲基尿嘧啶(5U)等，5U為與T相同的結構。在本說明書所附的序列表中，5C被表示為C，5U被表示為T或U。

在本說明書中，核酸之標記方法係有以「鹼基之記號(糖部分之記號)」表示的情形。關於糖部分之記號，係在以下之各種核苷的記載處進行説明。

在本說明書中，寡核苷酸之「修飾樣式」，只要未特別提及，則意指與鹼基之序列無關係地，構成寡核苷酸的各核苷之糖部分的修飾樣式之配置。又，未特別提及的情形，進一步意指與各核苷間之鍵結樣式組合而成的修飾樣式。糖部分的結構或核苷間鍵結，由於是不依存於標的序列而對作為分子之穩定性、或起因於該穩定性的結合性會造成影響的要素，因此被認為：對某標的序列已確認之因修飾樣式所致的作用效果，於對另一標的序列適用相同修飾樣式的情形，亦顯示同樣的作用效果之或然性很高(參照例如，Mol Ther. (2018) 26:708-717)。

在本說明書中，「天然型之核苷」係指2’-去氧核苷或核糖核苷。對應各鹼基的2’-去氧核苷(也稱為「DNA」。表示糖部分的記號為(D)，亦有以鹼基部分的小寫字母標記表示的情形)具有以下之式所表示的結構，亦有2’-去氧腺苷係表示為A(D)或a，2’-去氧鳥苷係表示為G(D)或g，2’-去氧胞苷係表示為C(D)或c；胸苷係表示為T(D)或t，2’-去氧-5-甲基胞苷係表示為5C(D)或5c，2’-去氧尿苷係表示為U(D)或u的情形。又，未特定鹼基的2’-去氧核苷有表示為N(D)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

對應各鹼基的核糖核苷(亦稱為「RNA」。表示糖部分的記號為(R)，亦有以鹼基部分之大寫字母標記表示的情形)具有以下之式所表示的結構，亦有腺苷係表示為A(R)或A；鳥苷係表示為G(R)或G；胞苷係表示為C(R)或C；尿苷係表示為U(R)或U的情形。又，未特定鹼基的核糖核苷有表示為N(R)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

在本說明書中，「修飾核苷」及「修飾核苷酸」係意指在天然之核苷的鹼基部分、糖部分或磷酸二酯部分包含至少一個經化學修飾的結構的核苷或核苷酸。

在本說明書中，「可經化學修飾的磷酸二酯鍵」係意指在天然之核苷間鍵結所採用的磷酸二酯鍵、或經化學修飾的磷酸二酯鍵。天然之核苷間鍵結為下述式(P)所表示的磷酸二酯鍵，於鹼基序列之表示中，係在核苷之間不包夾文字及符號地表示。又，在本說明書中，「經化學修飾的磷酸二酯鍵」係意指磷酸二酯鍵中所含的磷原子經化學修飾的結合樣式。就經化學修飾的磷酸二酯鍵之例而言，可列舉下述式(PS)所表示的硫代磷酸酯鍵、為氮原子附加於磷原子的修飾結合之亞磷醯胺(phosphoramidate)鍵、為可取代的烷基附加於磷原子的修飾結合之烷基膦酸酯鍵(例如，甲基的情形，係成為甲基膦酸酯鍵)、為可取代的烷基附加於磷酸基之非共價鍵的氧原子的修飾結合之磷酸三酯鍵。採用硫代磷酸酯鍵的情形，於鹼基序列之表示中，於核苷之間表示「^」。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢，一方的鍵結肢表示與鄰接於5’側的核苷之3’-羥基的氧原子(在3’位經修飾的核苷中為2’位之氧原子)或鄰接的結構單元進行酯鍵結，另一方的鍵結肢表示與鄰接於3’側的核苷之5’-羥基的氧原子或結構單元進行酯鍵結)。

在本說明書中，「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分經修飾的核苷。在糖修飾核苷中包含本發明所屬技術領域中已知的糖修飾的全部樣式。就糖修飾核苷之例而言，可列舉2’-修飾核苷、3’-修飾核苷、4’-硫修飾核苷、4’-硫-2’-修飾核苷及2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷等。就較佳糖修飾而言，可例示2’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)、2’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基化等)、2’-鹵素化(氯化、氟化等)、3’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)、3’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基化等)、3’-鹵素化(氯化、氟化等)、2’-O,4’-C-交聯化(伸烷基化交聯等)等。

在本說明書中，「2’-修飾核苷」係指核苷中所含的核呋喃糖之2’位經化學修飾的核苷。就該種修飾之例而言，可例示例如2’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)核苷、2’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基等)核苷、2’-鹵素化(氯化、氟化等)核苷、2’-烯丙基化核苷、2’-胺基化核苷、2’-疊氮化核苷、2’-O-烯丙基化核苷、2’-OCF ₃核苷、2’-O(CH ₂) ₂SCH ₃核苷、2’-O-(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)核苷、或2’-O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)核苷(各R _m與R _n係個別地為H、胺基保護基、或取代或非取代C ₁-C ₁₀烷基)等。較佳的2’-修飾核苷為2’-O-烷基化核苷、2’-O-烷氧基烷基化核苷、或2’-鹵素化核苷。

糖修飾核苷之中，就2’-O-烷基化修飾之例而言，可列舉例如2’-O-甲基核苷(亦有表示「2’-OMe RNA」或「2’- O-甲基RNA」的情形。表示糖部分的記號為(M))。對應各鹼基的2’-O-甲基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O-甲基腺苷標記為A(M)、將2’-O-甲基鳥苷標記為G(M)、將2’-O-甲基胞苷標記為C(M)、將2’-O-甲基-5-甲基胞苷標記為5C(M)、將2’-O-甲基尿苷標記為U(M)、將2’-O-甲基-5-甲基尿苷標記為T(M)的情形。又，未特定鹼基的2’-O-甲基核苷有標記為N(M)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

又，2’-O-烷氧基烷基化修飾之例而言，可列舉例如2’-O-甲氧基乙基核苷(亦有表示為「2’-MOE RNA」、「2’-O-甲氧基乙基RNA」或「2’-甲氧基乙氧基RNA」的情形。表示糖部分的記號為(m))。對應各鹼基的2’-O-甲氧基乙基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O-甲氧基乙基腺苷表示為A(m)、將2’-O-甲氧基乙基鳥苷表示為G(m)、將2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷表示為C(m)(鹼基之結構為5C，但方便上表示為C(m)。亦可取代為2’-O-甲氧基乙基胞苷而使用)、將2’-O-甲氧基乙基尿苷表示為U(m)、將2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷表示為T(m)的情形。又，未特定鹼基的2’-O-甲氧基乙基核苷有標記為N(m)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

又，就2’-鹵素化修飾之例而言，可列舉例如2’-去氧-2’-氟核苷(亦有表示為「2’-F RNA」或「2’-去氧-2’-氟RNA」的情形。表示糖部分的記號為(F))。對應各鹼基的2’-去氧-2’-氟核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-去氧-2’-氟腺苷標記為A(F)、將2’-去氧-2’-氟鳥苷標記為G(F)、將2’-去氧-2’-氟胞苷標記為C(F)、將2’-去氧-2’-氟-5-甲基胞苷標記為5mC(F)、將2’-去氧-2’-氟尿苷標記為U(F)、將2’-去氧-2’-氟-5-甲基尿苷標記為T(F)的情形。又，未特定鹼基的2’-去氧-2’-氟核苷有標記為N(F)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

在本說明書中，「3’-修飾核苷」係指核苷所含的核呋喃糖之3’位經化學修飾的核苷。3’-修飾核苷中的2’位之羥基可經修飾。就該種修飾之例而言，可例示例如3’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)核苷、3’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基等)核苷、3’-鹵素化(氯化、氟化等)核苷、3’-烯丙基化核苷、3’-胺基化核苷、3’-疊氮化核苷、3’-O-烯丙基化核苷、3’-OCF ₃核苷、3’-O(CH ₂) ₂SCH ₃核苷、3’-O-(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)核苷、或3’-O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)核苷(各R _m與R _n係個別地為H、胺基保護基、或取代或非取代C ₁-C ₁₀烷基)等。較佳的3’-修飾核苷為3’-O-烷基化核苷、3’-O-烷氧基烷基化核苷、或3’-鹵素化核苷。

3’-修飾核苷之中，就3’-O-烷基化修飾之例而言，可列舉例如3’-O-甲基核苷(亦有表示為「3’-OMe RNA」的情形。表示糖部分的記號為(3M))。對應各鹼基的3’-O-甲基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將3’-O-甲基腺苷標記為A(3M) 、將3’-O-甲基鳥苷標記為G(3M)、將3’-O-甲基胞苷標記為C(3M)、將3’-O-甲基-5-甲基胞苷標記為5mC(3M)、將3’-O-甲基尿苷標記為U(3M)、將3’-O-甲基-5-甲基尿苷標記為T(3M)的情形。又，未特定鹼基的3’-O-甲基核苷有標記為N(3M)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

又，就3’-O-烷氧基烷基化修飾之例而言，可列舉例如3’-O-甲氧基乙基核苷(亦有表示為「3’-MOE RNA」、「3’-O-甲氧基乙基RNA」或「3’-甲氧基乙氧基RNA」的情形。表示糖部分的記號為(3m))。對應各鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷，係在對應各鹼基的3’-O-甲基核苷之上述結構圖中，具有替代與3’位之氧原子結合的甲基而有甲氧基乙基結合的結構。對應各鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷，亦有將3’-O-甲氧基乙基腺苷標記為A(3m)、將3’-O-甲氧基乙基鳥苷標記為G(3m)、將3’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷標記為C(3m)(鹼基之結構為5C，但方便上標記為C(3m)。亦可取代為3’-O-甲氧基乙基胞苷而使用)、將3’-O-甲氧基乙基尿苷標記為U(3m)、將3’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷標記為T(3m)的情形。又，未特定鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷有標記為N(3m)的情形。

又，就3’-鹵素化修飾之例而言，可列舉例如3’-去氧-3’-氟核苷(亦有表示為「3’-F RNA」或「3’-去氧-3’-氟RNA」的情形。表示糖部分的記號為(3F))。對應各鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷，係在對應各鹼基的3’-O-甲基核苷之上述結構圖中，具有替代與3’位之碳原子結合的甲氧基而有氟原子結合的結構。對應各鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷，亦有時將3’-去氧-3’-氟腺苷表示為A(3F)、將3’-去氧-3’-氟鳥苷表示為G(3F)、將3’-去氧-3’-氟胞苷表示為C(3F)、將3’-去氧-3’-氟-5-甲基胞苷表示為5mC(3F)、將3’-去氧-3’-氟尿苷表示為U(3F)、將3’-去氧-3’-氟-5-甲基尿苷表示為T(3F)。又，未特定鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷有標記為N(3F)的情形。

在本說明書中，「4’-硫修飾核苷」係指核苷所含的核呋喃糖之4’位的氧原子經硫原子取代的核苷。就4’-硫修飾核苷之例而言，可列舉4’-氧原子經硫原子取代的β-D-核糖核苷(Hoshika, S. et al. FEBS Lett.579, p.3115-3118, (2005)；Dande, P. et al. J.Med.Chem.49, p.1624-1634(2006)；Hoshika, S. et al. ChemBioChem. 8, p.2133-2138, (2007))。

在本說明書中，「4’-硫-2’-修飾核苷」係指核苷所含的核呋喃糖之2’位經化學修飾，且核呋喃糖之4’位的氧原子被硫原子取代的核苷。就4’-硫-2’-修飾核苷之例而言，可列舉保持2’-H、或2’-O-甲基的4’-硫-2’-修飾核苷(Matsugami, et al. Nucleic Acids Res. 36, 1805 (2008))。

糖修飾核苷之中，就2’-O,4’-C-交聯化修飾之例而言，可列舉例如2’-O,4’-C-伸乙基交聯核苷(亦有表示為「ENA」、「ENA單元」的情形。表示糖部分的記號為(E))(Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, p.73(2002).；Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem., 11, p.2211(2003).)。對應各鹼基的2’-O,4’-C-伸乙基交聯核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O,4’-C-伸乙基交聯腺苷標記為A(E)、將2’-O,4’-C-伸乙基交聯鳥苷標記為G(E)、將2’-O,4’-C-伸乙基交聯-5-甲基胞苷標記為C(E)(鹼基之結構為5C，方便上表示為C(E)。亦可取代為2’-O,4’-C-伸乙基交聯胞苷而使用)、將2’-O,4’-C-伸乙基交聯尿苷標記為U(E)、將2’-O,4’-C-伸乙基交聯-5-甲基尿苷標記為T(E)的情形。又，未特定鹼基的2’-O,4’-C-伸乙基交聯核苷有標記為N(E)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

又，就2’-O,4’-C-交聯化修飾之另外之例而言，可列舉例如2’-O,4’-C-亞甲基交聯核苷(亦有表示為「LNA」、「LNA單元」的情形。表示糖部分的記號為(L))(Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 38, p.8735- (1997).；Obika, S. et al., Tetrahedron Lett., 39, p.5401-(1998).；A. A. Koshkin, A.A. et al.Tetrahedron, 54, p.3607(1998).；Obika, S. Bioorg. Med. Chem., 9, p.1001(2001).)。對應各鹼基的2’-O,4’-C-亞甲基交聯核苷具有以下之式所表示的結構，亦有時將2’-O,4’-C-亞甲基交聯腺苷標記為A(L)、將2’-O,4’-C-亞甲基交聯鳥苷標記為G(L)、將2’-O,4’-C-亞甲基交聯-5-甲基胞苷標記為C(L)(鹼基之結構表示為5C，方便上表示為C(L)。亦可取代為2’-O,4’-C-亞甲基交聯胞苷而使用)、將2’-O,4’-C-亞甲基交聯尿苷標記為U(L)、將2’-O,4’-C-亞甲基交聯-5-甲基尿苷標記為T(L)。又，未特定鹼基的2’-O,4’-C-亞甲基交聯核苷有標記為N(L)的情形。

