TW202331735A

TW202331735A - 協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法

Info

Publication number: TW202331735A
Application number: TW111140925A
Authority: TW
Inventors: 費德瑞克福格特; 濱藍; 珍妮佛陳; 雷蒙娜雷帕基瓊斯
Original assignee: 美商艾歐凡斯生物治療公司
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2023-08-01
Also published as: US20230187042A1; AR127482A1; US20240412835A1; JP2024541911A; WO2023077015A2; WO2023077015A3; CA3235824A1; EP4423755A2

Abstract

一種協調用於患者之經擴增之細胞療法產品之製造的方法可包括接收擴增用於該患者之該細胞療法產品之細胞訂單請求；生成與該細胞訂單請求相關的患者特異性標識符或細胞訂單標識符；以及自獲自該患者之實體腫瘤之至少一些起始擴增該細胞療法產品之過程。若該擴增細胞療法產品之接受參數在擴增過程中之第一時間點之後的第二時間點不滿足某些接受標準，則基於該第二時間點之接受參數來確定是否有可能自該第一時間點使用細胞擴增技術再執行該細胞療法產品之擴增。若此類再執行該擴增係可能的，則對使用該經擴增之細胞療法產品之患者治療事件再排程。

Description

協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法

本發明係關於協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法。

使用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性轉移來治療大型、難治性癌症對於預後不良患者代表一種強大之治療方案。Gattinoni 等人, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6,383-393。成功免疫療法需要大量之TIL，而商業化需要強健且可靠之過程。由於細胞擴增之技術、物流及監管問題，這對於實現係一項挑戰。基於IL-2之TIL擴增及隨後之「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增之較佳方法。Dudley 等人, Science 2002, 298,850-54；Dudley 等人, J. Clin.Oncol. 2005, 23,2346-57；Dudley 等人, J. Clin.Oncol. 2008, 26,5233-39；Riddell 等人, Science 1992, 257,238-41；Dudley 等人, J. Immunother. 2003, 26,332-42。REP可在14天期間導致1,000倍之TIL擴增，不過其需要大量過量(例如，200倍)的經照射之通常來自多個供體之同種異體周邊血單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，以及抗CD3抗體(OKT3)及高劑量之IL-2。Dudley 等人, J. Immunother. 2003, 26,332-42。經歷REP程序之TIL已在宿主免疫抑制後之黑色素瘤患者中產生成功之過繼性細胞療法。

及

相關申請案之交叉引用

本申請案係2021年4月22日申請之美國專利申請案第17/238,092號的部分接續案，該美國專利申請案主張2020年4月22日申請之美國臨時申請案第63/013,942號、2021年3月2日申請之美國臨時申請案第63/155,711號及2021年3月11日申請之美國臨時申請案第63/159,806號的優先權，各案出於所有目之以全文引用之方式併入本文中。 I. 前言 A. 過繼性細胞轉移

利用藉由快速擴增方案(REP)離體培養之TIL之過繼性細胞療法已在宿主免疫抑制後在癌症(諸如黑色素瘤)患者中產生成功之過繼性細胞療法。目前之輸注接受參數依賴於TIL之組成之讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產品之數值擴增倍數及活力。雖然TIL可離體再活化及擴增，但一旦投與經擴增TIL，其在抑制性腫瘤微環境中之表觀遺傳編程可能使TIL保持高分化且低功能狀態。

本發明係關於在TIL之離體擴增期間在細胞培養基中使用表觀遺傳再編程劑以對抗抑制性腫瘤微環境之效應且改良經擴增TIL針對持久性、功能性及抗腫瘤潛力之品質。 II.定義

除非另行定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有本發明所屬領域之技術人員通常所瞭解之相同含義。本文所提及之所有專利及出版物均以引用之方式整體併入。

如本文所用，術語「共投與(co-administration/ co-administering)」、「與......組合投與(administered in combination with/administering in combination with)」、「同時」及「並用」涵蓋投與兩種或兩種以上活性醫藥成分(在本發明之一較佳實施例中，例如複數種TIL)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或其代謝物同時存在於個體中。共投與包括同時投與分開組合物、在不同時間投與分開組合物或投與其中存在兩種或兩種以上活性醫藥成分之組合物。同時投與分開組合物及投與其中存在兩種劑之組合物係較佳的。

術語「活體內( in vivo)」係指發生在個體體內之事件。

術語「活體外( in vitro)」係指發生在個體體外之事件。活體外分析涵蓋基於細胞之分析，其中採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋其中不採用完整細胞之不含細胞之分析。

術語「離體( ex vivo)」係指涉及對自個體之身體去除之細胞、組織及/或器官進行處理或執行程序之事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療之方法返回個體之身體。

術語「快速擴增(rapid expansion)」意謂抗原特異性TIL之數目在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，更佳地在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或最佳地在一週期間增加至少約100倍。多種快速擴增方案描述於本文中。

本文中之「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」意謂最初作為白血球獲得但離開個體之血流且遷移至腫瘤中之細胞群體。TIL包括但不限於CD8 ⁺細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4 ⁺T細胞、天然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括原代及次級TIL。「原代TIL」係如本文所概述獲自患者組織樣品之彼等細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「次級TIL」係如本文所論述經擴增或增生之任何TIL細胞群體，包括但不限於主體TIL (bulk TIL)及經擴增TIL (「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞群體可包括經基因修飾之TIL。

本文中之「細胞群體(population of cells)」(包括TIL)意謂一些共享共同特質之細胞。一般而言，群體之數目通常介於1×10 ⁶至1×10 ¹⁰範圍內，其中不同TIL群體包含不同數目。例如，原代TIL在IL-2存在下之初始生長導致大約1×10 ⁸個細胞之主體TIL群體。通常進行REP擴增以提供1.5×10 ⁹至1.5×10 ¹⁰個用於輸注之細胞之群體。

本文中之「冷凍保存之TIL」意謂在約-150℃至-60℃範圍內處理且儲存之原代、主體或經擴增(REP TIL) TIL。冷凍保存之一般方法亦描述於本文別處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存之TIL」與可用作原代TIL來源之冷凍組織樣品區別開。

本文中之「解凍之冷凍保存之TIL (thawed cryopreserved TIL)」意謂先前經冷凍保存且接著經處理以返回室溫或更高溫度之TIL群體，包括但不限於細胞培養溫度或其中可將TIL投與至患者之溫度。

TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌物)或功能性(藉由其浸潤腫瘤且實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多種以下生物標誌物來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由其在重新引入患者體內後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。

術語「冷凍保存培養基(cryopreservation media/cryopreservation medium)」係指任何可用於冷凍保存細胞之培養基。此類培養基可包括包含7%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及其組合。術語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions之冷凍保存培養基。CS10培養基可以其商標名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10培養基係無血清、無動物組分之培養基，其包含DMSO。

術語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人類中為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7 ^hi)及CD62L (CD62 ^hi)。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR觸發之後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞主要位於血液中之CD4隔室中，且在人類之淋巴結及扁桃腺中按比例富集。

術語「效應記憶T細胞(effector memory T cell)」係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如同中央記憶T細胞為CD45R0+，但已失去CCR7之組成性表現(CCR7 ^lo)且CD62L表現為異質或低的(CD62L ^lo)。中央記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高水準之發炎細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞主要位於血液中之CD8隔室中，且在人類之肺、肝臟及腸中按比例富集。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量之穿孔素。

術語「密閉系統」係指與外界環境隔離之系統。任何適用於細胞培養方法之密閉系統皆可用於本發明方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直至準備將TIL投與至患者為止。

如本文所用，術語「片段化(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「片段化之(fragmented)」描述將腫瘤破壞之過程，包括機械片段化方法，諸如破碎、切片、分割及粉碎腫瘤組織，以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。

術語「周邊血單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之周邊血細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈遞細胞(PBMC為一種類型之抗原呈遞細胞)時，周邊血單核細胞較佳為經照射之同種異體周邊血單核細胞。

術語「周邊血淋巴細胞」及「PBL」係指自周邊血擴增之T細胞。在一些實施例中，PBL係自供體之全血或單采產物分離。在一些實施例中，PBL藉由T細胞表型(諸如CD3+CD45+之T細胞表型)之正向或負向選擇自供體之全血或單采產物分離。

術語「抗CD3抗體」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之抗體或其變異體，例如單株抗體，且包括人類、人類化、嵌合或鼠科動物抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1純系，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。

術語「OKT-3」(本文中亦稱為「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之單株抗體或其生物類似物或變異體，包括人類、人類化、嵌合或鼠科動物抗體，且包括市售形式，諸如OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變異體、保守胺基酸取代、糖形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3之融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且經指派ATCC寄存編號CRL 8001。能夠產生OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且經指派目錄號86022706。表1. 莫羅單抗之胺基酸序列(例示性OKT-3抗體)。

術語「IL-2」(本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-2，包括其人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖形式、生物類似物及變異體。IL-2描述於例如Nelson, J. Immunol. 2004, 172,3983-88及Malek, Annu.Rev. Immunol. 2008, 26,453-79中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，術語IL-2涵蓋IL-2之人類重組形式，諸如阿地白介素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每個單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (目錄號CYT-209-b)供應之重組IL-2形式及來自其他供應商之其他市售等效物。阿地白介素(去丙胺醯基-1、絲胺酸-125人類IL-2)為IL-2之非糖基化人類重組形式，其分子量為大約15 kDa。適用於本發明之阿地白介素之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。術語IL-2亦涵蓋如本文所述之IL-2之聚乙二醇化形式，包括聚乙二醇化IL2前藥貝加德盧金(bempegaldesleukin) (NKTR-214，如SEQ ID NO:4所示之聚乙二醇化人類重組IL-2，其中平均6個離胺酸殘基係經[(2,7-雙{[甲基聚(氧基伸乙基)]胺甲醯基}-9H-茀-9-基)甲氧基]羰基取代之N ⁶)，其可獲自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA或可藉由此項技術中已知之方法製備，諸如國際專利申請公開案第WO 2018/132496 A1號之實例19中所述的方法或美國專利申請公開案第US 2019/0275133 A1號之實例1中所述的方法，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之貝加德盧金(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL-2分子描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之結合IL-2之替代形式描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4,902,502號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為THOR-707，可獲自Synthorx, Inc。THOR-707之製備及性質以及適用於本發明之IL-2的額外替代形式描述於美國專利申請公開案第US 2020/0181220 A1號及第US 2020/0330601 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為介白素2 (IL-2)結合物，其包含：經分離及純化之IL-2多肽；及結合至經分離及純化之IL-2多肽的選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸位置之結合部分，其中胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO:5。在一些實施例中，胺基酸位置係選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置係選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置係選自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置係選自R38及K64。在一些實施例中，胺基酸位置係選自E61、E62及E68。在一些實施例中，胺基酸位置為E62。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成離胺酸、半胱胺酸或組胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成離胺酸。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)、N6-炔丙乙氧基-L-離胺酸(PraK)、BCN-L-離胺酸、降冰片烯離胺酸、TCO-離胺酸、甲基四嗪離胺酸、烯丙氧基羰基離胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、2-胺基-8-側氧基辛酸、對乙醯基-L-苯丙胺酸、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)、對碘-L-苯丙胺酸、m-乙醯苯丙胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、對炔丙基氧基苯丙胺酸、對炔丙基-苯丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、O-烯丙基酪胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、膦醯基酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、2-胺基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-側氧基丙基)胺基)乙基)硒烷基)丙酸、2-胺基-3-(苯硒烷基)丙酸或硒代半胱胺酸。在一些實施例中，IL-2結合物相對於野生型IL-2多肽具有降低之對IL-2受體α (IL-2Rα)次單元之親和力。在一些實施例中，降低之親和力係對IL-2Rα之結合親和力相對於野生型IL-2多肽降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大於99%。在一些實施例中，降低之親和力係相對於野生型IL-2多肽約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或超過1000倍。在一些實施例中，結合部分損害或阻斷IL-2與IL-2Rα之結合。在一些實施例中，結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，額外結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物中之每一者獨立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇) (PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧基乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣類)、聚(α-羥酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)或其組合。在一些實施例中，水溶性聚合物中之每一者獨立地包含PEG。在一些實施例中，PEG為線性PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，水溶性聚合物中之每一者獨立地包含多醣。在一些實施例中，多醣包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基-澱粉(HES)。在一些實施例中，水溶性聚合物中之每一者獨立地包含聚醣。在一些實施例中，水溶性聚合物中之每一者獨立地包含聚胺。在一些實施例中，結合部分包含蛋白質。在一些實施例中，額外結合部分包含蛋白質。在一些實施例中，各蛋白質獨立地包含白蛋白、轉鐵蛋白或轉甲狀腺素蛋白。在一些實施例中，各蛋白質獨立地包含Fc部分。在一些實施例中，各蛋白質獨立地包含IgG之Fc部分。在一些實施例中，結合部分包含多肽。在一些實施例中，額外結合部分包含多肽。在一些實施例中，各多肽獨立地包含XTEN肽、富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、類彈性蛋白多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白(GLK)聚合物。在一些實施例中，經分離及純化之IL-2多肽藉由麩胺醯化(glutamylation)加以修飾。在一些實施例中，結合部分直接結合至經分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，結合部分經由連接體間接結合至經分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，連接體包含同型雙官能連接體。在一些實施例中，同型雙官能連接體包含Lomant試劑二硫雙(琥珀醯亞胺丙酸酯) (DSP)、3’3’-二硫雙(磺基琥珀醯亞胺丙酸酯) (DTSSP)、二琥珀醯亞胺辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺)辛二酸酯(BS)、二琥珀醯亞胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀醯亞胺酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺琥珀酸酯) (EGS)、二琥珀醯亞胺戊二酸酯(DSG)、N,N’-二琥珀醯亞胺碳酸酯(DSC)、己二亞胺酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3’-二硫雙丙醯亞胺酯(DTBP)、1,4-二-(3’-(2’-吡啶基二硫)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4’-二氟-3,3’-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基水楊醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二環氧甘油醚、己二酸二醯肼、卡肼、鄰甲苯胺、3,3’-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α’-對二胺基二苯基、二碘-對二甲苯磺酸、N,N’-乙烯-雙(碘乙醯胺)或N,N’-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，連接體包含雜雙官能連接體。在一些實施例中，雜雙官能連接體包含N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(sPDP)、長鏈N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀醯亞胺(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、琥珀醯亞胺基6-((碘乙醯基)胺基)己酸酯(sIAX)、琥珀醯亞胺基6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸酯(slAXX)、琥珀醯亞胺基4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀醯亞胺基6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸酯(sIACX)、對硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)、羰基反應性及巰基反應性交聯劑諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基水楊酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基水楊酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺-(4-疊氮基水楊醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺-2-(對疊氮基水楊醯胺基)乙基-1,3’-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯基琥珀醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3’-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮基苯基)1,3’-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀醯亞胺(4-疊氮基苯基)-1,3’-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀醯亞胺4-(對疊氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀醯亞胺2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3’-二硫丙酸酯(sAED)、磺基琥珀醯亞胺7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、對硝基苯基疊氮基丙酮酸酯(pNPDP)、對硝基苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(對疊氮基水楊醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基水楊醯胺基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫)丙醯胺(APDP)、二苯基酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基水楊醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮基苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，連接體包含可裂解連接體，視情況包含雙肽連接體。在一些實施例中，雙肽連接體包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，連接體包含不可裂解連接體。在一些實施例中，連接體包含順丁烯二醯亞胺基，視情況包含順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀醯亞胺-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些實施例中，連接體進一步包含間隔子。在一些實施例中，間隔子包含對胺基苄醇(PAB)、對胺基苄氧羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，額外結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係本文所述之IL-2形式中的任一者之片段。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式如美國專利申請公開案第US 2020/0181220 A1號及美國專利申請公開案第US 2020/0330601 A1號所揭示經聚乙二醇化。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)之IL-2多肽，共價附接至包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；且參考SEQ ID NO:5內之胺基酸位置，AzK取代位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處之胺基酸。在一些實施例中，IL-2多肽相對於SEQ ID NO:5包含N端缺失一個殘基。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式缺乏IL-2R α鏈銜接，但保留與中間親和力IL-2R β-γ信號傳導複合物之正常結合。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)之IL-2多肽，共價附接至包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；且參考SEQ ID NO:5內之胺基酸位置，AzK取代位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處之胺基酸。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)之IL-2多肽，共價附接至包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；且參考SEQ ID NO:5內之胺基酸位置，AzK取代位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處之胺基酸。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包含：包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)之IL-2多肽，共價附接至包含聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少98%序列一致性之胺基酸序列；且參考SEQ ID NO:5內之胺基酸位置，AzK取代位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處之胺基酸。

在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為內姆瓦盧金阿法(亦稱為ALKS-4230 (SEQ ID NO:6))，其可獲自Alkermes, Inc。內姆瓦盧金阿法亦稱為人類介白素2片段(1-59)變異體(Cys ¹²⁵＞Ser ⁵¹)，經由肽基連接體( ⁶⁰GG ⁶¹)融合至人類介白素2片段(62-132)，經由肽基連接體( ¹³³GSGGGS ¹³⁸)融合至人類介白素2受體α鏈片段(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，糖基化；人類介白素2 (IL-2) (75-133)-肽[Cys ¹²⁵(51)＞Ser]-突變體(1-59)，經由G ₂肽連接體(60-61)融合至人類介白素2 (IL-2) (4-74)-肽(62-132)且經由GSG ₃S肽連接體(133-138)融合至人類介白素2受體α鏈(IL2R次單元α，IL2Rα，IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，糖形式α。內姆瓦盧金阿法之胺基酸序列在SEQ ID NO: 6給出。在一些實施例中，內姆瓦盧金阿法展現以下轉譯後修飾：以下位置之二硫橋：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO:6之編號)，及以下位置之糖基化位點：N187、N206、T212 (使用SEQ ID NO:6之編號)。內姆瓦盧金阿法之製備及性質以及適用於本發明之IL-2之額外替代形式描述於美國專利申請公開案第US 2021/0038684 A1號及美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係與SEQ ID NO:6具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之蛋白質。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式具有SEQ ID NO:6給出之胺基酸序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係融合蛋白，其包含SEQ ID NO:7之胺基酸24-452或其變異體、片段或衍生物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係融合蛋白，其包含與SEQ ID NO:7之胺基酸24-452具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之胺基酸序列或其變異體、片段或衍生物。其他適用於本發明之IL-2形式描述於美國專利第10,183,979中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。視情況，在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係融合蛋白，其包含藉由黏液素域多肽連接體連接至第二融合搭配物之第一融合搭配物，其中第一融合搭配物係IL-1Rα或與IL-1Rα具有至少98%胺基酸序列一致性之蛋白質且具有IL-Rα之受體拮抗劑活性，且其中第二融合搭配物包含所有或一部分之包含Fc區之免疫球蛋白，其中黏液素域多肽連接體包含SEQ ID NO:8或與SEQ ID NO:8具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，且其中融合蛋白之半衰期相較於第一融合搭配物與第二融合搭配物在黏液素域多肽連接體不存在下之融合有所改良。表2. 介白素之胺基酸序列。

在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式包括抗體細胞介素植入蛋白，其包含重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)及植入VH或VL之CDR中的IL-2分子或其片段，該重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中該抗體細胞介素植入蛋白優先擴增T效應細胞而非調節T細胞。在一些實施例中，該抗體細胞介素植入蛋白包含重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)及植入VH或VL之CDR中的IL-2分子或其片段，該重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中IL-2分子為突變蛋白，且其中該抗體細胞介素植入蛋白優先擴增T效應細胞而非調節T細胞。在一些實施例中，IL-2方案包含投與美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中所述之抗體，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該抗體細胞介素植入蛋白包含重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)及植入VH或VL之CDR中的IL-2分子或其片段，該重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中IL-2分子為突變蛋白，其中該抗體細胞介素植入蛋白優先擴增T效應細胞而非調節T細胞，且其中該抗體進一步包含選自由以下組成之群的IgG類別重鏈及IgG類別輕鏈：包含SEQ ID NO:39之IgG類別輕鏈及包含SEQ ID NO:38之IgG 類型重鏈；包含SEQ ID NO:37之IgG類別輕鏈及包含SEQ ID NO:29之IgG類別重鏈；包含SEQ ID NO:39之IgG類別輕鏈及包含SEQ ID NO:29之IgG類別重鏈；及包含SEQ ID NO:37之IgG類別輕鏈及包含SEQ ID NO:38之IgG類別重鏈。

在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VH之HCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VH之HCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VH之HCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VL之LCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VL之LCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段係植入VL之LCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。

IL-2分子之插入可在CDR之N端區或在CDR之N端區附近、在CDR之中間區或在CDR之C端區或在CDR之C端區附近。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含併入CDR中之IL-2分子，其中IL2序列不使CDR序列移碼。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含併入CDR中之IL-2分子，其中IL-2序列置換全部或部分之CDR序列。IL-2分子進行之置換可為CDR之N端區、在CDR之中間區或在CDR之C端區或在CDR之C端區附近。IL-2分子進行之置換可為少至CDR序列之一或兩個胺基酸或整個CDR序列。

在一些實施例中，IL-2分子係在無肽連接體下直接植入CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間無額外胺基酸。在一些實施例中，IL-2分子係藉由肽連接體間接植入CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間有一或多個額外胺基酸。

在一些實施例中，本文所述之IL-2分子為IL-2突變蛋白。在一些情況下，IL-2突變蛋白包含R67A取代。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包含美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號之表1中的胺基酸序列，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含選自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:25組成之群之HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含選自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:16組成之群之HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含選自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:26組成之群之HCDR2。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含選自由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:27組成之群之HCDR3。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之VL區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH區，及包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的VL區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的重鏈區，及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的輕鏈區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的重鏈區，及包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列的輕鏈區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列的重鏈區，及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的輕鏈區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含有包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列的重鏈區，及包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列的輕鏈區。在一些實施例中，抗體細胞介素植入蛋白包含美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1，或其變異體、衍生物或片段，或其保守胺基酸取代，或與其具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之蛋白質。在一些實施例中，本文所述之抗體細胞介素植入蛋白的抗體組分包含帕利珠單抗之免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些實施例中，本文所述之抗體細胞介素植入蛋白具有與野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地白介素或可相當分子)相比較長之血清半衰期。在一些實施例中，本文所述之抗體細胞介素植入蛋白具有如表3所示之序列。表3：例示性帕利珠單抗抗體-IL-2植入蛋白之序列

術語「IL-4」(本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4之細胞介素，其係由Th2 T細胞以及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish, Respir. Res. 2001, 2,66-70。在IL-4之活化下，Th2 T細胞隨後以正反饋迴路產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及II類MHC表現，且誘導B細胞類型轉換成表現IgE及IgG ₁。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (目錄號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:9)。

術語「IL-7」(本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7之糖基化組織源性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall, Blood 2002, 99,3892-904。IL-7可刺激T細胞之發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成之異二聚體)結合，其產生對於T細胞在胸腺內之發育及在週邊內之存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (目錄號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:10)。

術語「IL-15」(本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包括IL-2之所有形式，包括其人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖形式、生物類似物及變異體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri, Blood 2001, 97,14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共享β及γ信號傳導受體次單元。重組人類IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)之單一、非糖基化多肽鏈，其分子質量為12.8 kDa。重組人類IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (目錄號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:11)。

術語「IL-21」(本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白質，且包括IL-21之所有形式，包括其人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖形式、生物類似物及變異體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13,379-95中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及經活化之人類CD4 ⁺T細胞產生。重組人類IL-21係含有132個胺基酸之單一、非糖基化多肽鏈，其分子質量為15.4 kDa。重組人類IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (目錄號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21之胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:21)。

當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投與之本發明組合物的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及疾患之個體差異來確定。一般可指出，本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(例如次級TIL或經基因修飾之細胞毒性淋巴細胞)之醫藥組合物可以10 ⁴至10 ¹¹個細胞/kg體重(例如10 ⁵至10 ⁶、10 ⁵至10 ¹⁰、10 ⁵至10 ¹¹、10 ⁶至10 ¹⁰、10 ⁶至10 ¹¹、10 ⁷至10 ¹¹、10 ⁷至10 ¹⁰、10 ⁸至10 ¹¹、10 ⁸至10 ¹⁰、10 ⁹至10 ¹¹或10 ⁹至10 ¹⁰個細胞/kg體重)之劑量投與，包括在彼等範圍內之所有整數值。TIL (在一些情況下包括經基因修飾之細胞毒性淋巴細胞)組合物亦可以此等劑量投與多次。TIL (在一些情況下包括經基因工程改造之TIL)可使用在免疫療法中通常已知之輸注技術來投與( 參見例如Rosenberg 等人, New Eng. J. of Med. 1988, 319, 1676)。針對特定患者之最佳劑量及治療方案可輕易地由醫學領域之熟練技術人員藉由監測患者之疾病病徵且據此調整治療加以確定。

術語「血液惡性病(hematological malignancy/ hematologic malignancy)」或有相關含義之術語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織)之癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤、急性單核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。術語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞之血液惡性病。

術語「液體腫瘤」係指本質上為流體之細胞異常塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性腫瘤。自液體腫瘤獲得之TIL在本文中亦可稱作骨髓浸潤淋巴細胞(MIL)。獲自液體腫瘤(包括在周邊血中循環之液體腫瘤)之TIL在本文中亦可稱為PBL。術語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且僅基於產生細胞之組織類型而不同。

如本文所用，術語「微環境」可指整個實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所用，腫瘤微環境係指「促進腫瘤轉化、支持腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤不受宿主免疫性影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長之生態位的細胞、可溶因子、信號傳導分子、細胞外基質及機械提示」之複雜混合物，如Swartz 等人 , Cancer Res., 2012, 72,2473中所述。雖然腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但免疫系統因為微環境之免疫抑制作用而很少進行腫瘤清除。

在一些實施例中，本發明包括一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除性化學療法預處理。在一些實施例中，可提供TIL群體，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除性化學療法預處理。在一些實施例中，非骨髓清除性化學療法係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一些實施例中，在根據本發明之非骨髓清除性化學療法及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接收720,000 IU/kg靜脈內IL-2之靜脈內輸注至生理耐受。

實驗發現指示，在腫瘤特異性T淋巴細胞之過繼性轉移之前的淋巴細胞耗盡藉由消除調節T細胞及免疫系統之競爭元件(「細胞介素匯」)發揮增強治療功效之關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。

術語「有效量」或「治療有效量」係指足以實現預期應用(包括但不限於疾病治療)之如本文所述之化合物或化合物組合的彼量。治療有效量可依預期應用(活體外或活體內)或正在治療之個體及疾病病況(例如個體之體重、年齡及性別)、疾病病況之嚴重性或投與方式而異。該術語亦適用於將誘導標靶細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著及/或細胞遷移)之劑量。特定劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、該化合物是否與其他化合物組合投與、投與時間選擇、其欲投與之組織及攜帶該化合物之物理遞送系統而異。

術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性的(就完全或部分預防疾病或其症狀而言)，及/或可為治療性的(就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之副作用而言)。如本文所用，「治療」涵蓋對哺乳動物(尤其人類)之疾病的任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體中發生，該個體可易發生該疾病，但尚未診斷出患有該疾病；(b)抑制疾病，亦即停止其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或疾患不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或賦予免疫性之組合物，例如以疫苗為例。

當術語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質之部分時，指示該核酸或蛋白質包含兩個或兩個以上實際上彼此不具有相同關係之子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生的，具有兩個或兩個以上來自不相關基因且經佈置以製造新的功能性核酸之序列，例如來自一種來源之啟動子及來自另一來源之編碼區，或來自不同來源之編碼區。同樣，異源性蛋白質指示該蛋白質包含兩個或兩個以上實際上彼此不具有相同關係之子序列(例如融合蛋白)。

在兩種或兩種以上核酸或多肽之上下文中，術語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義術語，例如「99%一致」)係指當兩個或兩個以上序列或子序列經比較及比對(必要時引入間隙)以達最高對應性且不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之部分時，該兩個或兩個以上序列或子序列係相同的或具有特定百分率之相同核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或算法，或藉由目視檢查來量測。各種算法及軟體係此項技術中已知的，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對。確定序列一致性百分比之合適程式包括例如可獲自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站之BLAST程式套件。兩個序列之間之比較可使用BLASTN或BLASTP算法進行。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign (可獲自DNASTAR)係可用於比對序列之其他公開可得之軟體程式。熟習此項技術者可確定用於藉由特定比對軟體進行最大比對之適當參數。在某些實施例中，使用比對軟體之預設參數。

如本文所用，術語「變異體」涵蓋但不限於包含與參考抗體之胺基酸序列不同的胺基酸序列之抗體或融合蛋白，不同之處在於在該參考抗體之胺基酸序列內或相鄰之某些位置有一或多個取代、缺失及/或添加。相較於參考抗體之胺基酸序列，變異體之胺基酸序列中可包含一或多個保守取代。保守取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸之取代。變異體保留與參考抗體之抗原特異性結合之能力。術語變異體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。

本文中之「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」意謂最初作為白血球獲得但離開個體之血流且遷移至腫瘤中之細胞群體。TIL包括但不限於CD8 ⁺細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4 ⁺T細胞、天然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括原代及次級TIL。「原代TIL」係如本文所概述獲自患者組織樣品之彼等細胞(有時稱為「新鮮收集」)，而「次級TIL」係如本文所論述經擴增或增生之任何TIL細胞群體，包括但不限於本文所論述之主體TIL、經擴增TIL (「REP TIL」)以及「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二次擴增TIL或第二次額外擴增TIL (例如圖8步驟D中所述之彼等，包括稱為reREP TIL之TIL)。

TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌物)或功能性(藉由其浸潤腫瘤且實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多種以下生物標誌物來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由其重新引入患者體內後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。TIL可進一步藉由效力表徵-例如，若例如干擾素(IFN)釋出大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可被視為有效。例如，若干擾素(IFNγ)釋出大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL、大於約300 pg/mL、大於約400 pg/mL、大於約500 pg/mL、大於約600 pg/mL、大於約700 pg/mL、大於約800 pg/mL、大於約900 pg/mL、大於約1000 pg/mL，則TIL可被視為有效。

術語「去氧核糖核苷酸」涵蓋天然及合成、未經修飾及經修飾去氧核糖核苷酸。修飾包括糖部分、鹼基部分及/或在寡核苷酸之去氧核糖核苷酸之間的鍵聯之變化。

術語「RNA」定義包含至少一個核糖核苷酸殘基之分子。術語「核糖核苷酸」定義在b-D-呋喃核糖部分之2’位置處具有羥基之核苷酸。術語RNA包括雙股RNA、單股RNA、經分離RNA (諸如部分純化RNA、基本上純RNA)、合成RNA、重組產生之RNA以及改變之RNA，該改變之RNA與天然存在之RNA的不同之處在於一或多個核苷酸之添加、缺失、取代及/或改變。本文所述之RNA分子的核苷酸亦可包含非標準核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。此等改變之RNA可稱作天然存在之RNA的類似物或類似物。

術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包括任何及所有溶劑、分散培養基、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途係此項技術中熟知的。除非任何習知的醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則考慮其在本發明之治療組合物中之用途。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組合物及方法中。

術語「約」或「大約」意指在一個值之具統計意義之範圍內。此類範圍可在既定值或範圍之一個數量級內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，更佳在10%以內，且甚至更佳在5%以內。術語「約」或「大約」所涵蓋之允許偏差取決於特定研究系統，且可由一般技術者容易地瞭解。此外，如本文所用，術語「約」及「大約」意謂尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他量及特徵並不精確而且無需精確，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，從而反映出公差、轉換因子、四捨五入、量測誤差及其類似因素以及熟習此項技術者已知之其他因素。一般而言，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明確說明。已注意到極其不同大小、形狀及尺寸之實施例可採用所述佈置。

當用於呈原始及修改形式之隨附申請專利範圍中時，轉折語「包含」、「基本上由......組成(consisting essentially of)」及「由......組成(consisting of)」定義了申請專利範圍範圍，即哪些未引述之額外申請專利範圍要素或步驟(若有的話)被排除於申請專利範圍之範圍以外。術語「包含」意欲為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。術語「由......組成」排除除申請專利範圍中指明之彼等以外的任何元件、步驟或材料，且在後一情況中排除與所指明之材料尋常相關的雜質。術語「基本上由......組成」將申請專利範圍之範圍限制於所指明之元件、步驟或材料以及本質上未影響要求保護之發明的基本及新穎特徵之彼等。本文所述之體現本發明之所有組合物、方法及套組均可在替代實施例中由任何轉折語「包含」、「基本上由......組成」及「由......組成」更特定地加以定義。

術語「抗體(antibody)」及其複數形式「抗體(antibodies)」係指完整免疫球蛋白及其任何抗原結合片段(「抗原結合部分」)或單鏈。「抗體」進一步係指包含藉由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為V _H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為V _L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域C _L。抗體之V _H及V _L區可進一步再分成高變區，其稱作互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，且其可散佈有更加保守之區域(稱作構架區(FR))。各V _H及V _L由自胺基端至羧基端依以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與一或多個抗原之抗原決定基相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之多種細胞(例如，效應子細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。

術語「抗原」係指誘導免疫反應之物質。在一些實施例中，抗原係能夠結合抗體或TCR (若由主要組織相容性複合物(MHC)分子提供)之分子。如本文所用，術語「抗原」亦涵蓋T細胞抗原決定基。抗原另外能夠由免疫系統識別。在一些實施例中，抗原能夠誘導體液免疫反應、或細胞免疫反應，從而導致B淋巴細胞及/或T淋巴細胞之活化。在一些情況下，這可需要抗原含有或連接至Th細胞抗原決定基。抗原亦可具有一或多個抗原決定基(例如，B-抗原決定基及T-抗原決定基)。在一些實施例中，抗原將較佳地通常以高度特異性且選擇性方式與其相應抗原或TCR反應且不與可由其他抗原誘導之多種其他抗體或TCR反應。

術語「單株抗體」、「mAb」、「單株抗體組合物」或其複數形式係指單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組合物對特定抗原決定基呈現單一結合特異性及親和力。可使用此項技術中之知識及技能來製備對某些受體具特異性之單株抗體，即用合適抗原注射測試個體且接著分離表現具有所需序列或功能特徵之抗體的融合瘤。編碼該等單株抗體之DNA容易加以分離且使用習知程序(例如，藉由使用能够特异性地結合於編碼該等單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)進行測序。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。一旦分離，即可將DNA置於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不會以其他方式產生免疫球蛋白蛋白質之融合瘤細胞中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體。抗體之重組產生將更詳細地描述於下文中。

如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「片段」)係指抗體中保留與抗原特異性結合之能力的一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内之結合片段的實例包括(i) Fab片段，其係由V _L、V _H、C _L及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab’)2片段，其係包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由V _H及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單一臂之V _L及V _H域組成的Fv片段，(v) 域抗體(dAb)片段(Ward 等人 , Nature, 1989, 341,544-546)，其可由V _H或V _L域組成；及(vi)經分離之互補决定區(CDR)。此外，雖然Fv片段之兩個域V _L及V _H係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子使得其能够被製成單個蛋白鏈，其中V _L與V _H區配對以形成稱為單鏈Fv (scFv)之單價分子；參見例如Bird 等人, Science 1988, 242,423-426；及Huston 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85,5879-5883)。此類scFv抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得此等抗體片段，且以與完整抗體相同之方式篩選該等片段之效用。在一些實施例中，scFv蛋白域包含V _H部分及V _L部分。若V _L域為scFv分子之N端部分，則scFv分子係表示為V _L-L-V _H，或若V _H域為scFv分子之N端部分，則scFv分子係表示為V _H-L-V _L。用於製備scFv分子且設計合適肽連接體之方法描述於美國專利第4,704,692號，美國專利第4,946,778號，R. Raag及M. Whitlow, “Single Chain Fvs.” FASEB 第9卷:73-80 (1995)，以及R. E. Bird及B. W. Walker, Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH, 第9卷: 132-137 (1991)中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有其中框架及CDR區係源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區之抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由 活體外隨機或位點特异性突變誘發或藉由 活體內體細胞突變引入之突變)。如本文所用，術語「人類抗體」不欲包括其中源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已植入人類構架序列上的抗體。

術語「人類單株抗體」係指呈現單一結合特異性之抗體，該等抗體具有其中框架及CDR區係源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。在一些實施例中，人類單株抗體由包括獲自轉殖基因非人類動物(例如，轉殖基因小鼠)之B細胞的融合瘤產生，該轉殖基因非人類動物具有包含人類重鏈轉殖基因及融合至永生化細胞之輕鏈轉殖基因之基因體。

如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如(a)自人類免疫球蛋白基因或由其製備的融合瘤(下文進一步描述)之轉殖基因或轉染色體動物(諸如小鼠)分離之抗體，(b)自經轉化以表現該人類抗體之宿主細胞(例如，自轉染瘤)分離之抗體，(c)自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體，及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有其中框架及CDR區係源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經受 活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時， 活體內體細胞突變誘發)且因此，該等重組抗體之V _H及V _L區的胺基酸序列係雖然源自人類生殖系V _H及V _L序列且與該等序列有關，但無法天然地存在於 活體內人類抗體生殖系譜系內之序列。

如本文所用，「同型」係指由重鏈恒定區基因編碼之抗體類別(例如，IgM或IgG1)。

片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具特异性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特异性結合之抗體」互換使用。

術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾形式，包括該抗體之結合物以及另一活性醫藥成分或抗體。術語「結合物」、「抗體-藥物結合物」、「ADC」或「免疫結合物」係指與另一治療部分結合之抗體或其片段，該另一治療部分可使用此項技術中可獲得的方法與本文所述之抗體結合。

術語「人類化抗體(humanized antibody/ humanized antibodies)」及「人類化」不欲指稱其中源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已植入人類構架序列上的抗體。可在人類框架序列內進行額外框架區修飾。非人類(例如鼠科動物)抗體之人類化形式係含有源自非人類免疫球蛋白之極小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之高變區的殘基由來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體，諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之15個高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基係由相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含接受者抗體中或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步細化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域中之實質上全部，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等，且全部或實質上全部FR區係人類免疫球蛋白序列之彼等。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之彼部分。關於進一步詳情，參見Jones 等人, Nature 1986, 321,522-525；Riechmann 等人, Nature 1988, 332,323-329；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2,593-596。本文所述之抗體亦可經修飾以採用已知賦予效應子功能及/或FcR結合之改良(例如，減少)的任何Fc變異體。該等Fc變異體可包括例如以下文獻中所揭示之任一胺基酸取代：國際專利申請公開案第WO 1988/07089 A1號、第WO 1996/14339 A1號、第WO 1998/05787 A1號、第WO 1998/23289 A1號、第WO 1999/51642 A1號、第WO 99/58572 A1號、第WO 2000/09560 A2號、第WO 2000/32767 A1號、第WO 2000/42072 A2號、第WO 2002/44215 A2號、第WO 2002/060919 A2號、第WO 2003/074569 A2號、第WO 2004/016750 A2號、第WO 2004/029207 A2號、第WO 2004/035752 A2號、第WO 2004/063351 A2號、第WO 2004/074455 A2號、第WO 2004/099249 A2號、第WO 2005/040217 A2號、第WO 2005/070963 A1號、第WO 2005/077981 A2號、第WO 2005/092925 A2號、第WO 2005/123780 A2號、第WO 2006/019447 A1號、第WO 2006/047350 A2號及第WO 2006/085967 A2號；及美國專利第5,648,260號；第5,739,277號；第5,834,250號；第5,869,046號；第6,096,871號；第6,121,022號；第6,194,551號；第6,242,195號；第6,277,375號；第6,528,624號；第6,538,124號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,998,253號；及第7,083,784號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

術語「嵌合抗體」意欲指稱其中可變區序列係源自一種物種且恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中可變區序列係源自小鼠抗體且恆定區序列係源自人類抗體之抗體。

「雙功能抗體」係具有兩個抗原結合位點之小抗體片段。該等片段包含在同一多肽鏈(V _H-V _L或V _L-V _H)中與輕鏈可變域(V _L)連接之重鏈可變域(V _H)。由於使用之連接子過短以致於無法在同一鏈上之兩個域之間進行配對，迫使該等域與另一鏈之互補域配對且産生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如歐洲專利第EP 404,097號、國際專利公開案第WO 93/11161號；及Bolliger 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90,6444-6448中。

術語「糖基化」係指抗體之經修飾衍生物。無糖基化抗體缺乏糖基化。糖基化可發生改變以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點而實現。例如，可產生一或多個胺基酸取代，導致消除一或多個可變區框架糖基化位點以由此消除彼位點處之糖基化。無糖基化可增加抗體對抗原之親和力，如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中所述。此外或替代地，可產生具有改變之糖基化類型的抗體，諸如具有減少量之岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構的抗體。此類改變之糖基化模式已證實增加抗體之能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變之糖基化機制的宿主細胞中表現該抗體而實現。具有改變之糖基化機制的細胞已描述於此項技術中且可用作宿主細胞，其中欲表現本發明之重組抗體以由此產生具有改變之糖基化的抗體。例如，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8 (α (1,6)岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705及Ms709細胞株中表現之抗體的碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8−/−細胞株係藉由使用兩種置換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因而產生的(參見例如美國專利公開案第2004/0110704號或Yamane-Ohnuki 等人 , Biotechnol. Bioeng., 2004, 87,614-622)。作為另一實例，歐洲專利第EP 1,176,195號描述具有功能性破壞之FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶，使得在此類細胞株中表現之抗體藉由減少或消除α 1,6鍵相關酶而展現低岩藻糖基化，且亦描述具有將岩藻糖添加至與抗體Fc區結合之N-乙醯基葡糖胺中的低酶活性或不具有該酶活性之細胞株，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。國際專利公開案WO 03/035835描述變異體CHO細胞株Lec 13細胞，其具有降低之使岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物的能力，亦導致在彼宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields 等人 , J. Biol. Chem. 2002, 277,26733-26740。國際專利公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶( 例如，β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III (GnTIII))的細胞株，使得在經工程改造之細胞株中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構，從而導致增加之抗體ADCC活性(亦參見Umana 等人, Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶裂解出抗體之岩藻糖基殘基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體移除岩藻糖基殘基，如Tarentino 等人, Biochem. 1975, 14,5516-5523中所述。

「聚乙二醇化」係指經修飾抗體或其片段，其通常在使得一或多個PEG基團附接至該抗體或抗體片段之條件下與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物反應。聚乙二醇化可例如增加抗體之生物(例如，血清)半衰期。較佳地，經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)發生醯化反應或烷基化反應來進行聚乙二醇化。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任何PEG形式，諸如單(C ₁-C ₁₀)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。欲聚乙二醇化之抗體可為無糖基化抗體。聚乙二醇化方法係此項技術中已知的且可應用於本發明抗體，如例如歐洲專利第EP 0154316號及第EP 0401384號以及美國專利第5,824,778號中所述，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

術語「生物類似物」意謂生物產品，包括單株抗體或蛋白質，該生物產品與美國許可參考生物產品高度類似，不過臨床無活性組分存在微小差異，且就產品之安全性、純度及效力而言，該生物產品與該參考之間不存在臨床上有意義差異。此外，類似生物或「生物類似」藥品係與已由歐洲藥品管理局授權使用之另一生物藥品類似的生物藥品。術語「生物類似物」亦由其他國家及地區監管機構同義使用。生物產品或生物藥品係由諸如細菌或酵母之生物來源產生或源自該生物來源之藥品。其可由相對較小分子(諸如人類胰島素或紅血球生成素)或複雜分子(諸如單株抗體)組成。例如，若參考IL-2蛋白為阿地白介素(PROLEUKIN)，則由藥物主管機關參考阿地白介素所批准之蛋白質係與阿地白介素「生物類似」或為阿地白介素之「其生物類似物」。在歐洲，類似生物或「生物類似」藥品係與已由歐洲藥品管理局(EMA)授權使用之另一生物藥品類似的生物藥品。歐洲類似生物應用之相關法律依據係經修訂的第726/2004號法規(EC)第6條及第2001/83/EC號指令第10(4)條，且因此在歐洲，可根據第726/2004號法規(EC)第6條及第2001/83/EC號指令第10(4)條對生物類似物進行授權、批准授權或申請授權。在歐洲，已經授權之原始生物醫藥產品可稱為「參考醫藥產品」。欲視為生物類似物之產品的一些要求概述於CHMP類似生物醫藥產品指南中。此外，EMA亦以產品為基礎提供產品特定指南，包括與單株抗體生物類似物相關之指南，且在其網站上公佈。如本文所述之生物類似物可在品質特徵、生物活性、作用機制、安全性型態及/或功效方面與參考醫藥產品類似。此外，生物類似物可用於或意欲用於與參考醫藥產品治療相同疾患。因此，如本文所述之生物類似物可被視為具有與參考醫藥產品類似或高度類似之品質特徵。或者或另外，如本文所述之生物類似物可被視為具有與參考醫藥產品類似或高度類似之生物活性。或者或另外，如本文所述之生物類似物可被視為具有與參考醫藥產品類似或高度類似之安全性型態。或者或另外，如本文所述之生物類似物可被視為具有與參考醫藥產品類似或高度類似之功效。如本文所述，將歐洲之生物類似物與已由EMA授權之參考醫藥產品進行比較。然而，在一些情況下，在某些研究中，可將該生物類似物與已在歐洲經濟區以外獲得授權之參考醫藥產品(非EEA授權「比較物」)進行比較。此類研究包括例如某些臨床及活體內非臨床研究。如本文所用，術語「生物類似物」亦有關已與或可與非EEA授權比較物進行比較之生物醫藥產品。某些生物類似物為蛋白質，諸如抗體、抗體片段(例如，抗原結合部分)及融合蛋白。蛋白質生物類似物可具有在胺基酸結構中具有微小修飾(包括例如胺基酸之缺失、添加及/或取代)之胺基酸序列，該等微小修飾不會顯著影響多肽之功能。生物類似物可包含與其參考醫藥產品具有97%或更大(例如，97%、98%、99%或100%)之序列一致性之胺基酸序列。生物類似物可包含一或多個轉譯後修飾，例如但不限於糖基化、氧化、去醯胺及截短，該一或多個轉譯後修飾不同於參考醫藥產品之轉譯後修飾，其限制條件在於差異不會導致醫藥產品之安全性及/或功效的變化。生物類似物可具有與參考醫藥產品一致或不同之糖基化模式。尤其但非排他地，若差異解決或意欲解決與參考醫藥產品相關之安全性問題，則生物類似物可具有不同糖基化模式。另外，生物類似物可在例如其強度、醫藥形式、調配、賦形劑及/或呈遞方面偏離參考醫藥產品，其限制條件在於醫藥產品之安全性及功效不受影響。生物類似物可包含如與參考醫藥產品相比例如藥物動力學(PK)及/或藥效學(PD)型態之差異，但仍被視為與參考醫藥產品充分類似，從而獲得授權或被視為適合授權。在某些情況下，生物類似物展現如與參考醫藥產品相比不同之結合特徵，其中不同之結合特徵未被主管機關(諸如EMA)視為作為類似生物產品獲得授權之障礙。術語「生物類似物」亦由其他國家及地區監管機構同義使用。 III. Gen 2 TIL 製造過程

含有此等特徵中之一些的例示性TIL過程家族(稱為Gen 2，亦稱為過程2A)係描述於圖1及2中。Gen 2之一實施例顯示於圖2中。

如本文中所論述，本發明可包括關於再刺激冷凍保存之TIL之步驟，以增加其代謝活性及因此在移植至患者中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如本文中大致概述，TIL通常取自患者樣品且經操縱以在移植至患者中之前擴增其數目。在一些實施例中，TIL可如下文所論述視情況經基因操縱。

在一些實施例中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加其代謝。

在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，第一次擴增(包括稱為REP前之過程以及圖1步驟A所示的過程)縮短至3至14天且第二次擴增(包括稱為REP之過程以及圖1步驟B所示的過程)縮短至7至14天。在一些實施例中，第一次擴增(例如，圖1步驟B所述之擴增)縮短至11天且第二次擴增(例如，圖1步驟D所述之擴增)縮短至11天。在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，第一次擴增與第二次擴增(例如，如圖1步驟B及步驟D所述之擴增)之組合縮短至22天。

下文「步驟」名稱A、B、C等係參考圖1且參考本文所述之某些實施例。下文及圖1中之步驟的排序為例示性的且本申請案及本文所揭示之方法考慮了步驟之任何組合或次序以及額外步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣品

一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣品且接著擴增成較大群體以進行如本文所述之進一步操縱，視情況經冷凍保存，如本文所概述經再刺激且視情況評估表型及作為TIL健康之指標的代謝參數。

患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，通常經由手術切除、針刺活組織檢查、粗針活組織檢查、小活組織檢查或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品之手段。在一些實施例中，使用多病變取樣。在一些實施例中，手術切除、針刺活組織檢查、粗針活組織檢查、小活組織檢查或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品之手段包括多病變取樣(亦即，自患者之一或多個腫瘤位點及/或位置以及在相同位置或緊密接近之一或多個腫瘤獲得樣品)。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可屬於肺組織。在一些實施例中，有用之TIL獲自非小細胞肺癌(NSCLC)。實體腫瘤可屬於皮膚組織。在一些實施例中，有用之TIL係獲自黑色素瘤。

一旦獲得，腫瘤樣品通常使用銳器解剖經片段化成介於1至約8 mm3之間之小塊，其中約2至3 mm3為尤其有用的。在一些實施例中，使用酶促腫瘤消化物由此等片段培養TIL。此類腫瘤消化物可藉由在酶培養基(例如，Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL正大黴素、30單位/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶)中培育，隨後機械解離(例如使用組織解離器)而產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤置於酶培養基中且機械解離腫瘤持續大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直至僅小組織塊存在而產生。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死亡細胞，則可使用FICOLL分支鏈親水性多醣來執行密度梯度分離以移除此等細胞。可使用此項技術中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所述之彼等，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法均可用於本文所述之任何實施例中的擴增TIL之方法或治療癌症之方法。

腫瘤解離酶混合物可包括一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原酶(包括膠原酶之任何摻合物或類型)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳酶、木瓜凝乳酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、彈性酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶)、去氧核糖核酸酶I (DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白水解酶及其任何組合。

在一些實施例中，解離酶係自凍乾之酶重構。在一些實施例中，凍乾之酶係以一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)重構。

在一些情況下，膠原酶(諸如無動物1型膠原酶)係以10 mL之無菌HBSS或另一緩衝液重構。凍乾之儲備酶之濃度可為2892 PZ U/小瓶。在一些實施例中，膠原酶係以5 mL至15 mL緩衝液重構。在一些實施例中，在重構後，膠原酶儲備液介於約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL範圍內，例如約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL、約200 PZ U/mL、約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。

在一些實施例中，中性蛋白酶係以1 mL之無菌HBSS或另一緩衝液重構。凍乾之儲備酶之濃度可為175 DMC U/小瓶。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液介於約100 DMC/mL-約400 DMC/mL範圍內，例如約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/mL或約400 DMC/mL。

在一些實施例中，DNA酶I係以1 mL之無菌HBSS或另一緩衝液重構。凍乾之儲備酶之濃度為4 KU/小瓶。在一些實施例中，在重構後，DNA酶I儲備液介於約1 KU/mL-10 KU/mL範圍內，例如約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。

在一些實施例中，酶儲備液係可變的且可能需要測定濃度。在一些實施例中，凍乾之儲備液之濃度可經驗證。在一些實施例中，添加至消化混合液中之酶的最終量係基於所測定之儲備液濃度進行調整。

在一些實施例中，酶混合物包括在約4.7 mL無菌HBSS中之約10.2-ul中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 µL膠原酶(1.2 PZ/mL)及250-ul DNA酶I (200 U/mL)。

如上文所指示，在一些實施例中，TIL係源自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化且以全腫瘤進行酶促消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2下消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2及旋轉下消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤在恒定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤在37℃、5% CO2及恒定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，全腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。

在一些實施例中，腫瘤係以凍乾之酶在無菌緩衝液中重構。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。

在一些實施例中，酶混合物包含膠原酶。在一些實施例中，膠原酶為膠原酶IV。在一些實施例中，膠原酶之工作儲備液為100 mg/mL 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000 IU/mL 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/mL 10X工作儲備液。

在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/mL膠原酶、1000 IU/mL DNA酶及1 mg/mL玻尿酸酶。

在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/mL膠原酶、500 IU/mL DNA酶及1 mg/mL玻尿酸酶。

一般而言，將所收集之細胞懸浮液稱為「原代細胞群體」或「新鮮收集之」細胞群體。

在一些實施例中，片段化包括物理片段化，包括例如解剖以及消化。在一些實施例中，片段化為物理片段化。在一些實施例中，片段化為解剖。在一些實施例中，片段化係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自藉由消化或片段化獲自患者之腫瘤樣品而獲得的酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。

在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在例如步驟A (如圖1中所提供)中獲得腫瘤樣品後，對腫瘤進行物理片段化。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，片段化發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將10、20、30、40或更多個片段或塊置於各容器進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將30或40個片段或塊置於各容器進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將40個片段或塊置於各容器進行第一次擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3之體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3至約1500 mm3。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。

在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器解剖獲得。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm3與10 mm3之間。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm3與8 mm3之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm3。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm3。在一些實施例中，腫瘤為1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤為1 mm × 1 mm × 1 mm。在一些實施例中，腫瘤為2 mm × 2 mm × 2 mm。在一些實施例中，腫瘤為3 mm × 3 mm × 3 mm。在一些實施例中，腫瘤為4 mm × 4 mm × 4 mm。

在一些實施例中，切除腫瘤以便使各塊上之出血性、壞死及/或脂肪組織之量降至最低。在一些實施例中，切除腫瘤以便使各塊上之出血性組織之量降至最低。在一些實施例中，切除腫瘤以便使各塊上之壞死組織之量降至最低。在一些實施例中，切除腫瘤以便使各塊上之脂肪組織之量降至最低。

在一些實施例中，執行腫瘤片段化以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，在不使用解剖刀執行鋸切動作之情況下執行腫瘤片段化。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL正大黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶之酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而生成。在將腫瘤置於酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2中培育30分鐘，且接著再次機械破壞該溶液持續大約1分鐘。在37℃下在5% CO2中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次持續大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若大塊組織仍然存在，則向樣品施加1或2次額外機械解離，再在37℃下在5% CO2中培育30分鐘或不再培育。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量之紅血球或死亡細胞，則可使用Ficoll來執行密度梯度分離以移除此等細胞。

在一些實施例中，將第一次擴增步驟之前所收集的細胞懸浮液稱為「原代細胞群體」或「新鮮收集之」細胞群體。

在一些實施例中，細胞可在樣品收集後視情況冷凍且在進入步驟B所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟B在下文中更詳細描述且在圖1以及圖8中例示。 1. 胸腔積液 T 細胞及 TIL

在一些實施例中，樣品為胸膜液樣品。在一些實施例中，用於根據本文所述之過程擴增之T細胞或TIL的來源為胸膜液樣品。在一些實施例中，樣品為胸腔積液源性樣品。在一些實施例中，用於根據本文所述之過程擴增之T細胞或TIL的來源為胸腔積液源性樣品。參見例如美國專利公開案US 2014/0295426中所述之方法，該案出於所有目的以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，可採用任何疑似及/或含有TIL之胸膜液或胸腔積液。此類樣品可源自原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣品可源自起源於另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發性轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法之樣品為胸膜滲出液。在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法之樣品為胸膜漏出液。其他生物樣品可包括其他含有TIL之漿液，包括例如腹部之腹水或胰囊腫液。腹水及胸膜液涉及極類似之化學系統；腹部及肺部皆具有間皮細胞株且在惡性病中以相同情況在胸膜空間及腹部空間形成流體且此類流體在一些實施例中含有TIL。在一些實施例中，其中所揭示之方法使用胸膜液，可使用含有TIL之腹水或其他囊腫液執行相同方法以得到類似結果。

在一些實施例中，胸膜液係呈直接自患者移出之未處理形式。在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，將未處理之胸膜液置於標準血液收集管(諸如EDTA或肝素管)中。在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，將未處理之胸膜液置於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，自患者收集之後立即將樣品置於CellSave管中以避免活TIL之數目降低。若留在未處理之胸膜液中，即使在4℃下，活TIL之數目亦可在24小時內降低至顯著程度。在一些實施例中，在自患者移出之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內，將樣品置於適當收集管中。在一些實施例中，在4℃下自患者移出之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內，將樣品置於適當收集管中。

在一些實施例中，可對來自所選個體之胸膜液樣品進行稀釋。在一些實施例中，稀釋為1:10胸膜液:稀釋劑。在其他實施例中，稀釋為1:9胸膜液:稀釋劑。在其他實施例中，稀釋為1:8胸膜液:稀釋劑。在其他實施例中，稀釋為1:5胸膜液:稀釋劑。在其他實施例中，稀釋為1:2胸膜液:稀釋劑。在其他實施例中，稀釋為1:1胸膜液:稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑包括生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、另一緩衝液或生理學上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，自患者收集及稀釋之後立即將樣品置於CellSave管中以避免活TIL之降低，若留在未處理之胸膜液中，即使在4℃下，活TIL之降低亦可在24-48小時內發生至顯著程度。在一些實施例中，在自患者移出及稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內，將胸膜液樣品置於適當收集管中。在一些實施例中，在4℃下自患者移出及稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內，將胸膜液樣品置於適當收集管中。

在其他實施例中，在進一步處理步驟之前，藉由習知手段濃縮胸膜液樣品。在一些實施例中，胸膜液之此預處理在其中胸膜液必須經冷凍保存以供運輸至執行該方法之實驗室或供稍後分析(例如晚於收集後24-48小時)之情況下係較佳的。在一些實施例中，胸膜液樣品係藉由自個體抽出胸膜液樣品之後將其離心且將離心分離物或集結粒再懸浮於緩衝液中來製備。在一些實施例中，胸膜液樣品進行多次離心及再懸浮，然後經冷凍保存以供運送或稍後分析及/或處理。

在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液樣品。在一些實施例中，在進一步處理中使用之胸膜液樣品係藉由使流體通過含有已知且基本上一致孔徑以允許胸膜液傳遞通過膜但保留腫瘤細胞之過濾器過濾來製備。在一些實施例中，膜中之孔之直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔直徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中可為6、7、8、9或10 μM中任一者。在過濾之後，可將由膜保留之細胞(包括TIL)沖洗脫離膜至合適生理學上可接受之緩衝液中。以此方式濃縮之細胞(包括TIL)接著可用於該方法之進一步處理步驟中。

在一些實施例中，使胸膜液樣品(包括例如未處理之胸膜液)、經稀釋之胸膜液或再懸浮細胞集結粒與差異性溶解存在於樣品中之無核紅血球之溶解試劑接觸。在一些實施例中，此步驟係在其中胸膜液含有大量RBC之情況下在進一步處理步驟之前執行。合適溶解試劑包括單一溶解試劑或溶解試劑及淬滅試劑或溶解劑、淬滅試劑及固定試劑。合適溶解系統在市面上有售且包括BD Pharm Lyse™系統(Becton Dickenson)。其他溶解系統包括Versalyse™系統、FACSlyse™系統(Becton Dickenson)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter, Inc.)或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求為有效溶解紅血球及保留胸膜液中之TIL及TIL之表型性質而異。除了採用單一溶解試劑之外，可用於本文所述之方法中的溶解系統亦可包括第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或阻滯溶解試劑之效應者，例如Stabilyse™試劑(Beckman Coulter, Inc.)。取決於溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施，亦可採用習知固定試劑。

在一些實施例中，如上文所述之未處理、經稀釋或經多次離心或處理之胸膜液樣品在經進一步處理及/或本文所提供之擴增之前係在約−140℃之溫度下冷凍保存。 B. 步驟 B ：第一次擴增

在一些實施例中，本發明方法提供獲得年輕TIL，該等年輕TIL在投與至個體/患者後能夠增加複製週期且因此相較於較老TIL (亦即，在投與至個體/患者之前已進一步經歷更多輪複製之TIL)可能提供額外治療益處。年輕TIL之特徵已描述於文獻中，例如描述於Donia 等人, Scand. J. Immunol. 2012 , 75,157-167；Dudley 等人, Clin. Cancer Res. 2010 , 16,6122-6131；Huang 等人, J. Immunother. 2005 , 28, 258-267；Besser 等人, Clin. Cancer Res. 2013 , 19, OF1-OF9；Besser 等人, J. Immunother. 2009, 32:415-423；Robbins 等人, J. Immunol. 2004, 173,7125-7130；Shen 等人, J. Immunother., 2007 , 30,123-129；Zhou 等人, J. Immunother. 2005 , 28,53-62；及Tran 等人, J. Immunother., 2008, 31, 742-751中，各案以引用之方式併入本文中。

T及B淋巴細胞之多樣抗原受體係藉由有限但大量之基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V (可變區)、D (多樣區)、J (接合區)及C (恒定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於生成展現且增加T細胞譜系多樣性之TIL之方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL相較於新鮮收集之TIL及/或使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1中所體現之彼等方法以外的方法)製備之TIL，展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL相較於新鮮收集之TIL及/或使用稱為過程1C的方法(如圖5及/或圖6中所例示)製備之TIL，展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，在第一次擴增中獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即，TCRα/β)之表現增加。

在例如圖1步驟A所述之解剖或消化腫瘤片段之後，在有利於TIL但不利於腫瘤及其他細胞之生長的條件下在含有IL-2之血清中培養所得細胞。在一些實施例中，在2 mL孔中包含不活化人類AB血清及6000 IU/mL IL-2之培養基中培育腫瘤消化物。將此原代細胞群體培養數天之時期(通常3-14天)，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養7-14天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養10-14天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養約11天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。

在一些實施例中，TIL之擴增可使用如以下及本文所述之初始主體TIL擴增步驟(例如圖1步驟B中所述之彼等，其可包括稱為REP前之過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述之第二次擴增(步驟D，包括稱為快速擴增方案(REP)步驟之過程)，隨後執行視情況選用的冷凍保存，且隨後執行如以下及本文所述之第二步驟D (包括稱為再刺激REP步驟之過程)。可視情況表徵獲自此過程之TIL的如本文所述之表型特徵及代謝參數。

在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養簇(Corning Incorporated, Corning, NY))之實施例中，各孔可在含IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)之2 mL完全培養基(CM)中接種1 × 10 ⁶個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm ³與10 mm ³之間。

在一些實施例中，第一次擴增培養基係稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL正大黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在其中培養起始於具有40 mL容量及10 cm ²透氣矽底之透氣燒瓶(例如G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)之實施例中，各燒瓶在10-40 mL含IL-2之CM中裝載10-40×10 ⁶個活腫瘤消化細胞或5-30個腫瘤片段。G-REX10及24孔板皆在潮濕培育箱中在37℃、CO ₂下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天后，每2-3天更換一半培養基。

在一些實施例中，本文所揭示之擴增過程中所用的培養基為無血清培養基或成分確定之培養基。在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基包含基礎細胞培養基及血清補充物及/或血清替代物。在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基用於預防及/或減少部分地歸因於含血清培養基之批次間變化的實驗變化。

在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基包含基礎細胞培養基及血清補充物及/或血清替代物。在一些實施例中，該基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove改良杜氏培養基。

在一些實施例中，血清補充物或血清替代物包括但不限於以下一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充物、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維他命、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅體、一或多種抗生素及一或多種痕量元素。在一些實施例中，成分確定之培養基包含白蛋白及選自由以下組成之群的一或多種成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-酥胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、經還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有痕量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，成分確定之培養基進一步包含L-麩醯胺、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。

在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該等習知生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove改良杜氏培養基。

在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基中的總血清替代物濃度(vol%)為以體積計總的無血清或成分確定之培養基之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為該無血清或成分確定之培養基的總體積之約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為該無血清或成分確定之培養基的總體積之約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為該無血清或成分確定之培養基的總體積之約10%。

在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。CTS™ OpTmizer™之任何調配物均可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物之組合，兩者在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，連同55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，且該等培養基中之2-巰基乙醇的最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，該成分確定之培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。CTS™ OpTmizer™之任何調配物均可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物之組合，兩者在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，連同55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，且該等培養基中之2-巰基乙醇的最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有麩醯胺(亦即，GlutaMAX®)，其濃度為約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM。在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有麩醯胺(亦即，GlutaMAX®)，其濃度為約2 mM。

在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有2-巰基乙醇，其濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM。在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有2-巰基乙醇，其濃度為約55 mM。在一些實施例中，該等培養基中之2-巰基乙醇的最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，國際PCT公開案第WO/1998/030679號(其以引用之方式併入本文中)中所述的成分確定之培養基可用於本發明。在彼公開案中，描述了無血清真核細胞培養基。該無血清真核細胞培養基包括補充有無血清補充物之基礎細胞培養基，該無血清補充物能夠支持細胞在無血清培養基中之生長。該無血清真核細胞培養基補充物包含或藉由組合選自由以下組成之群的一或多種成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維他命、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅體、一或多種痕量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，成分確定之培養基進一步包含L-麩醯胺、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，成分確定之培養基包含白蛋白或白蛋白代用品及選自由以下組成之群的一或多種成分：一或多種胺基酸、一或多種維他命、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅體及一或多種痕量元素。在一些實施例中，成分確定之培養基包含白蛋白及選自由以下組成之群的一或多種成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-酥胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、經還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有痕量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由以下組成之群：杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove改良杜氏培養基。

在一些實施例中，成分確定之培養基中的甘胺酸之濃度係在約5-200 mg/L範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-酥胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，經還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白( 例如，AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。

在一些實施例中，成分確定之培養基中的非痕量元素部分成分以下表4中之標題「1X培養基中之濃度範圍」所處之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，成分確定之培養基中的非痕量元素部分成分以表4中之標題「1X培養基之較佳實施例」所處之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，成分確定之培養基係包含無血清補充物之基礎細胞培養基。在此等實施例中之一些中，該無血清補充物包含下表4中之標題「補充物之較佳實施例」所處之欄中列出的類型及濃度之非痕量部分成分。表4：非痕量元素部分成分之濃度

成分	補充物之較佳實施例(mg/L) (約)	1X培養基中之濃度範圍(mg/L) (約)	1X培養基之較佳實施例(mg/L) (約)
甘胺酸	150	5-200	53
L-組胺酸	940	5-250	183
L-異白胺酸	3400	5-300	615
L-甲硫胺酸	90	5-200	44
L-苯丙胺酸	1800	5-400	336
L-脯胺酸	4000	1-1000	600
L-羥基脯胺酸	100	1-45	15
L-絲胺酸	800	1-250	162
L-酥胺酸	2200	10-500	425
L-色胺酸	440	2-110	82
L-酪胺酸	77	3-175	84
L-纈胺酸	2400	5-500	454
硫胺素	33	1-20	9
經還原麩胱甘肽	10	1-20	1.5
抗壞血酸-2-PO ₄(Mg鹽)	330	1-200	50
轉鐵蛋白(鐵飽和)	55	1-50	8
胰島素	100	1-100	10
亞硒酸鈉	0.07	0.000001-0.0001	0.00001
AlbuMAX ^®I	83,000	5000-50,000	12,500

在一些實施例中，成分確定之培養基的容積滲透濃度係在約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，容積滲透濃度係在約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，成分確定之培養基補充有多達約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。成分確定之培養基可進一步補充有L-麩醯胺(約2 mM最終濃度)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；約100 μM最終濃度)、2-巰基乙醇(約100 μM最終濃度)。

在一些實施例中，描述於Smith等人, Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中之成分確定之培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用作基礎細胞培養基，且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基係未過濾的。使用未過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所必需之程序。在一些實施例中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。

在製備腫瘤片段後，在有利於TIL但不利於腫瘤及其他細胞生長之條件下在含有IL-2之血清中培養所得細胞(亦即，片段)。在一些實施例中，在2 mL孔中之包含不活化人類AB血清(或在一些如本文所概述之情況下，在APC細胞群體存在下)及6000 IU/mL IL-2之培養基中培育腫瘤消化物。將此原代細胞群體培養數天之時期(通常10-14天)，導致通常約1×108個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，在第一次擴增期間之生長培養基包含IL-2或其變異體。在一些實施例中，IL為重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×106 IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×106 IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×106 IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×106 IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL- 2儲備液具有4-8×106 Iu/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL- 2儲備液具有5-7×106 Iu/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL- 2儲備液具有6×106 IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液係如實例5所述來製備。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL IL-2。

在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。

在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。

在一些實施例中，細胞培養基包含抗CD3促效劑抗體，例如OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。參見例如表1。

在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變異體、生物類似物及組合組成之群。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。

在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。

在一些實施例中，第一次擴增培養基係稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其係稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL正大黴素之含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在其中培養起始於具有40 mL容量及10 cm2透氣矽底之透氣燒瓶(例如G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)之實施例中，各燒瓶在10-40 mL含IL-2之CM中裝載10-40×106個活腫瘤消化細胞或5-30個腫瘤片段。G-REX10及24孔板皆在潮濕培育箱中在37℃、5% CO2下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天后，每2-3天更換一半培養基。在一些實施例中，CM係實例中所述之CM1，參見實例1。在一些實施例中，第一次擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。

在一些實施例中，第一次擴增(包括例如圖1步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前之彼等過程)過程縮短至3-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第一次擴增(包括例如圖1步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前之彼等過程)縮短至7至14天，如實例中所論述以及圖4及5中所示，以及包括例如圖1步驟B所述之擴增。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短至10-14天。在一些實施例中，第一次擴增縮短至11天，如例如圖1步驟B所述之擴增中所論述。

在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可包括於第一次擴增期間，例如包括於根據圖1以及本文所述之步驟B過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可包括於根據圖1以及本文所述之步驟B過程期間。

在一些實施例中，第一次擴增(包括稱為REP前之過程；例如根據圖1之步驟B)過程縮短至3-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短至7-14天。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短至10-14天。在一些實施例中，第一次擴增縮短至11天。

在一些實施例中，第一次擴增(例如根據圖1之步驟B)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1. 細胞介素及其他添加劑

本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(詳言之IL-2)之培養基，如此項技術中所知。

或者，使用細胞介素之組合來進行TIL之快速擴增及或第二次擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或兩者以上的組合係如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能之組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2或IL-15及IL-21，其中最後一種組合在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特定地有利於生成淋巴細胞，且詳言之如其中所述之T細胞。

在一些實施例中，步驟B亦可包括將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟B亦可包括將4-1BB促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟B亦可包括將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。在其他實施例中，諸如過氧化物酶體增生物活化受體γ共活化劑I-α促效劑(包括增生物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如四氫噻唑二酮化合物)之添加劑可用於步驟B期間之培養基，如美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 C. 步驟 C ：第一次擴增至第二次擴增之轉變

在一些情況下，獲自第一次擴增之主體TIL群體(包括例如獲自例如圖1所示之步驟B的TIL群體)可使用下文所論述之方案立即進行冷凍保存。或者，獲自第一次擴增之TIL群體(稱為第二TIL群體)可進行第二次擴增(其可包括有時稱為REP之擴增)且接著如下文所論述進行冷凍保存。同樣，在其中經基因修飾之TIL將用於療法中之情況中，第一TIL群體(有時稱為主體TIL群體)或第二TIL群體(其在一些實施例中可包括稱為REP TIL群體之群體)可在擴增之前或在第一次擴增之後且在第二次擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。

在一些實施例中，獲自第一次擴增(例如圖1所示之步驟B)之TIL係經儲存直至為了選擇而分析表型。在一些實施例中，獲自第一次擴增(例如圖1所示之步驟B)之TIL未進行儲存且直接進行第二次擴增。在一些實施例中，獲自第一次擴增之TIL在第一次擴增之後且在第二次擴增之前未進行冷凍保存。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約3天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約4天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約4天至10天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約7天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之約14天。

在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之1天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之3天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之4天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之5天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之6天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之7天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之8天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之9天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之10天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之11天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之12天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之13天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之14天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之1天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之2天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之3天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之4天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之5天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之6天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之7天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之8天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之9天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之10天至11天。在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後之11天。

在一些實施例中，TIL在第一次擴增之後且在第二次擴增之前未進行儲存，且TIL直接進行第二次擴增(例如在一些實施例中，在如圖1所示之自步驟B至步驟D之轉變期間並未進行儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一次擴增之TIL (第二TIL群體)直接進行第二次擴增而無轉變期。

在一些實施例中，自第一次擴增轉變至第二次擴增(例如根據圖1之步驟C)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100生物反應器。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 D. 步驟 D ：第二次擴增

在一些實施例中，TIL細胞群體在收集及初始主體處理(例如步驟A及步驟B之後)以及稱為步驟C之轉變(如圖1所示)之後數目擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二次擴增，其可包括此項技術中通常稱為快速擴增過程(REP)之擴增過程；以及如圖1步驟D所示之過程。第二次擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中完成。

在一些實施例中，TIL之第二次擴增或第二次TIL擴增(其可包括有時稱為REP之擴增；以及如圖1步驟D所示之過程)可使用熟習此項技術者已知的任何TIL燒瓶或容器來執行。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約14天。

在一些實施例中，第二次擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖1步驟D所示之過程)來執行。例如，TIL可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體(諸如約30 ng/mL OKT3)、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二次擴增期間包括一或多種癌症之抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該一或多種抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體，諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1 :26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)表現。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈遞細胞上之相同癌症抗原再刺激來快速擴增。或者，TIL可進一步用例如經照射之自體淋巴細胞或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二次擴增之一部分發生。在一些實施例中，第二次擴增在經照射之自體淋巴細胞或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2存在下發生。

在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL之間之IL-2。

在一些實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可包括於第二次擴增期間，例如包括於根據圖1以及本文所述之步驟D過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可包括於根據圖1以及本文所述之步驟D過程期間。

在一些實施例中，第二次擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈遞餵養細胞及視情況選用之TNFRSF促效劑的經補充之細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二次擴增在經補充之細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC；亦稱為抗原呈遞餵養細胞)。在一些實施例中，第二次擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞餵養細胞(亦即抗原呈遞細胞)之細胞培養基中發生。

在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。

在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。

在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈遞細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC之比率係介於1:50與1:300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC之比率係介於1:100與1:200之間。

在一些實施例中，REP及/或第二次擴增係在燒瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量之不活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 mL培養基中混合。進行培養基置換(通常經由抽吸用新鮮培養基置換2/3培養基)，直至細胞轉移至替代性生長腔室。替代性生長腔室包括G-REX燒瓶及如下文更充分論述之透氣容器。

在一些實施例中，第二次擴增(其可包括稱為REP過程之過程)縮短至7-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第二次擴增縮短至11天。

在一些實施例中，REP及/或第二次擴增可使用T-175燒瓶及如先前所述之透氣袋(Tran 等人, J. Immunother. 2008, 31,742-51；Dudley 等人, J. Immunother. 2003, 26,332-42)或透氣培養器皿(G-REX燒瓶)來執行。在一些實施例中，第二次擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係在T-175燒瓶中執行，且可將懸浮於150 mL培養基中之約1×10 ⁶個TIL添加至各T-175燒瓶中。TIL可在CM及AIM-V培養基之1:1混合物中培養，該混合物補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3。T-175燒瓶可在37℃下在5% CO ₂中培育。可在第5天使用含有3000 IU/mL IL-2之50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天可將來自兩個T-175燒瓶之細胞組合於3 L袋中且將300 mL含有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM V添加至300 mL TIL懸浮液中。各袋中之細胞數目每天或每兩天計算一次，且添加新鮮培養基以保持細胞計數介於0.5與2.0×10 ⁶個細胞/mL之間。

在一些實施例中，第二次擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及圖1步驟D中所提及之彼等)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣燒瓶(G-REX-100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×10 ⁶或10×10 ⁶個TIL可與PBMC一起在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-REX-100燒瓶可在37℃下在5% CO ₂中培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置於離心瓶中且在1500 rpm (491 × g)下離心10分鐘。可用150 mL含有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基使TIL集結粒再懸浮，且添加回原始G-REX-100燒瓶。當TIL在G-REX-100燒瓶中連續擴增時，在第7天可使各G-REX-100中之TIL懸浮於存在於各燒瓶中之300 mL培養基中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-REX-100燒瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL含有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各燒瓶。G-REX-100燒瓶可在37℃下在5% CO ₂中培育，且在4天之後可將150 mL含有3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各G-REX-100燒瓶。可在培養之第14天收集細胞。

在一些實施例中，第二次擴增(包括稱為REP之擴增)係在燒瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量之不活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 mL培養基中混合。在一些實施例中，進行培養基置換直至細胞轉移至替代性生長腔室。在一些實施例中，藉由抽吸用新鮮培養基置換2/3之培養基。在一些實施例中，替代性生長腔室包括G-REX燒瓶及如下文更充分論述之透氣容器。

在一些實施例中，執行第二次擴增(包括稱為REP之擴增)且其進一步包括其中選擇具有優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用此項技術中已知之任何選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)所述之方法可用於選擇具有優異腫瘤反應性之TIL。

視情況，在第二次擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用此項技術中已知之標準分析來執行細胞活力分析。例如，可對主體TIL之樣品進行台盼藍排除分析，該分析選擇性標記死亡細胞且允許活力評估。在一些實施例中，可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)對TIL樣品進行計數且確定活力。在一些實施例中，活力係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動化細胞計數器方案確定。

在一些實施例中，TIL之第二次擴增(包括稱為REP之擴增)可使用T-175燒瓶及如先前所述之透氣袋(Tran 等人, 2008, J Immunother., 31, 742-751，及Dudley 等人 2003, J Immunother., 26, 332-342)或透氣G-REX燒瓶來執行。在一些實施例中，第二次擴增使用燒瓶來執行。在一些實施例中，第二次擴增使用透氣G-REX燒瓶來執行。在一些實施例中，第二次擴增係在T-175燒瓶中執行，且使約1 × 10 ⁶個TIL懸浮於150 mL培養基中且將其添加至各T-175燒瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經照射(50 Gy)之同種異體PBMC以1:100之比率培養，且在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物(50/50培養基)中培養細胞。在37℃下在5% CO ₂中培育T-175燒瓶。在一些實施例中，在第5天使用含有3000 IU/mL IL-2之50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天將來自2個T-175燒瓶之細胞組合於3 L袋中，且將300 mL含有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至300 mL TIL懸浮液。可每天或每兩天對各袋中之細胞數目計數，且可添加新鮮培養基以保持細胞計數介於約0.5與約2.0 × 10 ⁶個細胞/mL之間。

在一些實施例中，第二次擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm ²透氣矽底之燒瓶(G-REX-100, Wilson Wolf)中執行，將約5 × 10 ⁶或10 × 10 ⁶個TIL與經照射之同種異體PBMC以1:100之比率在400 mL補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/ mL抗CD3之50/50培養基中培養。在37℃下在5% CO ₂中培育G-REX-100燒瓶。在一些實施例中，在第5天移出250 mL上清液且置於離心瓶中且在1500 rpm (491 g)下離心10分鐘。接著可用150 mL含有3000 IU/mL IL-2之新鮮50/50培養基使TIL集結粒再懸浮，且添加回原始G-REX-100燒瓶。在其中在G-REX-100燒瓶中連續擴增TIL之實施例中，在第7天使各G-REX-100中之TIL懸浮於存在於各燒瓶中之300 mL培養基中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-REX-100燒瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL含有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各燒瓶。在37℃下在5% CO ₂中培育G-REX-100燒瓶，且在4天之後將150 mL含有3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各G-REX-100燒瓶。在培養之第14天收集細胞。

T及B淋巴細胞之多樣抗原受體係藉由有限但大量之基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V (可變區)、D (多樣區)、J (接合區)及C (恒定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於生成展現且增加T細胞譜系多樣性之TIL之方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，在第二次擴增中獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即，TCRα/β)之表現增加。

在一些實施例中，第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更詳細論述之抗原呈遞餵養細胞(APC)。

在一些實施例中，本文所揭示之擴增過程中所用的培養基為無血清培養基或成分確定之培養基。在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基包含基礎細胞培養基及血清補充物及/或血清替代物。在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基用於預防及/或減少部分地歸因於含血清培養基之批次間變化的實驗變化。

在一些實施例中，該成分確定之培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。CTS™ OpTmizer™之任何調配物均可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物之組合，兩者在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，連同55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及2 mM麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，且該等培養基中之2-巰基乙醇的最終濃度為55 µM。

在一些實施例中，成分確定之培養基中的非痕量元素部分成分以表4中之標題「1X培養基中之濃度範圍」所處之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，成分確定之培養基中的非痕量元素部分成分以表4中之標題「1X培養基之一較佳實施例」所處之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，成分確定之培養基係包含無血清補充物之基礎細胞培養基。在此等實施例中之一些中，該無血清補充物包含表4中之標題「補充物之較佳實施例」所處之欄中列出的類型及濃度之非痕量部分成分。

在一些實施例中，描述於Smith 等人, Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中之成分確定之培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用作基礎細胞培養基，且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，第二次擴增(例如根據圖1之步驟D)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，快速或第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大(scaling up)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速或第二次擴增，及接著(b)實現小規模培養中之TIL轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之TIL持續約4至7天之時期。

在一些實施例中，快速或第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大(scaling out)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之第一小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速或第二次擴增，及接著(b)實現來自第一小規模培養之TIL轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之TIL部分係在第二小規模培養中培養約4至7天之時期。

在一些實施例中，將第一小規模TIL培養分配至複數個(約2至5個) TIL亞群中。

在一些實施例中，快速或第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速或第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之TIL轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分係在較大規模培養中培養約4至7天之時期。

在一些實施例中，快速或第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約5天之時期來執行快速或第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之TIL轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500 MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分係在較大規模培養中培養約6天之時期。

在一些實施例中，在快速或第二次擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL。在一些實施例中，在快速或第二次擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL、至少10 ⁹個TIL或至少10 ¹⁰個TIL。在一例示性實施例中，各第二容器包含至少10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，將第一小規模TIL培養分配至複數個亞群中。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養分配至複數個(約2至5個)亞群中。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養分配至複數個(約2、3、4或5個)亞群中。

在一些實施例中，在快速或第二次擴增完成之後，該複數個亞群包含治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速或第二次擴增完成之後，將一或多個TIL亞群匯集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速擴增完成之後，各TIL亞群包含治療有效量之TIL。

在一些實施例中，在分成複數個步驟之前，執行快速或第二次擴增持續約3至7天之時期。在一些實施例中，快速或第二次擴增之分開發生在起始快速或第二次擴增之後約第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。

在一些實施例中，快速或第二次擴增之分開發生在起始第一次擴增( 亦即，REP前擴增)之後約第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天第17天或第18天。在一例示性實施例中，快速或第二次擴增之分開發生在起始第一次擴增之後約第16天。

在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速或第二次擴增持續約7至11天之時期。在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速或第二次擴增持續約5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時期。

在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基不同的組分。

在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC。

在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。

在一些實施例中，在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基包含IL-2及OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及視情況選用之OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之後用於快速或第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速或第二次擴增之細胞培養基而生成。

在一些實施例中，快速擴增之分開發生在密閉系統中。

在一些實施例中，在快速或第二次擴增期間TIL培養之規模縱向擴大包括將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中(亦稱作餵養TIL)。在一些實施例中，該餵養包括頻繁地將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中。在一些實施例中，該餵養包括以規則時間間隔將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中。在一些實施例中，經由恆定流向TIL供應新鮮細胞培養基。在一些實施例中，諸如Xuri W25之自動化細胞擴增系統用於快速擴增及餵養。 1. 餵養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，本文所述之第二次擴增程序(例如包括諸如圖1步驟D中所述之彼等以及稱為REP之彼等的擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二次擴增期間需要過量之餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。

一般而言，同種異體PBMC係經由照射或熱處理而不活化，且用於REP程序，如實例所述，該等實例提供用於評估照射同種異體PBMC之複製不能的例示性方案。

在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目，則認為PBMC係複製不能的且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。

在一些實施例中，若在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天之活細胞總數並未自在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，若在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天之活細胞總數並未自在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在10-50 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在20-40 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在25-35 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為人工抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:50與1:300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:100與1:200之間。

在一些實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 ⁹個餵養細胞對約100×10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 ⁹個餵養細胞對約50×10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 ⁹個餵養細胞對約25×10 ⁶個TIL。

在一些實施例中，本文所述之第二次擴增程序在第二次擴增期間需要過量之餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈遞(aAPC)細胞來替代PBMC。

一般而言，同種異體PBMC係經由照射或熱處理而不活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括圖式及實例中所述之例示性程序。

在一些實施例中，在第二次擴增中使用人工抗原呈遞細胞來替換PBMC或與PBMC組合。 2. 細胞介素及其他添加劑

或者，使用細胞介素之組合來進行TIL之快速擴增及或第二次擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或兩者以上的組合係如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能之組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中最後一種組合在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特定地有利於生成淋巴細胞，且詳言之如其中所述之T細胞。

在一些實施例中，步驟D亦可包括將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟D亦可包括將4-1BB促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟D亦可包括將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。另外，諸如過氧化物酶體增生物活化受體γ共活化劑I-α促效劑(包括增生物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如四氫噻唑二酮化合物)之添加劑可用於步驟D期間之培養基，如美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 E. 步驟 E ：收集 TIL

在第二次擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖1所提供之一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1所提供之兩個擴增步驟之後收集TIL。

TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。用於TIL收集之方法係此項技術中熟知的且本過程可採用任何此類已知方法。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。

細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc。本發明方法可採用任何基於細胞之收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統係基於膜之細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。術語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造之任何儀器或裝置，其可將包含細胞之溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)，從而允許連續流動及細胞處理以在無需集結粒化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。

在一些實施例中，收集(例如根據圖1之步驟E)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。

在一些實施例中，根據圖1之步驟E係根據本文所述之過程來執行。在一些實施例中，在無菌條件下經由注射器進入密閉系統以便維持該系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所述之密閉系統。

在一些實施例中，根據實例中所述之方法來收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中(諸如實例中之第11天TIL收集中)所述的方法來收集在第1天與第11天之間之TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中(諸如實例中之第22天TIL收集中)所述的方法來收集在第12天與第24天之間之TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中(諸如實例中之第22天TIL收集中)所述的方法來收集在第12天與第22天之間之TIL。 F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注容器

在如圖1以例示性次序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至用於投與至患者之容器，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，一旦使用上文所述之擴增方法獲得治療學上足夠數目的TIL，即將其轉移至用於投與至患者之容器。

在一些實施例中，使用本揭示案之APC擴增之TIL係作為醫藥組合物投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物係TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知之任何合適途徑投與。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投與，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投與。 IV. Gen 3 TIL 製造過程

在不受任何特定理論限制下，據信如本發明方法中所述的啟動T細胞活化之啟動性第一次擴增、隨後加強T細胞活化之快速第二次擴增允許製備保留「較年輕」表型的經擴增T細胞，且因此預期本發明之經擴增T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞對癌細胞展現較高細胞毒性。詳言之，據信如本發明方法所教示的藉由暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及視情況選用之抗原呈遞細胞(APC)而啟動且接著藉由後續暴露於額外抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC而加強的T細胞活化會限制或避免培養中之T細胞成熟，從而產生具有較不成熟表型之T細胞群體，該等T細胞較少因培養中之擴增而耗竭且對癌細胞展現較高細胞毒性。在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養T細胞持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現小規模培養中之T細胞轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500 MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之T細胞持續約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之第一小規模培養中培養T細胞持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自第一小規模培養之T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之T細胞部分係在第二小規模培養中培養約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養T細胞持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之T細胞部分係在較大規模培養中培養約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養T細胞持續約4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之T細胞轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500 MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之T細胞部分係在較大規模培養中培養約5天之時期。

在一些實施例中，在快速擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL。在一些實施例中，在快速擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL、至少10 ⁹個TIL或至少10 ¹⁰個TIL。在一例示性實施例中，各第二容器包含至少10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，在快速擴增完成之後，該複數個亞群包含治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速擴增完成之後，將一或多個TIL亞群匯集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速擴增完成之後，各TIL亞群包含治療有效量之TIL。

在一些實施例中，在分成複數個步驟之前，執行快速擴增持續約1至5天之時期。在一些實施例中，快速擴增之分開發生在起始快速擴增之後約第1天、第2天、第3天、第4天或第5天。

在一些實施例中，快速擴增之分開發生在起始第一次擴增( 亦即，REP前擴增)之後約第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天。在一例示性實施例中，快速擴增之分開發生在起始啟動性第一次擴增之後約第10天。在另一例示性實施例中，快速擴增之分開發生在起始啟動性第一次擴增之後約第11天。

在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速擴增持續約4至11天之時期。在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速擴增持續約3天、4天天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時期。

在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速擴增之細胞培養基不同的組分。

在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC。

在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。

在一些實施例中，在分開之後用於快速擴增之細胞培養基包含IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速擴增之細胞培養基包含IL-2及OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及視情況選用之OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速擴增之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之後用於快速擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速擴增之細胞培養基而生成。

在一些實施例中，快速擴增之分開發生在密閉系統中。

在一些實施例中，在快速擴增期間TIL培養之規模縱向擴大包括將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中(亦稱作餵養TIL)。在一些實施例中，該餵養包括頻繁地將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中。在一些實施例中，該餵養包括以規則時間間隔將新鮮細胞培養基添加至TIL培養中。在一些實施例中，經由恆定流向TIL供應新鮮細胞培養基。在一些實施例中，諸如Xuri W25之自動化細胞擴增系統用於快速擴增及餵養。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化開始降低、趨緩、衰退或消退之後執行。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化已降低達或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化已降低在或約1%至100%範圍內的百分率之後執行。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化已降低在或約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%範圍內的百分率之後執行。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化已降低至少為或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99%之後執行。

在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化已降低至多為或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。

在一些實施例中，藉由啟動性第一次擴增所實現之T細胞活化之降低係藉由T細胞回應於抗原刺激所釋出之干擾素γ之量的減少來確定。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在至多為或約7天或約8天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在至多為或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在至多為或約11天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在至多為或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在自在或約1天至在或約7天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在自在或約1天至在或約11天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在至多為或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在至多為或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或約11天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在自在或約1天至在或約8天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在自在或約1天至在或約9天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在8天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在9天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在自在或約1天至在或約7天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在自在或約1天至在或約9天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞之啟動性第一次擴增係在7天之時期內執行且T細胞之快速第二次擴增係在9天之時期內執行。

在一些實施例中，T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。

在一些實施例中，T細胞為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。

在一些實施例中，T細胞為周邊血淋巴細胞(PBL)。

在一些實施例中，T細胞獲自罹患癌症之供體。

在一些實施例中，T細胞係獲自罹患癌症之患者所切除之腫瘤的TIL。

在一些實施例中，T細胞係獲自罹患血液惡性病之患者之骨髓的MIL。

在一些實施例中，T細胞係獲自來自供體之周邊血單核細胞(PBMC)之PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。

在本發明之某些態樣中，可使用熟練技術人員已知之多種技術，諸如FICOLL分離，自一單位的自個體收集之血液獲得免疫效應子細胞(例如T細胞)。在一較佳態樣中，來自個體之循環血液中之細胞係藉由單採獲得。單采產物一般含有淋巴細胞，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，可洗滌藉由單采所收集之細胞以移除血漿部分且視情況將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌細胞。在一替代實施例中，該洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若非所有)二價陽離子。在一態樣中，自周邊血淋巴細胞分離T細胞，其中例如藉由離心通過PERCOLL梯度或藉由逆流離心淘析來溶解紅血球且耗盡單核球。

在一些實施例中，T細胞係自供體之全血或富含淋巴細胞之單采產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。在一些實施例中，藉由使用正向或負向選擇方法自全血或富含淋巴細胞之單采產物分離PBL，亦即，使用T細胞表型標誌物(例如CD3+ CD45+)移出PBL，或移除非T細胞表型細胞而留下PBL。在其他實施例中，藉由梯度離心分離PBL。在分離來自供體組織之PBL後，可根據本文所述之任何方法中的啟動性第一次擴增步驟，藉由將合適數目之經分離PBL (在一些實施例中，大約1×10 ⁷個PBL)接種於啟動性第一次擴增培養中來起始PBL之啟動性第一次擴增。

含有此等特徵中之一些的例示性TIL過程(稱為過程3，本文中亦稱為Gen 3)係描繪於圖8 (詳言之，例如圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中，且本發明之此實施例的一些相較於Gen 2之優勢係描述於圖1、2、8、30及31 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中。Gen 3之實施例顯示於圖1、8及30 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中。過程2A或Gen 2或Gen 2A亦描述於美國專利公開案第2018/0280436號中，該案以引用之方式整體併入本文中。Gen 3過程亦描述於國際專利公開案WO 2020/096988中。

如本文中所論述及大致概述，TIL取自患者樣品且使用本文所述且稱為Gen 3之TIL擴增過程進行操縱以在移植至患者中之前擴增其數目。在一些實施例中，TIL可如下文所論述視情況經基因操縱。在一些實施例中，TIL可在擴增之前或之後經冷凍保存。一旦解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加其代謝。

在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，啟動性第一次擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所示之過程)縮短至1-8天且快速第二次擴增(包括本文中稱為快速擴增方案(REP)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所示之過程)縮短至1-9天。在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，啟動性第一次擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所示之過程)縮短至1-8天且快速第二次擴增(包括本文中稱為快速擴增方案(REP)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所示之過程)縮短至1-8天。在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，啟動性第一次擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖7C及/或圖8D)步驟B所示之過程)縮短至1-7天且快速第二次擴增(包括本文中稱為快速擴增方案(REP)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所示之過程)縮短至1-9天。在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，啟動性第一次擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖1B及/或圖8C)步驟B所示之過程)為1-7天且快速第二次擴增(包括本文中稱為快速擴增方案(REP)之過程以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所示之過程)為1-10天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)縮短至8天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為7-9天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為8天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為8-9天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)縮短至7天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為7-8天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)縮短至8天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為8天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為8天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為9天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為8天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為10天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為7天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為7-10天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為7天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為8-10天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)為7天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為9-10天。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B所述之擴增)縮短至7天且快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所述之擴增)為7-9天。在一些實施例中，如下文以及實例及圖式中詳細論述，啟動性第一次擴增與快速第二次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖1B及/或圖8C)步驟B及步驟D所述之擴增)之組合為14-16天。詳言之，考慮本發明之某些實施例包含啟動性第一次擴增步驟，其中藉由在IL-2存在下暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露於抗原來活化TIL。在某些實施例中，如上文所述在啟動性第一次擴增步驟中經活化之TIL為第一TIL群體，亦即，其為原代細胞群體。

下文「步驟」名稱A、B、C等係參考圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之非限制性實例且參考本文所述之某些非限制性實施例。下文及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟的排序為例示性的且本申請案及本文所揭示之方法考慮了步驟之任何組合或次序，以及額外步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣品

一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣品(「原代TIL」)或獲自循環淋巴細胞，諸如周邊血淋巴細胞，包括具有TIL樣特徵之周邊血淋巴細胞，且接著擴增成較大群體以進行如本文所述之進一步操縱，視情況經冷凍保存，且視情況評估表型及作為TIL健康之指標的代謝參數。

患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，通常經由手術切除、針刺活組織檢查或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品之手段。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。該實體腫瘤可屬於任何癌症類型，包括但不限於乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸部癌(包括例如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，有用之TIL係獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為據報道此等腫瘤具有尤其高水準之TIL。

一旦獲得，腫瘤樣品通常使用銳器解剖經片段化成介於1至約8 mm ³之間之小塊，其中約2-3 mm ³為尤其有用的。使用酶促腫瘤消化物由此等片段培養TIL。此類腫瘤消化物可藉由在酶培養基( 例如，Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL正大黴素、30單位/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶)中培育，隨後機械解離( 例如使用組織解離器)而產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤置於酶培養基中且機械解離腫瘤持續大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直至僅小組織塊存在而產生。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死亡細胞，則可使用FICOLL分支鏈親水性多醣來執行密度梯度分離以移除此等細胞。可使用此項技術中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所述之彼等，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法均可用於本文所述之任何實施例中的擴增TIL之方法或治療癌症之方法。

如上文所指示，在一些實施例中，TIL係衍生自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化。在一些實施例中，實體腫瘤未經片段化且以全腫瘤進行酶促消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO ₂下消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在包含膠原酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO ₂及旋轉下消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤在恒定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤在37℃、5% CO ₂及恒定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，全腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。

在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000IU/mL 10X工作儲備液。

一般而言，獲自腫瘤之細胞懸浮液係稱為「原代細胞群體」或「新鮮收集之」或「新鮮分離之」細胞群體。在某些實施例中，使新鮮獲得之TIL細胞群體暴露於包含抗原呈遞細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。

在一些實施例中，片段化包括物理片段化，包括例如解剖以及消化。在一些實施例中，片段化為物理片段化。在一些實施例中，片段化為解剖。在一些實施例中，片段化係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶促腫瘤消化物及腫瘤片段培養。

在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在例如步驟A (如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供)中獲得腫瘤樣品後，對腫瘤進行物理片段化。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，片段化發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，片段化發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，片段化之步驟為 活體外或離體過程。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將10、20、30、40或更多個片段或塊置於各容器進行啟動性第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將30或40個片段或塊置於各容器進行啟動性第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤片段化且將40個片段或塊置於各容器進行啟動性第一次擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm ³之體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm ³至約1500 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm ³。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。

在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器解剖獲得。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm ³與10 mm ³之間。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm ³與8 mm ³之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm ³。在一些實施例中，腫瘤片段為1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為1 mm × 1 mm × 1 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為2 mm × 2 mm × 2 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為3 mm × 3 mm × 3 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為4 mm × 4 mm × 4 mm。

在一些實施例中，將腫瘤片段化以便使各塊上之出血性、壞死及/或脂肪組織之量降至最低。在一些實施例中，將腫瘤片段化以便使各塊上之出血性組織之量降至最低。在一些實施例中，將腫瘤片段化以便使各塊上之壞死組織之量降至最低。在一些實施例中，將腫瘤片段化以便使各塊上之脂肪組織之量降至最低。在某些實施例中，腫瘤片段化之步驟為 活體外或離體方法。