(上述各式中，虛線表示鍵結肢)。

本發明之寡核苷酸或其鹽具有﹕具有與標的序列之核苷酸序列實質上互補的核苷酸序列之反義股區域(亦有時簡稱為反義股)、及具有與該反義股區域之互補區域中的核苷酸序列實質上互補的核苷酸序列之有義股區域(亦有時簡稱為有義股)。有義股區域及反義股區域雖在互補區域之核苷酸序列形成雙股結構，但可以各自獨立的寡核苷酸形成雙股寡核苷酸，亦可一方之5’末端的核苷酸之5’位與另一方之3’末端的核苷酸之3’位(在3’位經修飾的核苷酸則為2’位)連結而形成單股寡核苷酸。即，本發明之寡核苷酸可為2分子之寡核苷酸，亦可為1分子之寡核苷酸。本發明之寡核苷酸為1分子之寡核苷酸的情形，就有義股區域及反義股區域之連結樣式而言，只要本發明之寡核苷酸具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用則未特別限定，但可列舉例如一方之5’末端的核苷酸之5’位與另一方之3’末端的核苷酸之3’位(在3’位經修飾的核苷酸則為2’位)之藉由所冀望之化學連接子或寡核苷酸連接子的連結。

本說明書中的「實質上相同之核苷酸序列」係指對於成為對象的核苷酸序列，除了由全部相同的鹼基所構成的核苷酸序列之外，亦包含：具有70%以上之序列同一性的核苷酸序列；包含1或數個不相同的鹼基，但可發揮作為寡核苷酸之所冀望之功能的核苷酸序列。此處，「相同的鹼基」係指除了與原本的鹼基完全相同的鹼基之外，還包含具有與原本的鹼基同等以上之鹼基對形成能力的鹼基。就該種鹼基而言，例如，為化學修飾鹼基且具有與原本的鹼基同等以上之鹼基對形成能力的鹼基(例如，C與5C、U與T(5U))，係各自視為相同的鹼基。關於序列之同一性，係指對於成為對象的核苷酸序列，較佳為80%以上、進一步較佳為90%以上、進一步更佳為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同一性，或者具有3個鹼基、2個鹼基或1個鹼基的錯誤配對的序列。核苷酸序列之同一性可使用BLAST(註冊商標)等之周知基因解析軟體進行計算。

本說明書中的「實質上互補的核苷酸序列」係指對於成為對象的核苷酸序列，除了由全部互補的核苷酸所構成的核苷酸序列之外，亦包含：1或數個(例如，5個、4個、3個、或2個)核苷酸不是互補的核苷酸，但寡核苷酸彼此會形成鹼基對的核苷酸序列。又，在本說明書中，「互補的鹼基」係指對於成為對象的鹼基可形成沃森-克里克鹼基對的鹼基，可為未修飾之鹼基，亦可為經化學修飾的鹼基。例如，5-甲基尿嘧啶係與腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶係與鳥糞嘌呤各自彼此互補的鹼基。

本說明書中的寡核苷酸之「雙股結構」係指彼此實質上互補的核苷酸序列彼此形成沃森-克里克鹼基對而具有雙股之結構者。形成雙股結構的核苷酸序列可為2個分子之不同寡核苷酸間的實質上互補的核苷酸序列彼此，亦可為單股寡核苷酸之內部中實質上互補的序列彼此。

在本說明書中，「結構單元」係指對寡核苷酸賦予所冀望之功能的化學結構單元。就對寡核苷酸賦予的所冀望之功能而言，可列舉例如，將寡核苷酸輸送到標的組織或標的細胞(亦稱為標的組織等)的功能、改善寡核苷酸之體內動態的功能等。結構單元係可以周知之方法與寡核苷酸結合，例如，可藉由在結構單元中具有亞磷醯胺(amidite)結構，而使其與寡核苷酸之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸中為2’位)或5’末端之核苷酸之5’位結合。又，可藉由在結構單元中具有配體(ligand)等之促進對標的組織等的輸送之結構，而對寡核苷酸賦予對標的組織等的輸送能力，就該種結構而言，可列舉用以對肝細胞輸送的GalNAc單元、用以對肌肉組織輸送的脂肪酸單元等。在本說明書中，有時將此種用以賦予對標的組織等之輸送能力的結構單元特別稱為「輸送用單元」。

＜2.RNAi-寡核苷酸＞在本說明書中，「RNAi-寡核苷酸」係指於有義股區域及反義股區域中所包含的實質上互補的核苷酸彼此形成沃森-克里克鹼基對，包含形成雙股結構的互補區域，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的寡核苷酸。只要具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則可非為RNAi-寡核苷酸中所包含的互補區域的全部鹼基形成沃森-克里克鹼基對。在本說明書中，RNAi-寡核苷酸亦有記載為「siRNA」的情形。

在本說明書中，「與標的序列實質上相同之核苷酸序列」係指與標的序列相同之核苷酸序列，但除了完全相同的序列之外，只要RNAi-寡核苷酸具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同之核苷酸序列。

在本說明書中，「與標的序列實質上互補的核苷酸序列」係指與標的序列互補的核苷酸序列，但除了完全互補的序列之外，只要RNAi-寡核苷酸具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上互補的核苷酸序列。

在本說明書中，將包含與標的序列實質上互補的核苷酸序列且對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的寡核苷酸，稱為針對標的基因的RNAi-寡核苷酸。

針對標的基因的RNAi-寡核苷酸之核苷酸序列，係只要具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限制，但例如，可基於使用電腦軟體(例如，GENETYX(註冊商標)：GENETYX COORPORATION製等)而預測為具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的序列來決定。亦可進一步藉由確認基於選擇的序列所製作的RNAi-寡核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用來決定。

在本說明書中，基因表現抑制作用係指除了完全抑制基因之表現的作用之外，亦包含與對照相比而使基因之表現減少的作用，基因靜默(gene silencing)亦包含於基因表現抑制作用中。又，於本說明書中，以相同意義使用基因表現抑制作用與基因表現抑制活性。

RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用可以所屬技術領域中具有通常知識者通常進行的方法確認，例如，藉由利用西方墨點解析來定量對有標的基因表現的細胞投予針對標的基因的RNAi-寡核苷酸而經過一定時間後之標的基因的轉譯產物之蛋白質，且將蛋白質之表現量與對照組進行比較來確認。又，亦可藉由利用即時PCR之手法而即時測定針對標的基因的RNAi-寡核苷酸投予後之標的基因之表現量來確認。

在本說明書中，「標的序列」意指一種序列，其係標的基因之核苷酸序列中可為任一部分的18個核苷酸以上之序列，且本發明之RNAi-寡核苷酸以其為標的。又，在標的序列中已知SNPs等的情形，具有彼等變異的序列亦包含於標的序列中。於本發明之RNAi-寡核苷酸中，於反義股區域之至少一部分包含與標的序列實質上互補的序列(以下，「標的對應序列」)。

在本說明書中，「互補區域」意指RNAi-寡核苷酸中所包含的有義股區域與反義股區域之核苷酸序列彼此實質上互補的區域。有義股區域與反義股區域在其互補區域中，未必一定要完全互補，但至少互補區域中的末端的鹼基彼此為互補。在本發明之RNAi-寡核苷酸中，反義股區域之互補區域係包含標的對應序列，但可在互補區域之5’末端及/或3’末端進一步延長的區域維持與有義股區域之互補性。

構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的反義股區域中之標的對應序列的鏈長，係只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為從18個核苷酸到標的基因的開讀框(ORF)之全長為止的任一長度。例如，標的對應序列的鏈長可作成18～29個核苷酸，較佳為18～24個核苷酸、18～23個核苷酸、或18～22個核苷酸，更佳為18～21個核苷酸，進一步較佳為18或19個核苷酸。

構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的有義股區域及反義股區域中的各互補區域之鏈長係只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為任一長度。例如，互補區域之鏈長可作成19～29個核苷酸，較佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，更佳為19～21個核苷酸，進一步較佳為19個核苷酸。

構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的有義股區域及反義股區域之鏈長，係只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為任一長度。就有義股區域之鏈長而言，例如，可作成19～39個核苷酸，較佳為19～29個核苷酸，更佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，進一步較佳為19～21個核苷酸，最佳為19個核苷酸。就反義股區域之鏈長而言，例如，可作成19～39個核苷酸，較佳為19～29個核苷酸，更佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，進一步較佳為21～23個核苷酸，最佳為21個核苷酸

於本發明之RNAi-寡核苷酸中，有義股區域與反義股區域存在於不同的寡核苷酸分子的情形，並無其全體為雙股結構之必要，可具有5’及/或3’末端之核苷一部分突出、或不形成雙股結構的外伸結構。此種外伸結構可列舉例如，由1～5個核苷、較佳為1～3個核苷、進一步較佳為2個核苷所構成的結構。又，外伸結構可存在於雙股寡核苷酸之全部的末端，亦可僅存在於其一部分。在本說明書中，作為外伸結構的表示，有各自將有義股區域之5’末端表示為S _O5，將3’末端表示為S _O3，將反義股區域之5’末端表示為A _O5，將3’末端表示為A _O3的情形。外伸結構的鹼基序列未特別限定，可採用Oligo T或Oligo U。

RNAi-寡核苷酸係具有選自下述之(i)～(iv)的至少一者的性質。 (i)具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用； (ii)對於RNA分解酵素穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用； (iii)對於核酸外切酶穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用； (iv)對於RNA分解酵素、核酸外切酶穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；

就RNAi-寡核苷酸之一例而言，源自具有針對標的基因的反義股區域及有義股區域的雙股寡核苷酸，其中該有義股區域具有與該反義股區域實質上互補的核苷酸序列，而此反義股區域之5’末端的核苷酸之5’位及有義股區域之3’末端的核苷酸之3’位(在3’位經修飾的核苷酸中為2’位)可藉由在各自形成可經化學修飾的磷酸二酯結構的連接子而結合。此種寡核苷酸係可列舉形成以下結構的寡核苷酸：寡核苷酸3’-P(=O)(OH)-[連接子]-P(=O)(OH)-5’-寡核苷酸[此處，『寡核苷酸3’』表示在寡核苷酸之3’末端的核苷酸之3’位(在3’位經修飾的核苷酸，則為2’位)不具有羥基上的氫原子的結構，『5’-寡核苷酸』表示在寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位不具有羥基上的氫原子的結構]。此種連接子，例如記載於WO2012/074038等，可參考此等文獻的記載而合成。

構成RNAi-寡核苷酸的核苷可為天然型核苷，亦可採用糖修飾核苷。又，核苷間鍵結為可經化學修飾的磷酸二酯鍵，例如，可適當選擇磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。

＜3.S3M-寡核苷酸＞本發明係提供一種RNAi-寡核苷酸(以下，稱為「S3M-寡核苷酸」)或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，反義股區域由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，且其進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：有義股區域：5’ S _O5-S _a-S ₁₉-S ₁₈-S ₁₇-S ₁₆-S ₁₅-S ₁₄-S ₁₃-S ₁₂-S ₁₁-S ₁₀-S ₉-S ₈-S ₇-S ₆-S ₅-S ₄-S ₃-S ₂-S ₁-S _O33’ (I) 反義股區域：5’ A _O5-A ₁-A ₂-A ₃-A ₄-A ₅-A ₆-A ₇-A ₈-A ₉-A ₁₀-A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅-A ₁₆-A ₁₇-A ₁₈-A ₁₉-A _a-A _O33’ (II) (a)S ₁～S ₁₉各自表示1個核苷，S ₁為3’-修飾核苷。S _a為0～10個核苷，較佳為0～5個或0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。S _O3及S _O5係各自獨立為0～5個核苷，較佳為0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個。各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (b)A ₁～A ₁₉各自表示1個核苷，A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅中至少一者為DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA。A _a為0～10個核苷，較佳為0～5個或0～4個核苷，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個。A _O3及A _O5係各自獨立為0～5個，較佳為0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (c)A ₂～A _a之間的核苷酸序列係由與標的序列實質上互補的核苷酸序列(標的對應序列)所構成，A ₁為具有與標的序列所對應的核苷互補之鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A _O3與A _O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立而與標的序列所對應的核苷為獨立地選擇的核苷酸序列； (d)S ₁～S _a之間的核苷酸序列、與A ₁～A _a之間的核苷酸序列，係由彼此實質上互補的核苷酸序列所構成的互補區域，且形成雙股結構； (e)S _O5與A _O3之兩者存在的情形，S _O5與A _O3為彼此非互補的核苷； (f)S _O3與A _O5之兩者存在的情形，S _O3與A _O5為彼此非互補的核苷；以及 (g)有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位或是3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。

＜3-1.有義股區域＞ S3M-寡核苷酸之有義股區域係指上述式(I)所表示的區域，即S _O5～S _O3。S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域表示為從3’末端之核苷編號的S ₁～S ₁₉、及位於互補區域之5’側的S _a。即，S3M-寡核苷酸之有義股中的互補區域為上述式(I)中的S ₁～S _a的區域。S ₁～S ₁₉各自表示一個核苷，S _a為0～5個核苷，較佳為0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個。又，有義股區域之外伸結構係將附加於5’末端者表示為S _O5，附加於3’末端者表示為S _O3，各自表示0～5個核苷，較佳為0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個。