在一些實施例中，執行腫瘤片段化以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，在不使用解剖刀執行鋸切動作之情況下執行腫瘤片段化。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL正大黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶之酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而生成。在將腫瘤置於酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，且接著再次機械破壞該溶液持續大約1分鐘。在37℃下在5% CO ₂中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次持續大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若大塊組織仍然存在，則向樣品施加1或2次額外機械解離，再在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘或不再培育。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量之紅血球或死亡細胞，則可使用Ficoll來執行密度梯度分離以移除此等細胞。

在一些實施例中，將啟動性第一次擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「原代細胞群體」或「新鮮獲得之」或「新鮮分離之」細胞群體。

在一些實施例中，細胞可在樣品分離後( 例如，在獲得腫瘤樣品後及/或在獲得來自腫瘤樣品之細胞懸浮液後)視情況冷凍且在進入步驟B所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟B在下文中更詳細描述且在圖8 (詳言之，例如圖8B)中例示。 1. 粗針 / 小活組織檢查源性 TIL

在一些實施例中，TIL最初獲自藉由粗針活組織檢查或類似程序獲得的患者腫瘤樣品(「原代TIL」)且接著擴增成較大群體以進行如本文所述之進一步操縱，視情況經冷凍保存，且視情況評估表型及代謝參數。

在一些實施例中，患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，通常經由小活組織檢查、粗針活組織檢查、針刺活組織檢查或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品之手段。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。在一些實施例中，樣品可來自多個小腫瘤樣品或活組織檢查。在一些實施例中，樣品可包含來自同一患者之單一腫瘤的多個腫瘤樣品。在一些實施例中，樣品可包含來自同一患者之一個、兩個、三個或四個腫瘤的多個腫瘤樣品。在一些實施例中，樣品可包含來自同一患者之多個腫瘤的多個腫瘤樣品。實體腫瘤可為肺及/或非小細胞肺癌(NSCLC)。

一般而言，獲自腫瘤核心或片段之細胞懸浮液係稱為「原代細胞群體」或「新鮮收集之」或「新鮮分離之」細胞群體。在某些實施例中，使新鮮獲得之TIL細胞群體暴露於包含抗原呈遞細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。

在一些實施例中，若腫瘤為轉移性的且過去已有效地處理/移除原發性病變，則可需要移除一個轉移性病變。在一些實施例中，微創方法係移除皮膚病變，或當可用時移除頸部或腋窩區域上之淋巴結。在一些實施例中，移除皮膚病變或移除其小活組織檢查。在一些實施例中，移除淋巴結或其小活組織檢查。在一些實施例中，腫瘤為黑色素瘤。在一些實施例中，黑色素瘤之小活組織檢查包含黑痣或其部分。

在一些實施例中，小活組織檢查為穿刺活組織檢查。在一些實施例中，用按壓至皮膚中之圓形刀片獲得穿刺活組織檢查。在一些實施例中，用按壓至圍繞可疑黑痣之皮膚中之圓形刀片獲得穿刺活組織檢查。在一些實施例中，用按壓至皮膚中之圓形刀片獲得穿刺活組織檢查，且移除一塊圓形皮膚。在一些實施例中，小活組織檢查為穿刺活組織檢查且移除腫瘤之圓形部分。

在一些實施例中，小活組織檢查為切除活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切除活組織檢查且移除整個黑痣或生長。在一些實施例中，小活組織檢查為切除活組織檢查且移除整個黑痣或生長，連同正常出現之皮膚的小邊界。

在一些實施例中，小活組織檢查為切口活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切口活組織檢查且僅取得黑痣或生長之最不規則部分。在一些實施例中，小活組織檢查為切口活組織檢查且當無法完成其他技術時，諸如若可疑黑痣極大，則使用切口活組織檢查。

在一些實施例中，小活組織檢查為肺活組織檢查。在一些實施例中，藉由支氣管鏡檢查獲得小活組織檢查。通常在支氣管鏡檢查中，將患者置於麻醉下，且一個小工具穿過鼻子或嘴，沿喉嚨向下，且進入支氣管通道中，在此處使用小工具來移除小組織。在其中經由支氣管鏡檢查無法到達腫瘤或生長之一些實施例中，可採用經胸針刺活組織檢查。通常對於經胸針刺活組織檢查，患者亦處於麻醉下且將針直接通過皮膚插入可疑位點以移除一小塊組織樣品。在一些實施例中，經胸針刺活組織檢查可需要介入放射學(例如，使用x射線或CT掃描來引導該針)。在一些實施例中，藉由針刺活組織檢查獲得小活組織檢查。在一些實施例中，用內窺鏡超音波(例如，具有光之內窺鏡且通過嘴置於食道中)獲得小活組織檢查。在一些實施例中，手術獲得小活組織檢查。

在一些實施例中，小活組織檢查為頭頸部活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切口活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切口活組織檢查，其中自異常外觀區域切下一小塊組織。在一些實施例中，若該異常區域容易進入，則可取得樣品而無需住院。在一些實施例中，若腫瘤在嘴或喉嚨內部較深處，則可需要在手術室中在全身麻醉下進行活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切除活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為切除活組織檢查，其中移除整個區域。在一些實施例中，小活組織檢查為細針抽吸(FNA)。在一些實施例中，小活組織檢查為細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之極細針自腫瘤或腫塊提取(抽吸)細胞。在一些實施例中，小活組織檢查為穿刺活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為穿刺活組織檢查，其中使用咬取鉗來移除一塊可疑區域。

在一些實施例中，小活組織檢查為子宮頸活組織檢查。在一些實施例中，經由陰道鏡檢查獲得小活組織檢查。一般而言，陰道鏡檢查方法使用附接至放大雙目鏡(陰道鏡)之照明放大儀，接著使用該照明放大儀對子宮頸表面之一小部分進行活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為錐形切除術/錐形活組織檢查。在一些實施例中，小活組織檢查為錐形切除術/錐形活組織檢查，其中可需要門診手術自子宮頸移除一塊較大組織。在一些實施例中，錐形活組織檢查除了幫助確認診斷以外，錐形活組織檢查亦可用作出初始治療。

術語「實體腫瘤」係指異常組織塊，其通常不含囊腫或液體區域。實體腫瘤可為良性或惡性的。術語「實體腫瘤癌係指惡性、腫瘤性或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌包括肺癌。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)。實體腫瘤之組織結構包括相互依賴之組織隔室，包括實質(癌細胞)及其中分散有癌細胞且可提供支持性微環境之支持性基質細胞。

在一些實施例中，來自腫瘤之樣品作為細針抽吸物(FNA)、粗針活組織檢查、小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)獲得。在一些實施例中，首先將樣品置於G-REX-10中。在一些實施例中，當存在1或2個粗針活組織檢查及/或小活組織檢查樣品時，首先將樣品置於G-REX-10中。在一些實施例中，當存在3、4、5、6、8、9或10個粗針活組織檢查及/或小活組織檢查樣品時，首先將樣品置於G-REX-100中。在一些實施例中，當存在3、4、5、6、8、9或10個粗針活組織檢查及/或小活組織檢查樣品時，首先將樣品置於G-REX-500中。

FNA可獲自皮膚腫瘤，包括例如黑色素瘤。在一些實施例中，FNA係獲自皮膚腫瘤，諸如來自患有轉移性黑色素瘤之患者的皮膚腫瘤。在一些情況下，患有黑色素瘤之患者先前已經歷手術治療。

FNA可獲自肺腫瘤，包括例如NSCLC。在一些實施例中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自患有非小細胞肺癌(NSCLC)之患者的肺腫瘤。在一些情況下，患有NSCLC之患者先前已經歷手術治療。

本文所述之TIL可獲自FNA樣品。在一些情況下，使用介於18號針至25號針範圍內之細規格針自患者獲得或分離FNA樣品。該細規格針可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施例中，來自患者之FNA樣品可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多TIL。

在一些情況下，本文所述之TIL係獲自粗針活組織檢查樣品。在一些情況下，使用介於11號針至16號針範圍內之手術或醫用針自患者獲得或分離粗針活組織檢查樣品。該針可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施例中，來自患者之粗針活組織檢查樣品可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多TIL。

在一些實施例中，TIL並未獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，實體腫瘤核心未經片段化。

在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL正大黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶之酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而生成。在將腫瘤置於酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘，且接著再次機械破壞該溶液持續大約1分鐘。在37℃下在5% CO ₂中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次持續大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若大塊組織仍然存在，則向樣品施加1或2次額外機械解離，再在37℃下在5% CO ₂中培育30分鐘或不再培育。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量之紅血球或死亡細胞，則可使用Ficoll來執行密度梯度分離以移除此等細胞。

在一些實施例中，獲得第一TIL群體包括多病變取樣方法。

在一些實施例中，解離酶係自凍乾之酶重構。在一些實施例中，凍乾之酶係以一定量之無菌緩衝液(諸如漢克氏平衡鹽溶液(HBSS))重構。

在一些實施例中，DNA酶I係以1 mL之無菌HBSS或另一緩衝液重構。凍乾之儲備酶之濃度為4 KU/小瓶。在一些實施例中，在重構後，DNA酶I儲備介於約1 KU/mL至10 KU/mL範圍內，例如約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。

在一些實施例中，酶儲備液可能變化，從而驗證凍乾之儲備液的濃度且相應地修改添加至消化混合液中之酶的最終量

在一些實施例中，酶混合物包括在約4.7 mL無菌HBSS中之約10.2-ul中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3-ul膠原酶(1.2 PZ/mL)及250-ul DNA酶I (200 U/mL)。 2. 胸腔積液 T 細胞及 TIL

在一些實施例中，可採用任何疑似及/或含有TIL之胸膜液或胸腔積液。此類樣品可源自原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣品可為源自另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發性轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法之樣品為胸膜滲出液。在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法之樣品為胸膜漏出液。其他生物樣品可包括其他含有TIL之漿液，包括例如腹部之腹水或胰囊腫液。腹水及胸膜液涉及極類似之化學系統；腹部及肺部皆具有間皮細胞株且在惡性病中以相同情況在胸膜空間及腹部空間形成流體且此類流體在一些實施例中含有TIL。在一些實施例中，其中本揭示案以胸膜液為例，可使用含有TIL之腹水或其他囊腫液執行相同方法以得到類似結果。

在一些實施例中，胸膜液係呈直接自患者移出之未處理形式。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未處理之胸膜液置於標準血液收集管(諸如EDTA或肝素管)中。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未處理之胸膜液置於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，自患者收集之後立即將樣品置於CellSave管中以避免活TIL之數目降低。若留在未處理之胸膜液中，即使在4℃下，活TIL之數目亦可在24小時內降低至顯著程度。在一些實施例中，在自患者移出之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內，將樣品置於適當收集管中。在一些實施例中，在4℃下自患者移出之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內，將樣品置於適當收集管中。

在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液樣品。在一些實施例中，在接觸步驟中使用之胸膜液樣品係藉由使液體經由含有已知且基本上一致孔徑以允許胸膜液藉由膜但保留腫瘤細胞之過濾器過濾來製備。在一些實施例中，膜中之孔之直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔直徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中可為6、7、8、9或10 μM中任一者。在過濾之後，可將由膜保留之細胞(包括TIL)沖洗脫離膜至合適生理學上可接受之緩衝液中。以此方式濃縮之細胞(包括TIL)接著可用於該方法之接觸步驟中。

在一些實施例中，使胸膜液樣品(包括例如未處理之胸膜液)、經稀釋之胸膜液或再懸浮細胞集結粒與差別性溶解存在於樣品中之無核紅血球之溶解試劑接觸。在一些實施例中，此步驟係在其中胸膜液含有大量RBC之情況下在進一步處理步驟之前執行。合適溶解試劑包括單一溶解試劑或溶解試劑及淬滅試劑或溶解劑、淬滅試劑及固定試劑。合適溶解系統在市面上有售且包括BD Pharm Lyse™系統(Becton Dickenson)。其他溶解系統包括Versalyse™系統、FACSlyse™系統(Becton Dickenson)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter, Inc.)或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求為有效溶解紅血球及保留胸膜液中之TIL及TIL之表型性質而異。除了採用單一溶解試劑之外，可用於本文所述之方法中的溶解系統亦可包括第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或阻滯溶解試劑之效應者，例如Stabilyse™試劑(Beckman Coulter, Inc.)。取決於溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施，亦可採用習知固定試劑。

在一些實施例中，如上文所述之未處理、經稀釋或經多次離心或處理之胸膜液樣品在經進一步處理及/或本文所提供之擴增之前係在約−140℃之溫度下冷凍保存。 3. 自周邊血擴增周邊血淋巴細胞 (PBL) 之方法

PBL方法1。在本發明之一些實施例中，使用本文所述之方法來擴增PBL。在本發明之一些實施例中，該方法包括自全血獲得PBMC樣品。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+部分之負向選擇自PBMC分離純T細胞來富集T細胞。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+部分之基於磁性珠粒之負向選擇自PBMC分離純T細胞來富集T細胞。

在本發明之一些實施例中，如下執行PBL方法1：在第0天，使冷凍保存之PBMC樣品解凍且對PBMC計數。使用人類全T細胞分離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)來分離T細胞。

PBL方法2。在本發明之一些實施例中，使用PBL方法2來擴增PBL，該方法包括自全血獲得PBMC樣品。藉由在37℃下培育PBMC持續至少三小時且接著分離非黏附細胞來富集來自PBMC之T細胞。

在本發明之一些實施例中，如下執行PBL方法2：在第0天，使冷凍保存之PBMC樣品解凍且在6孔板中之CM-2培養基中以6百萬個細胞/孔接種PBMC細胞且在37℃下培育3小時。在3小時後，移除作為PBL之非黏附細胞且計數。

PBL方法3。在本發明之一些實施例中，使用PBL方法3來擴增PBL，該方法包括自周邊血獲得PBMC樣品。使用CD19+選擇來分離B細胞且使用PBMC樣品之非CD19+部分的負向選擇來選擇T細胞。

在本發明之一些實施例中，如下執行PBL方法3：在第0天，使源自周邊血之冷凍保存之PBMC解凍且計數。使用人類CD19多次分選套組(Miltenyi Biotec)來分選CD19+ B細胞。在非CD19+細胞部分中，使用人類全T細胞分離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)來純化T細胞。

在一些實施例中，自全血樣品分離PBMC。在一些實施例中，將PBMC樣品用作起始材料以擴增PBL。在一些實施例中，在擴增過程之前冷凍保存樣品。在其他實施例中，將新鮮樣品用作起始材料以擴增PBL。在本發明之一些實施例中，使用此項技術中已知之方法自PBMC分離T細胞。在一些實施例中，使用人類全T細胞分離套組及LS管柱來分離T細胞。在本發明之一些實施例中，使用此項技術中已知之抗體選擇方法(例如，CD19負向選擇)自PBMC分離T細胞。

在本發明之一些實施例中，在所需溫度下培育PBMC樣品持續一段時期以有效鑑別非黏附細胞。在本發明之一些實施例中，培育時間為約3小時。在本發明之一些實施例中，溫度為約37℃。接著使用上文所述之過程來擴增非黏附細胞。

在一些實施例中，PBMC樣品係來自視情況已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理的個體或患者。在一些實施例中，腫瘤樣品係來自已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理的個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣品係來自已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理、已經歷治療持續至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或更久之個體或患者。在其他實施例中，PBMC係源自目前接受ITK抑制劑方案(諸如依魯替尼)之患者。

在一些實施例中，PBMC樣品係來自已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理且對激酶抑制劑或ITK抑制劑(諸如依魯替尼)之治療呈現難治性的個體或患者。

在一些實施例中，PBMC樣品係來自已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理、但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑之治療的個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣品係來自已經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案預處理、但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑之治療且已持續至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或更久未接受治療之個體或患者。在其他實施例中，PBMC係源自先前已暴露於ITK抑制劑、但在至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少1年內未接受治療之患者。

在本發明之一些實施例中，在第0天，針對CD19+選擇細胞且相應地進行分選。在本發明之一些實施例中，使用抗體結合珠粒進行選擇。在本發明之一些實施例中，在第0天，自PBMC分離純T細胞。

在本發明之一些實施例中，對於未經依魯替尼或其他ITK抑制劑預處理之患者，10-15 mL膚色血球層將產生約5×10 ⁹個PBMC，其又將產生約5.5×10 ⁷個PBL。

在本發明之一些實施例中，對於未經依魯替尼或其他ITK抑制劑預處理之患者，該擴增過程將產生約20×10 ⁹個PBL。在本發明之一些實施例中，40.3×10 ⁶個PBMC將產生約4.7×10 ⁵個PBL。

在任何前述實施例中，PBMC可源自全血樣品，藉由單采得到，源自膚色血球層，或由此項技術中已知用於獲得PBMC之任何其他方法得到。

在一些實施例中，使用美國專利申請公開案第US 2020/0347350 A1號中所述之方法來製備PBL，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 4. 自源自骨髓之 PBMC 擴增骨髓浸潤性淋巴細胞 (MIL) 之方法

MIL方法3。在本發明之一些實施例中，該方法包括自骨髓獲得PBMC。在第0天，針對CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+選擇PBMC且進行分選，且對非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+細胞部分進行音波處理且將經音波處理之細胞部分的一部分添加回所選擇之細胞部分中。

在本發明之一些實施例中，如下執行MIL方法3：在第0天，使冷凍保存之PBMC樣品解凍且對PBMC計數。用CD3、CD33、CD20及CD14抗體對細胞染色且使用經分選之S3e細胞(Bio-Rad)進行分選。將細胞分選成兩個部分，即免疫細胞部分(或MIL部分) (CD3+CD33+ CD20+CD14+)及AML母細胞部分(非CD3+CD33+CD20+ CD14+)。

在本發明之一些實施例中，自骨髓獲得PBMC。在一些實施例中，經由單采、抽吸、針刺活組織檢查或此項技術中已知之其他類似手段自骨髓獲得PBMC。在一些實施例中，PBMC為新鮮的。在其他實施例中，PBMC係經冷凍保存。

在本發明之一些實施例中，自10-50 mL骨髓抽吸物擴增MIL。在本發明之一些實施例中，自患者獲得10 mL骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得20 mL骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得30 mL骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得40 mL骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得50 mL骨髓抽吸物。

在本發明之一些實施例中，自約10-50 mL骨髓抽吸物產生之PBMC的數目為約5×10 ⁷至約10×10 ⁷個PBMC。在其他實施例中，所產生之PBMC的數目為約7×10 ⁷個PBMC。

在本發明之一些實施例中，約5×10 ⁷至約10×10 ⁷個PBMC產生約0.5×10 ⁶至約1.5×10 ⁶個MIL。在本發明之一些實施例中，產生約1×10 ⁶個MIL。

在本發明之一些實施例中，源自骨髓抽吸物之12×10 ⁶個PBMC產生大約1.4×10 ⁵個MIL。

在任何前述實施例中，PBMC可源自全血樣品，源自骨髓，藉由單采得到，源自膚色血球層，或由此項技術中已知用於獲得PBMC之任何其他方法得到。

在一些實施例中，使用美國專利申請公開案第US 2020/0347350 A1號中所述之方法來製備MIL，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 B. 步驟 B ：啟動性第一次擴增

在一些實施例中，本發明方法提供較年輕TIL，該等較年輕TIL相較於較老TIL (亦即，在投與至個體/患者之前已進一步經歷更多輪複製之TIL)可能提供額外治療益處。年輕TIL之特徵已描述於文獻中，例如描述於Donia 等人, Scand. J. Immunol. 2012 , 75,157-167；Dudley 等人, Clin. Cancer Res. 2010 , 16,6122-6131；Huang 等人, J. Immunother. 2005 , 28, 258-267；Besser 等人, Clin. Cancer Res. 2013 , 19, OF1-OF9；Besser 等人, J. Immunother. 2009, 32,415-423；Robbins 等人, J. Immunol. 2004, 173,7125-7130；Shen 等人, J. Immunother., 2007 , 30,123-129；Zhou 等人, J. Immunother. 2005 , 28,53-62；及Tran 等人, J. Immunother., 2008, 31, 742-751中，各案以引用之方式併入本文中。

在例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C)步驟A所述之解剖或消化腫瘤片段及/或腫瘤片段之後，在有利於TIL但不利於腫瘤及其他細胞生長之條件下在含有IL-2、OKT-3及餵養細胞( 例如，抗原呈遞餵養細胞)之血清中培養所得細胞。在一些實施例中，在培養起始時添加IL-2、OKT-3及餵養細胞，連同腫瘤消化物及/或腫瘤片段( 例如，在第0天)。在一些實施例中，在具有多達60個片段/容器且具有6000 IU/mL IL-2之容器中培育腫瘤消化物及/或腫瘤片段。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養數天之時期(通常1-8天)，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養數天之時期(通常1-7天)，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，啟動性第一次擴增持續1-8天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，啟動性第一次擴增持續1-7天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續5-8天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續5-7天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續約6-8天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續約6-7天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續約7-8天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續約7天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此啟動性第一次擴增持續約8天之時期，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。

在一些實施例中，TIL之擴增可使用如以下及本文所述之啟動性第一次擴增步驟(例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等，其可包括稱為REP前或啟動性REP之過程且其含有來自第0天及/或來自培養起始的餵養細胞)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述之快速第二次擴增(步驟D，包括稱為快速擴增方案(REP)步驟之過程)，隨後執行視情況選用的冷凍保存，且隨後執行如以下及本文所述之第二步驟D (包括稱為再刺激REP步驟之過程)。可視情況表徵獲自此過程之TIL的如本文所述之表型特徵及代謝參數。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm ³與10 mm ³之間。

在一些實施例中，第一次擴增培養基係稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL正大黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。

在一些實施例中，存在少於或等於240個腫瘤片段。在一些實施例中，少於或等於240個腫瘤片段置於少於或等於4個容器中。在一些實施例中，該等容器為GREX100 MCS燒瓶。在一些實施例中，將少於或等於60個腫瘤片段置於1個容器中。在一些實施例中，各容器包含少於或等於500 mL培養基/容器。在一些實施例中，培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，培養基包含抗原呈遞餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)。在一些實施例中，培養基包含2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含30 ng/mL OKT-3/容器。在一些實施例中，該容器為GREX100 MCS燒瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2、30 ng OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。

在製備腫瘤片段後，在有利於TIL但不利於腫瘤及其他細胞生長且允許TIL啟動及自第0天之培養起始加速生長之條件下在含有IL-2、抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之培養基中培養所得細胞( 亦即，作為原代細胞群體之片段)。在一些實施例中，用6000 IU/mL IL-2以及抗原呈遞餵養細胞及OKT-3培育腫瘤消化物及/或腫瘤片段。將此原代細胞群體培養數天之時期(通常1-8天)，導致通常約1×10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間之生長培養基包含IL-2或其變異體，以及抗原呈遞餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，將此原代細胞群體培養數天之時期(通常1-7天)，導致通常約1 × 10 ⁸個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間之生長培養基包含IL-2或其變異體，以及抗原呈遞餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，IL-2為重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，用於1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 ⁶IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 ⁶IU/mg之IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 ⁶IU/mg之IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 ⁶IU/mg之IL-2之最終濃度。在一些實施例中，如實例C所述來製備IL-2儲備液。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL IL-2。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基進一步包含IL-15。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於15 ng/mL與約30 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。參見例如表1。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變異體、生物類似物及組合組成之群。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。

在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，啟動性第一次擴增細胞培養基進一步包含初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，啟動性第一次擴增細胞培養基進一步包含初始濃度為約6000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基係稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其係稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL正大黴素之含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在一些實施例中，CM係實例中所述之CM1。在一些實施例中，啟動性第一次擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，啟動性第一次擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞餵養細胞(本文中亦稱為餵養細胞)。

在一些實施例中，描述於Smith 等人, Clin. Transl. Immunology, 4(1), 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中之成分確定之培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用作基礎細胞培養基，且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為1-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為2-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為3-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為4-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為5-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為6-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖1 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所提供之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為7-8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所提供之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖7C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為1-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖7C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為2-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖7C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為3-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖7C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為4-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8B及/或圖8C)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為5-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為6-7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，啟動性第一次擴增(包括例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所提供之彼等過程的過程，其可包括有時稱為REP前或啟動性REP之彼等過程)過程為7天，如實例及圖式中所論述。

在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行1天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行1天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行2天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行2天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行3天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行3天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行4天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行4天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行5天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行5天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行6天至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行6天至7天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行7至8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行8天。在一些實施例中，啟動性第一次TIL擴增可自片段化發生時及/或自第一啟動性擴增步驟起始時進行7天。

在一些實施例中，TIL之啟動性第一次擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在啟動性第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可包括於啟動性第一次擴增期間，例如包括於根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及本文所述之步驟B過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在啟動性第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可包括於根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)且如本文所述之步驟B過程期間。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增(例如，根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用之生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，所採用之生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用之生物反應器為G-REX-10。 1. 餵養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第4-8天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第4-7天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第5-8天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第5-7天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第6-8天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第6-7天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第7天或第8天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第7天期間的任何時間進行添加。在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)，而是在啟動性第一次擴增期間在第8天期間的任何時間進行添加。

在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8B)步驟B中所述之彼等以及稱為REP前或啟動性REP之彼等的擴增)在TIL擴增起始時且在啟動性第一次擴增期間需要餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)。在許多實施例中，餵養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間使用2.5 × 10 ⁸個餵養細胞。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間使用2.5 × 10 ⁸個餵養細胞/容器。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間使用2.5 × 10 ⁸個餵養細胞/GREX-10。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間使用2.5 × 10 ⁸個餵養細胞/GREX-100。

在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在啟動性第一次擴增之第0天置於培養中之初始活細胞數目，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。

在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養之活細胞的總數未自在啟動性第一次擴增之第0天置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養之活細胞的總數未自在啟動性第一次擴增之第0天置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在10-50 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在20-40 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在25-35 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為人工抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:50及1:300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:100與1:200之間。

在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約100 × 10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約50 × 10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約25 × 10 ⁶個TIL。在其他實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞。在其他實施例中，啟動性第一次擴增需要快速第二次擴增中所用之餵養細胞的數目之四分之一、三分之一、十二分之五或一半。

在一些實施例中，啟動性第一次擴增中之培養基包含IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增中之培養基包含6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，啟動性第一次擴增中之培養基包含抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，啟動性第一次擴增中之培養基包含2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，啟動性第一次擴增中之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含30 ng OKT-3/容器。在一些實施例中，該容器為GREX100 MCS燒瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基及15 µg OKT-3/2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基及15 µg OKT-3/容器。在一些實施例中，該容器為GREX100 MCS燒瓶。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基、6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基、6000 IU/mL IL-2、15 µg OKT-3及2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基及15 µg OKT-3/2.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。

在一些實施例中，本文所述之啟動性第一次擴增程序在第二次擴增期間需要相較於TIL過量之餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈遞(aAPC)細胞來替代PBMC。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增中使用人工抗原呈遞細胞來替換PBMC或與PBMC組合。 2. 細胞介素及其他添加劑

或者，使用細胞介素之組合來進行TIL之啟動性第一次擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或兩者以上的組合係如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能之組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中最後一種組合在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特定地有利於生成淋巴細胞，且詳言之如其中所述之T細胞。參見例如表2。

在一些實施例中，步驟B亦可包括將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟B亦可包括將4-1BB促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟B亦可包括將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。另外，諸如過氧化物酶體增生物活化受體γ共活化劑I-α促效劑(包括增生物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如四氫噻唑二酮化合物)之添加劑可用於步驟B期間之培養基，如美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 C. 步驟 C ：啟動性第一次擴增至快速第二次擴增之轉變

在一些情況下，獲自啟動性第一次擴增(其可包括有時稱為REP前之擴增)之主體TIL群體(包括例如獲自例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示之步驟B的TIL群體)可進行快速第二次擴增(其可包括有時稱為快速擴增方案(REP)之擴增)且接著如下文所論述進行冷凍保存。同樣，在其中經基因修飾之TIL將用於療法中之情況中，來自啟動性第一次擴增之經擴增TIL群體或來自快速第二次擴增之經擴增TIL群體可在擴增步驟之前或在啟動性第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。

在一些實施例中，獲自啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示之步驟B)之TIL係經儲存直至為了選擇而分析表型。在一些實施例中，獲自啟動性第一次擴增(例如，圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示之步驟B)之TIL未進行儲存且直接進行快速第二次擴增。在一些實施例中，獲自啟動性第一次擴增之TIL在啟動性第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前未進行冷凍保存。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在腫瘤片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約3天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約3天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約4天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約4天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約5天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約5天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約6天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約6天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約7天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之約8天。

在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之1天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之1天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之2天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之2天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之3天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之3天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之4天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之4天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之5天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之5天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之6天至7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之6天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之7天至8天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之7天。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增發生在片段化發生後及/或第一啟動性擴增步驟起始後之8天。

在一些實施例中，TIL在初級第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前未進行儲存，且TIL直接進行快速第二次擴增(例如，在一些實施例中，在如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示之自步驟B至步驟D之轉變期間並未進行儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自啟動性第一次擴增之TIL (第二TIL群體)直接進行快速第二次擴增而無轉變期。

在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增(例如，根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如GREX-10或GREX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。在一些實施例中，自啟動性第一次擴增轉變至快速第二次擴增涉及容器大小之規模縱向擴大。在一些實施例中，啟動性第一次擴增係在比快速第二次擴增小之容器中執行。在一些實施例中，啟動性第一次擴增係在GREX-100中執行且快速第二次擴增係在GREX-500中執行。 D. 步驟 D ：快速第二次擴增

在一些實施例中，TIL細胞群體在收集及啟動性第一次擴增之後(即步驟A及步驟B之後)以及稱為步驟C之轉變(如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示)之後進一步數目擴增。此進一步擴增在本文中稱為快速第二次擴增或快速擴增，其可包括此項技術中通常稱為快速擴增過程(快速擴增方案或REP)之擴增過程；以及如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所指示之過程。快速第二次擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中完成。在一些實施例中，在快速第二次擴增起始之後1天、2天、3天或4天( 亦即，在整體Gen 3過程之第8、9、10或11天)，將TIL轉移至較大體積容器。

在一些實施例中，TIL之快速第二次擴增(其可包括有時稱為REP之擴增；以及如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所指示之過程)可使用熟習此項技術者已知之任何TIL燒瓶或容器來執行。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約2天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約2天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約3天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約3天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約4天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約4天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約5天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約5天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約6天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約6天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約8天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約9天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約2天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約3天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約4天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約5天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約6天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約7天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約8天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約10天。

在一些實施例中，快速第二次擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D所指示之過程)來執行。在一些實施例中，在IL-2、OKT-3及餵養細胞(本文中亦稱為「抗原呈遞細胞」)存在下在快速第二次擴增中擴增TIL。在一些實施例中，在IL-2、OKT-3及餵養細胞存在下在快速第二次擴增中擴增TIL，其中所添加之餵養細胞的最終濃度係啟動性第一次擴增中存在之餵養細胞之濃度的兩倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體(諸如約30 ng/mL OKT3)、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二次擴增期間包括一或多種癌症之抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該一或多種抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體，諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1 :26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)表現。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈遞細胞上之相同癌症抗原再刺激來快速擴增。或者，TIL可進一步用例如經照射之自體淋巴細胞或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二次擴增之一部分發生。在一些實施例中，第二次擴增在經照射之自體淋巴細胞或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2存在下發生。

在一些實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於15 ng/mL與約30 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含介於30 ng/mL與約60 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，細胞培養基包含約60 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。

在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含7.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含500 mL培養基及30 µg OKT-3/容器。在一些實施例中，該容器為G-REX-100 MCS燒瓶。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及7.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及7.5 × 10 ⁸個抗原呈遞餵養細胞/容器。

在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含介於5 × 10 ⁸個與7.5 × 10 ⁸個之間之抗原呈遞餵養細胞/容器。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含500 mL培養基及30 µg OKT-3/容器。在一些實施例中，該容器為G-REX-100 MCS燒瓶。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及介於5 × 10 ⁸個與7.5 × 10 ⁸個之間之抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包含500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及介於5 × 10 ⁸個與7.5 × 10 ⁸個之間之抗原呈遞餵養細胞/容器。

在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可包括於第二次擴增期間，例如包括於根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及本文所述之步驟D過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可包括於根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)且如本文所述之步驟D過程期間。

在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈遞細胞之比率為約1:10、約1:15、約1:20、約1:25、約1:30、約1:35、約1:40、約1:45、約1:50、約1:75、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC之比率係介於1:50與1:300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL對PBMC之比率係介於1:100與1:200之間。

在一些實施例中，在燒瓶中執行REP及/或快速第二次擴增，其中在150 mL培養基中使主體TIL與100倍或200倍過量之不活化餵養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2混合，其中餵養細胞濃度係啟動性第一次擴增中之餵養細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。進行培養基置換(通常經由抽吸2/3廢培養基且用相等體積之新鮮培養基置換來置換2/3培養基)，直至細胞轉移至替代性生長腔室。替代性生長腔室包括G-REX燒瓶及如下文更充分論述之透氣容器。

在一些實施例中，快速第二次擴增(其可包括稱為REP過程之過程)為7-9天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第二次擴增為7天。在一些實施例中，第二次擴增為8天。在一些實施例中，第二次擴增為9天。

在一些實施例中，第二次擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D中所提及之彼等)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣燒瓶(G-REX-100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5 × 10 ⁶或10 × 10 ⁶個TIL可與PBMC一起在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-REX-100燒瓶可在37℃下在5% CO ₂中培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置於離心瓶中且在1500 rpm (491 × g)下離心10分鐘。可用150 mL含有5%人類AB血清、6000 IU/mL IL-2之新鮮培養基使TIL集結粒再懸浮，且添加回原始GREX-100燒瓶。當在GREX-100燒瓶中連續擴增TIL時，在第10或11天，可將TIL移動至較大燒瓶，諸如GREX-500。可在培養之第14天收集細胞。可在培養之第15天收集細胞。可在培養之第16天收集細胞。在一些實施例中，進行培養基置換直至細胞轉移至替代性生長腔室。在一些實施例中，藉由抽吸廢培養基且用相等體積之新鮮培養基置換來置換2/3培養基。在一些實施例中，替代性生長腔室包括GREX燒瓶及如下文更充分論述之透氣容器。

在一些實施例中，該無血清或成分確定之培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。CTS™ OpTmizer™之任何調配物均可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物之組合，兩者在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，連同55 mM 2-巰基乙醇。

在一些實施例中，該成分確定之培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。CTS™ OpTmizer™之任何調配物均可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物之組合，兩者在使用之前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)，連同55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及2 mM麩醯胺，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺，且進一步包含約6000 IU/mL IL-2。

在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有2-巰基乙醇，其濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM。在一些實施例中，該無血清培養基或成分確定之培養基補充有2-巰基乙醇，其濃度為約55 mM。

在一些實施例中，國際專利申請公開案第WO1998/030679號及美國專利申請公開案第US 2002/0076747 A1號(其以引用之方式併入本文中)中所述的成分確定之培養基可用於本發明。在彼公開案中，描述了無血清真核細胞培養基。該無血清真核細胞培養基包括補充有無血清補充物之基礎細胞培養基，該無血清補充物能夠支持細胞在無血清培養基中之生長。該無血清真核細胞培養基補充物包含或藉由組合選自由以下組成之群的一或多種成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維他命、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅體、一或多種痕量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，成分確定之培養基進一步包含L-麩醯胺、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，成分確定之培養基包含白蛋白或白蛋白代用品及選自由以下組成之群的一或多種成分：一或多種胺基酸、一或多種維他命、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅體及一或多種痕量元素。在一些實施例中，成分確定之培養基包含白蛋白及選自由以下組成之群的一或多種成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-酥胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、經還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有痕量元素部分Ag ⁺、Al ³⁺、Ba ²⁺、Cd ²⁺、Co ²⁺、Cr ³⁺、Ge ⁴⁺、Se ⁴⁺、Br、T、Mn ²⁺、P、Si ⁴⁺、V ⁵⁺、Mo ⁶⁺、Ni ²⁺、Rb ⁺、Sn ²⁺及Zr ⁴⁺之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由以下組成之群：杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove改良杜氏培養基。

在一些實施例中，描述於Smith 等人, Clin. Transl. Immunology, 4(1), 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中之成分確定之培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用作基礎細胞培養基，且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。

在一些實施例中，執行快速第二次擴增(包括稱為REP之擴增)且其進一步包括其中選擇具有優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用此項技術中已知之任何選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)所述之方法可用於選擇具有優異腫瘤反應性之TIL。

視情況，在快速第二次擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用此項技術中已知之標準分析來執行細胞活力分析。例如，可對主體TIL之樣品進行台盼藍排除分析，該分析選擇性標記死亡細胞且允許活力評估。在一些實施例中，可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)對TIL樣品進行計數且確定活力。在一些實施例中，活力係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動化細胞計數器方案確定。

在一些實施例中，快速第二次擴增培養基( 例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更詳細論述之抗原呈遞餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基( 例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/燒瓶之OKT-3以及7.5 × 10 ⁸個如下文更詳細論述之抗原呈遞餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基( 例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更詳細論述之抗原呈遞餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基( 例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/燒瓶之OKT-3以及5 × 10 ⁸個如下文更詳細論述之抗原呈遞餵養細胞(APC)。

在一些實施例中，快速第二次擴增(例如，根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D)係在密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用之生物反應器為例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用之生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用之生物反應器為G-REX-500。

在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器( 例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現小規模培養中之TIL轉移至比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500-MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之TIL持續約4至7天之時期。

在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器( 例如G-REX-100 MCS容器)之第一小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自第一小規模培養之TIL轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之TIL部分係在第二小規模培養中培養約4至7天之時期。

在一些實施例中，將第一小規模TIL培養分配至複數個約2至5個TIL亞群。

在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器( 例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約3至7天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之TIL轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分係在較大規模培養中培養約4至7天之時期。

在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器( 例如G-REX-100 MCS容器)之小規模培養中培養TIL持續約5天之時期來執行快速或第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之TIL轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500 MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之TIL部分係在較大規模培養中培養約6天之時期。

在一些實施例中，在快速第二次擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL。在一些實施例中，在快速或第二次擴增分開後，各第二容器包含至少10 ⁸個TIL、至少10 ⁹個TIL或至少10 ¹⁰個TIL。在一例示性實施例中，各第二容器包含至少10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，在快速第二次擴增完成之後，該複數個亞群包含治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速或第二次擴增完成之後，將一或多個TIL亞群匯集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在快速擴增完成之後，各TIL亞群包含治療有效量之TIL。

在一些實施例中，在分成複數個步驟之前，執行快速第二次擴增持續約3至7天之時期。在一些實施例中，快速第二次擴增之分開發生在起始快速或第二次擴增之後約第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。

在一些實施例中，快速第二次擴增之分開發生在起始第一次擴增( 亦即，REP前擴增)之後約第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天第17天或第18天。在一例示性實施例中，快速或第二次擴增之分開發生在起始第一次擴增之後約第16天。

在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速第二次擴增持續約7至11天之時期。在一些實施例中，在分開之後，進一步執行快速第二次擴增持續約5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時期。

在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基包含與在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基不同的組分。

在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC。

在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由對第一次擴增中的細胞培養基補充包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基而生成。

在一些實施例中，在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基包含IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基包含IL-2及OKT-3。在一些實施例中，在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及視情況選用之OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基而生成。在一些實施例中，在分開之後用於快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包含IL-2及OKT-3的新鮮培養基替換在分開之前用於快速第二次擴增之細胞培養基而生成。 1. 餵養細胞及抗原呈遞細胞

在一些實施例中，本文所述之快速第二次擴增程序(例如包括諸如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)步驟D中所述之彼等以及稱為REP之彼等的擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二次擴增期間需要過量之餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。

在一些實施例中，若第7或14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天( 亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。

在一些實施例中，若在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天之活細胞總數並未自在REP第0天及/或第二次擴增第0天( 亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，若在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天之活細胞總數並未自在REP第0天及/或第二次擴增第0天( 亦即，第二次擴增之起始日)置於培養中之初始活細胞數目增加，則認為PBMC係複製不能的且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下進行培養。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下進行培養。

在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈遞餵養細胞為人工抗原呈遞餵養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率為約1:10、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:50及1:300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL對抗原呈遞餵養細胞之比率係介於1:100與1:200之間。

在一些實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約5 × 10 ⁸個餵養細胞對約100 × 10 ⁶個TIL之比率。在一些實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約100 × 10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約5 × 10 ⁸個餵養細胞對約50 × 10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約50 × 10 ⁶個TIL之比率。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約5 × 10 ⁸個餵養細胞對約25 × 10 ⁶個TIL。在其他實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 ⁸個餵養細胞對約25 × 10 ⁶個TIL。在其他實施例中，快速第二次擴增需要兩倍於快速第二次擴增之餵養細胞數目。在其他實施例中，當本文所述之啟動性第一次擴增需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞時，快速第二次擴增需要約5 × 10 ⁸個餵養細胞。在其他實施例中，當本文所述之啟動性第一次擴增需要約2.5 × 10 ⁸個餵養細胞時，快速第二次擴增需要約7.5 × 10 ⁸個餵養細胞。在其他實施例中，快速第二次擴增需要兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X於啟動性第一次擴增之餵養細胞數目。

在一些實施例中，本文所述之快速第二次擴增程序在快速第二次擴增期間需要過量之餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法(諸如Ficoll-Paque梯度分離)獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈遞(aAPC)細胞來替代PBMC。在一些實施例中，PBMC以添加至啟動性第一次擴增之PBMC之濃度的兩倍添加至快速第二次擴增。

在一些實施例中，在快速第二次擴增中使用人工抗原呈遞細胞來替換PBMC或與PBMC組合。 2. 細胞介素及其他添加劑

本文所述之快速第二次擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(詳言之IL-2)之培養基，如此項技術中所知。

或者，使用細胞介素之組合來進行TIL之快速第二次擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或兩者以上的組合係如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能之組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特定地有利於生成淋巴細胞，且詳言之如其中所述之T細胞。

在一些實施例中，步驟D (詳言之，來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)亦可包括將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟D亦可包括將4-1BB促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。在一些實施例中，步驟D (詳言之，來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)亦可包括將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文中別處所述。另外，諸如過氧化物酶體增生物活化受體γ共活化劑I-α促效劑(包括增生物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如四氫噻唑二酮化合物)之添加劑可用於步驟D (詳言之，來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)期間之培養基，如美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 E. 步驟 E ：收集 TIL

在快速第二次擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在一個、兩個、三個、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL，例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供。在一些實施例中，在兩個擴增步驟之後收集TIL，例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供。在一些實施例中，在兩個擴增步驟(即一個啟動性第一次擴增及一個快速第二次擴增)之後收集TIL，例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供。

在一些實施例中，根據圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟E係根據本文所述之過程來執行。在一些實施例中，在無菌條件下經由注射器進入密閉系統以便維持該系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如本文所述之密閉系統。

在一些實施例中，根據本文所述之方法來收集TIL。在一些實施例中，在第14天與第16天之間使用如本文所述之方法來收集TIL。在一些實施例中，在第14天使用如本文所述之方法來收集TIL。在一些實施例中，在第15天使用如本文所述之方法來收集TIL。在一些實施例中，在第16天使用如本文所述之方法來收集TIL。 F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注容器

在如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以例示性次序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至用於投與至患者之容器，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，一旦使用上文所述之擴增方法獲得治療學上足夠數目的TIL，即將其轉移至用於投與至患者之容器。

在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之TIL係作為醫藥組合物投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物係TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。如本文所揭示經擴增之TIL可藉由此項技術中已知之任何合適途徑投與。在一些實施例中，TIL係作為單一動脈內或靜脈內輸注投與，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投與。 V. 其他 Gen 2 、 Gen 3 及其他 TIL 製造過程 實施例 A.PBMC餵養細胞比率

在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(參見例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D))中之培養基包括抗CD3抗體，例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL群體中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常係較佳的；參見例如Tsoukas 等人, J. Immunol.1985, 135,1719，由此以引用之方式整體併入。

在一些實施例中，如下計算PBMC餵養層之數目： A. T細胞體積(10 µm直徑)： V= (4/3) πr ³=523.6 µm ³B. 具有40 µm (4個細胞)高度之G-REX-100 (M)管柱： V= (4/3) πr ³= 4×10 ¹²µm ³C. 填充管柱B所需之細胞數目：4×10 ¹²µm ³/ 523.6 µm ³= 7.6×10 ⁸µm ³* 0.64 = 4.86×10 ⁸D. 可視情況在4D空間中活化之細胞數目：4.86×10 ⁸/ 24 = 20.25×10 ⁶E. 外推至G-REX-500之餵養細胞及TIL數目：TIL：100×10 ⁶，且餵養細胞：2.5×10 ⁹

在此計算中，使用在具有100 cm ²基底之圓柱體中提供用於活化TIL之二十面體幾何形狀所需之單核細胞數目的近似值。該計算得出T細胞之閾值活化的實驗結果為約5×10 ⁸，與NCI實驗數目密切相關，如Jin 等人, J. Immunother. 2012, 35,283-292中所述。在(C)中，乘數(0.64)係等效球體之隨機堆積密度，如藉由Jaeger及Nagel, Science, 1992, 255,1523-3所計算。在(D)中，除數24係可能在4維空間中接觸類似物體之等效球體之數目或「牛頓數」，如Musin, Russ. Math. Surv.,2003, 58,794-795中所述。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增期間外源供應之抗原呈遞餵養細胞的數目大約係在快速第二次擴增期間外源供應之抗原呈遞餵養細胞的數目之一半。在某些實施例中，該方法包括在如與快速第二次擴增之細胞培養基相比包含大約少50%之抗原呈遞細胞的細胞培養基中執行啟動性第一次擴增。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之抗原呈遞餵養細胞(APC)的數目係大於在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至20:1或約20:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至9:1或約9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至8:1或約8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至7:1或約7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至6:1或約6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增)期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2:1或約2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增)期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約約2:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率為2:1或約2:1。

在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目對在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目之比率為以下值或約以下值：1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目為以下值或約以下值：1×10 ⁸、1.1×10 ⁸、1.2×10 ⁸、1.3×10 ⁸、1.4×10 ⁸、1.5×10 ⁸、1.6×10 ⁸、1.7×10 ⁸、1.8×10 ⁸、1.9×10 ⁸、2×10 ⁸、2.1×10 ⁸、2.2×10 ⁸、2.3×10 ⁸、2.4×10 ⁸、2.5×10 ⁸、2.6×10 ⁸、2.7×10 ⁸、2.8×10 ⁸、2.9×10 ⁸、3×10 ⁸、3.1×10 ⁸、3.2×10 ⁸、3.3×10 ⁸、3.4×10 ⁸或3.5×10 ⁸個APC，且在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目為以下值或約以下值：3.5×10 ⁸、3.6×10 ⁸、3.7×10 ⁸、3.8×10 ⁸、3.9×10 ⁸、4×10 ⁸、4.1×10 ⁸、4.2×10 ⁸、4.3×10 ⁸、4.4×10 ⁸、4.5×10 ⁸、4.6×10 ⁸、4.7×10 ⁸、4.8×10 ⁸、4.9×10 ⁸、5×10 ⁸、5.1×10 ⁸、5.2×10 ⁸、5.3×10 ⁸、5.4×10 ⁸、5.5×10 ⁸、5.6×10 ⁸、5.7×10 ⁸、5.8×10 ⁸、5.9×10 ⁸、6×10 ⁸、6.1×10 ⁸、6.2×10 ⁸、6.3×10 ⁸、6.4×10 ⁸、6.5×10 ⁸、6.6×10 ⁸、6.7×10 ⁸、6.8×10 ⁸、6.9×10 ⁸、7×10 ⁸、7.1×10 ⁸、7.2×10 ⁸、7.3×10 ⁸、7.4×10 ⁸、7.5×10 ⁸、7.6×10 ⁸、7.7×10 ⁸、7.8×10 ⁸、7.9×10 ⁸、8×10 ⁸、8.1×10 ⁸、8.2×10 ⁸、8.3×10 ⁸、8.4×10 ⁸、8.5×10 ⁸、8.6×10 ⁸、8.7×10 ⁸、8.8×10 ⁸、8.9×10 ⁸、9×10 ⁸、9.1×10 ⁸、9.2×10 ⁸、9.3×10 ⁸、9.4×10 ⁸、9.5×10 ⁸、9.6×10 ⁸、9.7×10 ⁸、9.8×10 ⁸、9.9×10 ⁸或1×10 ⁹個APC。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目係選自1.5×10 ⁸或約1.5×10 ⁸個APC至3×10 ⁸或約3×10 ⁸個APC之範圍，且在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目係選自4×10 ⁸或約4×10 ⁸個APC至7.5×10 ⁸或約7.5×10 ⁸個APC之範圍。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目係選自2×10 ⁸或約2×10 ⁸個APC至2.5×10 ⁸或約2.5×10 ⁸個APC之範圍，且在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目係選自4.5×10 ⁸或約4.5×10 ⁸個APC至5.5×10 ⁸或約5.5×10 ⁸個APC之範圍。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增期間外源供應之APC的數目為2.5×10 ⁸或約2.5×10 ⁸個APC，且在快速第二次擴增期間外源供應之APC的數目為5×10 ⁸或約5×10 ⁸個APC。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增之第0天添加的APC (包括例如PBMC)之數目大約係在啟動性第一次擴增之第7天( 例如，該方法之第7天)添加的PBMC之數目之一半。在某些實施例中，該方法包括在啟動性第一次擴增之第0天將抗原呈遞細胞添加至第一TIL群體且在第7天將抗原呈遞細胞添加至第二TIL群體，其中第0天添加之抗原呈遞細胞的數目大約係在啟動性第一次擴增之第7天( 例如，該方法之第7天)添加之抗原呈遞細胞的數目之50%。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係大於在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之PBMC的數目。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：1.0×10 ⁶個APC/cm ²或約1.0×10 ⁶個APC/cm ²至4.5×10 ⁶個APC/cm ²或約4.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：1.5×10 ⁶個APC/cm ²或約1.5×10 ⁶個APC/cm ²至3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：2×10 ⁶個APC/cm ²或約2×10 ⁶個APC/cm ²至3×10 ⁶個APC/cm ²或約3×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以2×10 ⁶個APC/cm ²或約2×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種於培養燒瓶中。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以以下值或約以下值之密度接種於培養燒瓶中：1.0×10 ⁶、1.1×10 ⁶、1.2×10 ⁶、1.3×10 ⁶、1.4×10 ⁶、1.5×10 ⁶、1.6×10 ⁶、1.7×10 ⁶、1.8×10 ⁶、1.9×10 ⁶、2×10 ⁶、2.1×10 ⁶、2.2×10 ⁶、2.3×10 ⁶、2.4×10 ⁶、2.5×10 ⁶、2.6×10 ⁶、2.7×10 ⁶、2.8×10 ⁶、2.9×10 ⁶、3×10 ⁶、3.1×10 ⁶、3.2×10 ⁶、3.3×10 ⁶、3.4×10 ⁶、3.5×10 ⁶、3.6×10 ⁶、3.7×10 ⁶、3.8×10 ⁶、3.9×10 ⁶、4×10 ⁶、4.1×10 ⁶、4.2×10 ⁶、4.3×10 ⁶、4.4×10 ⁶或4.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：2.5×10 ⁶個APC/cm ²或約2.5×10 ⁶個APC/cm ²至7.5×10 ⁶個APC/cm ²或約7.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²至約6.0×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²至約5.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在快速第二次擴增中外源供應之APC以以下值或約以下值之密度接種於培養燒瓶中：2.5×10 ⁶個APC/cm ²、2.6×10 ⁶個APC/cm ²、2.7×10 ⁶個APC/cm ²、2.8×10 ⁶、2.9×10 ⁶、3×10 ⁶、3.1×10 ⁶、3.2×10 ⁶、3.3×10 ⁶、3.4×10 ⁶、3.5×10 ⁶、3.6×10 ⁶、3.7×10 ⁶、3.8×10 ⁶、3.9×10 ⁶、4×10 ⁶、4.1×10 ⁶、4.2×10 ⁶、4.3×10 ⁶、4.4×10 ⁶、4.5×10 ⁶、4.6×10 ⁶、4.7×10 ⁶、4.8×10 ⁶、4.9×10 ⁶、5×10 ⁶、5.1×10 ⁶、5.2×10 ⁶、5.3×10 ⁶、5.4×10 ⁶、5.5×10 ⁶、5.6×10 ⁶、5.7×10 ⁶、5.8×10 ⁶、5.9×10 ⁶、6×10 ⁶、6.1×10 ⁶、6.2×10 ⁶、6.3×10 ⁶、6.4×10 ⁶、6.5×10 ⁶、6.6×10 ⁶、6.7×10 ⁶、6.8×10 ⁶、6.9×10 ⁶、7×10 ⁶、7.1×10 ⁶、7.2×10 ⁶、7.3×10 ⁶、7.4×10 ⁶或7.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以以下值或約以下值之密度接種於培養燒瓶中：1.0×10 ⁶、1.1×10 ⁶、1.2×10 ⁶、1.3×10 ⁶、1.4×10 ⁶、1.5×10 ⁶、1.6×10 ⁶、1.7×10 ⁶、1.8×10 ⁶、1.9×10 ⁶、2×10 ⁶、2.1×10 ⁶、2.2×10 ⁶、2.3×10 ⁶、2.4×10 ⁶、2.5×10 ⁶、2.6×10 ⁶、2.7×10 ⁶、2.8×10 ⁶、2.9×10 ⁶、3×10 ⁶、3.1×10 ⁶、3.2×10 ⁶、3.3×10 ⁶、3.4×10 ⁶、3.5×10 ⁶、3.6×10 ⁶、3.7×10 ⁶、3.8×10 ⁶、3.9×10 ⁶、4×10 ⁶、4.1×10 ⁶、4.2×10 ⁶、4.3×10 ⁶、4.4×10 ⁶或4.5×10 ⁶個APC/cm ²，且將在快速第二次擴增中外源供應之APC以以下值或約以下值之密度接種於培養燒瓶中：2.5×10 ⁶個APC/cm ²、2.6×10 ⁶個APC/cm ²、2.7×10 ⁶個APC/cm ²、2.8×10 ⁶、2.9×10 ⁶、3×10 ⁶、3.1×10 ⁶、3.2×10 ⁶、3.3×10 ⁶、3.4×10 ⁶、3.5×10 ⁶、3.6×10 ⁶、3.7×10 ⁶、3.8×10 ⁶、3.9×10 ⁶、4×10 ⁶、4.1×10 ⁶、4.2×10 ⁶、4.3×10 ⁶、4.4×10 ⁶、4.5×10 ⁶、4.6×10 ⁶、4.7×10 ⁶、4.8×10 ⁶、4.9×10 ⁶、5×10 ⁶、5.1×10 ⁶、5.2×10 ⁶、5.3×10 ⁶、5.4×10 ⁶、5.5×10 ⁶、5.6×10 ⁶、5.7×10 ⁶、5.8×10 ⁶、5.9×10 ⁶、6×10 ⁶、6.1×10 ⁶、6.2×10 ⁶、6.3×10 ⁶、6.4×10 ⁶、6.5×10 ⁶、6.6×10 ⁶、6.7×10 ⁶、6.8×10 ⁶、6.9×10 ⁶、7×10 ⁶、7.1×10 ⁶、7.2×10 ⁶、7.3×10 ⁶、7.4×10 ⁶或7.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：1.0×10 ⁶個APC/cm ²或約1.0×10 ⁶個APC/cm ²至4.5×106個APC/cm ²或約4.5×106個APC/cm ²，且將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：2.5×10 ⁶個APC/cm ²或約2.5×10 ⁶個APC/cm ²至7.5×10 ⁶個APC/cm ²或約7.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：1.5×10 ⁶個APC/cm ²或約1.5×10 ⁶個APC/cm ²至3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²，且將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²至6×10 ⁶個APC/cm ²或約6×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：2×10 ⁶個APC/cm ²或約2×10 ⁶個APC/cm ²至3×10 ⁶個APC/cm ²或約3×10 ⁶個APC/cm ²，且將在快速第二次擴增中外源供應之APC以選自以下範圍之密度接種於培養燒瓶中：4×10 ⁶個APC/cm ²或約4×10 ⁶個APC/cm ²至5.5×10 ⁶個APC/cm ²或約5.5×10 ⁶個APC/cm ²。

在其他實施例中，將在啟動性第一次擴增中外源供應之APC以2×10 ⁶個APC/cm ²或約2×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種於培養燒瓶中，且將在快速第二次擴增中外源供應之APC以4×10 ⁶個APC/cm ²或約4×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種於培養燒瓶中。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之PBMC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至20:1或約20:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之PBMC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之PBMC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至9:1或約9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至8:1或約8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至7:1或約7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至6:1或約6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2:1或約2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約約2:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率為2:1或約2:1。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目對在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目之比率為以下值或約以下值：1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目為以下值或約以下值：1×10 ⁸、1.1×10 ⁸、1.2×10 ⁸、1.3×10 ⁸、1.4×10 ⁸、1.5×10 ⁸、1.6×10 ⁸、1.7×10 ⁸、1.8×10 ⁸、1.9×10 ⁸、2×10 ⁸、2.1×10 ⁸、2.2×10 ⁸、2.3×10 ⁸、2.4×10 ⁸、2.5×10 ⁸、2.6×10 ⁸、2.7×10 ⁸、2.8×10 ⁸、2.9×10 ⁸、3×10 ⁸、3.1×10 ⁸、3.2×10 ⁸、3.3×10 ⁸、3.4×10 ⁸或3.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)，且在快速第二次擴增在第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目為以下值或約以下值：3.5×10 ⁸、3.6×10 ⁸、3.7×10 ⁸、3.8×10 ⁸、3.9×10 ⁸、4×10 ⁸、4.1×10 ⁸、4.2×10 ⁸、4.3×10 ⁸、4.4×10 ⁸、4.5×10 ⁸、4.6×10 ⁸、4.7×10 ⁸、4.8×10 ⁸、4.9×10 ⁸、5×10 ⁸、5.1×10 ⁸、5.2×10 ⁸、5.3×10 ⁸、5.4×10 ⁸、5.5×10 ⁸、5.6×10 ⁸、5.7×10 ⁸、5.8×10 ⁸、5.9×10 ⁸、6×10 ⁸、6.1×10 ⁸、6.2×10 ⁸、6.3×10 ⁸、6.4×10 ⁸、6.5×10 ⁸、6.6×10 ⁸、6.7×10 ⁸、6.8×10 ⁸、6.9×10 ⁸、7×10 ⁸、7.1×10 ⁸、7.2×10 ⁸、7.3×10 ⁸、7.4×10 ⁸、7.5×10 ⁸、7.6×10 ⁸、7.7×10 ⁸、7.8×10 ⁸、7.9×10 ⁸、8×10 ⁸、8.1×10 ⁸、8.2×10 ⁸、8.3×10 ⁸、8.4×10 ⁸、8.5×10 ⁸、8.6×10 ⁸、8.7×10 ⁸、8.8×10 ⁸、8.9×10 ⁸、9×10 ⁸、9.1×10 ⁸、9.2×10 ⁸、9.3×10 ⁸、9.4×10 ⁸、9.5×10 ⁸、9.6×10 ⁸、9.7×10 ⁸、9.8×10 ⁸、9.9×10 ⁸或1×10 ⁹個APC (包括例如PBMC)。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增在第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自1×10 ⁸或約1×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)至3.5×10 ⁸或約3.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)之範圍，且在快速第二次擴增在第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自3.5×10 ⁸或約3.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)至1×10 ⁹或約1×10 ⁹個APC (包括例如PBMC)之範圍。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增在第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自1.5×10 ⁸或約1.5×10 ⁸個APC至3×10 ⁸或約3×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)之範圍，且在快速第二次擴增在第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自4×10 ⁸或約4×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)至7.5×10 ⁸或約7.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)之範圍。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增在第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自2×10 ⁸或約2×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)至2.5×10 ⁸或約2.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)之範圍，且在快速第二次擴增在第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目係選自4.5×10 ⁸或約4.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)至5.5×10 ⁸或約5.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)之範圍。

在其他實施例中，在啟動性第一次擴增在第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目為2.5×10 ⁸或約2.5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)，且在快速第二次擴增在第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)的數目為5×10 ⁸或約5×10 ⁸個APC (包括例如PBMC)。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增之第0天添加的APC (包括例如PBMC)層之數目大約係在快速第二次擴增之第7天添加的APC (包括例如PBMC)層之數目之一半。在某些實施例中，該方法包括在啟動性第一次擴增之第0天將抗原呈遞細胞層添加至第一TIL群體且在第7天將抗原呈遞細胞層添加至第二TIL群體，其中第0天添加之抗原呈遞細胞層的數目大約係在第7天添加之抗原呈遞細胞層的數目之50%。

在其他實施例中，在快速第二次擴增之第7天外源供應之APC (包括例如PBMC)層的數目係大於在啟動性第一次擴增之第0天外源供應之APC (包括例如PBMC)層的數目。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有2個或約2個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有4個或約4個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有1個或約1個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有3個或約3個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有1.5個或約1.5個細胞層至2.5個或約2.5個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有3個或約3個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有1個或約1個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有2個或約2個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有以下值或約以下值之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層，且快速第二次擴增之第7天在具有以下值或約以下值之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生：3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有1個或約1個細胞層至2個或約2個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有3個或約3個細胞層至10個或約10個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有2個或約2個細胞層至3個或約3個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有4個或約4個細胞層至8個或約8個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有2個或約2個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有4個或約4個細胞層至8個或約8個細胞層之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有以下值或約以下值之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生：1、2或3個細胞層，且快速第二次擴增之第7天在具有以下值或約以下值之平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生：3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:10或約1:10之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:8或約1:8之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:7或約1:7之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:6或約1:6之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:5或約1:5之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:4或約1:4之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:3或約1:3之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:2或約1:2之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.2或約1:1.2至1:8或約1:8之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.3或約1:1.3至1:7或約1:7之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.4或約1:1.4至1:6或約1:6之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.5或約1:1.5至1:5或約1:5之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.6或約1:1.6至1:4或約1:4之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.7或約1:1.7至1:3.5或約1:3.5之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.8或約1:1.8至1:3或約1:3之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自1:1.9或約1:1.9至1:2.5或約1:2.5之範圍。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率為1: 2或約1: 2。

在其他實施例中，啟動性第一次擴增之第0天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第一數目之第一平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增之第7天在具有等於APC (包括例如PBMC)層之第二數目之第二平均厚度的分層APC (包括例如PBMC)存在下發生，其中APC (包括例如PBMC)層之第一數目對APC (包括例如PBMC)層之第二數目的比率係選自以下值或約以下值：1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增中之APC的數目係選自約1.0×10 ⁶個APC/cm ²至約4.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍，且在快速第二次擴增中之APC的數目係選自約2.5×10 ⁶個APC/cm ²至約7.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增中之APC的數目係選自約1.5×10 ⁶個APC/cm ²至約3.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍，且在快速第二次擴增中之APC的數目係選自約3.5×10 ⁶個APC/cm ²至約6.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍。

在一些實施例中，在啟動性第一次擴增中之APC的數目係選自約2.0×10 ⁶個APC/cm ²至約3.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍，且在快速第二次擴增中之APC的數目係選自約4.0×10 ⁶個APC/cm ²至約5.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍。 A. 視情況選用之細胞培養基組分 1. 抗 CD3 抗體

在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(參見例如圖1及8 西安焉知，例如圖8B))中之培養基包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL群體中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常係較佳的；參見例如Tsoukas 等人, J. Immunol. 1985, 135,1719，由此以引用之方式整體併入。

熟習此項技術者應理解，一些合適之抗人類CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠科動物、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在一些實施例中，使用OKT3抗CD3抗體莫羅單抗(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。參見表1。

熟習此項技術者應理解，一些合適之抗人類CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠科動物、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在一些實施例中，使用OKT3抗CD3抗體莫羅單抗(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。 2. 4-1BB (CD137) 促效劑

在一些實施例中，啟動性第一次擴增及/或快速第二次擴增之細胞培養基包含TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB (CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為此項技術中已知之任何4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人類或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型( 例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別( 例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類之免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈兩者。如本文所用，術語結合分子亦包括與4-1BB結合之抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體( 例如，雙特異性抗體)、人類、人類化或嵌合抗體及以上任一者之抗體片段( 例如，Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現文庫產生之片段、抗原決定基結合片段)，以及抗體之經工程改造形式( 例如，scFv分子)。在一些實施例中，4-1BB促效劑為抗原結合蛋白，該蛋白為全人類抗體。在一些實施例中，4-1BB促效劑為抗原結合蛋白，該蛋白為人類化抗體。在一些實施例中，用於目前所揭示之方法及組合物的4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人類抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB纖連蛋白、抗4-1BB域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白及其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物。已知激動性抗4-1BB抗體誘導強烈免疫反應。Lee 等人, PLOS One 2013, 8,e69677。在一些實施例中，4-1BB促效劑為激動性、抗4-1BB人類化或全人類單株抗體( 亦即，源自單一細胞株之抗體)。在一些實施例中，4-1BB促效劑為EU-101 (Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物。在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物。

在一些實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白。在一些實施例中，與通常具有兩個配位體結合域之激動性單株抗體相比，諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配位體結合域)之多聚體4-1BB促效劑可誘導優良受體(4-1BBL)成簇及內部細胞信號傳導複合物形成。包含三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接此等融合蛋白中之兩者或兩者以上的三聚體(三價)或六聚體(六價)或更大融合蛋白描述於例如Gieffers 等人, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12,2735-47中。

已知激動性4-1BB抗體及融合蛋白誘導強烈免疫反應。在一些實施例中，4-1BB促效劑係以足以降低毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞毒性(ADCC) (例如NK細胞毒性)之激動性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之激動性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之激動性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之激動性4-1BB單株抗體或融合蛋白。

在一些實施例中，4-1BB促效劑之特徵在於以高親和力及激動活性與人類4-1BB (SEQ ID NO:40)結合。在一些實施例中，4-1BB促效劑係與人類4-1BB (SEQ ID NO:40)結合之結合分子。在一些實施例中，4-1BB促效劑係與鼠科動物4-1BB (SEQ ID NO:41)結合之結合分子。與4-1BB促效劑或結合分子結合之4-1BB抗原的胺基酸序列概述於表5中。表5. 4-1BB抗原之胺基酸序列。

標識符	序列(單字母胺基酸符號)
SEQ ID NO: 40人類4-1BB ，腫瘤壞死因子受體超家族，成員9 (智人)
SEQ ID NO: 41鼠科動物4-1BB，腫瘤壞死因子受體超家族，成員9 (小家鼠)

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約100 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約90 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約80 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約70 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約60 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約50 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約40 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合，或以約30 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物4-1BB結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約8 × 10 ⁵l/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約8.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約9 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約9.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合，或以約1 × 10 ⁶1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物4-1BB結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.1 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.3 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.4 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.5 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.6 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合或以約2.7 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.8 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2.9 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合，或以約3 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物4-1BB結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約10 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約9 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約8 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約7 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約6 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約5 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約4 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約3 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，以約2 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合，或以約1 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物4-1BB結合。

在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變異體或生物類似物。烏圖木單抗可獲自Pfizer, Inc。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ、抗[ 智人TNFRSF9 (腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]，智人(全人類)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列陳述於表6中。烏圖木單抗包含在Asn59及Asn292處之糖基化位點；在位置22-96 (V _H-V _L)、143-199 (C _H1-C _L)、256-316 (C _H2)及362-420 (C _H3)處之重鏈鏈內二硫橋；在位置22’-87’ (V _H-V _L)及136’-195’ (C _H1-C _L)處之輕鏈鏈內二硫橋；在IgG2A同功型位置218-218、219-219、222-222及225-225處，在IgG2A/B同功型位置218-130、219-219、222-222及225-225處，及在IgG2B同功型位置219-130 (2)、222-222及225-225處之鏈內重鏈-重鏈二硫橋；以及在IgG2A同功型位置130-213’ (2)、IgG2A/B同功型位置218-213’及130-213’處，及在IgG2B同功型位置218-213’ (2)處之鏈內重鏈-輕鏈二硫橋。烏圖木單抗及其變異體及片段之製備及性質描述於美國專利第8,821,867號；第8,337,850號；及第9,468,678號及國際專利申請公開案第WO 2012/032433 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵描述於Fisher 等人, Cancer Immunolog. & Immunother. 2012 , 61,1721-33中。烏圖木單抗在多種血液及實體腫瘤適應症中之當前臨床試驗包括美國國立衛生研究院clinicaltrials.gov標識符NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:42給出之重鏈及由SEQ ID NO:43給出之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:43所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:44所示之序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:45所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含有包含各自與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區的scFv抗體。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:51所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參考烏圖木單抗所批准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏圖木單抗。表6. 與烏圖木單抗相關之4-1BB促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 42為烏圖木單抗之重鏈
SEQ ID NO: 43為烏圖木單抗之輕鏈
SEQ ID NO: 44為烏圖木單抗之重鏈可變區
SEQ ID NO: 45為烏圖木單抗之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 46為烏圖木單抗之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 47為烏圖木單抗之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 48為烏圖木單抗之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 49為烏圖木單抗之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 50為烏圖木單抗之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 51為烏圖木單抗之輕鏈CDR3

在一些實施例中，4-1BB促效劑為單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變異體或生物類似物。烏瑞魯單抗可獲自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ、抗[ 智人TNFRSF9 (腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]，智人(全人類)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列陳述於表7中。烏瑞魯單抗包含在位置298 (及298”)處之N-糖基化位點；在位置22-95 (V _H-V _L)、148-204 (C _H1-C _L)、262-322 (C _H2)及368-426 (C _H3)處(及在位置22”-95”、148”-204”、262”-322”及368”-426”處)之重鏈鏈內二硫橋；在位置23’-88’ (V _H-V _L)及136’-196’ (C _H1-C _L)處(及在位置23”’-88”’及136”’-196”’處)之輕鏈鏈內二硫橋；在位置227-227”及230-230”處之鏈內重鏈-重鏈二硫橋；以及在135-216’及135”-216”’處之鏈內重鏈-輕鏈二硫橋。烏瑞魯單抗及其變異體及片段之製備及性質描述於美國專利第7,288,638號及第8,962,804號中，該等美國專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵描述於Segal 等人, Clin. Cancer Res. 2016 中， 可獲自http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。烏瑞魯單抗在多種血液及實體腫瘤適應症中之當前臨床試驗包括美國國立衛生研究院clinicaltrials.gov標識符NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:52給出之重鏈及由SEQ ID NO:53給出之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:54所示之序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:55所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包含有包含各自與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區的scFv抗體。

在一些實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:61所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參考烏瑞魯單抗所批准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。表7. 與烏瑞魯單抗相關之4-1BB促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 52為烏瑞魯單抗之重鏈
SEQ ID NO: 53為烏瑞魯單抗之輕鏈
SEQ ID NO: 54為烏瑞魯單抗之可變重鏈
SEQ ID NO: 55為烏瑞魯單抗之可變輕鏈
SEQ ID NO: 56為烏瑞魯單抗之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 57為烏瑞魯單抗之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 58為烏瑞魯單抗之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 59為烏瑞魯單抗之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 60為烏瑞魯單抗之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 61為烏瑞魯單抗之輕鏈CDR3

在一些實施例中，4-1BB促效劑係選自由以下組成之群：1D8、3Elor、4B4 (BioLegend 309809)、H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532)、BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX)、145501 (Leinco Technologies B591)、藉由以ATCC編號HB-11248寄存之細胞株產生且揭示於美國專利第6,974,863號中的抗體、5F4 (BioLegend 31 1503)、C65-485 (BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244中之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號中之抗體(諸如20H4.9-IgGl (BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號中之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號中之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號中之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號中之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號中之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號中之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號中之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號中之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號中之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號中之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號中之抗體、揭示於國際專利申請公開案第WO 2012/177788號、第WO 2015/119923號及第WO 2010/042433號中之抗體以及其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案中每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，4-1BB促效劑係描述於以下文獻中之4-1BB促效劑融合蛋白：國際專利申請公開案第WO 2008/025516 A1號、第WO 2009/007120 A1號、第WO 2010/003766 A1號、第WO 2010/010051 A1號及第WO 2010/078966 A1號；美國專利申請公開案第US 2011/0027218 A1號、第US 2015/0126709 A1號、第US 2011/0111494 A1號、第US 2015/0110734 A1號及第US 2015/0126710 A1號；及美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，4-1BB促效劑係如結構I-A (C端Fc-抗體片段融合蛋白)或結構I-B (N端Fc-抗體片段融合蛋白)中描繪之4-1BB促效劑融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物( 參見圖18)。在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合域。結構I-A及I-B包含源自例如4-1BBL (4-1BB配位體、CD137配位體(CD137L)或腫瘤壞死因子超家族成員9 (TNFSF9))或結合4-1BB之抗體的三個線性連接TNFRSF結合域，該等結合域折疊形成三價蛋白，該三價蛋白接著經由IgG1-Fc (包括C _H3及C _H2域)連接至第二三價蛋白，該IgG1-Fc接著用於將該等三價蛋白中之兩者經由二硫鍵(小的延長橢圓形)連接在一起，從而穩定結構且提供促效劑，該促效劑能夠使六種受體及信號傳導蛋白之細胞內信號傳導域結合在一起以形成信號傳導複合物。表示為圓柱體之TNFRSF結合域可為scFv域，其包含例如藉由連接體連接的V _H及V _L鏈，該連接體可包含親水性殘基及用於靈活性之Gly及Ser序列以及用於溶解度之Glu及Lys。可使用任何scFv域設計，諸如以下文獻中所述之彼等：de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad 等人, Clin.& Dev. Immunol. 2012,980250；Monnier 等人, Antibodies, 2013, 2,193-208；或本文中別處併入之參考文獻。此形式之融合蛋白結構描述於美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中，該等美國專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。

圖18中給出之結構I-A之其他多肽域的胺基酸序列可見於表8中。Fc域較佳地包含完整恆定域(SEQ ID NO:62之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO:62之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分( 例如，SEQ ID NO:62之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc-抗體之較佳連接體可選自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中給出之實施例，包括適合額外多肽之融合的連接體。表8. TNFRSF促效劑融合蛋白(包括4-1BB促效劑融合蛋白)之胺基酸序列，具有C端Fc-抗體片段融合蛋白設計(結構I-A)。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:62 Fc域
SEQ ID NO: 63連接體
SEQ ID NO: 64連接體
SEQ ID NO: 65連接體
SEQ ID NO: 66連接體
SEQ ID NO: 67連接體
SEQ ID NO: 68連接體
SEQ ID NO: 69連接體
SEQ ID NO: 70連接體
SEQ ID NO: 71連接體
SEQ ID NO: 72連接體

圖18中給出之結構I-B之其他多肽域的胺基酸序列可見於表9中。若Fc抗體片段與結構I-B中之TNRFSF融合蛋白的N端融合，則Fc模塊之序列較佳地為SEQ ID NO:73中所示者，且連接體序列較佳地選自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所陳述之彼等實施例。表9. TNFRSF促效劑融合蛋白(包括4-1BB促效劑融合蛋白)之胺基酸序列，具有N端Fc-抗體片段融合蛋白設計(結構I-B)。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:73 Fc域
SEQ ID NO: 74連接體
SEQ ID NO: 75連接體
SEQ ID NO: 76連接體

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含選自由以下組成之群的一或多個4-1BB結合域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表10中所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述各物之可變重鏈及可變輕鏈的任何組合及其片段、衍生物、結合物、變異體及生物類似物。

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含有包含4-1BBL序列之一或多個4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含有包含根據SEQ ID NO:77之序列的一或多個4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含有包含可溶性4-1BBL序列之一或多個4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含有包含根據SEQ ID NO:78之序列的一或多個4-1BB結合域。

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含一或多個4-1BB結合域，該一或多個4-1BB結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含一或多個4-1BB結合域，該一或多個4-1BB結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含一或多個4-1BB結合域，該一或多個4-1BB結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自與表10中給出之V _H及V _L序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。表10. 可用作融合蛋白中之4-1BB結合域或可用作scFv 4-1BB促效劑抗體之額外多肽。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:77 4-1BBL
SEQ ID NO:78 4-1BBL可溶性域
SEQ ID NO: 79為4B4-1-1型式1之可變重鏈
SEQ ID NO: 80為4B4-1-1型式1之可變輕鏈
SEQ ID NO: 81為4B4-1-1型式2之可變重鏈
SEQ ID NO: 82為4B4-1-1型式2之可變輕鏈
SEQ ID NO: 83為H39E3-2之可變重鏈
SEQ ID NO: 84為H39E3-2之可變輕鏈

在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效劑單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性4-1BB結合域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性4-1BB結合域，其進一步包含在N末端及/或C末端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效劑單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性4-1BB結合域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性4-1BB結合域，其進一步包含在N末端及/或C末端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域，其中該等可溶性4-1BB域中每一者缺乏柄區(該柄區促進三聚且提供與細胞膜的一定距離，但並非4-1BB結合域之一部分)且第一及第二肽連接體獨立地具有3-8個胺基酸之長度。

在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效劑單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中該等可溶性TNF超家族細胞介素域中每一者缺乏柄區且第一及第二肽連接體獨立地具有3-8個胺基酸之長度，且其中各TNF超家族細胞介素域為4-1BB結合域。

在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效劑scFv抗體，其包含與前述V _L域中任一者連接之前述V _H域中任一者。

在一些實施例中，4-1BB促效劑為BPS Bioscience 4-1BB促效劑抗體目錄號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA。在一些實施例中，4-1BB促效劑為Creative Biolabs 4-1BB促效劑抗體目錄號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA。 3. OX40(CD134) 促效劑

在一些實施例中，TNFRSF促效劑為OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為此項技術中已知之任何OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人類或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型( 例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別( 例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類之免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈兩者。如本文所用，術語結合分子亦包括與OX40結合之抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體( 例如，雙特異性抗體)、人類、人類化或嵌合抗體及以上任一者之抗體片段( 例如，Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現文庫產生之片段、抗原決定基結合片段)，以及抗體之經工程改造形式( 例如，scFv分子)。在一些實施例中，OX40促效劑為抗原結合蛋白，該蛋白為全人類抗體。在一些實施例中，OX40促效劑為抗原結合蛋白，該蛋白為人類化抗體。在一些實施例中，用於目前所揭示之方法及組合物的OX40促效劑包括抗OX40抗體、人類抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40纖連蛋白、抗OX40域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白及其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物。在一些實施例中，OX40促效劑為激動性、抗OX40人類化或全人類單株抗體( 亦即，源自單一細胞株之抗體)。

在一些實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白。包含與OX40L融合之Fc域的OX40融合蛋白描述於例如Sadun 等人, J. Immunother. 2009, 182,1481-89中。在一些實施例中，與通常具有兩個配位體結合域之激動性單株抗體相比，諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配位體結合域)之多聚體OX40促效劑可誘導優良受體(OX40L)成簇及內部細胞信號傳導複合物形成。包含三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接此等融合蛋白中之兩者或兩者以上的三聚體(三價)或六聚體(六價)或更大融合蛋白描述於例如Gieffers 等人, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12,2735-47中。

已知激動性OX40抗體及融合蛋白誘導強烈免疫反應。Curti 等人, Cancer Res. 2013, 73,7189-98。在一些實施例中，OX40促效劑係以足以降低毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞毒性(ADCC) (例如NK細胞毒性)之激動性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之激動性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之激動性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之激動性OX40單株抗體或融合蛋白。

在一些實施例中，OX40促效劑之特徵在於以高親和力及激動活性與人類OX40 (SEQ ID NO:85)結合。在一些實施例中，OX40促效劑係與人類OX40 (SEQ ID NO:85)結合之結合分子。在一些實施例中，OX40促效劑係與鼠科動物OX40 (SEQ ID NO:86)結合之結合分子。與OX40促效劑或結合分子結合之OX40抗原的胺基酸序列概述於表11中。表11. OX40抗原之胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 85人類OX40 (智人)
SEQ ID NO: 86鼠科動物OX40 (小家鼠)

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括OX40促效劑，該OX40促效劑以約100 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約90 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約80 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約70 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約60 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約50 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，以約40 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合，或以約30 pM或更低之K _D與人類或鼠科動物OX40結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括OX40促效劑，該OX40促效劑以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，以約8 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，以約8.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，以約9 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，以約9.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合，或以約1 × 10 ⁶1/M·s或更快之k _締合與人類或鼠科動物OX40結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括OX40促效劑，該OX40促效劑以約2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.1 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.3 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.4 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.5 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.6 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合或以約2.7 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.8 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，以約2.9 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合，或以約3 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類或鼠科動物OX40結合。

在一些實施例中，所述之組合物、過程及方法包括OX40促效劑，該OX40促效劑以約10 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約9 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約8 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約7 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約6 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約5 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約4 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約3 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，以約2 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合，或以約1 nM或更低之IC ₅₀與人類或鼠科動物OX40結合。

在一些實施例中，OX40促效劑為塔伏利西單抗(tavolixizumab)，亦稱作MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可獲自AstraZeneca, Inc之MedImmune子公司。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ、抗[ 智人TNFRSF4 (腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]，人類化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列陳述於表12中。塔伏利西單抗包含在位置301及301”處之N-糖基化位點，具有岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；在位置22-95 (V _H-V _L)、148-204 (C _H1-C _L)、265-325 (C _H2)及371-429 (C _H3)處(及在位置22”-95”、148”-204”、265”-325”及371”-429”處)之重鏈鏈內二硫橋；在位置23’-88’ (V _H-V _L)及134’-194’ (C _H1-C _L)處(及在位置23”’-88”’及134”’-194”’處)之輕鏈鏈內二硫橋；在位置230-230”及233-233”處之鏈內重鏈-重鏈二硫橋；以及在224-214’及224”-214”’處之鏈內重鏈-輕鏈二硫橋。塔伏利西單抗在多種實體腫瘤適應症中之當前臨床試驗包括美國國立衛生研究院clinicaltrials.gov標識符NCT02318394及NCT02705482。

在一些實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:87給出之重鏈及由SEQ ID NO:88給出之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:89所示之序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:90所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含有包含各自與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區的scFv抗體。

在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95及SEQ ID NO:96所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參考塔伏利西單抗所批准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為塔伏利西單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為塔伏利西單抗。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為塔伏利西單抗。表12. 與塔伏利西單抗相關之OX40促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 87為塔伏利西單抗之重鏈
SEQ ID NO: 88為塔伏利西單抗之輕鏈
SEQ ID NO: 89為塔伏利西單抗之重鏈可變區
SEQ ID NO: 90為塔伏利西單抗之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 91為塔伏利西單抗之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 92為塔伏利西單抗之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 93為塔伏利西單抗之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 94為塔伏利西單抗之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 95為塔伏利西單抗之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 96為塔伏利西單抗之輕鏈CDR3

在一些實施例中，OX40促效劑為11D4，其係可獲自Pfizer, Inc之全人類抗體。11D4之製備及性質描述於美國專利第7,960,515號；第8,236,930號；及第9,028,824號中，該等美國專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。11D4之胺基酸序列陳述於表13中。

在一些實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:97給出之重鏈及由SEQ ID NO:98給出之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:99所示之序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:100所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102及SEQ ID NO:103所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105及SEQ ID NO:106所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參考11D4所批准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為11D4。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為11D4。表13. 與11D4相關之OX40促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 97為11D4之重鏈
SEQ ID NO: 98為11D4之輕鏈
SEQ ID NO: 99為11D4之重鏈可變區
SEQ ID NO: 100為11D4之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 101為11D4之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 102為11D4之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 103為11D4之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 104為11D4之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 105為11D4之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 106為11D4之輕鏈CDR3

在一些實施例中，OX40促效劑為18D8，其係可獲自Pfizer, Inc之全人類抗體。18D8之製備及性質描述於美國專利第7,960,515號；第8,236,930號；及第9,028,824號中，該等美國專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。18D8之胺基酸序列陳述於表14中。

在一些實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:107給出之重鏈及由SEQ ID NO:108給出之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:109所示之序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:110所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:113所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:116所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參考18D8所批准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為18D8。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為18D8。表14. 與18D8相關之OX40促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 107為18D8之重鏈
SEQ ID NO: 108為18D8之輕鏈
SEQ ID NO: 109為18D8之重鏈可變區
SEQ ID NO: 110為18D8之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 111為18D8之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 112為18D8之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 113為18D8之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 114為18D8之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 115為18D8之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 116為18D8之輕鏈CDR3

在一些實施例中，OX40促效劑為Hu119-122，其係可獲自GlaxoSmithKline plc之人類化抗體。Hu119-122之製備及性質描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列陳述於表15中。

在一些實施例中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:117所示之序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:118所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:121所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123及SEQ ID NO:124所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參考Hu119-122所批准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu119-122。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu119-122。表15. 與Hu119-122相關之OX40促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 117為Hu119-122之重鏈可變區
SEQ ID NO: 118為Hu119-122之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 119為Hu119-122之重鏈CDRl
SEQ ID NO: 120為Hu119-122之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 121為Hu119-122之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 122為Hu119-122之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 123為Hu119-122之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 124為Hu119-122之輕鏈CDR3

在一些實施例中，OX40促效劑為Hu106-222，其係可獲自GlaxoSmithKline plc之人類化抗體。Hu106-222之製備及性質描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列陳述於表16中。

在一些實施例中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:125所示之序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:126所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128及SEQ ID NO:129所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:132所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域及其保守胺基酸取代。

在一些實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參考Hu106-222所批准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且如與該參考醫藥產品或參考生物產品相比，其包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或提交授權書之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu106-222。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為Hu106-222。表16. 與Hu106-222相關之OX40促效劑抗體的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 125為Hu106-222之重鏈可變區
SEQ ID NO: 126為Hu106-222之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 127為Hu106-222之重鏈CDR1
SEQ ID NO: 128為Hu106-222之重鏈CDR2
SEQ ID NO: 129為Hu106-222之重鏈CDR3
SEQ ID NO: 130為Hu106-222之輕鏈CDR1
SEQ ID NO: 131為Hu106-222之輕鏈CDR2
SEQ ID NO: 132為Hu106-222之輕鏈CDR3

在一些實施例中，OX40促效劑抗體為MEDI6469 (亦稱為9B12)。MEDI6469為鼠科動物單株抗體。Weinberg 等人, J. Immunother. 2006, 29, 575-585。在一些實施例中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體，寄存於Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)，如Weinberg 等人, J. Immunother. 2006, 29, 575-585中所述，該案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。在一些實施例中，該抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，該抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。

在一些實施例中，OX40促效劑為L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 目錄號20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 目錄號20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 目錄號20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為鼠科動物單株抗體抗mCD134/mOX40 (純系OX86)，可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。

在一些實施例中，OX40促效劑係選自描述於以下文獻中之OX40促效劑：國際專利申請公開案第WO 95/12673號、第WO 95/21925號、第WO 2006/121810號、第WO 2012/027328號、第WO 2013/028231號、第WO 2013/038191號及第WO 2014/148895號；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案第US 2010/136030號、第US 2014/377284號、第US 2015/190506號及第US 2015/132288號(包括純系20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101號、第7,550,140號、第7,622,444號、第7,696,175號、第7,960,515號、第7,961,515號、第8,133,983號、第9,006,399號及第9,163,085號，各案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，OX40促效劑係如結構I-A (C端Fc-抗體片段融合蛋白)或結構I-B (N端Fc-抗體片段融合蛋白)中描繪之OX40激動性融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變異體或生物類似物。結構I-A及I-B之性質描述於上文及美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中，該等美國專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。圖18中給出之結構I-A之多肽域的胺基酸序列可見於表9中。Fc域較佳地包含完整恆定域(SEQ ID NO:62之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO:62之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分( 例如，SEQ ID NO:62之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc-抗體之較佳連接體可選自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中給出之實施例，包括適合額外多肽之融合的連接體。同樣，圖18中給出之結構I-B之多肽域的胺基酸序列可見於表10中。若Fc抗體片段與結構I-B中之TNRFSF融合蛋白的N端融合，則Fc模塊之序列較佳地為SEQ ID NO:73中所示者，且連接體序列較佳地選自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所陳述之彼等實施例。

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含選自由以下組成之群的一或多個OX40結合域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表17中所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述各物之可變重鏈及可變輕鏈的任何組合及其片段、衍生物、結合物、變異體及生物類似物。

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含有包含OX40L序列之一或多個OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含有包含根據SEQ ID NO:133之序列的一或多個OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含有包含可溶性OX40L序列之一或多個OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含有包含根據SEQ ID NO:134之序列的一或多個OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含有包含根據SEQ ID NO:135之序列的一或多個OX40結合域。

在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:127及SEQ ID NO:128所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126所示之序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包含一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域係包含V _H及V _L區之scFv域，該等區各自與表17中給出之V _H及V _L序列具有至少95%一致性，其中V _H及V _L域藉由連接體連接。表17. 可用作融合蛋白( 例如，結構I-A及I-B)中之OX40結合域或可用作scFv OX40促效劑抗體之額外多肽。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO: 133 OX40L
SEQ ID NO: 134 OX40L 可溶性域
SEQ ID NO: 135 OX40L 可溶性域(替代性)
SEQ ID NO: 136為008之可變重鏈
SEQ ID NO: 137為008之可變輕鏈
SEQ ID NO: 138為011之可變重鏈
SEQ ID NO: 139為011之可變輕鏈
SEQ ID NO: 140為021之可變重鏈
SEQ ID NO: 141為021之可變輕鏈
SEQ ID NO: 142為023之可變重鏈
SEQ ID NO: 143為023之可變輕鏈
SEQ ID NO: 144為重鏈可變區
SEQ ID NO: 145為輕鏈可變區
SEQ ID NO: 146為重鏈可變區
SEQ ID NO: 147為輕鏈可變區
SEQ ID NO: 148為人類化抗體之重鏈可變區
SEQ ID NO: 149為人類化抗體之重鏈可變區
SEQ ID NO: 150為人類化抗體之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 151為人類化抗體之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 152為人類化抗體之重鏈可變區
SEQ ID NO: 153為人類化抗體之重鏈可變區
SEQ ID NO: 154為人類化抗體之輕鏈可變區

SEQ ID NO: 155為人類化抗體之輕鏈可變區
SEQ ID NO: 156重鏈可變區
SEQ ID NO: 157輕鏈可變區

在一些實施例中，OX40促效劑為OX40激動性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性OX40結合域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包含在N末端及/或C末端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，OX40促效劑為OX40激動性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性OX40結合域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包含在N末端及/或C末端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域，其中該等可溶性OX40結合域中每一者缺乏柄區(該柄區促進三聚且提供與細胞膜的一定距離，但並非OX40結合域之一部分)且第一及第二肽連接體獨立地具有3-8個胺基酸之長度。

在一些實施例中，OX40促效劑為OX40激動性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域、(ii)第一肽連接體、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域、(iv)第二肽連接體及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中該等可溶性TNF超家族細胞介素域中每一者缺乏柄區且第一及第二肽連接體獨立地具有3-8個胺基酸之長度，且其中該TNF超家族細胞介素域為OX40結合域。

在一些實施例中，OX40促效劑為MEDI6383。MEDI6383為OX40激動性融合蛋白且可如美國專利第6,312,700號中所述來製備，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，OX40促效劑為OX40激動性scFv抗體，其包含與前述V _L域中任一者連接之前述V _H域中任一者。

在一些實施例中，OX40促效劑為Creative Biolabs OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。

在一些實施例中，OX40促效劑為OX40激動性抗體純系Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。 B. 視情況選用之細胞活力分析

視情況，在啟動性第一次擴增(有時稱為初始主體擴增)之後可使用此項技術中已知之標準分析來執行細胞活力分析。因此，在某些實施例中，該方法包括在啟動性第一次擴增後執行細胞活力分析。例如，可對主體TIL之樣品進行台盼藍排除分析，該分析選擇性標記死亡細胞且允許活力評估。其他用於測試活力之分析可包括但不限於阿爾瑪藍分析及MTT分析。 1. 細胞計數、活力、流式細胞術

在一些實施例中，量測細胞計數及/或活力。標誌物(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文所揭示或描述者)之表現可藉由流式細胞術使用FACSCanto™流式細胞儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於可購自BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA)之彼等)量測。細胞可使用拋棄式c-芯片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且活力可使用此項技術中已知之任何方法(包括但不限於台盼藍染色)來評估。細胞活力亦可基於美國專利申請公開案第2018/0282694號進行分析，該案以引用之方式整體併入本文中。細胞活力亦可基於美國專利申請公開案第2018/0280436號或國際專利申請公開案第WO/2018/081473號進行分析，兩者皆出於所有目的整體併入本文中。

在一些情況下，主體TIL群體可使用以下論述之方案立即冷凍保存。或者，主體TIL群體可如下文所論述進行REP且接著冷凍保存。同樣，在其中經基因修飾之TIL將用於療法中之情況中，主體或REP TIL群體可進行基因修飾以用於合適治療。 2. 細胞培養

在一些實施例中，用於擴增TIL之方法(包括上文所論述以及圖1及8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所例示之彼等)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL細胞培養基。在一些實施例中，培養基為無血清培養基。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增中之培養基係無血清的。在一些實施例中，在第二次擴增中之培養基係無血清的。在一些實施例中，在啟動性第一次擴增及第二次擴增(亦稱為快速第二次擴增)中之培養基均係無血清的。在一些實施例中，擴增TIL數目使用不超過一種類型之細胞培養基。可使用任何合適之細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺、50 μM硫酸鏈黴素及10 μM硫酸正大黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數目所需之培養基之量及培養基類型之數目。在一些實施例中，擴增TIL數目可包括頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在透氣容器中擴增細胞數目藉由減少擴增細胞所需之餵養頻率，而簡化擴增細胞數目所需之程序。

在一些實施例中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基係未過濾的。使用未過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所必需之程序。在一些實施例中，在第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME)。

在一些實施例中，該方法之持續時間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣品；在含有包括IL-2、1X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的第一透氣容器中培養腫瘤組織樣品持續約1-8天之持續時間，例如作為啟動性第一次擴增持續約7天，或作為啟動性第一次擴增持續約8天；將TIL轉移至第二透氣容器且在含有包括IL-2、2X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的該第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7-9天之持續時間，例如約7天、約8天或約9天。

在一些實施例中，該方法之持續時間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣品；在含有包括IL-2、1X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的第一透氣容器中培養腫瘤組織樣品持續約1-7天之持續時間，例如作為啟動性第一次擴增持續約7天；將TIL轉移至第二透氣容器且在含有包括IL-2、2X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的該第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7-14天或約7-9天之持續時間，例如約7天、約8天或約9天、約10天或約11天。

在一些實施例中，該方法之持續時間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣品；在含有包括IL-2、1X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的第一透氣容器中培養腫瘤組織樣品持續約1-7天之持續時間，例如作為啟動性第一次擴增持續約7天；將TIL轉移至第二透氣容器且在含有包括IL-2、2X抗原呈遞餵養細胞及OKT-3之細胞培養基的該第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7-11天之持續時間，例如約7天、約8天、約9天、約10天或約11天。

在一些實施例中，TIL係在透氣容器中擴增。已使用透氣容器來擴增TIL，其中使用PBMC，使用此項技術中已知之方法、組合物及裝置，包括美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號中所述之彼等，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，TIL係在透氣袋中擴增。在一些實施例中，使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)來擴增TIL。在一些實施例中，使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統，諸如WAVE生物反應器系統(亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare))來擴增TIL。在一些實施例中，細胞擴增系統包括透氣細胞袋，其體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L組成之群。

在一些實施例中，TIL可在G-REX燒瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。此類實施例允許細胞群體自約5×10 ⁵個細胞/cm ²擴增至介於10×10 ⁶與30×10 ⁶個細胞/cm ²之間。在一些實施例中，此舉未進行餵養。在一些實施例中，此舉未進行餵養，只要G-REX燒瓶中之培養基位於約10 cm之高度。在一些實施例中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一些實施例中，細胞介素可呈推注形式添加，不需要將細胞介素與培養基混合。此類容器、裝置及方法係此項技術中已知的且已用於擴增TIL，且包括美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際公開案第WO 2014/210036 A1號、美國專利申請公開案第us 2013/0115617 A1號、國際公開案第WO 2013/188427 A1號、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際公開案第WO 2011/072088 A2號、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際公開案第WO 2012/129201 A1號、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際公開案第WO 2013/173835 A1號、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號中所述之彼等，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。此類過程亦描述於Jin 等人, J. Immunotherapy,2012, 35:283-292中。 C.TIL中之基因的視情況選用之敲低或剔除

在一些實施例中，在擴增步驟之前、期間或之後，包括在密閉、無菌製造過程期間(各自如本文所提供)，進一步操縱本發明之經擴增TIL以便以瞬時方式改變蛋白質表現。在一些實施例中，瞬時改變之蛋白質表現係歸因於瞬時基因編輯。在一些實施例中，用轉錄因子(TF)及/或能夠瞬時改變TIL中之蛋白質表現的其他分子處理本發明之經擴增TIL。在一些實施例中，TF及/或能夠瞬時改變蛋白質表現之其他分子提供TIL群體中改變之腫瘤抗原表現及/或腫瘤抗原特異性T細胞數目之改變。

在某些實施例中，該方法包括基因編輯TIL群體。在某些實施例中，該方法包括基因編輯第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。

在一些實施例中，本發明包括經由核苷酸插入(諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包括信使RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA (siRNA)插入)至TIL群體中進行基因編輯，以用於一或多種蛋白質之表現的促進或一或多種蛋白質之表現的抑制，以及一組蛋白質之促進與另一組蛋白質之抑制的同時組合。