S3M-寡核苷酸係特徵為位於有義股區域中的互補區域之3’末端的核苷(即，上述式(I)中的S ₁)為3’-修飾核苷。就該種3’-修飾核苷而言，只要S3M-寡核苷酸具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，但較佳為3’-去氧-3’-氟RNA(3’-F RNA)、3’-OMe RNA、或3’-MOE RNA，更佳為3’-OMe RNA。再者，此3’-修飾核苷之2’位可為羥基、可經修飾的烷氧基(較佳為甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基)、或可經修飾的磷酸基(較佳為硫磷酸基、二硫磷酸基、甲基磷酸基、乙基磷酸基)，可與外伸結構(即，上述式(I)中的S _O3)之核苷的5’位結合，或可與連接子結構結合。較佳2’位為羥基。

S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域的S ₁以外之核苷未特別限定，可採用各式各樣的天然核苷或糖修飾核苷，但較佳係各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA。

S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之一個態樣，係從3’末端起第11、12、13及15號之核苷(即，上述式(I)中的S ₁₁、S ₁₂、S ₁₃及S ₁₅)中，至少一者為2’-F RNA，其以外之核苷為2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或彼等之組合。較佳為S ₁₁、S ₁₂、S ₁₃及S ₁₅全部為2’-F RNA。

S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之一個較佳態樣，係有義股區域中的互補區域之S ₂～S ₁₀、S ₁₄、S ₁₆～S ₁₉及S _a之核苷各自獨立，而為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，或者是由彼等選擇的2種類交互地配置的修飾樣式，更佳為各自獨立，而為2’-OMe RNA或DNA，或者是彼等交互地配置的修飾樣式，進一步更佳為彼等全部為2’-OMe RNA。S _a之核苷數可在0～10個之間適當選擇，有因應必要而從其3’側起表示為S ₂₀、S ₂₁、S ₂₂、S ₂₃、S ₂₄、S ₂₅、S ₂₆、S ₂₇、S ₂₈、及S ₂₉的情形。

S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之核苷酸序列(即，上述式(I)中的S ₁～S _a)係與反義股區域中的互補區域(即，上述式(II)中的A ₁～A _a)實質上互補的核苷酸序列。

S3M-寡核苷酸之有義股區域，可在其互補區域之3’末端及/或5’末端具有外伸結構(即，上述式(I)中的S _O3及S _O5)。S _O3及S _O5各自獨立表示0～5個(較佳為4、3、2、1或0個)核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。較佳為S _O3及S _O5不存在。

S _O3及S _O5存在的情形，其鹼基只要發揮作為外伸的功能，則未特別限定，較佳為Oligo U或Oligo T。

於以下式(Ia)～(Ic)例示S3M-寡核苷酸之有義股區域之修飾樣式。 5’S _O5(N(M))-S _a(N(M))-S ₁₉(N(M))-S ₁₈(N(M))-S ₁₇(N(M))- S ₁₆(N(M))-S ₁₅(N(F))-S ₁₄(N(M))-S ₁₃(N(F))-S ₁₂(N(F))-S ₁₁(N(F))-S ₁₀(N(M))-S ₉(N(M))-S ₈(N(M))-S ₇(N(M))-S ₆(N(M))-S ₅(N(M))-S ₄(N(M))-S ₃(N(M))-S ₂(N(M))-S ₁(N(3M))-2’H 3’　(Ia) 5’S _a(N(M))-S ₁₉(N(M))-S ₁₈(N(M))-S ₁₇(N(M))-S ₁₆(N(M))-S ₁₅(N(F))-S ₁₄(N(M))-S ₁₃(N(F))-S ₁₂(N(F))-S ₁₁(N(F))-S ₁₀(N(M)) -S ₉(N(M))-S ₈(N(M))-S ₇(N(M))-S ₆(N(M))-S ₅(N(M))-S ₄(N(M))-S ₃(N(M))-S ₂(N(M))-S ₁(N(3M))-2’H 3’　(Ib) 5’S ₁₉(N(M))-S ₁₈(N(M))-S ₁₇(N(M))-S ₁₆(N(M))-S ₁₅(N(F))-S ₁₄(N(M))-S ₁₃(N(F))-S ₁₂(N(F))-S ₁₁(N(F))-S ₁₀(N(M))-S ₉(N(M)) -S ₈(N(M))-S ₇(N(M))-S ₆(N(M))-S ₅(N(M))-S ₄(N(M))-S ₃(N(M))-S ₂(N(M))-S ₁(N(3M))-2’H 3’　(Ic) [於上述式中，(N(M))表示2’-OMe RNA，(N(F))表示2’-F RNA，(N(3M))表示3’-OMe RNA。S _O5(N(M))及S _a(N(M))表示由0～3個2’-OMe RNA所構成的核苷。各寡核苷酸之從5’末端及3’末端起3個核苷的2處之核苷間鍵結為硫代磷酸酯鍵，其以外之核苷間鍵結為磷酸二酯鍵。即，各寡核苷酸係在3’末端與5’末端，各自有2處，合計4處之硫代磷酸酯鍵]。

＜3-2.反義股區域＞ S3M-寡核苷酸之反義股區域，係指上述式(II)所表示的區域，即A _O5～A _O3。S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域，係表示為從5’末端之核苷起編號的A ₁～A ₁₉、及位於互補區域之3’側的A _a。即，反義股之互補區域為上述式(II)中的A ₁～A _a的區域。S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之核苷酸序列，若為與標的序列實質上互補的核苷酸序列即可，例如，可含有與標的序列5、4、3、2或1個鹼基的錯誤配對，較佳為完全互補。A ₁～A ₁₉各自表示一個核苷，A _a表示0～5個核苷。又，反義股區域之外伸結構係將附加於5’末端者表示為A _O5，將附加於3’末端者表示為A _O3。

A ₁可為與標的序列所對應的鹼基實質上互補之鹼基，亦可獨立於標的序列而為腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。於US專利10093923等已記載：在siRNA之有義股的互補區域中的3’末端的鹼基與標的序列無關係地為腺嘌呤或尿嘧啶的情形，顯示良好的RNA干擾活性。又，於文獻(Nature 465, 818-822 (2010))已呈示：反義股之5’末端的核苷與參與RNA干擾活性的Ago2蛋白質結合，不與標的mRNA結合。由於亦已呈示反義股之5’末端的核苷為腺嘌呤或尿嘧啶核苷的情形係比鳥糞嘌呤或胞嘧啶的情形還更強地與Ago2蛋白質結合，故反義股之5’末端較佳為腺嘌呤或尿嘧啶核苷。

S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅之中，至少一者(較佳為2個以上)為選自由DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷及2’-MOE RNA所組成之群組的任一者。就此處使用的2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷而言，未特別限定，但較佳為LNA或ENA。於反義股互補區域中，前述所鑑定的核苷以外之核苷未特別限定，可採用各式各樣的天然核苷或糖修飾核苷，但較佳係各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA。

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A ₁₄為RNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖2之56型、57型、圖3之61型、62型、66型及67型、圖5之75型～83型、圖6之91型～95型所示者，但未限定於此等。

就A ₁₄為RNA的寡核苷酸之反義股區域之較佳態樣而言，A ₁₃為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷、2’-OMe RNA或2’-F RNA，更佳為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷，更佳為ENA或LNA(圖5之76型～83型、及圖6之91型～93型)。於此種S3M-寡核苷酸，作為A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅之修飾樣式，較佳為以下式(IIIa)～(IIIh)之任一者。 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIa) A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIb) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIc) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIId) A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIe) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIf) A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIg) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIh)

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A ₁₄為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷的寡核苷酸。此處，作為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷，較佳為ENA或LNA。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖4之70型～74型、及圖6之88型～90型所示者，但未限定於此等。

就A ₁₄為2’-O, 4’-C-交聯化修飾核苷的寡核苷酸之較佳態樣而言，A ₁₂為DNA。於此種S3M-寡核苷酸中，作為反義股互補區域之A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅之修飾樣式，較佳為以下式(IIIi)～(IIIl)之任一者。 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIi) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)- A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIj) A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIk) A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)　(IIIl)

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A ₁₄為DNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖2之58型及59型、圖3之63型、64型、68型及69型所示者，但未限定於此等。

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域之式(II)之A ₁₅為2’-MOE RNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖5之79型及83型所示者，但未限定於此等。

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃)之任一者為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，ENA為圖1之43型、45型、圖4之75型～84型、圖6之85型、86型、及91型～93型所示者，LNA為圖1之44型、46型、及圖3之67型、69型所示者，但未限定於此等。

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃)之任一者為DNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖1之41型、42型、圖4之71型、及圖6之87型～90型所示者，但未限定於此等。

作為本發明之一例，而提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃)之任一者為2’- MOE RNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾樣式而言，可例示例如，圖1之47型及48型、圖4之74型所示者，但未限定於此等。

於本發明之S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域中，上述所特定的核苷以外之核苷，係可適當選擇各式各樣的種類，但較佳為A ₂、A ₆及A ₁₆之至少一者(較佳為全部)之核苷為2’-F RNA。進一步較佳的反義股區域係除了A ₂、A ₆及A ₁₆之外，由A ₈、A ₉及A ₁₀所組成之群組選擇的1或2個核苷為2’-F RNA，前述所特定者以外之核苷(例如，A ₁、A ₃～A ₅、A ₇、A ₁₇ _～A ₁₉及A _a)為2’-OMe RNA或DNA。

於本發明之S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域中，A ₁₁～A ₁₅以外的區域之較佳的修飾樣式，係例如可例示於以下之表A-1及表A-2。

[表A-1]

	A ₁	A ₂	A ₃	A ₄	A ₅	A ₆	A ₇	A ₈	A ₉	A ₁₀
樣式1	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式2	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)
樣式3	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)
樣式4	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(M)	(F)	(M)
樣式5	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)
樣式6	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)
樣式7	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(F)	(M)	(F)	(M)
樣式8	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式9	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)
樣式10	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)
樣式11	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(F)	(M)
樣式12	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(F)	(F)
樣式13	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(F)	(F)	(M)
樣式14	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)	(F)	(M)
樣式15	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(M)	(F)	(M)
樣式16	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)	(F)	(M)	(M)	(F)	(F)

[表A-2]

	A ₁₆	A ₁₇	A ₁₈	A ₁₉	A _a	A _O3
樣式1	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式2	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式3	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式4	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式5	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式6	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式7	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式8	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式9	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式10	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式11	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式12	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式13	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式14	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)
樣式15	(F)	(M)	(F)	(M)	(M)	(M)
樣式16	(F)	(M)	(M)	(M)	(M)	(M)

[於上述表中，(M)為2’-OMe RNA，(F)為2’-F RNA。A _a為0～5個核苷，0以外的情形全部為相同之核苷。A _O3為0～5個核苷，0以外的情形全部為相同之核苷。核苷間鍵結係適當選擇磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵]。

S3M-寡核苷酸中所含的反義股區域，可在其互補區域之3’末端及/或5’末端可具有外伸結構(即，上述式(II)中的A _O3及A _O5)。A _O3及A _O5各自獨立而表示0～5個(較佳為3、2、1或0個)核苷，且各自之核苷獨立而為2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。較佳為：A _O3為由2或3個2’-OMe RNA所構成的外伸，或者是由1或2個2’-OMe RNA與1或2個2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷所構成的外伸，而A _O5不存在。

A _O3及A _O5存在的情形，其鹼基只要發揮作為外伸的功能則未特別限定，較佳為Oligo U或Oligo T。

＜3-3.核苷間鍵結＞本發明之S3M-寡核苷酸的各核苷間之鍵結樣式可適當選擇可經化學修飾的磷酸二酯鍵，較佳為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，彼等可各自單獨採用，或組合而採用。較佳為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵之組合，於有義股區域及反義股區域各自所含的核苷間鍵結中，硫代磷酸酯鍵之含有率為50%以下、40%以下、30%以下、29%以下、28%以下、27%以下、26%以下或25%以下。

採用了RNA及/或2’-F RNA的情形，該核苷與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結可為硫代磷酸酯鍵。較佳為採用RNA的情形，該核苷與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。

於本發明之S3M-寡核苷酸中，寡核苷酸之從5’末端及/或3’末端起第1、2、3、4或5號之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，有1、2、3、或4處)，係較佳為採用硫代磷酸酯鍵。於本發明之寡核苷酸中，有義股區域與反義股區域包含於不同寡核苷酸的情形，有義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3、4或5號之各自之核苷間、以及反義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3、4或5號之各自之核苷酸間鍵結可為硫代磷酸酯鍵，較佳為有義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為2處)、以及反義股區域之從5’末端起第1、2、3號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為2處)、及從3’末端起第1、2、3或4號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為3處)為硫代磷酸酯鍵。

＜4.寡核苷酸之合成方法＞就本發明之寡核苷酸的調製方法而言，只要可合成所冀望的寡核苷酸，則未特別限制，可使用已知之化學合成法(磷酸三酯法、亞磷醯胺法(phosphoramidite method)、或H-膦酸酯法(H-phosphonate method)等)。例如，可使用市售之核酸合成機，使用市售之DNA/RNA合成所使用的試藥進行合成。

藉由通常之亞磷醯胺法，具有所冀望之核苷酸序列的寡核苷酸可使用DNA合成機，例如使用PerkinElmer公司之利用亞磷醯胺法的模型392等而按照文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984))記載之方法進行合成。