在一些實施例中，本發明之經擴增TIL經歷蛋白質表現之瞬時改變。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第一次擴增之前發生於主體TIL群體中，包括例如發生於獲自例如圖8 (尤其圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示之步驟A的TIL群體中。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第一次擴增期間發生，包括例如發生於在例如圖8 (例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所指示之步驟B中擴增的TIL群體中。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第一次擴增之後發生，包括例如發生於在第一次與第二次擴增之間轉變的TIL群體( 例如，如本文所述之第二TIL群體)中，所述TIL群體獲自例如圖8所指示之步驟B中且包括於步驟C中。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第二次擴增之前發生於主體TIL群體中，包括例如發生於獲自例如圖8所指示之步驟C且在步驟D中之其擴增之前的TIL群體中。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第二次擴增期間發生，包括例如發生於在例如圖8所指示之步驟D中擴增的TIL群體( 例如第三TIL群體)中。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變係在第二次擴增之後發生，包括例如發生於獲自例如圖8所指示之步驟D中之擴增的TIL群體中。

在一些實施例中，瞬時改變TIL群體中之蛋白質表現的方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係此項技術中已知的且描述於例如Tsong, Biophys. J.1991, 60,297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，瞬時改變TIL群體中之蛋白質表現的方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面塗佈及內吞作用)係此項技術中已知的且描述於Graham及van der Eb, Virology1973, 52,456-467；Wigler 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.1979, 76,1373-1376；及Chen及Okayarea, Mol. Cell. Biol.1987, 7,2745-2752；及美國專利第5,593,875號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，瞬時改變TIL群體中之蛋白質表現的方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法(諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n, n, n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法)係此項技術中已知的且描述於Rose 等人, Biotechniques1991, 10,520-525及Felgner 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84,7413-7417及美國專利第5,279,833號；第5,908,635號；第6,056,938號；第6,110,490號；第6,534,484號；及第7,687,070號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，瞬時改變TIL群體中之蛋白質表現的方法包括使用美國專利第5,766,902號；第6,025,337號；第6,410,517號；第6,475,994號；及第7,189,705號中所述之方法進行轉染之步驟；各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致幹細胞記憶T細胞(TSCM)之增加。TSCM係經歷抗原之中央記憶T細胞的早期祖細胞。TSCM通常呈現定義幹細胞之長期存活、自更新及多能能力，且通常可為生成有效TIL產品所需。在過繼性細胞轉移之小鼠模型中，與其他T細胞子集相比，TSCM已顯示增強之抗腫瘤活性。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致具有包含高比例之TSCM的組成之TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致TSCM百分率之至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%增加。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致TIL群體中之TSCM的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍增加。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之治療性TIL群體。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致經歷抗原之T細胞之更生。在一些實施例中，更生包括例如增加之增生、增加之T細胞活化及/或增加之抗原識別。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變會改變大部分T細胞中之表現以便保存腫瘤源性TCR譜系。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變不會改變腫瘤源性TCR譜系。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變維持腫瘤源性TCR譜系。

在一些實施例中，蛋白質之瞬時改變導致特定基因之表現改變。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向包括但不限於以下之基因：PD-1 (亦稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR (嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率組(HMG)盒(TOX)、錨蛋白重複域11 (ANKRD11)、BCL6共抑制因子(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A (PKA)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向選自由以下組成之群的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CTLA-4、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR (嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率組(HMG)盒(TOX)、錨蛋白重複域11 (ANKRD11)、BCL6共抑制因子(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A (PKA)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向PD-1。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向TGFBR2。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR4/5。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CTLA-4。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CBLB。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CISH。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR (嵌合共刺激受體)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向IL-2。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向IL-12。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向IL-15。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向IL-21。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向TIM3。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向LAG3。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向TIGIT。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向TET2。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向TGFβ。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR1。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR2。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR4。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCR5。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CXCR1。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CXCR2。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CSCR3。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL2 (MCP-1)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL3 (MIP-1α)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL4 (MIP1-β)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL5 (RANTES)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CXCL1。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CXCL8。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL22。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CCL17。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向VHL。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向CD44。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向PIK3CD。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向SOCS1。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向胸腺細胞選擇相關高遷移率組(HMG)盒(TOX)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向錨蛋白重複域11 (ANKRD11)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向BCL6共抑制因子(BCOR)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變靶向cAMP蛋白激酶A (PKA)。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致趨化介素受體之增加及/或過表現。在一些實施例中，藉由瞬時蛋白質表現過表現之趨化介素受體包括具有包括但不限於CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17之配位體的受體。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1、CTLA-4、CBLB、CISH、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TET2、TGFβR2及/或TGFβ表現(包括導致例如TGFβ路徑阻斷)。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CBLB (CBL-B)表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CISH表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM-3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG-3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TGFβR2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TGFβ表現。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致趨化介素受體之增加及/或過表現以便例如改良TIL運輸或移動至腫瘤位點。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致CCR (嵌合共刺激受體)之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致選自由以下組成之群的趨化介素受體之增加及/或過表現：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致介白素之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致選自由以下組成之群的介白素之增加及/或過表現：IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致NOTCH 1/2 ICD之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致VHL之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致CD44之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致PIK3CD之增加及/或過表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致SOCS1之增加及/或過表現。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之cAMP蛋白激酶A (PKA)表現。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之選自由以下組成之群的分子之表現：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之選自由以下組成之群的兩種分子之表現：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及選自由以下組成之群的一種分子之表現：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT及其組合之表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1以及CTLA-4、LAG3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT、TET2及其組合中之一者的表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及CTLA-4表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及LAG3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及CISH表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及CBLB表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及TIM3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之PD-1及TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及LAG3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及CISH表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及CBLB表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及TIM3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CTLA-4及TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG3及CISH表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG3及CBLB表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG3及TIM3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG3及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之LAG3及TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CISH及CBLB表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CISH及TIM3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CISH及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CISH及TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CBLB及TIM3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CBLB及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之CBLB及TET2表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及PD-1表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及LAG3表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及CISH表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及CBLB表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及TIGIT表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之TIM3及TET2表現。

在一些實施例中，藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法將選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合組成之群的黏附分子插入第一TIL群體、第二TIL群體或所收集之TIL群體中( 例如，增加黏附分子之表現)。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之選自由以下組成之群的分子之表現：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合，及增加及/或增強之CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合之表現。在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變導致減少及/或降低之選自由以下組成之群的分子之表現：PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、CISH、CBLB、TIGIT、TET2及其組合，及增加及/或增強之CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合之表現。

在一些實施例中，存在約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約80%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約85%之表現降低，在一些實施例中，存在至少約90%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約99%之表現降低。

在一些實施例中，存在約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約80%、約85%、約90%或約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約85%、約90%或約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約80%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約85%之表現增加，在一些實施例中，存在至少約90%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約95%之表現增加。在一些實施例中，存在至少約99%之表現增加。

在一些實施例中，藉由用轉錄因子(TF)及/或能夠瞬時改變TIL中之蛋白質表現的其他分子處理TIL來誘導蛋白質表現之瞬時改變。在一些實施例中，採用無SQZ載體之微流體平台來進行轉錄因子(TF)及/或能夠瞬時改變蛋白質表現之其他分子的細胞內遞送。此類方法證實將包括轉錄因子在內之蛋白質遞送至多種原代人類細胞(包括T細胞)之能力，其已描述於美國專利申請公開案第US 2019/0093073 A1號、第US 2018/0201889 A1號及第US 2019/0017072 A1號中，其中每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。此類方法可用於本發明以便使TIL群體暴露於轉錄因子(TF)及/或能夠誘導瞬時蛋白質表現之其他分子，其中該等TF及/或能夠誘導瞬時蛋白質表現之其他分子提供TIL群體中增加之腫瘤抗原表現及/或腫瘤抗原特異性T細胞數目之增加，因此導致TIL群體的再編程及如與非再編程TIL群體相比，再編程TIL群體之治療功效增加。在一些實施例中，再編程導致相對於TIL之開始或先前群體( 亦即，在再編程之前)群體，效應子T細胞及/或中央記憶T細胞之亞群增加，如本文所述。

在一些實施例中，轉錄因子(TF)包括但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為TCF-1。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為MYB。在一些實施例中，用誘導型亞全能幹細胞培養物(iPSC)，諸如市售KNOCKOUT血清替代物(Gibco/ ThermoFisher)來投與轉錄因子(TF)，以誘導額外TIL再編程。在一些實施例中，用iPSC混合液來投與轉錄因子(TF)以誘導額外TIL再編程。在一些實施例中，無需iPSC混合液來投與轉錄因子(TF)。在一些實施例中，再編程導致TSCM之百分率增加。在一些實施例中，再編程導致TSCM之百分率增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95% TSCM。

在一些實施例中，如上文所述之瞬時改變蛋白質表現之方法可與基因修飾TIL群體之方法組合，該基因修飾TIL群體之方法包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在某些實施例中，該方法包括基因修飾TIL群體之步驟。在某些實施例中，該方法包括基因修飾第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Levine 等人, Proc. Nat’l Acad. Sci.2006, 103,17372-77；Zufferey 等人 , Nat. Biotechnol.1997, 15,871-75；Dull 等人, J. Virology1998, 72, 8463-71及美國專利第6,627,442號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括γ-逆轉錄病毒轉導步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Cepko及Pear, Cur. Prot. Mol. Biol.1996, 9.9.1-9.9.16中，該文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括轉位子介導之基因轉移步驟。轉位子介導之基因轉移系統係此項技術中已知的且包括如下系統，其中轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現RNA或蛋白質經提供，使得該轉位酶之長期表現不會在轉殖基因細胞中發生，例如作為mRNA ( 例如，包含帽及聚A尾之mRNA)提供之轉位酶。合適的轉位子介導之基因轉移系統包括salmonid型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11及SB100x，及具有增加之酶活性的經工程改造酶，該等系統描述於例如Hackett 等人, Mol. Therapy2010, 18,674-83及美國專利第6,489,458號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，TIL中之蛋白質表現的瞬時改變係藉由小干擾RNA (siRNA)誘導，siRNA有時稱為短干擾RNA或沈默RNA，其為雙股RNA分子，長度通常為19-25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其干擾具有互補核苷酸序列之特定基因的表現。

在一些實施例中，蛋白質表現之瞬時改變為表現降低。在一些實施例中，TIL中之蛋白質表現的瞬時改變係藉由自遞送RNA干擾(sdRNA)誘導，sdRNA係具有高百分率之2’-OH取代(通常為氟或-OCH ₃)的化學合成之不對稱siRNA雙螺旋，其包含20個核苷酸之反義(向導)股及13-15個鹼基之有義(過客)股，該等股使用四乙二醇連接體(TEG)在其3’末端結合至膽固醇。小干擾RNA (siRNA)有時稱為短干擾RNA或沈默RNA，其為雙股RNA分子，長度通常為19-25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其干擾具有互補核苷酸序列之特定基因的表現。sdRNA係共價及疏水性修飾之RNAi化合物，該等化合物無需遞送媒劑來進入細胞。sdRNA通常係不對稱的化學修飾之核酸分子，具有最小雙股區。sdRNA分子通常含有單股區及雙股區且可在該分子之單股及雙股區兩者內含有多種化學修飾。另外，sdRNA分子可附接至疏水性結合物，諸如習知及高級甾醇型分子，如本文所述。sdRNA及用於製備此類sdRNA之相關方法亦已廣泛地描述於例如美國專利申請公開案第US 2016/0304873 A1號、第US 2019/0211337 A1號、第US 2009/0131360 A1號及第US 2019/0048341 A1號及美國專利第10,633,654號及第10,913,948B2號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。為了最佳化sdRNA結構、化學、靶向位置、序列偏好及其類似因素，已開發算法且將其用於sdRNA效力預測。基於此等分析，通常已將功能性sdRNA序列定義為在1 µM濃度下具有超過70%表現降低，其概率超過40%。

雙股DNA (dsRNA)通常可用於定義任何包含一對互補RNA股(通常為有義(過客)及反義(作為向導)股)之分子，且可包括單股懸垂區。與siRNA相比，術語dsRNA通常係指包括siRNA分子之序列的前驅體分子，該siRNA分子藉由裂解酶系統(包括Dicer)之作用自較大dsRNA分子釋放。

在一些實施例中，該方法包括TIL群體(包括經修飾以表現CCR之TIL)中之蛋白質表現的瞬時改變，其包括使用自遞送RNA干擾(sdRNA)誘導，sdRNA例如係具有高百分率之2’-OH取代(通常為氟或-OCH ₃)的化學合成之不對稱siRNA雙螺旋，其包含20個核苷酸之反義(向導)股及13-15個鹼基之有義(過客)股，該等股使用四乙二醇連接體(TEG)在其3’末端結合至膽固醇。使用siRNA及sdRNA之方法已描述於Khvorova及Watts, Nat. Biotechnol.2017, 35,238-248；Byrne 等人, J. Ocul. Pharmacol. Ther.2013, 29,855-864；及Ligtenberg 等人, Mol. Therapy,2018, 26,1482-93中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，使用電穿孔或細胞膜破壞(諸如擠壓或SQZ方法)來實現siRNA遞送。在一些實施例中，不使用電穿孔、SQZ或其他方法，而是使用其中使TIL群體暴露於培養基中濃度為1 µM/10,000個TIL之sdRNA的1-3天時期來實現將sdRNA遞送至TIL群體。在某些實施例中，該方法包括將siRNA或sdRNA遞送至TIL群體，其包括使TIL群體暴露於培養基中濃度為1 µM/10,000個TIL之sdRNA持續1-3天之間之時期。在一些實施例中，使用其中使TIL群體暴露於培養基中濃度為10 µM/10,000個TIL之sdRNA的1-3天時期來實現將sdRNA遞送至TIL群體。在一些實施例中，使用其中使TIL群體暴露於培養基中濃度為50 µM/10,000個TIL之sdRNA的1-3天時期來實現將sdRNA遞送至TIL群體。在一些實施例中，使用其中使TIL群體暴露於培養基中濃度介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL之間之sdRNA的1-3天時期來實現將sdRNA遞送至TIL群體。在一些實施例中，使用其中使TIL群體暴露於培養基中濃度介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL之間之sdRNA的1-3天時期來實現將sdRNA遞送至TIL群體，其中藉由將新鮮sdRNA添加至培養基中來執行暴露於sdRNA兩次、三次、四次或五次。其他合適過程描述於例如美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1號、第US 2013/0131141 A1號及第US 2013/0131142 A1號及美國專利第9,080,171號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，在製造期間將siRNA或sdRNA插入TIL群體中。在一些實施例中，sdRNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A (PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施例中，基於基因沈默之百分率來確定表型降低，例如，如藉由流式細胞術及/或qPCR.所評估。在一些實施例中，存在約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約80%、約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約85%、約90%或約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約80%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約85%之表現降低，在一些實施例中，存在至少約90%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約95%之表現降低。在一些實施例中，存在至少約99%之表現降低。

基於siRNA之化學修飾的可自遞送RNAi技術可用於本發明方法以成功地將sdRNA遞送至TIL，如本文所述。具有不對稱siRNA結構及疏水性配位體之骨架修飾的組合( 參見例如Ligtenberg 等人, Mol. Therapy,2018, 26,1482-93及美國專利申請公開案第2016/0304873 A1號，其揭示內容以引用之方式併入本文中)允許sdRNA滲透經培養之哺乳動物細胞而無需額外調配物及方法，僅需簡單添加至培養基中，從而利用sdRNA之核酸酶穩定性。此穩定性允許簡單地藉由維持培養基中之sdRNA的活性濃度來支持恆定水準之RNAi介導之標靶基因活性降低。不受理論束縛，sdRNA之骨架穩定化提供基因表現效應之延長降低，其可在非分裂細胞總持續數月。

在一些實施例中，TIL之轉染效率超過95%，且各種特異性siRNA或sdRNA導致標靶表現降低。在一些實施例中，用完全修飾之序列置換含有數個未經修飾核糖殘基之siRNA或sdRNA以增加RNAi效應之效力及/或壽命。在一些實施例中，表現效應之降低維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更久。在一些實施例中，表現效應之降低在TIL之siRNA或sdRNA處理後10天或更久減少。在一些實施例中，維持標靶表現之超過70%表現降低。在一些實施例中，TIL維持標靶表現之超過70%表現降低。在一些實施例中，PD-1/PD-L1路徑之表現降低允許TIL展現更有效活體內效應，這在一些實施例中係歸因於避免PD-1/PD-L1路徑之抑制效應。在一些實施例中，由siRNA或sdRNA引起之PD-1表現降低導致TIL增生之增加。

在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之70%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之75%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之80%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之85%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之90%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之95%表現降低。在一些實施例中，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之99%表現降低。在一些實施例中，當以約0.25 µM至約4 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約0.25 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約0.5 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約0.75 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約1.0 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約1.25 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約1.5 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約1.75 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約2.0 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約2.25 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約2.5 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約2.75 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約3.0 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約3.25 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約3.5 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約3.75 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。在一些實施例中，當以約4.0 µM之濃度遞送時，本發明中所用之sdRNA序列展現標靶基因之表現降低。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸劑包含一或多個修飾以增加該治療劑之穩定性及/或有效性，且實現將該寡核苷酸有效遞送至待處理之細胞或組織。此類修飾可包括2’-O-甲基修飾、2’-O-氟修飾、二硫代磷酸酯修飾、2’ F修飾之核苷酸、2’-O-甲基修飾之及/或2’去氧核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸係經修飾以包括一或多個疏水性修飾，包括例如甾醇、膽固醇、維他命D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在一些實施例中，經化學修飾之核苷酸為硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施例中，糖可經修飾且經修飾之糖可包括但不限於D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基及2’-0-乙基) (亦即，2’-烷氧基)、2’-胺基、2’-S-烷基、2’-鹵基(包括2’-氟)、T-甲氧基乙氧基、2’-烯丙氧基(-OCH ₂CH=CH ₂)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及其類似基團。在一些實施例中，糖部分可為己糖且併入寡核苷酸中，如Augustyns 等人, Nucl. Acids. Res.1992, 18,4711中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整個長度上為雙股，亦即，在該分子之任一末端均不具有懸垂單股序列，亦即為鈍端的。在一些實施例中，個別核酸分子可具有不同長度。換言之，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整個長度上並非雙股。例如，當使用兩種單獨核酸分子時，該等分子之一( 例如，包含反義序列之第一分子)可長於與其雜交之第二分子(留下該分子之一部分為單股)。在一些實施例中，當使用單一核酸分子時，該分子在任一末端之一部分均可保持單股。

在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在該寡核苷酸之至少約70%長度上為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約80%長度上為雙股。在其他實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約90%-95%長度上為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約96%-98%長度上為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。

在一些實施例中，該siRNA或sdRNA寡核苷酸可實質上免受核酸酶影響，例如藉由修飾3’或5’鍵聯，如美國專利第5,849,902號中所述，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。例如，寡核苷酸可藉由包括「阻斷基」而產生抗性。如本文所用，術語「阻斷基」係指可附接至寡核苷酸或核單體之取代基( 例如，非OH基團)，作為保護基或偶合基以用於合成( 例如，FITC、丙基(CH ₂-CH ₂-CH ₃)、二醇(-O-CH ₂-CH ₂-O-) 磷酸酯(PO ₃ ^2")、膦酸氫鹽或亞磷醯胺)。「阻斷基」亦可包括「末端阻斷基」或「核酸外切酶阻斷基」，該等阻斷基保護寡核苷酸之5’及3’端，包括經修飾核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA內之鄰接聚核苷酸的至少一部分係藉由替代鍵聯( 例如，硫代磷酸酯鍵聯)經連接。

在一些實施例中，化學修飾可導致siRNA或sdRNA之細胞攝取的至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500%增強。在一些實施例中，C或U殘基中之至少一者包括疏水性修飾。在一些實施例中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60% 65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%之C及U可含有疏水性修飾。在一些實施例中，所有C及U均含有疏水性修飾。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子經由併入可質子化胺而展現增強之內體釋放。在一些實施例中，可質子化胺係併入有義鏈中(在RISC裝載之後丟棄之分子部分中)。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物包含不對稱化合物，該不對稱化合物包含雙螺旋區(10-15個鹼基長之有效RISC進入所需)及4-12個核苷酸長之單股區；具有13個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，採用6個核苷酸之單股區。在一些實施例中，siRNA或sdRNA之單股區包含2-12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施例中，採用6-8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物亦包括獨特化學修飾模式，其提供穩定性且可與RISC進入相容。舉例而言，亦可藉由任何確認穩定性而不干擾RISC進入之化學修飾來修飾向導鏈。在一些實施例中，向導鏈中之化學修飾模式包括大部分C及U核苷酸經2’ F修飾且5 ‘末端經磷酸化。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA中之至少30%核苷酸係經修飾。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中之至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸係經修飾。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中之100%核苷酸係經修飾。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有最小雙股區。在一些實施例中，該分子之雙股區介於8-15個核苷酸長之範圍內。在一些實施例中，該分子之雙股區為8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施例中，雙股區為13個核苷酸長。在向導鏈與過客鏈之間可存在100%互補性，或在向導鏈與過客鏈之間可存在一或多個錯配。在一些實施例中，在該雙股分子之一個末端，該分子為鈍端的或具有一個核苷酸之懸垂物。該分子之單股區在一些實施例中介於4-12個核苷酸長之間。在一些實施例中，單股區可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區亦可為小於4個或大於12個核苷酸長。在某些實施例中，單股區為6或7個核苷酸長。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有增加之穩定性。在一些實施例中，經化學修飾之siRNA或sdRNA分子在培養基中具有長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時之半衰期，包括任何中間值。在一些實施例中，siRNA或sd-RNA在培養基中具有長於12小時之半衰期。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA係經最佳化以實現增加之效力及/或降低之毒性。在一些實施例中，向導鏈及/或過客鏈之核苷酸長度及/或向導鏈及/或過客鏈中之硫代磷酸酯修飾的數目可在一些態樣中影響RNA分子之效力，同時用2’-O-甲基(2’OMe)修飾置換2’-氟(2’F)修飾可在一些態樣中影響該分子之毒性。在一些實施例中，預測分子之2’F含量降低會降低該分子之毒性。在一些實施例中，RNA分子中之硫代磷酸酯修飾的數目可影響細胞中該分子之攝取，例如該分子被動攝取至細胞中之效率。在一些實施例中，siRNA或sdRNA不具有2’F修飾，但其特徵在於細胞攝取及組織滲透之相等效率。

在一些實施例中，向導鏈之長度為大約18-19個核苷酸且具有大約2-14個磷酸酯修飾。例如，向導鏈可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超過14個經磷酸酯修飾之核苷酸。向導鏈可含有一或多個修飾，該一或多個修飾賦予增加之穩定性而不干擾RISC進入。經磷酸酯修飾之核苷酸(諸如經硫代磷酸酯修飾之核苷酸)可位於3’末端、5’末端或遍佈於向導鏈中。在一些實施例中，向導鏈之3’端10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經硫代磷酸酯修飾之核苷酸。向導鏈亦可含有2’F及/或2’OMe修飾，該等修飾可位於整個分子中。在一些實施例中，向導鏈之位置1中的核苷酸(向導鏈之最5’位置中的核苷酸)係經2’OMe修飾及/或磷酸化。向導鏈內之C及U核苷酸可經2’F修飾。例如，19 nt向導鏈之位置2-10 (或不同長度之向導鏈中的相應位置)中之C及U核苷酸可經2’F修飾。向導鏈內之C及U核苷酸亦可經2’OMe修飾。例如，19 nt向導鏈之位置11-18 (或不同長度之向導鏈中的相應位置)中之C及U核苷酸可經2’OMe修飾。在一些實施例中，向導鏈之最3’末端的核苷酸係未經修飾的。在某些實施例中，向導鏈內之大多數C及U係經2’F修飾且向導鏈之5’末端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1以及在位置11-18中之C或U係經2’OMe修飾且向導鏈之5’末端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1以及在位置11-18中之C或U係經2’OMe修飾，向導鏈之5’末端係經磷酸化，且位置2-10中之C或U係經2’F修飾。

可自遞送RNAi技術提供一種用RNAi劑(無論siRNA、sdRNA或其他RNAi劑)直接轉染細胞之方法，無需額外調配物或技術。轉染難以轉染細胞株之能力、高 活體內活性及容易使用係提供優於傳統的基於siRNA之技術之顯著功能性優勢的組合物及方法之特徵，且因而，該等sdRNA方法用於與本發明之TIL中的標靶基因表現之降低方法相關之數個實施例中。該sdRNA方法允許將化學合成之化合物直接遞送至多種原代細胞及組織，離體及 活體內均可。本文中，本發明之一些實施例中所述的sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。

siRNA及sdRNA可形成為疏水性修飾之siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrne 等人, J. Ocular Pharmacol. Therapeut., 2013, 29, 855-864中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，可使用無菌電穿孔將siRNA或sdRNA寡核苷酸遞送至本文所述之TIL。在某些實施例中，該方法包括對TIL進行進行無菌電穿孔以遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸。

在一些實施例中，該等寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合遞送至細胞。在一些實施例中，此跨膜遞送系統包含脂質、病毒載體及其類似物。在一些實施例中，寡核苷酸劑為自遞送RNAi劑，其不需要任何遞送劑。在某些實施例中，該方法包括使用跨膜遞送系統以將siRNA或sdRNA寡核苷酸遞送至TIL群體。

使寡核苷酸及寡核苷酸組合物與( 例如，使之接觸，本文中亦稱為投與或遞送至)本文所述之TIL接觸且由該等TIL吸收，包括經由TIL之被動攝取。在第一次擴增(例如步驟B)期間，在第一次擴增之後(例如在步驟C期間)，在第二次擴增之前或期間(例如在步驟D之前或期間、在步驟D之後且在步驟E中之收集之前、在步驟F中之收集期間或之後、在步驟F中的最終調配及/或轉移至輸注袋之前或期間以及在步驟F中的任何視情況選用之冷凍保存步驟之前)，可將sdRNA添加至如本文所述之TIL中。此外，可在自步驟F中之任何冷凍保存步驟解凍之後添加sdRNA。在一些實施例中，可將一或多種如本文所述之sdRNA靶向基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)以選自由以下組成之群的濃度添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基中：100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM。在一些實施例中，可將一或多種如本文所述之sdRNA靶向基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)以選自由以下組成之群的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基中：0.1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.5 μM sdRNA/ 10,000個TIL/100 μL培養基、0.75 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.25 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、2 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基或10 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基。在一些實施例中，在REP前或REP階段期間，可每天兩次、每天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次將一或多種如本文所述之sdRNA靶向基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)添加至TIL培養物中。

可在擴增過程期間使本發明之寡核苷酸組合物(包括sdRNA)與如本文所述之TIL接觸，例如藉由使sdRNA以高濃度溶解於細胞培養基中且允許有充足時間發生被動攝取。在某些實施例中，本發明方法包括使TIL群體與如本文所述之寡核苷酸組合物接觸。在某些實施例中，該方法包括使寡核苷酸( 例如sdRNA)溶解於細胞培養基中且使該細胞培養基與TIL群體接觸。該等TIL可為如本文所述之第一群體、第二群體及/或第三群體。

在一些實施例中，可藉由合適的技術公認方法來增強寡核苷酸至細胞中之遞送，該等方法包括磷酸鈣、DMSO、甘油或聚葡萄糖、電穿孔或藉由例如使用陽離子、陰離子或中性脂質組合物或脂質體使用此項技術中已知之方法進行轉染，諸如美國專利第4,897,355號；第5,459,127號；第5,631,237號；第5,955,365號；第5,976,567號；第10,087,464號；及第10,155,945號；以及Bergan 等人, Nucl. Acids Res.1993, 21,3567中所述之彼等方法，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，使用超過一種siRNA或sdRNA來降低標靶基因之表現。在一些實施例中，合起來使用PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH靶向siRNA或sdRNA中之一或多者。在一些實施例中，PD-1 siRNA或sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH中之一或多者一起使用以便降低超過一種基因標靶之表現。在一些實施例中，LAG3 siRNA或sdRNA與CISH靶向siRNA或sdRNA組合使用以降低兩種標靶之基因表現。在一些實施例中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH中之一或多者的siRNA或sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA或多個其他供應商。

在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且另一siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自以下之基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自以下之基因：PD-1，及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合中之一者。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。

如本文所論述，本發明之實施例提供腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，該等淋巴細胞已經由基因編輯經基因修飾以增強其治療效應。本發明之實施例涵蓋經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL群體中進行之基因編輯以用於一或多種蛋白質之表現的促進及一或多種蛋白質之表現的抑制，以及其組合。本發明之實施例亦提供用於將TIL擴增至治療群體中之方法，其中該等方法包括基因編輯TIL。有數種基因編輯技術可用於基因修飾TIL群體，該等技術適合根據本發明來使用。此類方法包括下文所述之方法以及本文中別處所述之病毒及轉位子方法。在一些實施例中，基因修飾TIL、MIL或PBL以表現CCR之方法亦可包括經由此類基因之穩定剔除或此類基因之瞬時敲低進行修飾以抑制基因表現。

在一些實施例中，該方法包括基因修飾如本文所述之第一群體、第二群體及/或第三群體中之TIL群體的方法。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括穩定併入基因以產生或抑制( 例如，沈默)一或多種蛋白質的步驟。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係此項技術中已知的且描述於例如Tsong, Biophys.J.1991, 60,297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用此項技術中已知之其他電穿孔方法，諸如美國專利第5,019,034號；第5,128,257號；第5,137,817號；第5,173,158號；第5,232,856號；第5,273,525號；第5,304,120號；第5,318,514號；第6,010,613號及第6,078,490號中所述之彼等，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中至少三個DC電脈衝之序列具有以下特徵中之一者、兩者或三者：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同；及(3)該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔。在一些實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以誘導TIL中之孔形成，其包括向TIL施加至少三個DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中至少三個DC電脈衝之序列具有以下特徵中之一者、兩者或三者：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同；及(3)該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔，以致經誘導之孔持續相對較長時期，且以致維持TIL之活力。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面塗佈及內吞作用)係此項技術中已知的且描述於Graham及van der Eb, Virology1973, 52,456-467；Wigler 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.1979, 76,1373-1376；及Chen及Okayarea, Mol. Cell. Biol.1987, 7,2745-2752；及美國專利第5,593,875號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法(諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n, n, n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法)係此項技術中已知的且描述於Rose 等人, Biotechniques1991, 10,520-525及Felgner 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84,7413-7417及美國專利第5,279,833號；第5,908,635號；第6,056,938號；第6,110,490號；第6,534,484號；及第7,687,070號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括使用美國專利第5,766,902號；第6,025,337號；第6,410,517號；第6,475,994號；及第7,189,705號中所述之方法進行轉染之步驟；各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。該等TIL可為如本文所述之TIL之第一群體、第二群體及/或第三群體。

根據一實施例，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在一或多種免疫檢查點基因處生成雙股或單股斷裂。此類可編程核酸酶使得能夠藉由在特定基因體基因座處引入斷裂來進行精確基因體編輯， 亦即，其依賴於該基因體內之特定DNA序列的識別以將核酸酶域靶向此位置且介導在標靶序列處生成雙股斷裂。DNA中之雙股斷裂隨後將內源修復機制募集至斷裂位點以藉由非同源末端接合(NHEJ)或同源定向修復(HDR)來介導基因體編輯。因此，該斷裂之修復可導致引入插入/缺失突變，該等突變破壞( 例如，沈默、抑制或增強)標靶基因產物。

已開發用於實現位點特異性基因體編輯之核酸酶的大多數類別包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶( 例如，CRISPR/Cas9)。此等核酸酶系統可基於其DNA識別模式廣泛地分類成兩個種類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA相互作用實現特定DNA結合，而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由直接地與標靶DNA進行鹼基配對之短RNA向導分子且藉由蛋白質-DNA相互作用靶向特定DNA序列。 參見例如Cox 等人, Nature Medicine,2015, 第21卷, 第2期。

可根據本發明之TIL擴增方法使用的基因編輯方法之非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，該等方法更詳細地描述於下文中。根據一實施例，用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述( 例如Gen 2)或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所述之方法的任何實施例來進行，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者基因編輯該等TIL之至少一部分，以便生成可提供增強之治療效應的TIL。根據一實施例，可藉由 活體外比較經基因編輯之TIL與未經修飾之TIL，例如藉由與未經修飾之TIL相比評估 活體外效應子功能、細胞介素型態等來評估其經改良之治療效應。在某些實施例中，該方法包括使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法來基因編輯TIL群體。

在本發明之一些實施例中，電穿孔用於遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流動電穿孔系統。適合與本發明之一些實施例一起使用的合適流動電穿孔系統之實例為市售MaxCyte STX系統。有數種可適合與本發明一起使用之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus、Cellaxess Elektra (Cellectricon)、Nucleofector (Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell (BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96 (Ambion)之AgilePulse系統或ECM 830。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之剩餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之剩餘部分形成密閉無菌系統。

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述( 例如Gen 2)或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所述之方法的任何實施例來進行，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法( 例如，CRISPR/Cas9或CRISPR/ Cpf1)基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中沈默或降低。或者，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中增強。

CRISPR代表規律成簇間隔短回文重複序列。使用CRISPR系統來進行基因編輯之方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型之CRISPR系統併入RNA及Cas蛋白，且可根據本發明使用：I、II及III型。II型CRISPR (由Cas9例示)係最充分表徵之系統之一。

CRISPR係根據細菌及古生菌(單細胞微生物領域)之天然防禦機制進行改編的。此等生物體使用CRISPR源性RNA及各種Cas蛋白(包括Cas9)，藉由切開且破壞外來入侵者之DNA來抵禦病毒及各種異物之攻擊。CRISPR為DNA之特殊區域，具有兩種獨特特徵：存在核苷酸重複序列及間隔子。核苷酸重複序列分佈於整個CRISPR區中，其中外來DNA (間隔子)之短區段散佈於該等衝虛序列中。在II型CRISPR/Cas系統中，間隔子係整合於CRISPR基因體基因座內且經轉錄，且經處理成短CRISPR RNA (crRNA)。此等crRNA退火為反式活化crRNA (tracrRNA)且指導Cas蛋白對病原DNA之序列特異性裂解及沈默。藉由Cas9蛋白進行之標靶識別需要crRNA內之「種子」序列及在crRNA結合區上游的保守含二核苷酸之原間隔子相鄰基序(PAM)序列。由此，可藉由再設計crRNA來再靶向CRISPR/Cas系統以裂解幾乎任何DNA序列。原生系統中之crRNA及tracrRNA可簡化成大約100個核苷酸之單一向導RNA (sgRNA)以用於基因工程改造。該CRISPR/Cas系統藉由共遞送表現Cas9核酸內切酶之質體及必需crRNA組分可直接移動至人類細胞。Cas蛋白之不同變異體可用於降低靶向限制( 例如Cas9之直系同源物，諸如Cpf1)。

可藉由經由CRISPR方法永久基因編輯TIL而沈默或受到抑制之基因的非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。

可藉由經由CRISPR方法永久基因編輯TIL而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。

藉由CRISPR方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於美國專利第8,697,359號；第8,993,233號；第8,795,965號；第8,771,945號；第8,889,356號；第8,865,406號；第8,999,641號；第8,945,839號；第8,932,814號；第8,871,445號；第8,906,616號；及第8,895,308號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源(諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體)可購自諸如GenScript之公司。

在一些實施例中，可使用如美國專利第US 9790490號中所述之CRISPR/Cpf1系統來執行如本文所述之TIL群體之基因修飾，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述( 例如Gen 2)或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所述之方法的任何實施例來進行，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由TALE方法基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中沈默或降低。或者，在TIL擴增過程期間使用TALE方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中增強。

TALE代表轉錄活化子樣效應子蛋白，其包括轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)。使用TALE系統來進行基因編輯之方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE係來自植物病原菌黃單胞菌屬( Xanthomonas)之天然存在之蛋白質，且含有由一系列33-35個胺基酸之重複域構成的DNA結合域，該等重複域各自識別單一鹼基對。藉由兩種高變胺基酸確定TALE特異性，該等高變胺基酸係稱作重複-可變二殘基(RVD)。使模塊TALE重複序列連接在一起以識別鄰接DNA序列。DNA結合域中之特定RVD識別標靶基因座中之鹼基，從而提供結構特徵以組裝可預測DNA結合域。使TALE之DNA結合域融合至IIS型FokI核酸內切酶之催化域以產生可靶向TALE核酸酶。為了誘導位點特異性突變，兩個個別TALEN臂由14-20個鹼基對之間隔子區隔開，使FokI單體緊密接近以二聚且產生靶向雙股斷裂。

利用各種組裝方法進行之數項大型系統研究已指示，可組合TALE重複序列以識別幾乎任何用戶定義之序列。定制設計之TALE陣列亦可經由Cellectis Bioresearch (Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies (Grand Island, NY, USA)購得。適合用於本發明之TALE及TALEN方法係描述於美國專利申請公開案第US 2011/0201118 A1號；第US 2013/0117869 A1號；第US 2013/0315884 A1號；第US 2015/0203871 A1號及第US 2016/0120906 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

可藉由經由TALE方法永久基因編輯TIL而沈默或受到抑制之基因的非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。

可藉由經由TALE方法永久基因編輯TIL而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。

藉由TALE方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於美國專利第8,586,526號中，該案以引用之方式併入本文中。

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所述之方法的任何實施例來進行，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中沈默或降低。或者，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中增強。

個別鋅指在保守ββα組態中含有大約30個胺基酸。在α-螺旋之表面上的數個胺基酸通常接觸DNA大溝中之3個bp，具有變化水準之選擇性。鋅指具有兩個蛋白質域。第一個域為DNA結合域，其包括真核轉錄因子且含有鋅指。第二個域為核酸酶域，其包括FokI限制酶且負責DNA之催化裂解。

個別ZFN之DNA結合域通常含有介於三個與六個之間的個別鋅指重複序列且可各自識別9個與18個之間的鹼基對。若鋅指域對其預期標靶位點具特異性，則理論上，即使一對識別總計18個鹼基對之3指ZFN亦可靶向哺乳動物基因體中之單一基因座。一種生成新的鋅指陣列之方法係組合具有已知特異性之較小鋅指「模塊」。最常見的模塊組裝過程涉及組合各自可識別3個鹼基對之DNA序列的三個獨立鋅指以生成3指陣列，該陣列可識別9個鹼基對之標靶位點。或者，可使用基於選擇之方法(諸如寡聚池工程改造(OPEN))自隨機化文庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機化文庫考慮到相鄰指之間的上下文相關相互作用。經工程改造之鋅指可購自Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)及Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。

可藉由經由鋅指方法永久基因編輯TIL而沈默或受到抑制之基因的非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。

可藉由經由鋅指方法永久基因編輯TIL而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。

藉由鋅指方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於美國專利第6,534,261號、第6,607,882號、第6,746,838號、第6,794,136號、第6,824,978號、第6,866,997號、第6,933,113號、第6,979,539號、第7,013,219號、第7,030,215號、第7,220,719號、第7,241,573號、第7,241,574號、第7,585,849號、第7,595,376號、第6,903,185號及第6,479,626號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

藉由鋅指方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之其他實例係描述於Beane 等人, Mol. Therapy, 2015, 23,1380-1390中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，TIL視情況經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和力TCR，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子( 例如間皮素)或譜系受限之細胞表面分子( 例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施例中，該方法包括基因工程改造TIL群體以包括高親和力TCR，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子( 例如間皮素)或譜系受限之細胞表面分子( 例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。適當地，該等TIL群體可為如本文所述之第一群體、第二群體及/或第三群體。 D. 基因編輯過程 1. 概覽： TIL 擴增 + 基因編輯

本發明之實施例係關於擴增TIL群體之方法，該等方法包括基因編輯該等TIL之至少一部分的一或多個步驟以便增強其治療效應。如本文所用，「基因編輯(gene-editing/gene editing)」及「基因體編輯(genome editing)」係指一種類型之基因修飾，其中DNA在細胞基因體中經永久修飾，例如DNA在細胞之基因體內的插入、缺失、修飾或置換。在一些實施例中，基因編輯使DNA序列之表現沈默(有時亦稱為基因剔除)或受到抑制/降低(有時亦稱為基因敲低)。根據本發明之實施例，使用基因編輯技術來增強治療性TIL群體之有效性。

可根據本文所述之方法的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法進一步包括基因編輯該等TIL之至少一部分。根據額外實施例，根據WO 2018/081473 A1、WO 2018/129332 A1或WO 2018/182817 A1中所述之方法的任何實施例來進行將TIL擴增成治療性TIL群體之方法，各案以引用之方式整體併入本文中，其中該方法進一步包括基因編輯該等TIL之至少一部分。因此，本發明之一實施例提供一種已根據本文所述之任何實施例經擴增的治療性TIL群體，其中該治療群體之至少一部分已經基因編輯，例如，該治療性TIL群體中經轉移至輸注袋之至少一部分係經永久基因編輯。 2. TIL 擴增期間之基因編輯

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3- 9天以產生第二TIL群體； (c) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1- 7天，以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體；及 (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第四TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (d) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體；及 (f) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第四TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (c) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第四TIL群體持續約1-7天，以產生第五TIL群體之培養物；及 (f) 將第五TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (d) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (f) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第四TIL群體持續約1-7天，以產生第五TIL群體之培養物；及 (g) 將第五TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 在包含IL-2及OKT-3之第一細胞培養基中培養藉由在酶培養基中消化自個體或患者所切除之腫瘤組織以產生腫瘤消化物而獲得的第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (b) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體；及 (c) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，該方法包括培養或初始擴增第一TIL群體之步驟，其包括在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天，隨後在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體持續2-6天。

在一些實施例中，該方法包括培養或快速第二次擴增第三TIL群體之步驟，該步驟藉由在第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約1-7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3-7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3-9天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3-9天、約3-8天、約4-8天、約5-8天、約6-8天、約7-8天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約3-5天、約4-5天、約3-4天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約7天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約8天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約9天。

在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天、約1-2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約7天。

在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約5-15天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約5-15天、約6-15天、約7-15天、約8-15天、約9-15天、約10-15天、約11-15天、約12-15天、約13-15天、約14-15天、約5-14天、約6-14天、約7-14天、約8-14天、約9-14天、約10-14天、約11-14天、約12-14天、約13-14天、約5-13天、約6-13天、約7-13天、約8-13天、約9-13天、約10-13天、約11-13天、約12-13天、約5-12天、約6-12天、約7-12天、約8-12天、約9-12天、約10-12天、約11-12天、約5-11天、6-11天、7-11天、約8-11天、約9-11天、約10-11天、約5-10天、6-10天、7-10天、約8-10天、約9-10天、約5-9天、6-9天、7-9天、約8-9天、約5-8天、約6-8天、7-8天、約5-7天、約6-7天、約5-6天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約7天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約8天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約9天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約10天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約11天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約12天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約13天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約14天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約15天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約23天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約24天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約25天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約26天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約27天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約28天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約29天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約30天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約31天之時期內完成。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約1天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約1天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約1天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約1天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約1天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約2天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約2天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約2天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約2天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約2天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約3天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約3天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約3天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約3天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約3天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約4天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約4天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約4天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約4天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約4天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約6天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約6天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約6天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約6天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約6天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約3天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約6天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第四TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約7天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約7天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行，這意謂該基因編輯可在該擴增方法之任何步驟之前、期間或之後對TIL進行；例如，在上文方法中所概述之步驟(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)中任一者期間，或在上文方法中所概述之步驟(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)中任一者之前或之後。在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行超過一次。根據某些實施例，在培養步驟期間收集TIL (例如，對於該等TIL中之至少一部分，「暫停」該培養步驟)，且使所收集之TIL經歷基因編輯過程，且在一些情況下，隨後將其再引入返回培養步驟(例如，返回培養基)以繼續該培養步驟，因此該治療性TIL群體中最終轉移至輸注袋之至少一部分係經永久基因編輯。

應注意，該擴增過程之替代實施例可不同於上文所示之方法；例如，替代實施例可不具有相同步驟(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)，或可具有不同數目之步驟。不考慮特定實施例，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行。例如，替代實施例可包括超過兩個培養步驟，且有可能可在第三或第四培養步驟等期間在TIL上進行基因編輯。

根據一些實施例，當TIL仍在培養基中時且當正在進行培養步驟時執行基因編輯，亦即，不必為了進行基因編輯而自培養步驟中「移除」該等TIL。根據一些實施例，在自培養基收集之TIL上執行基因編輯，且在基因編輯過程之後，隨後將彼等TIL放回培養基中。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2及OKT-3之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3- 9天以產生第二TIL群體； (c) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體；及 (d) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2及OKT-3之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (d) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體；及 (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3-9天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3-9天、約3-8天、約4-8天、約5-8天、約6-8天、約7-8天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約3-5天、約4-5天、約3-4天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，培養第一TIL群體之步驟持續5天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約7天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約8天。在一些實施例中，執行培養第一TIL群體之步驟持續約9天。

在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約5-15天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約5-15天、約6-15天、約7-15天、約8-15天、約9-15天、約10-15天、約11-15天、約12-15天、約13-15天、約14-15天、約5-14天、約6-14天、約7-14天、約8-14天、約9-14天、約10-14天、約11-14天、約12-14天、約13-14天、約5-13天、約6-13天、約7-13天、約8-13天、約9-13天、約10-13天、約11-13天、約12-13天、約5-12天、約6-12天、約7-12天、約8-12天、約9-12天、約10-12天、約11-12天、約5-11天、6-11天、7-11天、約8-11天、約9-11天、約10-11天、約5-10天、6-10天、7-10天、約8-10天、約9-10天、約5-9天、6-9天、7-9天、約8-9天、約5-8天、約6-8天、7-8天、約5-7天、約6-7天、約5-6天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約7天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約8天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約9天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約10天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約11天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約12天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約13天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約14天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約15天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約23天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約24天之時期內完成。

在一些實施例中，培養第三TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第三TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，培養第三TIL群體之步驟藉由在第二培養基中培養第三TIL群體持續約5天之第一時期來執行，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行，這意謂該基因編輯可在該擴增方法之任何步驟之前、期間或之後進行；例如，在上文方法中所概述之步驟(a)-(d)或(a)-(e)中任一者期間，或在上文方法中所概述之步驟(a)-(d)或(a)-(e)中任一者之前或之後。在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行超過一次。根據某些實施例，在培養步驟期間收集TIL (例如，對於該等TIL中之至少一部分，「暫停」該培養步驟)，且使所收集之TIL經歷基因編輯過程，且在一些情況下，隨後將其再引入返回培養步驟(例如，返回培養基)以繼續該培養步驟，因此該治療性TIL群體中最終轉移至輸注袋之至少一部分係經永久基因編輯。

應注意，該擴增過程之替代實施例可不同於上文所示之方法；例如，替代實施例可不具有相同步驟(a)-(d)或(a)-(e)，或可具有不同數目之步驟。不考慮特定實施例，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行。例如，替代實施例可包括超過兩個培養步驟，且有可能可在第三或第四培養步驟等期間在TIL上進行基因編輯。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2及OKT-3之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (c) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體； (d) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約1-7天，以產生第四TIL群體之培養物；及 (e) 將第四TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供包含經擴增數目之TIL的第五TIL群體。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2及OKT-3之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-9天以產生第二TIL群體； (d) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體； (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約1-7天，以產生第四TIL群體之培養物；及 (f) 將第四TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供包含經擴增數目之TIL的第五TIL群體。

在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約1-7天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天、約1-2天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約1天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約7天。

在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約3-6天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約3-6天、約4-6天、約5-6天、約3-5天、約4-5天、約3-4天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養該複數個子培養物中的每一者之步驟持續約7天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約23天之時期內完成。

在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行，這意謂該基因編輯可在該擴增方法之任何步驟之前、期間或之後進行；例如，在上文方法中所概述之步驟(a)-(e)或(a)-(f)中任一者期間，或在上文方法中所概述之步驟(a)-(e)或(a)-(f)中任一者之前或之後。在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行超過一次。根據某些實施例，在培養步驟期間收集TIL (例如，對於該等TIL中之至少一部分，「暫停」該培養步驟)，且使所收集之TIL經歷基因編輯過程，且在一些情況下，隨後將其再引入返回培養步驟(例如，返回培養基)以繼續該培養步驟，因此該治療性TIL群體中最終轉移至輸注袋之至少一部分係經永久基因編輯。

應注意，該擴增過程之替代實施例可不同於上文所示之方法；例如，替代實施例可不具有相同步驟(a)-(e)或(a)-(f)，或可具有不同數目之步驟。不考慮特定實施例，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行。例如，替代實施例可包括超過兩個培養步驟，且有可能可在第三或第四培養步驟等期間在TIL上進行基因編輯。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天以產生第二TIL群體； (c) 在包含IL-2及OKT-3之第二細胞培養基中培養第二TIL群體持續2-4天以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體；及 (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第三細胞培養基中培養第四TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天以產生第二TIL群體； (d) 在包含IL-2及OKT-3之第二細胞培養基中培養第二TIL群體持續2-4天以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體；及 (f) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第三細胞培養基中培養第四TIL群體持續約5-15天，以產生經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，執行培養第二TIL群體之步驟持續約2-4天。在一些實施例中，執行培養第三TIL群體之步驟持續約2-4天、約3-4天、約2-3天。在一些實施例中，執行培養第二TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行培養第二TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養第二TIL群體之步驟持續約4天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。

在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行，這意謂該基因編輯可在該擴增方法之任何步驟之前、期間或之後進行；例如，在上文方法中所概述之步驟(a)-(f)或(a)-(g)中任一者期間，或在上文方法中所概述之步驟(a)-(f)或(a)-(g)中任一者之前或之後。在一些實施例中，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行超過一次。根據某些實施例，在培養步驟期間收集TIL (例如，對於該等TIL中之至少一部分，「暫停」該培養步驟)，且使所收集之TIL經歷基因編輯過程，且在一些情況下，隨後將其再引入返回培養步驟(例如，返回培養基)以繼續該培養步驟，因此該治療性TIL群體中最終轉移至輸注袋之至少一部分係經永久基因編輯。

應注意，該擴增過程之替代實施例可不同於上文所示之方法；例如，替代實施例可不具有相同步驟(a)-(f)或(a)-(g)，或可具有不同數目之步驟。不考慮特定實施例，該基因編輯過程可在TIL擴增方法期間之任何時間進行。例如，替代實施例可包括超過兩個培養步驟，且有可能可在第三或第四培養步驟等期間在TIL上進行基因編輯。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天以產生第二TIL群體； (c) 在包含IL-2及OKT-3之第二細胞培養基中培養第二TIL群體持續2-4天以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (e) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第三TIL群體持續約1-7天，以產生第四TIL群體之培養物；及 (f) 將第四TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供包含經擴增數目之TIL的第五TIL群體。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織以產生腫瘤消化物； (c) 在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天以產生第二TIL群體； (d) 在包含IL-2及OKT-3之第二細胞培養基中培養第二TIL群體持續2-4天以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (f) 在包含抗原呈遞細胞(APC)、OKT-3及IL-2之第二細胞培養基中培養第四TIL群體持續約1-7天，以產生第五TIL群體之培養物；及 (g) 將第五TIL群體之培養物分成複數個子培養物，在包含IL-2之第三細胞培養基中培養該複數個子培養物中的每一者持續約3-7天，且組合該複數個子培養物以提供包含經擴增數目之TIL的第五TIL群體。

在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約1-7天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約1-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天、約1-2天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約1天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行培養第四TIL群體之步驟持續約7天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群體之初始擴增(或啟動性第一次擴增)以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及視情況選用之抗原呈遞細胞(APC)，其中啟動性第一次擴增持續約3-9天之時期； (c) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (e) 在第二細胞培養基中執行第四TIL群體之快速第二次擴增以獲得經擴增數目之TIL，其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC；且其中在14天或更短之時期內執行快速擴增，視情況快速第二次擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群體之初始擴增(或啟動性第一次擴增)以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及視情況選用之抗原呈遞細胞(APC)，其中啟動性第一次擴增持續約3-9天之時期； (c) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體；及 (d) 在第二細胞培養基中執行第三TIL群體之快速第二次擴增以獲得經擴增數目之TIL，其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC；且其中在14天或更短之時期內執行快速擴增，視情況快速第二次擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤片段以產生腫瘤消化物； (c) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群體之初始擴增(或啟動性第一次擴增)以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及視情況選用之抗原呈遞細胞(APC)，其中啟動性第一次擴增持續約1-9天之時期； (d) 使用抗CD3及抗CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (f) 在第二細胞培養基中執行第四TIL群體之快速第二次擴增以獲得經擴增數目之TIL，其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC；且其中在14天或更短之時期內執行快速擴增，視情況快速第二次擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

在一些實施例中，用於製備經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法包括： (a) 自個體或患者所切除之腫瘤組織獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤片段以產生腫瘤消化物； (c) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群體之初始擴增(或啟動性第一次擴增)以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包含IL-2、視情況選用之OKT-3及視情況選用之抗原呈遞細胞(APC)，其中啟動性第一次擴增持續約1-9天之時期； (d) 基因編輯第二TIL群體之至少一部分，以產生第三TIL群體；及 (e) 在第二細胞培養基中執行第三TIL群體之快速第二次擴增以獲得經擴增數目之TIL，其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及APC；且其中在14天或更短之時期內執行快速擴增，視情況快速第二次擴增可在快速第二次擴增起始之後進行約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

在一些實施例中，執行初始擴增持續約3-9天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約1-9天、2-9天、3-9天、約4-9天、約5-9天、約6-9天、約7-9天、約8-9天、約1-8天、約2-8天、約3-8天、約4-8天、約5-8天、約6-8天、約7-8天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天或約1-2天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約1天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約2天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約3天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約4天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約5天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約6天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約7天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約8天。在一些實施例中，執行初始擴增持續約9天。

在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天或約1-2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約7天。

在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約5-15天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約5-15天、約6-15天、約7-15天、約8-15天、約9-15天、約10-15天、約11-15天、約12-15天、約13-15天、約14-15天、約5-14天、約6-14天、約7-14天、約8-14天、約9-14天、約10-14天、約11-14天、約12-14天、約13-14天、約5-13天、約6-13天、約7-13天、約8-13天、約9-13天、約10-13天、約11-13天、約12-13天、約5-12天、約6-12天、約7-12天、約8-12天、約9-12天、約10-12天、約11-12天、約5-11天、6-11天、7-11天、約8-11天、約9-11天、約10-11天、約5-10天、6-10天、7-10天、約8-10天、約9-10天、約5-9天、6-9天、7-9天、約8-9天、約5-8天、約6-8天、7-8天、約5-7天、約6-7天、約5-6天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約5天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約6天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約7天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約8天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約9天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約10天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約11天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約12天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約13天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約14天。在一些實施例中，執行快速第二次擴增持續約15天。

在一些實施例中，藉由在第二培養基中培養第三TIL群體持續約5天之第一時期來執行快速第二次擴增，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，藉由在第二培養基中培養第三TIL群體持續約5天之第一時期來執行快速第二次擴增，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 自藉由手術切除、針刺活組織檢查、粗針活組織檢查、小活組織檢查或其他用於自患者或個體獲得腫瘤組織之手段產生的腫瘤組織樣品獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 將腫瘤組織添加至密閉系統中且藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行第一次擴增持續約3-9天以獲得第二TIL群體； (c) 使用CD3及CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (d) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (e) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養第四TIL群體來執行第二次擴增，以產生第五TIL群體，其中執行第二次擴增持續約5-15天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，其中第五TIL群體為治療性TIL群體；及 (f) 收集獲自步驟(e)之治療性TIL群體，其中步驟(b)至(f)中之每一者係在密閉無菌系統中執行，且其中步驟(b)至步驟(c)之轉變、步驟(c)至步驟(d)之轉變、步驟(d)至步驟(e)之轉變及/或步驟(e)至步驟(f)之轉變無需打開該系統而發生。

在一些實施例中，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 自藉由手術切除、針刺活組織檢查、粗針活組織檢查、小活組織檢查或其他用於自患者或個體獲得腫瘤組織之手段產生的腫瘤組織樣品獲得及/或接收第一TIL群體； (b) 在酶培養基中消化腫瘤組織或腫瘤片段之樣品以產生腫瘤消化物； (c) 將腫瘤組織添加至密閉系統中且藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行第一次擴增持續約3-9天以獲得第二TIL群體； (d) 使用CD3及CD28珠粒或抗體來活化第二TIL群體持續1-7天，以產生第三TIL群體； (e) 基因編輯第三TIL群體之至少一部分，以產生第四TIL群體； (f) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養第四TIL群體來執行第二次擴增，以產生第五TIL群體，其中執行第二次擴增持續約5-15天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，其中第五TIL群體為治療性TIL群體；及 (g) 收集獲自步驟(e)之治療性TIL群體，其中步驟(c)至(g)中之每一者係在密閉無菌系統中執行，且其中步驟(c)至步驟(d)之轉變、步驟(d)至步驟(e)之轉變、步驟(e)至步驟(f)之轉變及/或步驟(f)至步驟(g)之轉變無需打開該系統而發生。

在一些實施例中，執行第一次擴增持續約3-9天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約3-9天、約3-8天、約3-7天、約3-6天、約3-5天、約3-4天、約4-9天、約4-8天、約5-9天、約5-8天、約6-9天、約6-8天、約7-9天、約7-8天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約3-5天、約4-5天、約3-4天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約3天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約4天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約5天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約6天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約7天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約8天。在一些實施例中，執行第一次擴增持續約9天。

在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1-7天、約2-7天、約3-7天、4-7天、約5-7天、約6-7天、約1-6天、約2-6天、約3-6天、約4-6天、約5-6天、約1-5天、約2-5天、約3-5天、約4-5天、約1-4天、約2-4天、約3-4天、約1-3天、約2-3天、約1-2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約1天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約2天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約3天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約4天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約5天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約6天。在一些實施例中，執行活化第二TIL群體之步驟持續約7天。

在一些實施例中，執行第二次擴增持續約5-15天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約5-15天、約6-15天、約7-15天、約8-15天、約9-15天、約10-15天、約11-15天、約12-15天、約13-15天、約14-15天、約5-14天、約6-14天、約7-14天、約8-14天、約9-14天、約10-14天、約11-14天、約12-14天、約13-14天、約5-13天、約6-13天、約7-13天、約8-13天、約9-13天、約10-13天、約11-13天、約12-13天、約5-12天、約6-12天、約7-12天、約8-12天、約9-12天、約10-12天、約11-12天、約5-11天、6-11天、7-11天、約8-11天、約9-11天、約10-11天、約5-10天、6-10天、7-10天、約8-10天、約9-10天、約5-9天、6-9天、7-9天、約8-9天、約5-8天、約6-8天、7-8天、約5-7天、約6-7天、約5-6天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約5天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約6天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約7天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約8天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約9天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約10天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約11天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約12天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約13天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約14天。在一些實施例中，執行第二次擴增持續約15天。

在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約8天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約9天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約10天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約11天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約12天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約13天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約14天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約15天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約16天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約17天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約18天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約19天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約20天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約21天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約22天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約23天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約24天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約25天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約26天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約27天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約28天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約29天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約30天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約31天之時期內完成。在一些實施例中，該方法之步驟在約32天之時期內完成。

在一些實施例中，藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行第二次擴增，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約5天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，藉由在第二培養基中培養第四TIL群體持續約5天之第一時期來執行第二次擴增，在該第一時期結束時，將培養物分成複數個子培養物，該複數個子培養物中之每一者在包含IL-2之第三培養基中培養持續約4天之第二時期，且在該第二時期結束時，組合該複數個子培養物以提供經擴增數目之TIL。

在一些實施例中，當TIL仍在培養基中時且當正在進行培養步驟時執行基因編輯，亦即，不必為了進行基因編輯而自培養步驟中「移除」該等TIL。根據一些實施例，在自培養基收集之TIL上執行基因編輯，且在基因編輯過程之後，隨後將彼等TIL放回培養基中。

在一些實施例中，基因編輯第二或第三TIL群體之至少一部分的步驟包括對第二或第三TIL群體執行無菌電穿孔步驟。

在一些實施例中，無菌電穿孔步驟介導至少一種基因編輯器之轉移。根據一些實施例，基因編輯器係用於調節至少一種蛋白質之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，TALE核酸酶系統下調PD-1之表現。根據一些實施例，基因編輯器進一步包含下調CTLA-4之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，基因編輯器進一步包含下調LAG-3之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，基因編輯器進一步包含下調CISH之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，基因編輯器進一步包含下調CBL-B之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，基因編輯器進一步包含下調TIGIT之表現的TALE核酸酶系統。根據一些實施例，所得TIL為PD-1剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CTLA-4剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為LAG-3剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CISH剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CBL-B剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為TIGIT剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL展現下調之PD-1表現及下調之CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT及CBL-B中的一或多者之表現。根據一些實施例，所得TIL展現下調之CTLA-4表現及下調之PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT及CBL-B中的一或多者之表現。根據一些實施例，所得TIL展現下調之LAG-3表現及下調之PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT及CBL-B中的一或多者之表現。根據一些實施例，所得TIL展現下調之CISH表現及下調之PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT及CBL-B中的一或多者之表現。根據一些實施例，所得TIL展現下調之CBL-B表現及下調之CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT及PD-1中的一或多者之表現。根據一些實施例，所得TIL為PD-1/CTLA-4雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為PD-1/LAG-3雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為PD-1/CISH雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為PD-1/CBL-B雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為PD-1/TIGIT雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CTLA-4/LAG-3雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CTLA-4/CISH雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CTLA-4/CBL-B雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CTLA-4/TIGIT雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為LAG-3/CISH雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為LAG-3/CBL-B雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為LAG-3/TIGIT雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CISH/CBL-B雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CISH/TIGIT雙剔除TIL。根據一些實施例，所得TIL為CBL-B/TIGIT雙剔除TIL。

在一些實施例中，基因編輯步驟進一步包括休止步驟。根據一些實施例，休止步驟包括在約30-40℃及約5% CO2下培育第四TIL群體。根據一些實施例，在約30℃、約30.5℃、約31℃、約31.5℃、約32℃、約32.5℃、約33℃、約33.5℃、約34℃、約34.5℃、約35℃、約35.5℃、約36℃、約36.5℃、約37℃、約37.5℃、約38℃、約38.5℃、約39℃、約39.5℃、約40℃下進行休止步驟。根據一些實施例，進行休止步驟持續約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時。根據一些實施例，休止步驟包括在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體。根據一些實施例，休止步驟包括在約30℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約15小時至約23小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約15小時至約23小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約15小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約16小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約17小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約18小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約19小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約20小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約21小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約22小時。根據一些實施例，休止步驟包括在37℃下在包含IL-2之細胞培養基中培育第三或第四TIL群體持續約1小時，隨後在約30℃下培育持續約23小時。

在一些實施例中，抗原呈遞細胞(APC)為PBMC。根據一些實施例，PBMC係經照射的。根據一些實施例，PBMC為同種異體的。根據一些實施例，PBMC係經照射及同種異體的。根據一些實施例，抗原呈遞細胞為人工抗原呈遞細胞。

在一些實施例中，腫瘤組織係來自經解剖之腫瘤。

在一些實施例中，經解剖之腫瘤出現不足8小時。

在一些實施例中，腫瘤組織係選自由以下組成之群：黑色素瘤腫瘤組織、頭頸部腫瘤組織、乳房腫瘤組織、腎腫瘤組織、胰臟腫瘤組織、神經膠質母細胞瘤腫瘤組織、肺腫瘤組織、結腸直腸腫瘤組織、肉瘤腫瘤組織、三陰性乳房腫瘤組織、子宮頸腫瘤組織、卵巢腫瘤組織及HPV陽性腫瘤組織。

在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約1.5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2.5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3.5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約4 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約4.5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約5.5 mm至6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約1.5 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2.5 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3.5 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約4 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約4.5 mm至5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約1.5 mm至4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2 mm至4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2.5 mm至4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3 mm至4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約3.5 mm至4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約1.5 mm至3 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2 mm至3 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約2.5 mm至3 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大致球形片段，其直徑為約1.5 mm至2 mm。

在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少1.5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少2 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少2.5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少3 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少3.5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少4 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少4.5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體矩形片段，其最短邊緣長度為至少5.5 mm且最長邊緣長度為約6 mm。

在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約3 mm或約6 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約3 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約3.5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約4 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約4.5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約5.5 mm。在一些實施例中，腫瘤組織經片段化成大體立方形片段，其邊緣長度為約6 mm。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由如本文所述之方法產生的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體。

在一些實施例中，本發明提供一種治療患者之癌症的方法，該方法包括向該患者投與有效量之藉由如本文所述之方法產生的治療性TIL群體。在一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、轉移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮內膜癌、膽管癌、由人類乳頭狀瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。在一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：皮膚黑色素瘤、眼部黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、結膜惡性黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、多形性黃色星形細胞瘤、胚胎發育不良性神經上皮腫瘤、神經節細胞膠質瘤及毛細胞性星形細胞瘤、具有顯著黏液分化之子宮內膜樣腺癌(ECMD)、乳頭狀甲狀腺癌、漿液性低級或臨界性卵巢癌、毛細胞白血病及朗格漢斯細胞組織細胞增多症。

在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1500 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2500 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3500 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於4000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於4500 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於5000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於5500 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1000 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1500 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2000 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2500 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3000 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3500 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於4000 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於4500 IU/mL與5000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1000 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1500 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2000 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2500 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3000 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於3500 IU/mL與4000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1000 IU/mL與3000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1500 IU/mL與3000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2000 IU/mL與3000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於2500 IU/mL與3000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1000 IU/mL與2000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中以介於1500 IU/mL與2000 IU/mL之間之初始濃度存在於細胞培養基中。

在一些實施例中，在第二次擴增步驟中，IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間之初始濃度存在且OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在。

在一些實施例中，第一細胞培養基及/或第二細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑。

在一些實施例中，使用透氣容器來執行第一次擴增。在一些實施例中，使用透氣容器來執行第二次擴增。

在一些實施例中，第一細胞培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。在一些實施例中，第二細胞培養基及/或第三培養基進一步包含選自由以下組成之群的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。

在一些實施例中，該方法進一步包括在向患者投與TIL或PBL產品之前用非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案處理患者之步驟。在一些實施例中，該方法進一步包括在向患者投與TIL或PBL產品之後次日開始用IL-2方案處理患者之步驟。在一些實施例中，該方法進一步包括在向患者投與TIL或PBL產品當天開始用IL-2方案處理患者之步驟。在一些實施例中，IL-2方案包含阿地白介素、內姆瓦盧金或其生物類似物或變異體。

在一些實施例中，治療有效量之TIL產品包含約2.3×1010至約13.7×1010個TIL。

在一些實施例中，第二TIL群體之數目比第一TIL群體大至少50倍。 3. PD-1

由於誘導檢查點阻斷之研究最多的標靶之一為程序性死亡受體(PD1或PD-1，亦稱為PDCD1)，該受體為T細胞調節因子之CD28超家族的成員。其配位體PD-L1及PD-L2在包括黑色素瘤在內之多種腫瘤細胞上表現。PD-1與PD-L1之相互作用抑制T細胞效應子功能，在慢性刺激設定中導致T細胞耗竭，且在腫瘤微環境中誘導T細胞凋亡。PD-1亦可在腫瘤特異性逃避免疫監視中發揮作用。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1表現沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使PD-1表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可涉及使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如PD-1)處生成雙股或單股斷裂。例如，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1表現沈默或降低。 4. CTLA-4

CTLA-4表現在經活化T細胞上之T細胞活化後經誘導，且競爭與抗原呈遞細胞活化抗原CD80及CD86結合。CTLA-4與CD80或CD86之相互作用引起T細胞抑制且用於維持免疫反應之平衡。然而，對CTLA-4與CD80或CD86之相互作用的抑制可延長T細胞活化且因此增加對癌症抗原之免疫反應的水準。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之CTLA-4表現沈默或降低。根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1及CTLA-4表現均沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法(例如，過程2A或圖20及21中所示之方法)的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使CTLA-4表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如CTLA-4)處生成雙股或單股斷裂。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法使TIL中之CTLA-4表現沈默或抑制該表現。在一些實施例中，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1及CTLA-4表現沈默或降低。 5. LAG-3

淋巴細胞活化基因-3 (LAG-3、CD223)係在主要組織相容性複合物(MHC) II類接合之後由T細胞及天然殺手(NK)細胞表現。儘管其機制尚不清楚，但其調節對T細胞功能產生負調節效應，從而預防組織損傷及自體免疫性。因此，LAG-3阻斷可改良抗腫瘤反應。參見例如Marin-Acevedo等人, Journal of Hematology & Oncology (2018) 11:39。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之LAG-3表現沈默或降低。根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1及LAG-3表現均沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法(例如，過程2A或圖20及21中所示之方法)的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使LAG-3表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如LAG-3)處生成雙股或單股斷裂。根據特定實施例，可使用CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法使TIL中之LAG-3表現沈默或抑制該表現。在一些實施例中，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1及LAG-3表現沈默或降低。 6. Cish

Cish係細胞介素信號傳導(SOCS)家族之抑制因子的成員，由CD8+ T細胞中之TCR刺激誘導且抑制其對腫瘤之功能性親合力。CD8+ T細胞中之Cish基因缺失可增強其表現、功能性親合力及細胞介素多功能性，導致對確定腫瘤之顯著且持久抑制。參見例如Palmer等人, Journal of Experimental Medicine, 212 (12): 2095 (2015)。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之Cish表現沈默或降低。根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1及Cish表現均沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法(例如，過程2A或圖20及21中所示之方法)的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使Cish表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如Cish)處生成雙股或單股斷裂。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法使TIL中之Cish表現沈默或抑制該表現。在一些實施例中，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1及Cish表現沈默或降低。 7. CBL-B

CBLB (或CBL-B)為E3泛素-蛋白連接酶且為T細胞活化之負調節因子。Bachmaier等人, Nature, 2000, 403, 211-216；Wallner等人, Clin. Dev. Immunol. 2012, 692639。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之CBL-B表現沈默或降低。根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1及CBL-B表現均沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法(例如，過程2A或圖20及21中所示之方法)的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使CBL-B表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如CBL-B)處生成雙股或單股斷裂。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法使TIL中之PKA表現沈默或抑制該表現。在一些實施例中，使用TALEN剔除使CBL-B沈默。在一些實施例中，使用TALE-KRAB轉錄抑制劑敲入使CBL-B沈默。關於此等方法之更多詳情可見於Boettcher及McManus, Mol. Cell Review, 2015, 58, 575-585中。在一些實施例中，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1及CBL-B表現沈默或降低。 8. TIGIT

TIGIT係在調節、記憶及經活化T細胞上表現之細胞表面蛋白。TIGIT屬於免疫球蛋白蛋白質之脊髓灰白質炎病毒受體(PVR)家族且抑制T細胞活化。(Yu等人, Nat Immunol., 2009, 10(1):48-57)。

根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之TIGIT表現沈默或降低。根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法使TIL中之PD-1及TIGIT表現均沈默或降低。例如，可根據本文所述之方法(例如，過程2A或圖20及21中所示之方法)的任何實施例來進行將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其中該方法包括藉由使TIGIT表現沈默或抑制該表現來基因編輯該等TIL之至少一部分。如下文更詳細描述，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在免疫檢查點基因(諸如TIGIT)處生成雙股或單股斷裂。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法使TIL中之PKA表現沈默或抑制該表現。在一些實施例中，使用TALEN剔除使TIGIT沈默。在一些實施例中，使用TALE-KRAB轉錄抑制劑敲入使TIGIT沈默。關於此等方法之更多詳情可見於Boettcher及McManus, Mol.Cell Review, 2015, 58, 575-585中。在一些實施例中，可使用TALEN方法使TIL中之PD-1及TIGIT表現沈默或降低。 E. 基因編輯方法

如上文所論述，本發明之實施例提供腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，該等淋巴細胞已經由基因編輯經基因修飾以增強其治療效應。本發明之實施例涵蓋經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL群體中進行之基因編輯以用於一或多種蛋白質之表現的抑制。本發明之實施例亦提供用於將TIL擴增至治療群體中之方法，其中該等方法包括基因編輯TIL。有數種基因編輯技術可用於基因修飾TIL群體，該等技術適合根據本發明來使用。

在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Levine等人, Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey等人, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull等人, J. Virology 1998, 72, 8463-71及美國專利第6,627,442號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括γ-逆轉錄病毒轉導步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Cepko及Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16中，該文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括轉位子介導之基因轉移步驟。轉位子介導之基因轉移系統係此項技術中已知的且包括如下系統，其中轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現RNA或蛋白質經提供，使得該轉位酶之長期表現不會在轉殖基因細胞中發生，例如作為mRNA (例如，包含帽及聚A尾之mRNA)提供之轉位酶。合適的轉位子介導之基因轉移系統包括salmonid型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11及SB100x，及具有增加之酶活性的經工程改造酶，該等系統描述於例如Hackett等人, Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及美國專利第6,489,458號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括穩定併入基因以產生或抑制(例如，沈默)一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係此項技術中已知的且描述於例如Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用此項技術中已知之其他電穿孔方法，諸如美國專利第5,019,034號；第5,128,257號；第5,137,817號；第5,173,158號；第5,232,856號；第5,273,525號；第5,304,120號；第5,318,514號；第6,010,613號及第6,078,490號中所述之彼等，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，該電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中至少三個DC電脈衝之序列具有以下特徵中之一者、兩者或三者：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同；及(3)該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以改變、操作或引起TIL之經定義且受控、永久或臨時變化，其包括向TIL施加至少三個單獨、操作員控制、獨立編程、DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔。在一實施例中，該電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，該方法包括用脈衝電場處理TIL之步驟以誘導TIL中之孔形成，其包括向TIL施加至少三個DC電脈衝之序列的步驟，該等電脈衝具有等於或大於100 V/cm之場強，其中至少三個DC電脈衝之序列具有以下特徵中之一者、兩者或三者：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝幅度方面彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度方面彼此不同；及(3)該至少三個脈衝中之第一組兩者的第一脈衝時間間隔不同於該至少三個脈衝中之第二組兩者的第二脈衝時間間隔，以致經誘導之孔持續相對較長時期，且以致維持TIL之活力。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面塗佈及內吞作用)係此項技術中已知的且描述於Graham及van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法(諸如採用陽離子脂質N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法)係此項技術中已知的且描述於Rose等人, Biotechniques 1991, 10, 520-525及Felgner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417及美國專利第5,279,833號；第5,908,635號；第6,056,938號；第6,110,490號；第6,534,484號；及第7,687,070號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括使用美國專利第5,766,902號；第6,025,337號；第6,410,517號；第6,475,994號；及第7,189,705號中所述之方法進行轉染之步驟；各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

根據一實施例，該基因編輯過程可包括使用可編程核酸酶，該核酸酶介導在一或多種免疫檢查點基因處生成雙股或單股斷裂。此類可編程核酸酶使得能夠藉由在特定基因體基因座處引入斷裂來進行精確基因體編輯，亦即，其依賴於該基因體內之特定DNA序列的識別以將核酸酶域靶向此位置且介導在標靶序列處生成雙股斷裂。DNA中之雙股斷裂隨後將內源修復機制募集至斷裂位點以藉由非同源末端接合(NHEJ)或同源定向修復(HDR)來介導基因體編輯。因此，該斷裂之修復可導致引入插入/缺失突變，該等突變破壞(例如，沈默、抑制或增強)標靶基因產物。

已開發用於實現位點特異性基因體編輯之核酸酶的大多數類別包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如，CRISPR/Cas9)。此等核酸酶系統可基於其DNA識別模式廣泛地分類成兩個種類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA相互作用實現特定DNA結合，而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由直接地與標靶DNA進行鹼基配對之短RNA向導分子且藉由蛋白質-DNA相互作用靶向特定DNA序列。參見例如Cox等人, Nature Medicine, 2015, 第21卷, 第2期。

可根據本發明之TIL擴增方法使用的基因編輯方法之非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，該等方法更詳細地描述於下文中。根據一實施例，用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述(例如過程2A)或如WO 2018/081473 A1、WO 2018/129332 A1或WO 2018/182817 A1中所述之方法的任何實施例來進行，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者基因編輯該等TIL之至少一部分，以便生成可提供增強之治療效應的TIL。根據一實施例，可藉由活體外比較經基因編輯之TIL與未經修飾之TIL，例如藉由與未經修飾之TIL相比評估活體外效應子功能、細胞介素型態等來評估其經改良之治療效應。

在本發明之一些實施例中，電穿孔用於遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流動電穿孔系統。適合與本發明之一些實施例一起使用的合適流動電穿孔系統之實例為可購得的MaxCyte STX系統。有數種可適合與本發明一起使用之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus、Cellaxess Elektra (Cellectricon)、Nucleofector (Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell (BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96 (Ambion)之AgilePulse系統或ECM 830。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之剩餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之剩餘部分形成密閉無菌系統。 1. TALE 方法

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述或如WO 2018/081473 A1、WO 2018/129332 A1或WO 2018/182817 A1中所述之方法的任何實施例來進行，其中該方法進一步包括藉由TALE方法基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中沈默或降低。或者，在TIL擴增過程期間使用TALE方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中增強。

TALE代表「轉錄活化子樣效應子」蛋白，其包括TALEN (「轉錄活化子樣效應子核酸酶」)。使用TALE系統來進行基因編輯之方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE係來自植物病原菌黃單胞菌屬之天然存在之蛋白質，且含有由一系列33-35個胺基酸之重複域構成的DNA結合域，該等重複域各自識別單一鹼基對。藉由兩種高變胺基酸確定TALE特異性，該等高變胺基酸係稱作重複-可變二殘基(RVD)。使模塊TALE重複序列連接在一起以識別鄰接DNA序列。DNA結合域中之特定RVD識別標靶基因座中之鹼基，從而提供結構特徵以組裝可預測DNA結合域。使TALE之DNA結合域融合至IIS型FokI核酸內切酶之催化域以產生可靶向TALE核酸酶。為了誘導位點特異性突變，兩個個別TALEN臂由14-20個鹼基對之間隔子區隔開，使FokI單體緊密接近以二聚且產生靶向雙股斷裂。

可藉由經由TALE方法永久基因編輯TIL而沈默或受到抑制之基因的非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。

靶向PD-1基因之TALE-核酸酶的非限制性實例係提供於下表中。在此等實例中，經靶向基因體序列含有兩個17個鹼基對(bp)之長序列(稱為半標靶，以大寫字母顯示)，該等序列由15-bp間隔子(以小寫字母顯示)隔開。各半標靶由表中列出之半TALE-核酸酶的重複序列識別。因此，根據特定實施例，根據本發明之TALE-核酸酶識別且裂解選自由以下組成之群的標靶序列：SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO: 128。TALEN序列及基因編輯方法亦描述於Gautron等人, Molecular Therapy: Nucleic Acids Dec. 2017, 第9卷:312-321中，該案以引用之方式併入本文中。 No. 標靶PD-1序列重複序列半TALE-核酸酶 1 TTCTCCCCAGCCCTGCT cgtggtgaccgaagg GGACAACGCCACCTTCA (SEQ ID NO:127) 重複PD-1-左 (SEQ ID NO:129) 重複PD-1-右 (SEQ ID NO: 130) PD-1-左TALEN (SEQ ID NO:133) PD-1-右TALEN (SEQ ID NO:134) 2 TACCTCTGTGGGGCCAT ctccctggcccccaa GGCGCAGATCAAAGAGA (SEQ ID NO:128) 重複PD-1-左 (SEQ ID NO:131) 重複PD-1-右 (SEQ ID NO: 132) PD-1-左TALEN (SEQ ID NO:135) PD-1-右TALEN (SEQ ID NO:136)

藉由TALE方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於美國專利第8,586,526號中，該案以引用之方式併入本文中。 2. Cas-CLOVER 方法

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述(例如過程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述之方法的任何實施例來進行，其中該方法進一步包括藉由Cas-CLOVER方法基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用Cas-CLOVER方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中沈默或降低。或者，在TIL擴增過程期間使用Cas-CLOVER方法導致一或多種免疫檢查點基因之表現在治療性TIL群體之至少一部分中增強。

Cas-CLOVER為二聚體、高保真度位點特異性核酸酶(SSN)，其由催化死亡之SpCas9 (dCas9)與來自梭菌屬Clo051 IIs型限制性核酸內切酶之核酸酶域的融合物組成(Madison等人, “Cas-CLOVER is a novel high-fidelity nuclease for safe and robust generation of T SCM-enriched allogeneic CAR-T cells,” Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2022)。此舉生成一種核酸酶，其活性取決於Clo051核酸酶域之二聚，該二聚藉由RNA指導之對兩個相鄰20-nt標靶序列的識別實現。不同於成對切口酶方法，例如當使用Cas9-D10A突變體時，單體Cas-CLOVER不會引入切口或DSB。Cas-CLOVER已顯示具有低脫靶核酸酶活性。

例示性Cas-CLOVER系統包括WO2019/ 126578中所述之彼等，該案之內容以引用之方式整體併入本文中。在實施例中，Cas-CLOVER系統包含融合蛋白，該融合蛋白包含DNA定位組分及效應分子，基本上由其組成，或由其組成。 a. DNA 定位組分

在實施例中，DNA定位組分能夠結合特定DNA序列。在實施例中，DNA定位組分係選自例如DNA結合寡核苷酸、DNA結合蛋白、DNA結合蛋白複合物及其組合。其他合適之DNA結合組分將由一般技術者識別。

在實施例中，DNA定位組分包含針對基因體中之一或多個特定基因座的寡核苷酸。該寡核苷酸可選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及其組合。

在實施例中，DNA定位組分包含當與標靶DNA結合時結合寡核苷酸之核苷酸結合蛋白或蛋白複合物。該蛋白或蛋白複合物能夠識別選自RNA-DNA異源雙螺旋、R-環或其組合之特徵。在實施例中，DNA定位組分包含能夠識別選自Cas9、級聯複合物、RecA、RNase H、RNA聚合酶、DNA聚合酶或其組合之R-環的蛋白或蛋白複合物。在實施例中，DNA定位組分包含能夠與標靶DNA結合之經工程改造蛋白質。在實施例中，DNA定位組分包含能夠結合選自大範圍核酸酶、鋅指陣列、轉錄活化子樣(TAL)陣列及其組合之DNA序列的蛋白質。在實施例中，DNA定位組分包含含有天然存在之DNA結合域的蛋白質。在實施例中，DNA定位組分包含bZIP域、螺旋-環-螺旋、螺旋-轉角-螺旋、HMG-盒、白胺酸拉鏈、鋅指或其組合。在實施例中，DNA定位組分包含針對基因體中之特定基因座的寡核苷酸。例示性寡核苷酸包括但不限於DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及其任何組合。在實施例中，DNA定位組分包含能夠識別選自RNA-DNA異源雙螺旋、R-環及其任何組合之特徵的蛋白或蛋白複合物。能夠識別R-環之例示性蛋白或蛋白複合物包括但不限於Cas9、級聯複合物、RecA、RNase H、RNA聚合酶、DNA聚合酶及其任何組合。在實施例中，能夠識別R-環之蛋白或蛋白複合物包含Cas9。在實施例中，DNA定位組分包含能夠結合選自大範圍核酸酶、鋅指陣列、TAL陣列及其任何組合之DNA序列的蛋白質。在實施例中，DNA定位組分包含針對基因體中之標靶位置的寡核苷酸及能夠與標靶DNA序列結合之蛋白質。

在實施例中，DNA定位組分包含至少一種向導RNA (gRNA)，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，DNA定位組分包含兩種gRNA，基本上由其組成，或由其組成，其中第一gRNA與雙股DNA標靶序列之第一股特異性結合且第二gRNA與雙股DNA標靶序列之第二股特異性結合。或者，在實施例中，DNA定位組分包含轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN，亦稱為TAL蛋白)之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，DNA定位組分包含源自黃單胞菌或羅爾斯頓氏菌之TALEN或TAL蛋白之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成。 b. 效應分子

在實施例中，效應分子能夠在基因體中之特定基因座處產生預定效應。例示性效應分子但不限於轉錄因子(活化因子或抑制因子)、染色質重塑因子、核酸酶、核酸外切酶、核酸內切酶、轉位酶、甲基轉移酶、去甲基酶、乙醯轉移酶、去乙醯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構酶、旋轉酶、解旋酶、螢光團或其任何組合。

在實施例中，效應分子包含轉位酶。在實施例中，效應分子包含PB轉位酶(PBase)。在實施例中，效應分子包含核酸酶。核酸酶之非限制性實例包括限制性核酸內切酶、歸巢核酸內切酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰臟DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸內切酶或其任何組合。在某些實施例中，效應分子包含限制性核酸內切酶。在某些實施例中，效應分子包含IIS型限制性核酸內切酶。在實施例中，效應分子包含核酸內切酶。核酸內切酶之非限制性實例包括AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I及Clo051。在實施例中，效應分子包含BmrI、BfiI或Clo051。

在實施例中，效應分子包含均二聚體或異二聚體，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，效應分子包含核酸酶(視情況，核酸內切酶)，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，Cas9為催化無活性或「不活化」Cas9 (dCas9 (WO2019/126578之SEQ ID NO: 302及303))。在實施例中，Cas9為Cas9之催化無活性或「不活化」核酸酶域。在實施例中，dCas9係由源自全長、催化不活化Cas9之較短序列編碼，本文中稱為「小」dCas9或dSaCas9 (WO2019/ 126578之SEQ ID NO: 23)。

在融合蛋白之實施例中，效應分子包含一或多種II型核酸酶之均二聚體或異二聚體，基本上由其組成，或由其組成。在融合蛋白之實施例中，效應分子包含II型核酸酶之均二聚體或異二聚體，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，II型核酸酶包含以下一或多者：AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I或Clo051。

在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含Clo051、BfiI或BmrI，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含與Clo051、BfiI或BmrI形成異二聚體之Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含與Clo051形成異二聚體之Cas9 (例如dCas9或dSaCas9)之催化無活性形式或其片段，基本上由其組成，或由其組成。例示性Clo05 l核酸酶域可包含以下胺基酸序列，基本上由其組成或由其組成： EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY (SEQ ID NO:238)。

在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含源自黃單胞菌或羅爾斯頓氏菌之TALEN或TAL蛋白之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含源自黃單胞菌或羅爾斯頓氏菌之TALEN或TAL蛋白之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成，該DNA結合域與Clo051、BfiI或BmrI形成均二聚體或異二聚體。在實施例中，包括包含均二聚體或異二聚體之彼等效應分子在內的效應分子包含源自黃單胞菌或羅爾斯頓氏菌之TALEN或TAL蛋白之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成，該DNA結合域與Clo051形成均二聚體或異二聚體。 c. 鍵聯

在實施例中，融合蛋白包含DNA定位組分及效應分子，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，編碼融合蛋白之一或多種組分的核酸序列可操作地經連接，例如在表現載體中。在實施例中，融合蛋白為嵌合蛋白。在實施例中，融合蛋白係由一或多個重組核酸序列編碼。在實施例中，融合蛋白亦包括連接體區以可操作地連接融合蛋白之兩種組分。例如，在實施例中，融合蛋白包含藉由連接體區可操作地連接之DNA定位組分及效應分子，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，DNA定位組分、連接體區及效應分子可由插入表現卡匣及/或表現載體中之一或多個核酸序列編碼，以致該核酸序列之轉譯產生融合蛋白。在實施例中，融合蛋白可包含在DNA定位組分與效應分子之間之非共價鍵聯。該非共價鍵聯可包含抗體、抗體片段、抗體模擬物或支架蛋白。 d. 融合蛋白

在實施例中，DNA定位組分包含至少一種gRNA，基本上由其組成或由其組成，且效應分子包含Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，DNA定位組分包含至少一種gRNA，基本上由其組成，或由其組成，且效應分子包含不活化Cas9 (dCas9)或不活化核酸酶域，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，DNA定位組分包含至少一種gRNA，基本上由其組成，或由其組成，且效應分子包含不活化小Cas9 (dSaCas9)，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，效應分子包含Cas9、dCas9、dSaCas9或其核酸酶域及第二核酸內切酶，基本上由其組成，或由其組成。第二核酸內切酶可包含IIS型核酸內切酶，基本上由其組成，或由其組成，該IIS型核酸內切酶包括但不限於以下一或多者：AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051。

在融合蛋白之實施例中，DNA定位組分包含轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN，亦稱為TAL蛋白)之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成，且效應分子包含核酸內切酶，基本上由其組成，或由其組成。在本揭示案之融合蛋白的實施例中，DNA定位組分包含源自黃單胞菌或羅爾斯頓氏菌之TALEN或TAL蛋白之DNA結合域，基本上由其組成，或由其組成，且效應分子包含IIS型核酸內切酶，基本上由其組成，或由其組成，該IIS型核酸內切酶包括但不限於以下一或多者：AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I或Clo051。

在某些實施例中，例示性dCas9-Clo051融合蛋白可包含以下序列，基本上由其組成，或由其組成：WO2019/126578之SEQ ID NO: 305或307的胺基酸序列或WO2019/126578之SEQ ID NO: 306或308的核酸序列。 e. 構築體

在實施例中，核酸酶域包含dCas9及Clo051，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，核酸酶域包含dSaCas9及Clo051，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，核酸酶域包含黃單胞菌-TALE及Clo051，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，核酸酶域包含羅爾斯頓氏菌-TALE及Clo051，基本上由其組成，或由其組成。在實施例中，融合蛋白包含dCas9-Clo051、dSaCas9-Clo051、黃單胞菌-TALE-Clo051或羅爾斯頓氏菌-TALE-Clo051。在實施例中，編碼融合蛋白之載體包含Csy4-T2A-Clo051-G4S連接體-dCas9 (化膿鏈球菌)或pRT1-Clo051-dCas9雙重NLS。

根據一些實施例，Cas-CLOVER系統包含有包含DNA定位組分及效應分子之融合蛋白，其中該DNA定位組分與TIL之DNA分子的標靶序列雜交，其中該DNA分子編碼且該TIL表現至少一種免疫檢查點分子，且該效應分子使該DNA分子裂解，由此改變該至少一種免疫檢查點分子之表現。

根據特定實施例，Cas-CLOVER方法包括藉由引入對免疫檢查點基因之標靶DNA序列具特異性的Cas-CLOVER系統(例如，dCas9-Clo051、dSaCas9-Clo051、黃單胞菌-TALE-Clo051或羅爾斯頓氏菌-TALE-Clo051融合蛋白)來使TIL中之一或多種免疫檢查點基因之表現沈默或降低。該融合蛋白可作為DNA、mRNA、蛋白質遞送。在使基因體與Cas-CLOVER系統接觸後，可切割標靶雙股DNA之一或多個股。若在一或多種DNA修復路徑或其組分存在下進行切割，則Cas-CLOVER方法藉由一或多個鹼基對之插入、缺失或取代而中斷基因表現或修飾基因體序列。DSB可在細胞中藉由非同源末端接合(NHEJ)進行修復，NHEJ係頻繁引起DNA中之插入或缺失(插入/缺失)之機制。插入/缺失通常引起移碼，從而產生功能等位基因之損失；例如，藉由在靶向基因之開放閱讀框(ORF)內引起早熟終止密碼子。根據某些實施例，結果係靶向免疫檢查點基因內之功能喪失型突變。

或者，藉由Cas-CLOVER系統誘導之DSB可藉由同源定向修復(HDR)而非NHEJ進行修復。雖然NHEJ介導之DSB修復通常破壞基因之開放閱讀框，但同源定向修復(HDR)可用於生成介於單一核苷酸變化至大型插入範圍內之特定核苷酸變化。根據一些實施例，HDR藉由用Cas-CLOVER系統將含有所需序列之DNA修復模板遞送至TIL中而用於基因編輯免疫檢查點基因。該修復模板較佳地含有所需編輯以及在標靶基因之直接上游及下游的額外同源序列(通常稱為左及右同源臂)。

可藉由經由Cas-CLOVER方法永久基因編輯TIL而沈默或受到抑制之基因的非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。

藉由Cas-CLOVER方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於WO2019126578、US2017/0107541、US2017/0114149、US2018/0187185及美國專利第10,415,024號中，各案之內容以引用之方式整體併入本文中。用於進行Cas-CLOVER方法之資源(諸如CLOVER mRNA及Cas-CLOVER mRNA構築體)可購自諸如Demeetra及Hera Biolabs之公司。

根據一些實施例，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體； (b) 將該腫瘤片段添加至密閉系統中； (c) 藉由在包含IL-2且視情況包含OKT-3及/或4-1BB促效劑抗體之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-11天來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行； (d) 藉由添加OKT-3且培養約1-3天來刺激第二TIL群體，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對第二TIL群體進行無菌電穿孔以實現將至少一種基因編輯器轉移至第二TIL群體中之複數個細胞中； (f) 使第二TIL群體休止約1天； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、視情況選用之OKT-3抗體、視情況選用之OX40抗體及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行第二次擴增持續約7-11天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)之治療性TIL群體以提供所收集之TIL群體，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中所收集之TIL群體為治療性TIL群體； (i) 將所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 視情況使用冷凍保存介質來冷凍保存所收集之TIL群體，其中電穿孔步驟包括遞送至少一種包含Cas-CLOVER系統之基因編輯器系統，該至少一種基因編輯器系統調節至少一種檢查點蛋白在第二TIL群體之複數個細胞中之表現。

根據一些實施例，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體； (b) 將該腫瘤片段添加至密閉系統中； (c) 藉由在包含IL-2且視情況包含OKT-3及/或4-1BB促效劑抗體之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-11天來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行； (d) 藉由添加OKT-3且培養約1-3天來刺激第二TIL群體以獲得第二TIL群體，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對第二TIL群體進行無菌電穿孔以實現將至少一種基因編輯器轉移至第二TIL群體中之複數個細胞中； (f) 使第二TIL群體休止約1天； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、視情況選用之OKT-3抗體、視情況選用之OX40抗體及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行第二次擴增持續約7-11天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)之治療性TIL群體以提供所收集之TIL群體，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中所收集之TIL群體為治療性TIL群體； (i) 將所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 視情況使用冷凍保存介質來冷凍保存所收集之TIL群體，其中電穿孔步驟包括遞送至少一種包含Cas-CLOVER系統之基因編輯器系統，該至少一種基因編輯器系統抑制至少一種檢查點蛋白在第二TIL群體之複數個細胞中之表現。 F. 基因表現方法

在一些實施例中，基因修飾TIL群體以調節蛋白質表現之方法可視情況包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括γ-逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括腺病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括腺相關病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括單純疱疹病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括痘病毒病毒轉導步驟。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括慢病毒轉導步驟，包括使用包括HIV-1在內的人類免疫缺乏病毒(HIV)之慢病毒轉導。慢病毒轉導系統及其他合適病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Levine等人, Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey等人, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull等人, J. Virology 1998, 72, 8463-71及美國專利第5,350,674號、第5,585,362號及第6,627,442號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括γ-逆轉錄病毒轉導步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統係此項技術中已知的且描述於例如Cepko及Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16，Hawley等人, Gene Ther. 1994, 1, 136-38中；各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 1. piggyBac 方法

用於將TIL擴增至治療群體中之方法可根據本文所述(例如過程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述之方法的任何實施例來進行，其中該方法進一步包括藉由piggyBac方法(例如，piggyBac轉位子及轉位酶或piggyBac樣轉位子及轉位酶)基因編輯該等TIL之至少一部分。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用piggyBac方法導致至少一種免疫調節組合物在治療性TIL群體之至少一部分的細胞表面處表現。或者，在TIL擴增過程期間使用piggyBac方法導致至少一種免疫調節組合物在治療性TIL群體之至少一部分的細胞表面處表現，且視情況導致一或多種免疫檢查點基因在治療性TIL群體之至少一部分中增強。在一些實施例中，該至少一種免疫調節組合物包含與膜錨融合之免疫調節劑(例如，本文所述之膜錨定免疫調節融合蛋白)。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑(例如，CD40L或激動性CD40結合域)。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑。

piggyBac轉位子係在供體載體與宿主染色體之間有效轉位之可移動遺傳元件。此系統幾乎不具有貨物限制，且充分可逆，從而在切除後未在基因體中留下足跡。piggyBac轉位子/轉位酶系統由識別位於轉位子卡匣之兩側的piggyBac特異性末端反向重複序列(ITR)之轉位酶組成。該轉位酶切除可轉位元件以將其整合至TT/AA染色體位點中，該等TT/AA染色體位點優先位於哺乳動物基因體之真染色質區中(Ding等人 2005；Cadinaños及Bradley 2007；Wilson等人 2007；Wang等人 2008；Li等人 2011)。

例示性piggyBac系統包括WO2019/046815中所述之彼等，該案之內容以引用之方式整體併入本文中。在實施例中，piggyBac系統包含轉位子/轉位酶系統。

在實施例中，piggyBac方法包括向TIL遞送(a)包含編碼轉位酶之序列的核酸或胺基酸序列及(b)包含編碼轉位子之DNA序列的重組及非天然存在之DNA序列。

在實施例中，編碼轉位酶之序列為mRNA序列。在實施例中，編碼轉位酶之序列為DNA序列。在實施例中，該DNA序列為cDNA序列。在實施例中，編碼轉位酶之序列為胺基酸序列。在用轉位子DNA進行預培育後，可遞送蛋白質Super piggybac轉位酶(SPB)。轉位子/轉位酶

例示性轉位子/轉位酶系統包括但不限於piggyBac轉位子及轉位酶、睡美人轉位子及轉位酶、Helraiser轉位子及轉位酶以及Tol2轉位子及轉位酶。

piggyBac轉位酶識別在轉位子末端之轉位子特異性末端反向重複序列(ITR)且將ITR之間的內含物移動至TTAA染色體位點中。piggyBac轉位子系統對於可包括於ITR之間的所關注基因並無有效載荷限制。在實施例中，轉位子為piggyBac轉位子或piggyBac樣轉位子。

piggyBac及piggyBac樣轉位酶及轉位子之實例包括例如WO2019/046815中所揭示之彼等，該案之內容以引用之方式整體併入本文中。在實施例中，piggyBac或piggyBac樣轉位酶為高活性的。高活性piggyBac或piggyBac樣轉位酶係活性高於產生該轉位酶之天然存在之變異體的轉位酶。在實施例中，高活性piggyBac或piggyBac樣轉位酶係分離自或源自家蠶(Bombyx mori)。高活性胺基酸取代之清單可見於美國專利第10,041,077號中，該案之內容以引用之方式整體併入本文中。在實施例中，piggyBac或piggyBac樣轉位酶為整合缺乏的。在實施例中，整合缺乏piggyBac或piggyBac樣轉位酶係可切除其相應轉位子但以低於相應野生型轉位酶之頻率整合所切除之轉位子的轉位酶。整合缺乏胺基酸取代之清單可見於美國專利第10,041,077號中，該案之內容以引用之方式整體併入。