對應各種核苷的亞磷醯胺試藥，可購入市售者而使用，亦可按照周知方法而合成。

本發明之寡核苷酸，可使用市售之合成機(例如，PerkinElmer公司之利用亞磷醯胺法的模型392)等，按照文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))記載之方法而進行合成。此時使用的亞磷醯胺試藥，針對天然型之核苷及2’-O-甲基核苷(即，2’-O-甲基鳥苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基尿苷)，可使用市售之亞磷醯胺試藥。關於2’-O-烷基之碳數為2～6個2’-O-烷基鳥苷、2’-O-烷基腺苷、2’-O-烷基胞苷及2’-O-烷基尿苷，如以下所示。

2’-O-胺基乙基鳥苷、2’-O-胺基乙基腺苷、2’-O-胺基乙基胞苷、2’-O-胺基乙基尿苷係可按照文獻(Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.)，合成對應的亞磷醯胺試藥。

2’-O-丙基鳥苷、2’-O-丙基腺苷、2’-O-丙基胞苷、2’-O-丙基尿苷，係可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)，而合成對應的亞磷醯胺試藥。

2’-O-烯丙基鳥苷、2’-O-烯丙基腺苷、2’-O-烯丙基胞苷、2’-O-烯丙基尿苷，係可使用市售之亞磷醯胺試藥。

關於2’-MOE RNA，2’-O-甲氧基乙基鳥苷、2’-O-甲氧基乙基腺苷、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷，係可按照專利(US6261840)或文獻(Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.)而合成對應的亞磷醯胺試藥，亦可使用市售之亞磷醯胺試藥。

2’-O-丁基鳥苷、2’-O-丁基腺苷、2’-O-丁基胞苷、2’-O-丁基尿苷，係可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)而合成對應的亞磷醯胺試藥。

2’-O-戊基鳥苷、2’-O-戊基腺苷、2’-O-戊基胞苷、2’-O-戊基尿苷，係可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)而合成對應的亞磷醯胺試藥。

2’-O-炔丙基鳥苷、2’-O-炔丙基腺苷2’-O-炔丙基胞苷、2’-O-炔丙基尿苷，係可使用市售之亞磷醯胺試藥。

關於2’-F RNA，2’-去氧-2’-氟鳥苷、2’-去氧-2’-氟腺苷、2’-去氧-2’-氟胞苷、2’-去氧-2’-氟尿苷，係可按照文獻(J. Med. Chem. 36, 831 (1993))而合成對應的亞磷醯胺試藥，亦可使用市售之亞磷醯胺試藥。

關於為3’-修飾核苷的3’-F RNA，3’-去氧-3’-氟鳥苷係可按照WO2017027645、3’-去氧-3’-氟腺苷係可按照WO2018198076、3’-去氧-3’-氟尿苷係可按照US2011/0196141，而合成對應的亞磷醯胺試藥。又，3’-去氧-3’-氟胞苷係可參考前述文獻等周知的方法而合成。

關於為3’-修飾核苷的3’-OMe RNA，3’-O-甲基鳥苷、3’-O-甲基腺苷、3’-O-甲基胞苷、3’-O-甲基尿苷，係可使用市售之亞磷醯胺試藥而合成。

關於為3’-修飾核苷的3’-MOE RNA，3’-O-甲氧基乙基鳥苷、3’-O-甲氧基乙基腺苷、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷，係可按照US2003/0096979而合成對應的亞磷醯胺試藥。

關於LNA，針對2’-O,4’-C-亞甲基鳥苷、2’-O,4’-C-亞甲基腺苷、2’-O,4’-C-亞甲基胞苷、2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基尿苷，可按照WO99/14226記載之方法而製造對應的亞磷醯胺試藥。

關於2’-O,4’-C-交聯部分的伸烷基之碳數為2～5個的2’-O,4’-C-伸烷基鳥苷、2’-O,4’-C-伸烷基腺苷、2’-O,4’-C-伸烷基胞苷、2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基尿苷，可按照WO00/47599記載之方法而製造對應的亞磷醯胺試藥。

D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-C,4’-C-亞甲基氧基亞甲基化的核苷，係可按照文獻(Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724而合成對應的亞磷醯胺試藥。

S-cEt(約束性乙基(constrained ethyl))，係可按照文獻(Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.)而合成對應的亞磷醯胺試藥。

AmNA係可按照文獻(Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.)或WO2014/109384而合成對應的亞磷醯胺試藥。

可藉由在將亞磷醯胺試藥偶合後，使硫、二硫化四乙基秋蘭姆(Tetraethylthiuram disulfide) (TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥(Glen Research公司)、或氫化黃原素等之試藥反應，而合成具有硫代磷酸酯鍵的反義寡核苷酸(Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198)。

將合成機中使用的可控孔徑的玻璃球(controlled pore glass)(CPG)、及聚苯乙烯作為固相担體，2’-O-甲基核苷及3’-O-甲基核苷所結合的固相担體，可使用市售者。又，可按照文獻(Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984)，而將關於2’-O,4’-C-亞甲基鳥苷、2’-O,4’-C-亞甲基腺苷、2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基尿苷之按照WO99/14226記載之方法所製造的核苷，將關於伸烷基之碳數為2～5個的2’-O,4’-C-伸烷基鳥苷、2’-O,4’-C-伸烷基腺苷、2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基尿苷之按照WO00/47599記載之方法所製造的核苷，與CPG結合。又，可藉由使用Universal Resin使上述之亞磷醯胺試藥結合而合成。又，可藉由使用經修飾的CPG(記載於特開平7-87982之實施例12b)，而合成在3’末端結合有2-羥基乙基磷酸基的寡核苷酸。又，若使用3’-amino-Modifier C3 CPG、3’-amino-Modifier C7 CPG、Glyceryl CPG (Glen Research)、3’-specer C3 SynBase CPG 1000、3’-specer C9 SynBase CPG 1000(link technologies)，則可合成在3’末端結合有羥基烷基磷酸基、或胺基烷基磷酸基的寡核苷酸。

又，將寡核苷酸類似物進行硫代化(thioate)的情形，除了硫之外，還可使用二硫化四乙基秋蘭姆(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、二硫化苯乙醯/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液(Ravikumar, V.T. et al. Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006) 16, p.2513-2517)等之試藥，按照文獻(Tetarhedron Letters, 32, 3005(1991)、J. Am. Chem. Soc., 112, 1253(1990))記載之方法而獲得硫代化物衍生物。

使用三級丁基二甲基矽(TBS)基等之矽基系的保護基作為RNA之2’-羥基的保護基的情形，可使用四丁基氟化銨(TBAF)、HF-吡啶、或HF-三乙基胺等而進行脱保護。

使用濃氨水、甲醇性氨、乙醇性氨、濃氨水-乙醇(3：1V/V)混液、濃氨水-40%甲基胺水溶液(1：1V/V)混液、甲基胺、0.5M LiOH水溶液、3.5M 三乙基胺/甲醇溶液之(1：10V/V)混液、含0.05M碳酸鉀的甲醇等，可將鹼基部的醯基、及磷酸基部的氰基乙基進行脱保護，較佳為濃氨水、濃氨水-乙醇混液(3：1V/V)。

可藉由利用逆相層析、離子交換層析(包含高速液體層析)等各種層析等之通常的核酸純化所使用的純化操作進行純化，而獲得本發明之寡核苷酸。

於本發明之寡核苷酸包含：結合有用以將寡核苷酸輸送至標的組織或標的細胞之輸送用單元的寡核苷酸。就此種結合有輸送用單元的寡核苷酸而言，可列舉例如，使對所冀望的化學結構導入了胺基烷基磷酸基(例如，就烷基而言，具有3至9之碳數)的單元與寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位及/或3’末端之核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸中為2’位)結合的寡核苷酸。就該種輸送用單元而言，例如，可適當採用會與肝臟實質細胞之脫唾液酸糖(asialo sugar)受體(ASGRP)結合的GalNAc單元、用以輸送至肝臟或肌肉組織的脂肪酸(例如，肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、俞樹酸等)單元(例如，參照Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044、WO2017/19267號公報等)等。

GalNAc單元係指包含可與ASGRP結合的N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)的結構單元，可用於將本發明之寡核苷酸遞送至肝臟。GalNAc單元可具有直鏈或分枝的連接子結構，可具有例如，直鏈、2分枝以上、3分枝以上、或4分枝以上、或4分枝以下、3分枝以下、或2分枝以下之分枝的連接子結構。又，GalNAc單元亦可包含用以與寡核苷酸鍵結的磷酸基或硫磷酸基。只要能維持與ASGRP的結合能力，則一個GalNAc單元中所含的GalNAc的數目並無限制，又GalNAc之結構可被修飾。就本發明之寡核苷酸中可使用的GalNAc單元而言，可適當採用例如，WO2021/049504號公報、WO2009/073809號公報、WO2014/076196號公報、WO2014/179620號公報、WO2015/006740號公報、WO2015/105083號公報、WO2016/0556012017/023817號公報、WO2017/084987號公報、WO2017/131236號公報、Methods in Enzymology、1999年、313卷、297～321頁、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693等周知之GalNAc單元。

例如，就可採用的GalNAc單元而言，可列舉下述式，並可依據WO2021/049504記載之方法適當調整。

(上述式中，虛線表示鍵結肢，鍵結肢之氧原子表示與鄰接的核苷酸鍵結，與5’末端之核苷酸鍵結的情形表示與5’-磷酸基、與3’末端之核苷酸鍵結的情形表示與3’-磷酸基(在3’位被修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)形成磷酸二酯鍵，所形成的磷酸二酯鍵可為硫代磷酸酯鍵等經化學修飾的磷酸二酯鍵)。

於本發明之寡核苷酸亦包含：對寡核苷酸導入了膽固醇單元、脂質單元或、維生素E單元者(參照例如，Lorenz， C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.，14，p.4975-4977(2004)；Soutschek, J., et al. Nature，432，p.173-178, (2004)；Wolfrum, C. et al. Nature Biotech. 25，p.1149-1157，(2007))Kubo, T. et al. Oligonucleotides, 17, p.1-20，(2007)；Kubo, T., et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 365，p.54-61，(2008)；Nishina, K., et al., Mol. Ther. 16，p.734-740，(2008))；及在寡核苷酸之末端結合有為會與蛋白質結合的核酸分子之適體(aptamer)者。

於本發明之寡核苷酸亦包含：結合有寡核苷酸與單株抗體(或其適當結合部分)、或蛋白質(或其適當寡肽片段)者(參照例如，Song, et al. Nature Biotech. 23, p.709-717(2005)；Xia et al. Pharm. Res. 24, p.2309-2316(2007)、Kumar, et al.Nature, 448, p.39-43(2007))。又，於本發明之寡核苷酸中亦包含：藉由對寡核苷酸加入陽離子聚合物，而作成帶正電荷的複合體者(作為可達成對臟器及細胞的分布之例，參照Leng et al. J. Gen. Med. 7, p.977-986(2005)；Baigude et al.2, p.237-241, ACS Chem. Biol.(2007)；Yadava et al. Oligonucleotide 17, p.213-222(2007))。

本發明之寡核苷酸中包含上述之寡核苷酸之各種的藥學上可容許的鹽類、酯、或此種酯之鹽類。就本發明之寡核苷酸之藥學上可容許的鹽類而言，較佳可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之類的鹼金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽之類的鹼土金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；銨鹽之類的無機鹽、三級辛基胺鹽、二苄基胺鹽、啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基伸乙基二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之類的有機鹽等之胺鹽；氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之類的鹵素原子化氫酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之類的低級鏈烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之類的芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；及甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之類的胺基酸鹽。

含有本發明之寡核苷酸的組成物係可作為例如脂質體、受體標的分子、經口、直腸、局部的或用以輔助攝取、分佈及/或吸收的其他處方，而與其他之分子、分子結構或化合物的混合物混合、封入、共軛。在將本發明之寡核苷酸作為疾病之預防藥或治療藥使用的情形，可將前述寡核苷酸、或其藥理學上可容許的鹽與其本身或與適當之藥理學上可容許的賦形劑、稀釋劑等混合，藉由錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等而經口地、或藉由注射劑、栓劑、貼附劑、或外用劑等而非經口地投予。

此等之製劑係可使用賦形劑(可列舉例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇的糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、α澱粉、糊精的澱粉衍生物；如結晶纖維素的纖維素衍生物；阿拉伯樹膠；葡聚醣；聚三葡萄糖之類的有機系賦形劑；及輕質無水矽酸、合成矽酸鋁、矽酸鈣、偏矽酸鎂鋁(magnesium aluminometasilicate)之類的矽酸鹽衍生物；磷酸氫鈣之類的磷酸磷；碳酸鈣之類的碳酸鹽；硫酸鈣之類的硫酸鹽等之無機系賦形劑)、潤滑劑(可列舉例如，硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂之類的硬脂酸金屬鹽；滑石；膠體二氧化矽；蜂蠟、鯨蠟之類的蠟類；硼酸；己二酸；硫酸鈉之類的硫酸鹽；二醇；反丁烯二酸；苯甲酸鈉；DL白胺酸；月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂之類的月桂基硫酸鹽；無水矽酸、矽酸水合物水合物之類的矽酸類；及上述澱粉衍生物)、結合劑(可列舉例如，羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、及與前述賦形劑相同的化合物)、崩解劑(可列舉例如，低取代度羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈣、內部交聯羧基甲基纖維素鈉之類的纖維素衍生物；羧基甲基澱粉、羧基甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯啶酮之類的化學修飾澱粉・纖維素類)、乳化劑(可列舉例如，膨土、VEEGUM之類的膠體性黏土；氫氧化鎂、氫氧化鋁之類的金屬氫氧化物；月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈣之類的陰離子界面活性劑；氯化苄烷銨之類的陽離子界面活性劑；及聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙基山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯之類的非離子界面活性劑)、穩定劑(可列舉對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯之類的對羥基苯甲酸酯類；氯丁醇、苄醇或苯乙醇之類的醇類；氯化苄烷銨；苯酚、甲酚之類的酚類；硫柳汞；去氫乙酸；及山梨酸)、矯味矯臭劑(可列舉例如，通常使用之甘味料、酸味料、香料等)、稀釋劑等之添加劑而以周知之方法製造。

就導入如上述調製的寡核苷酸的被導入體而言，若標的基因為可在其細胞內被轉錄成RNA者，即未特別限制。就被導入體而言，意指細胞、組織、或個體。

就導入本發明之寡核苷酸的細胞而言，可為生殖系列細胞、體性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分裂細胞、非分裂細胞、實質組織細胞、上皮細胞、永生化細胞、轉形細胞、神經細胞或免疫細胞之任一者。

就組織而言，包含單一細胞胚或構成性細胞、或多重細胞胚、胎兒組織等。又，就上述分化細胞而言，可列舉例如脂肪細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經細胞、神經膠細胞、血液細胞、巨核球、淋巴球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞、白血球、顆粒球、角蛋白生成細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、肝細胞及內分泌腺或外分泌腺之細胞等。就此類的細胞之例而言，較佳使用CHO-K1細胞(RIKEN Cell bank)、果蠅S2細胞(Schneider， l. et al.， J. Embryol. Exp. Morph.， 27，p.353-365(1972)、人類HeLa細胞(ATCC：CCL-2)、或人類HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)等。

作為可進一步作為本發明之寡核苷酸之被導入體使用的個體，具體而言，可列舉屬於植物、動物、原生動物、病毒、細菌、或真菌類者等。植物可為單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物，動物可為脊椎動物或無脊椎動物。就脊椎動物而言，較佳為包含小鼠、大鼠、猴子、狗及人類的哺乳類。

就對被導入體之本發明之寡核苷酸的導入方法而言，在被導入體為細胞、或組織的情形，可使用磷酸鈣法、電穿孔法、脂質轉染法、病毒感染、對3L5-寡核苷酸溶液之浸漬、或轉形法等。又，就導入至胚的方法而言，可列舉顯微注射、電穿孔法、或病毒感染等。在被導入體為植物的情形，可使用對植物體之體腔或間質細胞等的注入或灌流、或利用噴霧的方法。又，在動物個體的情形，可使用藉由經口、局部、皮下、肌肉內及靜脈內投予、非經口、經陰道、經直腸、經鼻、經眼、經膜內投予等而全身性導入的方法、或電穿孔法及病毒感染等。就經口導入之方法而言，亦可使用將本發明之寡核苷酸與生物的食物直接混合的方法。

關於將本發明之寡核苷酸對患者導入的方法，除了上述之外，可使用膠體分散系統。膠體分散系統被期待有提高化合物之活體內的穩定性的效果、將化合物有效率地輸送至特定臟器、組織或細胞的效果。膠體分散系統若為通常使用者，則未限定，但可列舉以包含高分子複合體、奈米膠囊、微球、小珠、及水中油系之乳化劑、微胞、混合微胞及脂質體的脂質為基質的分散系統，較佳為具有將化合物有效率地輸送至特定臟器、組織或細胞的效果之複數個脂質體、人工膜之小胞(Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, p.682-；Blume and Cevc, Biochem.et Biophys.Acta, 1990, 1029, p.91-；Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, p.119-；Chonn and Cullis, Current Op.Biotech., 1995, 6, p.698-)。大小範圍為0.2-0.4μm的單膜脂質體，可將含有巨大分子的水性緩衝液之相當大的比例被包化，化合物被胞化於此水性內膜，並以生物學上活性的形態被輸入至腦細胞(Fraley et al.，Trends Biochem.Sci., 1981, 6, p.77-)。

脂質體之組成通常為脂質，特別是磷脂質，尤其是將相轉移溫度高的磷脂質與1種或其以上之類固醇(特別是膽固醇)通常複合者。脂質體生產上有用的脂質之例，係包含磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、神經鞘脂質、磷脂醯乙醇胺、腦苷脂及神經節苷脂之類的磷脂醯化合物。

特別有用者為二醯基磷脂醯甘油，而在此處，脂質部分含有14-18個碳原子，特別是16-18個碳原子，且為飽和(於14-18個碳原子鏈之內部欠缺雙鍵)。

代表的磷脂質係包含磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。

包含脂質體的膠體分散系統之標的化，係可為被動的或主動的之任一者。

被動的標的化，係藉由利用欲分布至含有竇狀毛細血管的臟器之網狀內皮細胞之脂質體原本的傾向而達成。

另一方面，主動的標的化係可列舉例如藉由以下而修飾脂質體的手法等：使病毒之蛋白質外殼(Morishita et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.), 1993, 90, p.8474-)、單株抗體(或其適當的結合部分)、糖、糖脂質或蛋白質(或其適當的寡肽片段)之類的特定配體結合至脂質體；或為了達成對天然存在的局部部位以外之臟器及細胞型的分布而改變脂質體之組成。

經標的化的膠體分散系統的表面可以各式各樣的方法進行修飾。在以脂質體經標的化的遞送系統，係為了在與脂質雙層之緊密會合下維持標的配體，而可對脂質體之脂質雙層併入脂質基。為了將脂質鏈與標的配體連結，而可使用各式各樣的連結基。

會與在本發明之寡核苷酸的遞送被冀望之細胞上優勢地表現的特定之細胞表面分子結合之標的配體，係可為例如：(1)與依遞送被冀望之細胞而優勢性表現的特定之細胞受體結合的激素、成長因子或其適當的寡肽片段；或(2)會與標的細胞上優勢性表現的抗原性表位特異性結合之多株或單株抗體、或其適當的片段(例如，Fab；F(ab’)2)。2種或其以上之生物活性劑亦可在單一之脂質體內部進行複合並投予。

亦可向膠體分散系統追加提高內容物之細胞內穩定性及/或標的化的藥劑。

本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許之鹽的使用量會依症狀、年齡等而異，但在經口投予的情形，每1次下限1mg(較佳為30mg)、上限2000mg(較佳為1500mg)，在靜脈內投予或皮下投予的情形，每1次下限0.5mg(較佳為5mg)、上限500mg(較佳為250mg)，在氣管內投予的情形，每1次下限0.5mg(較佳為5mg)、上限500mg(較佳為250mg)，在眼球內投予的情形，每1次下限0.05mg(較佳為0.5mg)、上限10mg(較佳為5mg)，對於成人，冀望每1日1至3次因應症狀而進行投予。又，在穩定性提高的藥劑的情形，冀望每1週1至3次，在穩定性更提高的藥劑的情形，冀望每1個月1至3次，因應症狀而進行投予。

對於局部的投予之藥學的組成物及處方，係包含經皮的貼布、軟膏、乳液、乳霜、凝膠、軟糖、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。 [實施例]

(實施例1～52、及參考例1～3) 本化合物係使用亞磷醯胺法(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015))進行合成。關於具體的序列、結構，記載於表1-1～表1-10。又，實施例1～17、實施例48～52、參考例2及參考例3之化合物為針對編碼人類之運鐵蛋白受體2(transferrin receptor 2、TfR2)的基因之以mRNA作為標的基因之siRNA。又，實施例1～4及參考例2之化合物係以序列識別號1所示的人類TfR2(hTfR2) mRNA之鹼基序列中的第1536～1554號，而實施例5～17及參考例3之化合物係以第2847～2865號之由19核苷酸所構成的鹼基序列作為各自的標的序列，且進一步在各反義股區域之3’末端作為外伸結構而結合有U(M)U(M)者。又，實施例18～47及參考例1之化合物係對於WO2012/177921所記載之為針對小鼠TfR2(mTfR2)之siRNA的AD-47882中的19個鹼基對(即，互補區域)施予各式各樣的化學修飾，且進一步在各反義股區域之3’末端結合作為外伸結構而結合有U(M)U(M)者。

實施例48(TfR2-019.94DUG.s1)及實施例49(TfR2-019.94DUG.s2)之化合物，係實施例16之化合物(TfR2-019.94DUG)中的反義股區域之3’末端的外伸結構各自為1個核苷酸、或未存在的siRNA。實施例50(TfR2-019.94DUG.e1)及實施例51(TfR2-019.94DUG.e2)之化合物，係以將實施例16之化合物(TfR2-019.94DUG)中的標的序列在5’末端側各自延長1或2個核苷酸鏈長的序列(即，各自為序列識別號1之第2846～2865號的序列及第2845～2865號的序列)作為標的序列，且互補區域之鏈長各自為20bp、21bp的siRNA。實施例52(TfR2-019.94DUG.e3)之化合物，係將實施例16之化合物(TfR2-019.94DUG)中的反義股區域之3’末端的外伸結構作成G(M)U(M)的siRNA。

「2’-O-甲基核苷」之部分係使用記載於Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989)的亞磷醯胺體進行合成。「DNA」之部分係使用記載於Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984)的亞磷醯胺體進行合成。「3’-O-甲基核苷」之部分係使用3’-O-甲基腺苷(n-bz) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2901)、3’-O-甲基胞苷 (n-bz) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2902)、3’-O-甲基鳥苷(n-ibu) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2903)、或3’-O-甲基尿苷CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2904)進行合成。「2’-O,4’-C-亞甲基核苷」之部分係使用記載於WO99/14226的亞磷醯胺體進行合成。「2’-去氧-2’-氟核苷」之部分係使用記載於J. Med. Chem. 36, 831 (1993)的亞磷醯胺體進行合成。「2’-O-甲氧基乙基核苷」之部分係使用記載於Helv. Chim. Acta 78, 486-504 (1995)的亞磷醯胺體進行合成。「GN」之部分係使用WO2019/172286參考例41記載的亞磷醯胺體進行合成。本化合物係藉由負離子ESI質量分析進行鑑定，將其結果記載於表1。

各實施例化合物及參考例化合物係將由各自個別地合成之表1-1及表1-7記載之鹼基序列所構成的有義股區域、與由表1-2～表1-6及表1-8記載之鹼基序列所構成的反義股區域，等莫耳地置入1個試管而降溫貼合處理後，使用非變性凝膠或HPLC，確認形成雙股。

[表1-1]

有義股名稱	有義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
TfR2-039.23SG	GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M)	7228.28	7228.32	2
TfR2-019.22SG	GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7230.30	7230.28	9
AD47882.23SG	GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)	7056.15	7056.20	12

[表1-2]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
1	TfR2-039.41DUG	TfR2-039.23SG	TfR2-039.41AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	6949.06	6949.79	3
2	TfR2-039.42DUG	TfR2-039.23SG	TfR2-039.42AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	6964.35	6965.86	3
3	TfR2-039.43DUG	TfR2-039.23SG	TfR2-039.43AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(E) U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	6994.48	6991.83	4
4	TfR2-039.45DUG	TfR2-039.23SG	TfR2-039.45AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)T(E)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	6994.74	6991.82	5
5	TfR2-019.85DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.85AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6955.94	6956.00	10
6	TfR2-019.86DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.86AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(E)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6941.94	6941.99	10
7	TfR2-019.87DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.87AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6899.95	6899.98	10
8	TfR2-019.71DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.71AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6926.06	6925.99	11
9	TfR2-019.88DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.88AS	U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6926.05	6925.99	11
10	TfR2-019.89DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.89AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6926.11	6925.99	11

[表1-3]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
11	TfR2-019.90DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.90AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M)	6926.00	6925.99	11
12	TfR2-019.80DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.80AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6958.09	6957.96	10
13	TfR2-019.91DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.91AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6957.96	6957.96	10
14	TfR2-019.92DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.92AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6958.07	6957.96	10
15	TfR2-019.93DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.93AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6958.06	6957.96	10
16	TfR2-019.94DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.94AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6935.66	6935.69	10
17	TfR2-019.95DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.95AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	6935.68	6935.69	10
18	AD47882.41DUG	AD47882.23SG	AD47882.41AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7119.06	7118.1	13
19	AD47882.42DUG	AD47882.23SG	AD47882.42AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)^C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7134.05	7134.08	13
20	AD47882.43DUG	AD47882.23SG	AD47882.43AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(E)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7147.06	7146.10	14
21	AD47882.44DUG	AD47882.23SG	AD47882.44AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(L)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7133.06	7132.08	14

[表1-4]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
22	AD47882.45DUG	AD47882.23SG	AD47882.45AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(E)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7161.08	7160.11	14
23	AD47882.46DUG	AD47882.23SG	AD47882.46AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(L)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7148.09	7146.10	14
24	AD47882.47DUG	AD47882.23SG	AD47882.47AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(m)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7178.11	7178.12	14
25	AD47882.48DUG	AD47882.23SG	AD47882.48AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(m)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7192.09	7192.14	14
26	AD47882.70DUG	AD47882.23SG	AD47882.70AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(F)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7146.09	7146.10	14
27	AD47882.71DUG	AD47882.23SG	AD47882.71AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7130.08	7130.10	13
28	AD47882.72DUG	AD47882.23SG	AD47882.72AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(E) U(M)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7158.07	7158.10	14
29	AD47882.73DUG	AD47882.23SG	AD47882.73AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7172.10	7172.11	14
30	AD47882.74DUG	AD47882.23SG	AD47882.74AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(m)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7204.09	7204.14	14
31	AD47882.75DUG	AD47882.23SG	AD47882.75AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7148.04	7148.09	14
32	AD47882.76DUG	AD47882.23SG	AD47882.76AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7146.06	7146.10	14