在實施例中，piggyBac或piggyBac樣轉位子能夠由piggyBac或piggyBac樣轉位酶插入標靶核酸內之序列5’-TTAT-3。在實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac轉位子之實施例中，轉位酶為piggyBac轉位酶。在實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac樣轉位子之實施例中，轉位酶為piggyBac樣轉位酶。在實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac轉位子之實施例中，轉位酶為piggyBac™或Super piggyBac™ (SPB)轉位酶。在實施例且詳言之其中轉位酶為Super piggyBac™ (SPB)轉位酶之實施例中，編碼轉位酶之序列為mRNA序列。

藉由識別ITR之睡美人轉位酶將睡美人(SB)轉位子轉位至標靶基因體中，且將ITR之間的內含物移動至TA染色體位點中。在實施例中，轉位子為睡美人轉位子。在實施例中，轉位酶為睡美人轉位酶(參見例如美國專利第9,228,180號，其內容以引用之方式整體併入本文中)。在實施例中，睡美人轉位酶為高活性睡美人(SB100X)轉位酶。

Helraiser轉位子係由Helitron轉位酶轉位。不同於其他轉位酶，Helitron轉位酶不含RNase-H樣催化域，而是包含由複製起始域(Rep)及DNA解旋酶域構成之RepHel基序。Rep域係核酸酶HUH超家族之核酸酶域。在實施例中，轉位子為Helraiser轉位子。在Helraiser轉位子序列之實施例中，轉位酶側接左及右末端序列(稱為LTS及RTS)。在實施例中，此等序列由保守5’-TC/CTAG-3’基序終止。在實施例中，具有形成髮夾終止結構之潛力的19 bp回文重複序列位於RTS上游11個核苷酸處且包含序列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG。在實施例且詳言之其中轉位子為Helraiser轉位子之實施例中，轉位酶為Helitron轉位酶。

Tol2轉位子可分離自或源自清鳉魚之基因體，且可類似於hAT家族之轉位子。本揭示案之例示性Tol2轉位子係由包含約4.7千鹼基之序列編碼且含有編碼Tol2轉位酶之基因，該基因含有四個外顯子。在實施例中，轉位子為Tol2轉位子。在本揭示案之方法的某些實施例且詳言之其中轉位子為Tol2轉位子之彼等實施例中，轉位酶為Tol2轉位酶。

在實施例中，載體包含編碼轉位子之重組及非天然存在之DNA序列。在實施例中，載體包含DNA之任何形式且其中載體包含至少100個核苷酸(nt)、500 nt、1000 nt、1500 nt、2000 nt、2500 nt、3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt、5000 nt、6500 nt、7000 nt、7500 nt、8000 nt、8500 nt、9000 nt、9500 nt、10,000 nt或其間任何數目之核苷酸。在實施例中，載體包含單股或雙股DNA。在實施例中，載體包含環狀DNA。在實施例中，載體為質體載體、奈米質體載體、微環。在實施例中，載體包含線性或線性化DNA。在實施例中，載體為雙股doggybone™ DNA序列。

在實施例中，編碼轉位子之重組及非天然存在之DNA序列進一步包含編碼一或多種免疫檢查點基因之序列。

在實施例中，編碼轉位酶之核酸序列為DNA序列，且編碼轉位酶之DNA序列的量及編碼轉位子之DNA序列的量係等於或小於10.0 μg/100 μL、小於7.5 μg/100 μL、小於6.0 μg/100 μL、小於5.0 μg/100 μL、小於2.5 μg/100 μL或小於1.67 μg/100 μL、小於0.55 μg/100 μL、小於0.19 μg/100 μL、小於0.10 μg/100 μL電穿孔或核轉染反應。在某些實施例中，電穿孔或核轉染反應中編碼轉位酶之DNA序列的量及編碼轉位子之DNA序列的量之濃度係等於或小於100 μg/mL、等於或小於75 μg/mL、等於或小於60 μg/mL、等於或小於50 μg/mL、等於或小於25 μg/mL、等於或小於16.7 μg/mL、等於或小於5.5 μg/mL、等於或小於1.9 μg/mL、等於或小於1.0 μg/mL。

在實施例中，編碼轉位酶之核酸序列為RNA序列，且編碼轉位酶之RNA序列的量及編碼轉位子之RNA序列的量係等於或小於10.0 μg/100 μL、小於7.5 μg/100 μL、小於6.0 μg/100 μL、小於5.0 μg/100 μL、小於2.5 μg/100 μL或小於1.67 μg/100 μL、小於0.55 μg/100 μL、小於0.19 μg/100 μL、小於0.10 μg/100 μL電穿孔或核轉染反應。在某些實施例中，電穿孔或核轉染反應中編碼轉位酶之RNA序列的量及編碼轉位子之RNA序列的量之濃度係等於或小於100 μg/mL、等於或小於75 μg/mL、等於或小於60 μg/mL、等於或小於50 μg/mL、等於或小於25 μg/mL、等於或小於16.7 μg/mL、等於或小於5.5 μg/mL、等於或小於1.9 μg/mL、等於或小於1.0 μg/mL。

在實施例中，藉由第二基因編輯工具進一步修飾TIL，該工具包括但不限於本文所述之彼等。在實施例中，第二基因編輯工具可包括僅切除piggyBac轉位酶以再切除所插入之序列或其任何部分。例如，僅切除piggyBac轉位酶可用於「再切除」轉位子。

根據一些實施例，piggyBac系統包含轉位子/轉位酶系統，其中轉位酶識別位於包含編碼一或多種免疫檢查點基因之貨物的轉位子卡匣之兩側的ITR，且切除可轉位元件以將其整合至TT/AA染色體位點中，從而實現轉位子卡匣之基因體插入及該一或多種免疫檢查點基因之表現。根據一些實施例，該貨物編碼兩種或兩種以上免疫檢查點分子。

可藉由經由piggyBac方法永久基因編輯TIL而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21、NOTCH 1/2細胞內域(ICD)及/或NOTCH配位體mDLL1。

藉由piggyBac方法來改變標靶基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用的系統、方法及組合物之實例係描述於WO2019/046815、WO2015006700、WO2010085699、WO2010099301、WO2010099296、WO2006122442、WO2001081565及WO1998040510中，各案之內容以引用之方式整體併入本文中。

用於進行piggyBac方法之資源(諸如用於表現轉位子/轉位酶之質體)可購自諸如Demeetra及Hera Biolabs之公司。

根據一些實施例，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體； (b) 將該腫瘤片段添加至密閉系統中； (c) 藉由在包含IL-2且視情況包含OKT-3及/或4-1BB促效劑抗體之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-11天來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行； (d) 藉由添加OKT-3且培養約1-3天來刺激第二TIL群體，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對第二TIL群體進行無菌電穿孔以實現將至少一種基因編輯器轉移至第二TIL群體中之複數個細胞中； (f) 使第二TIL群體休止約1天； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、視情況選用之OKT-3抗體、視情況選用之OX40抗體及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行第二次擴增持續約7-11天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)之治療性TIL群體以提供所收集之TIL群體，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中所收集之TIL群體為治療性TIL群體； (i) 將所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 視情況使用冷凍保存介質來冷凍保存所收集之TIL群體，其中電穿孔步驟包括遞送至少一種包含piggyBac系統之基因編輯器系統，該至少一種基因編輯器系統實現至少一種免疫調節組合物在第二TIL群體之複數個細胞的細胞表面處之表現且調節至少一種檢查點蛋白在第二TIL群體之複數個細胞中之表現。

根據一些實施例，用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a) 藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體； (b) 將該腫瘤片段添加至密閉系統中； (c) 藉由在包含IL-2且視情況包含OKT-3及/或4-1BB促效劑抗體之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3-11天來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行； (d)藉由添加OKT-3且培養約1-3天來刺激第二TIL群體以獲得第二TIL群體，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對第二TIL群體進行無菌電穿孔以實現將至少一種基因編輯器轉移至第二TIL群體中之複數個細胞中； (f) 使第二TIL群體休止約1天； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、視情況選用之OKT-3抗體、視情況選用之OX40抗體及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行第二次擴增持續約7-11天以獲得第三TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)之治療性TIL群體以提供所收集之TIL群體，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中所收集之TIL群體為治療性TIL群體； (i) 將所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 視情況使用冷凍保存介質來冷凍保存所收集之TIL群體，其中電穿孔步驟包括遞送至少一種包含piggyBac系統之基因編輯器系統，該至少一種基因編輯器系統實現至少一種免疫調節組合物在第二TIL群體之複數個細胞的細胞表面處之表現。在一些實施例中，該至少一種免疫調節組合物包含與膜錨融合之免疫調節劑(例如，本文所述之膜錨定免疫調節融合蛋白)。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑(例如，CD40L或激動性CD40結合域)。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑。在一些實施例中，該免疫調節劑係選自由以下組成之群：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及CD40促效劑。

在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包括使用非病毒技術，諸如piggyBac方法(例如piggyBac轉位子及轉位酶或piggyBac樣轉位子及轉位酶)。在一些實施例中，該方法包括向TIL遞送：(a)包含編碼轉位酶之序列的核酸或胺基酸序列；及(b)包含編碼轉位子之DNA序列的重組及非天然存在之DNA序列。在本揭示案之方法的某些實施例中，編碼轉位酶之序列為mRNA序列。編碼轉位酶之mRNA序列可活體外產生。在本揭示案之方法的某些實施例中，編碼轉位酶之序列為DNA序列。編碼轉位酶之DNA序列可活體外產生。該DNA序列可為cDNA序列。在本揭示案之方法的某些實施例中，編碼轉位酶之序列為胺基酸序列。編碼轉位酶之胺基酸序列可活體外產生。在用轉位子DNA進行預培育後，可遞送蛋白質Super piggybac轉位酶(SPB)。在某些實施例中，轉位子為piggyBac轉位子或piggyBac樣轉位子。在某些實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac轉位子之彼等實施例中，轉位酶為piggyBac轉位酶。在某些實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac樣轉位子之彼等實施例中，轉位酶為piggyBac樣轉位酶。在某些實施例中，piggyBac轉位酶包含有包含WO2019046815之SEQ ID NO: 14487的胺基酸序列。在某些實施例且詳言之其中轉位子為piggyBac轉位子之彼等實施例中，轉位酶為piggyBac™或Super piggyBac™ (SPB)轉位酶。在某些實施例且詳言之其中轉位酶為Super piggyBac™ (SPB)轉位酶之彼等實施例中，編碼轉位酶之序列為mRNA序列。在本揭示案之方法的某些實施例中，轉位酶為piggyBac™ (PB)轉位酶。piggyBac (PB)轉位酶可包含與以下序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間任何百分率之一致性的胺基酸序列或由其組成： 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO:239；WO2019046815之SEQ ID NO: 14487)。

在本揭示案之方法的某些實施例中，轉位子為睡美人轉位子。在本揭示案之方法的某些實施例中，轉位酶為睡美人轉位酶(參見例如美國專利第9,228,180號，其內容以引用之方式整體併入本文中)。在某些實施例中，睡美人轉位酶為高活性睡美人(SB100X)轉位酶。在某些實施例中，睡美人轉位酶包含與以下序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間任何百分率之一致性的胺基酸序列： 1 MGKSKEISQD LRKKIVDLHK SGSSLGAISK RLKVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR 61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGRSARKK 121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN 181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMRKENYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRK V 241 FQMDNDPKHT SKWAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL 301 HQLCQEEWAK IHPTYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY (SEQ ID NO:240；WO2019046815之SEQ ID NO: 14485)。

在某些實施例(包括其中睡美人轉位酶為高活性睡美人(SB100X)轉位酶之彼等)中，睡美人轉位酶包含與以下序列具有至少至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間任何百分率之一致性的胺基酸序列： 1 MGKSKEISQD LRKRIVDLHK SGSSLGAISK RLAVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR 61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGHSARKK 121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN 181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMDAVQYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV 241 FQHDNDPKHT SKWAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL 301 HQLCQEEWAK IHPNYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY (SEQ ID NO:241；WO2019046815之SEQ ID NO: 14486)。 G. 用於 TIL 製造之密閉系統

本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。此類密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少燒瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用兩個容器。

此類密閉系統係此項技術中熟知的且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https:// www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。

無菌連接裝置(STCD)在兩段可相容管道之間產生無菌鍛接。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包括如實例中所述之魯爾鎖及熱密封系統。在一些實施例中，在無菌條件下經由注射器進入密閉系統以便維持該系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所述之密閉系統。在一些實施例中，根據本文實例中所述之方法將TIL調配至最終產品調配物容器中。

在一些實施例中，密閉系統自獲得腫瘤片段之時開始一直至TIL即將投與至患者或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用兩個容器之實施例中，第一容器為密閉G容器，且TIL群體在無需打開第一密閉G容器之情況下經離心且轉移至輸注袋。在一些使用兩個容器之實施例中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統之特徵在於，一旦添加了腫瘤樣品及/或腫瘤片段，該系統即可自外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染侵襲。

在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。

密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。

此外，TIL細胞培養環境之pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之培養基係循環的，該密閉環境仍需要持續維持為用於TIL增生之最佳環境。為此，可需要藉助於感測器監測密閉環境之培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，該感測器之信號用於控制安裝於培養環境入口處之氣體交換器，且密閉環境之氣體分壓根據培養液體中之變化即時進行調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供一種密閉細胞培養系統，該系統在密閉系統之入口處併入配備有監測裝置之氣體交換器，該監測裝置量測該密閉環境之pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置之信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。

在一些實施例中，在密閉環境內之壓力係經連續或間歇控制。即，在密閉環境中之壓力可藉助於例如壓力維持裝置而異，因此確保該空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。此外，藉由間歇性施加負壓，有可能藉助於暫時性收縮密閉環境之體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環之液體。

在一些實施例中，用於TIL增生之最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3之因子以及組合。 H. 視情況選用之 TIL 冷凍保存

主體TIL群體(例如第二TIL群體) 或經擴增TIL群體(例如第三TIL群體)可視情況經冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存係針對治療性TIL群體。在一些實施例中，冷凍保存係針對在第二次擴增後收集之TIL。在一些實施例中，冷凍保存係針對圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之例示性步驟F中的TIL。在一些實施例中，TIL在輸注袋中冷凍保存。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存，然後置於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存且不置於輸注袋中。在一些實施例中，冷凍保存使用冷凍保存培養基來執行。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲亞碸(DMSO)。這通常藉由將TIL群體放入冷凍溶液( 例如，85%補體不活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中來完成。將細胞溶液置於冷凍小瓶中且儲存於-80℃下持續24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器中進行冷凍保存。參見Sadeghi 等人 , Acta Oncologica 2013, 52,978-986。

適當時，自冷凍器移出細胞且在37℃水浴中解凍，直至大約4/5之溶液解凍。通常將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一或多次。在一些實施例中，可對解凍之TIL計數且如此項技術中已知來評估活力。

在一些實施例中，TIL群體使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10, BioLife Solutions)進行冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體使用含有二甲亞碸(DMSO)之冷凍保存培養基進行冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體使用1:1 (vol:vol)比率之CS10及細胞培養基進行冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體使用約1:1 (vol:vol)比率之CS10及細胞培養基進行冷凍保存，該細胞培養基進一步包含額外IL-2。

如上文所論述及如圖1及/或8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之步驟A至E中所例示，冷凍保存可發生於TIL擴增過程中之許多時刻。在一些實施例中，在第一次擴增(如例如根據步驟B所提供)後之經擴增TIL群體或在一或多個根據圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D的第二次擴增後之經擴增TIL群體可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL群體置於冷凍溶液( 例如，85%補體不活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中來完成。將細胞溶液置於冷凍小瓶中且儲存於-80℃下持續24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器中進行冷凍保存。參見Sadeghi 等人 , Acta Oncologica 2013, 52,978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例6所提供之方法進行冷凍保存。

在一些情況下，圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B的TIL群體可使用以下論述之方案立即冷凍保存。或者，主體TIL群體可進行圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C及步驟D且接著在圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D後進行冷凍保存。同樣，在其中經基因修飾之TIL將用於療法中之情況中，圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B或步驟D的TIL群體可進行基因修飾以用於合適治療。 I. 經擴增 TIL 之表型特徵

在一些實施例中，分析TIL在擴增後之許多表型標誌物之表現，包括本文及實例中所描述之彼等。在一些實施例中，檢查一或多種表型標誌物之表現。在一些實施例中，在圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B的第一次擴增之後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C的轉變期間分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C的轉變期間且在冷凍保存之後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D的第二次擴增之後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D的兩次或兩次以上擴增之後分析TIL之表型特徵。

在一些實施例中，標誌物係選自由CD8及CD28組成之群。在一些實施例中，檢查CD8之表現。在一些實施例中，檢查CD28之表現。在一些實施例中，如與其他過程( 例如，如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之Gen 3過程相比，如與如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之2A過程相比，CD8及/或CD28表現在根據本發明過程產生之TIL上較高。在一些實施例中，如與其他過程( 例如，如例如圖8 (詳言之，例如圖8B)所提供之Gen 3過程相比，如與如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之2A過程相比，CD8表現在根據本發明過程產生之TIL上較高。在一些實施例中，如與其他過程( 例如，如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之Gen 3過程相比，如與如例如圖8 (詳言之，例如圖8A))所提供之2A過程相比，CD28表現在根據本發明過程產生之TIL上較高。在一些實施例中，高CD28表現指示較年輕、更持久TIL表型。在一些實施例中，量測一或多種調節標誌物之表現。

在一些實施例中，在用於擴增本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的方法中之任何步驟期間，未基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL群體、第二TIL群體、第三TIL群體或所收集之TIL群體。

在一些實施例中，如與其他過程( 例如，如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之Gen 3過程相比，如與如例如圖8 (詳言之，例如圖8A))所提供之2A過程相比，中央記憶細胞之百分率在根據本發明過程產生之TIL上較高。在一些實施例中，用於中央記憶細胞之記憶標誌物係選自由CCR7及CD62L組成之群。

在一些實施例中，可將CD4+及/或CD8+ TIL記憶子集分成不同的記憶子集。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含原生(CD45RA+CD62L+) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含中央記憶(CM；CD45RA-CD62L+) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含效應子記憶(EM；CD45RA-CD62L-) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含RA+效應子記憶/效應子(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+) TIL。

在一些實施例中，TIL表現一或多種選自由顆粒酶B、穿孔素及顆粒溶解素組成之群之標誌物。在一些實施例中，TIL表現顆粒酶B。在一些實施例中，TIL表現穿孔素。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解素。

在一些實施例中，亦可使用細胞介素釋出分析來評估再刺激之TIL之細胞介素釋出。在一些實施例中，可評估TIL之干擾素γ (IFN-γ)分泌。在一些實施例中，藉由ELISA分析來量測IFN-γ分泌。在一些實施例中，藉由ELISA分析在快速第二次擴增步驟之後，在如例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之步驟D之後量測IFN-γ分泌。在一些實施例中，藉由IFN-γ (IFN-gamma)分泌來量測TIL健康。在一些實施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產量之效力分析。IFN-γ產量係細胞毒性潛力之另一量度。IFN-γ產量可藉由確定經CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激之TIL培養基中的細胞介素IFN-γ之水準來量測。來自此等受刺激TIL之培養基中之IFN-γ水準可使用量測IFN-γ釋出來確定。在一些實施例中，如與例如在如圖8 (詳言之，例如圖8A)所提供之2A過程之步驟D中相比，例如在如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之Gen 3過程之步驟D中的TIL中之IFN-γ產量增加，指示步驟D TIL之細胞毒性潛力增加。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組來量測IFN-γ。在一些實施例中，離體量測TIL中之IFN-γ。在一些實施例中，離體量測TIL中之IFN-γ，包括藉由本發明方法(包括例如圖8B方法)產生之TIL。

在一些實施例中，能夠實現至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少一倍以上IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少兩倍以上IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少三倍以上IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少四倍以上IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少五倍以上IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。

在一些實施例中，能夠實現至少100 pg/mL至約1000 pg/mL或更多IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL、至少250 pg/mL、至少300 pg/mL、至少350 pg/mL、至少400 pg/mL、至少450 pg/mL、至少500 pg/mL、至少550 pg/mL、至少600 pg/mL、至少650 pg/mL、至少700 pg/mL、至少750 pg/mL、至少800 pg/mL、至少850 pg/mL、至少900 pg/mL、至少950 pg/mL或至少1000 pg/mL或更多IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少300 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少400 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少500 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少600 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少700 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少800 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少900 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少1000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少2000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少3000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少4000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少5000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少6000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少7000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少8000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少9000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少10,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少15,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少20,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少25,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少30,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少35,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少40,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少45,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少50,000 pg/mL IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。

在一些實施例中，能夠實現至少100 pg/mL/5e5個細胞至約1000 pg/mL/5e5個細胞或更多IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL/5e5個細胞、至少250 pg/mL/5e5個細胞、至少300 pg/mL/5e5個細胞、至少350 pg/mL/5e5個細胞、至少400 pg/mL/5e5個細胞、至少450 pg/mL/5e5個細胞、至少500 pg/mL/5e5個細胞、至少550 pg/mL/5e5個細胞、至少600 pg/mL/5e5個細胞、至少650 pg/mL/5e5個細胞、至少700 pg/mL/5e5個細胞、至少750 pg/mL/5e5個細胞、至少800 pg/mL/5e5個細胞、至少850 pg/mL/5e5個細胞、至少900 pg/mL/5e5個細胞、至少950 pg/mL/5e5個細胞或至少1000 pg/mL/5e5個細胞或更多IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少300 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少400 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少500 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少600 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少700 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少800 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少900 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少1000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少2000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少3000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少4000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少5000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少6000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少7000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少8000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少9000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少10,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少15,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少20,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少25,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少30,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少35,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少40,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少45,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少50,000 pg/mL/5e5個細胞之IFN-γ分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。

T及B淋巴細胞之多樣抗原受體係藉由有限但大量之基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V (可變區)、D (多樣區)、J (接合區)及C (恒定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於生成展現且增加T細胞譜系多樣性之TIL之方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL相較於新鮮收集之TIL及/或使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所體現之彼等方法以外的方法)製備之TIL，展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL相較於新鮮收集之TIL及/或使用稱為Gen 2的方法(如圖8 (詳言之，例如圖8A)中所例示)製備之TIL，展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，在第一次擴增中獲得之TIL展現增加之T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中、存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即，TCRα/β)之表現增加。在一些實施例中，基於樣品內之獨特肽CDR的數目，如與其他過程(例如，稱為Gen 2之過程)相比，如本文所述之過程( 例如，Gen 3過程)顯示較高純系多樣性。

在一些實施例中，可藉由檢查一或多種標誌物來確定TIL之活化及耗竭。在一些實施例中，可使用多色流式細胞術來確定活化及耗竭。在一些實施例中，標誌物之活化及耗竭包括但不限於一或多種選自由以下組成之群的標誌物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103及/或LAG-3)。在一些實施例中，標誌物之活化及耗竭包括但不限於一或多種選自由以下組成之群的標誌物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，標誌物之活化及耗竭包括但不限於一或多種選自由以下組成之群的標誌物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，可確定及/或分析T細胞標誌物(包括活化及耗竭標誌物)以檢查T細胞活化、抑制或功能。在一些實施例中，T細胞標誌物可包括但不限於一或多種選自由以下組成之群的標誌物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4及/或CD59。

在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL至300000 pg/10 ⁶個TIL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL、大於5000 pg/10 ⁶個TIL、大於7000 pg/10 ⁶個TIL、大於9000 pg/10 ⁶個TIL、大於11000 pg/10 ⁶個TIL、大於13000 pg/10 ⁶個TIL、大於15000 pg/10 ⁶個TIL、大於17000 pg/10 ⁶個TIL、大於19000 pg/10 ⁶個TIL、大於20000 pg/10 ⁶個TIL、大於40000 pg/10 ⁶個TIL、大於60000 pg/10 ⁶個TIL、大於80000 pg/10 ⁶個TIL、大於100000 pg/10 ⁶個TIL、大於120000 pg/10 ⁶個TIL、大於140000 pg/10 ⁶個TIL、大於160000 pg/10 ⁶個TIL、大於180000 pg/10 ⁶個TIL、大於200000 pg/10 ⁶個TIL、大於220000 pg/10 ⁶個TIL、大於240000 pg/10 ⁶個TIL、大於260000 pg/10 ⁶個TIL、大於280000 pg/10 ⁶個TIL、大於300000 pg/10 ⁶個TIL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於5000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於7000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於9000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於11000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於13000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於15000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於17000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於19000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於20000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於40000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於60000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於80000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於100000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於120000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於140000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於160000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於180000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於200000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於220000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於240000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於260000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於280000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於300000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL至300000 pg/10 ⁶個TIL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL、大於5000 pg/10 ⁶個TIL、大於7000 pg/10 ⁶個TIL、大於9000 pg/10 ⁶個TIL、大於11000 pg/10 ⁶個TIL、大於13000 pg/10 ⁶個TIL、大於15000 pg/10 ⁶個TIL、大於17000 pg/10 ⁶個TIL、大於19000 pg/10 ⁶個TIL、大於20000 pg/10 ⁶個TIL、大於40000 pg/10 ⁶個TIL、大於60000 pg/10 ⁶個TIL、大於80000 pg/10 ⁶個TIL、大於100000 pg/10 ⁶個TIL、大於120000 pg/10 ⁶個TIL、大於140000 pg/10 ⁶個TIL、大於160000 pg/10 ⁶個TIL、大於180000 pg/10 ⁶個TIL、大於200000 pg/10 ⁶個TIL、大於220000 pg/10 ⁶個TIL、大於240000 pg/10 ⁶個TIL、大於260000 pg/10 ⁶個TIL、大於280000 pg/10 ⁶個TIL、大於300000 pg/10 ⁶個TIL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於5000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於7000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於9000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於11000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於13000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於15000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於17000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於19000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於20000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於40000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於60000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於80000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於100000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於120000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於140000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於160000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於180000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於200000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於220000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於240000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於260000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於280000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於300000 pg/10 ⁶個TIL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。

在一些實施例中，展現大於1000 pg/mL至300000 pg/mL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於1000 pg/mL、大於2000 pg/mL、大於3000 pg/mL、大於4000 pg/mL、大於5000 pg/mL、大於6000 pg/mL、大於7000 pg/mL、大於8000 pg/mL、大於9000 pg/mL、大於10000 pg/mL、大於20000 pg/mL、大於30000 pg/mL、大於40000 pg/mL、大於50000 pg/mL、大於60000 pg/mL、大於70000 pg/mL、大於80000 pg/mL、大於90000 pg/mL、大於100000 pg/mL或更多顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於1000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於2000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於3000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於4000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於5000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於6000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於7000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於8000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於9000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於10000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於20000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於30000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於40000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於50000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於60000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於70000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於80000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於90000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於100000 pg/mL之顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於120000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於140000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於160000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於180000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於200000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於220000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於240000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於260000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於280000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。在一些實施例中，展現大於300000 pg/mL之顆粒酶B分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生的TIL。

在一些實施例中，本發明之擴增方法產生相較於非擴增TIL群體在活體外展現增加之顆粒酶B分泌的經擴增TIL群體，包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D中所提供之TIL。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少一倍至五十倍或更多倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少一倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少兩倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少三倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少四倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少五倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少六倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少七倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少八倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少九倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少十倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少二十倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少三十倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少四十倍。在一些實施例中，本發明之經擴增TIL群體之顆粒酶B分泌相較於非擴增TIL群體增加至少五十倍。

在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍水準之TNF-α ( 亦即，TNF-alpha)分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少一倍水準之TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少兩倍水準之TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少三倍水準之TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少四倍水準之TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，相較於IFN-γ分泌能夠降低至少五倍水準之TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。

在一些實施例中，能夠實現至少200 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α ( 亦即，TNF-alpha)分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少500 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少1000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少2000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少3000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少4000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少5000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少6000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少7000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少8000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。在一些實施例中，能夠實現至少9000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α分泌之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL。

在一些實施例中，量測IFN-γ及顆粒酶B水準以確定藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL之表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ及TNF-α水準以確定藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL之表型特徵。在一些實施例中，量測顆粒酶B及TNF-α水準以確定藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL之表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ、顆粒酶B及TNF-α水準以確定藉由本發明之擴增方法(包括例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生的TIL之表型特徵。

在一些實施例中，在冷凍保存之後檢查表型表徵。 J. 額外過程實施例

在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該方法包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來執行啟動性第一次擴增，其中執行啟動性第一次擴增持續約1至7天或約約1至8天以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體之數目比第一TIL群體大；(c)藉由使第二TIL群體與包含IL-2、OKT-3及外源抗原呈遞細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行快速第二次擴增持續約1至11天或約1至10天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天或約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現小規模培養中之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，在較大規模培養中培養來自小規模培養之第二TIL群體持續約4至7天或約4至8天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之第一小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天或約約4至8天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天或約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天或約4至8天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天之時期。

在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該方法包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來執行啟動性第一次擴增，其中執行啟動性第一次擴增持續約1至8天以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體之數目比第一TIL群體大；(c)藉由使第二TIL群體與包含IL-2、OKT-3及外源抗原呈遞細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行快速第二次擴增持續約1至8天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現小規模培養中之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，在較大規模培養中培養來自小規模培養之第二TIL群體持續約4至8天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之第一小規模培養中培養第二TIL群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天之時期。

在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該方法包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來執行啟動性第一次擴增，其中執行啟動性第一次擴增持續約1至7天以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體之數目比第一TIL群體大；(c)藉由使第二TIL群體與包含IL-2、OKT-3及外源抗原呈遞細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行快速第二次擴增持續約1至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現小規模培養中之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器( 例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，在較大規模培養中培養來自小規模培養之第二TIL群體持續約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之第一小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天之時期。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器( 例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第二TIL群體持續約4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(2)實現來自第一小規模培養中之第二TIL群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器( 例如，G-REX-g500MCS容器)中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由使第一TIL群體與進一步包含外源抗原呈遞細胞(APC)之培養基接觸來執行初級第一次擴增，其中步驟(c)中培養基中之APC的數目大於步驟(b)中培養基中之APC的數目。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，培養基補充有額外外源APC。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至20:1或約20:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至9:1或約9:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至8:1或約8:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至7:1或約7:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至6:1或約6:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自1.1:1或約1.1:1至2:1或約2:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至10:1或約10:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至5:1或約5:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至4:1或約4:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至3:1或約3:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.9:1或約2.9:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.8:1或約2.8:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.7:1或約2.7:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.6:1或約2.6:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.5:1或約2.5:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.4:1或約2.4:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.3:1或約2.3:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.2:1或約2.2:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率係選自2:1或約2:1至2.1:1或約2.1:1之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率為2:1或約2:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目對步驟(b)中添加之APC的數目之比率為以下值或約以下值：1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在初級第一次擴增中添加之APC的數目為以下值或約以下值：1×10 ⁸、1.1×10 ⁸、1.2×10 ⁸、1.3×10 ⁸、1.4×10 ⁸、1.5×10 ⁸、1.6×10 ⁸、1.7×10 ⁸、1.8×10 ⁸、1.9×10 ⁸、2×10 ⁸、2.1×10 ⁸、2.2×10 ⁸、2.3×10 ⁸、2.4×10 ⁸、2.5×10 ⁸、2.6×10 ⁸、2.7×10 ⁸、2.8×10 ⁸、2.9×10 ⁸、3×10 ⁸、3.1×10 ⁸、3.2×10 ⁸、3.3×10 ⁸、3.4×10 ⁸或3.5×10 ⁸個APC，且使得在快速第二次擴增中添加之APC的數目為以下值或約以下值：3.5×10 ⁸、3.6×10 ⁸、3.7×10 ⁸、3.8×10 ⁸、3.9×10 ⁸、4×10 ⁸、4.1×10 ⁸、4.2×10 ⁸、4.3×10 ⁸、4.4×10 ⁸、4.5×10 ⁸、4.6×10 ⁸、4.7×10 ⁸、4.8×10 ⁸、4.9×10 ⁸、5×10 ⁸、5.1×10 ⁸、5.2×10 ⁸、5.3×10 ⁸、5.4×10 ⁸、5.5×10 ⁸、5.6×10 ⁸、5.7×10 ⁸、5.8×10 ⁸、5.9×10 ⁸、6×10 ⁸、6.1×10 ⁸、6.2×10 ⁸、6.3×10 ⁸、6.4×10 ⁸、6.5×10 ⁸、6.6×10 ⁸、6.7×10 ⁸、6.8×10 ⁸、6.9×10 ⁸、7×10 ⁸、7.1×10 ⁸、7.2×10 ⁸、7.3×10 ⁸、7.4×10 ⁸、7.5×10 ⁸、7.6×10 ⁸、7.7×10 ⁸、7.8×10 ⁸、7.9×10 ⁸、8×10 ⁸、8.1×10 ⁸、8.2×10 ⁸、8.3×10 ⁸、8.4×10 ⁸、8.5×10 ⁸、8.6×10 ⁸、8.7×10 ⁸、8.8×10 ⁸、8.9×10 ⁸、9×10 ⁸、9.1×10 ⁸、9.2×10 ⁸、9.3×10 ⁸、9.4×10 ⁸、9.5×10 ⁸、9.6×10 ⁸、9.7×10 ⁸、9.8×10 ⁸、9.9×10 ⁸或1×10 ⁹個APC。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在初級第一次擴增中添加之APC的數目係選自1×10 ⁸個APC或約1×10 ⁸個APC至3.5×10 ⁸個APC或約3.5×10 ⁸個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加之APC的數目係選自3.5×10 ⁸個APC或約3.5×10 ⁸個APC至1×10 ⁹個APC或約1×10 ⁹個APC之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在初級第一次擴增中添加之APC的數目係選自1.5×10 ⁸個APC或約1.5×10 ⁸個APC至3×10 ⁸個APC或約3×10 ⁸個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加之APC的數目係選自4×10 ⁸個APC或約4×10 ⁸個APC至7.5×10 ⁸個APC或約7.5×10 ⁸個APC之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在初級第一次擴增中添加之APC的數目係選自2×10 ⁸個APC或約2×10 ⁸個APC至2.5×10 ⁸個APC或約2.5×10 ⁸個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加之APC的數目係選自4.5×10 ⁸個APC或約4.5×10 ⁸個APC至5.5×10 ⁸個APC或約5.5×10 ⁸個APC之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得2.5×10 ⁸個APC或約2.5×10 ⁸個APC添加至初級第一次擴增中且5×10 ⁸個APC或約5×10 ⁸個APC添加至快速第二次擴增中。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得抗原呈遞細胞為周邊血單核細胞(PBMC)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個腫瘤片段分佈於複數個獨立容器中，在該等獨立容器中之每一者中，第一TIL群體係在步驟(a)中獲得，第二TIL群體係在步驟(b)中獲得，且第三TIL群體係在步驟(c)中獲得，且組合在步驟(c)中來自該複數個容器之治療性TIL群體以產生自步驟(d)收集之TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個腫瘤均勻地分佈於該複數個獨立容器中。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含至少兩個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含兩個至二十個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含兩個至十五個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含兩個至十個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含兩個至五個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該複數個獨立容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個獨立容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得對於其中在步驟(b)中對第一TIL群體執行啟動性第一次擴增之每一容器，在步驟(c)中在同一容器中對自此類第一TIL群體產生之第二TIL群體執行快速第二次擴增。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該等獨立容器中之每一者均包含第一透氣表面區域。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個腫瘤片段分佈於單一容器中。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該單一容器包含第一透氣表面區域。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中，APC以一個細胞層或約一個細胞層至三個細胞層或約三個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，APC以1.5個細胞層或約1.5個細胞層至2.5個細胞層或約2.5個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，APC以2個細胞層或約2個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第一透氣表面區域上分層：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以3個細胞層或約3個細胞層至10個細胞層或約10個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以4個細胞層或約4個細胞層至8個細胞層或約8個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第一透氣表面區域上分層：3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第一透氣表面區域上分層：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，在包含第一透氣表面區域之第一容器中執行啟動性第一次擴增且在步驟(c)中，在包含第二透氣表面區域之第二容器中執行快速第二次擴增。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二容器大於第一容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中步驟(b)中，APC以一個細胞層或約一個細胞層至三個細胞層或約三個細胞層之平均厚度在第一透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如適用經修改，使得在步驟(b)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第一透氣表面區域上分層：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以3個細胞層或約3個細胞層至10個細胞層或約10個細胞層之平均厚度在第二透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以4個細胞層或約3個細胞層至8個細胞層或約10個細胞層之平均厚度在第二透氣表面區域上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第二透氣表面區域上分層：3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如適用經修改，使得在步驟(c)中，APC以以下值或約以下值之平均厚度在第二透氣表面區域上分層：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，在包含第一透氣表面區域之第一容器中執行啟動性第一次擴增且在步驟(c)中，在該第一容器中執行快速第二次擴增。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:10或約1:10之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:9或約1:9之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:8或約1:8之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:7或約1:7之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:6或約1:6之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:5或約1:5之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:4或約1:4之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:3或約1:3之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.1或約1:1.1至1:2或約1:2之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.2或約1:1.2至1:8或約1:8之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.3或約1:1.3至1:7或約1:7之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.4或約1:1.4至1:6或約1:6之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.5或約1:1.5至1:5或約1:5之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.6或約1:1.6至1:4或約1:4之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.7或約1:1.7至1:3.5或約1:3.5之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.8或約1:1.8至1:3或約1:3之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:1.9或約1:1.9至1:2.5或約1:2.5之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自1:2或約1:2之範圍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，藉由對第一TIL群體之細胞培養基補充額外抗原呈遞細胞(APC)來執行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加之APC的數目大於在步驟(b)中添加之APC的數目，且其中在步驟(b)中分層之APC的平均層數對在步驟(c)中分層之APC的平均層數之比率係選自以下值或約以下值：1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體中之TIL的數目對第一TIL群體中之TIL的數目之比率為1.5:1或約1.5:1至100:1或約100:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體中之TIL的數目對第一TIL群體中之TIL的數目之比率為50:1或約50:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體中之TIL的數目對第一TIL群體中之TIL的數目之比率為25:1或約25:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體中之TIL的數目對第一TIL群體中之TIL的數目之比率為20:1或約20:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體中之TIL的數目對第一TIL群體中之TIL的數目之比率為10:1或約10:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體之數目比第一TIL群體大至少50倍或約50倍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二TIL群體之數目比第一TIL群體大至少以下值或約以下值：1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或50倍。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中開始第二時期之後2天或約2天或3天或約3天，細胞培養基補充有額外IL-2。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如上文適用經修改以進一步包括使用冷凍保存過程將步驟(d)中所收集之TIL群體冷凍保存的步驟。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如上文適用經修改以包括在步驟(d)之後執行(e)將步驟(d)中所收集之TIL群體轉移至視情況含有HypoThermosol之輸注袋的額外步驟。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如上文適用經修改以包括使用冷凍保存過程將包含步驟(e)中所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存的步驟。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得使用所收集之TIL群體對冷凍保存培養基之1:1比率執行冷凍保存過程。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得PBMC係經照射及同種異體的。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中添加至培養基中之APC的總數為2.5 × 10 ⁸。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中添加至培養基中之APC的總數為5 × 10 ⁸。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得APC為PBMC。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得抗原呈遞細胞為人工抗原呈遞細胞。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得使用基於膜之細胞處理系統來執行步驟(d)中之收集。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得使用LOVO細胞處理系統來執行步驟(d)中之收集。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含5個或約5個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含10個或約10個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含15個或約15個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含20個或約20個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含25個或約25個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含30個或約30個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含35個或約35個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含40個或約40個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含45個或約45個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含50個或約50個至60個或約60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，多個片段包含以下值或約以下值：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個片段/容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有27 mm ³或約27 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有20 mm ³或約20 mm ³至50 mm ³或約50 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有21 mm ³或約21 mm ³至30 mm ³或約30 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有22 mm ³或約22 mm ³至29.5 mm ³或約29.5 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有23 mm ³或約23 mm ³至29 mm ³或約29 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有24 mm ³或約24 mm ³至28.5 mm ³或約28.5 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有25 mm ³或約25 mm ³至28 mm ³或約28 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有26.5 mm ³或約26.5 mm ³至27.5 mm ³或約27.5 mm ³之體積。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各片段具有以下值或約以下值之體積：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mm ³。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個片段包含30或約30至60或約60個片段，其總體積為1300 mm ³或約1300 mm ³至1500 mm ³或約1500 mm ³。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個片段包含50或約50個片段，其總體積為1350 mm ³或約1350 mm ³。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得多個片段包含50或約50個片段，其總質量為1公克或約1公克至1.5公克或約1.5公克。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得細胞培養基係提供於作為G容器或Xuri細胞袋之容器中。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得細胞培養基中之IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得細胞培養基中之IL-2濃度為約6,000 IU/mL。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在以下值或約以下值之時期內執行步驟(b)中之第一時期：1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在以下值或約以下值之時期內執行步驟(c)中之第二時期：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各自個別地在以下值或約以下值之時期內執行步驟(b)中之第一時期及步驟(c)中之第二時期：1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各自個別地在以下值或約以下值之時期內執行步驟(b)中之第一時期及步驟(c)中之第二時期：5天、6天或7天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得各自個別地在以下值或約以下值之時期內執行步驟(b)中之第一時期及步驟(c)中之第二時期：7天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計14天或約14天至18天或約18天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計15天或約15天至18天或約18天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計16天或約16天至18天或約18天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計17天或約17天至18天或約18天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計14天或約14天至17天或約17天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計15天或約15天至17天或約17天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計16天或約16天至17天或約17天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計14天或約14天至16天或約16天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計15天或約15天至16天或約16天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計14天或約14天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計15天或約15天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計16天或約16天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計17天或約17天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計18天或約18天內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計14天或約14天或更短時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計15天或約15天或更短時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計16天或約16天或更短時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)-(d)在總計18天或約18天或更短時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(d)中所收集之治療性TIL群體包含足以實現治療有效劑量之TIL的TIL。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得足以實現治療有效劑量之TIL的數目為2.3×10 ¹⁰或約2.3×10 ¹⁰至13.7×10 ¹⁰或約13.7×10 ¹⁰。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(c)中之第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(c)中之第三TIL群體提供如與藉由超過16天之過程製備的TIL相比至少一倍至五倍或更多倍干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(c)中之第三TIL群體提供如與藉由超過17天之過程製備的TIL相比至少一倍至五倍或更多倍干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(c)中之第三TIL群體提供如與藉由超過18天之過程製備的TIL相比至少一倍至五倍或更多倍干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得獲自步驟(c)中之第三TIL群體的效應子T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)中之第二TIL群體的效應子T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加之CD8及CD28表現。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法中所陳述之每一容器均為密閉容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法中所陳述之每一容器均為G容器。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法中所陳述之每一容器均為GREX-10。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法中所陳述之每一容器均為GREX-100。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法中所陳述之每一容器均為GREX-500。

在其他實施例中，本發明提供藉由如上文適用之任一先前段落中所述之方法製得的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由不添加任何抗原呈遞細胞(APC)或OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由不添加任何抗原呈遞細胞(APC)來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由不添加任何OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由不添加抗原呈遞細胞(APC)且不添加OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由超過16天之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由超過17天之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供由患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，其中與藉由超過18天之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產量及/或增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，其提供增加之干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，其提供增加之多株性。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，其提供增加之功效。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過16天之過程製備的TIL相比至少一倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過17天之過程製備的TIL相比至少一倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過18天之過程製備的TIL相比至少一倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過16天之過程製備的TIL相比至少兩倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過17天之過程製備的TIL相比至少兩倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過18天之過程製備的TIL相比至少兩倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少兩倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過16天之過程製備的TIL相比至少三倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過17天之過程製備的TIL相比至少三倍多干擾素-γ產量。在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經修改，使得該治療性TIL群體能夠提供如與藉由超過18天之過程製備的TIL相比至少三倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少三倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，與藉由不添加任何抗原呈遞細胞(APC)來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群體，與藉由不添加任何OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，與藉由不添加任何APC來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少兩倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少兩倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，與藉由不添加任何OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少兩倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少兩倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，與藉由不添加任何APC來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少三倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少一倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，與藉由不添加任何OKT3來執行TIL之第一次擴增之過程製備的TIL相比，該治療性TIL群體能夠提供至少三倍多干擾素-γ產量。在一些實施例中，由於本文所述之擴增過程，例如上文步驟A-F中所述或根據上文步驟A-F (亦例如圖8 (詳言之，例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所示，使得TIL能夠提供至少三倍多干擾素-γ產量。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得腫瘤片段為小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查(core biopsies/core needle biopsies)或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得腫瘤片段為粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得腫瘤片段為細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得腫瘤片段為小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得(i)該方法包括自個體之腫瘤組織的一或多個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在執行啟動性第一次擴增之步驟之前，在包含IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天之時期的步驟，(iii)該方法包括執行啟動性第一次擴增持續約8天之時期，及(iv)該方法包括執行快速第二次擴增持續約11天之時期。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得(i)該方法包括自個體之腫瘤組織的一或多個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在執行啟動性第一次擴增之步驟之前，在包含IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天之時期的步驟，(iii)該方法包括執行啟動性第一次擴增持續約8天之時期，及(iv)該方法包括藉由培養第二TIL群體之培養物持續約5天，將該培養物分成多達5個子培養物且培養該等子培養物持續約6天來執行快速第二次擴增。在一些前述實施例中，該多達5個子培養物各自在與其中在快速第二次擴增中開始第二TIL群體之培養的容器相同大小或更大之容器中培養。在一些前述實施例中，第二TIL群體之培養物相等地分給該多達5個子培養物。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查(core biopsies/core needle biopsies)或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約20個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約20個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約10個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1至約10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一TIL群體獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得(i)該方法包括自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活組織檢查獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在執行啟動性第一次擴增之步驟之前，在包含IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天之時期的步驟，(iii)該方法包括藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之培養基中培養第一TIL群體持續約8天之時期以獲得第二TIL群體來執行啟動性第一次擴增步驟，及(iv)該方法包括藉由在包含IL-2、OKT-3及APC之培養基中培養第二TIL群體持續約11天之時期來執行快速第二次擴增步驟。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得(i)該方法包括自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活組織檢查獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在執行啟動性第一次擴增之步驟之前，在包含IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天之時期的步驟，(iii)該方法包括藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之培養基中培養第一TIL群體持續約8天之時期以獲得第二TIL群體來執行啟動性第一次擴增步驟，及(iv)該方法包括藉由在包含IL-2、OKT-3及APC之培養基中培養第二TIL群體之培養物持續約5天，將該培養物分成多達5個子培養物且在包含IL-2之培養基中培養該等子培養物中之每一者持續約6天來執行快速第二次擴增。在一些前述實施例中，該多達5個子培養物各自在與其中在快速第二次擴增中開始第二TIL群體之培養的容器相同大小或更大之容器中培養。在一些前述實施例中，第二TIL群體之培養物相等地分給該多達5個子培養物。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得(i)該方法包括自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活組織檢查獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在執行啟動性第一次擴增之步驟之前，在G-REX-100M燒瓶中之0.5 L CM1培養基中包含6000 IU IL-2/mL之細胞培養基中培養第一TIL群體持續約3天之時期的步驟，(iii)該方法包括藉由添加含有6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及約10 ⁸個餵養細胞之0.5 L CM1培養基且培養約8天之時期來執行啟動性第一次擴增，及(iv)該方法包括如下執行快速第二次擴增：(a)將第二TIL群體轉移至含有具有3000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及5×10 ⁹個餵養細胞之5 L CM2培養基的G-REX-500MCS燒瓶且培養約5天，(b)藉由將10 ⁹個TIL轉移至多達5個含有具有3000 IU/mL IL-2之5 L AIM-V培養基的G-REX-500MCS燒瓶中之每一者中且培養該等子培養物持續約6天而將該培養物分成多達5個子培養物。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，該方法包括：(a)藉由培養獲自供體之第一T細胞群體來執行第一T細胞群體之啟動性第一次擴增以實現第一T細胞群體之生長且啟動活化；(b)在步驟(a)中啟動的第一T細胞群體之活化開始衰退之後，藉由培養第一T細胞群體來執行第一T細胞群體之快速第二次擴增以實現第一T細胞群體之生長且加強活化以獲得第二T細胞群體；及(c)收集第二T細胞群體。在其他實施例中，快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之第一T細胞群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之第一T細胞群體持續約4至7天之時期。在其他實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之第一小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自第一小規模培養之第一T細胞群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之第一T細胞群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天之時期。在其他實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之第一T細胞群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天之時期。在其他實施例中，快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養中之第一T細胞群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速第二次擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之第一T細胞群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)且在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養之第一T細胞群體持續約5至7天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之第一小規模培養中培養第一T細胞群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自第一小規模培養之第一T細胞群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養之第一T細胞群體部分係在第二小規模培養中培養約5至7天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約2至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養之第一T細胞群體轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養中之第一T細胞群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5至6天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養中之第一T細胞群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養中之第一T細胞群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約6天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得快速擴增之步驟係分成以下複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)之小規模培養中培養第一T細胞群體持續約3至4天之時期來執行快速第二次擴增，及接著(b)實現來自小規模培養中之第一T細胞群體轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養之第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約7天之時期。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在多達7天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(b)之快速第二次擴增係在多達8天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(b)之快速第二次擴增係在多達9天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(b)之快速第二次擴增係在多達10天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(b)之快速第二次擴增係在多達11天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在7天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達9天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在7天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達10天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在7天或8天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達9天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在7天或8天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達10天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在8天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達9天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得步驟(a)之啟動性第一次擴增係在8天之時期內執行且步驟(b)之快速第二次擴增係在多達8天之時期內執行。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包含OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3及IL-2。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第一T細胞群體係在包含OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)之第二培養基中培養。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包含第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第一APC群體在第一透氣表面上分層，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體在該容器中之第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第二APC群體在第一透氣表面上分層，且其中第二APC群體大於第一APC群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包含第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第一APC群體在第一透氣表面上分層，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體在該容器中之第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第二APC群體在第一透氣表面上分層，且其中第二APC群體大於第一APC群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包含第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第一APC群體在第一透氣表面上分層，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體在該容器中之第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第二APC群體在第一透氣表面上分層，且其中第二APC群體大於第一APC群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包含第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第一APC群體在第一透氣表面上分層，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體在該容器中之第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的且第二APC群體在第一透氣表面上分層，且其中第二APC群體大於第一APC群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第二APC群體中之APC的數目對第一APC群體中之APC的數目之比率為約2:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一APC群體中之APC的數目為約2.5 × 10 ⁸且第二APC群體中之APC的數目為約5 × 10 ⁸。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以2個APC層之平均厚度在第一透氣表面上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第二APC群體以選自4至8個APC層之範圍的平均厚度在第一透氣表面上分層。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中在第一透氣表面上分層之APC的平均層數對在步驟(a)中在第一透氣表面上分層之APC的平均層數之比率為2:1。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自1.0×10 ⁶個APC/cm ²或約1.0×10 ⁶個APC/cm ²至4.5×10 ⁶個APC/cm ²或約4.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自1.5×10 ⁶個APC/cm ²或約1.5×10 ⁶個APC/cm ²至3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自2.0×10 ⁶個APC/cm ²或約2.0×10 ⁶個APC/cm ²至3.0×10 ⁶個APC/cm ²或約3.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以2.0×10 ⁶個APC/cm ²或約2.0×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第二APC群體以選自2.5×10 ⁶個APC/cm ²或約2.5×10 ⁶個APC/cm ²至7.5×10 ⁶個APC/cm ²或約7.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第二APC群體以選自3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²至6.0×10 ⁶個APC/cm ²或約6.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第二APC群體以選自4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²至5.5×10 ⁶個APC/cm ²或約5.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(b)中，第二APC群體以4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自1.0×10 ⁶個APC/cm ²或約1.0×10 ⁶個APC/cm ²至4.5×10 ⁶個APC/cm ²或約4.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自2.5×10 ⁶個APC/cm ²或約2.5×10 ⁶個APC/cm ²至7.5×10 ⁶個APC/cm ²或約7.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之方法，該方法如適用經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自1.5×10 ⁶個APC/cm ²或約1.5×10 ⁶個APC/cm ²至3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自3.5×10 ⁶個APC/cm ²或約3.5×10 ⁶個APC/cm ²至6.0×10 ⁶個APC/cm ²或約6.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自2.0×10 ⁶個APC/cm ²或約2.0×10 ⁶個APC/cm ²至3.0×10 ⁶個APC/cm ²或約3.0×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²至5.5×10 ⁶個APC/cm ²或約5.5×10 ⁶個APC/cm ²之範圍的密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(a)中，第一APC群體以2.0×10 ⁶個APC/cm ²或約2.0×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種至第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以4.0×10 ⁶個APC/cm ²或約4.0×10 ⁶個APC/cm ²之密度接種至第一透氣表面上。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得APC為周邊血單核細胞(PBMC)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得PBMC係經照射且對於第一T細胞群體之供體為外源性的。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得T細胞為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得T細胞為周邊血淋巴細胞(PBL)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體係藉由自供體之全血分離而獲得。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體係藉由自供體之單采產物分離而獲得。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體藉由T細胞表型之正向或負向選擇自供體之全血或單采產物分離。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得T細胞表型為CD3+及CD45+。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在執行第一T細胞群體之啟動性第一次擴增之前，自NK細胞分離T細胞。在其他實施例中，藉由自第一T細胞群體移除CD3- CD56+細胞而自第一T細胞群體中之NK細胞分離T細胞。在其他實施例中，藉由使用移除CD3- CD56+細胞部分且收回陰性部分之閘控策略使第一T細胞群體經歷細胞分選，自第一T細胞群體移除CD3- CD56+細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以高百分率之NK細胞為特徵之第一T細胞群體中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以高百分率之CD3- CD56+細胞為特徵之第一T細胞群體中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以存在大量NK細胞為特徵之腫瘤組織中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以大量CD3- CD56+細胞為特徵之腫瘤組織中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以存在大量NK細胞為特徵之獲自罹患腫瘤之患者的腫瘤組織中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在以存在大量CD3- CD56+細胞為特徵之獲自罹患腫瘤之患者的腫瘤組織中擴增T細胞。在其他實施例中，前述方法用於在獲自罹患卵巢癌之患者的腫瘤組織中擴增T細胞。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得將來自第一T細胞群體之1×10 ⁷或約1×10 ⁷個T細胞接種於容器中以在此類容器中起始初級第一次擴增培養。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體分佈於複數容器中，且在各容器中，接種來自第一T細胞群體之1×10 ⁷或約1×10 ⁷個T細胞以在此類容器中起始初級第一次擴增培養。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在步驟(c)中收集之第二T細胞群體為治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的一或多個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)、粗針活組織檢查或細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的一或多個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至20個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至10個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活組織檢查。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的一或多個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至20個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至10個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的一或多個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1至10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得第一T細胞群體獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活組織檢查(包括例如穿刺活組織檢查)。

在其他實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該方法包括：i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養腫瘤樣品持續約3天，自獲自個體之腫瘤的一或多個小活組織檢查、粗針活組織檢查或針刺活組織檢查之腫瘤樣品獲得及/或接收第一TIL群體；(ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養第一TIL群體來執行啟動性第一次擴增以產生第二TIL群體，其中在包含第一透氣表面區域之容器中執行啟動性第一次擴增，其中執行啟動性第一次擴增持續約7或8天之第一時期以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體之數目大於第一TIL群體；(iii)藉由用額外IL-2、OKT-3及APC補充第二TIL群體之第二細胞培養基來執行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中在快速第二次擴增中添加之APC的數目係在步驟(ii)中添加之APC的數目之至少兩倍，其中執行快速第二次擴增持續約11天之第二時期以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中在包含第二透氣表面區域之容器中執行快速第二次擴增；(iv)收集獲自步驟(iii)之治療性TIL群體；及(v)將步驟(iv)中所收集之TIL群體轉移至輸注袋。

在其他實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該方法包括：(i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養腫瘤樣品持續約3天，自獲自個體之腫瘤的一或多個小活組織檢查、粗針活組織檢查或針刺活組織檢查之腫瘤樣品獲得及/或接收第一TIL群體；(ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)之第二細胞培養基中培養第一TIL群體來執行啟動性第一次擴增以產生第二TIL群體，其中執行啟動性第一次擴增持續約7或8天之第一時期以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體之數目比第一TIL群體大；(iii)藉由使第二TIL群體與包含IL-2、OKT-3及APC之第三細胞培養基接觸來執行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中執行快速第二次擴增持續約11天之第二時期以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(iv)收集獲自步驟(iii)之治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在第二時期之第5天之後，將培養物分成2個或2個以上子培養物，且用額外量之第三培養基補充各子培養物且培養約6天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在第二時期之第5天之後，將培養物分成2個或2個以上子培養物，且用包含IL-2之第四培養基補充各子培養物且培養約6天。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得在第二時期之第5天之後，將培養物分成5個子培養物。

在其他實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得該方法之所有步驟在約22天內完成。

在其他實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，該方法包括：(i)藉由培養來自獲自供體之腫瘤的一或多個小活組織檢查、粗針活組織檢查或針刺活組織檢查之腫瘤樣品的第一T細胞群體來執行第一T細胞群體之啟動性第一次擴增以實現第一T細胞群體之生長且啟動活化；(ii)在步驟(a)中啟動的第一T細胞群體之活化開始衰退之後，藉由培養第一T細胞群體以實現第一T細胞群體之生長且加強活化以獲得第二T細胞群體來執行第一T細胞群體之快速第二次擴增；及(iv)收集第二T細胞群體。在一些實施例中，腫瘤樣品係獲自複數個粗針活組織檢查。在一些實施例中，該複數個粗針活組織檢查係選自由2、3、4、5、6、7、8、9及10個粗針活組織檢查組成之群。

在一些實施例中，本發明提供如上文適用之任一先前段落中所述之方法，該方法經修改，使得T細胞或TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL正大黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶之酶培養基中培育腫瘤，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而生成。在一些實施例中，將腫瘤置於腫瘤解離酶混合物中，該腫瘤解離酶混合物包括一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原酶(包括膠原酶之任何摻合物或類型)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳酶、木瓜凝乳酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、彈性酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶)、去氧核糖核酸酶I (DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白水解酶及其任何組合。在其他實施例中，將腫瘤置於腫瘤解離酶混合物中，該腫瘤解離酶混合物包括膠原酶(包括膠原酶之任何摻合物或類型)、中性蛋白酶(分散酶)及去氧核糖核酸酶I (DNA酶)。 VI. 醫藥組合物、劑量及給藥方案

在一些實施例中，將使用本揭示案之方法擴增及/或基因修飾的TIL、MIL或PBL (包括經基因修飾以表現CCR之TIL、MIL或PBL)作為醫藥組合物投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物係TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知之任何合適途徑投與。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投與，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投與。

可投與任何合適劑量之TIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個TIL，平均約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其若癌症為NSCLC或黑色素瘤。在一些實施例中，投與約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其癌症為黑色素瘤時。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其癌症為NSCLC時。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供的TIL之數目為約1×10 ⁶、2×10 ⁶、3×10 ⁶、4×10 ⁶、5×10 ⁶、6×10 ⁶、7×10 ⁶、8×10 ⁶、9×10 ⁶、1×10 ⁷、2×10 ⁷、3×10 ⁷、4×10 ⁷、5×10 ⁷、6×10 ⁷、7×10 ⁷、8×10 ⁷、9×10 ⁷、1×10 ⁸、2×10 ⁸、3×10 ⁸、4×10 ⁸、5×10 ⁸、6×10 ⁸、7×10 ⁸、8×10 ⁸、9×10 ⁸、1×10 ⁹、2×10 ⁹、3×10 ⁹、4×10 ⁹、5×10 ⁹、6×10 ⁹、7×10 ⁹、8×10 ⁹、9×10 ⁹、1×10 ¹⁰、2×10 ¹⁰、3×10 ¹⁰、4×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰、6×10 ¹⁰、7×10 ¹⁰、8×10 ¹⁰、9×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、2×10 ¹¹、3×10 ¹¹、4×10 ¹¹、5×10 ¹¹、6×10 ¹¹、7×10 ¹¹、8×10 ¹¹、9×10 ¹¹、1×10 ¹²、2×10 ¹²、3×10 ¹²、4×10 ¹²、5×10 ¹²、6×10 ¹²、7×10 ¹²、8×10 ¹²、9×10 ¹²、1×10 ¹³、2×10 ¹³、3×10 ¹³、4×10 ¹³、5×10 ¹³、6×10 ¹³、7×10 ¹³、8×10 ¹³及9×10 ¹³。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供的TIL之數目係在1×10 ⁶至5×10 ⁶、5×10 ⁶至1×10 ⁷、1×10 ⁷至5×10 ⁷、5×10 ⁷至1×10 ⁸、1×10 ⁸至5×10 ⁸、5×10 ⁸至1×10 ⁹、1×10 ⁹至5×10 ⁹、5×10 ⁹至1×10 ¹⁰、1×10 ¹⁰至5×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰至1×10 ¹¹、5×10 ¹¹至1×10 ¹²、1×10 ¹²至5×10 ¹²及5×10 ¹²至1×10 ¹³範圍內。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v之醫藥組合物。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v之醫藥組合物。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之醫藥組合物範圍內。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之醫藥組合物範圍內。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。

本發明之醫藥組合物中所提供之TIL在寬廣劑量範圍內有效。精確劑量將取決於投與途徑、化合物之投與形式、待治療之個體的性別及年齡、待治療之個體的體重及主治醫師之偏好及經驗。適當時亦可使用TIL之臨床建立劑量。使用本文中之方法所投與之醫藥組合物的量(諸如TIL之劑量)將取決於正在治療之人類或哺乳動物、病症或疾患之嚴重性、投與速率、活性醫藥成分之部署及處方醫師之考量。

在一些實施例中，TIL可以單一劑量投與。此類投與可為注射，例如靜脈內注射。在一些實施例中，TIL可以多個劑量投與。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為一個月一次、每兩週一次、每週一次或每兩天一次。TIL之投與可視需要繼續進行。

在一些實施例中，TIL之有效劑量為約1×10 ⁶、2×10 ⁶、3×10 ⁶、4×10 ⁶、5×10 ⁶、6×10 ⁶、7×10 ⁶、8×10 ⁶、9×10 ⁶、1×10 ⁷、2×10 ⁷、3×10 ⁷、4×10 ⁷、5×10 ⁷、6×10 ⁷、7×10 ⁷、8×10 ⁷、9×10 ⁷、1×10 ⁸、2×10 ⁸、3×10 ⁸、4×10 ⁸、5×10 ⁸、6×10 ⁸、7×10 ⁸、8×10 ⁸、9×10 ⁸、1×10 ⁹、2×10 ⁹、3×10 ⁹、4×10 ⁹、5×10 ⁹、6×10 ⁹、7×10 ⁹、8×10 ⁹、9×10 ⁹、1×10 ¹⁰、2×10 ¹⁰、3×10 ¹⁰、4×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰、6×10 ¹⁰、7×10 ¹⁰、8×10 ¹⁰、9×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、2×10 ¹¹、3×10 ¹¹、4×10 ¹¹、5×10 ¹¹、6×10 ¹¹、7×10 ¹¹、8×10 ¹¹、9×10 ¹¹、1×10 ¹²、2×10 ¹²、3×10 ¹²、4×10 ¹²、5×10 ¹²、6×10 ¹²、7×10 ¹²、8×10 ¹²、9×10 ¹²、1×10 ¹³、2×10 ¹³、3×10 ¹³、4×10 ¹³、5×10 ¹³、6×10 ¹³、7×10 ¹³、8×10 ¹³及9×10 ¹³個。在一些實施例中，TIL之有效劑量係在1×10 ⁶至5×10 ⁶、5×10 ⁶至1×10 ⁷、1×10 ⁷至5×10 ⁷、5×10 ⁷至1×10 ⁸、1×10 ⁸至5×10 ⁸、5×10 ⁸至1×10 ⁹、1×10 ⁹至5×10 ⁹、5×10 ⁹至1×10 ¹⁰、1×10 ¹⁰至5×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰至1×10 ¹¹、5×10 ¹¹至1×10 ¹²、1×10 ¹²至5×10 ¹²及5×10 ¹²至1×10 ¹³個之範圍內。

在一些實施例中，TIL之有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg範圍內。

在一些實施例中，TIL之有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg範圍內。

有效量之TIL可以單一或多個劑量經由具有類似效用之劑的任何可接受之投與模式投與，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、表面、經由移植或經由吸入。

在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包含上文任一先前段落中所述之治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組合物，其包含上文任一先前段落中所述之治療性TIL群體及醫藥學上可接受之載劑。

在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包含上文任一先前段落中所述之TIL組合物。

在其他實施例中，本發明提供上文任一先前段落中所述之治療性TIL群體的冷凍保存製劑。

在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組合物，其包含上文任一先前段落中所述之治療性TIL群體及冷凍保存培養基。

在其他實施例中，本發明提供上文任一先前段落中所述之TIL組合物，該TIL組合物經修改，使得冷凍保存培養基含有DMSO。

在其他實施例中，本發明提供上文任一先前段落中所述之TIL組合物，該TIL組合物經修改，使得冷凍保存培養基含有7-10% DMSO。

在其他實施例中，本發明提供上文任一先前段落中所述之TIL組合物的冷凍保存製劑。

在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之TIL係作為醫藥組合物投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物係TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知之任何合適途徑投與。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投與，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投與。

可投與任何合適劑量之TIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個TIL，平均約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其若癌症為NSCLC。在一些實施例中，投與約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，投與約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 ¹⁰至約13.7×10 ¹⁰個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 ¹⁰個TIL，尤其癌症為NSCLC時。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 ¹⁰至約4.3×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 ¹⁰至約12×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 ¹⁰至約10×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 ¹⁰至約8×10 ¹⁰個TIL。

有效量之TIL可以單一或多個劑量經由具有類似效用之劑的任何可接受之投與模式投與，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、表面、經由移植或經由吸入。 VII. 治療患者之方法

治療方法始於初始TIL收集及TIL培養。此類方法皆已在此項技術中由例如Jin 等人 , J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292描述，其以引用之方式整體併入本文中。治療方法之實施例描述於以下所有章節，包括實例。

根據本文所述之方法包括例如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F (亦如例如圖1及或圖8所示)產生的經擴增TIL可特定用於治療癌症患者(例如，Goff等人, J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239以及補充內容所述)；其以引用之方式整體併入本文中。在一些實施例中，TIL係如先前所述自轉移性黑色素瘤所切除之沈積物生長(參見Dudley 等人, J Immunother., 2003, 26:332-342；以引用之方式整體併入本文中)。新鮮腫瘤可在無菌條件下解剖。可收集代表性樣品進行正式病理分析。可使用2 mm ³至3 mm ³之單一片段。在一些實施例中，獲得每個患者5、10、15、20、25或30個樣品。在一些實施例中，獲得每個患者20、25或30個樣品。在一些實施例中，獲得每個患者20、22、24、26或28個樣品。在一些實施例中，獲得每個患者24個樣品。可將樣品置於24孔板之個別孔中，維持於含有高劑量IL-2 (6,000 IU/mL)之生長培養基中且監測腫瘤之破壞及/或TIL之增生。任何在處理後仍有活細胞之腫瘤均可如本文所述經酶消化成單一細胞懸浮液且經冷凍保存。

在一些實施例中，可對成功生長之TIL取樣以進行表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)且當可用時，針對自體腫瘤進行測試。若隔夜共培養產生之干擾素-γ (IFN-γ)水準˃ 200 pg/mL且為背景之兩倍，則可將TIL可視為具反應性。(Goff 等人, J Immunother., 2010, 33:840-847；以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，可選擇具有自體反應性或足夠生長模式之證據的培養物進行第二次擴增(例如，如根據圖1及/或圖8步驟D所提供之第二次擴增)，包括有時稱為快速擴增(REP)之第二次擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如，在第二次擴增期間之高增生)之經擴增TIL進行額外第二次擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如，如在圖1及/或圖8步驟D中所提供之第二次擴增期間之高增生)的TIL進行根據圖1及/或圖8步驟D之額外第二次擴增。

可藉由流式細胞術( 例如FlowJo)來分析冷凍保存之輸注袋TIL樣品之細胞表型的表面標誌物CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA (BD BioSciences)，以及藉由本文所述之任何方法來分析該等細胞表型。藉由使用標準酶聯免疫吸附劑分析技術來量測血清細胞介素。血清IFN-g之上升係定義為˃100 pg/mL且大於4 3個基線水準。

在一些實施例中，藉由本文所提供之方法(例如圖1及/或圖8中所例示之彼等)產生的TIL提供TIL之臨床功效之意外改良。在一些實施例中，藉由本文所提供之方法(例如圖1及/或圖8中所例示之彼等)產生的TIL相較於藉由除本文中所述之彼等方法以外的方法(包括例如除圖1及/或圖8中所例示之彼等方法以外之方法)產生的TIL展現增加之臨床功效。在一些實施例中，除本文中所述之彼等方法以外的方法包括稱為過程1C及/或第1代(Gen 1)之方法。在一些實施例中，藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應來量測增加之功效。在一些實施例中，藉由本文所提供之方法(例如圖1中所例示之彼等)產生的TIL相較於藉由除本文中所述之彼等方法以外的方法(包括例如除圖1及/或圖8中所例示之彼等方法以外之方法)產生的TIL展現類似之反應時間及安全性型態。

在一些實施例中，IFN-γ指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療之個體的血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產量之效力分析。IFN-γ產量係細胞毒性潛力之另一量度。可藉由確定用藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備之TIL治療的個體之離體血液、血清或TIL中之細胞介素IFN-γ水準來量測IFN-γ產量。在一些實施例中，IFN-γ增加指示用藉由本發明方法產生之TIL治療之患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組來量測IFN-γ。在一些實施例中，在用藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備之TIL治療的個體之離體TIL中量測IFN-γ。在一些實施例中，在用藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備之TIL治療的個體之血液中量測IFN-γ。在一些實施例中，在用藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備之TIL治療的個體之TIL血清中量測IFN-γ。在一些實施例中，IFN-γ指示癌症治療中之治療功效及/或增加之臨床功效。

在一些實施例中，藉由本發明方法(包括如例如圖1中所述之彼等方法)製備之TIL 在一些實施例中，IFN-γ指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療之個體的血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產量之效力分析。IFN-γ產量係細胞毒性潛力之另一量度。可藉由確定用藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備之TIL治療的個體之離體血液、血清或TIL中之細胞介素IFN-γ水準來量測IFN-γ產量。在一些實施例中，IFN-γ增加指示用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ。

在一些實施例中，藉由本發明方法(包括如例如圖1及/或圖8中所述之彼等方法)製備的TIL相較於藉由其他方法(包括未在圖1及/或圖8中例示之彼等方法，包括例如稱為過程1C方法之方法)產生的TIL展現增加之多株性。在一些實施例中，顯著改良之多株性及/或增加之多株性指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投與藉由本發明方法產生之TIL之治療功效。在一些實施例中，相較於使用除本文所提供之彼等方法以外的方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1及/或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加1000倍。

功效之量度可包括疾病控制率(DCR)以及總反應率(ORR)，如此項技術中已知以及本文中所述。 A.治療癌症之方法

本文所述之組合物及方法可用於治療疾病之方法中。在一些實施例中，其係用於治療成人患者或小兒患者之過度增生性病症，諸如癌症。其亦可用於治療如本文及以下段落所述之其他病症。

在一些實施例中，過度增生性病症為癌症。在一些實施例中，過度增生性病症為實體腫瘤癌。在一些實施例中，實體腫瘤癌選自由以下組成之群：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包括三陰性乳癌)、骨癌、人類乳突瘤病毒(HPV)造成之癌症、中樞神經系統相關癌症(包括室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包括鱗狀細胞子宮頸癌、子宮頸腺鱗癌及子宮頸腺癌)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食道胃結合部癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸道基質瘤、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、咽下癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、間皮瘤(包括惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包括胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包括尤文肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他骨及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包括未分化甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。

在一些實施例中，過度增生性病症為血液惡性病。在一些實施例中，血液惡性病選自由以下組成之群：慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症為血液惡性病。在一些實施例中，本發明包括一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL來治療癌症患者之方法，其中該癌症為血液惡性病。在一些實施例中，本發明包括一種使用經修飾以表現一或多種CCR之MIL或PBL來治療癌症患者之方法，其中該癌症為血液惡性病。

在一些實施例中，該癌症係包括實體腫瘤癌及血液惡性病在內的前述癌症之一，其對至少一種先前療法(包括化學療法、放射療法或免疫療法)之治療呈現復發或難治性。在一些實施例中，該癌症為前述癌症之一，其對至少兩種先前療法(包括化學療法、放射療法及/或免疫療法)之治療呈現復發或難治性。在一些實施例中，該癌症為前述癌症之一，其對至少三種先前療法(包括化學療法、放射療法及/或免疫療法)之治療呈現復發或難治性。

在一些實施例中，該癌症為微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)癌症。MSI-H及dMMR癌症及測試因此已描述於Kawakami 等人 , Curr. Treat. Options Oncol. 2015, 16,30中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本發明包括一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL來治療癌症患者之方法，其中該患者為人類。在一些實施例中，本發明包括一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL來治療癌症患者之方法，其中該患者為非人類。在一些實施例中，本發明包括一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL來治療癌症患者之方法，其中該患者為伴侶動物。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症對BRAF抑制劑及/或MEK抑制劑之治療呈現難治性。在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症對選自由威羅菲尼(vemurafenib)、達拉菲尼(dabrafenib)、恩考非尼(encorafenib)、索拉非尼(sorafenib)及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物組成之群的BRAF抑制劑之治療呈現難治性。在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症對選自由曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、畢尼替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹馬司替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物組成之群的MEK抑制劑之治療呈現難治性。在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症對選自由威羅菲尼、達拉菲尼、恩考非尼、索拉非尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物組成之群的BRAF抑制劑及選自由曲美替尼、考比替尼、畢尼替尼、司美替尼、匹馬司替尼、瑞法替尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物組成之群的MEK抑制劑之治療呈現難治性。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症為小兒癌症。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該癌症為葡萄膜黑色素瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該葡萄膜黑色素瘤為脈絡膜黑色素瘤、睫狀體黑色素瘤或虹膜黑色素瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該小兒癌症為神經胚細胞瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該小兒癌症為肉瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該肉瘤為骨肉瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該肉瘤為軟組織肉瘤。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該軟組織肉瘤為橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤或原始神經外胚層腫瘤(PNET)。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該小兒癌症為中樞神經系統(CNS)相關癌症。在一些實施例中，該小兒癌症對化學療法之治療呈現難治性。在一些實施例中，該小兒癌症對放射療法之治療呈現難治性。在一些實施例中，該小兒癌症對地努妥昔單抗(dinutuximab)之治療呈現難治性。

在一些實施例中，本發明包括一種治療癌症患者之方法，其中該CNS相關癌症為神經管胚細胞瘤、松果體母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤或神經膠質母細胞瘤。

本文所述之組合物及方法可用於治療癌症之方法中，其中該癌症對抗PD-1或抗PD-L1抗體之先前治療呈現難治性或抗性。在一些實施例中，患者係抗PD-1或抗PD-L1抗體之原發性難治性患者。在一些實施例中，患者對抗PD-1或抗PD-L1抗體不顯示先前反應。在一些實施例中，患者對抗PD-1或抗PD-L1抗體顯示先前反應，隨後顯示患者之癌症的進展。在一些實施例中，該癌症對抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1或抗PD-L1抗體與至少一種化學治療劑之組合呈現難治性。在一些實施例中，先前化學治療劑為卡鉑、太平洋紫杉醇、培美曲塞及/或順鉑。在一些先前實施例中，化學治療劑為鉑雙重化學治療劑。在一些實施例中，鉑雙重療法包含第一化學治療劑及第二化學治療劑，該第一化學治療劑選自由順鉑及卡鉑組成之群，該第二化學治療劑選自由長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel))組成之群。在一些實施例中，鉑雙重化學治療劑係與培美曲塞組合。

在一些實施例中，NSCLC為PD-L1陰性及/或係來自如本文中別處所述之患有以＜1%之腫瘤比例分數(TPS)表現PD-L1之癌症的患者。

在一些實施例中，NSCLC對包含抗PD-1或抗PD-L1抗體及鉑雙重療法之組合療法呈現難治性，其中該鉑雙重療法包含： i) 選自由順鉑及卡鉑組成之群的第一化學治療劑， ii) 及選自由長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇)組成之群的第二化學治療劑。

在一些實施例中，NSCLC對包含抗PD-1或抗PD-L1抗體、培美曲塞及鉑雙重療法之組合療法呈現難治性，其中該鉑雙重療法包含： i) 選自由順鉑及卡鉑組成之群的第一化學治療劑， ii) 及選自由長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇)組成之群的第二化學治療劑。

在一些實施例中，NSCLC已用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC已用抗PD-L1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過治療。在一些實施例中，NSCLC未曾用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC未曾用抗PD-L1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，NSCLC先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過抗PD-1/PD-L1。在一些實施例中，NSCLC患者具有低表現之PD-L1。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過NSCLC治療，或處於化學治療劑治療後，但未接受過抗PD-1/PD-L1。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過治療，或處於化學治療劑治療後，但未接受過抗PD-1/PD-L1且具有低表現之PD-L1。在一些實施例中，NSCLC患者在基線處具有大型腫瘤。在一些實施例中，個體在基線處具有大型腫瘤且具有低表現之PD-L1。在一些實施例中，NSCLC患者不具有可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過治療，或處於化學治療劑治療後，但未接受過抗PD-1/PD-L1且不具有可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，患者在基線處具有大型腫瘤且不具有可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者未接受過NSCLC治療，或處於化學療法後(例如，化學治療劑後)，但未接受過抗PD-1/PD-L1且具有低表現之PD-L1及/或在基線處具有大包塊疾病。在一些實施例中，當以橫斷面或冠狀面量測之最大腫瘤直徑大於7 cm時，指示大包塊疾病。在一些實施例中，當腫脹淋巴結之短軸直徑為20 mm或更大時，指示大包塊疾病。在一些實施例中，化學治療劑包括NSCLC之標準照護治療劑。

在一些實施例中，藉由腫瘤比例分數確定PD-L1表現。在一些實施例中，患有難治性NSCLC腫瘤之個體具有＜1%腫瘤比例分數(TPS)。在一些實施例中，患有難治性NSCLC腫瘤之個體具有≥1% TPS。在一些實施例中，患有難治性NSCLC之個體先前已用抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療且在該抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。在一些實施例中，患有難治性NSCLC之個體先前已用抗PD-L1抗體治療且在該抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。

在一些實施例中，藉由本發明方法(包括如例如圖1或圖8中所述之彼等方法)製備的TIL相較於藉由其他方法(包括未在圖1或圖8中例示之彼等方法，例如稱為過程1C方法之方法)產生的TIL展現增加之多株性。在一些實施例中，顯著改良之多株性及/或增加之多株性指示癌症治療之治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞譜系多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投與藉由本發明方法產生之TIL之治療功效。在一些實施例中，相較於使用除本文所提供之彼等方法以外的方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之彼等方法以外的其他方法(包括例如除圖1或圖8中所體現之彼等方法以外之方法)製備的TIL治療之患者，多株性增加1000倍。

在一些實施例中，藉由使用如本文所述之一或多種測試方法得到之腫瘤比例分數來確定PD-L1表現。在一些實施例中，患有NSCLC腫瘤之個體或患者具有＜ 1%腫瘤比例分數(TPS)。在一些實施例中，NSCLC腫瘤具有≥ 1% TPS。在一些實施例中，患有NSCLC之個體或患者先前已用抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療且在抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。在一些實施例中，患有NSCLC之個體或患者先前已用抗PD-L1抗體治療且在抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。在一些實施例中，患有難治性或抗性NSCLC腫瘤之個體或患者具有＜ 1%腫瘤比例分數(TPS)。在一些實施例中，患有難治性或抗性NSCLC腫瘤之個體或患者具有≥ 1% TPS。在一些實施例中，患有難治性或抗性NSCLC之個體或患者先前已用抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療且在抗PD-1及/或抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。在一些實施例中，患有難治性或抗性NSCLC之個體或患者先前已用抗PD-L1抗體治療且在抗PD-L1抗體治療之前確定腫瘤比例分數。

在一些實施例中，NSCLC係展現腫瘤比例分數(TPS)或在抗PD-1或抗PD-L1療法之前自患者取得的顯示任何強度之PD-L1蛋白之部分或完全膜染色的活腫瘤細胞之百分率小於1% (TPS＜1%)之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現選自由＜50%、＜45%、＜40%、＜35%、＜30%、＜25%、＜20%、＜15%、＜10%、＜9%、＜8%、＜7%、＜6%、＜5%、＜4%、＜3%、＜2%、＜1%、＜0.9%、＜0.8%、＜0.7%、＜0.6%、＜0.5%、＜0.4%、＜0.3%、＜0.2%、＜0.1%、＜0.09%、＜0.08%、＜0.07%、＜0.06%、＜0.05%、＜0.04%、＜0.03%、＜0.02%及＜0.01%組成之群的TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現選自由約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%及約0.01%組成之群的TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與1%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.9%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.8%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.7%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.6%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.5%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.4%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.3%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.2%之間之TPS之NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現介於0%與0.1%之間之TPS之NSCLC。TPS可藉由此項技術中已知之方法來量測，諸如描述於Hirsch 等人 J. Thorac. Oncol. 2017, 12,208-222中之彼等方法或在派姆單抗或其他抗PD-1或抗PD-L1療法之治療之前用於確定TPS之彼等方法。亦可使用經美國食品藥物管理局批准用於量測TPS之方法。在一些實施例中，PD-L1為胞外體PD-L1。在一些實施例中，PD-L1可見於循環腫瘤細胞上。

在一些實施例中，部分膜染色包括1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。在一些實施例中，完全膜染色包括大約100%膜染色。

在一些實施例中，PD-L1測試可涉及量測患者血清中之PD-L1水準。在此等實施例中，患者血清中之PD-L1的量測去除了腫瘤異質性之不確定性及連續活組織檢查之患者不適。

在一些實施例中，相較於基線或標準水準上升之可溶性PD-L1與NSCLC之較差預後相關。參見例如Okuma 等人, Clinical Lung Cancer, 2018, 19,410-417；Vecchiarelli 等人, Oncotarget, 2018, 9,17554-17563。在一些實施例中，PD-L1為胞外體PD-L1。在一些實施例中，PD-L1在循環腫瘤細胞上表現。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之個體或患者投與腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，其中該個體或患者具有以下至少一者： i.PD-L1之預定腫瘤比例分數(TPS)＜1%， ii.PD-L1之TPS分數為1%-49%，或 iii.預定不存在一或多種驅動突變，其中該驅動突變選自由以下組成之群：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變，且其中該方法包括： (a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接收來自該個體或患者所切除之腫瘤的第一TIL群體； (b) 將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行該第一次擴增持續約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行該第二次擴增持續約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (f) 將來自步驟(e)之所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 使用冷凍保存過程將來自步驟(f)之包含所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存；及 (h) 將來自步驟(g)之輸注袋的治療有效劑量之第三TIL群體投與至該個體或患者。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤之PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例分數(TPS)， (b) 測試患者中一或多種驅動突變之不存在，其中該驅動突變選自由以下組成之群：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變， (c) 確定患者之PD-L1之TPS分數為約1%至約49%且確定患者亦不具有驅動突變， (d) 藉由將獲自個體之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接收來自該個體或患者所切除之腫瘤的第一TIL群體； (e) 將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行該第一次擴增持續約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行該第二次擴增持續約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (i) 將來自步驟(e)之所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (j) 使用冷凍保存過程將來自步驟(f)之包含所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存；及 (k) 將來自步驟(g)之輸注袋的治療有效劑量之第三TIL群體投與至該個體或患者。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤之PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例分數(TPS)， (b) 測試患者中一或多種驅動突變之不存在，其中該驅動突變選自由以下組成之群：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變， (c) 確定患者之PD-L1之TPS分數小於約1%且確定患者亦不具有驅動突變， (d) 藉由將獲自個體之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接收來自該個體或患者所切除之腫瘤的第一TIL群體； (e) 將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行該第一次擴增持續約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行該第二次擴增持續約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (i) 將來自步驟(e)之所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (j) 使用冷凍保存過程將來自步驟(f)之包含所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存；及 (k) 將來自步驟(g)之輸注袋的治療有效劑量之第三TIL群體投與至該個體或患者。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤之PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例分數(TPS)， (b) 測試患者中一或多種驅動突變之不存在，其中該驅動突變選自由以下組成之群：EGFR突變、EGFR插入、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變或RET融合， (c) 確定患者之PD-L1之TPS分數為約1%至約49%且確定患者亦不具有驅動突變， (d) 藉由將獲自個體之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接收來自該個體或患者所切除之腫瘤的第一TIL群體； (e) 將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行該第一次擴增持續約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行該第二次擴增持續約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (i) 將來自步驟(e)之所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (j) 使用冷凍保存過程將來自步驟(f)之包含所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存；及 (k) 將來自步驟(g)之輸注袋的治療有效劑量之第三TIL群體投與至該個體或患者。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤之PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例分數(TPS)， (b) 測試患者中一或多種驅動突變之不存在，其中該驅動突變選自由以下組成之群：EGFR突變、EGFR插入、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變或RET融合， (c) 確定患者之PD-L1之TPS分數小於約1%且確定患者亦不具有驅動突變， (d) 藉由將獲自個體之腫瘤樣品處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接收來自該個體或患者所切除之腫瘤的第一TIL群體； (e) 將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來執行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中執行，其中執行該第一次擴增持續約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 藉由對該第二TIL群體之細胞培養基補充額外IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)來執行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中執行該第二次擴增持續約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (i) 將來自步驟(e)之所收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (j) 使用冷凍保存過程將來自步驟(f)之包含所收集之TIL群體之輸注袋冷凍保存；及 (k) 將來自步驟(g)之輸注袋的治療有效劑量之第三TIL群體投與至該個體或患者。

在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之如本文所述之治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之如本文所述之TIL組合物。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得在分別投與治療有效劑量之本文所述之治療性TIL群體及TIL組合物之前，已向該個體投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量之環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量之氟達拉濱持續五天的步驟。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改以便進一步包括在向該個體投與TIL細胞之後次日開始用高劑量IL-2方案治療該個體的步驟。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注投與600,000或720,000 IU/kg直至耐受為止。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為實體腫瘤。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳突瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸癌。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為黑色素瘤。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為HNSCC。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為子宮頸癌。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為NSCLC。

在其他實施例中，本發明提供該用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。

在其他實施例中，本發明提供用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為胃腸癌。

在其他實施例中，本發明提供用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為高突變癌症。

在其他實施例中，本發明提供用於治療患有本文所述之癌症之個體的方法，該方法經修改，使得該癌症為小兒高突變癌症。

在其他實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體的方法中之本文所述之治療性TIL群體，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之該治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法中之本文所述之TIL組合物，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之該TIL組合物。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或本文所述之TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得在向個體投與治療有效劑量的本文所述之治療性TIL群體或本文所述之TIL組合物之前，已向個體投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量之環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量之氟達拉濱持續五天的步驟。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改以便進一步包括在向患者投與TIL細胞之後次日開始用高劑量IL-2方案治療患者的步驟。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注投與600,000或720,000 IU/kg直至耐受為止。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為實體腫瘤。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳突瘤病毒所造成之癌症、頭頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸癌。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為黑色素瘤。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為HNSCC。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為子宮頸癌。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為NSCLC。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為神經膠質母細胞瘤。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為胃腸癌。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為高突變癌症。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或TIL組合物，該治療性TIL群體或TIL組合物經修改，使得該癌症為小兒高突變癌症。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體在治療個體之癌症的方法中之用途，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之該治療性TIL群體。

在其他實施例中，本發明提供任一先前段落中所述之TIL組合物在治療個體之癌症的方法中之用途，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之該TIL組合物。

在其他實施例中，本發明提供本文所述之治療性TIL群體或本文所述之TIL組合物在治療患者之癌症的方法中之用途，該方法包括向該患者投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案且接著向該個體投與治療有效劑量之任一先前段落中所述之治療性TIL群體或治療有效劑量之本文所述之TIL組合物。 1. 與 PD-1 及 PD-L1 抑制劑組合

在一些實施例中，提供給癌症患者之TIL療法可包括單獨治療性TIL群體治療或可包括組合治療，該組合治療包括TIL及一或多種PD-1及/或PD-L1抑制劑。

程序性死亡1 (PD-1)係由T細胞、B細胞、天然殺手(NK) T細胞、經活化之單核球及樹突狀細胞表現之288個胺基酸之跨膜免疫檢查點受體蛋白。PD-1 (其亦稱為CD279)屬於CD28家族，且在人類中由染色體2上之Pdcd1基因編碼。PD-1由一個免疫球蛋白(Ig)超家族域、跨膜區及含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)及基於免疫受體酪胺酸之轉換基序(ITSM)之細胞內域組成。已知PD-1及其配位體(PD-L1及PD-L2)在免疫耐受性中發揮關鍵作用，如Keir 等人 , Annu. Rev. Immunol. 2008, 26,677-704中所述。PD-1提供負向調節T細胞免疫反應之抑制信號。PD-L1 (亦稱為B7-H1或CD274)及PD-L2 (亦稱為B7-DC或CD273)在腫瘤細胞及基質細胞上表現，該等細胞可遇到表現PD-1之經活化之T細胞，導致該等T細胞之免疫抑制。PD-L1係由人類染色體9上之Cd274基因編碼的290個胺基酸之跨膜蛋白。使用PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑及/或PD-L2抑制劑來阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間之相互作用可克服免疫抗性，如最近的臨床研究所證實，諸如Topalian 等人, N. Eng. J. Med. 2012, 366, 2443-54中所述之研究。PD-L1在許多腫瘤細胞株上表現，而PD-L2大多數在樹突狀細胞及少數腫瘤株上表現表現。除了T細胞(其在活化後誘導性表現PD-1)之外，PD-1亦在B細胞、天然殺手細胞、巨噬細胞、經活化之單核球及樹突狀細胞上表現。

在一些實施例中，TIL及PD-1抑制劑作為組合療法或協同療法經投與以用於治療NSCLC。

在一些實施例中，NSCLC未經歷先前療法。在一些實施例中，PD-1抑制劑作為前線療法或初始療法經投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑作為前線療法或初始療法與如本文所述之TIL組合投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑可為此項技術中已知之任何PD-1抑制劑或PD-1阻斷劑。詳言之，其係以下段落更詳細描述之PD-1抑制劑或阻斷劑之一。參考PD-1抑制劑之術語「抑制劑(inhibitor)」、「拮抗劑(antagonist)」及「阻斷劑(blocker)」在本文中可互換使用。為了避免疑義，本文中提及之作為抗體之PD-1抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變異體、結合物或生物類似物。為了避免疑義，本文中提及之PD-1抑制劑亦可指小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為抗體( 亦即，抗PD-1抗體)、其片段(包括Fab片段)或其單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-1抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑與PD-1競爭結合及/或與PD-1上之抗原決定基結合。在一些實施例中，該抗體與PD-1競爭結合及/或與PD-1上之抗原決定基結合。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係以約100 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約90 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約80 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約70 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約60 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約50 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約40 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約30 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約20 pM或更低之KD與人類PD-1結合、以約10 pM或更低之KD與人類PD-1結合或以約1 pM或更低之KD與人類PD-1結合者。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係以約7.5 × 10 ⁵l/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合、以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合、以約8 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合、以約8.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合、以約9 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合、以約9.5 × 10 ⁵l/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合或以約1 × 10 ⁶1/M·s或更快之k _締合與人類PD-1結合者。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係以約2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.1 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.3 × 10-5 1/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.4 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.5 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.6 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合或以約2.7 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.8 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.9 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合或以約3 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合者。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合、以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合或以約1 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合者。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗(可作為OPDIVO購自Bristol-Myers Squibb Co.)或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變異體。納武單抗係阻斷PD-1受體之全人類IgG4抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為免疫球蛋白G4 κ、抗(人類CD274)抗體。納武單抗經指派化學文摘社(CAS)登記號946414-94-4，且亦稱為5C4、BMS-936558、MDX-1106及ONO-4538。納武單抗之製備及性質描述於美國專利第8,008,449號及國際專利公開案第WO 2006/121168號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中納武單抗在各種形式之癌症中的臨床安全性及功效已描述於Wang 等人, Cancer Immunol. Res. 2014, 2,846-56；Page 等人 , Ann. Rev. Med., 2014, 65,185-202；及Weber 等人, J. Clin. Oncology, 2013, 31,4311-4318中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。納武單抗之胺基酸序列陳述於表18中。納武單抗具有位於22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”及360”-418”處之重鏈內二硫鍵；位於23’-88’、134’-194’、23”’-88”’及134”’-194”’處之輕鏈內二硫鍵；位於127-214’、127”-214”’處之重鏈-輕鏈間二硫鍵、位於219-219”及222-222”處之重鏈-重鏈間二硫鍵；及位於290、290”處之N-糖基化位點(H CH2 84.4)。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含由SEQ ID NO:158給出之重鏈及由SEQ ID NO:159給出之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含納武單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:160所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:161所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:164所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166及SEQ ID NO:167所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與PD-1結合及/或與PD-1上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係藥物主管機關參考納武單抗所批准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為納武單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為納武單抗。表18. 與納武單抗相關之PD-1抑制劑的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:158 納武單抗重鏈
SEQ ID NO:159 納武單抗輕鏈
SEQ ID NO:160 納武單抗可變重鏈
SEQ ID NO:161 納武單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:162 納武單抗重鏈CDR1
SEQ ID NO:163 納武單抗重鏈CDR2
SEQ ID NO:164 納武單抗重鏈CDR3
SEQ ID NO:165 納武單抗輕鏈CDR1
SEQ ID NO:166 納武單抗輕鏈CDR2
SEQ ID NO:167 納武單抗輕鏈CDR3

在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與納武單抗。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療無法切除或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，投與納武單抗以治療無法切除或轉移性黑色素瘤且以每2週約240 mg投與。在一些實施例中，投與納武單抗以治療無法切除或轉移性黑色素瘤且以每4週約480 mg投與。在一些實施例中，投與納武單抗以治療無法切除或轉移性黑色素瘤，且以每3週約1 mg/kg、隨後在同一天3 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每2週240 mg或每4週480 mg投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以用於黑色素瘤之輔助治療。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以用於黑色素瘤之輔助治療。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以用於黑色素瘤之輔助治療。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約3 mg/kg連同每6週約1 mg/kg之伊匹單抗經投與以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約360 mg連同每6週1 mg/kg之伊匹單抗及2個週期之鉑雙重化學療法經投與以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg或每4週480 mg經投與以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，納武單抗係以每3週約360 mg連同每6週1 mg/kg之伊匹單抗經投與以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約3 mg/kg、隨後在同一天約1 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每2週240 mg經投與以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約3 mg/kg、隨後在同一天約1 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每2週240 mg、每4週480 mg經投與以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療經典霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療經典霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療經典霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療復發或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療復發或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療復發或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，投與納武單抗以治療成人或小兒患者之微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療≥40 kg之成人或小兒患者的微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療≥40 kg之成人或小兒患者的微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，納武單抗係以每2週約3 mg/kg投與以治療＜40 kg之小兒患者的微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約3 mg/kg、隨後在同一天1 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每2週240 mg經投與以治療≥40 kg之成人或小兒患者的微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約3 mg/kg、隨後在同一天1 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每4週480 mg經投與以治療≥40 kg之成人或小兒患者的微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療肝細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療肝細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約1 mg/kg、隨後在同一天3 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每2週240 mg經投與以治療肝細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每3週約1 mg/kg、隨後在同一天3 mg/kg之伊匹單抗共4劑，接著每4週480 mg經投與以治療肝細胞癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每2週約240 mg經投與以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗係以每4週約480 mg經投與以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，納武單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，納武單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在其他實施例中，PD-1抑制劑包含派姆單抗(可作為KEYTRUDA獲自Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA)或其抗原結合片段、結合物或變異體。派姆單抗經指派CAS登記號1374853-91-4，且亦稱為來伯裡茲單抗、MK-3475及SCH-900475。派姆單抗具有免疫球蛋白G4、抗(人類蛋白質PDCD1 (程序性細胞死亡1)) (人類-小家鼠單株重鏈)、二硫化物與人類-小家鼠單株輕鏈之二聚體結構。派姆單抗之結構亦可描述為免疫球蛋白G4、抗(人類程序性細胞死亡1)；人類化小鼠單株[228-L-脯胺酸(H10-S＞P)]γ4重鏈(134-218’)-二硫化物與人類化小鼠單株κ輕鏈之二聚體(226-226”:229-229”)-雙二硫化物。派姆單抗之性質、用途及製備描述於國際專利公開案第WO 2008/156712 A1號、美國專利第8,354,509號及美國專利申請公開案第US 2010/0266617 A1號、第US 2013/0108651 A1號及第US 2013/0109843 A2號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。派姆單抗在各種形式之癌症中的臨床安全性及功效已描述於Fuerst, Oncology Times, 2014, 36, 35-36；Robert 等人, Lancet, 2014, 384, 1109-17；及Thomas 等人, Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14, 1061-1064中。派姆單抗之胺基酸序列陳述於表19中。派姆單抗包括以下二硫橋：22-96、22”-96”、23’-92’、23”’-92”’、134-218’、134”-218”’、138’-198’、138”’-198”’、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425及367”-425”，及以下糖基化位點(N)：Asn-297及Asn-297”。派姆單抗為IgG4/κ同型，在Fc區具有穩定性S228P突變；在IgG4鉸鏈區中插入此突變會防止一般在IgG4抗體中觀察到的半分子之形成。派姆單抗在各重鏈之Fc域內的Asn297處經異質性糖基化，從而產生完整抗體之大約149 kDa分子量。派姆單抗之優勢糖形式係岩藻糖基化之無半乳糖雙觸角聚醣形式(G0F)。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含由SEQ ID NO:168給出之重鏈及由SEQ ID NO:169給出之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含派姆單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:170所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:171所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，PD-1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173及SEQ ID NO:174所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176及SEQ ID NO:177所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與PD-1結合及/或與PD-1上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，PD-1抑制劑係藥物主管機關參考派姆單抗所批准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為派姆單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為派姆單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為派姆單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為派姆單抗。表19. 與派姆單抗相關之PD-1抑制劑的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:168 派姆單抗重鏈
SEQ ID NO:169 派姆單抗輕鏈
SEQ ID NO:170 派姆單抗可變重鏈
SEQ ID NO:171 派姆單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:172 派姆單抗重鏈CDR1
SEQ ID NO:173 派姆單抗重鏈CDR2
SEQ ID NO:174 派姆單抗重鏈CDR3
SEQ ID NO:175 派姆單抗輕鏈CDR1
SEQ ID NO:176 派姆單抗輕鏈CDR2
SEQ ID NO:177 派姆單抗輕鏈CDR3