[表1-5]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
33	AD47882.77DUG	AD47882.23SG	AD47882.77AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(E)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7172.08	7172.11	14
34	AD47882.78DUG	AD47882.23SG	AD47882.78AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(L)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7158.08	7158.10	14
35	AD47882.79DUG	AD47882.23SG	AD47882.79AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(m)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7204.12	7204.14	14
36	AD47882.80DUG	AD47882.23SG	AD47882.80AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7162.04	7162.07	14
37	AD47882.81DUG	AD47882.23SG	AD47882.81AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(E)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7188.05	7188.09	14
38	AD47882.82DUG	AD47882.23SG	AD47882.82AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(L)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7174.06	7174.07	14
39	AD47882.83DUG	AD47882.23SG	AD47882.83AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(m)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7220.08	7220.12	14
40	AD47882.84DUG	AD47882.23SG	AD47882.84AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(M)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7160.10	7160.11	14
41	AD47882.88DUG	AD47882.23SG	AD47882.88AS	A(M)^G(F)^A(M)A(F)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7130.10	7130.10	13
42	AD47882.89DUG	AD47882.23SG	AD47882.89AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7130.11	7130.10	13
43	AD47882.90DUG	AD47882.23SG	AD47882.90AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(F)^G(M)^U(M)^U(M)	7130.10	7130.10	13

[表1-6]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
44	AD47882.91DUG	AD47882.23SG	AD47882.91AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7162.09	7162.07	14
45	AD47882.92DUG	AD47882.23SG	AD47882.92AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7162.09	7162.07	14
46	AD47882.93DUG	AD47882.23SG	AD47882.93AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)U(F)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7162.05	7162.07	14
47	AD47882.94DUG	AD47882.23SG	AD47882.94AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(M)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	7136.04	7136.06	14
參考例1	AD47882.23DUG	AD47882.23SG	AD47882.9AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	7118.03	7118.12	14
參考例2	TfR2-039.23DUG	TfR2-039.23SG	TfR2-039.9AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M)	6950.0	6949.72	4
參考例3	TfR2-019.22DUG	TfR2-019.22SG	TfR2-019.22AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M)	6918.0	6917.74	10

[表1-7]

實施例	化合物名稱	有義股名稱	有義股區域之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
48	TfR2-019.94DUG.s1	TfR2-019.22SG	GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7230.30	7230.28	9
49	TfR2-019.94DUG.s2	TfR2-019.22SG	GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7230.30	7230.28	9
50	TfR2-019.94DUG.e1	TfR2-019.22SG.e1	GNG(M)^C(M)^G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M) A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7589.35	7589.35	15
51	TfR2-019.94DUG.e2	TfR2-019.22SG.e2	GNG(M)^G(M)^C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7948.42	7948.41	16
52	TfR2-019.94DUG.e3	TfR2-019.22SG	GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	7230.30	7230.28	9

[表1-8]

實施例	化合物名稱	反義股名稱	反義股區域之鹼基序列(5’-3’)	分子量	理論值	序列識別號
48	TfR2-019.94DUG.s1	TfR2-019.94AS.s1	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)	6599	6599.58	17
49	TfR2-019.94DUG.s2	TfR2-019.94AS.s2	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)	6263	6263.31	18
50	TfR2-019.94DUG.e1	TfR2-019.94AS.e1	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^C(M)^U(M)^U(M)	7254	7255.06	19
51	TfR2-019.94DUG.e2	TfR2-019.94AS.e2	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)^C(M)^U(M)^U(M)	7574	7574.27	20
52	TfR2-019.94DUG.e3	TfR2-019.94AS.e3	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^G(M)^U(M)	6974	6974.88	21

[表1-9]

有義股名稱	有義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
TfR2-039.23SG	GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M)	2
TfR2-019.22SG	GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	9
AD47882.23SG	GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)	12
TfR2-019.22SG.e1	GNG(M)^C(M)^G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	15
TfR2-019.22SG.e2	GNG(M)^G(M)^C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)	16

[表1-10]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
TfR2-039.41AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	3
TfR2-039.42AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	3
TfR2-039.43AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(E)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	4
TfR2-039.45AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)T(E)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M)	5
TfR2-019.85AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.86AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(E)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.87AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.71AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	11

[表1-11]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
TfR2-019.88AS	U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	11
TfR2-019.89AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	11
TfR2-019.90AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M)	11
TfR2-019.80AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.91AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.92AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.93AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.94AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10

[表1-12]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
TfR2-019.95AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)	10
AD47882.41AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.42AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)^C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.43AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(E)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.44AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(L)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.45AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(E)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.46AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(L)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.47AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(m)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14

[表1-13]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
AD47882.48AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(m)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.70AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(F)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.71AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.72AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(E)U(M)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.73AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.74AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(m)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.75AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.76AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14

[表1-14]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
AD47882.77AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(E)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.78AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(L)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.79AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)C(m)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.80AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.81AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(E)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.82AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(L)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.83AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(m)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.84AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(E)A(M)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14

[表1-15]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
AD47882.88AS	A(M)^G(F)^A(M)A(F)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.89AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.90AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(F)^G(M)^U(M)^U(M)	13
AD47882.91AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.92AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.93AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)U(F)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.94AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(M)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M)	14
AD47882.9AS	A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M)	14

[表1-16]

反義股名稱	反義股之鹼基序列(5’-3’)	序列識別號
TfR2-039.9AS	U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M)	4
TfR2-019.22AS	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M)	10
TfR2-019.94AS.s1	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)	17
TfR2-019.94AS.s2	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)	18
TfR2-019.94AS.e1	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^C(M)^U(M)^U(M)	19
TfR2-019.94AS.e2	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)^C(M)^U(M)^U(M)	20
TfR2-019.94AS.e3	U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^G(M)^U(M)	21

表中之「分子量」表示利用負離子ESI質量分析的實測值。在表中之「鹼基序列」中，N(R)表示RNA，N(D)表示DNA，N(M)表示2’-OMe RNA，N(m)表示2’-MOE RNA，N(3M)表示3’-OMe RNA，N(F)表示2’-F RNA，N(L)表示LNA，N(E)表示ENA。各自之核苷的結構係以上述各結構式表示。

「GN」表示以上述的(GN)所表示的GalNAc單元。關於核苷間之鍵結、核苷與GalNAc單元之結合、或核苷與連接子之結合，「^」表示硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-，以上述核苷間鍵結之結構圖中的(PS)表示)，未特別記載的情形，係表示以磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-，以上述核苷間鍵結之相同圖中的(P)表示)鍵結者。

各寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位及3’末端之核苷酸之3’位(在3’位經修飾的核苷酸則為2’位)，係氫原子成為與上述各核苷之結構圖中的氧原子鍵結的羥基。惟，「GN」成為末端的情形，氫原子之鍵結並非必要。

＜試驗例＞試驗例1：對HepG2細胞的TfR2 siRNA之利用反向轉染法的篩選藉由反向轉染法而如以下進行siRNA之篩選。轉染當日，分別製作siRNA檢體每1種類2孔份、以蒸餾水替代siRNA的陰性對照(NT)2孔分、作為陽性對照之對於為參考例2或3之化合物的對hTfR2之siRNA施加化學修飾的化合物(TfR2-039.23DUG或TfR2-019.22DUG)2孔分。

每1孔於14.8μL之Opti-MEM與0.2μL之RNAiMAX的混合液中添加5μL之siRNA(實施例之化合物)，在室溫下溫育20分鐘。作為陰性對照用之試藥調製，對Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之蒸餾水替代siRNA。作為陽性對照用之試藥調製，對Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之參考例2或之3的化合物。接著，各添加20μL包含siRNA或陰性對照或陽性對照的混合液至96孔之細胞培養用盤(SUMIRON公司製)。在添加了混合液的96孔盤中，將使用預先加溫為37℃之含有10% FBS的DMEM而調製的2×10 ⁴cells/mL之HepG2細胞，每1孔各接種80μL。作為siRNA之最終濃度，係調製成10nM至10倍或50倍公比。

進行轉染而於1日後或2日後，使用PBS而將細胞洗淨1次。使用Superprep Cell Lysis RT Kit for qPCR(Takara Bio公司製)，按照套組的程序，實施RNA提取及反轉錄反應而合成cDNA。使用獲得的cDNA，藉由定量的PCR測定內因性之hTfR2的mRNA表現量。作為管家基因，測定h18S之mRNA表現量。

定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下方式進行。獲得的cDNA係以原液使用。384孔之PCR平盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.25μL之hTfR2引子(Hs.PT.58.20599434，Integrated DNA Technologies公司製)或0.25μL之h18S引子(Hs.PT.39a.22214856.g、Integrated DNA Technologies公司製)、2.75μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例進行混合(共計10μL)，對於各cDNA，調製2孔分，進行定量的PCR。將hTfR2與h18S之mRNA表現量測定為2孔間之平均值。hTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的h18S之mRNA表現量進行常規化。作為將陰性對照中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，而算出並標記各siRNA處理的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量。結果係呈示於以下之表2至表4。

[表2-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-039.23DUG	0.001	0.91
	0.01	0.72
	0.1	0.60
	1	0.35
	10	0.27
TfR2-039.41DUG	0.001	0.81
	0.01	0.63
	0.1	0.31
	1	0.13
	10	0.14
TfR2-039.42DUG	0.001	0.66
	0.01	0.73
	0.1	0.37
	1	0.16
	10	0.12

[表2-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-039.23DUG	0.001	0.75
	0.01	0.76
	0.1	0.59
	1	0.25
	10	0.21
TfR2-039.41DUG	0.001	0.66
	0.01	0.63
	0.1	0.26
	1	0.08
	10	0.07
TfR2-039.43DUG	0.001	0.72
	0.01	0.52
	0.1	0.59
	1	0.42
	10	0.35
TfR2-039.45DUG	0.001	0.48
	0.01	0.47
	0.1	0.44
	1	0.23
	10	0.21

[表3-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.22DUG	0.001	0.87
	0.01	0.46
	0.1	0.23
	1	0.12
	10	0.15
TfR2-019.87DUG	0.001	0.95
	0.01	0.43
	0.1	0.25
	1	0.15
	10	0.13

[表3-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.22DUG	0.001	0.89
	0.01	0.51
	0.1	0.22
	1	0.13
	10	0.10
TfR2-019.85DUG	0.001	0.64
	0.01	0.36
	0.1	0.17
	1	0.15
	10	0.09
TfR2-019.86DUG	0.001	0.72
	0.01	0.34
	0.1	0.19
	1	0.15
	10	0.10
TfR2-039.41DUG	0.001	0.93
	0.01	0.89
	0.1	0.57
	1	0.33
	10	0.28

[表4-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.22DUG	0.001	1.07
	0.01	0.61
	0.1	0.33
	1	0.25
	10	0.22
TfR2-019.71DUG	0.001	0.97
	0.01	0.88
	0.1	0.57
	1	0.32
	10	0.31
TfR2-019.88DUG	0.001	0.86
	0.01	0.76
	0.1	0.46
	1	0.28
	10	0.24
TfR2-019.89DUG	0.001	0.81
	0.01	0.71
	0.1	0.40
	1	0.30
	10	0.19

[表4-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.22DUG	0.001	1.09
	0.01	0.73
	0.1	0.30
	1	0.20
	10	0.15
TfR2-019.90DUG	0.001	1.02
	0.01	0.93
	0.1	0.45
	1	0.29
	10	0.22
TfR2-019.80DUG	0.001	1.06
	0.01	0.76
	0.1	0.35
	1	0.26
	10	0.21
TfR2-019.91DUG	0.001	1.02
	0.01	0.66
	0.1	0.33
	1	0.25
	10	0.17

[表4-3]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.92DUG	0.001	0.88
	0.01	0.67
	0.1	0.33
	1	0.24
	10	0.24
TfR2-019.22DUG	0.001	0.83
	0.01	0.55
	0.1	0.34
	1	0.23
	10	0.24
TfR2-019.93DUG	0.001	0.85
	0.01	0.67
	0.1	0.40
	1	0.26
	10	0.24

[表4-4]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.92DUG	0.001	0.85
	0.01	0.52
	0.1	0.35
	1	0.16
	10	0.13
TfR2-019.93DUG	0.001	0.68
	0.01	0.42
	0.1	0.22
	1	0.11
	10	0.08
TfR2-019.94DUG	0.001	0.65
	0.01	0.48
	0.1	0.28
	1	0.15
	10	0.16
TfR2-019.95DUG	0.001	0.91
	0.01	0.53
	0.1	0.25
	1	0.18
	10	0.09

試驗例1-1：使用HepG2細胞的hTfR2弱化活性以與試驗例1同樣之方法，進行在使用反向轉染法而將siRNA導入至HepG2細胞2日後的hTfR2之mRNA表現量的評價。使用TfR2-019、及TfR2-019.94DUG(實施例16)作為siRNA。TfR2-019係由為各自獨立的寡核苷酸之有義股區域及反義股區域所構成的雙股寡核苷酸，該有義股區域及反義股區域之互補區域全部由天然型之RNA(即，A(R)、G(R)、C(R)、及U(R))所構成。又，TfR2-019中的反義股區域，係以序列識別號1所示的hTfR2 mRNA之第2847〜2865號的鹼基序列為標的序列，且具有由與該標的序列完全互補的序列所構成的互補區域，在該互補區域之各3’末端作為外伸結構而結合有2個連續的T(D)的寡核苷酸。又，TfR2-019中的有義股區域，係具有由與對應的反義股區域之互補區域中的核苷酸序列完全地互補的序列所構成的互補區域，在該互補區域之3’末端作為外伸結構而結合有2個連續的T(D)的寡核苷酸。又，各核苷間鍵結為未經化學修飾的磷酸二酯鍵。

關於hTfR2 mRNA表現量之評價，作為將陰性對照(NT)中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，而算出並標記各siRNA處理的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量。結果係呈示於圖11。

此結果係顯示尤其是TfR2-019.94DUG具有對於hTfR2 mRNA的高弱化活性。

試驗例2：對穩定表現mTfR2的HEK293A細胞(293A-mTfR2細胞)的TfR2 siRNA之利用反向轉染法的RNAi活性測定在藉由轉染而使編碼小鼠TfR2(mTfR2)的質體於HEK293A細胞過度表現後，藉由利用ENETICIN(Gibco公司製)的藥劑篩選，而選殖穩定表現mTfR2的HEK293A細胞(293A-mTfR2細胞)。

藉由反向轉染法如以下進行siRNA之篩選。轉染當日，分別製作siRNA檢體每1種類2孔份、以蒸餾水替代siRNA的陰性對照(NT)2孔分、作為陽性對照之對WO2012/177921記載的針對mTfR2的siRNA之序列施予化學修飾而成的參考例1之化合物(AD47882.23DUG)2孔分。

於每1孔14.8μL之Opti-MEM與0.2μL之RNAiMAX的混合液中，添加5μL之siRNA(各實施例之化合物)，在室溫下溫育20分鐘。作為陰性對照用之試藥調製，對Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之蒸餾水替代siRNA。作為陽性對照用之試藥調製，對Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之參考例1之化合物。接著，各添加20μL包含siRNA或陰性對照或陽性對照的混合液至96孔之細胞培養用盤(SUMIRON公司製)。在添加了混合液的96孔盤中，將使用預先加溫為37℃之含有10% FBS的DMEM而調製的2×10 ⁴cells/mL之293A-mTfR2細胞，每1孔各接種80μL。作為siRNA之最終濃度，係調製成10nM至10倍公比。

於進行轉染1日後或2日後，使用PBS而將細胞洗淨1次。使用Superprep Cell Lysis RT Kit for qPCR(Takara Bio公司製)，按照套組的程序，實施RNA提取及反轉錄反應而合成cDNA。使用獲得的cDNA，藉由定量的PCR測定mTfR2之mRNA表現量。作為管家基因，測定人類18S 核糖體RNA(h18S)之mRNA表現量。

定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下方式進行。獲得的cDNA係以原液使用。384孔之PCR平盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.25μL之mTfR2引子(Mm.PT.58.7860185，Integrated DNA Technologies公司製)或0.25μL之h18S引子(Hs.PT.39a.22214856.g，Integrated DNA Technologies公司製)、2.75μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例進行混合(計10μL)，對於各cDNA，調製2孔分，進行定量的PCR。以2孔間的平均值來測定mTfR2與h18S之mRNA表現量。mTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的h18S之mRNA表現量進行常規化。作為將陰性對照中的mTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，而算出各siRNA處理的檢體之相對mTfR2 mRNA表現量，且各自示於表5至表8。

[表5-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.86
	0.01	0.81
	0.1	0.35
	1	0.09
	10	0.05
AD47882.41DUG	0.001	0.64
	0.01	0.59
	0.1	0.25
	1	0.08
	10	0.05
AD47882.42DUG	0.001	0.76
	0.01	0.64
	0.1	0.27
	1	0.08
	10	0.06

[表5-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	1.04
	0.01	0.98
	0.1	0.52
	1	0.14
	10	0.08
AD47882.43DUG	0.001	0.99
	0.01	1.01
	0.1	0.56
	1	0.16
	10	0.09
AD47882.44DUG	0.001	0.98
	0.01	1.02
	0.1	0.53
	1	0.14
	10	0.08
AD47882.45DUG	0.001	0.94
	0.01	0.87
	0.1	0.42
	1	0.12
	10	0.08
AD47882.46DUG	0.001	0.85
	0.01	0.86
	0.1	0.47
	1	0.13
	10	0.07

[表5-3]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.97
	0.01	0.90
	0.1	0.41
	1	0.11
	10	0.06
AD47882.47DUG	0.001	1.00
	0.01	0.91
	0.1	0.47
	1	0.10
	10	0.05
AD47882.48DUG	0.001	0.95
	0.01	0.93
	0.1	0.44
	1	0.09
	10	0.05

[表6-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.89
	0.01	0.59
	0.1	0.22
	1	0.11
	10	0.09
AD47882.70DUG	0.001	0.87
	0.01	0.78
	0.1	0.36
	1	0.16
	10	0.14
AD47882.71DUG	0.001	0.78
	0.01	0.65
	0.1	0.24
	1	0.12
	10	0.10
AD47882.72DUG	0.001	0.83
	0.01	0.80
	0.1	0.60
	1	0.25
	10	0.18

[表6-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.90
	0.01	0.56
	0.1	0.20
	1	0.12
	10	0.09
AD47882.73DUG	0.001	0.98
	0.01	0.90
	0.1	0.63
	1	0.28
	10	0.22
AD47882.74DUG	0.001	0.87
	0.01	0.70
	0.1	0.47
	1	0.17
	10	0.15
AD47882.75DUG	0.001	0.78
	0.01	0.46
	0.1	0.16
	1	0.09
	10	0.07
AD47882.76DUG	0.001	0.73
	0.01	0.43
	0.1	0.19
	1	0.10
	10	0.08

[表6-3]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.77
	0.01	0.40
	0.1	0.15
	1	0.09
	10	0.08
AD47882.77DUG	0.001	0.84
	0.01	0.64
	0.1	0.24
	1	0.12
	10	0.10
AD47882.78DUG	0.001	0.73
	0.01	0.62
	0.1	0.29
	1	0.11
	10	0.10
AD47882.79DUG	0.001	0.61
	0.01	0.29
	0.1	0.10
	1	0.07
	10	0.06
AD47882.80DUG	0.001	0.68
	0.01	0.43
	0.1	0.17
	1	0.08
	10	0.06

[表6-4]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.87
	0.01	0.56
	0.1	0.18
	1	0.10
	10	0.08
AD47882.81DUG	0.001	0.88
	0.01	0.74
	0.1	0.35
	1	0.14
	10	0.11
AD47882.82DUG	0.001	0.77
	0.01	0.64
	0.1	0.33
	1	0.12
	10	0.11
AD47882.83DUG	0.001	0.64
	0.01	0.37
	0.1	0.16
	1	0.08
	10	0.06
AD47882.84DUG	0.001	0.71
	0.01	0.68
	0.1	0.48
	1	0.19
	10	0.15

[表7-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	1.04
	0.01	0.94
	0.1	0.42
	1	0.09
	10	0.06
AD47882.71DUG	0.001	1.07
	0.01	1.02
	0.1	0.60
	1	0.15
	10	0.10
AD47882.88DUG	0.001	1.05
	0.01	1.02
	0.1	0.54
	1	0.16
	10	0.12
AD47882.89DUG	0.001	1.03
	0.01	0.94
	0.1	0.57
	1	0.14
	10	0.08
AD47882.90DUG	0.001	1.05
	0.01	0.91
	0.1	0.54
	1	0.14
	10	0.08

[表7-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	0.90
	0.01	0.74
	0.1	0.34
	1	0.08
	10	0.05
AD47882.80DUG	0.001	0.93
	0.01	0.84
	0.1	0.39
	1	0.09
	10	0.05
AD47882.91DUG	0.001	0.86
	0.01	0.78
	0.1	0.40
	1	0.10
	10	0.05
AD47882.92DUG	0.001	0.78
	0.01	0.71
	0.1	0.42
	1	0.10
	10	0.05
AD47882.93DUG	0.001	0.78
	0.01	0.65
	0.1	0.32
	1	0.09
	10	0.04

[表8]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
AD47882.23DUG	0.001	1.03
	0.01	0.66
	0.1	0.20
	1	0.09
	10	0.06
AD47882.92DUG	0.001	1.12
	0.01	0.88
	0.1	0.28
	1	0.10
	10	0.08
AD47882.94DUG	0.001	1.12
	0.01	0.80
	0.1	0.29
	1	0.11
	10	0.08

試驗例3：正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗由於結合了GalNAc的TfR2 siRNA被認為使正常小鼠中的血漿中鐵濃度上升(WO2012/177921)，因此作為對該文獻記載的AD47882之鹼基序列施予各式各樣的化學修飾，且結合了GalNAc的siRNA，而使用參考例1之化合物(AD47882.23DUG)、實施例18至25之化合物(AD47882.41DUG～48DUG)，進行以下之試驗。

將結合了GalNAc的TfR2 siRNA，以1 mg/kg (1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行皮下投予(s.c.)(n=5/組)。作為媒劑(vehicle)組，係皮下投予PBS(n=5/組)。在siRNA或PBS之處理前(第0日)、處理2日後(第2日)、6日後(第6日)、13日後(第13日)進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit(Metallogenics公司製)，測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度之結果呈示於圖7(平均值±標準誤差)。

試驗例4：正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗為了評價TfR2 siRNA在小鼠體內之持續性的活性，作為對AD47882之鹼基序列施加各式各樣的化學修飾，且結合了GalNAc的siRNA，而使用參考例1之化合物(AD47882.23DUG)、實施例22之化合物(AD47882.45DUG)、實施例26至40之化合物(AD47882.70～84DUG)，進行以下之實驗。

將結合了GalNAc的TfR2 siRNA以1 mg/kg (1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)皮下投予(s.c.)(n=5/組)。作為媒劑組，係皮下投予PBS (n=5/組)。在siRNA或PBS之處理前(第0日)、處理7日後(第7日)、12日後(第12日)、21日後(第21日)、28日後(第28日)進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit(Metallogenics公司製)，測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度之結果呈示於圖8(平均值±標準誤差)。

試驗例5：正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗與試驗例4同樣地，作為對AD47882之鹼基序列施加各式各樣的化學修飾，且結合了GalNAc的siRNA，而使用參考例1之化合物(AD47882.23DUG)、實施例27之化合物(AD47882.71DUG)、實施例36之化合物(AD47882.80DUG)、實施例41至46之化合物(AD47882.88～93DUG)，進行以下之試驗。

將結合了GalNAc的TfR2 siRNA以1 mg/kg (1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)皮下投予(s.c.)(n=5/組)。作為媒劑組，係皮下投予PBS (n=5/組)。在siRNA或PBS之處理前(第0日)、處理7日後(第7日)、14日後(第14日)、21日後(第21日)、28日後(第28日)進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit(Metallogenics公司製)，測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度之結果呈示於圖9(平均值±標準誤差)。

又，在siRNA或PBS之處理後28日後(第28日)，於利用異氟烷的麻醉下，藉由放血處理而將小鼠安樂死後，將肝臟採檢，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之提取係使用RNeasy Mini Kit(QUAGEN公司製)，而按照套組的程序而實施。使用將獲得的5000 ng之RNA藉由使用High Capacity RNA to cDNA kit(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應所獲得的cDNA，藉由定量的PCR而定量內因性之小鼠TfR2的mRNA量。

定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下之方式進行。獲得的cDNA係使用蒸餾水稀釋10倍(將cDNA 15μL及蒸餾水135μL加以混合)。384孔之PCR平盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.25μL之mTfR2引子(Mm.PT.58.7860185，Integrated DNA Technologies公司製)、或2.75μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例混合(共計10μL)，對於各cDNA，調製2孔分，進行定量的PCR。作為管家基因，而使用小鼠β-肌動蛋白(mActb)引子(Mm.PT.39a.22214843.g，Integrated DNA Technologies公司製)，以如上述比例進行混合，對於各cDNA，調製2孔分，進行定量的PCR。以2孔間的平均值來測定mTfR2及mActb之mRNA量。mTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的mActb之mRNA表現量進行常規化。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，而算出並標記siRNA處理組中的相對mRNA量(平均值±標準誤差)。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖9F。

試驗例6：伴隨炎症之貧血模型中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗結合了GalNAc的TfR2 siRNA係使伴隨炎症之貧血模型中的HGB值上升。作為對AD47882之鹼基序列施加各式各樣的化學修飾，且結合了GalNAc的siRNA，而使用AD47882.41DUG(實施例18之化合物)、AD47882.88DUG(實施例41之化合物)、AD47882.89DUG(實施例42之化合物)、AD47882.91DUG(實施例44之化合物)、AD47882.92DUG(實施例45之化合物)、AD47882.93DUG(實施例46之化合物)，進行以下之試驗。

將結合了GalNAc的TfR2 siRNA，以1 mg/kg(1mpk)之用量對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)投予1次(第0日)。作為媒劑組，係皮下投予PBS。進行siRNA或PBS處理，而於4日後(Day4)將松節油以150μL/小鼠進行皮下投予而誘導炎症。作為未誘導炎症的對象群(對照)，係替代松節油而將PBS進行s.c.投予。本試驗中係設為n=5/組。於投予第1次之松節油2日後(第6日)測定血漿中鐵濃度。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit(Metallogenics公司製)進行測定。結果係呈示於圖10A。

於投予第1次之松節油7日後(第11日)，再次將松節油以150μL/小鼠進行皮下投予。在投予第2次之松節油3日後(第14日)，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000(Sysmex股份有限公司製)，而測定HGB值、MCH值、RBC數。結果係各自呈示於圖10B、10C、10D。

又，在異氟烷麻醉下藉由放血處理而將小鼠安樂死後，採檢肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之提取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的mActb之mRNA表現量進行常規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係呈示於圖10E。作為將未誘導炎症的對照組的mRNA量設為1.0時之相對值，而算出並標記其他組中的相對mRNA量(平均值±標準誤差)。

試驗例7：對HepG2細胞的TfR2 siRNA之利用反向轉染法的篩選以與試驗例1同樣之方法，使用TfR2-019.94DUG(實施例16)、TfR2-019.94DUG.s1(實施例48)、TfR2-019.94.s2DUG(實施例49)、TfR2-019.94.e1DUG(實施例50)、TfR2-019.94DUG.e2(實施例51)、及TfR2-019.94DUG.e3(實施例52)作為siRNA，而針對hTfR2之mRNA表現量進行試驗。作為將陰性對照(NT)中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，而算出並標記將各siRNA處理的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量。結果係呈示於以下之表9。