在一些實施例中，PD-1抑制劑為派姆單抗或其生物類似物，且派姆單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為派姆單抗或其生物類似物，且派姆單抗係以約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為派姆單抗或其生物類似物，其中派姆單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為派姆單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為派姆單抗或其生物類似物，其中每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與派姆單抗。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與派姆單抗以治療黑色素瘤。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療黑色素瘤。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療黑色素瘤。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與派姆單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療NSCLC。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療NSCLC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與派姆單抗以治療小細胞肺癌(SCLC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療SCLC。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療SCLC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，投與派姆單抗以治療頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療HNSCC。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療HNSCC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱膈大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療成人之經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱膈大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約2 mg/kg (至多200 mg)經投與以治療小兒之經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱膈大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)癌症。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療成人之MSI-H或dMMR癌症。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約2 mg/kg (至多200 mg)經投與以治療小兒之MSI-H或dMMR癌症。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷結腸直腸癌(dMMR CRC。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療MSI-H或dMMR CRC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療胃癌。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療胃癌。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療食道癌。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療食道癌。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療子宮頸癌。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療子宮頸癌。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療肝細胞癌(HCC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療HCC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療成人之梅克爾細胞癌(MCC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療成人之MCC。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約2 mg/kg (至多200 mg)經投與以治療小兒之MCC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療腎細胞癌(RCC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg連同每天兩次口服5 mg阿西替尼(axitinib)經投與以治療RCC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療子宮內膜癌。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg連同每天一次口服20 mg樂伐替尼(lenvatinib)經投與以治療並非MSI-H或dMMR之腫瘤子宮內膜癌。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療成人之高腫瘤突變負荷(TMB-H)癌症。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療成人之TMB-H癌症。在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約2 mg/kg (至多200 mg)經投與以治療小兒之TMB-H癌症。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療cSCC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，派姆單抗係以每3週約200 mg經投與以治療三陰性乳癌(TNBC)。在一些實施例中，派姆單抗係以每6週約400 mg經投與以治療TNBC。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，若患者或個體為成人( 亦即，治療成人適應症)，則可採用每6週400 mg之額外投藥方案。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始。在一些實施例中，派姆單抗投與係在IL-2投與後1、2或3天開始。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週投與。在一些實施例中，派姆單抗亦可在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週投與。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為市售抗PD-1單株抗體，諸如抗m-PD-1純系J43 (目錄號BE0033-2)及RMP1-14 (目錄號BE0146) (Bio X Cell, Inc., West Lebanon, NH, USA)。一些市售抗PD-1抗體係一般技術者已知的。

在一些實施例中，PD-1抑制劑為美國專利第8,354,509號或美國專利申請公開案第2010/0266617 A1號、第2013/0108651 A1號、第2013/0109843 A2號中所揭示之抗體，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為美國專利第8,287,856號、第8,580,247號及第8,168,757號以及美國專利申請公開案第2009/0028857 A1號、第2010/0285013 A1號、第2013/0022600 A1號及第2011/0008369 A1號中所述之抗PD-1抗體，各案之教示由此以引用之方式併入。在其他實施例中，PD-1抑制劑為美國專利第8,735,553 B1號中所揭示之抗PD-1抗體，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為匹利珠單抗(亦稱為CT-011)，其描述於美國專利第8,686,119號中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，PD-1抑制劑可為小分子或肽或肽衍生物(諸如美國專利第8,907,053號；第9,096,642號；及第9,044,442號以及美國專利申請公開案第US 2015/0087581號中所述之彼等)；1,2,4-噁二唑化合物及衍生物(諸如美國專利申請公開案第2015/0073024號中所述之彼等)；環狀擬肽化合物及衍生物(諸如美國專利申請公開案第US 2015/0073042號中所述之彼等)；環狀化合物及衍生物(諸如美國專利申請公開案第US 2015/0125491號中所述之彼等)；1,3,4-噁二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物(諸如國際專利申請公開案第WO 2015/033301號中所述之彼等)；基於肽之化合物及衍生物(諸如國際專利申請公開案第WO 2015/036927號及第WO 2015/04490號中所述之彼等)或基於巨環肽之化合物及衍生物(諸如美國專利申請公開案第US 2014/0294898號中所述之彼等)；其中各案之揭示內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，PD-1抑制劑為西米普利單抗(cemiplimab)，其可購自Regeneron, Inc。

在一些實施例中，TIL及PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑作為組合療法或協同療法經投與以用於治療NSCLC。

在一些實施例中，NSCLC未經歷先前療法。在一些實施例中，PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑作為前線療法或初始療法經投與。在一些實施例中，PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑作為前線療法或初始療法與如本文所述之TIL組合投與。

在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑可為此項技術中已知之任何PD-L1或PD-L2抑制劑、抗拮劑或阻斷劑。詳言之，其係以下段落更詳細描述之PD-L1或PD-L2抑制劑、拮抗劑或阻斷劑之一。參考PD-L1及PD-L2抑制劑之術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑義，本文中提及之作為抗體之PD-L1或PD-L2抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變異體、結合物或生物類似物。為了避免疑義，本文中提及之PD-L1或PD-L2抑制劑可指化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。

在一些實施例中，本文所述之組合物、過程及方法包括PD-L1或PD-L2抑制劑。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為小分子。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為抗體( 亦即，抗PD-1抗體)、其片段(包括Fab片段)或其單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑競爭與PD-L1或PD-L2結合，及/或與PD-L1或PD-L2上之抗原決定基結合。在一些實施例中，該抗體競爭與PD-L1或PD-L2結合，及/或與PD-L1或PD-L2上之抗原決定基結合。

在一些實施例中，本文所提供之PD-L1抑制劑對PD-L1具選擇性，即該等化合物以實質上低於其與其他受體(包括PD-L2受體)結合或相互作用之濃度與PD-L1結合或相互作用。在某些實施例中，該等化合物與PD-L1受體結合之結合常數係與PD-L2受體結合之至少約2倍高濃度、約3倍高濃度、約5倍高濃度、約10倍高濃度、約20倍高濃度、約30倍高濃度、約50倍高濃度、約100倍高濃度、約200倍高濃度、約300倍高濃度或約500倍高濃度。

在一些實施例中，本文所提供之PD-L2抑制劑對PD-L2具選擇性，即該等化合物以實質上低於其與其他受體(包括PD-L1受體)結合或相互作用之濃度與PD-L2結合或相互作用。在某些實施例中，該等化合物與PD-L2受體結合之結合常數係與PD-L1受體結合之至少約2倍高濃度、約3倍高濃度、約5倍高濃度、約10倍高濃度、約20倍高濃度、約30倍高濃度、約50倍高濃度、約100倍高濃度、約200倍高濃度、約300倍高濃度或約500倍高濃度。

不受任何理論束縛，據信腫瘤細胞表現PD-L1，且T細胞表現PD-1。然而，腫瘤細胞之PD-L1表現並非PD-1或PD-L1抑制劑或阻斷劑之功效所需。在一些實施例中，腫瘤細胞表現PD-L1。在其他實施例中，腫瘤細胞不表現PD-L1。在一些實施例中，該等方法可包括PD-1及PD-L1抗體之組合(諸如本文所述之彼等)，與TIL組合。PD-1及PD-L1抗體及TIL之組合可同時或依序投與。

在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑係以約100 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約90 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約80 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約70 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約60 pM或更低之KD、以約50 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約40 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合或以約30 pM或更低之KD與人類PD-L1及/或PD-L2結合者。

在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑係以約7.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約8 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約8.5 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約9 × 10 ⁵1/M·s或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合、以約9.5 × 10 ⁵1/M·s及/或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合或以約1 × 10 ⁶1/M·s或更快之k _締合與人類PD-L1及/或PD-L2結合者。

在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑係以約2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-L1或PD-L2結合、以約2.1 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.2 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.3 × 10 ^-51/s或更慢之k解離與人類PD-1結合、以約2.4 × 10-5 1/s或更慢之k解離與人類PD-1結合、以約2.5 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.6 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-1結合、以約2.7 × 10 ^-51/s或更慢之k _解離與人類PD-L1或PD-L2結合或以約3 × 10 ^-51/s或更慢之k解離與人類PD-L1或PD-L2結合者。

在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑係以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合；或以約1 nM或更低之IC50阻斷人類PD-1或阻斷人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1結合者。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑為德瓦魯單抗(亦稱為MEDI4736，其可購自AstraZeneca plc.之子公司Medimmune, LLC, Gaithersburg, Maryland)或其抗原結合片段、結合物或變異體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑係美國專利第8,779,108號或美國專利申請公開案第2013/0034559號中所揭示之抗體，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之臨床功效已描述於Page等人, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202；Brahmer等人, J. Clin. Oncol. 2014, 32, 5s (增刊, 摘要8021)；及McDermott等人, Cancer Treatment Rev., 2014, 40, 1056-64中。德瓦魯單抗之製備及性質描述於美國專利第8,779,108號中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之胺基酸序列陳述於表20中。德瓦魯單抗單株抗體包括位於22-96、22”-96”、23’-89’、23”’-89”’、135’-195’、135”’-195”’、148-204、148”-204”、215’-224、215”’-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429及371”-429’處之二硫鍵；及位於Asn-301及Asn-301”處之N-糖基化位點。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含由SEQ ID NO:178給出之重鏈及由SEQ ID NO:179給出之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含德瓦魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:180所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:181所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186及SEQ ID NO:187所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與PD-L1結合及/或與PD-L1上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑係藥物主管機關參考德瓦魯單抗所批准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為德瓦魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為德瓦魯單抗。表20. 與德瓦魯單抗相關之PD-L1抑制劑的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:178 德瓦魯單抗重鏈
SEQ ID NO:179 德瓦魯單抗輕鏈
SEQ ID NO:180 德瓦魯單抗可變重鏈
SEQ ID NO:181 德瓦魯單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:182 德瓦魯單抗重鏈 CDR1
SEQ ID NO:183 德瓦魯單抗重鏈 CDR2
SEQ ID NO:184 德瓦魯單抗重鏈 CDR3
SEQ ID NO:185 德瓦魯單抗輕鏈 CDR1
SEQ ID NO:186 德瓦魯單抗輕鏈 CDR2
SEQ ID NO:187 德瓦魯單抗輕鏈 CDR3

在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿維魯單抗(亦稱為MSB0010718C，可購自Merck KGaA/EMD Serono)，或其抗原結合片段、結合物或變異體。阿維魯單抗之製備及性質描述於美國專利申請公開案第US 2014/0341917 A1號中，該案之揭示內容特定地以引用之方式併入本文中。阿維魯單抗之胺基酸序列陳述於表21中。阿維魯單抗具有位於22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”及370”-428”處之重鏈內二硫鍵(C23-C104)；位於22’-90’、138’-197’、22”’-90”’及138”’-197”’處之輕鏈內二硫鍵(C23-C104)；位於223-215’及223”-215”’處之重鏈-輕鏈內二硫鍵(h 5-CL 126)；位於229-229”及232-232”處之重鏈-重鏈內二硫鍵(h 11, h 14)；位於300、300”處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；及位於450及450’處之H CHS K2 C端離胺酸剪切。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含由SEQ ID NO:188給出之重鏈及由SEQ ID NO:189給出之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含阿維魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO:190所示之序列且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO:191所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193及SEQ ID NO:194所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196及SEQ ID NO:197所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與PD-L1結合及/或與PD-L1上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑係藥物主管機關參考阿維魯單抗所批准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿維魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿維魯單抗。表21. 與阿維魯單抗相關之PD-L1抑制劑之胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:188 阿維魯單抗重鏈
SEQ ID NO:189 阿維魯單抗輕鏈
SEQ ID NO:190 阿維魯單抗可變重鏈
SEQ ID NO:191 阿維魯單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:192 阿維魯單抗重鏈 CDR1
SEQ ID NO:193 阿維魯單抗重鏈 CDR2
SEQ ID NO:194 阿維魯單抗重鏈 CDR3
SEQ ID NO:195 阿維魯單抗輕鏈 CDR1
SEQ ID NO:196 阿維魯單抗輕鏈 CDR2
SEQ ID NO:197 阿維魯單抗輕鏈 CDR3

在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗(亦稱為MPDL3280A或RG7446，可作為TECENTRIQ購自Roche Holding AG之子公司Genentech, Inc., Basel, Switzerland)，或其抗原結合片段、結合物或變異體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑係美國專利第8,217,149號中所揭示之抗體，該案之揭示內容特定地以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-L1抑制劑係美國專利申請公開案第2010/0203056 A1號、第2013/0045200 A1號、第2013/0045201 A1號、第2013/0045202 A1號或第2014/0065135 A1號中所揭示之抗體，各案之揭示內容特定地以引用之方式併入本文中。阿特珠單抗之製備及性質描述於美國專利第8,217,149號中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。阿特珠單抗之胺基酸序列陳述於表22中。阿特珠單抗具有位於22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”及368”-426”處之重鏈內二硫鍵(C23-C104)；位於23’-88’、134’-194’、23”’-88”’及134”’-194”’處之輕鏈內二硫鍵(C23-C104)；位於221-214’及221”-214”’處之重鏈-輕鏈內二硫鍵(h 5-CL 126)；位於227-227”及230-230”處之重鏈-重鏈內二硫鍵(h 11, h 14)；及位於298及298’處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4＞A)。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含由SEQ ID NO:198給出之重鏈及由SEQ ID NO:199給出之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含阿特珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:200所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:201所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203及SEQ ID NO:204所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206及SEQ ID NO:207所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與PD-L1結合及/或與PD-L1上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，抗PD-L1抗體係藥物主管機關參考阿特珠單抗所批准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿特珠單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿特珠單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿特珠單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為阿特珠單抗。表22. 與阿特珠單抗相關之PD-L1抑制劑的胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:198 阿特珠單抗重鏈
SEQ ID NO:199 阿特珠單抗輕鏈
SEQ ID NO:200 阿特珠單抗可變重鏈
SEQ ID NO:201 阿特珠單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:202 阿特珠單抗重鏈 CDR1
SEQ ID NO:203 阿特珠單抗重鏈 CDR2
SEQ ID NO:204 阿特珠單抗重鏈 CDR3
SEQ ID NO:205 阿特珠單抗輕鏈 CDR1
SEQ ID NO:206 阿特珠單抗輕鏈 CDR2
SEQ ID NO:207 阿特珠單抗輕鏈 CDR3

在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括美國專利申請公開案第US 2014/0341917 A1號中所述之彼等抗體，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，亦包括與任何此等抗體競爭與PD-L1結合之抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MDX-1105 (亦稱為BMS-935559)，其揭示於美國專利第US 7,943,743號中，該案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗PD-L1抗體選自美國專利第US 7,943,743號中所揭示之抗PD-L1抗體，該案以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，PD-L1抑制劑為市售單株抗體，諸如INVIVOMAB抗m-PD-L1純系10F.9G2 (目錄號BE0101，Bio X Cell, Inc., West Lebanon, NH, USA)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為市售單株抗體，諸如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1)。一些市售抗PD-L1抗體係一般技術者已知的。

在一些實施例中，PD-L2抑制劑為市售單株抗體，諸如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2a κ同型(目錄號329602 Biolegend, Inc., San Diego, CA)、SIGMA抗PD-L2抗體(目錄號SAB3500395，Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)或一般技術者已知之其他市售抗PD-L2抗體。 2. 與 CTLA-4 抑制劑之組合

在一些實施例中，提供給癌症患者之TIL療法可包括單獨治療性TIL群體治療或可包括組合治療，該組合治療包括TIL及一或多種CTLA-4抑制劑。

細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA-4)係免疫球蛋白超家族之成員且在輔助T細胞之表面上表現。CTLA-4係CD28依賴性T細胞活化之負調節因子且充當適應性免疫反應之檢查點。與T細胞共刺激蛋白CD28類似，CTLA-4結合抗原在細胞上呈現CD80及CD86。CTLA-4向T細胞遞送抑制因子信號，而CD28遞送刺激信號。針對人類CTLA-4之人類抗體已經描述為在許多疾病狀況中之免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒及細菌感染及用於治療癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。一些全人類抗人類CTLA-4單株抗體(mAb)已在用於治療各種類型之實體腫瘤之臨床試驗中進行研究，包括但不限於伊匹單抗(MDX-010)及曲美木單抗(CP-675,206)。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑可為此項技術中已知之任何CTLA-4抑制劑或CTLA-4阻斷劑。詳言之，其係以下段落更詳細描述之CTLA-4抑制劑或阻斷劑之一。參考CTLA-4抑制劑之術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑義，本文中提及之作為抗體之CTLA-4抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變異體、結合物或生物類似物。為了避免疑義，本文中提及之CTLA-4抑制劑亦可指小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。

用於本發明方法中之合適CTLA-4抑制劑包括但不限於抗CTLA-4抗體、人類抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人類化抗CTLA-4抗體、單株抗CTLA-4抗體、多株抗CTLA-4抗體、嵌合抗CTLA-4抗體、MDX-010 (伊匹單抗)、曲美木單抗、抗CD28抗體、抗CTLA-4纖連蛋白、抗CTLA-4域抗體、單鏈抗CTLA-4片段、重鏈抗CTLA-4片段、輕鏈抗CTLA-4片段、激活共刺激路徑之CTLA-4抑制劑、PCT公開案第WO 2001/014424號中所揭示之抗體、PCT公開案第WO 2004/035607號中所揭示之抗體、美國公開案第2005/0201994號中所揭示之抗體及授權歐洲專利第EP 1212422 B1號中所揭示之抗體，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。額外CTLA-4抗體描述於美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/37504號；及美國公開案第2002/0039581號及第2002/086014號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。可用於本發明方法中之其他抗CTLA-4抗體包括例如以下文獻中所揭示之彼等：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998)；Camacho等人, J. Clin. Oncology, 22(145): 摘要編號2505 (2004) (抗體CP-675206)；Mokyr等人, Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)，及美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

額外CTLA-4抑制劑包括但不限於以下：能夠破壞CD28抗原與其同源配位體結合之能力、抑制CTLA-4與其同源配位體結合之能力、經由共刺激路徑放大T細胞反應、破壞B7與CD28及/或CTLA-4結合之能力、破壞B7活化共刺激路徑之能力、破壞CD80與CD28及/或CTLA-4結合之能力、破壞CD80活化共刺激路徑之能力、破壞CD86與CD28及/或CTLA-4結合之能力、破壞CD86活化共刺激路徑之能力以及破壞共刺激路徑一般以免經活化的任何抑制劑。這必然包括CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的小分子抑制劑；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的抗體；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的反義分子；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的纖連蛋白；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的RNAi抑制劑(單股及雙股)，以及其他CTLA-4抑制劑。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑以約10 ⁻⁶M或更低、10 ⁻⁷M或更低、10 ⁻⁸M或更低、10 ⁻⁹M或更低、10 ⁻¹⁰M或更低、10 ⁻¹¹M或更低、10 ⁻¹²M或更低(例如介於10 ⁻¹³M與10 ⁻¹⁶M之間)或具有前述值中之任兩者作為終點的任何範圍內之K _d與CTLA-4結合。在一些實施例中，當使用相同分析進行比較時，CTLA-4抑制劑以不超過伊匹單抗10倍之Kd與CTLA-4結合。在一些實施例中，當使用相同分析進行比較時，CTLA-4抑制劑以約相同或小於伊匹單抗( 例如，低至多10倍或低至多100倍)之Kd與CTLA-4結合。在一些實施例中，當使用相同分析進行比較時，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值分別高於伊匹單抗介導之對CTLA-4與CD80或CD86之結合的抑制不超過10倍。在一些實施例中，當使用相同分析進行比較時，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值分別約相同或小於( 例如，低至多10倍或低至多100倍)伊匹單抗介導之對CTLA-4與CD80或CD86之結合的抑制。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑之用量足以抑制CTLA-4之表現及/或降低CTLA-4之生物活性，相對於合適對照達至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如介於50%與75%、75%與90%或90%與100%之間。在一些實施例中，CTLA-4路徑抑制劑之用量足以藉由減少CTLA-4與CD80、CD86或兩者之結合來降低CTLA-4之生物活性，相對於合適對照達至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如相對於合適對照介於50%與75%、75%與90%或90%與100%之間。在評估或定量相關劑之效應的上下文中之合適對照一般係可相當之生物系統( 例如，細胞或個體)，該可相當之生物系統尚未暴露於或以相關劑( 例如，CTLA-4路徑抑制劑)處理(或已暴露於或以可忽略之量處理)。在一些實施例中，生物系統可充當其自身之對照( 例如，可在暴露於或以該劑處理之前評估該生物系統，且與在暴露或處理已開始或結束之後的狀態進行比較。在一些實施例中，可使用歷史對照。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗(可作為Yervoy購自Bristol-Myers Squibb Co.)，或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變異體。如此項技術中已知，伊匹單抗係指抗CTLA-4抗體，其係源自具有編碼重鏈及輕鏈之人類基因以生成功能性人類譜系的轉殖基因小鼠之全人類IgG 1κ抗體。伊匹單抗亦可以其CAS登記號477202-00-9指稱，且在PCT公開案第WO 01/14424號中提及，該案出於所有目的以引用之方式整體併入本文中。其經揭示為抗體10DI。詳言之，伊匹單抗含有輕鏈可變區及重鏈可變區(具有包含SEQ ID NO:211之輕鏈可變區且具有包含SEQ ID NO:210之重鏈可變區)。伊匹單抗之醫藥組合物包括含有伊匹單抗及一或多種稀釋劑、媒劑或賦形劑的所有醫藥學上可接受之組合物。含有伊匹單抗之醫藥組合物之實例描述於國際專利申請公開案第WO 2007/67959號中。伊匹單抗可經靜脈內(IV)投與。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含由SEQ ID NO:208給出之重鏈及由SEQ ID NO:209給出之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:210所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:211所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213及SEQ ID NO:214所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216及SEQ ID NO:217所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與CTLA-4結合及/或與CTLA-4上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係藥物主管機關參考伊匹單抗所批准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如，97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為伊匹單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。伊匹單抗之胺基酸序列陳述於表23中。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為伊匹單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為伊匹單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為伊匹單抗。表23. 伊匹單抗之胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:208 伊匹單抗重鏈
SEQ ID NO:209 伊匹單抗輕鏈
SEQ ID NO:210 伊匹單抗可變重鏈
SEQ ID NO:211 伊匹單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:212 伊匹單抗重鏈CDR1
SEQ ID NO:213 伊匹單抗重鏈CDR2
SEQ ID NO:214 伊匹單抗重鏈CDR3
SEQ ID NO:215 伊匹單抗輕鏈CDR1
SEQ ID NO:216 伊匹單抗輕鏈CDR2
SEQ ID NO:217 伊匹單抗輕鏈CDR3

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或其生物類似物，且伊匹單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或其生物類似物，且伊匹單抗係以約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或其生物類似物，且伊匹單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或其生物類似物，且伊匹單抗係以約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與伊匹單抗。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療無法切除或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，伊匹單抗係以每3週約mg/kg最多4劑投與以治療無法切除或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以用於黑色素瘤之輔助治療。在一些實施例中，伊匹單抗係以每3週約10 mg/kg共4劑、隨後每12週10 mg/kg持續至多3年經投與以用於黑色素瘤之輔助治療。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，伊匹單抗係在同一天在3 mg/kg納武單抗之後立即以約1 mg/kg經投與，每3週共4劑，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，在完成4劑之該組合之後，可根據晚期腎細胞癌及/或腎細胞癌之標準給藥方案投與作為單一劑之納武單抗。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，伊匹單抗係在同一天在3 mg/kg納武單抗靜脈內30分鐘之後立即以約1 mg/kg靜脈內30分鐘經投與，每3週共4劑，以治療微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在完成4劑之該組合之後，如根據微衛星高不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌之標準給藥方案所建議，投與作為單一劑之納武單抗。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，伊匹單抗係在同一天在1 mg/kg納武單抗靜脈內30分鐘之後立即以約3 mg/kg靜脈內30分鐘經投與，每3週共4劑，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，在完成4劑之該組合之後，根據肝細胞癌之標準給藥方案，投與作為單一劑之納武單抗。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，伊匹單抗係以每6週約1 mg/kg連同每2週3 mg/kg納武單抗經投與以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，伊匹單抗係以每6週約1 mg/kg連同每3週360 mg納武單抗及2個週期之鉑雙重化學療法經投與以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，投與伊匹單抗以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，伊匹單抗係以每6週約1 mg/kg連同每3週360 mg納武單抗經投與以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，伊匹單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

曲美木單抗(亦稱為CP-675,206)為全人類IgG2單株抗體且具有CAS編號745013-59-6。美國專利第6,682,736號(以引用之方式併入本文中)揭示曲美木單抗為抗體11.2.1。曲美木單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別陳述於SEQ ID NO:218及219中。曲美木單抗已在用於治療包括黑色素瘤及乳癌在內之各種腫瘤的臨床試驗中進行研究；其中曲美木單抗係每4或12週以0.01及15 mg/kg之劑量範圍作為單一劑量或多個劑量經靜脈內投與。在由本發明提供之方案中，曲美木單抗係局部、尤其皮內或皮下投與。皮內或皮下投與之曲美木單抗之有效量一般在每人5 - 200 mg/劑量之範圍內。在一些實施例中，曲美木單抗之有效量係在每人每劑量10 -150 mg/劑量之範圍內。在一些特定實施例中，曲美木單抗之有效量為每人約10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200 mg/劑量。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含由SEQ ID NO:218給出之重鏈及由SEQ ID NO:219給出之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含曲美木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:220所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:221所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223及SEQ ID NO:224所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226及SEQ ID NO:227所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與CTLA-4結合及/或與CTLA-4上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係藥物主管機關參考曲美木單抗所批准之抗CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如，97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為曲美木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。曲美木單抗之胺基酸序列陳述於表24中。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為曲美木單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為曲美木單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為曲美木單抗。表24. 曲美木單抗之胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:218 曲美木單抗重鏈
SEQ ID NO:219 曲美木單抗輕鏈
SEQ ID NO:220 曲美木單抗可變重鏈
SEQ ID NO:221 曲美木單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:222 曲美木單抗重鏈CDR1
SEQ ID NO:223 曲美木單抗重鏈CDR2
SEQ ID NO:224 曲美木單抗重鏈CDR3
SEQ ID NO:225 曲美木單抗輕鏈CDR1
SEQ ID NO:226 曲美木單抗輕鏈CDR2
SEQ ID NO:227 曲美木單抗輕鏈CDR3

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美木單抗或其生物類似物，且曲美木單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美木單抗或其生物類似物，且曲美木單抗係以約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美木單抗或其生物類似物，且曲美木單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美木單抗或其生物類似物，且曲美木單抗係以約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美木單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與曲美木單抗。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2、3、4或5週開始。在一些實施例中，曲美木單抗投與係在切除前( 亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣品之前) 1、2或3週開始。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為來自Agenus之澤弗利單抗，或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變異體。澤弗利單抗為全人類單株抗體。澤弗利單抗經指派化學文摘社(CAS)登記號2148321-69-9，且亦稱為亦稱為AGEN1884。澤弗利單抗之製備及性質描述於美國專利第10,144,779號及美國專利申請公開案第US2020/0024350 A1號中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含由SEQ ID NO:228給出之重鏈及由SEQ ID NO:229給出之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變異體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229所示之序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含澤弗利單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V _H)包含SEQ ID NO:230所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V _L)包含SEQ ID NO:231所示之序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231所示之序列具有至少99%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231所示之序列具有至少98%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231所示之序列具有至少97%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231所示之序列具有至少96%一致性之V _H及V _L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231所示之序列具有至少95%一致性之V _H及V _L區。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含分別具有SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233及SEQ ID NO:234所示之序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代，及分別具有SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236及SEQ ID NO:237所示之序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體與任何前述抗體競爭與CTLA-4結合及/或與CTLA-4上之相同抗原決定基結合。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係藥物主管機關參考澤弗利單抗所批准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，該生物類似物包含抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包含與參考醫藥產品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性( 例如，97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考醫藥產品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下一或多者：糖基化、氧化、去醯胺及截短。澤弗利單抗之胺基酸序列陳述於表25中。在一些實施例中，該生物類似物係獲得授權或提交授權書之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體在與參考醫藥產品或參考生物產品之調配物不同的調配物中提供，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為澤弗利單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物主管機關(諸如美國FDA及/或歐盟之EMA)授權。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，該生物類似物作為進一步包含一或多種賦形劑之組合物提供，其中該一或多種賦形劑與參考醫藥產品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考醫藥產品或參考生物產品為澤弗利單抗。表25. 澤弗利單抗之胺基酸序列。

標識符	序列 ( 單字母胺基酸符號 )
SEQ ID NO:228 澤弗利單抗重鏈
SEQ ID NO:229 澤弗利單抗輕鏈
SEQ ID NO:230 澤弗利單抗可變重鏈
SEQ ID NO:231 澤弗利單抗可變輕鏈
SEQ ID NO:232 澤弗利單抗重鏈CDR1
SEQ ID NO:233 澤弗利單抗重鏈CDR2
SEQ ID NO:234 澤弗利單抗重鏈CDR3
SEQ ID NO:235 澤弗利單抗輕鏈CDR1
SEQ ID NO:236 澤弗利單抗輕鏈CDR2
SEQ ID NO:237 澤弗利單抗輕鏈CDR3

額外抗CTLA-4抗體之實例包括但不限於：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659及ADG116，其係一般技術者已知的。

在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係以下專利公開案中任一者所揭示之抗CTLA-4抗體：US 2019/0048096 A1；US 2020/0223907；US 2019/0201334；US 2019/0201334；US 2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO 2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；及WO1997020574，其中每一者以引用之方式併入本文中。額外CTLA-4抗體描述於美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/37504號；及美國公開案第2002/0039581號及第2002/086014號；及/或美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號中，其中每一者以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係例如以下文獻中所揭示之彼等：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95,10067-10071 (1998)；Camacho 等人, J. Clin. Oncol., 2004,22, 145 (摘要編號2505 (2004) (抗體CP-675206)；或Mokyr 等人, Cancer Res., 1998,58, 5301-5304 (1998)，其中每一者以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係如WO 1996/040915 (以引用之方式併入本文中)中所揭示之CTLA-4配位體。

在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為CTLA-4表現之核酸抑制劑。例如，抗CTLA-4 RNAi分子可採用PCT公開案第WO 1999/032619號及第WO 2001/029058號；美國公開案第2003/0051263號、第2003/0055020號、第2003/0056235號、第2004/265839號、第2005/0100913號、第2006/0024798號、第2008/0050342號、第2008/0081373號、第2008/0248576號及第2008/055443號；及/或美國專利第6,506,559號、第7,282,564號、第7,538,095號及第7,560,438號(以引用之方式併入本文中)中所述之分子的形式。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子採用歐洲專利第EP 1309726號(以引用之方式併入本文中)中所述之雙股RNAi分子的形式。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子採用美國專利第7,056,704號及第7,078,196號(以引用之方式併入本文中)中所述之雙股RNAi分子的形式。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係國際專利申請公開案第WO 2004/081021號(以引用之方式併入本文中)中所述之適體。

在其他實施例中，本發明之抗CTLA-4 RNAi分子係美國專利第5,898,031號、第6,107,094號、第7,432,249號及第7,432,250號以及歐洲申請案第EP 0928290號(以引用之方式併入本文中)中所述之RNA分子。 3. 患者之淋巴細胞耗盡預處理

在一些實施例中，本發明包括一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之TIL之前經非骨髓清除性化學療法預處理。在一些實施例中，本發明包括用於治療已經非骨髓清除性化學療法預處理之患者的癌症之TIL群體。在一些實施例中，TIL群體係用於藉由輸注投與。在一些實施例中，非骨髓清除性化學療法係環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注之前第27天及第26天)及氟達拉濱25 mg/m ²/d持續5天(在TIL輸注之前第27天至第23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非骨髓清除性化學療法及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接收720,000 IU/kg靜脈內IL-2 (阿地白介素，可作為PROLEUKIN購得)之靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施例中，TIL群體係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL群體之後投與。

實驗發現指示，在腫瘤特異性T淋巴細胞之過繼性轉移之前之淋巴細胞耗盡藉由消除調節T細胞及免疫系統之競爭元件(『細胞介素匯』)而發揮增強治療功效之關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。

一般而言，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式係稱為馬磷醯胺)及其組合之投與來達成淋巴細胞耗盡。此類方法描述於Gassner 等人, Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60,75-85，Muranski 等人, Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3,668-681，Dudley 等人, J. Clin. Oncol. 2008, 26,5233-5239，及Dudley 等人, J. Clin. Oncol. 2005, 23,2346-2357中，所有文獻皆以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，以0.5 μg/mL至10 μg/mL之氟達拉濱之濃度投與氟達拉濱。在一些實施例中，以1 μg/mL之氟達拉濱之濃度投與氟達拉濱。在一些實施例中，投與氟達拉濱治療持續1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投與氟達拉濱。在一些實施例中，以35 mg/kg/天投與氟達拉濱治療持續2-7天。在一些實施例中，以35 mg/kg/天投與氟達拉濱治療持續4-5天。在一些實施例中，以25 mg/kg/天投與氟達拉濱治療持續4-5天。

在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度之馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度之馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，投與環磷醯胺治療持續1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，以100 mg/m ²/天、150 mg/m ²/天、175 mg/m ²/天、200 mg/m ²/天、225 mg/m ²/天、250 mg/m ²/天、275 mg/m ²/天或300 mg/m ²/天之劑量投與環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺係經靜脈內投與( 亦即，i.v.)。在一些實施例中，以35 mg/kg/天投與環磷醯胺治療持續2-7天。在一些實施例中，以250 mg/m ²/天i.v.投與環磷醯胺治療持續4-5天。在一些實施例中，以250 mg/m ²/天i.v.投與環磷醯胺治療持續4天。

在一些實施例中，藉由將氟達拉濱及環磷醯胺一起投與至患者來執行淋巴細胞耗盡。在一些實施例中，以25 mg/m ²/天i.v.投與氟達拉濱且以250 mg/m ²/天i.v.投與環磷醯胺歷經4天。

在一些實施例中，藉由投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡。

在一些實施例中，藉由投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天且投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡，其中環磷醯胺及氟達拉濱均在前兩天經投與，且其中執行淋巴細胞耗盡持續總計五天。

在一些實施例中，藉由投與約50 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天且投與約25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡，其中環磷醯胺及氟達拉濱均在前兩天經投與，且其中執行淋巴細胞耗盡持續總計五天。

在一些實施例中，藉由投與約50 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天且投與約20 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡，其中環磷醯胺及氟達拉濱均在前兩天經投與，且其中執行淋巴細胞耗盡持續總計五天。

在一些實施例中，藉由投與約40 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天且投與約20 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡，其中環磷醯胺及氟達拉濱均在前兩天經投與，且其中執行淋巴細胞耗盡持續總計五天。

在一些實施例中，藉由投與約40 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天且投與約15 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天來執行淋巴細胞耗盡，其中環磷醯胺及氟達拉濱均在前兩天經投與，且其中執行淋巴細胞耗盡持續總計五天。

在一些實施例中，藉由投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺及25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續三天來執行淋巴細胞耗盡。

在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉一起投與。在一些實施例中，以15 mg/kg投與美司鈉。在一些實施例中，當美司鈉係經輸注且若經連續輸注時，美司鈉可在大約2小時內與環磷醯胺一起輸注(在第-5天及/或第-4天)，接著以3 mg/kg/小時之速率進行輸注，持續與各環磷醯胺劑量同時開始之24小時內剩餘的22小時。

在一些實施例中，淋巴細胞耗盡包括在向患者投與第三TIL群體之後次日開始用IL-2方案治療患者之步驟。

在一些實施例中，淋巴細胞耗盡包括在向患者投與第三TIL群體當天開始用IL-2方案治療患者之步驟。

在一些實施例中，淋巴細胞耗盡包括5天之預處理治療。在一些實施例中，天數經指示為第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些實施例中，該方案包括在第-5天及第-4天( 亦即，第0天及第1天)之環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括在第-5天及第-4天( 亦即，第0天及第1天)之靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括在第-5天及第-4天( 亦即，第0天及第1天)之60 mg/kg靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉一起投與。在一些實施例中，該方案進一步包含氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包含靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括在第-5天及第-1天( 亦即，第0天至第4天)之25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括在第-5天及第-1天( 亦即，第0天至第4天)之25 mg/m ²靜脈內氟達拉濱。

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺及25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天之步驟。

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續五天之步驟。

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續三天之步驟

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺及25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續三天之步驟。

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺及25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續一天之步驟。

在一些實施例中，非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案包括投與60 mg/m ²/天之劑量的環磷醯胺持續兩天、隨後投與25 mg/m ²/天之劑量的氟達拉濱持續三天之步驟。

在一些實施例中，根據表26投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表26. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-5	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺60 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱25 mg/m ²/天	X	X	X	X	X
TIL輸注						X

在一些實施例中，根據表27投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表27. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺60 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱25 mg/m ²/天	X	X	X	X
TIL輸注					X

在一些實施例中，根據表28投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表28. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺60 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱25 mg/m ²/天	X	X	X
TIL輸注				X

在一些實施例中，根據表29投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表29. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-5	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺60 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱25 mg/m ²/天			X	X	X
TIL輸注						X

在一些實施例中，根據表30投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表30. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天

環磷醯胺300 mg/kg

美司鈉(視需要)

氟達拉濱30 mg/m ²/天

TIL輸注

在一些實施例中，根據表31投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表31. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺300 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱30 mg/m ²/天	X	X	X	X
TIL輸注					X

在一些實施例中，根據表32投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表32. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺300 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱30 mg/m ²/天	X	X	X
TIL輸注				X

在一些實施例中，根據表33投與非骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案。表33. 例示性淋巴細胞耗盡及治療方案。

天	-5	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4
環磷醯胺300 mg/kg	X	X
美司鈉(視需要)	X	X
氟達拉濱30 mg/m ²/天			X	X	X
TIL輸注						X

在一些實施例中，與骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案之前述實施例一起使用的TIL輸注可為本文所述之任何TIL組合物，以及添加IL-2方案及投與如本文所述之協同療法(諸如PD-1及PD-L1抑制劑)。 4. IL-2 方案

在一些實施例中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中該高劑量IL-2方案包括在投與治療有效部分之治療性TIL群體之後次日開始經靜脈內投與阿地白介素或其生物類似物或變異體，其中阿地白介素或其生物類似物或變異體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg (患者身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸注經投與直至耐受為止，最多14劑。在休止9天之後，可重複此排程以再投與14劑，最多總計28劑。在一些實施例中，投與1、2、3、4、5或6劑之IL-2。在一些實施例中，以最大劑量投與多達6劑之IL-2。

在一些實施例中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day 等人, J. Clin. Oncol. 1999, 17,2752-61及Eton 等人, Cancer 2000, 88,1703-9中，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，漸減IL-2方案包括6小時內經靜脈內投與18 × 10 ⁶IU/m ²阿地白介素或其生物類似物或變異體，隨後在12小時內經靜脈內投與18 × 10 ⁶IU/m ²，隨後在24小時內經靜脈內投與18 × 10 ⁶IU/m ²，隨後在72小時內經靜脈內投與4.5 × 10 ⁶IU/m ²。每28天可重複此治療週期，持續最多四個週期。在一些實施例中，漸減IL-2方案包括第1天18,000,000 IU/m ²，第2天9,000,000 IU/m ²，以及第3天及第4天4,500,000 IU/m ²。

在一些實施例中，IL-2方案包含低劑量IL-2方案。可使用此項技術中已知之任何低劑量IL-2方案，包括Dominguez-Villar及Hafler, Nat. Immunology 2000, 19,665-673；Hartemann 等人, Lancet Diabetes Endocrino l. 2013, 1, 295-305；及Rosenzwaig 等人, Ann. Rheum. Dis. 2019, 78,209-217中所述之低劑量IL-2方案，各案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，低劑量IL-2方案包括每24小時投與18 × 10 ⁶IU/m ²之阿地白介素或其生物類似物或變異體作為連續輸注液持續5天，隨後2-6天不使用IL-2療法，視情況隨後另外5天每24小時投與18 × 10 ⁶IU/m ²之靜脈內阿地白介素或其生物類似物或變異體作為連續輸注液，視情況隨後3週不使用IL-2療法，之後可投與額外週期。

在一些實施例中，以最大劑量投與多達6劑之IL-2。在一些實施例中，高劑量IL-2方案經調適用於小兒使用。在一些實施例中，使用每8-12小時600,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時500,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時400,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時500,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時300,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時200,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。在一些實施例中，使用每8-12小時100,000個國際單位(IU)/kg之阿地白介素之劑量，直至最多6劑。

在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投與聚乙二醇化IL-2。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投與貝加德盧金或其片段、變異體或生物類似物。

在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投與THOR-707或其片段、變異體或生物類似物。

在一些實施例中，IL-2方案包括在投與TIL之後，投與內姆瓦盧金阿法或其片段、變異體或生物類似物。在某些實施例中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量向患者投與內姆瓦盧金。

在一些實施例中，IL-2方案包括投與植入抗體骨架上之IL-2片段。在一些實施例中，IL-2方案包括投與與IL-2低親和力受體結合之抗體-細胞介素植入蛋白。在一些實施例中，該抗體細胞介素植入蛋白包含重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及植入V _H或V _L之CDR中的IL-2分子或其片段，其中該抗體細胞介素植入蛋白優先擴增T效應細胞而非調節T細胞。在一些實施例中，該抗體細胞介素植入蛋白包含重鏈可變區(V _H)，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V _L)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及植入V _H或V _L之CDR中的IL-2分子或其片段，其中該IL-2分子為突變蛋白，且其中該抗體細胞介素植入蛋白優先擴增T效應細胞而非調節T細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投與抗體或其片段、變異體或生物類似物，該抗體包含選自由SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:38組成之群的重鏈及選自由SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39組成之群的輕鏈。

在一些實施例中，本文所述之抗體細胞介素植入蛋白具有比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地白介素(Proleukin®)或可相當之分子)長的血清半衰期。

在一些實施例中，與骨髓清除性淋巴細胞耗盡方案之前述實施例一起使用的TIL輸注可為本文所述之任何TIL組合物，且亦可包括輸注MIL及PBL來替代TIL輸注，以及添加IL-2方案及投與如本文所述之協同療法(諸如PD-1及/或PD-L1抑制劑及/或CTLA-4抑制劑)。 VIII. 協調細胞擴增產品之製造及患者治療事件

如本文中所論述，自患者切除腫瘤至完成TIL製造之時間選擇取決於數種因素而異，包括例如可獲自患者之腫瘤之大小、在各種製造階段結束時之細胞計數、執行各種製造階段之天數等。因此，在排程各種患者治療事件時需要一定的靈活性。在一些實施例中，患者治療事件包括淋巴細胞耗盡。在一些實施例中，患者治療事件包括TIL輸注。在一些實施例中，患者治療事件包括白細胞單采程序。在一些實施例中，患者治療事件包括投與IL-2方案。在一些實施例中，患者治療事件包括腫瘤切除。在一些實施例中，患者治療事件包括住院以進行手術後治療。

本揭示案之一態樣提供一種用於實施本文所揭示之方法的系統。該系統可包括患者入口、製造入口、臨床醫師入口及物流入口。患者入口使患者或與患者相關聯之人(例如照顧者、監護人或法定代理人) (為了方便參考在本文中一起稱為「患者」)能夠存取與患者治療事件之排程有關的資訊。患者入口可要求患者提供驗證資訊以存取此資訊。患者入口亦可允許患者編輯與患者有關之資訊，例如地址或其他個人資訊。

臨床醫師入口(亦稱為醫院端界面)使門診(亦即，門診人員)能夠存取及/或編輯與患者、製造過程、製造設施、物流提供者有關之資訊以及與在門診執行或待執行之各種患者治療事件有關的資訊。

製造入口與醫院端界面及物流入口/物流界面通訊以確定及傳送與製造過程及/或製造槽之可用性有關的資訊。製造入口亦使得能夠生成製造標籤，該製造標籤包括如本文所揭示之各種製造步驟的更新之品質資訊。

物流入口(本文中亦稱為物流界面)與製造入口及醫院端界面通訊，交換與材料(亦即，實體腫瘤或所製造之細胞療法產品)在門診與製造設施之間運輸之排程有關的資訊，包括例如製造排程、製造槽之可用性及患者治療事件之排程以促進及時運輸材料。

用於實施本文所揭示之各種方法之系統可在計算系統上藉由實施專有計算機程式或藉由合適地修改市售軟體平臺(例如由Vineti、Salesforce.com、Salesforce Health Cloud、IQVIA、TracSel及SAP所提供之軟體平台)來實施。

修改市售軟體平臺以便合適地實施該系統且執行一或多種本文所揭示之方法可使得該平臺執行並非其最初設計用於之過程。換言之，在一些實施例中，修改可基於由平臺提供之各種工具之非習知用途。在一些實施例中，用於實施本文所揭示之各種方法的系統可包括軟體平臺(諸如框架程式)，其整合使物流任務能夠自動化之企業資源規劃(ERP)系統及使製造任務能夠自動化之製造執行系統(MES)。此類框架程式之實例描述於美國專利第7,343,605號中，該案以引用之方式整體併入本文中。

例如，連同MES應用，來自企業控制層級(企業資源規劃層級)及來自自動化層級(控制層級)之應用亦可經由框架程式加以整合且經由工作站(例如，在臨床設施、製造設施或快遞設施處)進行監測或管理。因此，該框架程式可形成用於整個患者治療過程之整合平臺，包括登記患者、摘取腫瘤、運輸腫瘤至製造設施、製造治療性或經擴增細胞療法產品、運輸治療性細胞療法產品至臨床設施、向患者投與療法及後續患者治療事件。來自企業控制層級、MES層級以及自動化層級之不同應用可藉由該框架程式在適配器及/或包裝器之協助下簡單且具成本效益地整合。因此，該框架程式必須被視為中介軟體平臺及製造應用整合工具。終端用戶(例如，案例管理師)可經由工作站看見待監測之應用之個別狀態且亦可存取該等應用之資料及方法。另外，終端用戶可藉由此存取使應用彼此連接。

因此，該框架程式首先使得達成來自不同企業層級之應用之垂直整合成為可能，其次該框架程式使得能夠水平整合在MES層級上之應用。

例如，允許資訊儲存於平臺中之基於軟體之案例物件係經儲存之資訊類型的整體定義。例如，在現成平臺中基於軟體之案例物件允許儲存關於客戶查詢之資訊。以此類物件而言，可有多個記錄儲存有關該資料類型之特定情形的資訊。因此，一案例記錄儲存有關個體之訓練查詢的資訊且另一案例記錄儲存有關另一個體之組態問題的資訊。此等物件可經定制以儲存與例如患者、針對彼患者之患者治療事件及對應排程有關之資訊。

同樣，在現成平臺內提供之自動化行動(諸如通知及警示)及工作流程規則(諸如商業邏輯行動)可經修改以觸發排程及過程步驟之變化，例如製造過程變化及基於QA測試結果之製造排程、製造槽之可用性及患者治療事件排程之後續變化。

在一些實施例中，本文所揭示之系統提供用於確定在製造過程期間可能之故障點的品質保證特徵，諸如美國專利第10,747,209號及美國專利第7,799,273號中所述之彼等，該等專利以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所揭示之系統提供資料系統，該等資料系統經組態以維持在自獲自患者之實體腫瘤(或其片段)製造最終細胞療法產品之過程期間所建立的電子批次記錄之完整性，諸如美國專利第8,491,839號中所述之彼等，該專利以引用之方式整體併入本文中。在一些實施例中，本文所揭示之系統包括經調適用於細胞製造過程之應用軟體，其中該細胞製造過程產生經擴增細胞療法產品，諸如治療性T細胞群體。該應用軟體係經組態以控制包括於用於細胞製造之密閉系統中之複數個裝置，諸如透氣裝置。

在一些實施例中，本文所揭示之系統整合應用軟體及本文所揭示之細胞製造方法，以提供由複數個終端用戶使用的全面驗證及品質保證方案，由此分析且使用自系統匯總之資料以確定是否達成品質保證方案及驗證方案。

在一些實施例中，該系統將應用軟體應用於多個產品線及/或多個細胞製造設施，由此使用相同系統來監測及控制多個細胞製造線及多個產品線。

在一些實施例中，該系統將本文所述之方法實施至細胞製造過程之細胞培養系統的批次最佳化中，由此隨時間連續追蹤由細胞培養系統匯總之資料且使用該資料來分析細胞培養系統。此外，該資料係經整合且用於廣泛分析細胞製造過程之品質控制過程。

在一些實施例中，本文所揭示之系統使工作站之設計能夠執行製造最終細胞療法產品之過程的各種步驟。該等工作站可經組態以使與先前步驟相關聯之資料得以驗證以確保所執行過程之完整性且使補救行動得以進行(可能的話)。此類工作站設計之實例提供於美國專利第8,041,444號中，該專利以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所揭示之系統藉由對各個製造商之可用製造排程進行存取使醫院設施與各個製造商之間能夠進行協調，各個製造商能夠由在醫院設施處獲得之實體腫瘤製造細胞療法產品。使此類協調得以進行之系統之實例提供於美國專利8,069,071中，該專利以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所揭示之系統係基於基於雲端之架構，該架構使與細胞療法產品之製造相關聯之各個實體得以即時存取(在適當許可下)與製造及運送細胞療法產品有關的資訊。此類基於雲端之架構之實例提供於美國專利第9,965,562號中，該專利以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所揭示之系統使與自患者獲得腫瘤、由所獲得之腫瘤製造細胞療法產品以及運送腫瘤及細胞療法產品相關聯的人員能夠使用電子簽章自行鑑定及認證以進行過程控制及批准，諸如美國專利申請公開案第2004/0243260號中所述，該案以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，該系統可進一步包括或在其中併入客戶關係管理(CRM)子系統。該CRM子系統可將與各當事人(例如醫生、醫院單位、護士、收費員、商業聯絡人等)有關之資訊歸檔。該資訊係由該CRM子系統維持，如此能夠在一個統一渠道中維持各當事人之單一觀點，從而允許在該系統內以遵守隱私之方式共享基於平臺、對潛在客戶及當事人之單一渠道觀點。與各當事人之間之關係有關的資訊可以分散式多重主控端、多重自屬端或對等式情境藉由移除個人可鑑定資訊而部分或完全匿名地共享至一或多個分散式自屬端或對等CRM系統。此類CRM子系統之一實例揭示於美國專利申請公開案第2014/0244351號、美國專利第US 8,489,451號及美國專利第US 9,342,292號中，其中每一者以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所述之系統可操作以提供包括中央事件處理子系統之網路，該中央事件處理子系統用於接收、處理及路由由即時醫療事件及/或製造事件觸發之訊息。該中央事件處理系統例如可鑑定與醫療事件相關聯之患者資訊且使患者資訊與健康規劃、臨床位置、TIL製造設施及/或物流提供者中之一或多者匹配。在使醫療及/或製造事件與相關當事人匹配後，該中央事件處理子系統可在觸發事件之短時期內(例如，幾乎即時)將關於醫療及/或製造事件之至少一部分資訊轉發至一或多個相關當事人。例如，基於與各相關當事人相關聯之規則，該中央事件處理系統可轉發資訊及/或發送警示或通知給相關當事人以使相關當事人知悉醫療事件。此類中央事件處理子系統之實例描述於美國專利申請公開案第2014/0372147號及美國專利第US 10,242,060號中，其中每一者以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，本文所揭示之系統可操作以選擇用於癌症治療方案之工作流程，該癌症治療方案包括患者治療事件，例如腫瘤切除、淋巴細胞耗盡、白細胞單采、TIL輸注及/或IL-2方案，或本文所揭示之其他患者治療事件。在選擇工作流程後，該系統可替代患者產生對應於細胞輸注療法之採購單，其中對應於細胞輸注療法之訂單包括細胞訂單請求及對應於癌症治療之指定治療方案之需求中的至少一者。此類工作流程選擇子系統之實例揭示於美國專利申請公開案第US 2014/0088985號中，該案以引用之方式整體併入本文中。

在一些實施例中，該系統可包括通話子系統，該通話子系統可包括服務需求驗證，包括在與患者或患者代表進行文字或音頻通訊之前驗證遠端存取裝置。在一些實施例中，該驗證可藉由自動驗證遠端存取裝置或藉由向患者(或代表)詢問問題來完成。此類通話子系統及驗證方法之實例揭示於美國專利申請公開案第US 2019/0026747號中，該案以引用之方式整體併入本文中。 A. 用於協調細胞擴增產品之製造之系統

本揭示案之實施例包括一種方法及一種系統，該方法及該系統用於協調用於患者之細胞療法產品(例如T細胞或TIL)之製造，且基於製造過程之各個階段的進展及成功動態排程該製造過程之各個階段以及各種患者治療事件。

本文所述之方法及系統可進一步操作以提供優於現有系統之特定技術優點，即在免疫療法程序期間提供患者特異性生物樣品之連續且自動監管鏈及身份鏈，以建立相關當事人(諸如患者、醫師、製造商及其他醫療人員)可使用之計算機化資訊入口以快速理解及追蹤免疫療法程序之現行階段及患者的生物樣品在該程序期間之狀態。缺乏維持監管鏈及身份鏈之能力導致製造過程期間之延遲，這對於在對抗危及生命之疾病的患者而言可能極度嚴重。

本揭示案之實施例使生物材料在製造過程期間(包括QA、製造、釋出測試及最終確定運輸)之監管鏈及生物材料在最終產品遞送過程期間(包括運輸及遞送至輸注單位)之監管鏈得以維持。本揭示案之實施例進一步使監管鏈與特定患者得以連續且固定關聯，由此確保在所有制造階段期間患者與生物材料之間之完整身份鏈。

藉由使生物材料自患者經由運送、製造過程、運送及返回患者之整個旅程期間之各事件與細胞訂單標識符及患者特異性標識符(患者所獨有)相關聯且追蹤整個旅程期間之各事件來執行COC及COI之維持。

此外，本文所述之方法及系統可操作以整合及同步自患者獲得活組織與製造過程，以及提供用於審核自獲得活組織至投與細胞療法產品之各步驟及後續治療事件之COC及COI的能力。

本文所述之方法及系統可進一步操作以協調自患者獲得活組織、遞送活組織至所選擇之製造設施、在所選擇之製造設施處製造細胞療法產品以及自製造設施遞送細胞療法產品至門診以供患者治療用之物流。

圖35A顯示根據本揭示案之一實施例用於協調用於患者之細胞療法產品之製造的系統之方塊圖。在一些實施例中，由圖35A中之組件執行之功能可整合至單一組件中。此外，在一些實施例中，由圖35A中之一或多個組件執行之功能亦可由圖35A中之其他組件來執行。

參考圖35A，系統300可包括醫院端界面110、事件排程器120、物流界面(本文中亦稱為快遞入口) 130及/或製造入口140。醫院端界面110、事件排程器120、物流界面130及製造入口140中之每一者例如使用諸如LAN、WAN ( 例如互聯網)及/或細胞網路之通訊網路與其他三者通訊。

在一些實施例中，醫院端界面110、事件排程器120、物流界面130、製造入口140及對應模塊(顯示於例如圖3中)在市售軟體平臺(例如由Vineti、Salesforce.com、Salesforce Health Cloud、IQVIA、TracSel及SAP所提供之彼等)上經合適地修改或建立。

醫院端界面110可與醫院或其他負責投與患者治療( 例如，提供如本文所揭示之癌症療法)之設施相關聯或可相互作用。在一些實施例中，醫院端界面110係與執行自患者獲得實體腫瘤以及由實體腫瘤或其片段獲得細胞療法產品之程序的臨床設施相關聯。在一些實施例中，該臨床設施僅用於獲得實體腫瘤，而由實體腫瘤或其片段獲得細胞療法產品之過程可在製造設施處執行。

在一些實施例中，醫院端界面110係與對患者執行獲自製造設施之經擴增細胞療法產品之輸注且提供後續照護及/或任何先前或追蹤治療之醫院相關聯。醫院或門診之臨床醫師或雇員可經由醫院端界面110與系統300相互作用。

在一些實施例中，醫院端界面110包括一或多個計算裝置，例如桌上型計算機、雲端伺服器、筆記型計算機、行動裝置或任何其他計算裝置，該任何其他計算裝置包括在處理器上執行且與記憶體相互作用之硬體及軟體模塊。醫院端界面110可經由有線或無線連接與計算裝置連接，該等計算裝置在醫院或臨床設施處進行操作或與醫院或臨床設施相關聯。

在一些實施例中，醫院端界面110可包括追蹤模塊112，該追蹤模塊經組態以用於自患者抽取之時間直至輸注至患者體內之時間追蹤來自患者之生物材料( 例如，來自患者之腫瘤、獲自患者之T細胞、在T細胞擴增過程之各個階段擴增的T細胞等)。

在一些實施例中，當患者針對TIL輸注治療進行登記時，建立用於製造用於患者之經擴增細胞療法產品之細胞訂單請求且生成與細胞訂單請求相關聯的細胞訂單標識符。在一些實施例中，採購單係根據細胞訂單請求生成且自醫院設施上傳至該系統。在一些實施例中，該系統可包括用於生成及/或上傳採購單之界面。

此外，生成患者所獨有之患者特異性標識符且與細胞訂單標識符相關聯。在一些實施例中，患者特異性標識符可包括例如帶有連續後綴之患者ID #，其中該後綴係按患者依序添加之單一字母(A-Z)。患者特異性標識符在該系統中係獨特的。在一些實施例中，僅某些身份可看見患者特異性標識符(詳細描述於本文中別處)。在一些實施例中，患者特異性標識符係印刷於患者生物材料以及所製造之生物材料的旅程中所印刷之每張標籤上。在一些實施例中，患者特異性標識符對所有系統用戶係唯讀的。換言之，在一些實施例中，患者特異性標識符一旦生成就無法編輯。

在一些實施例中，細胞訂單標識符可包括資訊，例如獨特患者標識符、細胞訂單標識符、訂單碼、細胞訂單批號、在各個時間點之一或多個接受參數的值、指示是否滿足各個時間點之接受標準之一或多個指標或其組合。

在一些實施例中，在與患者相關聯之任何生物材料(例如，自患者抽取之實體腫瘤、其片段、自其中抽取之細胞療法產品或自擴增細胞療法產品所獲得之經擴增細胞療法產品)改變監管或進行處理時之各時刻掃描細胞訂單標識符及患者特異性標識符。在自患者抽取之時間直至輸注至患者體內之時間的整個過程期間，各掃描可藉由追蹤模塊112登入且進行驗證。在整個過程期間之各步驟驗證患者特異性標識符確保該產品之身份鏈(COI)，而在整個過程期間之各步驟驗證細胞訂單標識符確保該產品之監管鏈(COC)。與維持COI及COC有關之詳情描述於本文中別處。

在一些實施例中，用由醫院設施生成之採購單驗證經掃描資訊。例如，當在製造設施處接收運輸物時，可掃描運輸容器上之標籤且可用採購單驗證標籤上之資訊以確保正確性。在一些實施例中，將驗證結果登入該系統內。

應理解，雖然追蹤模塊112顯示於圖35A中且在本文中經描述為醫院端界面110之一部分，但追蹤模塊112在一些實施例中可作為具有處理器及記憶體之獨立計算裝置來實施同樣，追蹤模塊112在一些實施例中亦可作為獨立軟體模塊( 例如，儲存於雲端伺服器上)來實施。

在一些實施例中，醫院端界面110可經由患者存取模塊116向患者提供有限存取，使患者能夠獲得與治療程序及對應排程有關之資訊。患者存取模塊116亦可使患者能夠向臨床醫師提供與自己有關之資訊(例如，個人鑑定資訊、保險資訊及與其健康狀況有關之資訊)。

醫院端界面110可進一步包括摘取模塊114，該模塊可操作以使臨床設施之人員能夠根據預定方案自患者獲得實體腫瘤，且輸入與用於自患者獲得實體腫瘤之程序有關的資訊。在一些實施例中，與用於獲得實體腫瘤之程序有關之資訊可經歸檔，如此能夠進行事後審核以確保法規要求遵從性。

在一些實施例中，摘取模塊114可進一步使臨床設施之人員能夠向製造設施提供有關實體腫瘤及用於自患者獲得實體腫瘤之過程的資訊。在其中臨床設施亦可操作以自實體腫瘤獲得細胞療法產品之實施例中，摘取模塊114可使臨床設施之人員能夠向製造設施提供有關所獲得之細胞療法產品的資訊，例如用於獲得細胞療法產品之過程或程序及對所獲得之細胞療法產品執行的品質控制分析之結果。

在一些實施例中，醫院端界面110可進一步包括製造協調模塊118。製造協調模塊118可操作以使得臨床設施處之用戶能夠獲得與一或多個製造設施相關之資訊，例如該一或多個製造設施中之每一者的製造槽之可用性及可用產能。製造協調模塊118進一步使臨床設施之用戶能夠協調保留所選擇之製造設施之製造槽，且經由物流界面130與物流提供者協調以佈置獲自患者之實體腫瘤、其片段或細胞療法產品的運送。製造協調模塊118進一步使臨床設施之用戶能夠經由製造入口140獲得與在製造過程期間執行之製造過程及/或品質控制分析有關的資訊。

事件排程器120可操作以協調在臨床設施及製造設施處執行之各種活動之排程。此外或替代地，事件排程器120可向物流提供者提供與各種活動之排程有關的資訊，以便促進臨床設施與製造設施(用於製造細胞療法產品之設施，例如其中發生細胞療法產品擴增之設施)之間的細胞療法產品之運送。如以下更詳細描述，基於在細胞療法產品之製造期間所發生的不同事件，當其他事件應發生時，事件排程器係經組態以進行動態排程。

在一些實施例中，事件排程器120包括計算裝置122，例如桌上型計算機、伺服器、筆記型計算機、行動裝置或任何其他計算裝置，該任何其他計算裝置包括在處理器上執行且與記憶體相互作用之硬體及軟體模塊。硬體及/或軟體模塊包括接受判定模塊123及排程模塊125。在一些實施例中，計算裝置122可為可經由醫院界面110、製造入口140及物流界面130存取之雲端伺服器。事件排程器120可經由有線或無線連接與計算裝置連接，該計算裝置在製造設施及/或醫院設施處進行操作或與製造設施及/或醫院設施相關聯。

應理解，雖然接受判定模塊123作為事件排程器120之一部分顯示於圖35A中，但接受判定模塊123亦可作為製造入口140之一部分來實施。或者，接受判定模塊123亦可作為獨立軟體模塊(例如，託管於雲端伺服器上)來實施。

物流界面或快遞入口130可與物流提供者(例如快遞服務或包裹處理服務)相關聯或可相互作用。

在一些實施例中，物流界面130包括一或多個計算裝置，例如桌上型計算機、雲端伺服器、筆記型計算機、行動裝置或任何其他計算裝置，該任何其他計算裝置包括在處理器上執行且與記憶體相互作用之硬體及軟體模塊。物流界面130可經由有線或無線連接經由網路(諸如互聯網)與計算裝置連接，該計算裝置在物流提供者處進行操作或與物流提供者相關聯。

製造入口140可與製造經擴增細胞療法產品之製造設施相關聯。製造入口140可操作以使製造設施之人員能夠控制及記錄在製造經擴增細胞產品期間的各種過程，包括例如維持身份鏈及監管鏈、記錄與在製造期間執行之品質控制分析有關的資訊、記錄各種過程之間之轉變及在擴增過程期間提供用於細胞療法產品之容器的標籤。

在一些實施例中，製造入口140包括一或多個計算裝置，例如桌上型計算機、雲端伺服器、筆記型計算機、行動裝置或任何其他計算裝置，該任何其他計算裝置包括在處理器上執行且與記憶體相互作用之硬體及軟體模塊。製造入口140可經由有線或無線連接與計算裝置連接，該計算裝置在製造設施處進行操作或與製造設施相關聯。

在一些實施例中，製造入口140包括標記模塊142及COC/COI模塊144。標記模塊142可操作以使製造設施處之人員能夠生成在製造經擴增細胞療法產品之過程(本文中亦稱為擴增過程)期間攜帶細胞療法產品之容器的標籤。該等標籤可包括資訊，例如患者特異性標識符、與處理容器及/或執行擴增過程之目前及/或先前步驟之人員有關的標識符、在先前步驟中執行之品質控制分析的結果、與生成標籤之原因有關的原因碼、以患者特異性標識符鑑定細胞療法產品之條碼或2D碼(例如QR碼)及其他合適資訊。

COC/COI模塊144可操作以使與製造設施相關聯之用戶能夠在擴增過程期間維持監管審核鏈。COC/COI模塊144可進一步操作以使與製造設施相關聯之用戶能夠維持與經擴增細胞療法產品相關聯之患者的身份審核鏈。

圖35B繪示在市售軟體平臺上經合適修改或建立之系統300之組件以及在彼等平臺內之彼等標準物的對象模式。例如，市售軟體平臺可具有對應於患者存取(包括例如患者標識符、患者接觸資訊、患者驗證資訊等)、治療規劃(包括例如患者治療事件之初始排程)、臨床醫師存取(例如，臨床醫師標識符及臨床醫師驗證資訊)及製造存取(例如，製造設施之接觸資訊)之內置物件。

另一方面，可定制物件(諸如自患者獲得實體腫瘤之程序相關聯之腫瘤摘取表格、包括與用於製造經擴增細胞療法產品之過程有關的資訊及與所獲得之實體腫瘤如何處理有關的資訊之製造訂單、一或多個製造設施處之製造排程、使得能夠審核完整過程之標籤審核軌跡)以與內置物件交互，以便提供與系統300相關聯之特定功能。

系統300中之定制物件及內置物件係經組態以彼此相互作用，如此能夠經由自患者獲得實體腫瘤至將經擴增細胞療法產品輸注至患者體內之所有事件維持及審核COC及COI。定制物件連同內置物件以及排程患者治療事件及相關物流係基於製造過程如何進展。

例如，在一些實施例中，系統300可提供定制物件，諸如批次記錄及標籤審核軌跡。此等定制物件加上定制工作流程自動化及定制用戶設定檔向市售軟體平臺提供最初在該市售軟體平臺內並未設想之功能，例如維持COC/COI、審核能力、基於製造執行動態排程患者治療事件、基於製造執行之標籤生成及/或製造執行與摘取之間的相互作用。在製造過程期間在定制物件與內置物件之間針對腫瘤摘取程序、維持COC及COI及生成標籤之相互作用之額外詳情提供於本文中別處。 B. 定制與內置物件之間針對維持 COC 及 COI 之相互作用

圖35C-35E根據本揭示案之一些實施例示意性繪示生物材料在製造設施處之製造過程中的軌跡。在一些實施例中，最初當在臨床設施處將獲自患者之腫瘤樣品遞送至製造設施時，掃描運輸標籤且獲自該掃描之資訊係與該系統上之對應基於計算機之物件相關聯。該資訊可包括但不限於細胞訂單標識符、患者特異性標識符、腫瘤切除之時間、用於腫瘤切除之過程、在切除之後用於儲存腫瘤之過程及欲用於自腫瘤擴增細胞療法產品之預期過程。一旦獲自掃描之患者相關資訊經製造設施處分開接收(例如經由製造入口140)之細胞訂單請求驗證，該系統即指示腫瘤被製造設施接收且監管鏈轉至製造設施。有關製造過程中監管鏈及身份鏈如何維持之詳情描述於本文中別處。

接著將腫瘤移送至品質檢查。在品質檢查期間，自掃描接收之腫瘤相關資訊經進一步驗證以確保腫瘤樣品滿足必需品質標準。在此過程中驗證之資訊包括例如與用於腫瘤切除之過程及在切除之後用於儲存及運輸腫瘤之過程有關的資訊。與用於腫瘤切除之過程有關的資訊可包括例如自腫瘤摘取表格處理之各種欄位，該腫瘤摘取表格進一步詳細地描述於本文中別處。一旦腫瘤被視為滿足品質標準，掃描對應標籤且更新對應物件。該物件中所包括之更新資訊可在整個系統中存取，該系統包括例如醫院設施以及物流提供者(本文中亦稱為快遞設施)。在一些實施例中，與醫院設施及快遞設施相關聯之各種過程係基於更新之物件進行更新。

接著將腫瘤移送至製造。接著掃描第0天批次記錄標籤以驗證適當腫瘤樣品經移送至製造且欲藉由適當製造過程進行處理。接著將腫瘤移送至適當燒瓶(該燒瓶包括用於處理患者腫瘤之擴增過程之培養基及試劑)，且掃描該燒瓶之標籤。使用獲自具有適當時間戳記之掃描之資訊來更新對應物件。

接著將第0天燒瓶手動移送至培育室，自培育室將其移送至製造室。在製造室中，再次掃描燒瓶標籤且記錄其中含有之資訊。來自燒瓶標籤之資訊亦用於確保遵守適當製造過程。

在基於所遵守之特定製造過程之第一必需時間量(例如圖35C所示之11天)之後，對燒瓶進行接種。在接種過程期間，可要求將燒瓶自製造室移出。在此類情況下，掃描燒瓶標籤，且在燒瓶離開製造室之前及之後更新批次記錄。在執行進一步過程之前，匹配來自之前及之後掃描的資訊。

在接種過程之後，將燒瓶再引入製造室中。在接種過程之後再引入製造室中之前及之後掃描燒瓶標籤且更新批次記錄。匹配來自之前及之後掃描之資訊以驗證使用正確燒瓶且使用適當後續過程來進一步處理細胞療法產品。

在第二必需時間量(例如圖35C所示之第16天)之後，將來自經接種之燒瓶的細胞分裝至複數個袋(例如圖35C所示之5個袋)中。在再引入製造室中之前及之後掃描各袋之標籤，且適當更新批次記錄及對應物件。使用來自之前及之後掃描之資訊以驗證來自燒瓶之細胞係根據細胞訂單請求進行分裝，且使用適當製造過程進一步處理該等袋。

在一些實施例中，在第一及第二必需時間執行品質控制分析以確保製造過程係根據細胞訂單請求進行且遵循預定排程。熟習此項技術者應理解，雖然本文中論述用於執行品質分析之第一及第二必需時間，但視所使用之特定製造過程而定，可在不同時間點執行更多或更少品質控制分析。在此類實施例中，品質控制分析之結果亦可包括於經掃描資訊中。在獲得來自對應掃描之此類資訊後，若確定在對應時間點獲得之細胞療法產品的品質不滿足某些品質標準，則據此更新批次記錄及對應物件。必要時，亦更新製造過程之排程。在一些實施例中，可向醫院設施以及快遞傳達更新之排程，以使得適當更新醫院設施及快遞欲執行之對應過程之排程。何時及如何更新製造排程之詳情描述於本文中別處。

接著在複數個袋中(如排程，或以合適修改之排程及/或中間步驟)繼續該製造過程至預定終點。在一些實施例中，將來自該複數個袋之一的細胞用於執行最終擴增之細胞療法產品之品質分析。接著標記選自品質分析之袋以及含有欲作為最終產品釋出之細胞的袋，且掃描標籤以更新批次記錄及對應物件。

接著將欲作為最終產品釋出之袋輸入至卡匣中且冷凍以供運送至醫院設施。掃描卡匣之標籤且更新批次記錄以及對應物件。接著掃描欲用於執行品質控制分析之袋之標籤，更新批次記錄及對應物件，且將該袋移送至品質控制站。在獲得品質控制分析之結果後，掃描結果且更新批次記錄及對應物件。

在一些實施例中，可將欲作為最終產品釋出之袋釋出至快遞(及最終醫院設施)，但需警告該等袋中之產品尚未經批准用於患者之療法，因為尚未取得品質分析之結果。在此類實施例中，當獲得品質分析之結果時即時更新對應物件，由此減少向患者遞送最終細胞療法產品之時間。

一旦品質分析之結果指示批准最終細胞療法產品用於患者之治療性用途，即掃描該等卡匣且更新批次記錄及對應物件。接著準備處理該等卡匣以供運送、交給物流提供者(亦即，快遞)且掃描，從而指示監管鏈已轉移至快遞。

快遞接著將最終細胞療法產品運送至醫院設施，在該處再次掃描標籤以指示監管鏈已轉移至醫院設施。更新批次記錄及對應物件以使製造設施及快遞接到最終細胞療法產品已遞送至醫院設施之通知。 C. 在製造過程期間標記細胞療法產品且維持監管鏈及身份鏈

圖3F根據製造過程之一些實施例(例如GEN 2過程或GEN 3過程)示意性繪示自獲得實體腫瘤通過製造過程至輸注至患者體內之細胞療法產品之旅程中維持COC及COI之過程。在一些實施例中，最初，醫院端界面110自與醫院端界面110連接之醫院的雇員( 例如註冊護士)接收有關患者之資訊。有關患者之資訊可包括有關健康保險之資訊、個人鑑定資訊、健康相關資訊、患者登記資訊( 例如，同意書)或任何其他可能有助於鑑定及照護患者之患者相關資訊。

在醫院之雇員(例如臨床醫師)確定患者係例如TIL輸注療法之候選者之後，患者可經由與醫院端界面110連接之計算機提供同意書以接受TIL輸注療法。

醫院之雇員接著可經由事件排程器120訂購用於患者之TIL輸注療法。醫院之收費部門雇員接著可經由物流界面130立下用於患者之TIL輸注療法之採購單。可將TIL輸注療法訂單及採購單傳遞至醫院端界面110。醫院端界面110可確認接收該訂單及採購單，以及在將細胞訂單請求發送至事件排程器120之前確認已完成患者登記及同意。同樣，醫院端界面可與保險提供者通訊以通知已排程各種患者治療事件且亦可向保險提供者提供患者治療事件之排程以處理付款。

接著可使患者特異性標識符與細胞訂單請求相關聯且在每個處理及/或運輸步驟中使其附接至與患者相關聯之生物材料，如此能夠如本文進一步詳述不中斷生物材料之監管鏈及身份鏈追蹤。亦可使患者特異性標識符與患者以及用於投與不同患者治療過程之治療設備相關聯以在整個治療方案中追蹤患者。

亦可經由醫院端界面110將患者特異性標識符傳達至保險提供者，如此能夠在各種患者治療事件之後處理付款。可進一步經由快遞入口130將患者特異性標識符傳達至快遞以使快遞能夠驗證與所運送之生物材料相關聯的患者之身份。

在本文所揭示之各種實施例中，排程模塊125與醫院端界面110、製造入口140或物流界面130之間與製造事件及/或患者治療事件之排程有關之任何通訊(不論是否變化)皆伴隨與經處理及排程之細胞訂單請求相關聯的患者特異性標識符。包括患者特異性標識符之此類通訊使醫院端界面110、製造入口140及物流界面130能夠正確處理、追蹤及鑑定生物材料，由此避免錯誤鑑定生物材料或患者，且改良患者安全性。

此外，如本文詳細解釋，患者特異性標識符用於生成在擴增過程期間使用之容器之標籤，如此能夠在擴增過程中維持COC/COI且能夠事後審核法規要求遵從性。

在一些實施例中，患者特異性標識符可包括於細胞訂單標識符中，該細胞訂單標識符亦經結構化以用於追蹤身份鏈/監管鏈以及用於追蹤事件歷史。在一些實施例中，除了患者特異性標識符以外，細胞訂單標識符亦可包括數個標記或欄位，各對應於來自經歷處理步驟之患者之生物材料。圖35G係根據一些實施例之細胞療法產品之標籤的代表性影像。在一些實施例中，該標籤包括細胞訂單標識符350、2D碼(例如QR碼) 362、原因欄位370及產品欄位380。細胞訂單標識符350可包括各種欄位，例如患者姓名354、患者特異性標識符352、患者之出生日期(例如用於額外驗證) 356、醫院相關之患者標識符358及製造批號360。

因此，該標籤使得能夠維持COI/COC且亦使得能夠自在臨床治療中心切除腫瘤、運輸腫瘤材料至製造設施、製造(包括測試所有正在加工中及成品樣品)、運輸藥物產品至臨床治療中心及藥物產品輸注來追蹤材料。

在一些實施例中，可在自獲得實體腫瘤通過製造過程至輸注至患者體內之細胞療法產品的旅程期間之不同時間點生成不同標籤，諸如圖35H中所說明之彼等。在不同時間點生成之標籤可包括圖35G中所說明之標籤中包括的額外或不同資訊。例如，在一些實施例中，在細胞擴增過程期間生成且例如黏貼於在細胞擴增過程期間使用之容器的標籤可包括對應於各個時間點之欄位及在個別時間點作出的擴增細胞療法產品之接受參數是否滿足某些接受標準之確定結果。

因此，在該過程中之任何階段，該標籤提供有關患者之資訊(經由患者特異性標識符)，由此使得能夠維持身份鏈及監管鏈。該標籤亦可提供有關相關生物材料所經歷之各種處理步驟之資訊，例如出於審核目的提供監管鏈以及事件歷史之記錄。

系統300因此可經組態以在整個細胞療法產品製造過程及供應鏈中維持COI及COC。此外，系統300可經組態以包括滿足21 CFR第11部分、HIPAA (健康保險可攜性與責任法案)及GDPR(一般資料保護法)法規及確保資料安全且受到保護之保護措施。

為了限制及局限敏感資料之存取，系統300在一些實施例中實施基於用戶之作用及存取。在一些實施例中，標籤上可包括在標籤生成之時之時間戳記。

在一些實施例中，經由追蹤模塊追蹤之細胞訂單標識符可進一步包括與例如各種運輸/運送事件、各種製造過程事件及/或治療方案中之各個步驟相關聯的標記或欄位。此等標記或欄位可未印刷於標籤上，但由追蹤模塊生成或附加，以追蹤與患者相關聯之生物材料以及追蹤治療之進展。在此類實施例中，指示某一步驟之完成時間的時間戳記可與每一步驟之細胞訂單標識符相關聯或附加每一步驟之細胞訂單標識符，其中既定標記或欄位係變化或更新的。應理解，包括於此類更新之細胞訂單標識符中的資訊亦可用於對患者治療事件動態再排程，如本文中別處詳細論述。 1. 在製造過程期間標記細胞療法產品

參考回圖35F，在一些實施例中，細胞訂單標識符係印刷於可讀標籤上且與條碼或QR碼(或2D碼)相關聯，以允許自腫瘤切除至輸注自體藥物產品之適當身份驗證。可將標籤黏貼於與生物材料以及治療方案相關聯之物件。例如，可將包括患者特異性標識符之標籤黏貼於自醫院或臨床設施攜帶切除之腫瘤至TIL製造設施之容器、在各種製造步驟期間之TIL製造設備及容器、用於運輸經擴增TIL返回醫院或臨床設施之運輸容器、與各種治療事件相關聯之設備或其任何組合。

例如，在一些實施中，患者可經由醫院端界面110之患者存取模塊116進入該系統且進行登記。在該系統內登記且捕獲可追蹤患者資訊後，可由該系統向患者指派患者特異性標識符(COI編號)。指派患者特異性標識符使得能夠進行切除日期及製造槽之排程。

該系統內之製造槽的排程觸發細胞訂單之生成及指派製造單位之批號。

在腫瘤切除之前，臨床設施可存取該系統、確認正確患者鑑定且生成腫瘤瓶標籤及腫瘤運輸罐標籤。除了細胞訂單標識符以外，該標籤亦可包括患者特異性標識符。在一些實施例中，患者特異性標識符可為細胞訂單標識符內之欄位。

在腫瘤切除之後，在追蹤模塊112處起始監管鏈。接著可將經標記之腫瘤瓶置於運輸罐中且交給快遞以運送至製造單位。當快遞驗證運輸罐標籤上之細胞訂單編號匹配整合至系統300中的快遞系統中之運輸單上之細胞訂單編號時，監管鏈繼續，由此提供在治療中心與製造單位之間之腫瘤即時追蹤。

在遞送腫瘤至製造單位後，該系統內可生成遞送證明。在接收腫瘤後，製造人員經由COC/COI模塊144將製造批號輸入至系統之製造模塊140中。找出患者記錄(可經由製造協調模塊118取得)，將腫瘤瓶標籤掃描至該系統中以驗證患者特異性標識符與製造批號相關聯。在驗證後，COC轉移至製造單位。

製造設施處之人員可進入該系統，其中標記模塊142使得能夠生成含有細胞訂單請求之在製品(WIP)標籤。為了促進事後記錄審核，可將WIP標籤黏貼於批次記錄及細胞生長燒瓶。圖35G係根據一實施例之WIP標籤之代表性影像。圖35H顯示根據一實施例之不同WIP標籤類型及包括於各種標籤類型中之資訊。

製造人員接著可在製造過程期間之關鍵轉變點掃描該等標籤，以驗證細胞生長燒瓶上之細胞訂單標識符編號匹配批次記錄，從而確保在整個製造過程中維持COI。

此外，各品質控制(QC)樣品將具有其自身之具有COI編號之標籤，以確保所生成之結果接著連接至對應批次記錄。在完成製造過程後，標記模塊142可生成成品標籤。圖35I及圖35J為成品標籤之實例。

如圖35I-35J所示，此等成品標籤含有獨特患者鑑定，包括名稱354、出生日期(DOB) 356及患者特異性標識符352。將成品標籤黏貼於最終產品，且掃描批次記錄及標籤兩者以確保在製造設施內之COI及完全監管鏈。

將成品置於具有相同細胞訂單標識符(包括匹配之患者特異性標識符)之運輸罐中，驗證且轉移至快遞以遞送至治療中心進行輸注。快遞接著可驗證運輸容器上之細胞訂單標識符及患者特異性標識符匹配快遞系統中經由物流界面130接收之細胞訂單及患者資訊，由此提供在製造單位與治療中心之間之各藥物產品批次之幾乎即時追蹤。此時，COC自製造單位轉移至快遞。

快遞遞送成品至治療中心以供輸注至患者體內。快遞可經由物流界面130起始遞送證明(POD)，且COC自快遞轉移至治療中心。COI以在治療中心輸注產品至患者結束。

如本文中所論述，在各處理步驟之後在醫院端界面110、事件排程器120、製造入口140與物流界面130之間傳達患者特異性標識符確保了所有關係人( 例如，臨床設施、製造設施及物流提供者)接收生物材料之監管鏈以及身份鏈之記錄，且亦接收生物材料所經歷之各種處理步驟的記錄。

因此，經由標籤提供給實體腫瘤之患者特異性標識符及細胞訂單請求使得能夠追蹤運輸，以便維持患者安全性以及法規遵從性(例如FDA審核)所必需之監管鏈及鑑定鏈。 2. 在製造過程發生變化之情況下的標籤核對

一旦製造設施接收實體腫瘤，即根據細胞訂單請求起始細胞療法產品之製造。例如，可使用細胞擴增技術使用至少一部分之實體腫瘤來製造細胞療法產品。

在一些實施例中，與製造設施相關聯之計算機子系統(例如標記模塊142)可造成待印刷之第二標籤與用於細胞擴增之該部分之實體腫瘤相關聯。第二標籤可包括患者特異性標識符及細胞請求標識符。第二標籤進一步使得能夠追蹤細胞療法產品以維持監管鏈及鑑定鏈。

隨後，在細胞療法產品之製造期間，確定所製造之細胞療法產品在各個時間點之接受參數。接著在接受判定模塊123中比較接受參數，以確定在特定時間點確定之接受參數是否滿足對應時間點之接受標準。該等接受參數可藉由本文所揭示之任何合適方法或過程確定。此外，接受標準可為本文所揭示之任何接受標準。

在一些實施例中，確定接受參數及接受參數是否滿足接受標準之結果可附加於如本文別處所揭示之細胞訂單標識符。在一些實施例中，可基於確定接受參數是否滿足(或不滿足)接受標準之結果生成第三標籤。

例如，若第二時間點之接受參數不滿足第二時間點之接受標準，則生成在製造過程期間所使用之容器的第三標籤，該第三標籤包括「原因碼」以傳送第二時間點之接受參數不滿足第二時間點之接受標準及為何不滿足第二時間點之接受標準的資訊。

另外，若確定在第二時間點獲得之細胞療法產品可自在第二時間點之前之第一時間點再處理以適當獲得滿足第二時間點之接受標準的細胞療法產品，則第三標籤可包括例如本文別處所揭示之新的或更新的細胞請求標識符之資訊。在此類情況下，第三標籤可另外包括「原因碼」以傳送關於為何第二時間點之接受標準及為何自第一時間點再處理細胞療法產品適當之資訊。

接著，基於如接受判定模塊123所確定的是否滿足一或多個時間點之接受標準，用於細胞療法產品之製造之製造排程經合適修改以生成如本文別處所論述的更新之製造排程。此外，製造設施之製造槽的可用性亦經合適修改以反映細胞療法產品之目前製造排程之變化(若有的話)。接著可向計算裝置傳達該製造設施之製造槽的變化或更新之可用性。另外，患者治療事件之初步排程亦可基於更新之製造排程進行修改，且可向計算裝置傳達患者治療事件之更新排程。

接著，根據更新之製造排程完成細胞療法產品之製造。

在一些實施例中，生成對應於複數個時間點中之每一者的製造標籤，在該複數個時間點確定接受參數。各時間點之製造標籤可包括與所製造之細胞療法產品之品質相關聯的更新之資訊。更新之資訊可包括在對應時間點之接受參數及/或該等接受參數是否滿足彼時間點之接受標準。

此外，在一些實施例中，控制製造過程之控制器可經組態以讀取更新之製造標籤且確定後續處理步驟。例如，若在第二時間點之QA測試之後更新之製造標籤指示細胞療法產品不滿足某些接受標準，但細胞療法產品可自第一時間點進行再處理，則該控制器可造成製造過程之合適變化。此外，亦基於更新之標籤上的資訊對製造排程、製造槽之可用性及患者治療事件之排程進行合適變化。熟習此項技術者應理解，更新之製造標籤可包括細胞訂單標識符及患者特異性標識符加上與所製造之細胞療法產品之品質及促進鑑定鏈及監管鏈之原因碼有關的資訊。

熟習此項技術者應進一步理解，可向醫院端界面及物流界面傳達如藉由讀取更新之製造標籤所獲得的與製造排程、製造槽之可用性及患者治療事件之排程之變化有關的資訊，以使對應計算裝置能夠對與彼等實體相關聯之個別排程進行對應變化。 D. 以患者治療事件協調細胞療法產品之製造

圖36A及圖36B顯示根據本揭示案中之製造過程的實施例用於協調用於患者之TIL之製造的方法之流程圖。在一些實施例中，圖36A及圖36B繪示之方法係在圖35A中描繪之完整系統上實施，然而在一些實施例中，圖36A及圖36B繪示之方法係藉由圖35A中描繪之系統的部分實施。在一些實施例中，事件排程器120接收(例如，S305)來自醫院端界面110之擴增用於患者之細胞療法產品(例如T細胞)的細胞訂單請求及與該細胞訂單請求相關聯之患者特異性標識符。

在一些實施例中，患者特異性標識符或替代地細胞訂單標識符係藉由事件排程器120 ( 例如，S310)而非追蹤模塊112生成。

該細胞訂單請求可包括資訊，例如患者鑑定資訊、各種患者治療事件之目標日期及/或最終擴增之TIL製造產品的目標參數。一旦接收細胞訂單請求，事件排程器120可向醫院端界面110傳遞確認，從而指示已接收對應於患者特異性標識符之細胞訂單請求。在其中患者特異性標識符係由事件排程器120生成之實施例中，事件排程器120可傳遞指示已接收患者之細胞訂單請求的確認且向醫院端界面110提供患者特異性標識符或細胞訂單標識符。此外，事件排程器120可基於所接收之細胞訂單請求傳遞患者治療事件之目標排程。

此外，事件排程器120可將包括患者特異性標識符之起始請求( 例如，S315)傳遞至醫院端界面110，例如臨床設施，以對患者執行程序，從而自患者獲得實體腫瘤且對快遞提貨時間排程以將所獲得之實體腫瘤轉移至製造設施。如本文中所論述，該程序可包括但不限於用於自患者抽取一部分之腫瘤之腫瘤活組織檢查。在一些實施例中，事件排程器120可自使用醫院端界面110之雇員接收程序日期。作為反應，事件排程器120可提示該雇員視需要訂購供應品( 例如，腫瘤切除套組、腫瘤運輸容器或冷凍運輸容器)且使其與患者特異性標識符相關聯。

在執行獲得實體腫瘤之程序且運輸實體腫瘤之後( 例如，S320)，且一旦製造設施接收所獲得之實體腫瘤，排程模塊125動態排程( 例如，S325)各種製造事件以及各種患者治療事件，且使各事件與患者特異性標識符相關聯。在一些實施例中，排程模塊125在接收所獲得之實體腫瘤之前，例如在自醫院端界面110接收有關自患者獲得實體腫瘤之程序的排程之資訊後確定製造事件及患者治療事件之排程，且使各事件與患者特異性標識符相關聯。

各種製造事件之排程與患者特異性標識符相關聯且可包括執行本文所述之各種製造步驟之對應目標日期以及完成TIL製造過程之對應目標日期。如本文中所論述，各種製造步驟之目標日期可取決於多種因素，諸如所接收之腫瘤的大小、起始既定步驟之前之細胞計數、既定步驟結束時之數值倍數、在既定步驟期間達成某個數值倍數所需之天數及/或其他因素。

各種患者治療事件之排程可包括與患者特異性標識符相關聯的各種患者治療事件之目標日期，例如目標TIL輸注日期、淋巴細胞耗盡日期、住院持續時間、IL-2輸注方案排程及/或其他類似的治療相關日期。如本文中所論述，患者治療事件之排程取決於製造事件之排程，且尤其取決於TIL製造完成日期。在一些實施例中，可將各種患者治療事件之排程連同患者特異性標識符傳遞至醫院端界面110。

排程模塊125經組態以基於不同製造步驟之進展及成功使製造事件之排程以及患者治療事件之排程動態變化。例如，取決於在不同步驟中與擴增細胞療法產品相關聯之接受參數是否滿足某些接受標準，後續製造步驟之起始日期需要變化，其進而使目標完成日期變化，且因此需要使用例如圖36B或圖36C中描繪之方法使患者治療事件之日期變化。

接受判定模塊123確定與擴增細胞療法產品相關聯之接受參數是否滿足某些接受標準。接受參數包括但不限於細胞計數、細胞活力、無菌性、支原體計數、CD3計數、CD5計數、干擾素γ (INF-γ)產生、內毒素分析結果、革蘭氏染色分析結果等。取決於量測接受參數之步驟，此等接受參數中之一些或所有可需要滿足接受標準。例如，在第一啟動性擴增結束時(本文中亦稱為第一時間點)，例如自擴增起始開始11天，接受標準可在於細胞計數應為至少5×10 ⁶個活細胞。在不同步驟中之接受標準亦取決於用於執行擴增之過程( 例如Gen 2、Gen 3、Gen 3.1等)。

因此，取決於用於執行擴增之過程，接受判定模塊123可在擴增起始之後超過一個不同時間點確定接受參數是否滿足某些接受標準。換言之，接受判定模塊123在每一個不同之規定時間點執行品質測試(本文中亦稱為QA測試)以確定下一行動方案，且排程模塊125基於自接受判定模塊123獲得的QA測試之結果動態排程後續製造步驟及患者治療事件。

表B提供用於Gen 2、類Gen 2及Gen 3過程之最終產品測試的接受參數及接受標準之一實例。表B：

測試類型 ( 接受參數 )	方法	接受標準
釋出測試
細胞活力	螢光	＞70%
總活細胞計數	螢光	1e9至150e9
一致性(%CD45+/CD3+)	流式細胞術	類Gen 2：對於所有適應症，＞90% CD45+CD3+ TIL Gen 3：對於非卵巢，＞90% CD45+CD3+ TIL 對於卵巢，＞85% CD45+CD3+ TIL
干擾素-γ產量(經刺激-未經刺激)	刺激及ELISA	＞500 pg/mL

參考圖36B，在一實施例中，在起始細胞療法產品之擴增之後，接受判定模塊123確定( 例如S402)第一時間點之經擴增細胞療法產品是否通過與第一時間點相關聯之QA測試。在確定細胞未通過第一時間點之QA測試後( 例如S404)，接受判定模塊123確定細胞是否因為污染而未通過QA測試。若細胞因為污染而未通過QA測試，則審查可能終止之案例( 例如，S422)。

另一方面，若細胞因為除污染以外之原因( 例如，因為低細胞計數或低活力)而未通過QA測試，取決於細胞未通過QA測試之原因，排程模塊125可將進行中步驟延長一段時間，且審查最終收集之結果( 例如，S408)。在一些實施例中，所有後續製造步驟及患者治療事件可由於將進行中步驟延長一段時間而經再排程。

或者，排程模塊125可僅對患者治療事件再排程，以便承擔完成製造過程之潛在延遲或承擔所製造的細胞療法產品之潛在低溫冷凍，從而允許完成製造與輸注細胞療法產品之間之時間差。應理解，在一些實施例中，細胞療法產品包含患者之T細胞。在一些實施例中，細胞療法產品包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。因此，為了簡單起見，本文中之論述可互換地將細胞療法產品指稱為T細胞或TIL。

例如，在一些情況下，細胞療法產品儘管未通過第一時間點之QA測試，但可通過最終QA測試。在此類情況下，審慎之做法係偏離製造事件及患者治療事件之理想排程，且延遲淋巴細胞耗盡，直至執行最終QA測試以避免非必需之患者治療。因此，取決於細胞未通過第一時間點之QA測試的原因，確定(S418)患者治療事件之排程是否需要偏離患者治療事件之理想排程。在確定患者治療事件之排程需要偏離理想排程後，排程模塊125可再排程(亦即，延遲) ( 例如，S420)淋巴細胞耗盡以及後續患者治療事件，且進一步視情況在完成製造過程之後排程低溫冷凍步驟。

參考回S402，若細胞通過第一時間點之QA測試，則不需要使製造過程或患者治療事件之排程變化。接受判定模塊123接著確定( 例如，S406)第二時間點之經擴增T細胞是否通過與第二時間點相關聯之QA測試。

若細胞未通過第二時間點之QA測試，則接受判定模塊123確定( 例如，S404)細胞是否因為污染而未通過QA測試。若細胞因為污染而未通過QA測試，則審查可能終止之案例( 例如，S422)。

或者，排程模塊125僅對患者治療事件再排程，以便承擔完成製造過程之潛在延遲或承擔所製造的TIL之潛在低溫冷凍，從而允許完成製造與輸注TIL之間之時間差。

例如，在一些情況下，細胞儘管未通過第二時間點之QA測試，但可通過最終QA測試。在此類情況下，審慎之做法係偏離患者治療事件之理想的預先決定之排程(本文中亦稱為黃金路徑)且延遲淋巴細胞耗盡，直至執行最終QA測試以避免非必需之患者治療。因此，取決於細胞未通過第二時間點之QA測試的原因，排程模塊125可再排程(亦即，延緩) ( 例如，S420)淋巴細胞耗盡以及後續患者治療事件，且進一步在完成製造過程之後排程低溫冷凍步驟。

在一些實施例中，當細胞未通過第一或第二時間點之QA測試時，可更新患者特異性標識符以鑑定細胞未通過個別時間點之QA測試，且醫院端界面110及物流界面130接到患者(與患者特異性標識符相關聯)之患者治療事件可能必須取消或延遲之通知。當患者治療事件之排程偏離預先決定之排程(例如黃金路徑排程)且患者治療事件已經再排程時，醫院端界面110及物流界面130接到已更新對應於患者特異性標識符之排程的通知，且向醫院端界面110及物流界面130傳達更新之排程。

此類通知使臨床設施或醫院能夠合適地調整患者治療事件之各種排程以及作出與個別患者治療事件所需之適當人員可用性以及設施及設備可用性有關的必需後勤佈置。該通知可另外促進醫院或臨床設施向患者告知患者治療事件之排程之變化。或者，事件排程器120及/或醫院端界面110可與患者直接通訊以向患者通知患者治療事件排程之變化且使患者能夠與醫院或臨床設施協調以根據變化之排程來佈置患者治療事件。

在一些實施例中，醫院端界面110可另外向保險提供者傳達更新之排程，使得可採取用於處理付款之適當措施。

同樣，該通知使物流提供者能夠作出再排程生物材料之運輸的必需佈置，例如佈置適當運輸盒及處理生物材料之適當人員之可用性。

參考回S406，若細胞通過第二時間點之QA測試，則排程模塊125可維持患者治療事件之排程。例如，在一些實施例中，排程模塊125可向醫院端界面110傳達( 例如，S410)可基於預先決定之排程向患者投與淋巴細胞耗盡治療，但需警告製造過程仍可經延遲或可能無法產生所需最終產品之概率極低，但非絕無可能。此類通訊在圖36B中經指定為「有風險之淋巴細胞耗盡」。在此類狀況下不使製造過程或患者治療事件之排程變化。

接受判定模塊123接著確定( 例如，S412)第三時間點之經擴增T細胞是否通過與第三時間點相關聯之QA測試。

若細胞通過第三時間點之QA測試，則經擴增細胞被視為在目標TIL輸注日期準備釋出產品。排程模塊125在此類情況下通知( 例如，S424)醫院端界面110將以目標排程繼續患者治療事件。換言之，不對排程作出變化。

另一方面，若細胞未通過第三時間點之QA測試，則執行產品影響評估( 例如，由投與該治療之醫生或首席醫療官) ( 例如，S414)以確定是否可提供經擴增細胞用於輸注或終止治療，這取決於細胞未通過第三時間點之QA測試的原因。若在產品影響評估後，確定( 例如，S416)該治療可繼續，但需警告可能有與繼續以可用產品進行治療相關聯之某些風險，則在無患者治療事件之排程的任何變化下批准經擴增細胞釋出( 例如，S424)。

參考圖36C，在一實施例中，在起始細胞療法產品之擴增之後，接受判定模塊123確定( 例如S402)第一時間點之經擴增細胞療法產品是否通過與第一時間點相關聯之QA測試。在確定細胞未通過第一時間點之QA測試後( 例如S404)，接受判定模塊123確定細胞是否因為污染而未通過QA測試。若細胞因為污染而未通過QA測試，則審查可能終止之案例( 例如，S422)。

參考回S402，若細胞通過第一時間點之QA測試，則不對製造過程或患者治療事件之排程作出變化。接受判定模塊123接著確定( 例如，S406)第二時間點之經擴增T細胞是否通過與第二時間點相關聯之QA測試。

若細胞未通過第二時間點之QA測試，則接受判定模塊123確定( 例如，S404’)細胞是否因為污染而未通過QA測試。若細胞因為污染而未通過QA測試，則審查可能終止之案例( 例如，S422)。

另一方面，若細胞因為除污染以外之原因( 例如，因為低細胞計數或低活力)而未通過QA測試，則接受判定模塊123確定(例如，S458)在第二時間點獲得之細胞療法產品是否具有足夠品質以使得能夠自第一時間點再執行細胞製造過程，以便導致細胞療法產品在第二時間點具有滿足第二時間點之接受標準的接受參數。此類確定可基於在第二時間點獲得之細胞療法產品之接受參數作出。例如，若第二時間點之接受參數滿足第二時間點除了總活細胞計數以外之所有接受標準，則可行的做法係再執行介於第一與第二時間點之間之細胞製造過程以獲得必需活細胞計數。

若確定自第一時間點再執行細胞製造過程並不可行，則審查可能終止之案例( 例如，S422)。

另一方面，若確定再執行介於第一與第二時間點之間之細胞製造過程係可行的，則排程模塊125估算細胞製造過程在再執行介於第一與第二時間點之間之過程之後的完成時間(例如，S460)。應理解，可基於在第二時間點獲得的細胞療法產品之接受參數來估算再執行介於第一與第二時間點之間之細胞製造過程所需之時間。因此，完成用於製造細胞療法產品之細胞擴增過程(包括自第一時間點再執行該過程)所需之時間可取決於在第二時間點獲得的細胞療法產品之接受參數。

接著，排程模塊125可因自第一時間點再執行細胞製造過程而基於在第二時間點獲得的細胞療法產品之接受參數再排程所有後續製造步驟及患者治療事件。例如，排程模塊125可對患者治療事件再排程，以便承擔完成製造過程之延遲或承擔所製造的TIL之潛在低溫冷凍，從而允許完成製造與輸注TIL之間之時間差。

另一方面，若在第二時間點獲得的細胞療法產品之接受參數滿足所有接受標準，則細胞製造過程可如最初排程般繼續進行。

熟習此項技術者應理解，即使在確定此類再執行係可行的而自第一時間點再執行細胞製造過程之後，仍確定在重複之第二時間點(本文中亦稱為替代第二時間點)獲得的細胞療法產品之接受參數。接著，再次確定重複之第二時間點(其可能與細胞製造過程中之原始第二時間點不同)之接受參數是否滿足第二時間點之接受標準，接著繼續細胞製造過程超過第二時間點。

在一些實施例中，繼續之過程接著遵循與圖36B所顯示之路徑相同的路徑「B」。例如，在一些情況下，細胞儘管未通過第二時間點之QA測試，但可通過最終QA測試。在此類情況下，審慎之做法係偏離患者治療事件之理想的預先決定之排程(本文中亦稱為黃金路徑)且延遲淋巴細胞耗盡，直至執行最終QA測試以避免非必需之患者治療。因此，取決於細胞未通過第二時間點之QA測試的原因，排程模塊125可再排程(亦即，延緩) ( 例如，S420)淋巴細胞耗盡以及後續患者治療事件，且進一步在完成製造過程之後排程低溫冷凍步驟。

熟習此項技術者應理解，當細胞製造過程具有數個用於確定接受參數及彼等接受參數是否滿足彼等對應時間點之接受標準之時間點時，可行的做法係自緊接之前一時間點再執行細胞製造過程中之步驟。因此，術語「第一時間點」及「第二時間點」未必描述確定接受參數之數值第一及數值第二時間點。相反地，「第一時間點」係指細胞製造過程中之一時間點，若後續時間點之接受參數不滿足彼時間點之接受標準，則自該時間點再執行細胞製造過程之步驟係可行的。例如，在1C過程中，第一及第二時間點可分別為第27天及第30天、分別為第30天及第36天或分別為第36天及第43天。同樣，在2A過程中，第一及第二時間點可分別為第11天及第16天，或分別為第16天及第22天。

在一些實施例中，當細胞未通過第一或第二時間點之QA測試時，可更新患者特異性標識符以鑑定細胞未通過個別時間點之QA測試，且醫院端界面110及物流界面130接到患者(與患者特異性標識符相關聯)之患者治療事件可能必須取消或延遲之通知。

因為若在第一時間點再執行細胞製造過程係可行的，則細胞療法產品之製造排程可偏離理想排程，故患者治療事件之排程亦偏離預先決定之排程(例如黃金路徑排程)。因此，排程模塊對患者治療事件再排程，且醫院端界面110及物流界面130接到已更新對應於患者特異性標識符之排程的通知。向醫院端界面110及物流界面130傳達更新之排程。

如本文中所論述，此類有關排程變化之通知使臨床設施或醫院能夠合適地調整患者治療事件之各種排程。此外，可作出與個別患者治療事件所需之適當人員可用性及設施及設備可用性有關之必需後勤佈置。該通知可進一步促進醫院或臨床設施向患者告知患者治療事件之排程之變化。或者，事件排程器120及/或醫院端界面110可與患者直接通訊以向患者通知患者治療事件排程之變化且使患者能夠與醫院或臨床設施協調以根據變化之排程來佈置患者治療事件。

在一些實施例中，除非治療終止，否則排程模塊125與物流界面130通訊以提供基於完成日期之提貨單，該完成日期基於各個時間點之QA測試的結果來確定。物流界面130接著與物流提供者(未顯示)通訊以作出及時收集及運輸經擴增TIL至醫院或臨床設施以供後續患者治療( 例如輸注)用之合適佈置。例如，在一些實施例中，可要求物流提供者在所排程之患者治療事件之前某些天運輸用於處理生物樣品之特殊容器至醫院或臨床設施。

同樣，若確定經擴增細胞通過QA測試，則排程模塊125向醫院端界面110傳達所排程之完成日期及患者治療事件之排程(亦即，更新之排程)。另一方面，若確定治療係待終止的，則排程模塊125與醫院端界面110通訊：治療係待終止的。

在一些實施例中，在對患者治療事件再排程後，將患者治療事件之更新之排程連同相關患者特異性標識符傳遞至醫院端界面110。

在一些實施例中，若確定自第一時間點再執行細胞製造過程之步驟係可行的，則可更新介於細胞訂單標識符與患者特異性標識符之間之關聯。例如，在確定自第一時間點再執行細胞療法產品之擴增可行之後，將細胞訂單標識符與患者特異性標識符解關聯。可生成與細胞訂單請求相關聯之新的細胞訂單標識符且患者特異性標識符與該新的細胞訂單標識符相關聯。在一些實施例中，可基於在第二時間點確定之接受參數生成新的細胞訂單標識符。在一些實施例中，細胞訂單標識符可包括對應於各時間點之欄位，在各時間點確定細胞療法產品之接受參數。此外，在一些實施例中，細胞訂單標識符亦可包括確定接受參數是否滿足接受標準之結果，包括例如哪些接受參數滿足接受標準及接受參數之值。

在一些實施例中，將患者特異性標識符、新的細胞訂單標識符及細胞療法產品之擴增之估算完成時間傳遞至醫院端界面以使醫院端界面能夠追蹤細胞療法產品且使細胞療法產品與患者相關聯。

細胞訂單標識符所包括之各種欄位可使排程模塊125能夠基於在各個時間點生成之更新或新的細胞訂單標識符確定患者治療事件之新排程以及與患者治療事件相關聯之運輸及物流事件。接著，將新排程連同相關患者特異性標識符傳遞至物流界面。亦可將患者特異性標識符及更新或新的細胞訂單標識符連同在一些實施例中之新排程傳遞至物流界面，以便維持細胞療法產品之監管鏈及鑑定鏈。

在一些實施例中，若確定再執行細胞製造過程之步驟並不可行(例如，因為第二時間點之接受參數不滿足接受標準之某些閾值)，則可取消第二時間點之後的患者治療。在此類實施例中，向醫院端界面及物流界面傳達患者治療之取消。在一些實施例中，在確定再執行細胞製造過程之步驟並不可行後，可銷毀經擴增細胞療法產品。例如，在若無法再執行細胞製造過程之步驟則不可能獲得活的經擴增細胞療法產品之情況下，輸注細胞療法產品變得不可能。因此，繼續第二時間點之後的患者治療事件對患者(例如，不論就健康結果而言，抑或就財務結果或兩者而言)可能有害。此外，若基於第二時間之確定之接受參數來確定無法進一步使用第二時間點之經擴增細胞療法產品(例如，若第二時間點之細胞療法產品受到污染或不滿足某些其他接受標準)，則可銷毀細胞療法產品。在此類情況下，將細胞訂單標識符與患者特異性標識符解關聯。 E. 協調製造設施之間之製造槽

在本揭示案之另一態樣中，揭示一種製造用於患者之細胞療法產品的方法。在一些實施例中，該方法包括接收製造用於該患者之細胞療法產品之細胞訂單請求。該細胞訂單請求可由與臨床設施相關聯之計算裝置接收。該細胞訂單請求可經由例如醫院端界面110接收。在一些實施例中，該計算裝置可在接收細胞訂單請求後生成患者特異性標識符及細胞訂單標識符，且使患者特異性標識符及細胞訂單標識符與細胞訂單請求相關聯。

除了細胞訂單請求之外，該計算裝置亦可接收用於製造細胞療法產品之複數個製造設施之製造槽。例如，該計算裝置可經由例如互聯網以通訊方式耦合至與該複數個製造設施相關聯之計算機子系統，以使該計算裝置可回應於計算裝置之查詢接收與製造槽有關之資訊。個別製造設施之製造槽可指示在彼製造設施處之設備及人員之可用性以使該製造設施能夠根據細胞訂單請求製造細胞療法產品。

該計算裝置可進一步接收用於以細胞療法產品治療患者之患者治療事件之初步排程。該初步排程可基於製造細胞療法產品之理想排程來決定，假設細胞療法產品滿足如本文中別處所論述之在製造過程期間之各製造步驟中的QA標準。

在接收細胞訂單請求、製造槽及患者治療事件之初步排程後，該計算裝置可基於患者治療事件之初步排程在排程用戶界面中確定且展示複數個用於製造細胞療法產品之可用製造槽。該可用製造槽係基於多種因素來確定，例如臨床設施之位置、個別製造設施之位置、在個別製造設施與臨床設施之間運輸細胞療法產品之物流提供者的可用性、臨床設施之臨床人員可用性(以便執行與患者治療事件相關聯之必需治療程序)及任何其他可影響細胞療法產品在個別位置處之抵達時間選擇及/或使用的因素。

接著由該計算裝置之操縱員或由該計算裝置自動地選擇一個可用製造槽。在選擇可用製造槽後，可例如在醫療設施處藉由執行適當程序自患者獲得實體腫瘤。該程序可根據初步排程且基於考慮到實體腫瘤至個別製造設施之運輸時間選擇及物流提供者之可用性的可用製造槽來執行。在一些實施例中，該計算裝置可起始印刷欲與實體腫瘤相關聯之第一運輸罐標籤(參見例如圖35H第1列)。第一運輸罐標籤可包括患者特異性標識符及細胞訂單標識符。在一些實施例中，第一標籤可另外包括與臨床設施、所選擇之製造設施及物流提供者有關的資訊。此外，第一產品標籤(參見例如圖35H第2列)將與產品容器相關聯。第一產品標籤之實例繪示於圖35G中。

接著根據可用製造槽，將實體腫瘤轉移至所選擇之製造設施。熟習此項技術者應理解，因為實體腫瘤包括活細胞，故所選擇之製造設施處實體腫瘤之抵達時間選擇應與製造槽之可用性小心協調，以使製造步驟可在可接受之時間窗內起始。因此，自臨床設施轉移實體腫瘤至所選擇之製造應基於物流提供者之可用性以及其他可影響此類轉移的因素小心地協調。例如，可能有在一些情況下可預期之天氣相關或交通延遲，且因此可據此調整轉移排程。在其他情況下，可能無法預見轉移延遲。然而，即使在此類情況下，實體腫瘤自臨床設施轉移至所選擇之製造設施亦可以其他合適方式進行協調。 F. 腫瘤摘取方案

參考回圖35A，系統300之醫院端界面包括腫瘤摘取模塊114，該模塊使臨床設施之人員能夠根據預定方案自患者獲得實體腫瘤，且輸入與用於自患者獲得實體腫瘤之程序有關的資訊。

在一些實施例中，摘取模塊114包括由臨床設施之人員使用的腫瘤摘取表格，以確保在自患者獲得實體腫瘤(或其片段)且準備將其運送至製造設施之過程期間遵循適當程序。圖35K-35P係根據本揭示案之一些實施例之腫瘤摘取表格的代表性螢幕截圖。在一些實施例中，腫瘤摘取表格可要求自患者獲得腫瘤之技術人員輸入與所執行之程序有關的資訊。輸入之資訊可用於更新批次記錄以供事後審核(若有必要)。

此外，因為包括於批次記錄中之資訊可在整個系統中存取(若有適當許可)，故與獲得腫瘤所遵循之過程有關的資訊亦可供製造設施處之人員使用。在一些實施例中，製造設施處之人員可存取與獲得腫瘤之過程有關的資訊作為品質控制措施以確保製造設施處接收之生物材料適合進一步處理。

在一些實施例中，腫瘤摘取表格包括要求滿足某些標準才讓技術人員繼續該過程中之後續步驟之智能表單特徵。例如，可要求技術人員輸入與該過程期間所使用之細胞培養基有關的資訊(諸如到期日)，且若該到期日係在當前日期之前，則腫瘤摘取模塊114可警示技術人員。另外，腫瘤摘取模塊114可不允許技術人員輸入任何與該過程有關之進一步資訊，由此迫使技術人員放棄該過程。

同樣，腫瘤摘取表格可要求技術人員執行某些步驟或程序，接著才能錄入與後續步驟或程序有關之資訊。因此，摘取模塊114要求技術人員遵循特定方案，而不得遺漏或跳過某些步驟。

在一些實施例中，摘取模塊114可要求腫瘤摘取表格進行驗證，接著才能向快遞釋出所獲得之腫瘤以運送至製造設施。該驗證要求之作用係防失敗，以確保當獲得腫瘤時遵循適當方案及程序。在一些實施例中，摘取模塊114可要求驗證腫瘤摘取表格之人與輸入腫瘤摘取表格中之資訊之人並非同一人。此類驗證要求亦確保適當法規要求遵從性。 G. 患者支持服務

本揭示案之實施例可進一步操作以使與患者或患者之代表(在本文中統稱為患者)交互的患者支持服務能夠支持旅行、健康管理、健康保險、給付及其他治療相關服務。在一些實施例中，該患者支持服務可與通話界面及可存取(若有適當許可)製造過程及COC/COI過程之角色(persona)交互。如本文所用，術語角色係指用戶類型。既定角色對於該系統及該系統內之資訊具備某種存取水準，且可存取該系統之某些功能。該系統內之角色包括但不限於社區角色、組織摘取角色、製造商角色、患者支持角色、患者角色及健康系統用戶角色。

社區角色涉及社區用戶，其可存取向患者提供治療程序之中心之人員。社區角色用戶可包括例如細胞療法協調者、骨髓移植護士、醫院收費部門等。與社區角色用戶相關聯之功能包括但不限於登記新患者、更新患者登記資料、建立及提交患者之TIL訂單請求、排程或變化切除日期、檢視黃金路徑日期、檢視最終產品遞送日期、上傳醫院採購單、上傳患者同意書、登記患者之患者支持選項、檢視及更新照顧者記錄、填寫及提交腫瘤摘取表格供批准、批准腫瘤摘取表格、印刷腫瘤摘取表格、上傳腫瘤摘取表格及印刷培養基瓶及腫瘤運輸罐標籤。

與製造商角色相關聯之用戶包括腫瘤接收人員、品質控制人員、製造過程人員及最終產品包裝人員。與製造商角色相關聯之功能包括但不限於輸入批號、檢視可用且保留之製造槽、印刷及掃描過程中、最終產品及運輸標籤。

與腫瘤摘取角色相關聯之用戶包括例如外科醫師及骨髓移植護士。與腫瘤摘取角色相關聯之功能可包括但不限於填寫腫瘤摘取表格、提交腫瘤摘取表格供批准、批准腫瘤摘取表格、印刷腫瘤摘取表格及上傳腫瘤摘取表格。

患者支持角色之用戶可包括但不限於患者支持人員、患者諮詢師、醫院收費管理師、醫院保險管理師等。與患者支持角色相關聯之功能可包括但不限於檢視患者協助服務案例、上傳檔案至案例、標注案例、轉移案例至案例管理師等。

在該系統之一些實施例中，某些角色可存取某些資訊類型。在一些實施例中，某些角色之用戶只有當執行某些類型之功能而非執行其他類型之功能時才可存取資訊。例如，在一些實施例中，醫院收費及/或醫院保險管理師可經由患者支持角色存取COC/COI及製造過程資訊，但患者諮詢師無法看見。在一些實施例中，執行例如排程患者治療事件、在患者治療事件之排程過程中協助患者及/或協助患者交通之功能之患者支持人員可看見但無法編輯製造及COC/COI資訊。

例如，在一些實施例中，一種藉由將獲自患者之腫瘤之細胞群體擴增成細胞療法產品來製造該細胞療法產品的方法可包括：基於製造用於該患者之該細胞療法產品之細胞訂單請求，在製造設施處接收來自該患者之細胞群體；由計算裝置生成患者特異性標識符，包括與該細胞訂單請求相關聯之細胞訂單標識符；起始製造該細胞療法產品之過程，該過程包括：在該製造設施處接收該細胞群體之後，由該計算裝置對患者治療事件排程，使用細胞擴增技術自該細胞群體之至少一些起始該細胞療法產品之擴增，且確定在第一時間點及在該第一時間點之後的第二時間點該擴增細胞療法產品之接受參數，確定該擴增細胞療法產品之接受參數是否滿足與對應時間點相關聯之接受標準，回應於該擴增細胞療法產品之接受參數滿足該第一時間點之接受標準的確定，使用該細胞擴增技術自該獲得之細胞療法產品之至少一些繼續細胞療法產品之該擴增直至該第二時間點，及回應於該擴增細胞療法產品之接受參數不滿足該第二時間點之接受標準的確定：基於該第二時間點之接受參數，確定自該第一時間點使用該細胞擴增技術再執行該細胞療法產品之該擴增是否可行，回應於該再執行係可行之確定，自該第一時間點使用該細胞擴增技術由該第二時間點獲得之該細胞療法產品之至少一些再執行該細胞療法產品之該擴增以獲得該細胞療法產品，自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之後，由該計算裝置估算該細胞療法產品之該擴增之完成時間，及由該計算裝置對患者治療事件再排程且自該第一時間點完成細胞療法產品之後續擴增，其中該等患者治療事件之該再排程係基於該細胞療法產品之該擴增之估算完成時間及在該經擴增細胞療法產品在該患者中之輸注之前或之後的患者治療事件之時間選擇來執行，及提供患者支持服務，例如支持旅行、健康管理、健康保險、給付及其他治療相關服務。 H. 用於追蹤治療期間患者之生物材料的系統

在一些實施例中，本文所揭示之系統使得能夠追蹤治療期間患者之生物材料。例如，該系統包括中央資料庫、處理系統及複數個入口，該等入口合起來使得能夠追蹤患者之生物材料及使用該生物材料製造的細胞療法產品，且維持監管鏈及身份鏈之記錄。該複數個入口使得與患者治療相關之各種過程中所涉及的人類行動者能夠與該系統相互作用(例如，輸入與治療工作流程期間執行之一或多個過程相關之資料，且驗證、認證及/或核對該系統上存在之資訊等)。

該系統提供單一平台來用於患者登記、患者排程、客戶關係管理、人員訓練狀態管理、產品訂單生成、採購單生成、追蹤自患者摘取生物樣品之過程、物流及快遞排程、追蹤製造品質、製造執行自動化、即時產品監測、產品品質控制、監測治療中心(例如，醫院設施)及製造商之品質、案例管理以及患者支持服務(諸如保險索賠及報銷、患者旅行及住院支持及其類似服務)及與使用TIL療法治療患者相關之其他因素。

為此，本文所揭示之系統之實施例向患者、照顧者、醫院設施、臨床醫師/外科醫師/健康照護提供者、製造設施及物流提供者(或其各自代表)提供不同界面(本文中亦稱為「入口」或若該界面為用戶界面，則稱為「用戶入口」)。各種界面詳細描述於本文中別處。

術語醫院設施係指其中向患者投與治療之設施且可互換稱為授權治療中心(ATC)。術語產品訂單係指ATC訂購使用獲自患者之生物樣品(例如，腫瘤樣品或獲自腫瘤樣品之細胞)製造的細胞療法產品之訂單或請求。在一些實施例中，細胞療法產品包括使用本文所揭示之任何方法擴增的經擴增TIL。術語採購單係指包括產品訂單之文件且包括基於ATC與製造商之間的貿易協議中所概述之品質參數來支付細胞療法產品之條件的詳情。

在一些實施例中，該系統基於所執行之各種功能向醫院設施處之人員提供複數個入口。例如，該系統可提供第一用戶界面(本文中亦稱為患者登記界面)以使得醫院設施人員能夠登記患者。登記患者之過程可包括例如經由患者登記界面提供患者資訊。

患者資訊可包括個人鑑定資訊，諸如名稱、地址、與患者之代表或照顧者相關的資訊、與患者之醫學狀況相關的資訊、與建議向患者提供之治療相關的資訊、與初級護理醫師、資訊醫師、主治醫師相關之資訊及其類似資訊。在患者登記期間提供之資訊亦可包括與授權治療中心相關之資訊、何時及何地(亦即，在ATC內之位置)以及將在何處進行投與之詳情、與將與治療投與相關之人員相關的資訊及其類似資訊。

在一些實施例中，患者登記界面可使得在已輸入患者資訊之後能夠編輯該資訊(例如，若患者轉移至不同住所)。在一些實施例中，患者資訊可僅由授權人員編輯且因此，患者登記界面可提供用於對可進入及/或編輯患者登記資訊之用戶進行認證的界面。

在一些實施例中，該系統使得當事人，諸如患者(或患者之代表)、醫院人員、案例管理師及其類似當事人能夠存取及/或安全地編輯與患者治療規劃所相關之各種事件的排程相關之資訊。例如，患者(或患者之代表)能夠存取要求患者位於ATC之患者治療事件的排程。在一些實施例中，該系統使得能夠經由呼叫中心進行此存取，相關當事人可在呼叫中心進行呼叫以獲得此類資訊。在此類實施例中，該系統可提供與呼叫中心之界面以存取患者登記資訊及/或其他資訊。在一些實施例中，呼叫中心進行之存取可基於預定許可而受限以便預防未授權存取以及遵從各種政府法規，例如美國HIPAA法規。

在一些實施例中，要求請求患者資訊或產品訂單資訊之變化之人提供認證資訊，且經由該系統內之對應界面提交請求。案例管理師接著可藉由例如跟進ATC及/或患者審查且驗證變化請求，以驗證患者記錄、患者標識符及任何其他認證資訊，且批准或拒絕該變化請求。在一些實施例中，案例管理師可經由案例管理入口對該系統進行存取。若變化獲得批准，則更新儲存於中央資料庫中之資訊，使得所有之後過程及事件接受變化之資訊，包括與庫存及物流相關之資訊。有利的是，此類過程預防資料一致性錯誤，因為一旦獲得批准，資料即在由與患者治療相關之所有授權作用查詢的單一資料庫中發生變化。

在一些實施例中，該系統提供客戶關係管理(CRM)資料庫或與客戶關係管理(CRM)資料庫通訊，該資料庫包括與ATC相關之資訊，包括例如與可執行治療程序之合格人員及合格場所有關的資訊、與收費員、保險提供者、患者支持服務提供者、商業聯絡人及其類似人員有關的資訊。在一些實施例中，該CRM資料庫維持用於執行治療程序之合格人員之憑證的更新清單。例如，該CRM資料庫可包括與訓練已接收之人、此人可基於彼訓練執行之程序、訓練日期、訓練到期日(若有的話)及其類似因素有關的資訊。

因此，若未訓練之人或正在訓練之人嘗試執行要求此類訓練之程序，則該系統標記此類嘗試且在一些實施例中，可藉由防止此人將任何資料輸入該系統中(例如，藉由封閉對應用戶界面中之錄入欄位)來限制此人執行該程序。

一旦患者進行登記，該系統即向該患者指派患者標識符。患者標識符係患者獨有的且在整個治療過程中維持於該系統內。因此，該系統使用患者標識符來鑑定患者，與例如針對該患者生成多少產品訂單或該患者接受多少次治療無關。在一些實施例中，該系統使用患者標識符隨時間追蹤患者資料。

一旦決定了治療規劃，該系統即生成細胞訂單標識符(本文中亦稱為訂單標識符)，該細胞訂單標識符接著用於追蹤生物材料及/或在整個治療程序期間(亦即，自患者抽取生物樣品至將細胞療法產品輸注至患者體內)與之有關的任何材料及容器。該訂單標識符可包括複數個欄位，其中在一些實施例中，至少一個欄位包括患者標識符。

案例管理師及/或醫院人員接著可提交產品訂單請求，該產品訂單請求基於自患者抽取之生物樣品規定細胞療法產品之詳情。接著，審查該產品訂單請求，進行核對且批准，且生成製造批號。在一些實施例中，該批號可包括複數個欄位，其中至少一個欄位包括訂單標識符。在一些實施例中，藉由將產品訂單請求中之資訊與醫院設施、患者、咨詢醫師、治療醫師及中央資料庫中存在之資訊中的一或多者進行交叉檢查來核對產品訂單。

在一些實施例中，產品訂單可包括訂單標識符、採購單、患者確認、患者治療事件之初步排程、製造過程之初步排程、與預期製造過程(例如，所製造之細胞療法產品的預期品質及數量參數)相關之詳情、與製造設施相關之資訊、與ATC相關之資訊、與ATC人員(例如，咨詢醫師、治療醫師、照護協調者、案例管理師等)相關之資訊、與製造設施處之人員相關的資訊(例如，處理製造過程之人員的預期訓練)及其類似資訊。

批准後，將產品訂單輸入至該系統中。ATC根據產品訂單起始用於自患者摘取生物樣品之程序。同樣，製造設施保留製造槽且佈置對應庫存及人員以便在製造設施處接收來自患者之生物樣品後根據產品訂單起始細胞療法產品之製造。同樣，快遞提供者佈置與將生物樣品自ATC運輸至製造設施及將所製造之細胞療法產品自製造設施運輸至ATC相關之物流。

訂單標識符用於在如本文中詳細描述之整個過程中追蹤與患者相關之所有材料及特定治療規劃。例如，在使用與患者及特定治療規劃相關之任何材料或易手之每個接觸點，記錄訂單標識符連同與一或多個處理者相關之標識符(使用由該系統提供之一或多個用戶入口)以在該系統之資料庫中產生監管鏈記錄。此外，因為訂單標識符與患者標識符相關(或在一些實施例中包括有包括患者標識符之欄位)，故亦藉由追蹤且記錄訂單編號來產生身份鏈記錄。

在一些實施例中，該系統例如經由患者登記入口向案例管理師及/或ATC人員提供與複數個製造設施處之製造槽可用性相關之資訊的存取。在一些實施例中，案例管理師及/或ATC人員接著可選擇可用製造槽以用於提交產品訂單。在一些實施例中，該系統藉由提供可用製造槽清單且提供與各可用製造槽相關之優先值來促進製造槽之提交。在一些實施例中，優先值係基於例如地理位置(亦即，物流相對於ATC之接近性或便利性)及過程可用性之因素來提供。在一些實施例中，該系統基於例如地理位置(亦即，物流相對於ATC之接近性或便利性)、過程可用性、製造設施之操作員及其類似因素之因素，代表案例管理師及/或ATC人員來選擇可用製造槽。

在一些實施例中，基於所選擇之製造槽來確定製造排程及/或運輸排程。用於確定患者治療事件之初步排程的因素包括但不限於製造設施可用性及其他因素，諸如使用所選擇之過程來完成細胞療法產品製造所需之時間、進行製造品質審查且釋出產品所需之時間、往返所選擇之製造設施進行運輸所需之時間及不同患者治療事件之時間排程。一旦確定患者治療事件之初步排程，該系統即基於患者治療事件之初步排程同步製造排程及運輸排程且自動地生成且提交用於對應運輸提貨之訂單。

在一些實施例中，該系統使得能夠基於例如患者及/或ATC人員可用性之變化、運輸及/或製造過程排程之變化及其類似因素之因素來修改患者治療事件之初步排程及/或製造排程。在一些實施例中，該等因素包括製造過程期間之後果或結果及製造過程期間之品質控制結果(例如，如藉由製造設施處之人員輸入或基於製造設施處之標籤掃描(如本文中別處詳述)所確定)。

該修改可為自動的，或用戶介導的，例如在必要的驗證、核對及批准之後由案例管理師及/或醫院設施人員起始。在一些實施例中，回應於對患者治療事件之排程的修改，該系統可修改快遞提貨及其他物流事件之排程。

在一些實施例中，該系統可使得能夠管理及/或修改其他患者相關事件及患者支持活動，包括例如對醫院人員之賠付及報銷以及對有資格獲得此類支持之患者(及/或其代表)的後勤、差旅及財務支持。在一些實施例中，經由患者登記界面選擇支持選項可經程式化為智能的，使得在選擇一個選項後，自動地選擇及/或展示某些欄位以使得用戶(例如，案例管理師或醫院設施人員)能夠輸入對應資料。

一旦提交產品訂單請求且獲得批准，該系統即為該訂單創建智能檢查表，其中執行自患者抽取生物樣品(例如，實體腫瘤樣品)之程序期間的各種過程。在一些實施例中，該智能檢查表可包括一或多個用戶界面，該一或多個用戶界面經程式化以展示(或防止展示)某些資訊或允許(或防止)錄入基於該系統中之資料(例如，儲存於中央資料庫中)及/或由執行各種過程之人員提供之資料的某些資訊。該一或多個用戶界面(本文中統稱為腫瘤摘取入口)可包括用於展示及錄入在用於抽取生物樣品之程序之前、在該程序期間及在該程序之後的資料之檢查表或表格。

例如，腫瘤摘取入口可提供智能表格，用於輸入與欲用於執行該程序之材料(例如培養基、溶液、設備及其他原材料，其可統稱為腫瘤摘取套組)相關的資訊。該資訊可手動輸入，或可基於可掃描之標籤而為機器可讀的。該系統接著使與該等材料相關之資訊與訂單標識符匹配以便維持身份鏈記錄。另外，若與該等材料相關之資訊中的訂單標識符未與中央資料庫中之訂單標識符匹配，則該系統可防止錄入與後續程序相關之資料。同樣，若確定材料之到期日在當前日期之前，則該系統可防止錄入與後續程序相關之資料。該系統可另外輸出警告(例如，聽覺及/或視覺)，即特定材料不應當用於該過程，例如經由腫瘤摘取入口。

例如，參考圖35K，腫瘤摘取入口提供用於輸入執行該程序之技術人員或外科醫師之名稱或鑑定的欄位、用於輸入醫院資訊、患者資訊、訂單標識符、患者標識符、與腫瘤樣品相關之批號、治療之潛在適應症、程序日期及其類似項之欄位。

另外，腫瘤摘取模塊可提供該程序所需之材料的檢查表。在一些實施例中，該程序所需之材料可提供於套組(本文中亦稱為腫瘤摘取套組)中。在一實例中，該套組可包括HypoThermosol® 100 mL瓶(維持於2-8℃下)；漢克氏平衡鹽溶液(HBSS) 500 mL (儲存於室溫下)；正大黴素(10 mg/mL) 10 mL小瓶(更新之溫度需求：維持於2°至8℃下)；兩性黴素B (250 μg/mL) 20 mL小瓶(儲存於-5℃至-20℃下)；3-4個具有蓋子之無菌樣本杯/容器(以在需要時洗滌OR中之腫瘤且將腫瘤樣本自OR/手術室運送至層流櫃)；石蠟；防漏包裝(具有吸收劑之樣本袋)；Crēdo Cube™ shipper kit; Nanocool™運輸罐套組(作為備份)；腫瘤運輸記錄表格；腫瘤樣本標籤(置於HypoThermosol®瓶上)；及運輸盒標籤。在一些實施例中，該程序所需之一些設備及材料一般可在典型醫院設施處獲得，例如無菌解剖刀、鉗、剪刀；酒精製劑；無菌區或解剖盤；具有針之1-及3-mL注射器等。另一方面，在一些實施例中，將腫瘤樣品包裝及運輸至製造設施所需之一些材料可由快遞提供者提供，例如經預處理之運輸罐，包括包裝材料及標籤；溫度監測裝置；預填寫之空運單等。

在一些實施例中，該系統可要求執行該程序之技術人員輸入及/或驗證檢查表中列出之各種項目。在一些實施例中，技術人員可掃描與各種材料相關之標籤且該系統可自經掃描之標籤提取相關資訊且自動地與檢查表交叉檢查該資訊。例如，該系統可基於經掃描之資訊檢查所用材料之數量、到期日及溫度是否為正確的。在一些實施例中，該系統亦可檢查與該程序相關之任何感測器及儀器(例如，溫度監測器、移液管及其類似物)之校準狀態。圖35L及圖35M顯示在技術人員已輸入及/或驗證(手動或經由掃描先關標籤)檢查表所需資訊之後腫瘤摘取模塊之螢幕截圖。

該系統可進一步需要技術人員輸入及/或驗證已執行某些程序。例如，該系統可要求技術人員驗證已根據用於執行該程序之方案製備材料。圖35M繪示針對材料製備之檢查表。如圖35M中可見，材料製備可包括自冷凍器及/或冰箱移出某些材料之容器，將其放入水浴中，混合某些試劑及/或化學品，及/或棄去剩餘材料，及其類似步驟。

同樣，圖35N繪示其中要求技術人員及/或外科醫師輸入及/或驗證與摘取之腫瘤相關之詳情的螢幕。例如，可要求技術人員經由腫瘤摘取入口驗證必需培養基經運送至手術室且由手術室接收，培養基瓶中之標籤具有訂單標識符及患者標識符，該等標識符與該系統中針對特定程序之彼等匹配；抽取腫瘤之病變位置；執行該程序之外科醫師的名稱；抽取腫瘤之時間(若抽取超過一個腫瘤)；及其類似因素。在一些實施例中，技術人員可掃描與手術室中接收之各種材料相關的標籤且該系統可自經掃描之標籤提取相關資訊且自動地驗證該資訊與該系統中針對特定程序之材料檢查表、訂單標識符及患者標識符匹配。亦可要求技術人員經由腫瘤摘取入口輸入額外資訊，例如腫瘤大小，且驗證所抽取之腫瘤的大小係在某一範圍內，正在執行或已執行確認腫瘤或其活組織檢查含有惡性細胞之程序，及其類似情形。此外，可要求技術人員經由腫瘤摘取入口確認將腫瘤樣品置於冷凍保存培養基中，且記錄將腫瘤樣品置於冷凍保存培養基中之時間。

該系統接著可要求除執行該等程序之技術人員以外的授權人經由腫瘤摘取入口批准及/或驗證已根據該方案執行該程序。

接著，在抽取腫瘤之後，該系統可要求錄入及/或確認與腫瘤抑制有關之詳情。例如，如圖35N及圖35O中所繪示，可要求技術人員及/或外科醫師經由腫瘤摘取入口確認將腫瘤置於必需容器中，該容器在必需溫度下具有適當培養基及/或試劑，該容器適當地經封閉及/或密封，將必需標籤黏貼於該容器，及將該容器適當地置於具有必需材料之運送袋中。

在一些實施例中，該系統可再次要求除執行含有自患者抽取之腫瘤樣品的程序之技術人員以外的授權人經由腫瘤摘取入口批准及/或驗證已根據該方案執行該程序。亦可要求該授權人確認與容器及運送袋相關之各種標籤上的各種標識符與該系統中之標識符匹配。在一些實施例中，該授權人可掃描與容器及運送袋相關之標籤且該系統可自經掃描之標籤提取相關資訊且自動地驗證該資訊匹配該系統中之標識符。在一些實施例中，該系統可要求由除確認該等程序之人以外的人對該確認進行額外驗證以提供冗餘且防止錯誤。

接著，該系統可經由腫瘤摘取入口提供與包裝腫瘤以運輸至製造設施相關之檢查表。圖35O及圖35P繪示與包裝程序相關之螢幕截圖。如圖35O及圖35P所繪示，該系統可要求包裝腫瘤運送袋之技術人員確認啟動必需量之冷卻引擎，所包裝之溫度監測器經適當校準且具有與該系統中之對應標識符匹配的標識符，該溫度監測器經啟動且黏貼於含有腫瘤樣品之運送袋，將含有腫瘤容器之運送袋置於低溫包裝(本文中稱為Crēdo Cube™或NanoCool™)中，正確的運送標籤牢固地黏貼於該低溫包裝，且運送標籤具有與該系統上之對應標識符匹配的所有必須標識符。在一些實施例中，該系統可要求包裝腫瘤運送袋之技術人員掃描運送標籤且該系統可自經掃描之標籤提取相關資訊且自動地驗證該資訊匹配該系統中之對應標識符。在一些實施例中，可要求包裝腫瘤運送袋之技術人員確認該低溫包裝經防篡改密封件密封且記錄完成包裝之時間。

在一些實施例中，該系統可再次要求除執行用於包裝運送袋之程序之技術人員以外的授權人經由腫瘤摘取入口批准及/或驗證已根據該方案執行該程序。亦可要求該授權人確認與容器及運送袋相關之各種標籤上的各種標識符與該系統中之標識符匹配。在一些實施例中，亦可要求該授權人掃描與容器及運送袋相關之各種標籤且該系統可自經掃描之標籤提取相關資訊且自動地驗證該資訊匹配該系統中之對應標識符。在一些實施例中，該系統可要求由除確認該等程序之人以外的人對該確認進行額外驗證以提供冗餘且防止錯誤。

在一些實施例中，在所有二次驗證及確認完成之後，該系統可生成腫瘤摘取報告，該報告可上傳至中央資料庫。在一些實施例中，經由腫瘤摘取入口輸入之資訊可在執行各種程序時即時保存至中央資料庫，由此避免生成及上傳腫瘤摘取報告之需要。

此外，在一些實施例中，一旦經由腫瘤摘取入口輸入與材料相關之資訊，與該材料相關之庫存資訊自動地上傳至中央資料庫以便使醫院設施能夠管理彼材料之庫存。

此外或替代地，腫瘤摘取入口可提供智能表格，用於輸入例如與手術小組(亦即，自患者抽取生物樣品之人員)、手術位點、腫瘤大小(例如，在實體腫瘤之情況下)、該程序之時間選擇及其類似因素相關的資訊。因此，若在手術程序期間經由該智能表格輸入之任何資訊均不與儲存於中央資料庫中之資訊匹配，則該系統可防止錄入額外治療，由此使得醫院設施能夠防止執行該程序。在一實例中，若手術小組之一或多個成員之訓練狀態已過期，或該程序之日期不正確，則該系統可防止將額外資料錄入腫瘤摘取入口中及/或輸出提示醫院設施停止該程序之警告(例如，聽覺及/或視覺)。

同樣，腫瘤摘取入口可提供智能表格，用於輸入例如與用於自患者抽取之生物樣品的中間儲存之容器、用於運輸該生物樣品之容器、處理運輸容器之人員及其類似物相關的資訊。該系統使每一容器上之訂單標識符與中央資料庫中之彼標識符匹配，且若存在錯配，則使得醫院設施能夠防止進一步程序。此外，該系統驗證各參數，例如準備生物樣品用於運輸之人員的訓練狀態、運輸容器之物理特徵(例如，溫度、溫度監測裝置之狀態等)及其類似參數。

另外，該系統可在整個程序中創建處理該等材料及生物樣品之成員的日誌以便使得能夠在中央資料庫上創建監管鏈記錄。例如，對於將材料及/或生物樣品(或其中具有生物樣品之容器)易手時之每一種情況，該系統可要求經由一個、兩個或兩個以上用戶入口(在適用之情況下)錄入與給出材料及/或生物樣品(或其中具有生物樣品之容器)之人相關的標識符及與接收材料及/或生物樣品(或其中具有生物樣品之容器)之人相關的標識符。此外，對於該程序期間發生之移交，該系統可要求接收之人具有某一訓練狀態。同樣，對於該程序之後發生的移交(例如，將運輸容器移交至快遞人員)，該系統可要求來自接收之人的特定驗證。

在一些實施例中，腫瘤摘取入口可使得能夠生成某些摘取標籤，該等標籤包括訂單標識符及至少一些額外資訊，例如處理者資訊、可使用性資訊、到期日、FDA標記資訊(在適用之情況下)及其類似資訊。該等摘取標籤可附接至在腫瘤切除過程期間以及在用於儲存、攜帶及運輸在腫瘤切除過程期間獲自患者之生物樣品的容器上使用之產品及裝置。

在一些實施例中，該等摘取標籤可包括呈機器可讀格式之資訊，當腫瘤摘取入口要求錄入對應資料時，可掃描該資訊以提取資訊。因此，在一些實施例中，該等摘取標籤上之一些或所有資訊可經編碼成一維或二維機器可讀碼，諸如條碼或QR碼。

在一些實施例中，該系統使得能夠對摘取標籤進行核對以確保不存在可能意外地用於錯誤物件上之雜散及/或重複標籤。例如，該系統可保存經印刷之摘取標籤之數目的日誌且可要求在完成該程序之前掃描相同數目之標籤。在該程序之後，該系統可使得授權人(其不同於執行掃描及/或輸入對應資料之人)能夠認證及驗證經輸入及/或掃描之資訊以使得能夠創建該程序之可審核記錄。授權人不同於輸入對應資料之人的要求為該程序提供額外安全性且確保遵循最佳實踐。

此外或替代地，該系統使得能夠實現、追蹤且控制(包括控制品質)用於欲運輸至製造設施之容器之運輸標籤的生成及印刷。該等運輸標籤包括訂單標識符及至少一些資訊，例如製造設施之地址、處理運輸容器之人員的標識符、FDA規定資訊(若有的話)、與運輸容器相關之物理參數(例如，溫度、含有生物樣品之容器的數目、溫度監測裝置之狀態等)、與欲使用之預期製造過程相關之詳情、關於在完成製造後所製造之細胞療法產品欲運輸到達的醫院設施之詳情、關於治療規劃及/或治療小組之詳情及其類似資訊。在一些實施例中，該系統中考慮由該系統印刷之每個標籤。若印刷不正確或重複標籤且未加以使用，則該系統自動地標記該事件以在系統中進行跟進及解決，這可能需要ATC處之案例管理師及/或授權人員之自動查詢以跟進且解決該事件，此舉在一些實施例中要求(由案例管理師或其他人員)在系統中對每個此類經印刷但不使用之標籤進行恢復、破壞及記錄，以便為系統中印刷之每個標籤創建完整的記錄及審核軌跡。

如本文中別處所論述，藉由要求運輸容器之移交所牽涉之人輸入其對應標識符來生成監管鏈記錄。若未輸入處理人之標識符資訊，則該系統可能防止完成移交日誌。

此外或替代地，該系統可要求將運輸容器移交至快遞之人具有某一訓練狀態，當將此人之標識符輸入腫瘤摘取入口來達成記錄監管鏈之目的時，該訓練狀態得到驗證。在一些實施例中，訓練狀態資訊經印刷於運輸標籤上。在一些實施例中，可提取運輸標籤上所包括之一些或所有資訊且傳達至快遞所使用之計算機系統以便使得能夠印刷快遞運貨單。

在一些實施例中，該系統使得能夠藉由使運貨單上之資訊與產品訂單中所包括之資訊匹配來驗證向快遞提供之資訊。一旦驗證完成，且快遞接收運輸容器，監管鏈即自醫院設施轉移至快遞。

同樣，該系統可要求在製造設施處接收運輸容器之人具有某一訓練狀態以便安全得且適當地接收運輸容器。當將在製造設施處接收運輸容器之人的標識符輸入系統中(亦即，經由製造設施入口)來達成記錄監管鏈之目的時，此人之訓練狀態得到驗證。

因此，該系統可使得僅允許合格處理者在該程序期間進行某些步驟。因此，該系統之對應入口可經設計以使得僅合格處理者輸入、選擇、簽發及/或驗證輸入該系統中之資料。

在一些實施例中，該系統為製造設施處之人員提供前端入口(本文中亦稱為製造入口)以與該系統相互作用(例如，輸入資料、印刷標籤、核對、批准及/或驗證所輸入之資料等)，且提供後端界面，該後端界面同步儲存於中央資料庫上且由醫院設施處之人員及/或快遞輸入(核對、批准及/或驗證)的資料。

因此，該系統向製造設施提供對中央資料庫之存取且相應地提供與例如根據產品訂單正在執行之程序相關的資訊。此外，製造設施經由存在於在製造設施處接收之運輸容器上的運輸標籤接收與該程序相關之資訊。製造設施處之人員例如經由製造入口驗證身份鏈(例如，藉由匹配來自產品訂單及運輸標籤之訂單標識符)，輸入資訊以創建監管鏈日誌，驗證過程資訊(例如，藉由匹配產品訂單及運輸標籤中之過程資訊)，驗證與所接收之生物樣品相關的詳情及採購單中提供之其他資訊。

如本文中別處所論述，可要求製造設施處之人員(包括例如製造技術人員及製造品質管理師)具有某一訓練狀態，當將此人之標識符輸入監管鏈記錄中時，該訓練狀態可得到驗證。

一旦運輸標籤及產品訂單上之資訊(包括例如訂單標識符、過程資訊、與生物樣品相關之詳情等)得到驗證，該系統使得製造設施能夠向醫院設施及快遞通知(例如，經由後端界面)該訂單及對應材料得到接收。一旦生成此通知，監管鏈即自快遞轉移至製造設施。

在一些實施例中，該系統使得能夠對醫院與製造設施之間之標籤進行核對。因此，例如，製造設施必須考慮由醫院設施印刷之所有標籤(例如，若在醫院設施處印刷2個標籤，則2個具有生物樣品之容器應處於在製造設施處接收之運輸容器中—若非如此，則執行額外核對或銷毀不明標籤或在系統資料庫內標記不明標籤)。在一些實施例中，該系統使得能夠藉由將在醫院設施處印刷之標籤的數目記錄至中央資料庫中來進行此核對。

在一些實施例中，該系統使得能夠藉由經由製造入口即時展示細胞療法產品之狀態來實現製造過程之自動化。該狀態可包括當前過程、與前一過程相關之品質控制資訊、完成當前過程之預期時間及其類似因素。

一旦基於產品訂單起始製造過程，即在該系統之中央資料庫中更新製造設施處之製造槽的可用性以使得醫院設施能夠更新排程過程。

在一些實施例中，該系統使得能夠實現包括ATC選擇進入之後補名單之早期製造隊列。有利的是，該早期製造隊列使得ATC能夠基於取消及/或再排程對患者治療進行排程，由此使複數個製造設施中製造槽之利用最佳化。

在該早期製造隊列之一例示性實施中，特定ATC可將該ATC有意使用之日期輸入該系統中。視整個製造過程內之任何時間的取消或再排程，彼等日期可變化(亦即，較早或較晚)。因此，舉例而言，若根據特定產品訂單製造細胞療法產品之製造過程因任何原因而終止(例如，患者不再需要細胞療法產品，或細胞療法產品不滿足中間時間點之品質控制參數)，則該系統可使得ATC能夠使用由於終止而變得可用之製造槽且對患者治療較早排程。有利的是，此類早期排程使得患者能夠較早接受治療。

在一些實施例中，該系統亦可自動更新與製造過程所需之供應品相關之庫存資訊，由此當製造槽變得具活性或可用時，促進製造設施之庫存管理。

在一些實施例中，該系統使得能夠生成用於製造之容器的製造標籤。該等製造標籤包括訂單標識符，至少一些資訊包括處理者標識符、品質控制報告(來自前一過程步驟)、批號及其類似資訊。

如同摘取標籤，該等製造標籤可包括呈機器可讀格式之資訊，當製造設施入口要求錄入對應資料時，可掃描該資訊以提取資訊。因此，在一些實施例中，該等製造標籤上之一些或所有資訊可經編碼成一維或二維機器可讀碼，諸如條碼或QR碼。

該系統可使得能夠印刷過程中標籤。例如，該系統可使得能夠印刷欲在啟動性擴增過程之後用於快速擴增過程之容器的標籤。因為細胞數目在製造過程期間傾向於呈指數增加，故快速擴增過程期間之容器數目可大於啟動性擴增過程期間之容器數目。因此，該系統可使得能夠僅印刷欲印刷之對應數目的標籤以便避免過量標籤黏貼於錯誤物件。

在一些實施例中，該系統可要求在生成及/或印刷標籤之前錄入原因碼以使得能夠進行審核及核對。因此，若標籤在無原因或未知原因之情況下經印刷，則製造設施處之人員可試圖銷毀該標籤(在適當標記之後)或可在中央資料庫中將該標籤標記為錯誤的或無關的。在一些實施例中，若未考慮所有實體標籤，則可用偏差關閉該核對(規定未接收一或多個標籤之一或多種原因)。在一些實施例中，若印刷不正確或重複標籤且未加以使用，則該系統自動地標記該事件以在系統中進行跟進及解決，這可能需要製造設施處之案例管理師及/或授權人員之自動查詢以跟進且解決該事件，此舉在一些實施例中要求(由案例管理師或其他人員)在系統中對每個此類經印刷但不使用之標籤進行恢復、破壞及記錄，以便為系統中印刷之每個標籤創建完整的記錄及審核軌跡。此外或替代地，該系統可使得僅授權用戶能夠印刷標籤且僅不同於印刷標籤之授權用戶的授權用戶能夠核對標籤。

在一些實施例中，該系統使得能夠生成及印刷用於最終產品標籤之標籤。因為最終產品經投與至患者，故要求最終產品之標籤包括由FDA或其他對應主管機關規定之資訊。因此，在一些實施例中，該系統使得能夠在標籤上包括法規規定資訊。在一些實施例中，若印刷不正確或重複標籤且未加以使用，則該系統自動地標記該事件以在系統中進行跟進及解決，這可能需要製造設施處之案例管理師及/或授權人員之自動查詢以跟進且解決該事件，此舉在一些實施例中要求(由案例管理師或其他人員)在系統中對每個此類經印刷但不使用之標籤進行恢復、破壞及記錄，以便為系統中印刷之每個標籤創建完整的記錄及審核軌跡。

在一些實施例中，該系統藉由使得能夠或需要在不同製造步驟處掃描標籤而使得能夠提取標籤上提供之資訊。將所提取之資訊與儲存於中央資料庫上之對應資訊進行比較(或針對其進行驗證)以便驗證身份鏈，且保存處理者標識符之記錄(例如，用於監管鏈、品質控制報告、審核報告等)，更新細胞療法產品在整個過程流程內之位置，及其類似步驟，且用時間戳記記錄在案。

在一些實施例中，該系統使得不同製造設施能夠創建用於維持及驗證監管鏈資訊之其自身程序及方案。因此，製造設施可添加或移除監管鏈方案內之特定驗證步驟。因為用於添加或移除驗證步驟之系統邏輯係可複製的，故製造設施可添加或移除該等驗證步驟而不必修改管理監管鏈記錄要求之後端碼。

有利的是，該系統對製造設施施加之記錄及驗證移交以便創建監管鏈記錄之要求亦藉由要求驗證訂單編號(其又與特定患者相關)且在製造過程以及品質控制過程期間之各個步驟中與附接至產品容器之標籤相關而使得能夠維持身份鏈。此外，維持監管鏈之要求藉由防止進一步過程或若任一所提取之資訊不正確則提供警告來防止誤操作，且經由品質控制資訊來提供過程控制資訊。

在一些實施例中，該系統使得製造設施能夠在製造過程中之不同時間點生成及印刷更新之製造標籤，例如，若製造排程存在變化或在製造過程期間之品質控制要求存在變化。在此類實施例中，更新之製造標籤包括與細胞療法產品之品質以及訂單標識符及處理者ID相關之更新資訊以確保維持身份鏈及監管鏈記錄。

在一些實施例中，該系統使得能夠例如基於品質控制資訊來實現製造過程控制。在一些實施例中，該系統可使得能夠基於在各個時間點獲得的品質控制資訊來控制製造過程內之不同步驟之排程。品質控制資訊可包括一或多種分析之結果，例如細胞活力分析、細胞計數、特定細胞表現分析及其類似分析。因此，該系統可使得能夠基於既定時間點之品質控制資訊是否滿足某些標準來修改製造排程。

在一些實施例中，該系統可使得授權用戶能夠在需要時修改製造排程。此外，回應於製造排程之修改，該系統可自動更新庫存資訊、製造槽可用性及運輸排程。此外，該系統可使得授權用戶能夠基於修改之製造排程及修改之運輸排程來修改治療排程且生成修改之治療排程。例如，若在製造過程期間之一些時間點的品質控制結果指示延遲獲得最終細胞療法產品，則製造排程發生變化，且相應地，治療排程及運輸排程亦發生變化。此外或替代地，該系統使得案例管理師或另一授權用戶能夠通知對應當事人關於變化之排程。

在一些實施例中，該系統使得第三方(中間)物流提供者能夠包括於快遞過程中，同時維持監管鏈。在一實例中，所製造之細胞療法產品可由單個運輸器自製造設施運輸至醫院設施，該運輸器在運輸期間使用運輸器自身之追蹤系統來維持監管鏈。該系統可使得能夠與運輸器之追蹤系統同步以允許關係人即時或事後獲得由運輸器之追蹤系統維持的監管鏈記錄。

在另一實例中，製造設施使用中間運輸器將所製造之細胞療法產品運送至由主要運輸器操作之轉運設施，該主要運輸器接著將所製造之細胞療法產品運送至醫院設施。該主要運輸器可使用主要運輸器之追蹤系統，在將細胞療法產品自轉運設施運送至醫院設施期間維持監管鏈。在此類情景中，該系統使得能夠在製造設施與中間運輸器之間的移交及在中間運輸器與主要運輸器之間的移交期間維持監管鏈。換言之，該系統使得能夠在所製造之細胞療法產品在製造設施與醫院設施之間的運送期間在監管鏈中添加一或多個監管環節。有利的是，藉由簡單地使製造設施或主要運輸器能夠在轉運工作流程中添加監管環節對象，可執行一或多個監管環節之添加而不使基礎碼變化。

在一些實施例中，該系統使得能夠實現所製造之細胞療法產品的偶然釋出。在此類實施例中，在獲得最終品質控制測試結果之前運輸細胞療法產品以便使得能夠實現更快周轉時間。該系統可生成運輸標籤，該運輸標籤在此類情況下指示產品釋出為偶然釋出且僅當品質控制報告指示產品準備釋出時，醫院可釋出產品。有利的是，所製造之細胞療法產品的偶然釋出使得能夠與運輸並行地執行品質控制測試。產品之偶然釋出可在有限情況下提供，且若偶然釋出產品，則運輸排程、患者治療排程等相應地發生變化。

在一些實施例中，一旦快遞將所製造之細胞療法產品遞送至醫院設施，則該系統使得能夠向製造設施傳遞通知，指示所製造之細胞療法產品已經遞送至醫院設施。在一些實施例中，該系統可要求醫院人員在簽字接受產品且接受所製造之細胞療法產品的監管之前審查產品且執行某些檢查(例如，驗證運輸容器之溫度，執行某些品質分析，及其類似檢查)。在此類實施例中，該系統僅在醫院人員已接受所製造之細胞療法產品之監管之後向製造設施通知已將所製造之細胞療法產品遞送至醫院設施。

在一些實施例中，該系統與快遞之追蹤系統交互以追蹤所製造之細胞療法產品且獲得即時資訊，例如與轉運中之運輸容器的溫度相關。在此類實施例中，該系統可使得授權用戶能夠在產品轉運時根據轉運延遲來更新或修改患者治療事件之排程。在一些實施例中，該系統基於運輸排程自動地更新患者治療事件之排程。

因為該系統使得能夠記錄自患者登記開始至將所製造之細胞療法產品輸注至患者體內之整個過程期間在每個接觸點的所有事件，故該系統可生成與該過程之任何態樣相關之審核報告。因此，該系統使得能夠進行批號指派、監管鏈驗證及審核、身份鏈驗證及審核。

在一些實施例中，該系統可經修改用於臨床試驗。在此類實施例中，該系統之一或多個態樣可經合適修改以遵從臨床試驗指南。例如，因為臨床試驗通常傾向於為雙盲對照試驗，故如針對該等臨床試驗經修改之系統可能不包括患者攝入過程。此外，因為臨床試驗可包括實驗製造方案，故製造工作流程(例如，針對各個過程步驟之時間點、所需品質控制分析及對應參數及標準及其類似因素)可針對如針對該等臨床試驗經修改之系統進行修改。儘管如此，用於臨床試驗之系統可包括與本文所述之系統相同的功能，而一些態樣可出於臨床試驗之目的經修改或受到限制。 I. 用於輸入及展示資料之系統界面

詳細參考附圖，其中相同參考數字始終指示相同元件，如所述，在以下附圖中顯示根據本發明之例示性實施例之更新及追蹤患者特異性免疫療法資料之例示性系統及方法。 1. 系統概覽

圖34係系統100之概念性方塊圖，該系統經組態以追蹤資料庫110處之端對端患者特異性免疫療法資料，與各種子系統(醫院設施系統130a、快遞系統130b及製造設施系統130c)通訊，資料庫110經組態以向更新資料之個別入口(例如，登記入口140a、案例管理師入口140b、製造入口140c、手術前入口140d、手術文件記錄入口140e、手術後入口140f及製造接收樣本入口140g)展示患者特異性免疫療法資料且在資料庫110處接收更新之免疫療法資料。在每個個別系統中，追蹤各別患者之COI及COD對於整個過程很重要。

在一實施例中，系統100包括一或多個用戶計算裝置，該一或多個用戶計算裝置具有一或多個處理器及記憶體(例如，一或多個非揮發性儲存裝置)以允許用戶根據本發明之至少一個實施例來更新儲存於資料庫伺服器上之免疫療法資料。在一些實施例中，記憶體或記憶體之計算機可讀儲存介質儲存程式、模塊及資料結構或其子集，以供處理器控制及運行本文所揭示之各種系統及方法。在一實施例中，一種非暫時性計算機可讀儲存介質，其上儲存有計算機可執行指令，當由處理器執行時，該等指令執行一或多種本文所揭示之方法。

在以下論述中，計算系統包括處理器、顯示器及所述之輸入裝置。應理解，該輸入裝置可為與計算系統相關之任何習知輸入裝置，諸如物理鍵盤、觸敏顯示器、鼠標、操縱桿、麥克風、語音識別裝置或遙控器。

伺服器110 (例如，IovanceCares資料庫及處理器)在以下描述中經提及；應理解，伺服器係指向其他裝置(包括但不限於其他伺服器及客戶端計算裝置)提供資料之計算裝置。伺服器110可經由互聯網上之區域網路(LAN)或廣域網路(WAN)以及其他資料傳遞介質傳遞資料。伺服器110可提供本文所述之不同服務且包括能夠提供彼等服務之軟體。伺服器110亦可託管適合傳遞多個UI、認證用戶及更新免疫療法資料之軟體。伺服器110亦可託管適合傳遞及接收患者特異性免疫療法資料物質資料且執行計算之軟體。術語「發送」及「傳遞」可在整個說明書中互換使用。伺服器110可包括用於構建一系列患者特異性免疫療法資料入口(例如，登記入口140a、案例管理師入口140b、製造入口140c、手術前入口140d、手術文件記錄入口140e、手術後140f及製造接收樣本入口140g)之軟體。

在一些實施例中，伺服器110包括用於儲存免疫療法資料之資料庫及一或多個用於更新(例如，添加、編輯、刪除)儲存於伺服器110上之免疫療法資料之用戶計算系統。伺服器110可包括一或多個用於儲存免疫療法資料之儲存裝置。該一或多個儲存裝置可包括硬驅動機、固態驅動機或任何其他形式之計算機儲存裝置。在一些實施例中，伺服器110可包括通訊模塊以允許資料庫伺服器同時向多個用戶子系統130a-c傳遞資料及自其接收資料。為了便於描述本發明之實施例，應假設一個用戶正在使用一個用戶計算系統來存取儲存於伺服器110上之資訊。然而，各自使用不同用戶計算系統之多個用戶可同時存取儲存於伺服器110上之資訊。伺服器110可自不同用戶計算系統接收更新之免疫療法資料。

在一些實施例中，系統100包括一或多個與伺服器110通訊之用戶計算系統。該等用戶計算系統可由個別入口(例如，登記入口)及/或一或多個資料庫機構之用戶使用，以存取儲存於資料庫上之患者特異性免疫療法資料。如上文所提及，為了便於描述，自與單一用戶計算系統相互作用之單一用戶的角度描述本發明實施例。用戶可在用戶計算系統中提供對應於諸如請求存取患者特異性免疫療法資料物質資料、編輯患者特異性免疫療法資料及添加新的患者特異性免疫療法資料之行動的用戶輸入。回應於用戶輸入，該用戶計算系統可將對應於用戶輸入之請求傳遞至伺服器110。回應於在伺服器110處自該用戶計算系統接收該請求，伺服器110可將資料(例如，與特定患者特異性免疫療法資料相關之UI)傳遞至該用戶計算系統。回應於自伺服器110接收所傳遞之資料，該用戶計算系統接著可經由顯示器向用戶展示資料。

參考圖34，伺服器110亦可由具有管理或權威權限之用戶(例如，資料庫機構)存取。如上文所提及，系統100允許多個用戶在一些情況下同時更新患者特異性免疫療法資料資訊以供審查。在一些實施例中，資料庫機構用戶能夠審查及批准/反對由用戶進行之更新。在一些實施例中，若資料庫機構批准由用戶進行之更新，則更新之資訊在伺服器110中替代當前資訊。在一些實施例中，若資料庫機構反對由用戶進行之更新，則維持伺服器110中之當前資訊。在一些實施例中，系統100不要求資料庫機構審查及批准/反對更新之資訊。在一些實施例中，系統100可允許多個用戶同時進行編輯且添加與患者特異性免疫療法資料物質相關之錄入，而無需多個本地副本保存。

圖37A-37K繪示由醫院用戶更新各別患者之登記資料且提交與各別患者有關之腫瘤樣本摘取訂單的方法，經由一系列例示性UI (例如，登錄界面200、登記界面202、選擇指示界面204)步進。圖37A-37K中所繪示及圖39-46中稍後繪示之走查發生於授權用戶已獲得對系統100之存取權限之後。各獨特UI (例如，圖37A-37H及40A-40K、41A-41C及42中示出之醫院設施UI及圖39A-39E及45A-45C中之製造設施UI，要求授權存取)。該等UI可展示於用戶計算系統之顯示器上。

參考圖37A，示出登錄界面200，其可經組態以請求授權醫院用戶之憑證(例如，醫院用戶之用戶名稱及密碼)，該等憑證由系統後端接收。

在圖37B中，示出登記UI 202，其中圖37A中之授權用戶已對系統100進行存取。登記UI 202可經組態以請求授權用戶(例如，用戶130)、患者名字(例如，Demo)、患者姓、患者性別、患者出生日期、治療醫師、授權治療中心及醫院患者ID。在接收針對登記UI 202描述之所有所需資料後，登記界面存取方案生成圖37C中所示之選擇指示UI 204。

選擇指示UI 204係經組態以接收請求：選擇指標，包含黑色素瘤或其他。回應於在選擇指示UI 204中由授權用戶接收所有所需資料之用戶輸入，生成請求上傳之文件UI 208 (如圖37D中所示)。請求上傳之文件UI 208包括請求一或多個患者同意書及一或多個採購單表格。

在由請求上傳之文件UI 208之授權用戶接收所有所需資料後，可生成審查支持UI 210及UI 212。審查支持UI 210及212 (圖37E-37F中示出)係經組態以包括福利驗證、事先授權、上訴協助、患者支持、患者參與及一般查詢。可選擇退出審查支持UI 210及UI 212且無需履行，其中選擇退出系統自動地轉移至圖37G之備用提貨交付界面218。

備用提貨及交付界面218係經組態以包括提貨日期、提貨時間(例如，針對提貨時間設定正常預定範圍)及腫瘤樣本摘取外科醫師。腫瘤摘取外科醫師為授權之經訓練腫瘤摘取外科醫師(例如，該系統可能不接受未經訓練之腫瘤摘取外科醫師作為輸入)。視所選擇之提貨日期而定，在提貨及交付界面218生成相關交付日期。該交付日期並非週末日期。在一些實施例中，若由該系統生成之相關交付日期係晚於所需之相關交付日期的日期，則生成選擇進入後補名單選項。

圖37H中之審查提貨及交付界面UI 220係經組態以審查在備用提貨及交付UI 218中接收之提貨日期的腫瘤樣本提貨之設施選擇且亦審查在提貨及交付UI 218中生成之腫瘤樣本交付日期的腫瘤樣本脫落之設施選擇。

提貨及交付界面UI 220亦經組態以審查在登記UI 202、選擇指示UI 204請求上傳之文件UI 208、接收支持UI 212、備用提貨及交付界面UI 218中之腫瘤樣本訂單的資料輸入，且在審查資料之後提交確認。

圖38A-38D繪示用於由案例管理師用戶批准腫瘤樣本摘取訂單且基於該批准訂單生成請求批號之方法的例示性UI，經由一系列例示性UI (例如，案例管理師批准UI 300)步進。

參考圖38A及圖38B，示出案例管理師批准UI 300及訂單狀態確認UI 302，用於批准生成之腫瘤樣本訂單及生成之快遞訂單(例如，在圖37A-37K中針對患者Demo生成之訂單)以遞送腫瘤樣本，包括追蹤編號。參考圖38C，示出案例管理師批准請求UI 204。參考圖38D，示出生成批號UI 306之請求，該請求係基於案例管理師批准訂單生成的。

圖39A-39E繪示製造設施用戶之例示性UI，用於指派圖38D中由案例管理師用戶生成的請求批號，經由一系列例示性UI (例如，製造設施訂單清單UI 400、需要驗證之批次UI 402、等待驗證UI 404、製造設施驗證UI 406)步進，且驗證所指派之請求批次訂單。參考圖39B，需要驗證之批次UI 402係經組態以包括：由案例管理師批准界面生成之請求批次訂單，且狀態UI 404係經組態以包括所指派之批次訂單的狀態。參考圖39C，批次記錄包括用於輸入或展示在各個時間點(例如，第11天、第16天及第22天)獲自在彼等時間點執行之品質控制分析的品質資訊之欄位。在一些實施例中，在如圖39D中之驗證UI 406所示驗證請求批次訂單後，生成成功驗證，如圖39E中之成功驗證UI 408所示。

圖40A-40K繪示治療設施用戶之例示性UI，用於追蹤手術前、手術及手術後期間之身份鏈及監管鏈，經由一系列例示性UI (例如，登錄界面500、主要腫瘤樣本摘取UI 502等)步進。

圖40A係用於腫瘤樣本摘取之登錄界面500。登錄界面500要求用戶藉由治療設施用戶(例如，醫師)鑑定治療設施位置(例如，USC、Westwood、Santa Monica等)。

圖40B為主要腫瘤樣本摘取UI 502，其包括各別患者名稱、與特定患者相關之醫院患者ID、腫瘤樣本提貨日期、培養基製備、手術及打包及運輸。在此實例中，日期遵從圖37A-39E中之患者Demo。因而，腫瘤樣本提貨日期係在提貨及交付界面218生成之日期。重要的是，腫瘤摘取界面始終追蹤手術前、手術及手術後身份鏈及監管鏈。

圖40C繪示培養基製備界面504。任何檢視培養基製備之用戶均無法編輯圖40C中所示之培養基製備界面，除非他們主張患者之所有權(例如，藉由選擇主張所有選圖標501a，且結果，獲得特定患者之「監管鏈」)。在一些實施例中，其他用戶均不可編輯培養基製備界面，除非他們具有特定患者之監管鏈。當患者處於當前監管鏈下時，另一用戶不能對特定患者主張所有權，除非藉由移除所有權圖標602來移除當前監管鏈(例如，監管鏈屬於已主張所有權之用戶且在移除所主張之所有權之前不能主張監管鏈)。該系統之後端追蹤監管鏈及身份鏈報告。因而，在所有時間，該系統均知曉誰已在治療中心完成包括培養基製備等之關鍵步驟。

參考圖40D，示出腫瘤樣本摘取UI 506，其包括套組交付地址。在一些實施例中，套組交付地址係指示自何處交付套組之地址(例如，如所示，Westwood位置之套組地址)。一旦已使用套組，該系統即及時匹配，為治療中心交付另一培養基套組。

在用戶選擇印刷標籤選項後，將用於腫瘤樣本之標籤(例如，欲置於腫瘤樣本上)及運輸標籤(例如，欲置於運送腫瘤樣本之奈米冷卻器上)印刷於一個模板上，兩者均顯示於圖40E中。圖40E係腫瘤樣本標籤508之實例及置於奈米冷卻器上之運輸標籤510之實例。

運輸標籤510具有含有特定患者之腫瘤樣本之腫瘤樣本奈米冷卻器的運輸地址以及兩個獨特標識符。第一個獨特標識符為COI編號且第二個獨特標識符為醫院患者ID。

在一些實施例中，基於同時在運輸標籤上指示之COI編號及醫院患者ID，腫瘤樣本與特定患者(例如，圖37B中所示之患者Demo)相關。

圖40F繪示根據一些實施例用於印刷圖40E中所示之額外腫瘤運輸標籤之界面512。若用戶已例如錯放初始運輸標籤(40E中所示)，則可印刷額外腫瘤運輸標籤。在印刷額外運輸標籤後，可向攝入單元通知已印刷兩個腫瘤運輸標籤。額外的腫瘤運輸器應在盒中，若標籤未在盒中，則需要起始核對過程，這將在圖45C中之品質步驟中加以解釋。

參考回圖40D，腫瘤摘取UI 506亦包括兩種試劑：正大黴素(0.5)、兩性黴素(1.0 ml) (例如，接著將該等試劑置於其中置放腫瘤組織之hypothermosol瓶中)。如所示，對於正大黴素、兩性黴素及hypothermosol，記錄其各自批號及截止日期。批號可與特定位置相關。例如，針對正大黴素輸入之批號與取回正大黴素之特定位置相關。同樣，兩性黴素之批號與取回兩性黴素之特定位置相關，且hypothermosol之批號與取回hypothermosol之特定位置相關。此舉允許該系統精確地追蹤試劑在使用之前位於何處(例如，該等試劑含於哪個冰箱或冷凍機中)。同樣，記錄各正大黴素、兩性黴素及hypothermosol之截止日期。該系統能夠偵測是否輸入在記錄日期之前的截止日期。腫瘤摘取UI 506要求確認試劑根據標準化程序進行儲存及記錄且標籤已得到驗證。

追蹤製備培養基之日期及時間(例如，以確保培養基未在截止時間框內截止)。當攝入發生時，操作員經訓練，以檢查截止日期係在截止時間框內。中心提供DIN (供體ID編號)，即醫院指派之編號，該DIN編號經指派至最終產品標籤，準備運輸至中心，且由該系統生成且應用於最終產品袋。

圖40I、圖40J及圖40K繪示治療設施驗證用戶之例示性UI，用於驗證手術前過程期間圖40A-40H中生成之記錄，經由一系列例示性UI步進。

在一些實施例中，驗證用戶在手術前步驟期間陪伴用戶完成資料(圖40A-40H)，接著在審查UI 520對其進行審查且在驗證UI 520記錄驗證。一旦在培養基製備界面驗證該記錄，無法在系統中返回。後端COI及COC報告界面追蹤到培養基製備由特定用戶進行且驗證由不同的授權用戶進行，其中培養基製備用戶及驗證用戶不同。

圖41A-41C繪示醫院治療設施處之例示性手術文件記錄UI (例如，手術文件記錄入口140e)，經由一系列例示性UI (例如，手術文件記錄UI 600、驗證步驟UI 602)步進。圖41A為例示性手術文件記錄UI 600，其中用戶(例如，外科醫師)將首先主張所有權，如藉由移除所有權圖標601所示(例如，由於已主張所有權，該圖標現已發生變化以移除所有權601，因為在手術文件記錄UI 600中記錄之各別用戶已經授予對各別患者之COC)。如先前所解釋，當主張所有權時，其他用戶無法編輯手術文件記錄UI。在主張所有權後，用戶可經引導至圖41B中所繪示之額外驗證步驟。

圖41B繪示用於手術文件記錄之驗證步驟UI 602，其要求主張所有權之用戶輸入位於hypothermosol瓶上之COI。在一些實施例中，此驗證步驟UI 602防止未適當存取治療介質(例如，hypothermosol瓶)之用戶對手術文件記錄UI 602進行存取。

返回圖41A，手術文件記錄UI 600係經組態以向用戶請求：運送至手術室(OR)之培養基、在OR中接收之培養基、腫瘤摘取外科醫師、培養基標籤上的患者資訊與腕帶匹配、腫瘤摘取開始時間(例如，日期及時間)、腫瘤摘取結束時間(例如，日期及時間)、病變經摘取之腫瘤摘取遏制詳情、病變類型、病變位置、驗證步驟(例如，已獲得用於TIL分離/製造之至少1.5 cm、但不超過4.0 cm直徑(聚集體)之理想活腫瘤量？取得腫瘤之手術中冷凍切片或活組織檢查以確認惡性細胞存在、最後一個腫瘤置於hypothermosol中之時間、使用無菌技術來修剪腫瘤樣本、封閉腫瘤樣本瓶且用石蠟包裹蓋子)。在一些實施例中，若患者標識符不匹配，則UI 600要求用戶停止。一旦提交手術文件記錄，與提交該手術文件記錄之用戶不同的驗證用戶可登錄且驗證圖41A及圖41C中提及之資料。

圖42繪示用於打包治療設施處之文件記錄之例示性手術後UI (例如，手術後入口140f)，經由一系列例示性UI (例如，打包及文件記錄UI 700)步進。如先前UI (例如，手術文件記錄UI 600)所指示，授權用戶必須主張所有權701，之後該用戶接著嘗試輸入位於hypothermosol瓶上之COI。僅在打包及文件記錄UI 700主張對打包及文件記錄過程之所有權的用戶可編輯打包及文件記錄UI 700。打包及文件記錄UI 700可經組態以請求以下資料：溫度監測器讀取(例如，奈米冷卻器中之溫度監測器裝置，連接至患者)及相關截止日期、與各別患者及相關截止日期相關之奈米冷卻器。

打包及文件記錄UI 700可包括針對用戶將腫瘤樣本包裝於由第三方提供之奈米冷卻器中的額外指令。黏貼於奈米冷卻器之標籤為患者特異性的(例如，患者之COI位於奈米冷卻器上)。打包及文件記錄UI 700係經組態以確認腫瘤樣本容器及運輸標籤上之患者資訊與患者記錄匹配。打包及文件記錄UI 700亦經組態以使主張打包及文件記錄UI 700之所有權的用戶確認：奈米冷卻器經啟動且標籤經掃描，密封奈米冷卻器且黏貼運輸器標籤、用腫瘤樣本完成奈米冷卻打包之時間、確保已印刷正確的快遞提單、生成運貨單。

在一些實施例中，在點擊運貨單鏈接後，用戶可生成圖43所示之運貨單標籤800，具有與特定患者相關之特定COI。運貨單標籤800亦包括治療設施資料。一旦由用戶提交打包及文件記錄，經驗證用戶(例如，不同於完成打包及文件記錄UI 700之用戶)必須驗證在打包及文件記錄UI 700中提交之所有資料。

圖44繪示自培養基製備(例如，圖40B中之主要腫瘤樣本摘取UI 502)至打包Crēdo Cube™或奈米冷卻器(例如，打包及文件記錄UI 700)之COI及COC報告900；所有後端資料均在COI及COC報告中進行追蹤。記錄每個步驟之文件記錄及驗證過程。

圖45A繪製在製造設施處接收腫瘤樣本進行擴增後之製造設施UI 1000。在接收腫瘤樣本後，最終產品狀態1001可讀取「快遞遞送之起始材料」。圖45B繪示在掃描運輸腫瘤樣本之奈米冷卻器上之QR碼後之第二製造設施UI 1010，最終產品狀態1001可讀取「倉庫接收之起始材料」。圖45C繪示用於品質用戶之製造品質設施UI 1020，以指示腫瘤樣本具有製造品質。在此例示性製造品質設施UI 1020中，發生標籤核對。在一些實施例中，要求將額外腫瘤樣本運輸標籤發送回製造設施。在一些實施例中，核對UI 1020中所示之所有標籤。在一些實施例中，標籤核對為品質事件而非COC事件。

圖46繪示登入後端(例如，資料庫110)中之腫瘤樣本掃描。資料可包括設施、CMO、MFU -製造用戶、MQU -製造品質用戶、品質。該系統係經設計用於靈活性，隨著製造過程發生變化，可併入額外掃描(例如，2級)。實例

現參考以下實例描述本文所涵蓋之實施例。此等實例僅出於說明目的而提供，且本文所涵蓋之揭示內容絕不應解釋為限於此等實例，而應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得明顯的任何及所有變化。 A. 實例 1 ：用於 REP 前及 REP 過程之培養基製備

此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基用於涉及培養源自各種實體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方案。此培養基可用於製備本申請案及其他實例中所述之任何TIL。 1.CM1之製備。

自冷藏庫中移出以下試劑且使其在37℃水浴中加溫：(RPMI1640、人類AB血清、200 mM L-麩醯胺)。根據下表34製備CM1培養基，其中將各成分添加至適合欲過濾之體積的0.2 µm過濾單元之頂部部分中。儲存於4℃下。表34. CM1之製備

成分	最終濃度	最終體積500 mL	最終體積IL
RPMI1640	NA	450 mL	900 mL
人類AB血清、熱不活化10%	50 mL	100 mL
200 mM L-麩醯胺	2 mM	5 mL	10 mL
55 mM BME	55 µM	0.5 mL	1 mL
50 mg/mL硫酸正大黴素	50 µg/mL	0.5 mL	1 mL

在使用當日，在37℃水浴中預加溫所需量之CM1且添加6000 IU/mL IL-2。

可根據表35視需要執行額外補充。表35. CM1之額外補充，視需要。

補充物	儲備液濃度	稀釋	最終濃度
GlutaMAXTM	200 mM	1:100	2 mM
青黴素/鏈黴素	10,000 U/mL青黴素 10,000 µg/mL鏈黴素	1:100	100 U/mL青黴素 100 μg/mL鏈黴素
兩性黴素B	250 µg/mL	1:100	2.5 µg/mL

2.CM2之製備

自冰箱中移出所製備之CM1或製備新鮮CM1。自冰箱中移出AIM-V®且藉由在無菌培養基瓶中使所製備之CM1與相等體積之AIM-V®混合物來製備所需之量的CM2。在使用當日，將3000 IU/mL IL-2添加至CM2培養基中。在使用當日，用3000 IU/mL IL-2製得足量CM2。在CM2培養基瓶上標明其名稱、製備者之姓名首字母、其過濾/製備日期、兩週截止日期且儲存於4℃下直至需要進行組織培養。 3.CM3之製備

在需要使用CM3當日，製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，在使用當日補充3000 IU/mL IL-2。藉由將IL-2儲備溶液直接添加至AIM-V瓶或袋中來製備足以滿足實驗需要之量的CM3。藉由輕微震盪來充分混合。在添加至AIM-V中之後立即在瓶上標明「3000 IU/mL IL-2」。若存在過量CM3，則將其儲存於4℃下之瓶中，標明培養基名稱、製備者之姓名首字母、培養基之製備日期及其截止日期(製備之後7天)。在4℃下儲存7天之後，棄去補充有IL-2之培養基。 4.CM4之製備

CM4與CM3相同，具有2 mM G1utaMAX™ (最終濃度)之額外補充物。對於每1 L CM3，添加10 mL 200 mM GlutaMAX™。藉由將IL-2儲備溶液及GlutaMAX™儲備溶液直接添加至AIM-V瓶或袋中來製備足以滿足實驗需要之量的CM4。藉由輕微震盪來充分混合。在添加至AIM-V中之後立即在瓶上標明「3000 IL/mL IL-2及GlutaMAX」。若存在過量CM4，則將其儲存於4℃下之瓶中，標明培養基名稱、「G1utaMAX」及其截止日期(製備之後7天)。在4℃下儲存超過7天之後，棄去補充有IL-2之培養基。 B. 實例 2 ：使用 IL-2 、 IL-15 及 IL-21 細胞介素混合液

此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素，該等細胞介素用作額外T細胞生長因子，與本文任何實例之TIL過程組合。

使用本文所述之過程，TIL可在該實驗之一組中在IL-2存在下自腫瘤生長且在另一組中在培養起始時由IL-2、IL-15及IL-21之組合替代IL-2。在REP前完成時，評估培養物之擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCR Vβ譜系。IL-15及IL-21描述於本文中別處及Santegoets 等人 , J. Transl. Med., 2013, 11,37中。

結果可顯示，相對於僅IL-2條件，可在IL-2、IL-15及IL-21處理之條件下觀察到CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞中增強之TIL表現(＞20%)。相對於僅IL-2培養物，在獲自IL-2、IL-15及IL-21處理之培養物的TIL中，朝向以CD8 ⁺群體為主偏斜，具有偏斜TCR Vβ譜系。與僅IL-2處理之TIL相比，IFN- γ及CD107a在IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中升高。 C. 實例 3 ：限定 γ 照射之周邊單核細胞的個別批次

此實例描述用於限定γ照射之周邊單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞或MNC)的個別批次之簡化程序，以在本文所述之例示性方法中用作同種異體餵養細胞。

由個別供體製備各經照射MNC餵養批次。個別地篩選各批次或供體在經純化抗CD3 (純系OKT3)抗體及介白素-2 (IL-2)存在下在REP中擴增TIL之能力。此外，在不添加TIL之情況下測試各批次之餵養細胞以驗證所接收之γ輻射劑量足以使其複製不能。

TIL之REP需要γ照射、生長遏制之MNC餵養細胞。餵養MNC上之膜受體與抗CD3 (純系OKT3)抗體結合且與REP燒瓶中之TIL交聯，從而刺激TIL擴增。由取自個別供體之全血的白細胞單采製備餵養批次。在Ficoll-Hypaque上對白細胞單采產物進行離心，洗滌，照射，且在GMP條件下冷凍保存。

重要的是，接受TIL療法之患者不能輸注活的餵養細胞，因為此舉可導致移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，藉由對餵養細胞給予γ照射使該等細胞受到生長遏制，導致雙股DNA斷裂，且在再培養後導致MNC細胞之細胞活力喪失。

依兩個標準評估餵養批次：(1)其在共培養中使TIL擴增＞100倍之能力，及(2)其複製不能。

利用在直立的T25組織培養燒瓶中生長之兩種主要REP前TIL株，以微型REP格式測試餵養批次。針對兩種獨特TIL株來測試餵養批次，因為各TIL株回應於REP中之活化而增生之能力係獨特的。作為對照，與測試批次一起運行多個經照射MNC餵養細胞，該等細胞歷來已顯示滿足標準。

為了確保單一實驗中所測試之所有批次均接收同等測試，可獲得足夠的相同REP前TIL株備料以測試所有條件及所有餵養批次。

對於所測試之餵養細胞的每一批次，存在共計六個T25燒瓶：REP前TIL株#1 (2個燒瓶)；REP前TIL株#2 (2個燒瓶)；及餵養對照(2個燒瓶)。含有TIL株#1及#2之燒瓶評估餵養批次擴增TIL之能力。餵養對照燒瓶評估餵養批次之複製不能。 1.A. 實驗方案

第-2/3天，使TIL株解凍。製備CM2培養基且在37℃水浴中加溫CM2。製備40 mL補充有3000 IU/mL IL-2之CM2。保持加溫直至使用。將20 mL不含IL-2之預加溫CM2置於兩個50 mL錐形管中之每一者中，該等錐形管標明所用TIL株之名稱。自LN2倉庫移出兩種指定REP前TIL株且將小瓶轉移至組織培養室中。藉由將小瓶置於37℃水浴中之密封拉鏈儲存袋中直至少量冰殘留來使小瓶解凍。

使用無菌轉移移液管，立即將每個小瓶之內含物轉移至所準備之經標記50 mL錐形管中之20 mL CM2中。使用不含IL-2之CM2 QS至40 mL以洗滌細胞，且在400 × CF下離心持續5分鐘。吸出上清液且再懸浮於補充有3000 IU/mL IL-2之5 mL溫CM2中。

移出小等分試樣(20 µL)，一式兩份，以使用自動化細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。當計數時，將具有TIL細胞之50 mL錐形管置於潮濕37℃、5% CO ₂培育箱中，鬆開蓋子以允許氣體交換。確定細胞濃度，且將TIL以1 × 10 ⁶個細胞/mL稀釋至補充有3000 IU/mL IL-2之CM2中。

在潮濕37℃培育箱中，在24孔組織培養板中之視需要足夠多的孔中以2 mL/孔進行培養，直至微型REP之第0天。在獨立24孔組織培養板中培養不同TIL株以避免混淆及潛在交叉污染。

起始微型REP。製備足夠CM2培養基，以滿足欲測試之餵養批次之數目。( 例如，為了一次性測試4個餵養批次，製備800 mL CM2培養基)。將上文所製備之CM2的一部分等分且對其補充3000 IU/mL IL-2以培養細胞。( 例如，為了一次性測試4個餵養批次，製備具有3000 IU/mL IL-2之500 mL CM2培養基)。

單獨處理每個TIL株以防止交叉污染，將具有TIL培養物之24孔板自培養箱中移出且轉移至BSC。

使用無菌轉移移液管或100-1000 µL移液器及尖端，自每孔中欲使用之TIL中移出約1 mL培養基且置於24孔組織培養板中未使用之孔中。

使用新鮮無菌轉移移液管或100-1000 µL移液器及尖端，使剩餘培養基與孔中之TIL混合以使細胞再懸浮且接著將細胞懸浮液轉移至表明TIL批次名稱之50 mL錐形管中且記錄體積。

用保存之培養基洗滌該等孔且將彼體積轉移至同一50 mL錐形管中。使細胞在400 × CF下旋轉以收集細胞集結粒。吸出培養基上清液且使細胞集結粒再懸浮於2-5 mL含有3000 IU/mL IL-2之CM2培養基中，欲使用之體積基於所收集之孔的數目及集結粒大小—體積應足以確保＞1.3 × 10 ⁶個細胞/mL之濃度。

使用血清移液管，使細胞懸浮液充分混合且記錄體積。移出200 µL以使用自動化細胞計數器獲得細胞計數。當計數時，將具有TIL細胞之50 mL錐形管置於潮濕5% CO ₂、37℃培育箱中，鬆開蓋子以允許氣體交換。記錄計數。

自培養箱中移出含有TIL細胞之50 mL錐形管且使其細胞以1.3 ×10 ⁶個細胞/mL之濃度再懸浮於補充有3000 IU/mL IL-2之CM2中。將50 mL錐形管放回培養箱中並鬆開蓋子。

針對第二TIL株，重複以上步驟。

就在將TIL接種於T25燒瓶中進行實驗之前，如下將TIL 1:10稀釋至1.3 × 10 ⁵個細胞/mL之最終濃度。

製備MACS GMP CD3純(OKT3)工作溶液。自4℃冰箱中取出OKT3 (1 mg/mL)儲備溶液且置於BSC中。30 ng/mL OKT3之最終濃度用於微型REP之培養基中。

該試驗之每個T25燒瓶中20 mL需要600 ng OKT3；這相當於每20 mL 60 µL 10 µg/mL溶液，針對每個餵養批次測試之所有6個燒瓶為360 µL。

針對所測試之每個餵養批次，製備400 µL 1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液以達成10 µg/mL之工作濃度( 例如，為了一次性測試4個餵養批次，製備1600 µL 1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液：16 µL 1 mg/mL OKT3 + 1.584 mL具有3000 IU/mL IL-2之CM2培養基。)

製備T25燒瓶。在製備餵養細胞之前，對各燒瓶進行標記且用CM2培養基填充燒瓶。將燒瓶置於37℃潮濕5% CO ₂培育箱中以使培養基保溫，同時等待添加剩餘組分。一旦製得餵養細胞，即將該等組分添加至每個燒瓶中之CM2中。

進一步資訊提供於表36中。表36. 溶液資訊。

組分	共培養燒瓶中之體積	對照(僅餵養細胞)燒瓶中之體積
CM2 + 3000 IU/mL IL-2	18 mL	19 mL
MNC：1.3 × 10 ⁷/mL於CM2 + 3000 IU IL-2中 (最終濃度為1.3 × 10 ⁷/燒瓶)	1 mL	1 mL
OKT3：10 μL/mL於CM2中= 3000 IU IL-2	60 μL	60 μL
TIL：1.3 × 10 ⁵/mL於CM2 + 3000 IU IL-2中 (最終濃度為1.3 × 10 ⁵/燒瓶)	1 mL	0

製備餵養細胞。針對此方案所測試之每個批次需要最少78 × 10 ⁶個餵養細胞。藉由SDBB冷凍之每1 mL小瓶在冷凍後具有100 × 10 ⁶個活細胞。假設自液體N ₂倉庫中解凍後存在50%恢復，推薦每批次解凍至少兩個1 mL小瓶之餵養細胞，估計每個REP存在100 × 10 ⁶個活細胞。或者，若在1.8 mL小瓶中供應，則僅一個小瓶提供充足餵養細胞。

在使餵養細胞解凍之前，針對欲測試之每個餵養批次，預加溫大約50 mL不含IL-2之CM2。自LN2倉庫中移出指定餵養批次小瓶，置於拉鏈儲存袋中，且置於冰上。藉由浸沒於37℃水浴中使小瓶在拉鏈儲存袋中解凍。自拉鏈袋中移出小瓶，用70% EtOH噴霧或擦拭，且轉移至BSC。

使用轉移移液管，立即將餵養小瓶之內含物轉移至50 mL錐形管中之30 mL溫CM2中。用小體積之CM2洗滌小瓶以移除小瓶中之任何殘餘細胞且在400 × CF下離心持續5分鐘。吸出上清液且再懸浮於4 mL溫CM2加3000 IU/mL IL-2中。移出200 µL以使用自動化細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。

使細胞以1.3 × 10 ⁷個細胞/mL再懸浮於溫CM2加3000 IU/mL IL-2中。將TIL細胞自1.3 × 10 ⁶個細胞/mL稀釋至1.3 × 10 ⁵個細胞/mL。

設置共培養。將TIL細胞自1.3 × 10 ⁶個細胞/mL稀釋至1.3 × 10 ⁵個細胞/mL。將4.5 mL CM2培養基添加至15 mL錐形管中。使用10 mL血清移液管自培育箱中移出TIL細胞且使其充分再懸浮。自1.3 × 10 ⁶個細胞/mL TIL懸浮液中移出0.5 mL細胞且添加至15 mL錐形管中之4.5 mL培養基中。將TIL儲備小瓶放回培育箱。使其充分混合。針對第二TIL株進行重複。

將用於單一餵養批次之具有預加溫之培養基的燒瓶自培育箱轉移至BSC。藉由用1 mL移液管尖端上下吸移數次使餵養細胞混合且將1 mL (1.3 × 10 ⁷個細胞)轉移至用於彼餵養批次之各燒瓶。將60 µL OKT3工作儲備液(10 µg/mL)添加至各燒瓶中。將兩個對照燒瓶放回培育箱。

將1 mL (1.3 × 10 ⁵)各TIL批次轉移至相應經標記之T25燒瓶。將燒瓶放回培育箱且直立培育。未進行打擾，直至第5天。針對所測試之所有餵養批次重複此程序。

第5天，培養基更換。製備具有3000 IU/mL IL-2之CM2。各燒瓶需要10 mL。使用10 mL移液管，將具有3000 IU/mL IL-2之10 mL溫CM2轉移至各燒瓶。將燒瓶放回培育箱且直立培育，直至第7天。針對所測試之所有餵養批次進行重複。

第7天，收集。自培育箱中移出燒瓶且轉移至BSC，小心不打擾燒瓶底部之細胞層。不打擾在燒瓶底部生長之細胞，自各測試燒瓶移出10 mL培養基且自各對照燒瓶移出15 mL培養基。

使用10 mL血清移液管，使細胞再懸浮於剩餘培養基中且充分混合以打碎任何細胞塊。在藉由移液使細胞懸浮液充分混合之後，移出200 µL用於細胞計數。使用適當標準操作程序以及自動化細胞計數器設備對TIL計數。記錄第7天之計數。針對所測試之所有餵養批次重複此程序。

評估餵養對照燒瓶之複製不能且評估含有TIL之燒瓶自第0天開始的擴增倍數。

第7天，繼續餵養對照燒瓶至第14天。在完成餵養對照燒瓶之第7天計數之後，將15 mL含有3000 IU/mL IL-2之新鮮CM2培養基添加至各對照燒瓶中。將對照燒瓶放回培育箱且在直立位置處培育，直至第14天。

第14天，延長餵養對照燒瓶之非擴增。自培育箱中移出燒瓶且轉移至BSC，小心不打擾燒瓶底部之細胞層。不打擾在燒瓶底部生長之細胞，自各對照燒瓶移出大約17 mL培養基。使用5 mL血清移液管，使細胞再懸浮於剩餘培養基中且充分混合以打碎任何細胞塊。記錄各燒瓶之體積。

在藉由移液使細胞懸浮液充分混合之後，移出200 µL用於細胞計數。使用適當標準操作程序以及自動化細胞計數器設備對TIL計數且記錄計數。針對所測試之所有餵養批次重複此程序。 2.結果及接受標準方案

結果。γ照射之劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批次均滿足評估標準且亦證實與第0天相比，在REP培養之第7天剩餘之餵養細胞的總活細胞數目減少。預期所有餵養批次均滿足截至REP培養之第7天TIL生長擴增100倍之評估標準。預期餵養對照燒瓶之第14天計數繼續在第7天可見之非增生趨勢。

接受標準。對於各批次之餵養細胞所測試的各複製TIL株，滿足以下接受標準。接受標準為兩倍，如下表37所示。表37. 接受標準之實施例。

測試	接受標準
對MNC之照射及複製不能	在7及14天未觀察到生長
TIL擴增	各TIL之至少100倍擴增(最少1.3 × 10 ⁷個活細胞)

當在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養時，評估足以使MNC餵養細胞複製不能之輻射劑量。在REP之第7天及第14天，藉由如自動化細胞計數所確定之總活細胞計數(TVC)來評估複製不能。

接受標準為「無生長」，意謂在第7天及第14天，總活細胞數目相對於在REP之第0天投入培養之初始活細胞數目並未增加。

評估餵養細胞支持TIL擴增之能力。TIL生長係根據自REP之第0天開始培養至REP之第7天的活細胞擴增倍數來量測。在第7天，TIL培養實現最少100倍擴增(亦即，比在REP第0天投入培養之總活TIL細胞數目大100倍)，如藉由自動化細胞計數所評估。

不滿足接受標準之MNC餵養批次的應急測試。若MNC餵養批次不滿足上文所概述之任一接受標準，則將進行以下步驟對該批次進行再測試，以排除簡單的實驗者錯誤為其原因。

若該批次存在兩個或兩個以上剩餘的衛星測試小瓶，則對該批次進行再測試。若該批次存在一個或無剩餘的衛星測試小瓶，則根據上文所列之接受標準，該批次不合格。

為了合格，有關批次及對照批次必須達到上文接受標準。在滿足此等標準後，釋出該批次以供使用。 D. 實例 4 ：製備 IL-2 儲備溶液

此實例描述將經純化、凍乾之重組人類介白素-2溶解至適合用於進一步組織培養方案之儲備樣品中的過程，包括本申請案及實例中所述之所有彼等，包括涉及使用rhIL-2之彼等。