[表9-1]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.94DUG	0.001	0.97
	0.01	0.58
	0.1	0.26
	1	0.05
	10	0.03
TfR2-019.94DUG.s1	0.001	1.13
	0.01	0.48
	0.1	0.17
	1	0.07
	10	0.02
TfR2-019.94DUG.s2	0.001	1.02
	0.01	0.53
	0.1	0.26
	1	0.08
	10	0.04
TfR2-019.94DUG.e1	0.001	0.92
	0.01	0.40
	0.1	0.20
	1	0.06
	10	0.02
TfR2-019.94DUG.e2	0.001	0.89
	0.01	0.51
	0.1	0.21
	1	0.08
	10	0.04

[表9-2]

化合物名稱	濃度(nM)	相對值
NT	-	1.00
TfR2-019.94DUG	0.001	0.86
	0.01	0.63
	0.1	0.30
	1	0.10
	10	0.06
TfR2-019.94DUG e3	0.001	0.99
	0.01	0.60
	0.1	0.27
	1	0.09
	10	0.03

試驗例8：正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗與試驗例5同樣地，作為對AD47882之鹼基序列施加各式各樣的化學修飾，且結合了GalNAc的siRNA，而使用參考例1之化合物(AD47882.23DUG)、實施例45之化合物(AD47882.92DUG)、實施例47之化合物(AD47882.94DUG)，進行以下之實驗。

作為結合了GalNAc的TfR2 siRNA，將AD47882.23DUG(23DUG)以1 mg/kg(1mpk)之用量，將AD47882.92DUG(92DUG)以0.3 mg/kg(0.3mpk)或1 mg/kg(1mpk)之用量，將AD47882.94DUG以0.3 mg/kg(0.3mpk)或1 mg/kg(1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行皮下投予(s.c.)(n=4或5/組)。作為媒劑組，係皮下投予PBS(n=4/組)。在siRNA或PBS之處理前(第0日)、處理9日後(第9日)、14日後(第14日)、21日後(第21日)、28日後(第28日)進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit(Metallogenics公司製)，測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度的結果各自呈示於圖12A至圖12E(平均值±標準誤差)。

又，在siRNA或PBS之處理後28日後(第28日)，在利用異氟烷的麻醉下，藉由放血處理將小鼠安樂死後，採檢肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之提取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的mActb之mRNA表現量進行常規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係呈示於圖12F。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，而算出並標記其他組中的相對mRNA量(平均值±標準誤差)。

試驗例9：人類TfR2表現小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之藥效評價試驗使用於特殊免疫研究所股份有限公司作出之具有人類TfR2基因座的雄性或雌性之TfR2人類化小鼠，而為了檢驗針對人類TfR2 mRNA之GalNAc結合TfR2 siRNA的效果，進行以下之實驗。作為結合了GalNAc的TfR2 siRNA，而使用TfR2-019.88DUG(實施例9)、TfR2-019.92DUG(實施例14)、TfR2-019.93DUG(實施例15)、TfR2-019.94DUG(實施例16)之化合物。

GalNAc結合TfR2 siRNA處理組係以3 mg/kg(3mpk)或0.3 mg/kg(0.3mpk)之用量進行1次皮下投予(s.c.)(n=3/組)。作為媒劑組，係將PBS進行1次皮下投予(n=4/組)。

在開始藥劑處理7日後，在異氟烷麻醉下藉由放血處理將小鼠安樂死後，採檢肝臟，測定hTfR2之mRNA表現量。RNA之提取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。hTfR2之mRNA表現量係以為管家基因的mActb之mRNA表現量進行常規化。對hTfR2的引子係使用試驗例1及試驗例2記載者。hTfR2之mRNA表現量之結果係呈示於圖13。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，而算出並標記其他組中的相對mRNA量(平均值±標準誤差)。

此等之結果顯示：藉由GalNAc結合TfR2 siRNA之處理，而可抑制人類TfR2 mRNA之表現量。又，顯示以下之可能性：藉由抑制人類TfR2 mRNA之表現量而使HGB值上升，可對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病，或伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血等之貧血疾病提供治療效果。 [序列表非關鍵詞文字]

序列識別號1：hTfR2 mRNA之核苷酸序列序列識別號2：TfR2-039之有義股核苷酸序列序列識別號3～8：TfR2-039之反義股核苷酸序列序列識別號9：TfR2-019之有義股核苷酸序列序列識別號10、11：TfR2-019之反義股核苷酸序列序列識別號12：AD47882之有義股核苷酸序列序列識別號13、14：AD47882之反義股核苷酸序列序列識別號15、16：雙股寡核苷酸之有義股區域之核苷酸序列序列識別號17～21：雙股寡核苷酸之反義股區域之核苷酸序列

無

圖1為呈示雙股siRNA之修飾樣式的圖。圖中，黑色圓圈表示2’-O-甲基RNA，白色圓圈表示2’-去氧-2’-氟RNA，黑色三角形表示DNA，白色三角形表示3’-O-甲基RNA，白色菱形表示ENA，黑色菱形表示RNA，有縱條在內的白色圓圈表示LNA，有橫條在內的白色圓圈表示2’-O-甲氧基乙基RNA，連接符號與符號的線表示磷酸二酯鍵，連接符號與符號的線上記載「s」的情形表示硫代磷酸酯鍵。圖中，上部的鏈表示有義股(或隨從股(passengerstrand))，有義股的左側末端表示5’末端，右側末端表示3’末端。下部的鏈表示反義股(或導引股(guide strand))，反義股的右側末端表示5’末端，左側末端表示3’末端。各siRNA以NNN-xxx表示，NNN-xxx的後面記載的數字與字母表示圖1至6記載之修飾樣式的縮寫。圖2為呈示雙股siRNA中的反義股之A ₁₄為DNA或RNA的情形之修飾樣式的圖。各符號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。圖3為呈示雙股siRNA中的反義股之A ₈及A ₉為2’-去氧-2’-氟RNA的情形之修飾樣式的圖。各符號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。圖4為呈示雙股siRNA中的反義股之A ₁₄為ENA的情形之修飾樣式的圖。各符號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。圖5為呈示雙股siRNA中的反義股之A ₈及A ₉為2’-去氧-2’-氟RNA且反義股之A ₁₃為ENA的情形之修飾樣式的圖。各符號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。圖6為呈示雙股siRNA中的反義股之A ₈為2’-O-甲基RNA及A ₉為2’-去氧-2’-氟RNA的情形之修飾樣式的圖。各符號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。圖7為呈示正常小鼠中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的血漿中鐵濃度之推移的圖。圖8中圖8A為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理前(第0日)之血漿中鐵濃度的圖。圖8B為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理7日後(第7日)之血漿中鐵濃度的圖。圖8C為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理12日後(第12日)之血漿中鐵濃度的圖。圖8D為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理21日後(第21日)之血漿中鐵濃度的圖。圖8E為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理28日後(第28日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9中圖9A為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理前(第0日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9B為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理7日後(第7日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9C為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理14日後(第14日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9D為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理21日後(第21日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9E為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理28日後(第28日)之血漿中鐵濃度的圖。圖9F為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理28日後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。圖10中圖10A為呈示伴隨炎症之貧血模型中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的血漿中鐵濃度的圖。圖10B為呈示伴隨炎症之貧血模型中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的HGB值的圖。圖10C為呈示伴隨炎症之貧血模型中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的MCH值的圖。圖10D為呈示伴隨炎症之貧血模型中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的RBC數的圖。圖10E為呈示伴隨炎症之貧血模型中的因GalNAc結合TfR2 siRNA之處理所致的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。圖11為呈示HepG2細胞中的siRNA之hTfR2弱化活性(knockdown activity)的圖。圖12中圖12A為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理前(第0日)之血漿中鐵濃度的圖。圖12B為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理9日後(第9日)之血漿中鐵濃度的圖。圖12C為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理14日後(第14日)之血漿中鐵濃度的圖。圖12D為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理21日後(第21日)之血漿中鐵濃度的圖。圖12E為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理28日後(第28日)之血漿中鐵濃度的圖。圖12F為呈示正常小鼠中的GalNAc結合TfR2 siRNA之處理28日後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。圖13為呈示hTfR2 Tg小鼠中的將GalNAc結合TfR2 siRNA進行處理7日後的肝臟hTfR2 mRNA表現量的圖。圖14為呈示編碼人類運鐵蛋白受體2(hTfR2)的基因之mRNA的鹼基序列(序列識別號1)的圖。底線之序列(第2847〜2865號之序列)表示TfR2-019之標的序列，雙底線之序列(第1536〜1554號之序列)表示TfR2-039之標的序列。

TW202400786A_112109504_SEQL.xml

無。

Claims

一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，係包含有義股區域及反義股區域的寡核苷酸，其中該有義股區域由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，該反義股區域由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，且其進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：有義股區域：5’ S _O5-S _a-S ₁₉-S ₁₈-S ₁₇-S ₁₆-S ₁₅-S ₁₄-S ₁₃-S ₁₂-S ₁₁-S ₁₀-S ₉-S ₈-S ₇-S ₆-S ₅-S ₄-S ₃-S ₂-S ₁-S _O33’(I) 反義股區域：5’ A _O5-A ₁-A ₂-A ₃-A ₄-A ₅-A ₆-A ₇-A ₈-A ₉-A ₁₀-A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅-A ₁₆-A ₁₇-A ₁₈-A ₁₉-A _a-A _O33’(II) (a)S ₁為3’-修飾核苷，S ₂～S ₁₉表示1個核苷，且各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S _a表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S _O3及S _O5各自獨立表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (b)A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅表示1個核苷，其中至少1個為DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA，其餘為2’-OMe RNA或2’-F RNA，A ₁～A ₁₀及A ₁₆～A ₁₉表示1個核苷，且各自獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A _a表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A _O3及A _O5各自獨立表示0～5個核苷，且各自之核苷獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵； (c)A ₂～A _a之間的核苷酸序列由與標的序列實質上互補的核苷酸序列所構成，A ₁為具有與標的序列所對應的核苷互補之鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A _O3與A _O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立而與標的序列所對應的核苷為獨立地選擇的核苷酸序列； (d)S ₁～S _a之間的核苷酸序列、與A ₁～A _a之間的核苷酸序列，係彼此實質上互補的核苷酸序列，且形成雙股結構； (e)S _O5與A _O3之兩者存在的情形，S _O5與A _O3為彼此非互補的核苷酸序列； (f)S _O3與A _O5之兩者存在的情形，S _O3與A _O5為彼此非互補的核苷酸序列；以及 (g)有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位或是3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。
如請求項1之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，S ₁為3’-OMe RNA。
如請求項1或2之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域及反義股區域以各自獨立的寡核苷酸形成雙股寡核苷酸。
如請求項1至3中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷為LNA或ENA。
如請求項1至4中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁、A ₁₂、A ₁₃、A ₁₄及A ₁₅之2個以上可相同或各自相異，為DNA、RNA、2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-MOE RNA。
如請求項5之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₄為RNA或2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。
如請求項6之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₃為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷或2’-OMe RNA，A ₁₄為RNA。
如請求項7之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅為以下之任一者； A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(ENA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(LNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(2’-OMe RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、或 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(2’-F RNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(RNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)。
如請求項6之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₂為DNA，A ₁₄為2’-O,4’-C-交聯化修飾核苷。
如請求項9之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₁₁-A ₁₂-A ₁₃-A ₁₄-A ₁₅為以下之任一者； A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(ENA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、A ₁₁(2’-F RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)、或 A ₁₁(2’-OMe RNA)-A ₁₂(DNA)-A ₁₃(2’-OMe RNA)-A ₁₄(LNA)-A ₁₅(2’-OMe RNA)。
如請求項1至10中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₂、A ₆及A ₁₆為2’-F RNA。
如請求項11之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，進一步，選自由A ₈、A ₉及A ₁₀所組成之群組的1或2個核苷為2’-F RNA，A ₁、A ₃～A ₅、A ₇、A ₁₇～A ₁₉及A _a之核苷為2’-OMe RNA。
如請求項12之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)，A ₂、A ₆、A ₈、A ₁₀及A ₁₆為2’-F RNA，A ₁、A ₃～A ₅、A ₇、A ₉、A ₁₇～A ₁₉及A _a之核苷為2’-OMe RNA。
如請求項1至13中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)，S ₁₁、S ₁₂、S ₁₃及S ₁₅為2’-F RNA。
如請求項14之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)，S ₂～S ₁₀、S ₁₄、S ₁₆～S ₁₉及S _a為2’-OMe RNA。
如請求項1至15中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)採用RNA的情形，該RNA與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。
如請求項1至16中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於該寡核苷酸之從5’末端及3’末端起2～5個核苷酸中，各核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵。
如請求項1至17中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3、S _O5、A _O5及A _O3之核苷數為0～2。
如請求項18之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3之核苷數為0。
如請求項19之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S _O3、S _O5及A _O5之核苷數為0，A _O3之核苷數為2。
如請求項1至20中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中寡核苷酸之5’末端的核苷之5’位及/或3’末端之核苷的3’位或是3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位的化學修飾為向目的組織之輸送用單元。
如請求項21之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中向目的組織之輸送用單元為GalNAc單元或脂肪酸單元。
如請求項22之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中GalNAc單元為下式所表示的單元﹕ (式中，虛線表示與鄰接的核苷酸之5’末端的磷酸基及/或3’末端的磷酸基(在3’位被修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)磷酸二酯鍵結)。