程序。製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29 mL無菌水轉移至50 mL錐形管中。將1 mL 1N乙酸添加至該50 mL錐形管中。藉由將管倒置2-3次使其充分混合。藉由使用Steriflip過濾器過濾使HAc溶液滅菌。

製備含1% HSA之PBS。將4 mL 25% HSA儲備溶液添加至150 mL無菌過濾單元中之96 mL PBS中。過濾溶液。儲存於4℃下。關於每個小瓶所製備之rhIL-2，填寫表格。

製備rhIL-2儲備溶液(6 × 10 ⁶IU/mL最終濃度)。各批次之rhIL-2係不同的且要求製造商分析證書(COA)中可見之資訊，諸如：1)每個小瓶之rhIL-2質量(mg)，2) rhIL-2比活性(IU/mg)，及3)推薦0.2% HAc重構體積(mL)。

藉由使用以下等式來計算rhIL-2批次所要求之1% HSA體積：

例如，根據rhIL-2批次10200121 (Cellgenix)之COA，l mg小瓶之比活性為25 × 10 ⁶IU/mg。其推薦在2 mL 0.2% HAc中重構rhIL-2。

用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶之橡膠塞。使用附接至3 mL注射器之16G針，向小瓶中注射推薦體積之0.2% HAc。小心不要在抽出針時使塞子脫落。將小瓶導致3次且渦旋，直至所有粉末均溶解。小心移出塞子且置於酒精擦拭物上。向小瓶中添加計算體積之1% HSA。

儲存rhIL-2溶液。關於短期儲存(＜72 h)，將小瓶儲存於4℃下。關於長期儲存(＞72 h)，將小瓶等分成較小體積且儲存於-20℃下之冷凍小瓶中直至準備使用。避免冷凍/解凍循環。在製備日期之後6個月截止。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄號、批號、截止日期、操作員姓名首字母、等分試樣之濃度及體積。 E. 實例 5 ：冷凍保存過程

此實例描述使用CryoMed控制速率冷凍器型號7454 (Thermo Scientific)來冷凍保存由本文所述之程序製備的TIL之過程方法。

所用設備如下：鋁卡匣固持器支架(可與CS750冷凍器袋相容)、750 mL袋之冷凍儲存卡匣、低壓(22 psi)液氮槽、冰箱、熱電偶感測器(袋用條帶類型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。

該冷凍過程提供自成核至-20℃之0.5℃速率及1℃/分鐘冷卻速率至-80℃。程式參數如下：步驟1 - 在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min (樣品溫度)至-4℃；步驟3：20.0℃/min (腔室溫度)至-45℃；步驟4：10.0℃/min (腔室溫度)至-10.0℃；步驟5：0.5℃/min (腔室溫度)至-20℃；及步驟6：1.0℃/min (樣品溫度)至-80℃。 F. 實例 6 ：使用成分確定之培養基的腫瘤擴增過程

可用成分確定之培養基(例如，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM, ThermoFisher，包括例如DM1及DM2)取代CM1及CM2培養基來執行上文所揭示之過程。 G. 實例 7 ：冷凍保存之 TIL 細胞療法的例示性 GEN 2 生產

此實例描述Iovance Biotherapeutics, Inc.根據當前良好組織規範及當前良好製造規範在G-REX燒瓶中之TIL細胞療法過程的cGMP製造。此實例描述根據當前良好組織規範及當前良好製造規範在G-REX燒瓶中之TIL細胞療法過程的例示性cGMP製造。表38. 過程擴增例示性規劃。

估算天數(接種後)	活性	目標標準	預期容器	估算總體積(mL)
0	腫瘤解剖	≤ 50個所需腫瘤片段 /G-REX-100MCS	G-REX-100MCS 1個燒瓶	≤1000
11	REP接種	5 - 200 × 106個活細胞/ G-REX-500MCS	G-REX-500MCS 1個燒瓶	≤5000
16	REP分開	1 × 109個活細胞/ G-REX-500MCS	G-REX-500MCS ≤5個燒瓶	≤25000
22	收集	總的可用細胞	3-4個CS-750袋	≤530

表39. 燒瓶體積。

燒瓶類型	工作體積/燒瓶 (mL)
G-REX-100MCS	1000
G-REX-500MCS	5000

第0天CM1培養基製備。在BSC中，將試劑添加至RPMI 1640培養基瓶中。每瓶添加以下試劑：熱不活化人類AB血清(100.0 mL)；GlutaMax™ (10.0 mL)；硫酸正大黴素，50 mg/mL (1.0 mL)；2-巰基乙醇(1.0 mL)

自BSC移除非必需材料。自BSC取出培養基試劑，將硫酸正大黴素及HBSS留在BSC中用於調配洗滌培養基製劑。

使IL-2等分試樣解凍。使一個1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 ⁶IU/mL) (BR71424)解凍，直至所有冰均已融化。記錄IL-2：批號及截止

將IL-2儲備溶液轉移至培養基。在BSC中，將1.0 mL IL-2儲備溶液轉移至所製備之CM1第0天培養基瓶。添加CM1第0天培養基1瓶及IL-2 (6x106 IU/mL) 1.0 mL。

將G-REX100MCS轉移至BSC。將G-REX100MCS (W3013130)無菌轉移至BSC中。

將所有完全CM1第0天培養基泵送至G-REX100MCS燒瓶中。組織片段錐形或GRex100MCS。

第0天腫瘤洗滌培養基製備。在BSC中，將5.0 mL正大黴素(W3009832或W3012735)添加至1 × 500 mL HBSS培養基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS (500.0 mL)；硫酸正大黴素，50 mg/mL (5.0 mL)。通過1 L 0.22微米過濾單元(W1218810)過濾所製備之含有正大黴素之HBSS。

第0天腫瘤處理。獲得腫瘤樣本且立即在2-8℃下轉移至套件中以供處理。將腫瘤洗滌培養基等分。使用8”鉗(W3009771)來執行腫瘤洗滌1。自樣本瓶移出腫瘤且轉移至所製備之「洗滌1」皿。此後為腫瘤洗滌2及腫瘤洗滌3。對腫瘤進行量測及評估。評估是否觀察到整個腫瘤區域之＞ 30%為壞死及/或脂肪組織。若適用，則清理解剖。若腫瘤較大且觀察到＞30%之組織外部為壞死/脂肪，則藉由使用解剖刀及/或鉗之組合移除壞死/脂肪組織、同時保存腫瘤內部結構來執行「清理解剖」。解剖腫瘤。使用解剖刀及/或鉗之組合，將腫瘤樣本切割成均勻、適當大小之片段(至多6個中間片段)。轉移中間腫瘤片段。將腫瘤片段解剖成大約3×3×3 mm大小之塊。儲存中間片段以防止乾燥。重複中間片段解剖。確定所收集之塊的數目。若所需組織保留，則自「有利的中間片段」6孔板選擇額外有利的腫瘤塊以填充液滴，最多達50塊。

準備錐形管。將腫瘤塊轉移至50 mL錐形管中。為G-REX100MCS準備BSC。自培育箱移出G-REX100MCS。將G-REX100MCS燒瓶無菌轉移至BSC中。將腫瘤片段添加至G-REX100MCS燒瓶中。使各塊均勻分佈。

在以下參數下培育G-REX100MCS：培育之G-REX燒瓶：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO ₂百分率：5.0±1.5%CO ₂。計算：培育時間；下限 = 培育時間 + 252小時；上限 = 培育時間 + 276小時。

在過程完成之後，棄去任何剩餘之加溫培養基且使IL-2之等分試樣解凍。

第11天-培養基製備。監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分率：5.0± 1.5% CO2。

對培育箱中之3個1000 mL RPMI 1640培養基(W3013112)瓶及3個1000 mL AIM-V (W3009501)瓶加溫持續≥ 30分鐘。自培育箱移出RPMI 1640培養基。準備RPMI 1640培養基。過濾培養基。使3個1.1 mL IL-2等分試樣(6×106 IU/mL) (BR71424)解凍。自培育箱移出AIM-V培養基。將IL-2添加至AIM-V中。將10 L Labtainer袋及中繼泵轉移裝置無菌轉移至BSC中。

準備10 L Labtainer培養基袋。準備Baxa泵。準備10 L Labtainer培養基袋。將培養基泵送至10 L Labtainer中。自Labtainer袋移出泵。

混合培養基。輕輕按摩該袋使其混合。根據取樣規劃對培養基取樣。移出20.0 mL培養基且置於50 mL錐形管中。準備細胞計數稀釋管。在BSC中，將已標明「用於細胞計數稀釋」及批號之4.5 mL AIM-V培養基添加至四個15 mL錐形管中。將試劑自BSC轉移至2-8℃。製備1 L轉移包。在BSC鍛接部分外部(根據過程注釋5.11)，為轉移裝置準備1 L轉移包，其附接至「完全CM2第11天培養基」袋。準備餵養細胞轉移包。培育完全CM2第11天培養基。

第11天 - TIL收集。預處理表格。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO ₂百分率：5.0±1.5% CO ₂。自培育箱移出G-REX100MCS。準備300 mL轉移包。將轉移包鍛接至G-REX100MCS。

準備燒瓶用於TIL收集及TIL收集之起始。收集TIL。使用GatheRex，將細胞懸浮液經由血液過濾器轉移至300 mL轉移包中。檢查膜上之黏附細胞。

沖洗燒瓶膜。關閉G-REX100MCS上之夾器。確保所有夾器均關閉。熱密封TIL及「上清液」轉移包。計算TIL懸浮液之體積。準備上清液轉移包用於取樣。

拉出Bac-T樣品。在BSC中，自1 L「上清液」轉移包抽出大約20.0 mL上清液且分配至無菌50 mL錐形管中。

根據取樣規劃接種BacT。使用適當大小之注射器自所準備之50 mL錐形經標記BacT移出1.0 mL樣品且對厭氧瓶進行接種。

培育TIL。將TIL轉移包置於培育箱中，直至需要時。執行細胞計數及計算。確定所執行之細胞計數的活細胞濃度及活力之平均值。活力 ÷ 2。活細胞濃度 ÷ 2。確定計數之上限及下限。下限：活細胞濃度之平均值 × 0.9。上限：活細胞濃度之平均值 × 1.1。確認兩個計數均在容許極限內。確定所執行之所有四次計數之平均活細胞濃度。

調整TIL懸浮液之體積：在移出細胞計數樣品之後，計算TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積(A)。所移出之細胞計數樣品的體積(4.0 mL) (B) 經調整之總TIL細胞體積C=A-B。

計算總的活TIL細胞。平均活細胞濃度*：總體積；總的活細胞：C = A × B。

針對流式細胞術之計算：若總的活TIL細胞計數≥ 4.0×10 ⁷，則計算流式細胞術樣品之體積以獲得1.0×10 ⁷個細胞。

流式細胞術所需之總的活細胞：1.0×10 ⁷個細胞。流式細胞術所需之細胞體積：活細胞濃度除以1.0×10 ⁷個細胞A。

計算出TIL懸浮液之體積等於2.0×10 ⁸個活細胞。根據需要，計算欲移出之過量TIL細胞之體積且移出過量TIL且根據需要將TIL置於培育箱中。根據需要，計算所移出之總的過量TIL。

計算欲添加至過量TIL細胞中之CS-10培養基的量，其中用於冷凍之目標細胞濃度為1.0×10 ⁸個細胞/mL。根據需要，使過量TIL離心。觀察錐形管且添加CS-10。

填充小瓶。將1.0 mL細胞懸浮液等分至適當大小之冷凍小瓶中。將殘餘體積等分至適當大小之冷凍小瓶中。若體積≤0.5 mL，則向小瓶中添加CS10直至體積為0.5 mL。

計算獲得用於冷凍保存之1×10 ⁷個細胞所需之細胞體積。移出樣品以用於冷凍保存。將TIL置於培育箱中。

樣品之冷凍保存。觀察錐形管且緩慢添加CS-10，且記錄所添加之CS10的體積為0.5 mL。

第11天-餵養細胞。獲得餵養細胞。自LN2冷凍器獲得3袋餵養細胞，具有至少兩個不同批號。使細胞保持於乾冰上，直至準備解凍。準備水浴或cryotherm。使餵養細胞在水浴或cytotherm中在37.0 ± 2.0℃下解凍持續約3-5分鐘或直至冰剛剛消失。自培育箱移出培養基。匯集解凍之餵養細胞。將餵養細胞添加至轉移包中。將餵養細胞自注射器分配至轉移包中。混合匯集之餵養細胞且標記轉移包。

計算轉移包中之餵養細胞懸浮液的總體積。移出細胞計數樣品。每個樣品使用單獨3 mL注射器，使用不必要的注射口自餵養細胞懸浮液轉移包拉出4×1.0 mL細胞計數樣品。將每個樣品等分至經標記之冷凍小瓶中。執行細胞計數且確定倍增因子，選擇方案且輸入倍增因子。確定所執行之細胞計數的活細胞濃度及活力之平均值。確定計數之上限及下限且確認在極限內。

調整餵養細胞懸浮液之體積。在移出細胞計數樣品之後，計算餵養細胞懸浮液之經調整體積。計算總的活餵養細胞。根據需要，獲得額外餵養細胞。根據需要，使額外餵養細胞解凍。將第4餵養細胞袋置於拉環袋中且在37.0 ± 2.0℃水浴或cytotherm中解凍持續約3-5分鐘且匯集額外餵養細胞。量測體積。量測注射器中之餵養細胞體積且記錄如下(B)。計算餵養細胞之新的總體積。將餵養細胞添加至轉移包中。

根據需要製備稀釋液，將4.5 mL AIM-V培養基添加至四個15 mL錐形管中。準備細胞計數。每個樣品使用單獨3 mL注射器，使用無針注射口自餵養細胞懸浮液轉移包移出4 × 1.0 mL細胞計數樣品。執行細胞計數及計算。確定所執行之所有四次計數之平均活細胞濃度。在移出細胞計數樣品之後，調整餵養細胞懸浮液之體積且計算餵養細胞懸浮液之經調整體積。總餵養細胞體積減去移出之4.0 mL。計算獲得5×10 ⁹個活餵養細胞所需之餵養細胞懸浮液體積。計算過量餵養細胞體積。計算欲移出之過量餵養細胞的體積。移出過量餵養細胞。

使用1.0 mL注射器及16G針，抽出0.15 mL OKT3且添加OKT3。熱密封餵養細胞懸浮液轉移包。

第11天G-REX填充及接種設置G-REX500MCS。自培育箱移出「完全CM2第11天培養基」且將培養基泵送至G-REX500MCS中。將4.5 L培養基泵送至G-REX500MCS中，填充至燒瓶上標記之線。根據需要，熱密封且培養燒瓶。將餵養細胞懸浮液轉移包鍛接至G-REX500MCS。將餵養細胞添加至G-REX500MCS中。進行熱密封。將TIL懸浮液轉移包鍛接至燒瓶。將TIL添加至G-REX500MCS中。進行熱密封。在37.0±2.0℃下培育G-REX500MCS，CO2百分率：5.0±1.5% CO2。

計算培育窗。執行計算以確定在第16天自培育箱移出G-REX500MCS之適當時間。下限：培育時間 + 108小時。上限：培育時間 + 132小時。

第11天過量TIL冷凍保存。可適用：冷凍過量TIL小瓶。驗證在冷凍之前已設置CRF。執行冷凍保存。將小瓶自控制速率冷凍器轉移至適當倉庫。在完成冷凍後，將小瓶自CRF轉移至適當儲存容器。將小瓶轉移至適當倉庫。記錄LN2中之儲存位置。

第16天培養基製備。對AIM-V培養基進行預加溫。計算對培養基袋1、2及3中之培養基進行加溫的時間。確保所有袋均已加溫持續12與24小時之間的持續時間。設置用於上清液之10 L Labtainer。使用Luer連接器將流體泵轉移裝置之較大直徑末端附接至10 L Labtainer袋之一凹型口。設置用於上清液之10 L Labtainer及標籤。設置用於上清液之10 L Labtainer。確保在自BSC移出之前，所有夾器均關閉。注意：在TIL收集期間使用上清液袋，TIL收集可與培養基製備並行地執行。

使IL-2解凍。使每袋CTS AIM V培養基5×1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 ⁶IU/mL) (BR71424)解凍，直至所有冰均已融化。將100.0 mL GlutaMax™等分。將IL-2添加至GlutaMax™中。準備CTS AIM V培養基袋以用於調配。準備CTS AIM V培養基袋以用於調配。筹备Baxa泵。準備調配培養基。將GlutaMax™ +IL-2泵送至袋中。監測之參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO ₂百分率：5.0±1.5% CO ₂。對完全CM4第16天培養基加溫。準備稀釋液。

第16天REP分開。監測之培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO ₂百分率：5.0±1.5%CO ₂。自培育箱移出G-REX500MCS。準備且將1 L轉移包標記為TIL懸浮液且稱取1 L。

G-REX500MCS之體積減少。將約4.5 L培養上清液自G-REX500MCS轉移至10 L Labtainer。

準備燒瓶以用於TIL收集。在移出上清液之後，將所有夾器關閉至紅線。

起始TIL收集。大力敲打燒瓶且使培養基渦旋以釋出細胞且確保所有細胞均已剝離。

TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液轉移包之所有夾器。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確保維持傾斜邊緣，直至已收集所有細胞及培養基。檢查膜上之黏附細胞。沖洗燒瓶膜。關閉G-REX500MCS上之夾器。熱密封含有TIL之轉移包。熱密封含有上清液之10 L Labtainer。記錄具有細胞懸浮液之轉移包的重量且計算懸浮液體積。準備轉移包以用於樣品移出。自細胞上清液移出所測試之樣品。

無菌性及BacT測試取樣。自所準備之15 mL錐形經標記BacT移出1.0 mL樣品。移出細胞計數樣品。在BSC中，每種樣品使用單獨3 mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包移出4×1.0 mL細胞計數樣品。

移出支原體樣品。使用3 mL注射器，自TIL懸浮液轉移包移出1.0 mL且置於所準備之標記為「支原體稀釋液」之15 mL錐形瓶中。

準備轉移包以用於接種。將TIL置於培育箱中。自BSC移出細胞上清液且置於培育箱中直至需要時。執行細胞計數及計算。最初，藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至所準備之4.5 mL AIM-V培養基中來稀釋細胞計數樣品，由此生成1:10稀釋液。確定所執行之細胞計數的活細胞濃度及活力之平均值。確定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度來調整稀釋。確定所執行之所有四次計數之平均活細胞濃度。調整TIL懸浮液之體積。在移出細胞計數樣品之後，計算TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積減去移出之5.0 mL以用於測試。

計算總的活TIL細胞。計算欲接種之燒瓶的總數。注意：欲接種之G-REX500MCS燒瓶的最大數目為5。若欲接種之燒瓶的計算數目超過5，則僅使用可用細胞懸浮液之整個體積來接種5個。

計算用於子培養之燒瓶的數目。除了所準備之袋，亦計算所需之培養基袋的數目。按照計算，每兩個G-REX-500M燒瓶需要準備一個10 L 「CM4第16天培養基」袋。在準備額外培養基且加溫時，繼續接種第一個GREX-500M燒瓶。準備所確定之計算數目的額外培養基袋且加溫。填充G-REX500MCS。準備泵送培養基且將4.5 L培養基泵送至G-REX500MCS中。進行熱密封。重複填充。培育燒瓶。計算欲添加至新的G-REX500MCS燒瓶中之TIL懸浮液之目標體積。若燒瓶之計算數目超過5，則將僅使用細胞懸浮液之整個體積來接種5個。準備燒瓶以用於接種。自培育箱移出G-REX500MCS。準備G-REX500MCS以用於泵送。除大型過濾器管線以外，關閉所有夾器。自培育箱移出TIL。準備細胞懸浮液以進行接種。無菌鍛接(根據過程注釋5.11)「TIL懸浮液」轉移包以泵送入口管線。將TIL懸浮液袋置於天平上。

用TIL懸浮液接種燒瓶。將所計算之體積的TIL懸浮液泵送至燒瓶中。進行熱密封。過濾剩餘燒瓶。

監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO ₂百分率：5.0±1.5% CO ₂。培育燒瓶。

確定在第22天自培育箱移出G-REX500MCS之時間範圍。

第22天洗滌緩衝液製備。準備10 L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾連接件將4”血漿轉移裝置附接至10 L Labtainer袋。準備10 L Labtainer袋。在轉移出BSC之前，關閉所有夾器。注意：每兩個欲收集之G-REX500MCS燒瓶準備一個10 L Labtainer袋。將Plasmalyte泵送至3000 mL袋中且藉由逆轉該泵且操縱該袋之位置自3000 mL Origen袋中移出空氣。將人類白蛋白25%添加至3000 mL袋中。獲得120.0 mL之最終體積的人類白蛋白25%。

準備IL-2稀釋劑。使用10 mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋上之無針注射口來移出5.0 mL LOVO洗滌緩衝液。將LOVO洗滌緩衝液分配至50 mL錐形管中。

等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100 mL注射器，自無針注射口抽出70.0 mL LOVO洗滌緩衝液。

使一份1.1 mL IL-2 (6×106 IU/mL)解凍，直至所有冰均已融化。將50 µL IL-2儲備液(6×10 ⁶IU/mL)添加至標記「IL-2稀釋劑」之50 mL錐形管中。

冷凍保存製備。在2-8℃下置放5個冷凍卡匣，以針對最終產品冷凍保存對該等冷凍卡匣進行預處理。

準備細胞計數稀釋液。在BSC中，將已標明批號及「用於細胞計數稀釋」之4.5 mL AIM-V培養基添加至4個單獨15 mL錐形管中。準備細胞計數。用小瓶數目(1-4)標記4個冷凍小瓶。使小瓶保持於BSC下待用。

第22天TIL收集。監測培育箱。培育箱參數溫度LED顯示器：37 ± 2.0℃，CO2百分率：5%±1.5%。自培育箱移出G-REX500MCS燒瓶。準備TIL收集袋且進行標記。密封額外連接件。體積減少：將約4.5 L上清液自G-REX500MCS轉移至上清液袋。

準備燒瓶以用於TIL收集。起始TIL收集。大力敲打燒瓶且使培養基渦旋以釋出細胞。確保所有細胞均已剝離。起始TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液收集袋之所有夾器。TIL收集。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000 mL收集袋中。檢查膜上之黏附細胞。沖洗燒瓶膜。關閉G- Rex500MCS上之夾器且確保所有夾器均關閉。將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。關閉所有夾器。進行熱密封。移出4×1.0 mL細胞計數樣品

執行細胞計數。利用NC-200及過程注釋5.14執行細胞計數及計算。最初，藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至所準備之4.5 mL AIM-V培養基中來稀釋細胞計數樣品。這生成1:10稀釋液。確定所執行之細胞計數的平均活力、活細胞濃度及總的有核細胞濃度。確定計數之上限及下限。確定所執行之細胞計數的平均活力、活細胞濃度及總的有核細胞濃度。對LOVO來源袋稱重。計算總的活TIL細胞。計算總的有核細胞。

準備支原體稀釋劑。經由魯爾取樣口自一個上清液袋移出10.0 mL且置於15 mL錐形瓶中。

執行「TIL G-REX收集」方案且確定最終產品目標體積。裝載一次性套組。移出濾液袋。輸入濾液容量。將濾液容器置於工作台上。附接PlasmaLyte。驗證已附接PlasmaLyte且觀察到PlasmaLyte正在移動。將來源容器附接至管道且驗證已附接來源容器。確認PlasmaLyte正在移動。

最終調配及填充。目標體積/袋計算。計算CS-10及LOVO洗滌緩衝液之體積以調配空白袋。準備CRF空白袋。

計算欲添加至最終產品中之IL-2的體積。所需之最終IL-2濃度(IU/mL) - 300 IU/mL。IL-2工作儲備液：6 × 10 ⁴IU/mL。組裝連接裝置。將4S-4M60無菌鍛接至CC2細胞連接件。將CS750冷凍袋無菌鍛接至所準備之線束。將CS-10袋鍛接至4S-4M60之釘上。用IL-2準備TIL。使用適當大小之注射器，移出自「IL-2 6×10 ⁴」等分試樣確定之量的IL-2。標記經調配之TIL袋。將經調配之TIL袋添加至該裝置中。添加CS10。切換注射器。將約10 mL空氣抽入100 mL注射器中且置換該裝置上之60 mL注射器。添加CS10。準備CS-750袋。分配細胞。

自最終產品袋移出空氣且加以保留。一旦最後一個最終產品袋經填充，即關閉所有夾器。將10 mL空氣抽入新的100 mL注射器中且置換該裝置上之注射器。將保留液分配至50 mL錐形管中且將管標記為「保留液」及批號。對每個袋重複空氣移出步驟。

準備最終產品用於冷凍保存，包括目視檢查。使冷凍袋保持於冷包裝上或2-8℃下，直至冷凍保存。

移出細胞計數樣品。使用適當大小之移液管，移出2.0 mL保留液且置於15 mL錐形管中以用於細胞計數。執行細胞計數及計算。注釋：僅將一個樣品稀釋至適當稀釋度以驗證稀釋係充分的。將額外樣品稀釋至適當稀釋因子且繼續計數。確定所執行之細胞計數的活細胞濃度及活力之平均值。確定計數之上限及下限。注釋：可根據預期細胞濃度來調整稀釋。確定活細胞濃度及活力之平均值。確定計數之上限及下限。計算IFN-γ。熱密封最終產品袋。

根據以下例示性取樣規劃來標記及收集樣品。表40. 取樣規劃。

樣品	容器之數目	欲添加至各容器中之樣品體積	容器類型
*支原體	1	1.0 mL	15 mL錐形瓶
內毒素	2	1.0 mL	2 mL冷凍小瓶
革蘭氏染色	1	1.0 mL	2 mL冷凍小瓶
IFN-γ	1	1.0 mL	2 mL冷凍小瓶
流式細胞術	1	1.0 mL	2 mL冷凍小瓶
**Bac-T 無菌性	2	1.0 mL	Bac-T瓶
QC保留液	4	1.0 mL	2 mL冷凍小瓶
衛星小瓶	10	0.5 mL	2 mL冷凍小瓶

無菌性及BacT測試。測試取樣。在BSC中，使用適當大小之注射器自所收集之經保留細胞懸浮液移出1.0 mL樣品且對厭氧瓶進行接種。對需氧瓶重複以上步驟。

最終產品冷凍保存。準備控制速率冷凍器(CRF)。驗證已設置CRF。設置CRF探針。將最終產品及樣品置於CRF中。確定達到4℃ ± 1.5℃所需之時間且繼續CRF運行。使CRF完成且進行儲存。在完成運行之後，停止CRF。自CRF移出卡匣及小瓶。將卡匣及小瓶轉移至汽相LN2以供儲存。記錄儲存位置。

最終藥物產品之後處理及分析包括以下測試：(第22天)藉由流式細胞術確定第22天REP上之CD3+細胞；(第22天)革蘭氏染色方法(GMP)；(第22天)藉由凝膠凝結LAL分析(GMP)進行之細菌內毒素測試；(第16天) BacT無菌性分析(GMP)；(第16天)藉由TD-PCR (GMP)進行之支原體DNA偵測；可接受的外觀屬性；(第22天) BacT無菌性分析(GMP)(第22天)；(第22天) IFN-γ分析。亦採用如本文所述之其他效力分析來分析TIL產品。 H. 實例 8 ： GEN 3 擴增平台之例示性實施例第0天

準備腫瘤洗滌培養基。在開始之前對培養基加溫。將5 mL正大黴素(50 mg/mL)添加至500 mL HBSS瓶中。將5 mL腫瘤洗滌培養基添加至15 mL錐形瓶中以用於OKT3稀釋。製備餵養細胞袋。將餵養細胞無菌轉移至餵養細胞袋且儲存於37℃下直至使用或冷凍。若在37℃下，則對餵養細胞計數。若經冷凍，則使其解凍且接著對餵養細胞計數。

餵養細胞濃度之最佳範圍係在5×10 ⁴與5×10 ⁶個細胞/mL之間。準備四個具有4.5 mL AIM-V之錐形管。為每次細胞計數添加0.5 mL細胞部分。若總的活餵養細胞數目≥ 1 × 10 ⁹個細胞，則繼續調整餵養細胞濃度。計算欲自第一餵養細胞袋移出之餵養細胞的體積以便將1×10 ⁹個細胞添加至第二餵養細胞袋中。

使用p1000微量移液管，將900 µL腫瘤洗滌培養基轉移至OKT3等分試樣(100 µL)中。使用注射器及無菌技術，抽出0.6 mL OKT3且添加至第二餵養細胞袋中。將培養基體積調整至2 L之最終體積。將第二餵養細胞袋轉移至培育箱。

OKT3調配詳情：可將OKT3等分且在100 µL等分試樣中以小瓶中之初始儲備濃度(1 mg/mL)進行冷凍。約10X等分試樣/1 mL小瓶。儲存於-80℃下。第0天：15 µg/燒瓶，亦即30 ng/mL於500 mL中-最多60 µL ~ 1個等分試樣。

將5 mL腫瘤洗滌培養基添加至標記有過量腫瘤塊之6孔板之所有孔中。使腫瘤洗滌培養基保持可用，以在解剖期間進一步用於保持腫瘤水分。將50 mL腫瘤洗滌培養基添加至各100 mm培養皿中。

使用解剖皿蓋下之尺子作為參考物，將腫瘤解剖成27 mm ³片段(3×3×3 mm)。解剖中間片段，直至達到60個片段。對最終片段之總數計數且根據所生成之最終片段的數目來準備G-REX-100MCS燒瓶(一般每個燒瓶60個片段)。

在標記為片段管1至片段管4之錐形管中保留有利的組織片段。根據起源之片段管的數目來計算G-REX-100MCS燒瓶之數目以接種餵養細胞懸浮液。

自培育箱移出餵養細胞袋且接種G-REX-100MCS。標記為D0 (第0天)。

添加腫瘤片段以在G-REX-100 MCS中進行培養。在無菌條件下，擰開標記腫瘤片段培養(D0) 1之G-REX-100MCS及標記片段管之50 mL錐形管的蓋。使打開之片段管1渦旋且同時，稍微抬起G-REX100MCS之蓋。將具有片段之培養基添加至G-REX100MCS中，同時使其渦旋。記錄轉移至G-REX100MCS中之片段數目。

一旦片段位於GREX燒瓶之底部，抽出7 mL培養基且創建七個1 mL等分試樣— 5 mL用於擴展表徵且2 mL用於無菌性樣品。在-20℃下儲存5個等分試樣(最終片段培養上清液)用於擴展表徵，直至需要時。

用1 mL最終片段培養上清液接種一個厭氧BacT/Alert瓶及一個需氧BacT/Alert瓶。對每個取樣燒瓶重複以上步驟。在第7-8天

製備餵養細胞袋。當冷凍時，使餵養袋在37℃水浴中解凍持續3-5分鐘。若經冷凍，則對餵養細胞計數。餵養細胞濃度之最佳範圍係在5×104與5×106個細胞/mL之間。準備四個具有4.5 mL AIM-V之錐形管。為每次細胞計數向新的冷凍小瓶管中添加0.5 mL細胞部分。使樣品充分混合且繼續細胞計數。

若總的活餵養細胞數目≥ 2 × 109個細胞，則繼續下一步驟以調整餵養細胞濃度。計算欲自第一餵養細胞袋移出之餵養細胞的體積以便將2 × 109個細胞添加至第二餵養細胞袋中。

使用p1000微量移液管，將900 µL HBSS轉移至100 µL OKT3等分試樣中。藉由上下吸移3次使其混合。準備兩個等分試樣。

OKT3調配詳情：可將OKT3等分且在100 µL等分試樣中以小瓶中之初始儲備濃度(1 mg/mL)進行冷凍。約10×等分試樣/1 mL小瓶。儲存於-80℃下。第7/8天：30 µg/燒瓶，亦即60 ng/mL於500 mL中-最多120 µl ~ 2個等分試樣。

使用注射器及無菌技術，抽出0.6 mL OKT3且添加至餵養細胞袋中，確保已添加全部。將培養基體積調整至2 L之總體積。用第二OKT3等分試樣重複且添加至餵養細胞袋中。將第二餵養細胞袋轉移至培育箱。

準備具有餵養細胞懸浮液之G-REX100MCS燒瓶。根據第0天生成之G-REX燒瓶數目，記錄欲處理之G-REX-100MCS燒瓶的數目。自培育箱移出G-REX燒瓶且自培育箱移出第二餵養細胞袋。

在餵養細胞懸浮液添加之前，移出上清液。使一個10 mL注射器連接至G-REX100燒瓶且抽出5 mL培養基。創建五個1 mL等分試樣- 5 mL用於擴展表徵且在-20℃下儲存該5個等分試樣(最終片段培養上清液)用於擴展表徵，直至發起者請求。對每個G-REX100燒瓶進行標記且重複以上步驟。

5-20 × 1 mL樣品用於表徵，視燒瓶數目而定： ● 5 mL = 1個燒瓶 ● 10 mL = 2個燒瓶 ● 15 mL = 3個燒瓶 ● 20 mL =4個燒瓶

繼續將餵養細胞接種至G-REX100 MCS中且對每個G-REX100 MCS燒瓶重複以上步驟。使用無菌轉移方法，按重量(假定1 g = 1 mL)將第二餵養細胞袋中之500 mL重力轉移至每個G-REX-100MCS燒瓶中且記錄量。對每個G-REX100燒瓶標記為第7天培養且重複以上步驟。將G-REX-100MCS燒瓶轉移至培育箱。第10-11天

移出第一G-REX-100MCS燒瓶且使用無菌條件，使用10 mL注射器移出7 mL預處理培養上清液。創建七個1 mL等分試樣— 5 mL用於擴展表徵且2 mL用於無菌性樣品。

小心地使燒瓶混合且使用新的10 mL注射器移出10 mL上清液且轉移至經標記為第D10/11天支原體上清液之15 mL管。

小心地使燒瓶混合且使用新的注射器，根據欲處理多少燒瓶移出以下體積： ● 1個燒瓶 = 40 mL ● 2個燒瓶 = 20 mL/燒瓶 ● 3個燒瓶 = 13.3 mL/燒瓶 ● 4個燒瓶 = 10 mL/燒瓶

應自所有燒瓶拉出總計40 mL且匯集於標記『第10/11天QC樣品』之50 mL錐形管中且儲存於培育箱中，直至需要時。執行細胞計數且分配細胞。

在≤-20℃下儲存5個等分試樣(預處理培養上清液)用於擴展表徵，直至需要時。用1 mL預處理培養上清液接種一個厭氧BacT/Alert瓶及一個需氧BacT/Alert瓶。

繼續將細胞懸浮液轉移至G-REX-500MCS且對每個G-REX-100MCS重複以上步驟。使用無菌條件，將每個G-REX-100MCS之內含物轉移至G-REX-500MCS中，一次監測約100 mL流體轉移。當G-REX-100MCS之體積減少至500 mL時，停止轉移。

在轉移步驟期間，使用10 mL注射器且將10 mL細胞懸浮液自G-REX-100MCS抽出至該注射器中。遵從根據培養中之燒瓶數目之指令。若僅1個燒瓶：使用兩個注射器移出總計20 mL。若2個燒瓶：每個燒瓶移出10 mL。若3個燒瓶：每個燒瓶移出7 mL。若4個燒瓶：每個燒瓶移出5 mL。將細胞懸浮液轉移至一個共同的50 mL錐形管中。保持於培育箱中，直至細胞計數步驟及QC樣品。QC所需之細胞的總數為約20e6個細胞：4 × 0.5 mL細胞計數(細胞計數首先為未稀釋的)。

分析所需之細胞的數量如下： 1. 最少10×106個細胞用於效力分析(諸如本文所述之彼等)，或用於IFN-γ或顆粒酶B分析 2. 1×106個細胞用於支原體 3. 5×106個細胞用於CD3+/CD45+之流式細胞術

將G-REX-500MCS燒瓶轉移至培育箱。

準備QC樣品。此實施例中之分析需要至少15 × 108個細胞。分析包括：細胞計數及活力；支原體(1 × 106個細胞/平均活濃度；)流動(5 × 106個細胞/平均活濃度；)及IFN-g分析(5 × 106個細胞 - 1 × 106 個細胞；IFN-γ分析需要8-10 × 106個細胞。

以10 × 106個細胞/mL計算用於冷凍保存之細胞部分的體積且計算欲準備之小瓶的數目第16-17天

洗滌緩衝液製備(1% HSA Plasmalyte A)。將HSA及Plasmalyte轉移至5 L袋以製備LOVO洗滌緩衝液。使用無菌條件，將125 mL總體積之25% HSA轉移至5 L袋。將10 mL或40 mL洗滌緩衝液移出且轉移至『IL-2 6 × 104 IU/mL』管中(若預先製備IL-2，則為10 mL，或若新鮮製備IL-2，則為40 mL)。

計算欲添加至Plasmalyte + 1% HSA中之重構IL-2之體積：重構IL-2之體積= (IL-2之最終濃度 × 最終體積)/ IL-2之比活性(基於標準分析)。IL-2之最終濃度為6 × 104 IU/mL。最終體積為40 mL。

移出重構IL-2所需之經計算之初始體積的IL-2且轉移至『IL-2 6 × 104 IU/mL』管中。將預先製備之等分試樣中的100 µL IL-2 6×106 IU/mL添加至含有10 mL LOVO洗滌緩衝液之標記『IL-2 6×104 IU/mL』之管中。

自G-REX-500MCS燒瓶移出約4500 mL上清液。使剩餘上清液渦旋且將細胞轉移至細胞收集池袋中。用所有G-REX-500MCS燒瓶重複以上步驟。

移出60 mL上清液且添加至上清液管中以用於品質控制分析，包括支原體偵測。儲存於+2-8℃下。

細胞收集。對細胞計數。準備四個具有4.5 mL AIM-V之15 mL錐形瓶。其可預先準備。最佳範圍=在5×104與5×106個細胞/mL之間。(推薦1:10稀釋)。關於1:10稀釋，向先前準備之4500 µL AIM V中添加500 µL CF。記錄稀釋因子。計算LOVO前之TC (總的細胞) (活 + 死) = 平均總細胞濃度(LOVO前之TC濃度) (活 + 死) × 來源袋之體積計算LOVO前之TVC (總的活細胞) (活) = 平均總活細胞濃度(LOVO前之TVC) (活) × LOVO來源袋之體積

當總細胞(TC)數目＞ 5 × 109時，移出5 × 108個細胞作為MDA保留樣品進行冷凍保存。5 × 108 ÷ 平均TC濃度(步驟14.44) = 欲移出之體積。

當總細胞(TC)數目≤ 5 × 109時，移出4 × 106個細胞作為MDA保留樣品進行冷凍保存。4 × 106 ÷ 平均TC濃度= 欲移出之體積。

當確定總細胞數目時，欲移出之細胞數目應允許保留150×109個活細胞。確認LOVO前之TVC為5 × 108或4 × 106或不適用。計算欲移出之細胞的體積。

計算袋中剩餘之剩餘總細胞。計算LOVO前之TC (總的細胞)。[平均總細胞濃度 × 剩餘體積 = 剩餘的LOVO前之TC]

根據剩餘細胞之總數，選擇表41中之對應過程。表41. 細胞之總數。

總的細胞：	滲餘物(mL)
0 ＜總的細胞 ≤ 31 × 109	115
31 × 109 ＜總的細胞 ≤ 71 × 109	165
71 × 109 ＜總的細胞 ≤ 110 × 109	215
110 × 109 ＜總的細胞≤ 115 × 109	265

選擇對應於所用過程之欲添加之IL-2的體積。體積計算為：滲餘物體積 × 2 × 300 IU/mL = 所需IL-2之IU所需IL-2之IU / 6 ×104 IU/mL = 欲添加至LOVO後之袋中之IL-2的體積。記錄所添加之所有體積。在冷凍小瓶中獲得樣品以供進一步分析。

使細胞產品充分混合。密封所有袋以供進一步處理，包括冷凍保存(當適用時)。

根據需要，對所獲得之冷凍小瓶樣品執行內毒素、IFN-γ、無菌性及其他分析。 I. 實例 9 ： GEN 2 及 GEN 3 例示性過程

此實例證實Gen 2及Gen 3過程。過程Gen 2及Gen 3 TIL一般由經由手術切除腫瘤而源自個別患者之自體TIL構成且接著離體擴增。Gen 3過程之啟動性第一次擴增步驟係在介白素-2 (IL-2)及單株抗體OKT3存在下進行細胞培養，該單株抗體OKT3靶向經照射之周邊血單核細胞(PBMC)之骨架上的T細胞共受體CD3。

Gen 2 TIL產品之製造由兩個階段組成：1)快速擴增前(REP前)及2)快速擴增方案(REP)。在REP前期間，所切除之腫瘤在每個維度上均切割成≤ 50個2-3 mm片段，該等片段用含血清培養基(RPMI 1640培養基，含有補充之10% HuSAB)及6,000 IU/mL介白素-2 (IL-2)培養，持續11天時期。在第11天，收集TIL且引入大規模第二次REP擴增中。REP由以下組成：在裝載150 µg單株抗CD3抗體(OKT3)之5×10 ⁹個經照射之同種異體PBMC餵養細胞在補充有3000 IU/mL rhIL-2之5 L體積的CM2中之共培養物中活化≤200 × 10 ⁶個來自REP前之活細胞，持續5天。在第16天，培養物體積減少90%且將細胞部分以≥ 1 × 10 ⁹個活淋巴細胞/燒瓶分至多個G-REX-500燒瓶中且用CM4 QS至5 L。再培育TIL持續6天。在第22天收集REP，洗滌，調配，且冷凍保存，接著在-150℃下運輸至臨床場所以供輸注。

Gen 3 TIL產品之製造由三個階段組成：1)啟動性第一次擴增方案，2)快速第二次擴增方案(亦稱為快速擴增階段或REP)，及3)子培養物分開。為了實現啟動性第一次擴增TIL增殖，所切除之腫瘤在每個維度上均切割成≤ 120個2-3 mm片段。在啟動性第一次擴增之第0天，在3個100 MCS容器中之每一者中的大約100 cm ²表面區域上建立裝載OKT-3之大約2.5 × 10 ⁸個同種異體經照射PBMC餵養細胞之餵養層。將腫瘤片段分佈於3個100 MCS容器中且在其中培養持續7天之時期，該等容器各自具有500 mL含血清CM1培養基及6,000 IU/mL介白素-2 (IL-2)及15 ug OKT-3。在第7天，藉由將裝載OKT-3之大約5 × 10 ⁸個同種異體經照射PBMC餵養細胞之額外餵養細胞層併入該3個100 MCS容器中之每一者中的腫瘤片段化培養階段中且用500 mL CM2培養基及6,000 IU/mL IL-2及30 µg OKT-3培養來起始REP。使用裝載OKT3之餵養細胞的密閉系統流體轉移至100MCS容器中來活化同一容器中之整個啟動性第一次擴增培養物，由此增強REP起始。關於Gen 3，TIL規模縱向擴大或分開涉及如下過程步驟，其中經由密閉系統流體轉移將整個細胞培養物擴展至較大容器且進行轉移(自100 M燒瓶至500 M燒瓶)且添加額外4 L CM4培養基。在第16天收集REP細胞，洗滌，調配，且冷凍保存，接著在-150℃下運輸至臨床場所以供輸注。

總之，Gen 3過程係較短、更具可擴展性且可容易修改之擴增平台，其將適於配合穩健製造及過程可比較性。表50. 例示性Gen 2及例示性Gen 3製造過程之比較。

步驟	過程(Gen 2)	過程(Gen 3)
REP前-第0天	至多50個片段，1個G-REX-100MCS，11天在1 L CM1培養基 + IL-2 (6000 IU/mL)中	至多120個片段之整個腫瘤均勻地分給至多3個燒瓶。1個燒瓶：1-60個片段 2個燒瓶：61-89個片段 3個燒瓶90-120個片段 7天，在500 mL CM1培養基 + IL-2 (6000 IU/mL)中 2.5×108個餵養細胞/燒瓶 15 ug OKT-3/燒瓶
REP起始	引導至REP，第11天，＜200×106個TIL (1) G-REX-500MCS於5 L CM2培養基中 IL-2 (3000 IU/mL) 5×109個餵養細胞 150 ug OKT-3	引導至REP，第7天，所有細胞，同一G-REX-100MCS 添加500 CM2培養基 IL-2 (6000 IU/mL) 5×108個餵養細胞/燒瓶 30 ug OKT-3/燒瓶
TIL增殖或規模縱向擴大	體積減少且將細胞部分分至至多5個G-REX-500MCS中 4.5 L CM4培養基 + IL-2 (3000 IU/mL) ≥ 1×109 TVC /燒瓶分開第16天	將各G-REX-100MCS (1 L)轉移至1個G-REX-500MCS 添加4 L CM4培養基 +IL-2 (3000 IU/mL) 在第9天至第11天，規模縱向擴大
收集	收集第22天， LOVO-自動化細胞洗滌器	收集第16天 LOVO-自動化細胞洗滌器
最終調配	冷凍保存之產品 300 IU/mL IL2- CS10於LN2中，多個等分試樣	冷凍保存之產品 300 IU/mL IL-2-CS10於LN2中，多個等分試樣
過程時間	22天	16天

在第0天，對於兩個過程，將腫瘤洗滌3次且使片段隨機化且分成兩個池；每個過程一個池。關於Gen 2過程，將片段轉移至一個-GREX 100MCS燒瓶，該燒瓶具有含有6,000IU/mL rhIL-2之1 L CM1培養基。關於Gen 3過程，將片段轉移至一個G-REX-100MCS燒瓶，該燒瓶具有含有6,000 IU/mL rhIL-2、15 ug OKT-3及2.5 × 108個餵養細胞之500 mL CM1。根據每個過程，用於Rep起始日之TIL接種發生於不同日。關於其中G-REX-100MCS燒瓶減少90%體積之Gen 2過程，將所收集之細胞懸浮液轉移至新的G-REX-500MCS以在第11天在含有IL-2 (3000 IU/mL)加5×109個餵養細胞及OKT-3 (30 ng/mL)之CM2培養基中開始REP起始。根據方案，在第16天使細胞擴增且分至多個G-REX-500 MCS燒瓶中，該等燒瓶具有含IL-2 (3000 IU/mL)之CM4培養基。接著，根據方案在第22天收集培養物且進行冷凍保存。關於Gen 3過程，REP起始發生於第7天，其中同一G-REX-100MCS用於REP起始。簡言之，將500 mL含有IL-2 (6000 IU/mL)及5 × 108個餵養細胞以及30 ug OKT-3之CM2培養基添加至各燒瓶中。在第9-11天，使培養物規模縱向擴大。將整個體積之G-REX100M (1 L)轉移至G-REX-500MCS且添加4 L含有IL-2 (3000 IU/mL)之CM4。培育燒瓶5天。在第16天，收集培養基且進行冷凍保存。

三個不同腫瘤包括於比較中，兩個肺腫瘤(L4054及L4055)及一個黑色素瘤腫瘤(M1085T)。

預先準備CM1 (培養基1)、CM2 (培養基2)及CM4 (培養基4)培養基且保持於4℃下以用於L4054及L4055。在無過濾之情況下準備CM1及CM2培養基以比較具有及不具有培養基過濾之細胞生長。

在REP起始及規模縱向擴大時，預先在37℃下對用於L4055腫瘤之培養基加溫持續至多24小時。

結果。對於所實現之總的活細胞，Gen 3結果在Gen 2之30%以內。Gen 3最終產品在再刺激之後展現較高IFN-γ產量。Gen 3最終產品展現增加之純系多樣性，如藉由存在之總的獨特CDR3序列所量測。Gen 3最終產品展現較長平均端粒長度。

Gen 2及Gen 3過程之REP前及REP擴增遵從上文所述之程序。對於各腫瘤，兩個池含有相等數目之片段。歸因於腫瘤之較小大小，無法實現每個燒瓶最大數目之片段。在第11天(關於Gen 2過程)及在第7天(關於Gen 3過程)收集總的REP前細胞(TVC)且計數。為了比較兩個REP前組，使細胞計數除以培養物中所提供之片段的數目以便計算每個片段之活細胞平均值。如下表51中所指示，與Gen 3過程相比，Gen 2過程在每個片段中始終生長更多細胞。對第11天關於Gen 3過程所預期之TVC數目進行外推計算，其係使REP前TVC除以7且接著乘以11來計算的。表51. REP前細胞計數

腫瘤ID	L4054	L4055*	M1085T
過程	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3
REP前 TVC	1.42E+08	4.32E+07	2.68E+07	1.38E+07	1.23E+07	3.50E+06
片段之數目	21	21	24	24	16	16
REP前每個片段之平均TVC	6.65E+06	2.06E+06	1.12E+06	5.75E+05	7.66E+05	2.18E+05
在REP前第11天之Gen 3外推值	N/A	6.79E+07	N/A	2.17E+07	N/A	5.49E+06

* L4055，未過濾之培養基。

關於Gen 2及Gen 3過程，根據過程條件對TVC計數且生成該過程之每一天的活細胞百分比。在收集時，收集第22天(Gen 2)及第16天(Gen 3)細胞且建立TVC計數。接著，使TVC除以第0天所提供之片段的數目，以計算每個片段之活細胞平均值。藉由使收集TVC除以REP起始TVC來計算擴增倍數。如表52中所展現，比較Gen 2及Gen 3，L4054之擴增倍數類似；在L4055之情況下，Gen 2過程之擴增倍數較高。特定言之，在此情況下，在REP起始日之前24對培養基加溫。關於M1085T，在Gen 3中亦觀察到較高擴增倍數。對第22天關於Gen 3過程所預期之TVC數目進行外推計算，其係使REP TVC除以16且接著乘以22來計算的。表52. TIL最終產品之總活細胞計數及擴增倍數。

腫瘤ID	L4054	L4055	M1085T
過程	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3
#片段	21	21	24	24	16	16
TVC /片段(在收集時)	3.18E+09	8.77E+08	2.30E+09	3.65E+08	7.09E+08	4.80E+08
REP起始	1.42E+08	4.32E+07	2.68E+07	1.38E+07	1.23E+07	3.50E+06
規模縱向擴大	3.36E+09	9.35E+08	3.49E+09	8.44E+08	1.99E+09	3.25E+08
收集	6.67E+10	1.84E+10	5.52E+10	8.76E+09	1.13E+10	7.68E+09
收集/ REP起始時之擴增倍數	468.4	425.9	2056.8	634.6	925.0	2197.2
在REP收集第22天之Gen 3外推值	N/A	2.53E+10	N/A	1.20E+10	N/A	1.06E+10

* L4055，未過濾之培養基。

表53：TIL最終產品之活力%：在收集後，針對活力%，將最終TIL REP產品與釋出標準進行比較。Gen 2及Gen 3過程之所有條件均超過70%活力標準且在過程及腫瘤中可相當。

在收集後，針對活力%，將最終TIL REP產品與釋出標準進行比較。Gen 2及Gen 3過程之所有條件均超過70%活力標準且在過程及腫瘤中可相當。表53. REP (TIL最終產品)之活力%

腫瘤ID	L4054	L4055	M1085T
過程	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3
REP起始	98.23%	97.97%	97.43%	92.03%	81.85%	68.27%
規模縱向擴大	94.00%	93.57%	90.50%	95.93%	78.55%	71.15%
收集	87.95%	89.85%	87.50%	86.70%	86.10%	87.45%

歸因於每個燒瓶之片段數目低於最大所需數目，計算每個腫瘤在收集日之估計細胞計數。該估計值係基於預期臨床腫瘤足夠大以致在第0天接種2或3個燒瓶。表54. 在Gen 3過程中將估計細胞計數計算外推至全標度2及3燒瓶。

腫瘤ID	L4054	L4055	M1085T
Gen 3過程	2個燒瓶	3個燒瓶	2個燒瓶	3個燒瓶	2個燒瓶	3個燒瓶
估計收集	3.68E+10	5.52E+10	1.75E+10	2.63E+10	1.54E+10	2.30E+10

免疫表型分析- TIL最終產品上之表型標誌物比較。三種腫瘤L4054、L4055及M1085T在Gen 2及Gen 3過程中經歷TIL擴增。在收集後，使REP TIL最終產品經歷流式細胞術分析以測試純度、分化及記憶標誌物。關於所有條件，TCR a/b+細胞之百分率超過90%。

與自Gen 2過程收集之TIL相比，自Gen 3過程收集之TIL顯示較高CD8及CD28表現。Gen 2過程顯示較高CD4+百分率。

與來自Gen 2過程之TIL相比，自Gen 3過程收集之TIL顯示中央記憶隔室上之較高表現。

在來自兩種腫瘤L4054及L4055之TIL中分析活化及耗竭標誌物以比較來自Gen 2及Gen 3 TIL擴增過程之最終TIL產品。在Gen 2與Gen 3過程之間，活化及耗竭標誌物可相當。

在再刺激後，分泌干擾素-γ。對於L4054及L4055，在收集日(對於Gen 2為第22天且對於Gen 3為第16天), TIL用經塗佈之抗CD3板再刺激隔夜。使用抗CD3、CD28及CD137珠粒，對M1085T執行再刺激。在所有條件下再刺激24小時之後收集上清液且使上清液冷凍。使用同一ELISA板，同時對來自兩個過程之上清液評估藉由ELISA進行之IFNγ分析。在所分析之三種腫瘤中，觀察到來自Gen 3過程之較高IFNγ產量。

量測培養基中之IL-2水準。為了在Gen 2與Gen 3過程之間比較IL-2消耗，在腫瘤L4054及L4055之REP起始、規模縱向擴大及收集日時，收集細胞上清液。藉由來自R&D之定量ELISA套組來量測細胞培養上清液中之IL-2的數量。總體趨勢指示，當與Gen 2過程比較時，Gen 3過程中之IL-2濃度保持較高。這可能歸因於Gen 3之REP啟動(6000 IU/mL)時較高的IL-2濃度，以及在整個過程中攜帶培養基。

代謝受質及代謝物分析。量測代謝受質(諸如D-葡萄糖及L-麩醯胺)之水準，作為總體培養基消耗之替代物。量測其相互代謝物，諸如乳酸及氨。葡萄糖為培養基中之簡單糖，其由粒線體用於產生呈ATP形式之能量。當葡萄糖經氧化時，產生乳酸(乳酸酯為乳酸之酯)。乳酸酯在細胞指數生長階段期間強烈產生。高水準之乳酸酯對細胞培養過程具有負面影響。

在兩個過程Gen 2及Gen 3之REP起始、規模縱向擴大及收集日時，收集L4054及L4055之廢培養基。關於Gen 2，在第11天、第16天及第22天；關於Gen 3，在第7天、第11天及第16天，收集廢培養基。在CEDEX Bio-分析儀上分析上清液之葡萄糖、乳酸、麩醯胺、GlutaMax™及氨濃度。

L-麩醯胺係細胞培養基調配物中所需之不穩定的必需胺基酸。麩醯胺含有胺，且此醯胺結構基團可將氮運送及遞送至細胞。當L-麩醯胺氧化時，該細胞產生有毒的氨副產物。為了抵消L-麩醯胺降解，向Gen 2及Gen 3過程之培養基補充GlutaMax™，GlutaMax™在水溶液中更穩定且不會自發地降解。在兩個腫瘤株中，Gen 3組顯示在該過程期間L-麩醯胺及GlutaMax™之降低以及在整個REP中氨之增加。在Gen 2組中，觀察到恆定濃度之L-麩醯胺及GlutaMax™，及氨產生之略微增加。在氨之收集日，Gen 2及Gen 3過程可相當且顯示L-麩醯胺降解之略微差異。

藉由流式-FISH偵測端粒重複。流式-FISH技術用於量測Gen 2及Gen 3過程中在L4054及L4055上之端粒重複的平均長度。使用來自DAKO之用於流式細胞術分析之端粒PNA套組/FITC來計算相對端粒長度(RTL)的確定。Gen 3顯示與Gen 2可相當之端粒長度。

CD3分析。為了確定在每個過程中生成之細胞產品的純系多樣性，對自L4054及L4055收集之TIL最終產品取樣且經由對T細胞受體之CDR3部分測序來分析純系多樣性分析。

表55顯示在TIL收集之細胞產品上，L4054上共享之獨特CDR3序列的百分率在Gen 2與Gen 3之間之比較。在Gen 3與Gen 2最終產品之間共享199個序列，對應於與Gen 3最終產品共享之來自Gen 2之前80%獨特CDR3序列之97.07%。表55. L4054上共享之uCDR3序列在Gen 2與Gen 3過程之間之比較。

# uCDR3 (重疊%)	所有uCDR3之	前80% uCDR3之
Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3
Gen 2-L4054	8915	4355 (48.85%)	205	199 (97.07%)
Gen 3-L4054	-	18130	-	223

表56顯示在TIL收集之細胞產品上，L4055上共享之獨特CDR3序列的百分率在Gen 2與Gen 3之間之比較。在Gen 3與Gen 2最終產品之間共享1833個序列，對應於與Gen 3最終產品共享之來自Gen 2之前80%獨特CDR3序列之99.45%。表56. L4055上共享之uCDR3序列在Gen 2與Gen 3過程之間之比較。

# uCDR3 (重疊%)	所有uCDR3之	前80% uCDR3之
Gen 2	Gen 3	Gen 2	Gen 3
Gen 2-L4055	12996	6599 (50.77%)	1843	1833 (99.45%)
Gen 3-L4055	-	27246	-	2616

在無過濾之情況下預先準備CM1及CM2培養基且保持於4℃下，直至腫瘤L4055使用以在Gen 2及Gen 3過程中使用。

在Gen 2及Gen 3過程中之REP起始日，在37℃下預先對腫瘤L4055之培養基加溫持續24小時。

在該等過程中收集之上清液中未量測到LDH。

用K2 cellometer細胞計數器進行M1085T TIL細胞計數。

在腫瘤M1085T上，樣品不可得，諸如用於代謝分析之上清液、用於活化及耗竭標誌物分析、端粒長度及CD3 - TCR vb分析之TIL產品。

結論。此實例描述3個獨立供體腫瘤組織之功能品質屬性，加上擴展表型表徵及在Gen 2及Gen 3過程中之培養基消耗。

在所生成之總的活細胞及總的有核細胞群體之活力方面，評估Gen 2及Gen 3 REP前及REP擴增比較。在Gen 2 (22天)與Gen 3 (16天)之間，在收集日之TVC細胞劑量不相當。Gen 3細胞劑量低於Gen 2，約為收集時所收集之總的活細胞之40%。

假設REP前收集發生於第11天而非第7天且REP收集發生於第22天而非第16天，計算Gen 3過程之外推細胞數目。在兩種情況下，與Gen 2過程相比，Gen 3顯示更接近之TVC數目，指示早期活化增強TIL生長。

在Gen 3過程中額外燒瓶(2或3個)之外推值的情況下，假設處理之腫瘤的大小更大，且達到所述之每個過程所需的最大數目之片段。觀察到與Gen 2過程中之第22天相比，在Gen 3過程中之第16天收集時可達到相似劑量之TVC。此觀察結果很重要且指示培養物之早期活化減少TIL處理時間。

就表型表徵而言，與Gen 2過程相比，在Gen 3過程中，在三個腫瘤中觀察到較高CD8+及CD28+表現。

與Gen 2過程相比，Gen 3過程顯示略微較高之中央記憶隔室。

Gen 2及Gen 3過程顯示可相當之活化及耗竭標誌物，不過Gen 3過程之持續時間較短。

在所分析之三種腫瘤中，Gen 3最終產品上之IFNγ (IFN gamma)產量比Gen 2高3倍。此資料指示如與Gen 2過程相比，Gen 3過程生成功能更高且效力更強之TIL產品，這可能歸因於Gen 3中之CD8及CD28表現的較高表現。表型表徵表明，與Gen 2過程相比，在Gen 3中，三種腫瘤上之CD8+、CD28+表現呈陽性趨勢。

TIL最終產品上之端粒長度在Gen 2與Gen 3之間可相當。

在Gen 2與Gen 3最終產品之間，葡萄糖及乳酸酯水準可相當，表明與Gen 2相比，Gen 3過程之培養基上的營養物水準未受影響，因為該過程之每一天中均未執行體積減少移出且該過程中之總體培養基體積較小。

與Gen 2過程相比，總體Gen 3過程顯示處理時間之幾乎兩倍減少，這將實質減少由Gen 3過程擴增之TIL產品的商品成本(COG)。

IL-2消耗指示Gen 2過程中之IL-2消耗的總體趨勢，且在Gen 3過程中由於未移出舊培養基，IL-2較高。

Gen 3過程顯示藉由CDR3 TCRab序列分析量測之較高純系多樣性。

在REP前之第0天添加餵養細胞及OKT-3允許TIL之早期活化且允許使用Gen 3過程之TIL生長。

表57描述如與當前Gen 2過程相比，Gen 3過程之各種實施例及後果。表57. 例示性Gen 3過程特徵。

步驟	過程Gen 2實施例	過程Gen 3實施例
REP前-第0天	≤50個片段 1X G-REX-100MCS 1 L培養基 IL-2 (6000 IU/mL) 11天	≤240個片段 ≤60個片段/燒瓶 ≤4個燒瓶 ≤2 L培養基(500 mL/燒瓶) IL-2 (6000 IU/mL) 2.5×108個餵養細胞/燒瓶 15 ug OKT3/燒瓶
REP起始	將新鮮TIL引導至REP 第11天 ≤200e6個活細胞 5×109個餵養細胞 G-REX-500MCS 5 L CM2培養基 + IL-2 (3000 IU/mL) 150 µg OKT3	將新鮮TIL引導至REP 第7天活化整個培養物 5×108個餵養細胞 30 µg OKT3/燒瓶 G-REX-100MCS 500 mL培養基+ IL-2 (6000 IU/mL)
TIL子培養或規模縱向擴大	≤5個G-REX-500MCS ≤1×10個活細胞/燒瓶 5 L/燒瓶第16天	≤4個G-REX-500MCS 使整個培養物規模縱向擴大 4 L/燒瓶第10-11天
收集	收集第22天， LOVO-自動化細胞洗滌器 2個洗滌循環	收集第16天 LOVO-自動化細胞洗滌器 5個洗滌循環
最終調配	冷凍保存之產品 300 IU/mL IL2- CS10於LN2中，多個等分試樣	冷凍保存之產品 300 IU/mL IL-2-CS10於LN2中，多個等分試樣
過程時間	22天	16天

J. 實例 10 ：例示性 GEN 3 過程 ( 亦稱為 GEN 3.1)

此實例描述關於「Gen 2與Gen 3過程之間的TIL擴增可比較性」之進一步研究。修改Gen 3過程以在該過程中包括早期活化步驟，其目的係增加最終總的活細胞(TVC)輸出，同時維持表型及功能型態。如下所示，將Gen 3實施例修改為另一實施例且在本文中在此實例中稱為Gen 3.1。

在一些實施例中，Gen 3.1 TIL製造過程具有四次操作員介入： 1. 腫瘤片段分離及活化：在該過程之第0天，對腫瘤進行解剖且所生成之最終片段各自為約3×3 mm (總計至多240個片段)且在1-4個G-REX100MCS燒瓶中培養。各燒瓶含有至多60個片段、500 mL CM1或DM1培養基，且補充有6,000 IU rhIL-2、15 μg OKT3及2.5×108個經照射之同種異體單核細胞。在37℃下培育該培養物持續6-8天。 2. TIL培養物再活化：在第7-8天，經由緩慢添加CM2或DM1培養基來補充該培養物，在兩種情況下均補充6,000 IU rhIL-2、30 μg OKT3及5×108個經照射之同種異體單核細胞。小心不打擾在燒瓶底部之現有細胞。在37℃下培育該培養物持續3-4天。 3. 培養物規模縱向擴大：發生於第10-11天。在培養物規模縱向擴大期間，將G-REX100MCS之整個內含物轉移至含有4 L CM4或DM2之G-REX500MCS燒瓶，在兩種情況下均補充3,000 IU/mL IL-2。在37℃下培育燒瓶持續5-6天，直至收集。 4. 收集/洗滌/調配：在第16-17天，使燒瓶體積減少且進行匯集。濃縮細胞且用含有1% HSA之PlasmaLyte A pH 7.4洗滌。使經洗滌之細胞懸浮液與CryoStor10以1:1比率進行調配且補充rhIL-2至300 IU/mL之最終濃度。

用控制速率冷凍器對DP進行冷凍保存且儲存於汽相液氮中。*完全標準TIL培養基1、2或4 (CM1、CM2、CM4)可能取代CTS™OpTmizer™ T細胞無血清培養基(稱為成分確定之培養基) (DM1或DM2)，如上文所注釋。

過程描述。在第0天，將腫瘤洗滌3次，接著片段化成3×3×3最終片段。一旦整個腫瘤片段化，則使最終片段相等地隨機化且分成三個池。將一個隨機化片段池引入各組中，每三個實驗矩陣添加相同數目之片段。

關於整個TIL擴增過程，用標準培養基執行腫瘤L4063擴增且用成分確定之培養基(CTS OpTmizer)執行腫瘤L4064擴增。培養基之組分描述於本文中。

CM1完全培養基1：RPMI+麩醯胺，補充有2 mM GlutaMax™、10%人類AB血清、正大黴素(50 ug/mL)、2-巰基乙醇(55 uM)。最終培養基調配物補充有6000 IU/mL IL-2。

CM2完全培養基2：50% CM1培養基 + 50% AIM-V培養基。最終培養基調配物補充有6000 IU/mL IL-2。

CM4完全培養基4：AIM-V，補充有GlutaMax™ (2 mM)。最終培養基調配物補充有3000 IU/mL IL-2。

CTS OpTmizer CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T-細胞擴增補充物(26 mL/L)。

DM1：CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物(26 mL/L)及CTS™免疫細胞SR (3%)以及GlutaMax™ (2 mM)。最終調配物補充有6,000 IU/mL IL-2。

DM2：CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充物(26 mL/L)及CTS™免疫細胞SR (3%)以及GlutaMax™ (2 mM)。最終調配物補充有3,000 IU/mL IL-2。

預先準備所用之所有類型的培養基，亦即完全(CM)及成分確定之(DM)培養基，保持於4℃度下直至使用前一天，且在處理日之前預先在培育箱中在37℃下加溫持續至多24小時。

關於兩種腫瘤，TIL培養物再活化發生於第7天。L4063之規模縱向擴大發生於第10天，且L4064之規模縱向擴大發生於第11天.在第16天，收集兩種培養物且進行冷凍保存。

所實現之結果。對細胞計數且確定Gen 3.0及Gen 3.1過程之活力%。所有條件下之擴增均遵從此實例中所述之詳情。

關於每種腫瘤，將片段分成相等數目之三個池。歸因於腫瘤之較小大小，無法實現每個燒瓶最大數目之片段。關於三個不同過程，評估每種條件下之總的活細胞及細胞活力。細胞計數經確定為第7天之TVC (用於再活化)、第10天(L4064)或第11天(L4063)之TVC (用於規模縱向擴大)及第16/17天在收集時之TVC。

對第7天及第10/11之細胞計數進行FIO。藉由使收集第16/17天TVC除以第7天再活化日TVC來計算擴增倍數。為了比較三個組，使收集日之TVC除以第0天培養物中所添加之片段的數目以便計算每個片段之活細胞平均值。

對L4063及L4064執行細胞計數及活力分析。在兩種腫瘤中，Gen 3.1-測試過程比Gen 3.0過程生成每個片段更多細胞。

該過程期間之總活細胞計數及擴增倍數；活力%。在再活化、規模縱向擴大及收集時，在所有條件下執行活力%。在第16/17天收集時，針對活力%，將最終TVC與釋出標準進行比較。所有所評估之條件均超過70%活力標準且在過程及腫瘤中可相當。

免疫表型分析- TIL最終產品上之表型表徵。使最終產品經歷流式細胞術分析以測試純度、分化及記憶標誌物。TCRα/β、CD4+及CD8+細胞在所有條件下之群體百分比均一致。

對REP TIL執行擴展表型分析。TIL產品在兩種腫瘤上顯示與Gen 3.0相比，在Gen 3.1條件下CD4+細胞之百分率較高，且在兩種條件下，與Gen 3.1條件相比，在Gen 3.0下來自CD8+群體之CD28+細胞之百分率較高。

自Gen 3.0及Gen 3.1過程收集之TIL在CD4+及CD8+細胞上顯示與CD27及CD56表現可相當之表型標誌物，且在CD4+閘控細胞群體上顯示可相當之CD28表現。TIL最終產品上之記憶標誌物比較：

對第16天收集之TIL之冷凍樣品進行染色以供分析。在Gen 3.0與Gen 3.1過程之間，TIL記憶狀態可相當。TIL最終產品上之活化及耗竭標誌物比較：

在CD4+及CD8+細胞上閘控之Gen 3.0與Gen 3.1過程之間，活化及耗竭標誌物可相當。

在再刺激後，分泌干擾素-γ。對於L4063及L4064，所收集之TIL用經塗佈之抗CD3板再刺激隔夜。在所分析之兩種腫瘤中，與Gen 3.0過程相比，觀察到來自Gen 3.1過程之較高IFNγ產量。

量測培養基中之IL-2水準。為了在所有條件及過程之間比較IL-2消耗水準，在第7天再活化起始時、在第10天(L4064) /第11天(L4063)規模縱向擴大時及在收集第16 / 17天時收集細胞上清液，且冷凍。隨後使上清液解凍且接著進行分析。藉由製造商方案來量測細胞培養上清液中之IL-2的數量。

在相同培養基條件下評估之整個過程期間，在IL-2消耗方面，總體Gen 3及Gen 3.1過程可相當。對自L4063及L4064收集之廢培養基進行IL-2濃度(pg/mL)分析。

代謝物分析。在每種條件下，在第7天再活化起始時、在第10天(L4064)或第11天(L4063)規模縱向擴大時及在第16/17天自L4063及L4064收集時，自L4063及L4064收集廢培養基上清液。在CEDEX Bio-分析儀上分析上清液之葡萄糖、乳酸酯、麩醯胺、GlutaMax™及氨濃度。

與完全培養基(2 g/L)相比，成分確定之培養基具有4.5 g/L之較高葡萄糖濃度。總之，在每種培養基類型內，Gen 3.0及Gen 3.1過程之葡萄糖濃度及消耗可相當。

觀察到乳酸酯之增加且在Gen 3.0與Gen 3.1條件之間且在用於再活化擴增之兩種培養基(完全培養基及成分確定之培養基)之間，乳酸酯之增加可相當。

在一些情況下，標準基礎培養基含有2 mM L-麩醯胺且補充有2 mM GlutaMax™以補償L-麩醯胺在培養條件下天然降解為L-麩胺酸及氨。

在一些情況下，所用之成分確定之(無血清)培養基不含基礎培養基中之L-麩醯胺，且僅用GlutaMax™補充至2 mM之最終濃度。GlutaMax™為L-丙胺酸及L-麩醯胺之二肽，在水溶液中比L-麩醯胺更穩定且不會自發地降解為麩胺酸及氨。相反，該二肽逐漸解離成個別胺基酸，由此維持較低但足夠濃度之L-麩醯胺以持續穩健細胞生長。

在一些情況下，麩醯胺及GlutaMax™之濃度在規模縱向擴大日略微降低，但在收集日，與再活化日相比顯示增加至相似或較接近水準。關於L4064，在整個過程期間，麩醯胺及GlutaMax™濃度在不同條件之間顯示相似速率之略微降解。

與在含有2 mM GlutaMax™)之成分確定之培養基中生長的彼等樣品相比，在含有2 mM麩醯胺 + 2 mM GlutaMax™)之標準培養基中生長之樣品中的氨濃度較高。此外，如預期，在培養過程中氨逐漸增加或積聚。在三種不同測試條件下，氨濃度無差異。

藉由流式-FISH偵測端粒重複。流式-FISH技術用於量測Gen 3及Gen 3.1過程中在L4063及L4064上之端粒重複的平均長度。使用來自DAKO之用於流式細胞術分析之端粒PNA套組/FITC來計算相對端粒長度(RTL)的確定。執行端粒分析。使樣品中之端粒長度與對照細胞株(1301白血病)進行比較。該對照細胞株係具有長穩定端粒之四倍體細胞株，其允許計算相對端粒長度。在兩種腫瘤中評估之Gen 3及Gen 3.1過程顯示可相當之端粒長度。 TCR Vβ譜系分析

為了確定在每個過程中生成之細胞產品的純系多樣性，經由對T細胞受體之CDR3部分測序來分析TIL最終產品之純系多樣性分析。

在三種條件之間比較三種參數： ● 獨特CDR3 (uCDR3)之多樣性指數 ● 共享uCDR3% ● 關於前80%之uCDR3： ○ 比較共享uCDR3複本% ○ 比較獨特純系型之頻率

對照及Gen 3.1測試，在TIL收集之細胞產品上的共享獨特CDR3序列之百分率：在Gen 3與Gen 3.1測試最終產品之間共享975個序列，等於與Gen 3.1共享之來自Gen 3之前80%獨特CDR3序列之88%。

對照及Gen 3.1測試，在TIL收集之細胞產品上的共享獨特CDR3序列之百分率：在Gen 3與Gen 3.1測試最終產品之間共享2163個序列，等於與Gen 3.1共享之來自Gen 3之前80%獨特CDR3序列之87%。

關於不同過程，自收集第16天收集之1×10 ⁶個細胞鑑定之獨特CD3序列的數目。基於樣品內之獨特肽CDR的數目，Gen 3.1測試條件顯示與Gen 3.0相比略微較高之純系多樣性。

Shannon熵多樣性指數係可靠且常用之比較指標，因為兩種腫瘤上之Gen 3.1條件均顯示略微高於Gen 3過程之多樣性，表明Gen 3.1條件之TCR Vβ譜系比Gen 3.0過程更具多株性。

另外，在兩種腫瘤L4063及L4064上，Gen 3.1測試條件之TCR Vβ譜系顯示與Gen 3.0過程之對應譜系的超過87%重疊。

在再活化日，Gen 3.1測試L4064之廢培養基中之IL-2濃度值低於預期值(類似於Gen 3.1對照及Gen 3.0條件)。

該低值可能歸因於吸移誤差，但由於所取樣品極少，可能無法重複該分析。

結論。與Gen 3.0及Gen 3.1對照相比，Gen 3.1測試條件(包括第0天之餵養細胞及OKT-3)顯示收集第16天細胞劑量之較高TVC。Gen 3.1測試條件之最終產品上的TVC比Gen 3.0高約2.5倍。

對於所測試之兩個腫瘤樣品，其中第0天添加OKT-3及餵養細胞之Gen 3.1測試條件在收集時達到燒瓶之最大容量。在此等條件下，若在第0天起始最多4個燒瓶，則最終細胞劑量可能在80 - 100×109個TIL之間。

在Gen 3.1測試與Gen 3.0過程之間，維持最終TIL產品之所有品質屬性，諸如表型表徵，包括純度、耗竭、活化及記憶標誌物。

在所分析之兩種腫瘤中，與Gen 3.0相比，在其中第0天添加餵養細胞及OKT-3之Gen 3.1中，最終TIL產品中之IFN-γ產量為3倍高，表明Gen 3.1過程生成有效TIL產品。

在測試條件下，未觀察到葡萄糖及乳酸酯水準之差異。在培養基條件下，在Gen 3.0與Gen 3.1過程之間未觀察到麩醯胺及氨之差異。培養基中之低麩醯胺水準未限制細胞生長且表明培養基中僅添加GlutaMax™足以生成使細胞增生所需之營養物。

分別在第11天及第10天進行規模縱向擴大且並未顯示在該過程之收集日達到的細胞數目之重大差異，且在整個過程期間，在兩種條件下，代謝物消耗可相當。此觀察結果表明，Gen 3.0最佳化過程可在處理日方面具有靈活性，由此促進製造排程之靈活性。

與Gen 3.0相比，其中第0天添加餵養細胞及OKT-3之Gen 3.1過程顯示藉由CDR3 TCRab序列分析量測之較高純系多樣性。

圖47描述Gen 3過程(Gen 3最佳化過程)之實施例。標準培養基及CTS Optimizer無血清培養基可用於Gen 3最佳化過程TIL擴增。在CTS Optimizer無血清培養基之情況下，推薦將培養基中之GlutaMax™增加之最終濃度4 mM。 K. 實例 11 ：使用 TALEN 在 TIL 中剔除 PD-1

該實例證實使用TALEN生成PD-1剔除(KO) TIL。在此實例中，一般程序如下：第0天 - REP前第7天 - 活化第12天 - 電穿孔第13天 - REP 第18天 - 規模縱向擴大第22天 - 收集

概述：此研究使用TALEN®基因工程改造技術以使用TALEN® mRNA構築體永久剔除PDCD-1基因(PD-1表面蛋白)。由1個肺(L4256)及2個黑色素瘤(M1207及M1209)腫瘤生成PD-1 KO TIL且接著進行表徵。

背景：已真是免疫-檢查點受體與其配位體之間的銜接抑制T細胞功能。PD-1係由經活化/耗竭T細胞表現之關鍵抑制調節因子，已獲得廣泛研究且為免疫療法之主要標靶。鑒於抗PD-1療法在改良癌症患者之臨床後果方面取得成功，靶向PD-1/PD-L1軸之方法可增強免疫療法之效率。過繼性TIL療法為癌症之挽救性免疫療法，在黑色素瘤患者中具有56%客觀反應。由於PD-1在活體內抗原刺激後在TIL中經調節，由腫瘤細胞表現之PD-1與PD-L1之間的相互作用可能潛在地抑制TIL功能。TALEN®之基因編輯已證實在人類及小鼠T細胞中具有永久基因破壞之高度特異性。在B16鼠科動物模型中，PD-1 TALEN®® T細胞之過繼性轉移揭示優越腫瘤控制，且增加腫瘤位點處浸潤性T細胞之效應子功能及增生能力。因此，檢查TALEN®介導之PD-1 KO在過繼性轉移之後是否可能增強TIL之活體內功能。

實驗設計：如圖49中之實驗佈局所示進行臨床製造規模運行，且臨床製造PD-1 KO TIL過程之概覽提供於表42及表43中。

該方法亦用於生成PD-1/CTLA-4雙剔除TIL、PD-1/LAG-3雙剔除TIL、PD-1/CISH雙剔除TIL、PD-1/TIGIT雙剔除TIL及PD-1/CBL-B雙剔除TIL。在此類情況下，可藉由在電穿孔步驟期間分別用PD-1及CTLA-4 TALEN mRNA、PD-1及LAG-3 TALEN mRNA、PD-1及CISH TALEN mRNA、PD-1及TIGIT TALEN mRNA或PD-1及CBL-B TALEN mRNA對TIL進行電穿孔來生成該等雙剔除。表42：關於REP前、活化、電穿孔及休止之過程概述(部分- I)

過程步驟	全尺寸過程
REP 前CM-1 IL-2 G-Rex 片段	第 0 天 ( 類似於 Gen 2 第 0 天批次記錄 )1 L 6000 IU/mL 100MCS ＜100
活化EXP-500中之TransAct	第 7 天● 體積減少且將REP前細胞轉移至EXP-500袋(約100 mL) ● 若REP前產量＜50 × 10 ⁶個細胞，則將5.7 mL T細胞TransAct ™試劑添加至EXP-500袋中。 ● 若REP前產量＞50 × 10 ⁶個細胞，則將具有6000 IU IL-2/mL及11.4 mL T細胞TransAct™試劑之100 mL CM-1添加至EXP-500袋中。
電穿孔	第 12 天體積減少且相等地分成2個部分且設置2個組： 1. 模擬條件 - 經電穿孔之細胞(無mRNA) 2. TriLink條件 - 經電穿孔之KO TIL (PD-1 KO，具有mRNA TALEN®)
休止	將電穿孔後細胞轉移至G-Rex 10中具有6000 IU IL-2/mL之20 mL CM-1

表43：關於REP、規模縱向擴大及收集之過程概述(部分-II)

過程步驟
REPTIL iPBMC CM-2 IL-2 OKT3 (1 mg/mL) G-Rex	第 13 天 - 每個燒瓶 (TALEN® TriLink 條件 ) 相等TVC (每個燒瓶最多25×10 ⁶個細胞) 0.5 × 10 ⁹個細胞 1 L 3000 IU/mL 30 ng/mL G-Rex 100MCS	第 13 天 ( 模擬條件 ) 類似於TALEN條件
規模縱向擴大TIL CM-4 IL-2 G-Rex	第 18 天將1 L TIL轉移至G-Rex 500MCS 將4 L添加至燒瓶 3000 IU/mL G-Rex 500MCS	第 18 天類似於TALEN條件
收集	第 22 天收集	第 22 天體積減少，以20-100 × 10 ⁶個細胞/mL冷凍保存CRF

結果：表44規定用於評估全尺寸實驗效能之接受標準，表45規定所執行之額外最終產品表徵測試，且表46列出用於此研究中之腫瘤及相關組織學。表44：過程中及收集產品釋出測試及接受標準

測試類型	方法	接受標準
過程中測試
表徵及活化 (% CD3/CD45/CD25/CD71)	流式細胞術	報告結果
第11天之細胞活力(電穿孔後)	螢光	報告結果
第11天之細胞恢復% (電穿孔後)	螢光	報告結果
釋出測試
細胞活力	螢光	＞70%
總活細胞計數	螢光	0.25 × 10 ⁹至150 × 10 ⁹
純度(%CD45+CD3+)	流式細胞術	＞90% CD45+CD3+細胞
IFNg (經刺激-未經刺激)	珠粒刺激及ELISA	報告結果
PD-1剔除效率	活化及流式細胞術	報告結果

表45：最終產品表徵

測試類型	方法	報告結果
活化後複製%Ki67	流式細胞術	報告結果
純度及記憶T細胞子集表型	流式細胞術	報告結果
活化及耗竭標誌物表型	流式細胞術	報告結果
顆粒酶B	珠粒刺激及ELISA	報告結果
CD107A	促分裂原刺激及流式細胞術	報告結果
TCR Vβ測序	深度測序(iRepertoire, Inc)	報告結果 (若可用)
代謝物分析	Cedex Biochemical分析儀	報告結果

表46：此研究中所用之腫瘤

實驗	組織學	Iovance ID	額外腫瘤資訊
全尺寸 1	黑色素瘤	M1207	供應商ID：MAD21-00204-T1-01 (CHTN)，0.47 g
全尺寸 2	黑色素瘤	M1209	供應商ID：013-Y118 (MTG)，g
全尺寸 3	肺	L4256	供應商ID：769734A1 (BioIVT)，0.57 g

第5天REP前總活細胞計數(TVC)生成平均45 × 10 ⁶個細胞，其中平均活力為73%。對於所有三種腫瘤，活化後之細胞倍增一致。黑色素瘤及子宮頸適應症顯示相似的活化狀態，其中活化標誌物具有＞50% CD25+及CD71+。然而，肺腫瘤L4213顯示活化標誌物CD71之較低表現，為33%。在所有三個樣品中，Ki67表現始終大於90%，指示細胞正在積極增生。來自此研究中所用之三種腫瘤的REP前及活化後之輸出概述於表47中。表47：REP前及活化後細胞培養概述

參數	接受標準	L4256	M1207	M1209
片段數目	≤ 100個片段	73	40	95
TVC (× 10 ⁶)	≥ 5	26.9	13.4	69.2
活力 (%)	N/A	97.9	88.6	97.5
TVC (× 10 ⁶)	N/A	120.0	37.8	419.0
活力 (%)	N/A	92.0	82.6	92.8
倍增 (D7 至 D12)	N/A	2.2	1.5	2.6
% CD45+/CD3+	N/A	80.4	83.1	60.1
% CD25+ ¹	N/A	92.2	88.5	66.8
% CD71+ ¹	N/A	75.6	87.8	48.9
% Ki-67+ ²	N/A	78.6	81.0	7.3

¹第10天活化後組之閘控策略：淋巴細胞＞ SSC單線態＞ FSC單線態＞活細胞＞ CD3+CD45 ＞ CD25+/ CD71+ ²Ki67組之閘控策略：淋巴細胞＞ SSC單線態＞ FSC單線態＞活細胞＞ CD45+ ＞ Ki67+

在第13天(休止後)計算活力及TVC恢復以確定電穿孔之效率。在所有條件下，電穿孔後細胞之活力%之恢復介於82-92%範圍內。在經電穿孔之樣品中，TVC之恢復介於16-30%範圍內。來自電穿孔及休止之資料概述於表48中。表48：電穿孔及REP起始概述

參數	接受標準	L4256	M1207	M1209
	T	M			T	M			T	M
第 12 天電穿孔前 TVC (× 10 ⁶)	＞3 x 10 ⁶	120	38	419
第 12 天電穿孔前活力 (%)	N/A	92	83	93
第 13 天電穿孔後 / 休止 TVC (× 10 ⁶)	N/A		9.5	15			2.4	2.4			3.7	13
第 13 天電穿孔後 / 休止活力 (%)	N/A		76	85			68	76			85	92
活力恢復 ¹ (%)	N/A		82	92			83	92			92	99
細胞恢復 ¹ (%)	N/A		19	30			16	16			4	13

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) ¹恢復，藉由使電穿孔後TVC或活力除以電穿孔前TVC或活力且乘以100來計算。 ²在所有條件下，接種至REP中之TVC的一致性係每個腫瘤之所有D11 TVC中最低的。

在實驗及對照條件下，使用相同數目之細胞來起始REP。在REP規模縱向擴大時，所有實驗及對照條件擴展平均4次細胞倍增。在REP收集時，TriLink實驗組TVC產量類似於模擬對照(＜ 20% TVC差異)。未經電穿孔之TVC產量略微高於TriLink及模擬對照組。在第11天至第20天之間觀察到平均9.8次細胞倍增。

使用TriLink組之最終產品劑量分別為16.5、28.5及28.7 × 10 ⁹，具有＞ 90%活力及＞ 98% CD45+CD3+細胞。最終產品為高度富集之TIL產品。

來自REP起始及收集之資料概述於表49中。表49：REP後及收集概述

參數	接受標準	L4256	M1207	M1209
TALEN 組	模擬對照	TALEN 組	模擬對照	TALEN 組	模擬對照
REP 起始
接種之 TVC ¹ (× 10 ⁶)	N/A	9.49	9.49	2.38	2.38	3.69	3.69
REP 後及收集
LOVO 前之 TVC (× 10 ⁹)	N/A	11.8	12.3	0.8	0.8	8.57	10.6
# 倍增 ⁴ (D13 至 D22)	N/A	10.3	10.3	8.4	8.4	11.2	11.5
LOVO 後之 TVC (× 10 ⁹)	N/A	9.67	N/A ⁵	0.7	N/A ⁵	8.3	N/A ⁵
LOVO 後恢復 ² (%)	N/A	82	84	97
外推之 TVC ³ (× 10 ⁹)	0.25 - 150	11.6	0.9	8.3
活力 %	≥ 70%	91	94	93	95	99	98
% CD45+/CD3+	≥ 90%	98	98	98	98	99	100

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) ¹在所有條件下，接種至REP中之TVC的一致性係每個腫瘤之所有D11 TVC中最低的。 ²恢復，藉由使LOVO後TVC除以LOVO前TVC且乘以100來計算。 ³假設產量，若所有細胞均繼續進入實驗及對照條件中。在第12天(在電穿孔前)，將細胞分佈於實驗(TriLink mRNA)及對照條件(模擬物)中。藉由使收集量乘以係數3來計算假設產量。 ⁴基於式「=LOG(第22天TVC/第11天TVC)/LOG(2)」計算細胞倍增。 ⁵未根據方案執行LOVO。 ⁶批次規模較小，未執行LOVO

所有TriLink TALEN® mRNA條件均滿足接受標準。

評估TALEN®介導之PD-1 KO TIL產品之剔除效率的資料概述於表50中。表50：TIL PD-1 KO概述

基於模擬物之 PD-1 KO 效率 % ( 流式 )	接受標準	L4256	M1207	M1209
報告結果	47.6	47.8	63.5

評估收集TIL之功能的資料(包括IFNg、顆粒酶-B及CD107a釋出輸出)概述於表51中。表51：TIL功能概述

特徵	L4256	M1207	M1209
T	M	T	M	T	M
經刺激之 IFNg (pg/mL)	7224	7146	2876	5624	3464	3945
未經刺激之 IFNg (pg/mL)	154	164	61	197	119	82
IFNg ，刺激 - 未經刺激 (pg/mL)	7070	6981	2815	5426	3345	3863
經刺激之顆粒酶 B (pg/mL)	17174	32605	15036	40185	19960	22763
未經刺激之顆粒酶 B (pg/mL)	2145	3624	4901	6889	2367	2300
顆粒酶 B ，刺激 - 未經刺激 (pg/mL)	15029	28981	10136	33296	17593	20463
% CD4+CD107A ¹	86	87	84	88	48	53
% CD8+CD107A ¹	81	85	72	87	67	73

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) ¹刺激活細胞/CD3+上之閘控

基於用抗CD3/抗CD28/抗CD137 Dynabeads刺激隔夜來表徵TIL之功能性。在24小時刺激之後收集上清液且進行冷凍。執行ELISA以評估釋出至上清液中之IFNg及顆粒酶B的濃度。IFNg釋出大於500 pg/mL，且所有TIL培養物在刺激後分泌始終高水準(15036 pg/mL - 40185 pg/mL)之顆粒酶B。

CD107a (LAMP-1)為淋巴細胞脫粒之標誌物，與細胞毒性活性相關(Aktas E等人, 2009)，在抗原刺激或多株刺激後表現。藉由流式細胞術分析CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞回應於2 h PMA刺激之CD107a細胞表面表現。表51中呈遞之結果係在未刺激條件下CD107A表現之量測值。與先前研究中生成之TIL產品相似，當用PMA/IO (CD4+及CD8 + TIL)刺激時，最終產品中之大部分TIL表現CD107A。

多色流式細胞術用於表徵REP TIL之TIL純度、一致性、記憶子集。＜ 1%之可偵測B細胞、單核球或NK細胞存在於最終收集之TIL中(表11)。REP TIL主要由具有效應子記憶分化之TCRa/b組成。CD4/CD8比率在樣品之間可變，但在單一樣品之條件之間一致。在實驗與對照條件之間未觀察到明顯差異。

顯示TIL純度、一致性及記憶表型之資料概述於表52中。表52：TIL純度、一致性及記憶表型表徵

特徵 ( 在活細胞上閘控 )	歷史值 ¹ (n=64)	L4256	M1207	M1209
T	M	T	M	T	M
雜質	NK 細胞 (%)	(0.0-5.9)	0	0	1	0	0	0
B 細胞 (%)	(0.0-0.3)	0	0	0	0	0	0
單核球 (%)	(0.0-0.2)	1	1	1	0	0	2
T 細胞一致性	TCRα/β (%)	(68.4-99.7)	96	97	71	90	74	95
TCRγ/δ (%)	(0.1-31.2)	0	0	3	2	0	0
TCRα/β+ CD4+ (%)	(0.7-94.5)	84	84	66	68	15	15
TCRα/β+ CD8+ (%)	(3.7-97.6)	14	13	27	26	63	77
記憶表型 -TCRαβ+	原生： (% CCR7+CD45RA+)	(0.0-18.8)	0	0	0	0	0	0
T-EM (% CCR7-CD45RA-)	(3.2-97.8)	93	92	83	92	77	98
T-CM (% CCR7+CD45RA-)	(1.2-73.4)	7	8	17	8	1	1
T-EFF/TEMRA ： (% CCR7-CD45RA+)	(0.0-75.0)	0	0	0	0	23	2

注意：TIL純度之閘控策略顯示如下：單核球：%活細胞、CD14+ NK (天然殺手)細胞：%活細胞、CD14-、CD3-、CD56+CD16+ B細胞：%活細胞、CD14-、CD3-、CD19+ T-CM- 中央記憶T細胞 T-EM- 效應子記憶T細胞 T-EFF/TEMRA- 效應子記憶及RA+效應子記憶

顯示CD4+、CD8+及CD3+ TIL之TIL活化及耗竭水準之資料概述於表53-55中。表53：CD4+ TIL之活化及耗竭狀態

特徵 ²	歷史值 ¹ (n=64)	L4256	M1207	M1209
T	M	T	M	T	M
分化	CD27+ (%)	(0.1-7.9)	1.1	0.9	2.0	1.4	31.2	19.8
CD28+ (%)	(0.7-80.2)	99.4	98.8	97.1	92.6	98.8	98.8
CD57+ (%)	(0.1-29.6)	5.8	2.8	4.3	5.3	19.4	27.6
KLRG1+ (%)	(0.2-43.7)	13.9	7.8	27.7	12.1	0.8	4.1
活化	2B4+ (%)	(0.2-18.5)	1.1	0.9	2.9	1.0	0.3	0.6
BTLA+ (%)	(32.9-98.0)	97.0	92.9	98.8	97.4	99.9	99.9
CD25+ (%)	(10.4-98.6)	47.8	42.6	49.7	47.4	8.1	16.2
CD69+ (%)	(15.3-88.8)	23.2	20.8	34.2	23.1	4.7	7.5
CD95+ (%)	(4.8-100.0)	97.8	96.7	96.4	93.4	99.9	99.9
耗竭	LAG3+ (%)	(1.6-28.3)	2.6	1.2	2.5	0.7	0.1	0.3
PD1+ (%)	(5.7-85.6)	5.0	10.6	3.4	1.8	8.8	5.3
TIGIT+ (%)	(16.6-82.1)	34.9	32.8	32.4	24.9	20.1	30.1
TIM3+ (%)	(35.7-91.3)	99.9	99.4	99.7	99.2	99.0	98.7

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) NE=未電穿孔 ¹上表10中報告之歷史值(n=64)取自REP-0112中之TIL-2組的分析 - 擴展之lifileucel表型表徵及在表型與臨床反應之間的相關性分析。 ²歷史範圍之閘控策略及層次如下：FSC單線態＞ SSC單線態2 ＞活細胞＞ CD3+ ＞ CD4+ ＞ CD4+頻率% 表54：CD8+ TIL之活化及耗竭狀態

特徵 ²	歷史值 ¹ (n=64)	L4256	M1207	M1209
T	M	T	M	T	M
分化	CD27+ (%)	(0.3-57.6)	4.8	3.8	11.4	8.5	53.6	46.2
CD28+ (%)	(0.5-76.2)	93.1	87.4	92.1	79.4	98.7	97.9
CD57+ (%)	(0.1-30.8)	1.6	0.9	2.0	2.3	14.3	13.9
KLRG1+ (%)	(0.6-68.4)	10.3	4.8	30.1	19.2	3.1	7.2
活化	2B4+ (%)	(18.4-79.5)	1.3	1.1	5.2	2.6	0.6	1.0
BTLA+ (%)	(26.7-99.3)	95.5	88.1	96.5	93.3	99.8	99.8
CD25+ (%)	(0.8-98.8)	46.2	37.6	34.5	37.5	7.0	11.1
CD69+ (%)	(10.6-85.4)	13.0	10.2	47.7	33.9	18.1	22.6
CD95+ (%)	(75.0-100.0)	92.4	88.2	90.6	82.8	99.9	99.9
耗竭	LAG3+ (%)	(3.1-57.2)	2.1	0.9	1.4	0.4	0.5	0.6
PD1+ (%)	(3.1-88.1)	2.4	5.1	1.7	1.4	9.7	5.0
TIGIT+ (%)	(17.7-97.8)	65.4	65.4	47.9	46.2	40.2	37.8
TIM3+ (%)	(35.3-97.0)	99.3	98.7	98.6	97.1	99.7	99.5

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) NE=未電穿孔 ¹上表10中報告之歷史值(n=64)取自REP-0112中之TIL-2組的分析 - 擴展之lifileucel表型表徵及在表型與臨床反應之間的相關性分析。 ²歷史範圍之閘控策略及層次如下：FSC單線態＞ SSC單線態2 ＞活細胞＞ CD3+ ＞ CD8+ ＞ CD8+頻率%

TriLink mRNA條件之CD4及CD8分化、活化及耗竭狀態與對照條件可相當。表55：CD3+ TIL之活化及耗竭狀態

特徵	歷史值 ¹ (n=64)	L4256	M1207	M1209
T	M	T	M	T	M
CD27+ (%)	(0.7-59.0)	1.4	1.2	5.0	3.8	45.3	36.9
CD28+ (%)	(12.7-92.0)	97.8	95.9	92.8	83.9	96.1	94.2
CD56+ (%)	(0.7-35.4)	0.3	0.3	9.5	7.8	8.7	4.0
CD57+ (%)	(1.1-35.5)	5.0	2.5	3.4	4.2	11.8	12.1
BTLA+ (%)	(33.3-99.2)	90.1	78.1	87.5	84.3	99.8	99.8
CD25+ (%)	(1.0-96.7)	48.5	42.6	39.3	42.3	6.2	10.0
CD69+ (%)	(13.2-82.9)	19.6	16.4	42.0	27.5	17.6	21.7

T= TriLink M= 模擬物(無TALEN mRNA之情況下經電穿孔) NE=未電穿孔 ¹上表10中報告之歷史值(n=64)取自REP-0112中之TIL-2組的分析 - 擴展之lifileucel表型表徵及在表型與臨床反應之間的相關性分析。 ²歷史範圍之閘控策略及層次如下：FSC單線態＞ SSC單線態2 ＞活細胞＞ CD3+ ＞ CD3+頻率%

在CD3+群體中，TriLink mRNA條件之活化及耗竭狀態與對照條件可相當。

結論：以臨床製造過程規模開發PD-1 KO TIL過程以在20天內將PD-1 KO TIL擴增至＞ 16 e9。使用以開發規模製造之TriLink mRNA的所有三個批次均滿足釋出參數之接受標準。

使用PD-1-KO TIL過程生成之TIL的所有品質屬性(諸如表型表徵，包括純度、記憶、活化、耗竭標誌物及功能)與黑色素瘤Gen 2可相當。參見表56。

總之，此工作證實在使用TriLink mRNA之臨床製造PD-1 KO TIL過程中可實現大於50%之PD-1 KO效率，由此支持TriLink mRNA用於臨床製造。表56：概述表

測試參數	接受標準 / 預期結果	L4256	M1207	M1209
細胞活力	≥ 70%	通過	通過	通過
總活細胞計數	0.25至 150 × 10 ⁹	通過	通過	通過
一致性 (%CD45+/CD3+)	≥ 90% CD45+CD3+細胞	通過	通過	通過
PD-1 KO 效率 %	報告結果	通過	通過	通過
IFNg ( 經刺激 - 未經刺激 )	≥ 500 pg/mL	通過	通過	通過

替代PD-1剔除(KO) TIL過程顯示於圖50及表57中。表57：用於PD-1 TIL培養之替代全尺寸過程的概覽

過程步驟	全尺寸過程
REP 前CM-1 IL-2 G-Rex 片段	第 0 天1 L 6000 IU/mL 100MCS ＜ 100
活化EXP-500中之TransAct	第 5 天● 體積減少且將REP前細胞轉移至EXP-500袋(約100 mL) ● 若REP前＜50 × 10 ⁶個細胞，則將5.7 mL T細胞TransAct ™試劑添加至EXP-500袋中。 ● 若REP前＞50 × 10 ⁶個細胞，則將具有6000 IU IL-2/mL及11.4 mL T細胞TransAct™試劑之100 mL CM-1添加至EXP-500袋中。
電穿孔及休止	第 10 天體積減少且相等地分成4個部分，進入以下組： 3. 模擬條件 - 經電穿孔之細胞(無mRNA) 4. 未電穿孔(NE)之條件 - 未電穿孔之細胞(無mRNA) 5. TriLink條件 - 經電穿孔之KO TIL (PD-1 KO，具有mRNA TALEN®®) 將電穿孔後及NE細胞轉移至G-Rex 10中具有6000 IU IL-2/mL之20 mL CM-1
REP TIL iPBMC CM-2 IL-2 OKT3 (1 mg/mL) G-Rex	第 11 天 - 每個燒瓶 (TALEN®® TriLink 條件 )所有條件之間的相等TVC 每個燒瓶最多25×10 ⁶個細胞 (最多4個燒瓶) 0.5e9個細胞 1 L 3000 IU/mL 30 ng/mL (30 µL) G-Rex 100MCS	第 11 天 ( 模擬條件 )所有條件之間的相等TVC (最多1個燒瓶) 0.5e9個細胞 1 L 3000 IU/mL 30 ng/mL (30 µL) G-Rex 100MCS	第 11 天 (NE 條件 )所有條件之間的相等TVC (最多1個燒瓶) 0.5e9個細胞 1 L 3000 IU/mL 30 ng/mL (30 µL) G-Rex 100MCS

規模縱向擴大TIL CM-4 IL-2 G-Rex	第 16 天將1 L TIL轉移至G-Rex 500MCS 將4 L添加至燒瓶 3000 IU/mL G-Rex 500MCS	第 16 天將1 L TIL轉移至G-Rex 500MCS 將4 L添加至燒瓶 3000 IU/mL G-Rex 500MCS	第 16 天轉移燒瓶之1% 將40 mL添加至燒瓶 3000 IU/mL G-Rex 5M
收集	第 20/21 天收集	第 20/21 天體積減少，以20-100 × 10 ⁶個細胞/mL冷凍保存CRF	第 20/21 天將產品以10-15個等分試樣冷凍保存於CS-10中

L. 實例 12 ：經基因修飾之 PDCD-1 剔除 (KO) 腫瘤浸潤性淋巴細胞 (TIL) 細胞療法之臨床前活性及製造可行性 3.背景

在患有晚期實體腫瘤之患者中，使用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL；lifileucel、LN-145)之過繼性細胞療法已在免疫檢查點抑制劑(ICI)後及未接受過ICI之設定中證實振奮人心之功效及安全性。在患有晚期/不可切除之黑色素瘤之患者中的ICI後設定中，一次性lifileucel TIL細胞療法實現持久反應(Sarnaik AA, Hamid A, Khushalani NI等人 J Clin Oncol. 2021;39(24):2656-2666；Larkin JMG, Sarnaik A, Chesney JA等人 J Clin Oncol. 2021;39(suppl 增刊15):摘要9505.)，其中客觀反應率(ORR)為36%且在33.1個月隨訪後未達到反應持續時間(DOR)。在患有晚期黑色素瘤之未接受過ICI之患者中，lifileucel加派姆單抗之早線組合導致60% ORR，及30%完全反應率(O’Malley D, Lee S, Psyrri A等人 J Immunother Cancer. 2021;9(增刊2):摘要492)

儘管有效，但抗程序性細胞死亡蛋白(PD)-1 ICI療法由於不良滲透至腫瘤中、內化及內吞清除而受到限制(Thurber GM, Schmidt MM, Dane Wittrup K. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(12):1421-1434；Less JR, Posner MC, Boucher Y, Borochovitz D, Wolmark N, Jain RK.Cancer Res.1992;52(22):6371-6374；Netti PA, Baxter LT, Boucher Y, Skalak R, Jain RK.Cancer Res.1995:55(22):5451-5458；Bordeau BM, Balthasar JP. Cancer Biol Med.2021;18(3): 649-664；Saga T, Neumann RD, Heya T等人 Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(19):8999-9003)；相比之下，TIL主動運送至腫瘤中，可基於化學吸引獨立移動，且未經清除或內化(Restifo NP, Dudley ME, Rosenberg SA. Nat Rev Immunol. 2018;12(4):269-281)。抗PD-1抗體之投與導致免疫相關不良事件(AE)，因為經由T細胞之全身性活化及增生，免疫路徑非特異性上調(Postow MA, Sildow R, Hellmann MD. N Engl J Med. 2018;378:158-168)。

IOV-4001為PDCD-1剔除(KO) TIL細胞療法，可增強TIL細胞療法之功效且廢除對全身性抗PD-1療法之需要，同時避免與抗PD-1/PD-L1療法相關之短期及長期全身性AE。轉錄活化因子樣效應子核酸內切酶(TALEN)係由DNA結合域及FokI核酸酶構成之雜合分子。針對編碼PD-1之PDCD-1基因的兩個TALEN組之組合介導DNA雙股斷裂，導致基因破壞及PD-1不活化(Gautron AS, Juillerat A, Guyot V等人Mol Ther Nucleic Acids. 2017;9:312-321；Menger L, Sledzinska A, Bergerhoff K等人Cancer Res. 2016;76:2087-2093；Qasim W, Zhan H, Samarasinghe S等人Sci Transl Med. 2017;9(374):eaaj2013)。已建立一種方法，用於生成TALEN介導之PDCD-1 KO TIL且將其擴增至具有穩健效應子功能及指示功能性TIL之表型標誌物的治療相關數目(Ritthipichai K, Machlin M, Lakshmipathi S等人在ESMO虛擬會議上呈遞; 2020年9月19-21日.摘要1052P)。

此實例描述IOV-4001 (1)活體內臨床前活性，(2)臨床規模製造過程開發，及(3)表型及功能表徵 4.方法

簡言之，植入黑色素瘤腫瘤細胞之hIL-2 NOG小鼠接受自體PD-1 KO TIL (使用TALEN® mRNA構築體生成)、模擬TIL (無TALEN之情況下電穿孔)、模擬TIL + 抗PD-1抗體之過繼性轉移，或不接受過繼性轉移(各自n=14)。每週2次量測腫瘤大小持續39天。建立22天臨床規模製造過程，包括快速擴增方案前(REP前)、活化、電穿孔、休止及REP，用於生成PD-1 KO TIL。表徵最終PD-1 KO TIL產品之總的活細胞(TVC)、純度(活力%)、一致性(% CD45 ⁺CD3 ⁺)及功能(PD-1 KO效率)。 5.製造：

建立22天臨床規模IOV-4001製造過程，包括快速擴增方案前(REP前)、活化、電穿孔、休止及REP，用於生成PDCD-1 KO TIL (使用TALEN® mRNA構築體)。在Iovance Process Development (Tampa, FL)，以非良好製造規範(GMP)規模產生開發運行。在合同製造組織(CMO)以GMP製造規模產生製造運行。 6.活體外抗腫瘤活性：

向在巨細胞病毒啟動子(hIL-2 NOG)15之控制下表現人類介白素-2 (hIL2)之小鼠植入黑色素瘤腫瘤細胞，且使其接受(A)自體PDCD-1 KO TIL、(B)模擬TIL (無TALEN之情況下經電穿孔的TIL)、(C)模擬TIL + 抗PD-1之過繼性轉移，或(D)不接受TIL之過繼性轉移；(各自n=14)。每週兩次量測腫瘤大小持續39天。 7.產品釋出：

對最終PDCD-1 KO TIL產品進行表徵： ● 總的活細胞(TVC)及純度(活力%)，使用NucleoCounter® NC-200™ (ChemoMetec, Lillerød, Denmark)自動化細胞計數器藉由吖啶橙/ 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)複染劑確定 ● 一致性(CD45+CD3+表型)，藉由免疫螢光染色及流式細胞術分析 ● 效力(干擾素-γ [IFNγ]釋出)，使用Quantikine® IFNγ ELISA套組(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)藉由ELISA分析

基於與模擬TIL相比PDCD-1 KO TIL之PD-1表現，藉由流式細胞術評估PDCD-1 KO效率。 8.表型：

使用2個多色流式細胞術面板來分析最終收集之PDCD-1 KO TIL產品的擴展表型標誌物，以表徵TIL純度、一致性、記憶子集、活化及耗竭狀態。 9.表徵：

IL-2分析：為了評估PDCD-1 KO TIL產品之安全性，在28天時期內評估在IL-2不存在下該最終產品之活體外增生能力。

核型分析：藉由NeoGenomics Laboratories (Fort Myers, FL, USA)執行細胞遺傳學檢查。簡言之，使冷凍保存之PDCD-1 KO TIL樣品休止且活化以收集中期細胞用於G-譜帶細胞遺傳學分析。對有絲分裂細胞之三個重複樣品進行分析、固定及染色以執行G-譜帶 10.統計學分析：

使用未配對學生t測試來分析表型差異，且使用Wilcoxon秩和測試來偵測小鼠活體內研究中之差異；p ＜ 0.05被視為統計學顯著的。 11.結果

簡言之，相對於模擬TIL (26 ± 8.5， P＜0.05)、模擬TIL + 抗PD-1 (33 ± 8.8， P＜0.01)及無過繼性TIL轉移(112 ± 8.4， P＜0.0001)，經PD-1 KO TIL處理之小鼠的第39天平均值 ± SEM腫瘤大小(mm ²) (6 ± 2.8)顯示優越腫瘤控制。PD-1 KO TIL之6個臨床規模製造運行的產品屬性係可接受的，其中中值(範圍) TVC、純度及一致性分別為8.3 × 10 ⁹(0.9×10 ⁹-35.7×10 ⁹)、94% (91%-99%)及99% (98%-99%)。中值(範圍) PD-1 KO效率為48% (31%-84%)。PD-1 KO TIL功能及表型(分化、記憶、活化及耗竭)與模擬TIL可相當。

如圖53中所示，相對於經單獨模擬TIL或模擬TIL + 抗PD-1抗體處理之小鼠，在經PDCD-1 KO TIL處理之小鼠中觀察到增強之活體內抗腫瘤活性。

如圖54中所示，所有PDCD-1 KO TIL產品均滿足關於劑量、純度、一致性、效力及PDCD-1 KO效率之釋出標準。在開發與製造運行之間未觀察到統計學顯著差異。開發及製造運行均產生具有可相當之劑量(A)及活力(B)之最終PDCD-1 KO TIL產品。開發及製造運行中之最終TIL產品之中值(範圍)一致性(%CD45+CD3+)分別為98.5% (98%-100%)及98.7% (96%-99%) (C)。最終PDCD-1 KO TIL產品在開發及製造運行中之中值IFNγ釋出分別為4015 pg/ mL及4725 pg/mL (D)。開發及製造運行中之中值(範圍) PDCD-1 KO效率分別為63% (48%-81%)及62% (31%-91%) (E)。在生長、純度、一致性及效力方面，PDCD-1 KO TIL產品與模擬TIL可相當。如先前研究中所示(Ritthipichai K, Machlin M, Lakshmipathi S等人在ESMO虛擬會議上呈遞; 2020年9月19-21日.摘要1052P)，在開發運行中，劑量、純度、一致性及效力結果在模擬物與PDCD-1 KO之間可相當(資料未示)。

如圖55所示，CD28標誌物在開發及製造樣品中之PDCD-1 KO及模擬TIL中均高度表現，而諸如CD27、CD57及KLRG1之其他標誌物以低水準表現(A)。使用CD45RA及CCR7表現來定義原生(TN)、中央記憶(TCM)、效應子記憶(TEM)及效應子記憶RA+(TEMRA) T細胞子集。大多數TIL批次主要展示效應子記憶表型(B)。在開發及製造運行中，在PDCD-1 KO與模擬TIL之間未觀察到TIL分化標誌物或記憶表型之統計學顯著差異。

如圖56所示，使用多色流式細胞術來表徵CD4+ (A)及CD8+ TIL (B)上之TIL活化及抑制受體表型。在開發及製造運行中，在PDCD-1 KO與模擬TIL之間未觀察到標誌物表現之統計學顯著差異。

如圖57所示，使用IL-2獨立增生分析，證實PDCD-1 KO TIL產品在TALEN介導之基因體編輯後均未經歷惡性轉化。在IL-2不存在下，經刺激(抗CD3/CD28)或未經刺激樣品均無法增生(A及B)。在IL-2存在下培養之所有樣品均顯示增生(A及B)。

PDCD-1 KO TIL產品之核型分析結果之概述顯示於圖58中。在G-譜帶分析中未觀察到純系染色體異常，指示在PDCD-1中，在TALEN介導之基因體編輯後無基因毒性。藉由G-譜帶分析之所有樣品均產生足夠中期以用於全面研究；觀察到正常G-譜帶模式。 12.結論

在抗PD-1存在或不存在下，PDCD-1 KO TIL之活體內抗腫瘤活性優於模擬TIL (無TALEN之情況下經電穿孔)之活性，表明內源PD-1抑制可向TIL賦予優於抗體組合之功能優勢。PDCD-1 KO TITIL臨床規模製造係可行的，且TIL產品品質屬性及表型係可接受的。所有開發及製造運行中之TIL屬性係可相當的且滿足產品釋出標準。在TALEN介導之基因體編輯後，PDCD-1 KO TIL產品均未經歷惡性轉化，如藉由IL-2獨立增生分析所確定。未藉由G-譜帶鑑定出TALEN誘導之純系染色體異常。重要的是，TIL產品中缺乏完全PDCD-1 KO可保留其他PD-1依賴性活體內細胞功能。總之，此等資料支持IOV-4001 (自體PDCD-1 KO TIL細胞療法)之臨床研究，作為患有晚期實體腫瘤之患者的潛在治療選項。 M. 實例 13 ： OKT3 對 TransAct 刺激之比較 13.方法

使來自不同適應症(頭頸部、肺及乳房)之REP前TIL株(N=4)解凍，活化，電穿孔，且經歷11天REP過程。

用板結合OKT3 (300 ng/ml)或TransAct (1:100)刺激REP前細胞持續兩天，隨後在4 mm間隙電穿孔比色皿中用右臂或左臂PD-1 TALEN各自4 ug/1e6個細胞對再懸浮於電穿孔緩衝液(稱為「T緩衝液」)中之5e6個細胞進行電穿孔。

在電穿孔之後，使細胞在30℃下在具有IL-2之CM1培養基中休止隔夜，隨後進行REP。以不同數目(100k、50k、20k、10k)接種開始數目之模擬細胞且進行測試以比較剔除效率。 14.結果

圖59A及圖59B顯示在電穿孔之前細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖59A顯示如與用OKT3或TransAct刺激2天後相比解凍後之細胞活力，且圖59B顯示在解凍且用OKT3或TransAct刺激之後的恢復倍數。

圖60A及圖60B顯示在電穿孔之後細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖60A顯示用OKT3或TransAct刺激之細胞在30℃下隔夜之後的恢復倍數，且圖60B顯示用OKT3或TransAct刺激之細胞在30℃下隔夜之後的活力。

圖61A-61C證實在CD3+、CD8+及CD4+細胞之情況下，當與OKT3刺激之TIL相比時，TransAct刺激之TIL顯示較低KO效率。 N. 實例 14 ： 30 ℃ 對 37 ℃ 隔夜休止之比較 15.方法

使來自不同適應症(頭頸部、肺及乳房)之REP前TIL株(N=4)解凍，活化，且電穿孔。

用TransAct (1:100)刺激REP前細胞持續兩天，隨後在4 mm間隙電穿孔比色皿中用右臂或左臂PD-1 TALEN各自4 ug/1e6個細胞對再懸浮於T緩衝液中之5e6個細胞進行電穿孔。

在電穿孔後，將細胞以相等數目接種於96孔板中且在具有IL-2或IL-15之CM1培養基中在30℃或37℃下休止隔夜。接著對細胞計數以確定恢復倍數及活力。 16.結果

圖62A及圖62B顯示在所有條件下(IL-2或IL-15)，在電穿孔之後細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖62A顯示在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之恢復倍數，且圖62B顯示在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之活力。

圖63A及圖63B顯示當使用6000 IU/mL IL-2時，在電穿孔之後細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖63A顯示在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之恢復倍數，且圖63B顯示在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之活力。

圖64A及圖64B顯示當使用各種條件時，在電穿孔之後細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖64A顯示當使用各種濃度之IL-2或IL-15時，在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之恢復倍數，且圖64B顯示當使用各種濃度之IL-2或IL-15時，在30℃或37℃隔夜休止之後細胞之活力。

如實例13中評估剔除效率。用抗CD3/CD28珠粒以1個珠粒:5個細胞之比率刺激TIL隔夜。圖65A-65C證實在推薦之1:100稀釋度下，用非GMP TransAct刺激觀察到減少之KO效率。 O. 實例 15 ： TALEN mRNA 濃度及培育條件之比較 17.方法

使來自不同適應症(頭頸部及乳房)之REP前TIL株(N=3)解凍，活化，電穿孔，且經歷10天REP過程。

用OKT3 (300 ng/mL，板結合)刺激REP前細胞持續兩天，隨後在1mm間隙電穿孔比色皿中用右臂或左臂PD-1 TALEN各自4 ug、2 ug、1 ug、0.5 ug/1e6個細胞對再懸浮於T緩衝液中之1e6個細胞進行電穿孔。

在電穿孔後，將細胞以相等數目接種於48孔板中且在具有IL-2之CM1培養基中在30℃或37℃下休止隔夜，隨後進行REP。 18.結果

圖66及圖67顯示在用不同濃度之PD-1 TALEN mRNA進行電穿孔之後細胞之細胞活力及恢復倍數。特定言之，圖66顯示在用不同濃度之PD-1 TALEN mRNA進行電穿孔之後之細胞活力，且圖67顯示在用不同濃度之PD-1 TALEN mRNA進行電穿孔之後之恢復倍數。在用不同濃度之PD-1 TALEN mRNA進行電穿孔之後，未觀察到活力或恢復之顯著變化。

圖68A及圖68B顯示當用37℃或30℃下預加溫之培養基在30℃下培養細胞隔夜時，細胞之細胞活力及恢復倍數。圖68A顯示在30℃或37℃下預加溫之培養基中在30℃或37℃下培養細胞隔夜之後之恢復倍數，且圖68B顯示在30℃或37℃下預加溫之培養基中在30℃或37℃下培養細胞隔夜之後之細胞活力。當用37℃或30℃下預加溫之培養基在30℃下培養細胞隔夜時，未觀察到活力或恢復之顯著變化。

如實例13中評估剔除效率。圖69A-69C顯示CD3+、CD8+及CD4+細胞中之PD-1 KO效率。用4 ug mRNA/百萬個細胞觀察到PD-1 TALEN之最佳KO效率且在30℃下休止隔夜。此濃度可為標靶特異性的且亦取決於電穿孔期間所用之細胞濃度。電穿孔過程期間所用之TALEN mRNA濃度看來不影響恢復及活力。 P. 實例 16 ：洗滌步驟及離心速度之比較 19.方法

使來自不同適應症(頭頸部及肺)之REP前TIL株(N=4)解凍，活化(OKT3板結合300 ng/mL)，且經受洗滌步驟，該等洗滌步驟通常恰好在電穿孔之前進行。

刺激REP前細胞持續兩天，接著以各自5e6個細胞分至獨立管中。用PBS洗滌該等細胞，集結成粒，用細胞穿孔緩衝液洗滌，集結成粒，接著再懸浮於細胞穿孔緩衝液中。使細胞再懸浮於500 uL細胞穿孔緩衝液中且藉由在CM1中1:10稀釋該等細胞來計數。在各旋轉之後執行細胞計數以確定洗滌步驟中損失之細胞的百分率。

使用不同離心速度(400g、300g、200g，持續5分鐘)來重複該程序，以盡力改良細胞恢復。 20.結果

圖70A及圖70B顯示當進行洗滌步驟時，在各種洗滌步驟之後之細胞數目(圖55A)及活力(圖70B)，該等洗滌步驟涉及在400g下離心持續5分鐘及3次旋轉。

圖71A及圖71B顯示使用PBS洗滌或Cyto洗滌在400g、300g及200g旋轉條件之後之細胞數目。

圖72A及圖72B顯示使用PBS洗滌或Cyto洗滌在400g、300g及200g旋轉條件之後之細胞活力。

圖73A及圖73B顯示在各種旋轉條件之後細胞之總旋轉比較細胞數目及總旋轉比較細胞活力，且圖74顯示在各種旋轉條件之後之總旋轉比較細胞損失%。

結果證實細胞穿孔緩衝液洗滌導致細胞損失，且當在300g而非400g下在細胞穿孔緩衝液中使細胞離心時，可存在恢復之改良。因此，一個細胞穿孔緩衝液洗滌步驟可為較佳的。 Q. 實例 17 ： OKT3 對 TransAct 刺激之比較 21.方法

使來自不同適應症(頭頸部及乳房)之REP前TIL株(N=3)解凍且用OKT3板結合300 ng/mL、TransAct 1:10及TransAct 1:17.5活化2天，且用PD-1 TAL進行電穿孔。 22.結果

圖75A-75C顯示使用各種刺激方法時在電穿孔期間之損失百分比及活力，特定言之在洗滌步驟中的細胞損失百分比(圖75A)，在電穿孔之後之細胞損失百分比(圖75B)，及在電穿孔之後之細胞活力(圖75C)。結果顯示在電穿孔之後，與OKT3相比，TransAct刺激展現較佳恢復及活力。

圖76A-76C顯示使用各種刺激方法時CD3+ (圖61A)、CD4+ (圖76B)及CD8+ (圖76C)細胞中之PD-1剔除效率。結果顯示，用OKT3及TransAct活化導致相似KO效率。

圖77A-77B顯示使用各種刺激方法時REP收集之細胞活力(圖77A)及擴增倍數(圖77B)。 R. 實例 18 ：在電穿孔之後培育溫度之比較 23.方法

使來自不同適應症(頭頸部及乳房)之REP前TIL株(N=2)解凍且用OKT3板結合300 ng/mL活化2天，且用PD-1 TAL進行電穿孔。

在電穿孔之後，在不同溫度(25、28、30、32、35、37℃)下培育細胞隔夜且次日進行REP。在隔夜培育之後評估細胞之細胞損失及活力且評估PD-1剔除效率。 24.結果

圖78A-78B顯示使用不同培育溫度時在電穿孔之後之細胞損失百分比(圖78A)及細胞活力(圖78B)。

圖79A-79C顯示使用不同培育溫度時CD3+ (圖79A)、CD4+ (圖79B)及CD8+ (圖79C)細胞中之剔除效率。

圖80A-80B顯示使用不同培育溫度時REP收集之擴增倍數(圖80A)及細胞活力(圖80B)。 S. 實例 19 ：刺激日時間選擇之比較 25.方法

使來自不同適應症(頭頸部及乳房)之REP前TIL株(N=2)解凍且用GMP TransAct 1:17.5在不同天活化。(第0天、第3天、第5天、第7天)。

在第9天及第12天用PD-1 TAL對細胞進行電穿孔以確定應刺激REP前細胞以使PD-1 KO效率及REP前細胞數目增至最大之最佳日。 26.結果

圖81A-81C顯示使用在不同日刺激之細胞時之細胞生長(圖81A)、第一次電穿孔剔除效率(圖81B)及第二次電穿孔剔除效率(圖81C)。

圖82顯示使用在不同日刺激之細胞時在3天休止內之生長百分比。 T. 實例 20 ： PD-1 KO TIL 產品之概覽

「PD-1 KO TIL產品」為自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之製劑，該等淋巴細胞已經歷轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)之基因體編輯以破壞程序性細胞死亡蛋白-1 (PD-1)之基因。PD-1 TALEN係經工程改造以結合與 PDCD1基因上之核分解標靶位點相鄰的不同DNA序列。DNA結合導致兩個分開之FokI核酸內切酶域的二聚，從而產生功能性DNA核酸內切酶，其可在外顯子2 ( PDCD1之中央蛋白編碼區)中產生序列特異性雙股斷裂(DSB)。由內源性易錯DNA修復路徑(諸如非同源末端接合(NHEJ))修復此DSB導致核苷酸插入或缺失，從而破壞PD-1之蛋白編碼區。

該4步PD-1 KO TIL產品製造過程係用於產生自體TIL產品lifileucel (IND 16317及16819)之方法的修改形式。此過程由以下步驟組成：在IL-2存在下使TIL生長之第一步，隨後用TransAct (與人類化CD3及CD28促效劑接合之無珠粒膠體聚合物奈米基質)對T細胞進行短期活化，對PD-1 KO TALEN mRNA (左臂及右臂)進行電穿孔，在30℃下休止隔夜，及最終快速擴增方案(REP)步驟。

各項研究中之PD-1 KO TIL產品表徵資料(表58)以及來自過程開發研究之資料證實，製造過程之變化不會影響產品品質(一致性、活力、PD-1剔除效率)且產生平均約60% PD-1 KO效率，這在PDX小鼠模型系統中證實在派姆單抗存在下比模擬對照TIL優越之抗腫瘤活性。表58. 非臨床研究之清單

研究 (報告編號)	目標	GLP或非GLP
藥理學-活體外研究
剔除效率	評估自體TIL中TALEN介導之PD-1 KO效率	非GLP
表型表徵	評估PD-1 KO TIL產品之表型的T細胞記憶、分化及活化
純系分佈	確定PD-1 KO TIL產品之TCR譜系中 PDCD1基因編輯之分佈
活體外功能分析	評估PD-1 KO TIL產品之效應子功能
殺死分析	評估PD-1 KO TIL產品之細胞溶解活性
藥理學 - 活體內研究
PDX小鼠模型研究	使用PDX小鼠模型來評估PD-1 KO人類TIL之活體內功效	非GLP
毒理學 / 安全性 - 活體外研究
TALEN持久性	評估用PD-1 KO TALEN mRNA電穿孔之TIL中PD-1 TALEN蛋白隨時間之清除	非GLP
OCA	確定脫靶TALEN核酸酶活性之潛在位點	非GLP
靶向/脫靶裂解分析	表徵在OCA研究中預測之潛在TALEN脫靶位點處之靶向 PDCD1基因編輯及突變誘發	非GLP
IL-2獨立增生分析	確定在抗CD3/CD28活化及IL-2刺激不存在下PD-1 KO TIL產品之增生能力	GLP/非GLP ¹
細胞遺傳學/核型分析	評估PD-1 KO TIL產品中之純系染色體異常的可能	GLP

縮寫：GLP=良好實驗室規範；IL-2 = 介白素2；KO = 剔除；OCA = 寡捕獲分析；PD-1 = 程序性細胞死亡蛋白-1； PDCD1= 程序性細胞死亡蛋白-1之基因；PDX = 患者源性異種移植物；TALEN = 轉錄活化因子樣效應子核酸酶；TCR = T細胞受體；TIL = 腫瘤浸潤性淋巴細胞 ¹在此研究中評估不同批次之PD-1 KO TIL產品，其中一些批次作為GLP順應性研究之部分進行評估。 27.概述

所執行之非臨床研究如下支持用於起始臨床研究之PD-1 KO TIL產品的安全性： ● 確認TIL中之PD-1 TALEN表現為短暫電穿孔後； ● 經由使用NGS進行表徵，確認OCA分析中鑑定之20個最高排序潛在脫靶位點中之19者中無TALEN相關突變誘發。在一個候選位點(Cand 3)處偵測到最小脫靶活性。這不可能為產品之安全性風險，因為突變頻率低且該位點對應於與疾病無已知相關性之非編碼RNA基因座； ● 在PD-1 KO TIL藥物產品之核型分析中未鑑定出純系染色體異常，且因此無證據表明歸因於TALEN介導之基因體編輯的顯著基因毒性； ● 未發現IL-2獨立增生之證據，且因此未在所測試之任何PD-1 KO TIL藥物產品中證實惡性轉化。

此外，基於以下觀察結果，非臨床研究支持PD-1 KO TIL產品之潛在抗腫瘤活性及作用機制： ● 在自體TIL基因體中實現可複製、高水準之TALEN介導之 PDCD1突變誘發(平均約60%)，其中 PDCD1突變誘發速率與PD-1表現之降低相關。因此，PD-1 KO TIL產品構成真正的PD-1 KO基因療法產品。 ● 被視為對抗腫瘤活性至關重要之自體TIL的一般特徵顯示未受PD-1 KO影響或受其積極影響，包括活力、增生能力、分化狀態、記憶T細胞子集、活化/耗竭狀態、TCR Vβ多樣性、T細胞效應子功能及細胞溶解活性。 ● 相對於未使用ACT、使用由未經修飾之自體TIL進行的ACT及由未經修飾之自體TIL與抗PD-1抗體之組合進行的ACT之對照研究組，在使用由PD-1 KO TIL產品進行之ACT治療的PDX小鼠模型中觀察到增強之腫瘤負荷控制。

總之，此等研究證實自多種腫瘤分離、經擴增且經基因工程改造為剔除PD-1之T細胞係安全的，在活體外及活體內模型中均具有穩健抗腫瘤活性。此等觀察結果表明，PD-1 KO TIL產品具有作為自體免疫療法之潛力，具有可管理安全性型態，用於治療構成未滿足之醫療需求之患者群體。 28.結果

圖83A-83C顯示PD-1剔除效率。圖83A顯示PD-1 KO效率，如藉由對PD-1 KO TIL產品上之PD-1受體表現進行流式細胞術量測所確定。圖83B顯示PD-1 KO效率，如藉由對具有插入/缺失之 PDCD1基因的總數進行NGS量測所確定。圖83C顯示藉由流式細胞術評估之PD-1 KO效率與用NGS確定之 PDCD1基因修飾之間的相關性。

圖84顯示在TALEN基因體編輯後 PDCD1中之大多數插入/缺失為核苷酸缺失。 29.表型表徵

使用研究規模方法，使用源自五個不同類型之腫瘤(乳房(n=5)、肺(n=2)、HNSCC (n=2)、黑色素瘤(n=2)及卵巢(n=1))之產品，相對於未經修飾之自體TIL，評估PD-1 KO TIL產品之增生能力、活力及免疫表型。 30.細胞活力及增生能力

PD-1 KO TIL產品具有與未電穿孔(NE) TIL可相當之細胞活力，其在兩種類型之樣品中的平均活力為大約93%。PD-1 KO TIL產品之增生能力亦與NE TIL可相當，其在產生過程之REP步驟期間的平均擴增倍數分別為1217及1565。 31.PD-1 KO TIL產品及NE TIL之分化狀態

PD-1 KO TIL產品具有相對於NE TIL可相當之分化狀態，如藉由CD27、CD28、CD56、BTLA及KLRG-1之相似表現水準所確定。因此，PD-1不活化不會改變TIL之分化狀態。 32.PD-1 KO TIL產品及NE TIL中之記憶T細胞子集

在本發明研究中，超過98%之PD-1 KO TIL產品及NE TIL為T效應細胞(CD45RA-CCR7-)，而T _CM子集(CD45RA-CCR7+)佔所分析之細胞的小於1%。重要的是，終末分化T細胞之比例可忽略。 33.PD-1 KO TIL產品及NE TIL中之活化及耗竭狀態

PD-1 KO TIL產品之活化狀態相對較高且與NE TIL之活化狀態可相當，如藉由CD69、CD25及DNAM之表現水準所指示。與其最近活化一致，PD-1 KO TIL產品及NE TIL均表現高水準之共抑制分子(TIGIT及TIM-3)。此等結果顯示PD-1不活化未改變活化及耗竭狀態。

總之，PD-1剔除不會顯著影響TIL活力、增生能力或免疫表型，表明PD-1 KO TIL產品活性與此等生物性質相關，類似於關於未經修飾之自體TIL所觀察到的活性。

圖85A-85B顯示TCR Vβ亞型在主體PD-1 KO TIL產品中及NE TIL在CD3+PD-1-子集中之分佈。由肺腫瘤L4022 (圖85A)及乳房腫瘤EP11017 (圖85B)生成之主體TIL經PD-1 TALEN mRNA (PD-1 KO)電穿孔，或未經電穿孔(NE)。在CD3+PD-1- T細胞子集中，藉由流式細胞術來評估二十四個TCR Vβ家族。TCR Vβ亞型之百分率繪製於圓餅圖中。匯集未藉由流式細胞術鑑定出之所有剩餘亞型且以淺藍色顯示(其他)。顏色表示各TCR Vβ亞型，如圓餅圖下方之圖例所指示。

圖86A-86B顯示PD-1 KO TIL效應子功能，如藉由MLR及多功能性所量測。關於圖86A，TIL由黑色素瘤(n=3)、乳癌(n=1)及肺癌(n=1)樣品生成，一式兩份。測試NE TIL (黑色圓圈)及PD-1 KO TIL (白色圓圈)對人類白血球抗原(HLA)錯配淋巴細胞之反應性。使用ELISA來評估上清液之IFN-γ分泌。水平條及垂直條分別指示平均值及標準誤差。藉由配對學生t測試來評估統計學顯著性。ns = 無統計學顯著性。關於圖86B，TIL由黑色素瘤(n=1)及乳癌(n=3)樣品生成。多功能強度指數(PSI)係在單細胞層面上產生多種細胞介素之能力的量度，在經活化主體PD-1 KO對NE TIL中進行量測。結果顯示為發炎(粉色)、調節(淺褐色)、化學吸引(紫色)、刺激(藍色)及效應子(綠色)路徑中所牽涉之細胞介素的具有相關標準誤差之平均值之條形圖。藉由配對學生t測試來評估統計學顯著性。ns = 無統計學顯著性。 34.活體內研究：患者源性異種移植物(PDX)小鼠模型研究

在hIL-2轉殖基因小鼠中所生長之患者源性異種移植物(PDX)模型中，此研究比較PD-1 KO TIL產品之抗腫瘤活性與未經修飾TIL之抗腫瘤活性。此研究中使用源自新鮮切除之人類黑色素瘤病變(n=1；M1152)之成對自體PDX腫瘤株/TIL製劑。PD-1 KO效率之水準為75%。在M1152 PD-1 KO與模擬TIL之間未觀察到細胞活力、增生能力、分化、記憶T細胞子集或耗竭狀態之差異。 35.PDX源性黑色素瘤腫瘤細胞株之表徵

由植入黑色素瘤腫瘤片段之NSG小鼠中生長之PDX腫瘤生成M1152 PDX腫瘤細胞株。PDX黑色素瘤細胞株之特徵在於經由流式細胞術量測稱為黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)之黑色素瘤-腫瘤特異性標誌物及PD-L1的表現。大約80%之腫瘤細胞表現MCSP蛋白，指示此等細胞中之大多數為黑色素瘤源性。IFN-γ治療誘導PD-L1在48小時內自13%上調至82%。此舉再現了用於使腫瘤細胞在腫瘤細胞之細胞溶解期間回應於T細胞之IFN-γ分泌而增加PD-L1表現之活體內抗性機制，且支持M1152 PDX模型之相關性以評估M1152 PD-1 KO TIL活性。 36.M1152 PD-1 KO TIL對活體內腫瘤負荷之控制

為了確定PD-1 KO TIL對腫瘤生長之影響，將PD-1 KO或模擬TIL過繼性轉移至植入自體黑色素瘤細胞之hIL-2 NOG小鼠。抗PD-1及模擬TIL之組合作為用於PD-1/PD-L1路徑阻斷之對照包括在內。藉由腫瘤負荷減少來評估PD-1 KO TIL之活體內功效。

圖87顯示M1152 PD-1 KO TIL產品之活體內抗腫瘤活性。對植入黑色素瘤腫瘤細胞之hIL-2 NOG小鼠(n=14/治療組)過繼性轉移PD-1 KO或模擬TIL。與模擬TIL組合之抗PD-1抗體治療作為用於PD-1/PD-L1阻斷之對照包括在內。藉由長度 × 寬度來計算腫瘤體積，且繪製為隨腫瘤植入後之時間而變。藉由Wilcoxon秩和測試來評估統計學顯著性*、**及****分別指定 P值＜0.05、＜0.01及＜0.0001，且被視為統計學顯著的。

在使用或不使用抗PD-1抗體治療之情況下，在經PD-1 KO及模擬TIL治療之小鼠中觀察到腫瘤減少。這指示TIL可識別且溶解植入之腫瘤細胞，從而驗證TIL經由MHC及TCR之銜接特異性識別腫瘤。另外，相對於模擬TIL，即使與抗PD-1治療組合，PD-1 KO TIL亦引起優越腫瘤控制。由於hIL-2 NOG小鼠為免疫缺乏的，且缺乏初級及次級淋巴器官，抗PD-1未能改良模擬TIL之活體內功效，表明全身性PD-1抑制之活體內機制可需要完整免疫系統。相反，PD-1 KO TIL之抗腫瘤活性相對模擬TIL有所改良，表明內源性PD-1抑制向TIL賦予功能優勢。

因此，該研究證實TALEN介導之PD-1 KO向TIL賦予功能優勢。此發現與數項公開研究一致，該等研究描述相對於未經修飾之T細胞，PD-1 KO T細胞控制腫瘤生長之能力增加(Menger 2016, Marotte 2020)。

圖88A-88B顯示自體TIL中之TALEN蛋白持久性，隨藉由西方墨點量測之時間而變。由黑色素瘤生成之TIL (n=6；M1011、M1017、M1025、M1030、M1034、M1040)經PD-1 TALEN mRNA電穿孔。NE TIL用作基線對照。在電穿孔之後8、10、12、14、18小時(圖88A)及第1天、第2天、第4天、第6天(圖88B)，藉由西方墨點在來自TIL之全細胞提取物中偵測TALEN蛋白。藉由密度測定法對TALEN特異性譜帶之強度進行定量且所得OD值藉由時間點求平均值且背景針對NE TIL之平均值進行校正。將平均值繪製為條，且標準誤差顯示為垂直線。在PD-1 TALEN靶向及候選脫靶位點處之突變誘發的定量

關於各候選(cand)脫靶位點之資訊包括於表59中。表59. 脫靶位點分析

位點	批次 M1191	批次 C2028	批次 L4213	批次 L4256	批次 M1207	批次 M1209	中值
PDCD1	74.73	68.37	62.69	45.34	38.09	43.86	54.015
cand1	0.06	0.03	0.02	-0.01	0.02	0.02	0.02
cand2	-0.01	-0.01	0	0	0.01	0.01	0
cand3	0.72	0.5	0.4	0.19	0.14	0.09	0.295
cand4	0.21	0.01	0.06	0.03	0.06	0.02	0.045
cand5	0.02	0	0	0.01	0.05	0	0.005
cand6	0.01	-0.01	-0.01	-0.02	0.02	-0.01	-0.01
cand7	0	0	0	0	0	0.01	0
cand8	0.07	0.03	0.03	0.01	0.01	-0.01	0.02
cand9	0.07	0.01	0	0	-0.01	0.02	0.005
cand10	0.02	0.01	0	0.03	0	0.01	0.01
cand11	0.06	0.02	0.04	0	0.02	0	0.02
cand12	0.06	0.01	0.01	0.01	0.01	0	0.01
cand13	0.02	0.02	0.01	0.02	0.02	0.04	0.02
cand14	0.04	-0.01	0	0	0.04	-0.01	0
cand15	0.06	0.01	0.08	0.04	0.01	0.02	0.03
cand16	0	0.01	0	0.01	0	-0.01	0
cand17	0.02	0.01	0	-0.01	-0.01	0.01	0.005
cand18	0.01	0.03	0	0.02	0	-0.03	0.005
cand19	0.19	0.01	0.06	0	0	0	0.005
cand20	0.06	0	0.02	0.01	-0.01	-0.03	0.005

37.IL-2獨立增生分析

在IL-2不存在下，用CD3/CD28活化評估之PD-1 KO TIL產品樣品截至該分析之第28天均未增生。在IL-2存在下培養之所有樣品均增生，其中截至第28天，具有最小1.7倍擴增及最大407倍擴增。應注意，自同一腫瘤分離之成對TALEN之編輯TIL及未經修飾TIL具有在各樣品中可相當之總體擴增倍數。結果藉由證實在IL-2不存在下無細胞增生而證實PD-1 KO TIL藥物產品之安全性，表明此產品中之細胞未經歷惡性轉化。 38.細胞遺傳學/核型分析

在該分析中觀察到兩種異常核型，其中在20個中期擴展中之4-5個中偵測到X染色體單染色體。此等結構異常在非基因體編輯之TIL樣品及TALEN編輯之TIL樣品中均偵測到，因此此異常不能歸因於TALEN介導之基因體編輯。此外，如200個中期細胞之細胞遺傳學分析所評估，與未經修飾TIL相對，在經PD-1 TALEN編輯之TIL中未觀察到突變誘發之顯著增加。基於該等結果，推斷出在所測試之任何樣品中均無證據表明TALEN誘導之純系染色體異常，且因此在TALEN介導之基因體編輯後未鑑定出顯著基因毒性。 U. 實例 21 ：例示性 TIL 製造過程

例示性TIL製造過程描繪於圖89A-F中。簡言之，在第0天，分離hypothermosol中之腫瘤組織，其中生物負荷樣品儲存於轉運培養基中，且將腫瘤片段以≤50個片段/燒瓶之密度接種於多個(2、3或4個) G-Rex 100 MCS燒瓶中。快速冷凍過量片段。在一些實施例中，可將活化步驟併入REP前步驟中，這為薔薇花狀/腫瘤ME內之TIL提供更佳共刺激環境。例如，在第3天，將60 ug OKT3或TransAct添加至多個G-Rex 100 MCS燒瓶中之每一者中，且細胞經歷第一次活化。在第7/8天，體積減少，過濾樣品且轉移至匯集之EXP1000。移出樣品以供細胞計數/活力分析。洗滌細胞，在400g、20℃下離心持續10 min，且以≥9:1之比率分成TALEN樣品及對照樣品。使該等細胞再懸浮於T緩衝液中且以10 × 10 ⁶/比色皿用TALEN mRNA (TALEN樣品)或無RNA (對照樣品)進行電穿孔。將來自每個比色皿之經電穿孔對照及TALEN樣品接種於具有含有6000 IU/mL IL-2之100 mL培養基的G-Rex100M燒瓶中，且在37℃下培育1小時。起始餵養細胞，解凍，匯集，且用IL-2培育。移出樣品以供細胞計數及活力分析。將餵養細胞及額外IL-2及OKT3添加至G-Rex 100MCS燒瓶中之經培育對照及TALEN樣品中以生成REP培養物(1個G-Rex 100MCS用於對照REP培養，≤9個G-Rex 100MCS用於TALEN REP培養)。在第10/11天，將500 mL培養基連同3000 IU/mL IL-2添加至REP培養物之每個燒瓶中。或者，細胞培養基可用新培養基完全更換。此步驟不需要轉移細胞懸浮液，且不使用G-Rex 500MCS。在第16天減少體積，且匯集樣品。經由血液過濾器轉移樣品，且移出樣品以供細胞計數/活力分析。使對照樣品離心，且生成對照最終調配物且在控制速率冷凍器下冷凍保存。經由LOVO系統處理TALEN樣品，且生成TALEN滲餘物最終調配物且在控制速率冷凍器下冷凍保存。經調配之產品樣品接著經歷品質控制分析。

此過程具有以下優勢：a)移除用於在袋中活化之懸浮液轉移步驟；b)允許1/10規模控制；c)移除過程中轉移至G-Rex10；d)移除30C下之隔夜培育步驟，有利於用環境溫度培養基立即再活化(REP)；及e)移除1個處理日。 V. 實例 22 ： 1/2 期研究以評估 PD-1 KO TIL 輸注液之功效及安全性 39.前言

在患有無法切除或轉移性黑色素瘤或III或IV期非小細胞肺癌之參與者中進行PD-1剔除腫瘤浸潤性淋巴細胞(PD-1 KO TIL)之1/2期、開放標籤研究。

PD-1 KO TIL產品為自體TIL產品，該產品已經歷轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN ^®)基因體編輯以破壞編碼PD-1之基因 PDCD1。此方案將評估PD-1 KO TIL產品，作為患有無法切除或轉移性黑色素瘤或III或IV期NSCLC之參與者的治療。 40.研究基本原理

此研究為PD-1 KO TIL產品之首次人體研究。評估PD-1 KO TIL產品之抗腫瘤活性及其直接靶向且殺死腫瘤細胞之能力，其方式類似於非基因體編輯之自體TIL產品，但由於 PDCD1破壞，有可能增強抗腫瘤活性。

與該假設一致，在患者源性異種移植物小鼠模型中，相對於非基因體編輯之自體TIL，在PD-1 KO TIL產品中觀察到改良之抗腫瘤活性。PD-1 KO TIL產品之概念驗證非臨床研究進一步顯示TALEN介導之 PDCD1突變誘發具有可再現水準，與PD-1細胞表面表現之降低相關，且指示被視為對抗腫瘤活性至關重要之自體TIL的一般生物性質未受PD-1剔除影響或受其積極影響。在與人類TIL測試相關之傳統非臨床動物模型不存在下，活體外研究支持PD-1 KO TIL產品之安全性。在20個最高排序潛在脫靶位點中之1個中偵測到低脫靶活性。這不可能為產品之安全性風險，因為突變頻率低及以下實情：此位點對應於與疾病無已知相關性之非編碼RNA。額外活體外研究顯示，在TALEN介導之基因體編輯後，無TALEN相關之純系染色體異常。 41.背景

無法切除或轉移性黑色素瘤及III及IV期NSCLC代表具有顯著未滿足之醫療需求之惡性病。儘管最近在黑色素瘤治療方面取得進展，包括ICI (例如，抗細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4 [CTLA-4]及抗PD-1單株抗體[mAb])及靶向療法(例如，原致癌基因B-Raf [BRAF]及促分裂原活化蛋白激酶[MEK]抑制劑)，無法切除或轉移性黑色素瘤仍難以治療且仍為重大公共健康問題(Howlader 2020；Steininger 2021)。雖然目前有數種有效的NSCLC療法，包括ICI (亦即，納武單抗及派姆單抗)、鉑雙重化學療法及酪胺酸激酶抑制劑(TKI)或其他針對驅動突變陽性腫瘤之靶向療法，但均未能提供足夠積極且持久之癌症控制。最終，大多數腫瘤在可用、最初有效之療法中取得進展。因此，儘管已批准ICI，但在使用可用標準照護療法取得進展之黑色素瘤及NSCLC患者中，仍有大量未滿足之醫療需求。

自體TIL已顯示持久反應且有可能解決患有轉移性黑色素瘤之臨床試驗參與者的主要未滿足需求，該等臨床試驗參與者在批准之療法後具有有限治療選項，包括抗PD-1/PD-L1療法之彼等原發性難治性患者(Rosenberg 2011；Larkin 2021；Sarnaik 2021)。同樣，初步資料證實TIL在既往治療線(包括ICI)中具有疾病進展之NSCLC參與者及具有表皮生長因子受體(EGFR)驅動突變陽性腫瘤之參與者中引起在臨床上有意義之反應(Creelan 2021；Schoenfeld 2021)。

可藉由淋巴細胞與腫瘤微環境之間的相互作用來抑制TIL之抗腫瘤活性。詳言之，當T細胞表面上之PD-1結合腫瘤細胞上之PD-L1時發生的信號傳導不利地影響T細胞抗腫瘤活性。與此發現一致，特異性阻斷PD-1/PD-L1路徑之多種抗體療法(諸如抗PD-1抗體派姆單抗及納武單抗)在實體腫瘤中作為單一劑及與非基因體編輯之自體TIL組合時均已顯示穩健活性。值得注意的是，除了有希望之抗癌活性以外，在無法切除或轉移性黑色素瘤、復發性及/或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌及持久、復發性或轉移性子宮頸癌中，使用非基因體編輯之自體TIL療法與抗PD-1抗體之組合的臨床研究亦已為TIL過繼細胞療法(ACT)之背景中不活化PD-1信號傳導之安全性提供初步證據，從而證實安全性型態與個別療法之型態一致(O’Malley 2021)。這與以下研究之結果一致：迄今對患有轉移性黑色素瘤之參與者執行的其他研究，該等研究已評估TIL療法與免疫檢查點抑制之組合(Besser 2013；Mullinax 2018)；以及研究在患有NSCLC之參與者中投與TIL療法與納武單抗之組合的研究(Creelan 2021)。

抗PD-1抗體之全身性投與導致AE，因為經由T細胞之活化及增生，免疫路徑非特異性上調。作為此治療之潛在替代方案，使用TALEN基因體編輯技術特異性地使自體TIL中之 PDCD1不活化，以製備PD-1 KO TIL產品PD-1剔除產品。藉由將PD-1信號傳導之抑制作用限制於治療性腫瘤源性T細胞，預期PD-1 KO TIL產品療法應提供更安全之替代方案，以替代對PD-1路徑賦予全身性抑制之ICI治療。此外，與要求重複投與之抗PD-1抗體方案相對，PD-1 KO TIL產品療法有可能作為一次性治療提供臨床益處。 42.益處/風險評估

目前尚無PD-1 KO TIL產品之臨床安全性資料，因為此為PD-1 KO TIL產品之首次人體研究。在由已經基因體編輯以剔除PD-1之自體TIL進行之ACT研究中，尚無臨床安全性資料；然而，在單獨或與抗PD-1抗體組合投與之非基因體編輯之TIL方案中存在安全性資料。來自非基因體編輯之TIL產品之研究的安全性資料被視為相關的，因為該產品之製造使用衍生PD-1 KO TIL產品製造過程之過程，具有與PD-1 KO TIL產品之配方一致之配方，且作為對PD-1 KO TIL產品所建議之方案相似的方案之一部分來投與。

下文所呈遞之風險及益處評估係基於與NMA-LD及IL-2投與相關之觀察結果(如其各自處方資訊所報告)，及與PD-1 KO TIL產品相似之治療的臨床經驗，尤其非基因體編輯之自體TIL產品，該產品單獨或與抗PD-1抗體組合投與，作為對PD-1 KO TIL產品所建議之方案相似的方案之一部分。 a. 益處評估

對參與者之潛在益處包括接受研究介入之可能性，該研究介入可在缺乏有效治療選項之患者群體中停止、減慢或逆轉癌症進展。 b. 總體益處風險結論

考慮到以下因素，PD-1 KO TIL產品治療方案之益處-風險型態適合計劃納入研究IOV-GM1-201中之參與者： ● 單獨或與抗PD-1抗體組合投與之非基因體編輯之自體TIL方案(亦即，NMA-LD、IL-2及非基因體編輯之自體TIL產品)的已知毒性係可監測及可管理的， ● 採取措施使參與者之風險降至最低， ● 缺乏為研究群體提供持久益處之有效治療選項，及 ● 此新穎療法有可能改良現有基於TIL之實體腫瘤治療方案及PD-1抑制劑治療之抗腫瘤活性及安全性型態目標及終點

目標	中斷
主要
1期：在安全運行階段期間確認PD-1 KO TIL產品之安全性且確定PD-1 KO TIL產品之推薦2期劑量	將基於此階段期間所收集之全部DLT及AE資料來評估PD-1 KO TIL產品之安全性
2期：評估PD-1 KO TIL產品之功效，如根據RECIST v1.1藉由ORR所量測	ORR係定義為自PD-1 KO TIL產品輸注日期直至疾病進展或新的抗癌療法開始時根據RECIST v1.1如由調查員所評估具有確認CR或PR之參與者的比例。
次要
評估PD-1 KO TIL產品之功效，如藉由CR率、DOR、DCR、PFS及OS所量測	● CR率係定義為自PD-1 KO TIL產品輸注日期直至疾病進展或新的抗癌療法開始時根據RECIST v1.1如由調查員所評估具有確認CR之參與者的比例 ● DOR自根據RECIST v1.1如由調查員所評估滿足CR或PR標準之時進行量測，直至疾病進展或因任何原因而死亡為止 ● DCR藉由自PD-1 KO TIL產品輸注日期直至疾病進展或新的抗癌療法開始時，根據RECIST v1.1如由調查員所評估在任何時間加上SD ≥ 4週具有最佳總體確認CR或PR反映之參與者的百分率來量測 ● PFS係定義為自PD-1 KO TIL產品輸注日期直至根據RECIST v1.1如由調查員所評估存在疾病進展或因任何原因而死亡之時間 ● OS係自PD-1 KO TIL產品輸注日期至因任何原因而死亡之時間

證實PD-1 KO TIL產品在患有無法切除或轉移性黑色素瘤及III或IV期非小細胞肺癌之參與者中的安全性及耐受性	PD-1 KO TIL產品之安全性的特徵將在於TEAE之嚴重程度、嚴重性、與研究介入之關係及特徵，包括SAE、研究介入相關AE及導致研究介入提前中止或退出評估期或在起始研究介入後至多5年即死亡之AE
評估PD-1 KO TIL產品療法在患有無法切除或轉移性黑色素瘤或III或IV期非小細胞肺癌之參與者中的可行性	產品可行性將藉由已收集腫瘤且在無製造延遲或失敗之情況下經治療之參與者的比例來評估。

43.研究設計 a. 總體設計

此為1/2期、開放標籤、非隨機化、多群組、多中心研究，在患有無法切除或轉移性黑色素瘤(群組1)或III或IV期NSCLC (群組2)之參與者中評估使用PD-1 KO TIL產品之自體TIL方案的安全運行。在各群組中，自各參與者切除腫瘤樣品且離體培養以製造IOV-4001。在包括環磷醯胺及氟達拉濱之淋巴細胞耗盡化學療法之後，對參與者輸注PD-1 KO TIL產品，且隨後輸注IL-2。在安全運行期間，將以交錯方式治療2個群組中之任一者中的前3個參與者。一旦每個參與者成功完成在PD-1 KO TIL產品輸注時開始之28天DLT觀察期，下一參與者可接受授權以繼續進行NMA-LD。後續登記將遵從標準3 + 3降級設計，該設計允許在評估新出現之PD-1 KO TIL產品安全性及耐受性資料後輸入額外參與者。SRC將對此等安全性資料進行審查，SRC由發起者代表及已登記DLT可評估參與者之所有調查員組成，以提出關於劑量水準決定之建議。總體安全性將由獨立DSMB監測。在前3-6名參與者結束DLT觀察期且獲得DSMB批准後，兩個群組中之研究登記，將繼續進行，而不實施參與者之間的交錯期。 b. 研究設計之科學基本原理

該研究之設計無對照組，因為此等經過大量預處理之參與者並無替代的有效治療選項，無法為研究群體提供持久益處。雖然並無比較者，但鑒於參與者之晚期難治性疾病的性質以及研究介入(自體TIL方案)作為一次性單一療法經投與之實情，可推測該研究期間所觀察到的任何重大腫瘤消退均歸因於研究介入。

本研究之2期部分的主要功效終點(根據RECIST v1.1之ORR)係用於在單組研究中評估腫瘤反應之經驗證方法。 c. 研究群體

不允許前瞻性批准登記標準之方案偏離(亦稱為方案豁免或免除)。 d. 關鍵納入標準

僅當所有以下標準適用時，參與者有資格納入研究中： 1. 參與者在簽署知情同意書時為18歲或更大。 2. 參與者已在組織學上或在病理學上確定診斷為IIIC、IIID或IV期無法切除或轉移性黑色素瘤(群組1)或III或IV期NSCLC (群組2)。 3. 參與者已接受過以下先前療法：群組1 (黑色素瘤)：參與者在PD-1/PD-L1阻斷抗體之全身性療法期間或在最後一劑PD-1/PD-L1阻斷抗體之後12週內已出現記錄在案之放射性疾病進展。若腫瘤為BRAF V600突變陽性，則參與者亦接受BRAF抑制劑，同時接受或不接受MEK抑制劑。群組2 (NSCLC)：參與者應已接受過不超過3種先前治療線，且 ● 不具有致癌基因驅動之腫瘤的參與者在PD-1/PD-L1阻斷抗體之全身性療法期間或在最後一劑PD-1/PD-L1阻斷抗體之後12週內已出現記錄在案之放射性疾病進展 ● 或對於具有可用有效靶向療法治療之致癌基因驅動之腫瘤的參與者(例如，EGFR、退行性淋巴瘤激酶[ALK]、ROS原致癌基因[ROS]或編碼MET酪胺酸受體激酶[MET]之原致癌基因)，參與者在至少1個適當靶向治療線及鉑雙重化學療法期間或之後或在PD-1/PD-L1阻斷抗體之全身性療法期間或在最後一劑PD-1/PDL1阻斷抗體之後12週內出現記錄在案之放射性疾病進展。 4. 參與者之ECOG效能狀態為0或1。 5. 參與者經評估為具有至少一個可切除病變 6. 先前經照射之病變在收集之前必須具有放射性進展。 7. 有生育能力之參與者或具有有生育能力之伴侶的彼等參與者必須願意在治療期間且在接受所有方案相關療法之後12個月內實施經批准之高度有效之節育方法。 e. 關鍵排除標準

若任何以下標準適用，則參與者自研究中排除： 1. 參與者患有嚴重心臟病。 2. 參與者患有葡萄膜/眼源性黑色素瘤。 3. 參與者患有有症狀之未經治療腦轉移。 4. 參與者患有任何形式之原發性免疫缺乏。 5. 參與者在前3年內患有另一原發性惡性病。 6. 參與者在開始NMA-LD之前28天內已接受或將接受活或減毒疫苗接種。

關於實例22之參考文獻 W. 實例 23 ：氙電穿孔儀評估

進行研究以確定氙電穿孔儀(Thermo)是否可能用於生成PD-1 KO TIL之過程中。研究結果概述於圖91中。 44.方法概覽

經活化REP或REP前TIL用於實驗 ● REP TIL：Demo日、氖實驗1、氙實驗1 ● REP前TIL：氙實驗3、氙實驗4 ● 用TransAct活化持續5天

電穿孔之細胞準備日(各實驗中相同)： ● 使緩衝液平衡至室溫 ● 用PBS洗滌TIL 1次 ● 用電穿孔緩衝液(Thermo - CTS™ Xenon™基因體編輯緩衝液)洗滌TIL 1次 ● 離心且再懸浮於最終體積之電穿孔緩衝液中 ○ 單發要求每個樣品1 ml之精確體積(最多100e6/ml) ○ 氖體積可為10 ul或100 ul (最多20e6/ml) ● 添加mRNA (GFP 1 ug/1e6個細胞、TALEN 4 ug/1e6個細胞) ● 電穿孔 ● 在G-Rex10中之CM2 + 3000 IU/ml IL-2 (若使用＞ 10e6，則在2個G-Rex10之間分開)中休止隔夜 ● 37℃，GFP mRNA ● 30℃，TALEN mRNA ● 收集休止之樣品且使用150 um細胞過濾器過濾 ● 進行細胞計數且繼續進行流動染色或REP (氙實驗4) 45.實驗1：使用Thermo之Demo日 ● 用GFP mRNA測試經活化REP TIL (L4346) ● 解凍(第0天)且活化(第1天) 50e6 + TransAct ● 1 ug/1e6個細胞之GFP mRNA (1 mg/ml儲備液) ● 使用Thermo推薦最佳化方案進行電穿孔 ● 單發(範圍為2e7-1e8個細胞/1 ml) - 20e6/ml ● 氖 - 2e6/100 ul ● 測試參數： ○ 恢復及活力 ○ 24 h後之GFP，藉由流式(L/D aqua及FITC用於GFP) ○ 24 h後之膜聯蛋白V，藉由流式

圖92中顯示之結果證實24 h後，1700/20/1及2300/3/4顯示較高GFP表現及恢復。 46.實驗2：氖實驗1 ● 目的：使用氖使氙Demo期間鑑定之2個電穿孔設定最佳化且與BTX進行比較 ● 細胞濃度：氖 - 2e6個細胞/100 µl ● 來自氙之骨架電穿孔設定： ○ 1700/20/1 ○ 2300/3/4 ● 改變持續時間(ms)及脈衝數目，同時使電壓設定保持恆定 ● 測試參數： ○ 恢復及活力 ○ 24 h後之GFP，藉由流式(L/D aqua及FITC用於GFP) ○ 24 h後之膜聯蛋白V，藉由流式

圖93中顯示之結果證實，2300/3/4 Thermo推薦設定(5*)具有最高GFP表現及60%恢復，且由2300 V電壓設定及較短持續時間(2 ms)及較少脈衝(3)改良恢復，其中GFP表現降低。 47.實驗3：氙實驗1 ● 目的：確定細胞濃度對氙GFP表現及恢復之影響 ● N=1個經活化REP TIL樣品(EP11231) ● 氙對BTX ● 電穿孔條件：2300/3/4，基於最高GFP表現及60%恢復加以選擇 ● 使用單發來測試細胞濃度 ○ 1e6/ml ○ 5e6/ml ○ 10e6/ml ○ 25e6/ml ● BTX對照 ○ 10e6 + GFP (在400 µl中，因此具有25e6/ml濃度) ○ 2e6個模擬物 ● 測試參數： ○ 恢復及活力 ○ 24 h後之GFP，藉由流式(L/D aqua及FITC用於GFP)

圖94中顯示之結果證實，與BTX相比，使用氙時GFP表現略微降低，GFP表現未受細胞濃度影響，在較低細胞濃度下恢復降低且在較低細胞濃度下細胞凋亡增加。24 h後，2300/3/4看來在低細胞濃度下具毒性。 48.實驗4：氙實驗3

目的：確定細胞濃度(低/高)對氙GFP表現及恢復之影響，使用已證實最高恢復之EP設定。 ● N=1個經活化REP前TIL樣品(K7136) ● 氙對BTX ● 電穿孔條件： ○ 1400/30/1 ○ 1700/20/1 ○ 2300/2/3 ○ 2500/2/5 ● 使用單發來測試細胞濃度 ○ 5e6/ml ○ 25e6/ml ● BTX對照 ○ 5e6 + GFP (在200 µl中，因此具有25e6/ml濃度) ○ 1e6個模擬物 ●測試參數： ○ 恢復及活力 ○ 24 h後之GFP，藉由流式(L/D aqua及FITC用於GFP)

圖95中顯示之結果證實，各樣品中具有高GFP表現，與BTX可相當，且在5e6與25e6之間之差異極小。EP設定1400/30/1及2300/2/3之恢復在5e6與25e6之間相似，且24 h後，2300/2/3恢復與BTX可相當。 49.實驗5：氙實驗4 ● 目的：使用TALEN mRNA來比較氙電穿孔儀與BTX電穿孔儀。 ● N=1個經活化REP前TIL樣品(L4374) ● 氙對BTX ● 電穿孔條件： ○ 2300/2/3 ● 條件： ○ 氙Talen (25e6) ○ 氙模擬物(5e6) ○ BTX Talen (25e6) ○ BTX模擬物(5e6) ● 測試參數： ○ 恢復及活力 ○ PD-1 KO，藉由流式 ● PD-1臨時KO流動資料在電穿孔後之休止樣品上運行(未經REP) ● 最終PD-1 KO流動資料在REP收集樣品上

圖96中顯示之結果證實，氙及BTX之恢復在5e6與25e6之間相似，且使用氙時存在略微較高恢復，臨時PD-1 KO效率(電穿孔後之休止細胞)在氙(89%)與BTX (86%)之間相似，且對於REP樣品之PD-1表現及KO效率分析，使用氙(83%)時之KO效率略微高於BTX (76%)。 50.結論

該研究鑑定了氙上之電穿孔設定2300/2/3，其導致在低及高細胞濃度下之高細胞恢復(與BTX可相當)、在低及高細胞濃度下之高GFP表現(與BTX可相當)以及高PD-1 KO效率(與BTX可相當)。 IX. 進一步考慮

提供上述實例以向一般技術者給出如何產生及使用本發明組合物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且不欲限制被發明人視為其發明之發明的範圍。用於進行本發明之上述模式之修改係熟習此項技術者顯而易見的，意欲在以下申請專利範圍之範圍內。本說明書中所提及之所有專利及公開案均指示熟習本發明所屬領域之技術人員的技能水準。

所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式進行限制。舉例而言，熟習此項技術者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範圍在適當時組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。

本文所引用之所有參考文獻由此以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度就如同各個別公開案或專利或專利申請案係出於所有目的特定地且個別地經指示以全文引用之方式併入一般。

熟習此項技術者將顯而易見，在不背離本申請案之精神及範圍的情況下可對其進行許多修改及變化。本文所述之特定實施例及實例僅以實例方式提供，且本申請案將僅由隨附申請專利範圍之術語以及申請專利範圍有權要求之等效物的完整範圍限制。

本揭示案之各態樣之各種實例出於方便描述為編號條款(1、2、3等)。此等條款作為實例提供，且不限制主題技術。圖式及參考編號之鑑定在下文中僅作為實例且出於說明目的提供，且該等條款不受彼等鑑定限制。條款1. 一種藉由將獲自患者之腫瘤之細胞群體擴增成細胞療法產品來製造該細胞療法產品的方法，該方法包括：基於製造用於該患者之該細胞療法產品之細胞訂單請求，在製造設施處接收來自該患者之細胞群體；由計算裝置生成患者特異性標識符，包括與該細胞訂單請求相關之細胞訂單標識符；起始製造該細胞療法產品之過程，該過程包括：在該製造設施處接收該細胞群體之後，由該計算裝置對患者治療事件排程，使用細胞擴增技術自該細胞群體之至少一些起始該細胞療法產品之擴增，且確定在第一時間點及在該第一時間點之後的第二時間點該擴增細胞療法產品之接受參數，確定該擴增細胞療法產品之接受參數是否滿足與對應時間點相關之接受標準，回應於該擴增細胞療法產品之接受參數滿足該第一時間點之接受標準的確定，使用該細胞擴增技術自該獲得之細胞療法產品之至少一些繼續細胞療法產品之該擴增直至該第二時間點，及回應於該擴增細胞療法產品之接受參數不滿足該第二時間點之接受標準的確定：基於該第二時間點之接受參數，確定自該第一時間點使用該細胞擴增技術再執行該細胞療法產品之該擴增是否可行，回應於該再執行係可行之確定，自該第一時間點使用該細胞擴增技術由該第二時間點獲得之該細胞療法產品之至少一些再執行該細胞療法產品之該擴增以獲得該細胞療法產品，自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之後，由該計算裝置估算該細胞療法產品之該擴增之完成時間，及由該計算裝置對該等患者治療事件再排程且自該第一時間點完成細胞療法產品之後續擴增，其中該等患者治療事件之該再排程係基於該細胞療法產品之該擴增之估算完成時間及在該擴增之細胞療法產品在該患者中之輸注之前或之後的患者治療事件之時間選擇來執行。條款2. 如條款1之方法，其中該細胞療法產品包含T細胞。條款3. 如條款1之方法，其中該細胞療法產品包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。條款4. 如條款1之方法，其中該等患者治療事件包括住院時期、切除日期、淋巴細胞耗盡日期、向該患者輸注該細胞療法產品之輸注日期及IL-2治療日期中之一或多者。條款5. 如條款1之方法，其中該確定該擴增細胞療法產品之接受參數是否滿足該等接受標準包括在該獲得之細胞療法產品之該擴增之該起始之後的複數個時間點確定該擴增細胞療法產品之接受參數，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款6. 如條款5之方法，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數不滿足該等接受標準之確定，對該等患者治療事件再排程。條款7. 如條款5之方法，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準之確定，終止該等患者治療事件。條款8. 如條款5之方法，其中回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準之確定，終止細胞療法產品之後續擴增。條款9. 如條款8之方法，其中確定該擴增細胞療法產品之接受參數包括活力、無菌性、細胞計數、支原體計數、CD3計數、內毒素分析結果及革蘭氏染色分析結果之確定中之一或多者。條款10. 如條款9之方法，其中該細胞擴增技術包括快速擴增步驟，且該方法進一步包括：確定該擴增細胞療法產品之接受參數在該快速擴增步驟之前是否滿足該等接受標準；及回應於該擴增細胞療法產品之接受參數滿足該等接受標準之確定，在該擴增之細胞療法產品之製造完成之前的日期對淋巴細胞耗盡日期排程，在該擴增之細胞療法產品之製造完成之後的日期對輸注日期排程，且在該輸注日期之後對IL-2治療日期排程。條款11. 如條款1之方法，其中該細胞擴增技術包括在單一密閉容器生物反應器中培養該細胞療法產品。條款12. 如條款1之方法，其中估算自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之後，該細胞療法產品之該擴增之完成時間包括基於該第二時間點之接受參數及與用於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之細胞群體相關的接受參數中之一者或兩者，確定自該第一時間點完成該擴增過程所需之時間。條款13. 如條款1之方法，其中擴增細胞療法產品之細胞訂單請求係由醫院端界面接收，且該方法進一步包括在接收該細胞訂單請求後，向該醫院端界面傳遞已接收與該患者相關之該細胞訂單請求的確認，該確認包括該患者特異性標識符及該細胞訂單標識符中之一者或兩者。條款14. 如條款13之方法，該方法進一步包括根據該細胞擴增技術及何時接收該細胞訂單請求對用於確定該擴增細胞療法產品之接受參數在該細胞療法產品之擴增期間是否滿足該等接受標準的一組對應於複數個時間點之日期排程，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款15. 如條款13之方法，該方法進一步包括在對該等患者治療事件再排程後，向該醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之更新排程。條款16. 如條款15之方法，該方法進一步包括：基於該完成時間，向物流界面傳遞與該患者特異性標識符相關之提貨單；及基於該完成時間，向醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之排程。條款17. 如條款16之方法，該方法進一步包括：回應於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增係可行之確定：由該計算裝置將該細胞訂單標識符與該患者特異性標識符解除關聯，及由該計算裝置生成與該細胞訂單請求相關之新細胞訂單標識符且使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關。條款18. 如條款17之方法，其中擴增細胞療法產品之該細胞訂單請求係自醫院端界面接收，且該方法進一步包括向該醫院端界面傳遞包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符及該細胞療法產品之該擴增之估算完成時間。條款19. 如條款17之方法，該方法進一步包括：基於該等患者治療事件之該再排程，由該計算裝置生成與該等患者治療事件相關的運輸及物流事件之新排程，及基於運輸及物流事件之該再排程，向物流界面傳遞與包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符相關的運輸及物流事件之該新排程。條款20. 如條款17之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置在確定接受參數是否滿足某些接受標準之各時間點使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關，該新細胞訂單標識符包括對應於各相應時間點及該確定之結果的欄位。條款21. 如條款20之方法，其中該排程包括：基於包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符，由該計算裝置對該等患者治療事件排程。條款22. 如條款21之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可能之確定，由該計算裝置取消在該第二時間點之後排程的患者治療事件。條款23. 如條款22之方法，該方法進一步包括向醫院端界面及物流界面傳遞患者治療事件之該取消。條款24. 如條款23之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可行之確定，銷毀該擴增之細胞療法產品且將該患者特異性標識符與該細胞訂單標識符解除關聯。條款25. 一種根據再排程之患者治療事件用藉由如條款1之方法獲得的擴增細胞療法產品治療患者之方法。條款26. 一種製造用於患者之細胞療法產品的方法，該方法包括：在計算裝置處接收製造用於該患者之該細胞療法產品之細胞訂單請求、在複數個製造設施處用於製造該細胞療法產品之製造槽及用於由該細胞療法產品治療該患者之患者治療事件之初步排程，其中在來自與個別製造設施相關之製造商計算機子系統的該計算裝置處接收用於該個別製造設施之該等製造槽；基於患者治療事件之該初步排程，由該計算裝置在排程用戶界面中確定及展示複數個用於製造該細胞療法產品之可用製造槽；在選擇該等可用製造槽之一後，根據患者治療事件之該初步排程及該可用製造槽，在醫療設施處對該患者執行程序以自該患者獲得實體腫瘤；根據該可用製造槽，將該獲得之實體腫瘤轉移至對應於該可用製造槽之製造設施；在該製造設施處接收該獲得之實體腫瘤後，使用細胞擴增技術自該獲得之實體腫瘤之至少一部分起始該細胞療法產品之製造；在該細胞療法產品之該製造期間，確定在第一時間點及在該第一時間點之後的第二時間點該製造之細胞療法產品之接受參數及該等接受參數是否滿足與對應時間點相關之接受標準，該等接受參數係基於與該對應時間點相關之分析的結果來確定；基於在該第一及該第二時間點中之一者或兩者是否滿足該等接受標準，由該計算裝置修改用於製造該細胞療法產品之製造排程、對應於該製造設施之製造槽及患者治療事件之該初步排程；及若在該第一及該第二時間點均滿足該等接受標準，則根據該修改之製造排程完成該細胞療法產品之該製造。條款27. 如條款26之方法，該方法進一步包括將該製造之細胞療法產品轉移至該醫療設施。條款28. 如條款26之方法，該方法進一步包括在接收該細胞訂單請求後，由該計算裝置生成與該患者及該細胞訂單請求相關之患者特異性標識符。條款29. 如條款28之方法，該方法進一步包括由該計算裝置自動生成用於該獲得之實體腫瘤之容器的運輸標籤，該運輸標籤包含該患者特異性標識符、該細胞訂單請求、該製造槽及對應於該可用製造槽之該製造設施。條款30. 如條款29之方法，該方法進一步包括由該計算裝置自動生成用於該獲得之實體腫瘤之容器的製造標籤，該製造標籤包含對應於當該製造標籤生成時用於製造該細胞療法產品之製造過程的時間點、容器鑑定條碼、該患者特異性標識符、在該時間點完成之製造步驟、與該完成之過程相關之接受參數及在該時間點執行之製造過程。條款31. 如條款26之方法，其中該細胞療法產品包含T細胞。條款32. 如條款26之方法，其中該細胞療法產品包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。條款33. 如條款26之方法，其中該等患者治療事件包括住院時期、切除日期、淋巴細胞耗盡日期、向該患者輸注該細胞療法產品之輸注日期及IL-2治療日期中之一或多者。條款34. 如條款26之方法，其中該確定該製造之細胞療法產品之接受參數是否滿足該等接受標準包括在該接收之細胞療法產品之該擴增之該起始之後的複數個時間點確定該製造之細胞療法產品之接受參數，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款35. 如條款34之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置對該等患者治療事件再排程且完成細胞療法產品之後續擴增，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該製造之細胞療法產品之接受參數不滿足該等接受標準的確定，對該等患者治療事件再排程。條款36. 如條款34之方法，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該製造之細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準的確定，終止該等患者治療事件。條款37. 如條款34之方法，其中回應於在該複數個時間點中之任一者該製造之細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準的確定，終止細胞療法產品之後續擴增。條款38. 如條款37之方法，其中確定該製造之細胞療法產品之接受參數包括活力、無菌性、細胞計數、支原體計數、CD3計數、內毒素分析結果及革蘭氏染色分析結果之確定中之一或多者。條款39. 如條款38之方法，其中該細胞擴增技術包括快速擴增步驟，且該方法進一步包括：確定該製造之細胞療法產品之接受參數在該快速擴增步驟之前是否滿足該等接受標準；及回應於該製造之細胞療法產品之接受參數滿足該等接受標準的確定，在該細胞療法產品之製造完成之前的日期對淋巴細胞耗盡日期排程，在該細胞療法產品之製造完成之後的日期對輸注日期排程，且在該輸注日期之後對IL-2治療日期排程。條款40. 如條款26之方法，其中該細胞擴增技術包括在單一密閉容器生物反應器中培養該細胞療法產品。條款41. 如條款26之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置估算該細胞療法產品之該擴增之完成時間，其中估算自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之後，該細胞療法產品之該擴增之完成時間包括基於該第二時間點之接受參數及與用於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之細胞群體相關的接受參數中之一者或兩者，確定自該第一時間點完成該擴增過程所需之時間。條款42. 如條款29之方法，其中擴增細胞療法產品之細胞訂單請求係由醫院端界面接收，且該方法進一步包括在接收該細胞訂單請求後，向該醫院端界面傳遞已接收與該患者相關之該細胞訂單請求的確認，該確認包括該患者特異性標識符及該細胞訂單標識符中之一者或兩者。條款43. 如條款42之方法，該方法進一步包括根據該細胞擴增技術及何時接收該細胞訂單請求對用於確定該製造之細胞療法產品之接受參數在該細胞療法產品之擴增期間是否滿足該等接受標準的一組對應於複數個時間點之日期排程，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款44. 如條款43之方法，該方法進一步包括在對該等患者治療事件再排程後，向該醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之更新排程。條款45. 如條款44之方法，該方法進一步包括：基於該完成時間，向物流界面傳遞與該患者特異性標識符相關之提貨單；及基於該完成時間，向醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之排程。條款46. 如條款45之方法，該方法進一步包括：回應於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增係可行之確定：由該計算裝置將該細胞訂單標識符與該患者特異性標識符解除關聯，及由該計算裝置生成與該細胞訂單請求相關之新細胞訂單標識符且使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關。條款47. 如條款46之方法，其中擴增細胞療法產品之該細胞訂單請求係自醫院端界面接收，且該方法進一步包括向該醫院端界面傳遞包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符及該細胞療法產品之該擴增之估算完成時間。條款48. 如條款47之方法，該方法進一步包括：基於該等患者治療事件之該再排程，由該計算裝置生成與該等患者治療事件相關的運輸及物流事件之新排程，及基於運輸及物流事件之該再排程，向物流界面傳遞與包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符相關的運輸及物流事件之該新排程。條款49. 如條款48之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置在確定接受參數是否滿足該等接受標準之各時間點使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關，該新細胞訂單標識符包括對應於各相應時間點及該確定之結果的欄位。條款50. 如條款49之方法，其中該排程包括：基於包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符，由該計算裝置對該等患者治療事件排程。條款51. 如條款50之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可能之確定，由該計算裝置取消在該第二時間點之後排程的患者治療事件。條款52. 如條款51之方法，該方法進一步包括向醫院端界面及物流界面傳遞患者治療事件之該取消。條款53. 如條款52之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可行之確定，銷毀該擴增之細胞療法產品且將該患者特異性標識符與該細胞訂單標識符解除關聯。條款54. 一種根據再排程之患者治療事件用藉由如條款26之方法獲得的製造之細胞療法產品治療患者之方法。條款55. 一種用於製造細胞療法產品之方法，該方法包括：在製造設施處接收獲自患者之實體腫瘤；由計算裝置生成用於製造容器之製造標籤，該製造容器欲用於使用細胞擴增技術自該獲得之實體腫瘤之至少一部分製造該細胞療法產品之過程，該製造標籤包含與該患者、該製造過程及製造之細胞療法產品的品質相關之資訊；起始製造該細胞療法產品之過程，該過程包括：在醫療設施處對該患者執行程序以自該患者獲得實體腫瘤，將該獲得之實體腫瘤轉移至製造設施，在該製造設施處接收該獲得之實體腫瘤之後，由該計算裝置對患者治療事件動態排程，該動態排程取決於隨後獲得之擴增細胞療法產品之接受參數，使用細胞擴增技術自該獲得之實體腫瘤之至少一些起始該細胞療法產品之擴增，且確定在複數個時間點該擴增細胞療法產品之接受參數，執行品質控制分析以在該複數個時間點確定該製造之細胞療法產品之接受參數；在該計算裝置處接收該製造之細胞療法產品之接受參數；由該計算裝置生成對應於該複數個時間點中之每一者的更新之製造標籤，該更新之製造標籤包含與製造之細胞療法產品之品質相關的更新之資訊，該更新之資訊包含在對應時間點之接受參數；在該複數個時間點中之每一者由該計算裝置讀取該更新之製造標籤；及基於在該複數個時間點中之每一者自該更新之製造標籤讀取的資訊，完成該細胞療法產品之擴增。條款56. 如條款55之方法，該方法進一步包括若存在以下情況，則由該計算裝置提供警告信號：在該更新之製造標籤上針對後續製造步驟的與該患者有關之資訊不匹配在該製造標籤上針對前一製造步驟的與該患者有關之資訊，或在該更新之製造標籤上針對該製造過程中的既定時間點之接受參數不滿足針對該製造過程中的彼時間點之接受標準，其中該等接受參數包含活力、無菌性、細胞計數、支原體計數、CD3計數、內毒素分析結果及革蘭氏染色分析結果中之一或多者。條款57. 如條款55之方法，其中與該患者有關之資訊包含患者特異性標識符及與製造用於該患者之該細胞療法產品之細胞訂單請求相關的細胞訂單標識符。條款58. 如條款55之方法，其中該細胞擴增技術包括在單一密閉容器生物反應器中培養該細胞療法產品。條款59. 如條款55之方法，其中該製造標籤包含條碼，該條碼編碼與該患者、該製造過程及製造之細胞療法產品的品質相關之資訊。條款60. 如條款56之方法，該方法進一步包括根據所使用之該細胞擴增技術及該製造設施何時接收細胞訂單請求對用於確定該製造之細胞療法產品之接受參數在該製造過程期間是否滿足該等接受標準的一組對應於複數個時間點之日期排程，該複數個時間點包括第一時間點及在該第一時間點之後的第二時間點。條款61. 如條款60之方法，該方法進一步包括與物流界面整合，經由快遞計算子系統接收快遞狀態資訊，其中快遞狀態資訊包括且回應於接收該快遞狀態資訊，基於該確定之製造排程來確定用於運輸該製造之細胞療法產品之運輸排程，及生成用於含有該製造之細胞療法產品的運輸容器之運輸標籤。條款62. 如條款60之方法，該方法進一步包括基於該確定之運輸排程將運輸請求傳遞至物流設施。條款63. 如條款60之方法，該方法進一步包括在執行最終品質控制分析之前生成用於含有該製造之細胞療法產品的運輸容器之運輸標籤，該運輸標籤指示該製造之細胞療法產品係不可釋出的，除非該最終品質控制分析之結果指示對應接受參數滿足對應接受標準。條款64. 如條款56之方法，該方法進一步包括：在確定該製造之細胞療法產品之接受參數滿足該等接受標準後，確定該細胞療法之製造的完成日期；基於該完成日期，由該計算裝置生成對應於該細胞療法產品用於治療患者之用途的患者治療事件之排程；基於該完成日期，向物流界面傳遞提貨單；及向醫院端界面傳遞該等患者治療事件之該排程。條款65. 如條款55之方法，其中該細胞療法產品包含T細胞。條款66. 如條款55之方法，其中該細胞療法產品包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。條款67. 如條款55之方法，其中該等患者治療事件包括住院時期、切除日期、淋巴細胞耗盡日期、向該患者輸注該細胞療法產品之輸注日期及IL-2治療日期中之一或多者。條款68. 如條款56之方法，其中該確定該擴增細胞療法產品之接受參數是否滿足該等接受標準包括在該獲得之細胞療法產品之該擴增之該起始之後的複數個時間點確定該擴增細胞療法產品之接受參數，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款69. 如條款68之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置對該等患者治療事件再排程且完成細胞療法產品之後續擴增，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數不滿足該等接受標準的確定，對該等患者治療事件再排程。條款70. 如條款68之方法，其中患者治療事件之該再排程包括回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準之確定，終止該等患者治療事件。條款71. 如條款68之方法，其中回應於在該複數個時間點中之任一者該擴增細胞療法產品之接受參數由於污染而不滿足該等接受標準之確定，終止細胞療法產品之後續擴增。條款72. 如條款71之方法，其中確定該擴增細胞療法產品之接受參數包括活力、無菌性、細胞計數、支原體計數、CD3計數、內毒素分析結果及革蘭氏染色分析結果之確定中之一或多者。條款73. 如條款72之方法，其中該細胞擴增技術包括快速擴增步驟，且該方法進一步包括：確定該擴增細胞療法產品之接受參數在該快速擴增步驟之前是否滿足該等接受標準；及回應於該擴增細胞療法產品之接受參數滿足該等接受標準的確定，在該細胞療法產品之製造完成之前的日期對淋巴細胞耗盡日期排程，在該細胞療法產品之製造完成之後的日期對輸注日期排程，且在該輸注日期之後對IL-2治療日期排程。條款74. 如條款55之方法，其中該細胞擴增技術包括在單一密閉容器生物反應器中培養該細胞療法產品。條款75. 如條款55之方法，其中估算自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之後，該細胞療法產品之該擴增之完成時間包括基於該第二時間點之接受參數及與用於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增之細胞群體相關的接受參數中之一者或兩者，確定自該第一時間點完成該擴增過程所需之時間。條款76. 如條款57之方法，其中擴增細胞療法產品之細胞訂單請求係由醫院端界面接收，且該方法進一步包括在接收該細胞訂單請求後，向該醫院端界面傳遞已接收與該患者相關之該細胞訂單請求的確認，該確認包括該患者特異性標識符及該細胞訂單標識符中之一者或兩者。條款77. 如條款76之方法，該方法進一步包括根據該細胞擴增技術及何時接收該細胞訂單請求對用於確定該擴增細胞療法產品之接受參數在該細胞療法產品之擴增期間是否滿足該等接受標準的一組對應於複數個時間點之日期排程，該複數個時間點包括該第一及該第二時間點。條款78. 如條款76之方法，該方法進一步包括在對該等患者治療事件再排程後，向該醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之更新排程。條款79. 如條款78之方法，該方法進一步包括：基於該完成時間，向物流界面傳遞與該患者特異性標識符相關之提貨單；及基於該完成時間，向醫院端界面傳遞與該患者特異性標識符相關的該等患者治療事件之排程。條款80. 如條款79之方法，該方法進一步包括：回應於自該第一時間點再執行該細胞療法產品之該擴增係可行之確定：由該計算裝置將該細胞訂單標識符與該患者特異性標識符解除關聯，及由該計算裝置生成與該細胞訂單請求相關之新細胞訂單標識符且使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關。條款81. 如條款80之方法，其中擴增細胞療法產品之該細胞訂單請求係自醫院端界面接收，且該方法進一步包括向該醫院端界面傳遞包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符及該細胞療法產品之該擴增之估算完成時間。條款82. 如條款80之方法，該方法進一步包括：基於該等患者治療事件之該再排程，由該計算裝置生成與該等患者治療事件相關的運輸及物流事件之新排程，及基於運輸及物流事件之該再排程，向物流界面傳遞與包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符相關的運輸及物流事件之該新排程。條款83. 如條款80之方法，該方法進一步包括：由該計算裝置在確定接受參數是否滿足某些接受標準之各時間點使該新細胞訂單標識符與該患者特異性標識符相關，該新細胞訂單標識符包括對應於各相應時間點及該確定之結果的欄位。條款84. 如條款83之方法，其中該排程包括：基於包括該新細胞訂單標識符之該患者特異性標識符，由該計算裝置對該等患者治療事件排程。條款85. 如條款84之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可能之確定，由該計算裝置取消在該第二時間點之後排程的患者治療事件。條款86. 如條款85之方法，該方法進一步包括向醫院端界面及物流界面傳遞患者治療事件之該取消。條款87. 如條款86之方法，該方法進一步包括回應於該再執行係不可行之確定，銷毀該擴增之細胞療法產品且將該患者特異性標識符與該細胞訂單標識符解除關聯。條款88. 一種根據再排程之患者治療事件用藉由如條款55之方法獲得的擴增細胞療法產品治療患者之方法。

[圖1]：提供步驟A至F之概覽的例示性Gen 2 (過程2A)圖。 [圖2A-2C]：用於TIL製造之Gen 2 (過程2A)的一些實施例之過程流程圖。 [圖3]：顯示冷凍保存之TIL例示性製造過程(約22天)的一些實施例之圖。 [圖4]：顯示用於TIL製造之22天過程Gen 2 (過程2A)的一些實施例之圖。 [圖5]：用於TIL製造之過程1C及Gen 2 (過程2A)的例示性實施例之步驟A至F之比較表。 [圖6]：用於TIL製造之過程1C的一些實施例及Gen 2 (過程2A)的一些實施例之詳細比較。 [圖7]：例示性GEN 3類型TIL製造過程。 [圖8A]顯示用於TIL製造之2A過程(約22天過程)與Gen 3過程(約14天至16天過程)的一些實施例之間之比較。 [圖8B]：繪示提供步驟A至F之概覽的例示性過程Gen3圖(約14天至16天過程)。 [圖8C]：顯示的圖提供針對三種過程變化形式中每一者之具有步驟A至F之概覽的三種例示性Gen 3過程(約14天至16天過程)。 [圖8D]：繪示提供步驟A至F之概覽的例示性經修改類Gen 2過程(約22天過程)。 [圖9]：提供針對Gen 2 (過程2A)對Gen 3過程之間的可比較性之實驗流程圖。 [圖10]：顯示各種Gen 2 (過程2A)與Gen 3.1過程實施例之間的比較。 [圖11]：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0過程之實施例的各種特徵之表。 [圖12]：用於Gen 3過程(稱作Gen 3.1)之一些實施例的培養基條件之概覽。 [圖13]：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.1過程之實施例的各種特徵之表。 [圖14]：比較Gen 2及Gen 3.0過程之實施例的各種特徵之表。 [圖15]：提供所述擴增過程之各種實施例中的培養基使用之表。 [圖16]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖17]：使用Gen 3擴增平台擴增來自造血惡性病之T細胞的方法之例示性實施例的示意圖。 [圖18]：提供結構I-A及I-B。圓柱體係指個別多肽結合域。結構I-A及I-B包含源自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的三個線性連接TNFRSF結合域，該等結合域折疊形成三價蛋白，該三價蛋白接著經由IgG1-Fc (包括CH ₃及CH ₂域)連接至第二三價蛋白，該IgG1-Fc接著用於將該等三價蛋白中之兩者經由二硫鍵(小的延長橢圓形)連接在一起，從而穩定結構且提供促效劑，該促效劑能夠使六種受體及信號傳導蛋白之細胞內信號傳導域結合在一起以形成信號傳導複合物。表示為圓柱體之TNFRSF結合域可為scFv域，其包含例如藉由連接體連接的V _H及V _L鏈，該連接體可包含親水性殘基及用於靈活性之Gly及Ser序列以及用於溶解度之Glu及Lys。 [圖19]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖20]：提供Gen 3.1過程(16天過程)之例示性實施例的過程概覽。 [圖21]：Gen 3.1測試(Gen 3.1最佳化)過程(16-17過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖22]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖23A]：例示性Gen 2及例示性Gen 3過程之比較表，其中突出顯示例示性差異。 [圖24]：Gen 3過程(16-17天過程)製備時間線之例示性實施例的示意圖。 [圖25]：Gen 3過程(14-16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖26A-26B]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖27]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。 [圖28]：Gen 2、Gen 2.1及Gen 3過程(16天過程)之一些實施例的比較。 [圖29]：Gen 2、Gen 2.1及Gen 3過程(16天過程)之一些實施例的比較。 [圖30]：Gen 3實施例組件。 [圖31]：Gen 3實施例流程圖比較(Gen 3.0、Gen 3.1對照、Gen 3.1測試)。 [圖32]：顯示Gen 3過程(Gen 3最佳化，16-17天過程)之例示性實施例的組件。 [圖33]：接受標準表。 [圖34]根據一些實施例顯示用於追蹤患者特異性免疫療法資料之系統的方塊圖。 [圖35A]顯示用於協調用於患者之TIL之製造的系統之方塊圖。 [圖35B]根據一些實施例繪示在市售軟體平臺上經合適修改或建立之系統300的組件之對象模式以及在彼等平臺內之彼等標準物。 [圖35C-35E]根據一些實施例示意性繪示生物材料在製造設施處之製造過程中之軌跡。 [圖35F]根據製造過程之一些實施例(例如GEN 3過程)示意性繪示自獲得實體腫瘤通過製造過程至輸注至患者體內之細胞療法產品的旅程中維持COC及COI之過程。 [圖35G]係根據一些實施例之患者腫瘤樣本之標籤的代表性影像。 [圖35H]為表格，顯示根據一些實施例在製造細胞療法產品之過程期間所生成的各種類型之標籤。 [圖35I]及[圖35J]係根據一些實施例之成品標籤之代表性影像。 [圖35K-35P]係根據一些實施例之腫瘤摘取表格之代表性螢幕截圖影像。 [圖36A]及[圖36B]顯示基於TIL製造過程之成功確定患者治療事件之排程的流程圖。 [圖36C]顯示基於TIL製造過程之成功確定患者治療事件之排程的替代實施例之流程圖。 [圖37A-37H]繪示用於由醫院用戶(例如醫院)更新患者登記資料且提交腫瘤樣本摘取訂單之例示性UI。 [圖38A-38D]繪示用於由案例管理師用戶批准腫瘤樣本摘取訂單且基於該批准訂單生成請求之批號之例示性UI。 [圖39A-39E]繪示製造設施用戶之例示性UI，用於指派圖38A-38D中由案例管理師用戶生成的請求批號且驗證所指派之請求批次訂單。 [圖40A-40K]繪示治療設施用戶之例示性UI，用於追蹤手術前、手術及手術後期間之監管鏈。 [圖41A-41C]根據一些實施例繪示用於治療設施處之手術文件記錄之例示性UI。 [圖42]根據一些實施例繪示用於打包治療設施處之文件記錄之例示性手術後UI。 [圖43]根據一些實施例繪示基於圖42中所述之打包及文件記錄步驟之例示性生成運貨單標籤。 [圖44]根據一些實施例繪示來自該系統之端對端之例示性COI及COC報告UI 900。 [圖45A-45C]根據一些實施例繪示在製造設施處接收腫瘤樣本後用於製造設施UI之例示性UI。 [圖46]根據一些實施例繪示登入後端中之腫瘤樣本掃描。 [圖47]：顯示Gen 3過程(16-17天過程)之例示性實施例的組件。 [圖48]：接受標準表。 [圖49]：全尺寸PD-1 KO TIL TALEN過程之實驗流程圖。 [圖50]：全尺寸PD-1 KO TIL TALEN過程之實驗流程圖。 [圖51A-51D]：KO TIL TALEN過程之例示性實施例之示意圖。 [圖52]：實例12中所述之過程之例示性實施例的示意圖。 [圖53A-53B]：PDCD-1 KO TIL之活體內功效。A)藉由流式細胞術評估之PDCD-1 KO效率。B)植入黑色素瘤腫瘤細胞之hIL-2 NOG小鼠(n=14/治療組)用PDCD-1 KO或模擬TIL進行過繼轉移。與模擬TIL組合之抗PD-1抗體治療作為用於PD-1/PD-L1阻斷之對照包括在內。統計學顯著性由*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01及****p ＜ 0.0001表示。 [圖54A-54E]：TIL產品之分析。A)活細胞劑量，B)純度，C)一致性，D)效力，及E) TIL產品之PDCD-1 KO效率。 [圖55A-55B]：TIL產品之分析。A) TIL分化及B) TIL記憶。 [圖56A-56B]：PDCD-1 KO TIL上之活化及抑制相關標誌物之表現。 [圖57A-57B]：PDCD-1 KO TIL產品之IL-2獨立增生分析。 [圖58]：PDCD-1 KO TIL產品之核型分析結果之概述。 [圖59A-59B]：在電穿孔之前細胞之細胞活力(圖59A)及恢復倍數(圖59B)。 [圖60A-60B]：在電穿孔之後細胞之恢復倍數(圖60A)及細胞活力(圖60B)。 [圖61A-61C]：CD3+ (圖61A)、CD8+ (圖61B)及CD4+ (圖61C)細胞上之剔除效率。 [圖62A-62B]：在電穿孔之後細胞之恢復倍數(圖62A)及細胞活力(圖62B)。 [圖63A-63B]：當使用6000 IU/mL IL-2時在電穿孔之後細胞之恢復倍數(圖63A)及細胞活力(圖63B)。 [圖64A-64B]：當使用各自條件時在電穿孔之後細胞之恢復倍數(圖64A)及細胞活力(圖64B)。 [圖65A-65C]：CD3+ (圖65A)、CD8+ (圖65B)及CD4+ (圖65C)細胞上之剔除效率。 [圖66]：在電穿孔之前之細胞活力。 [圖67]：在電穿孔之前細胞之恢復倍數。 [圖68A-68B]：在電穿孔之後細胞之恢復倍數(圖68A)及細胞活力(圖68B)。 [圖69A-69C]：CD3+ (圖69A)、CD8+ (圖69B)及CD4+ (圖69C)細胞上之剔除效率。 [圖70A-70B]：在各種洗滌步驟之後之細胞數目(圖70A)及活力(圖70B)。 [圖71A-71B]：使用PBS洗滌(圖71A)或Cyto洗滌(圖71B)在各種旋轉條件之後之細胞數目。 [圖72A-72B]：使用PBS洗滌(圖72A)或Cyto洗滌(圖72B)在各種旋轉條件之後之細胞活力。 [圖73A-73B]：在各種旋轉條件之後細胞之總旋轉比較細胞數目(圖73A)及總旋轉比較細胞活力(圖73B)。 [圖74]：在各種旋轉條件之後之總旋轉比較細胞損失百分比。 [圖75A-75C]：在電穿孔期間之損失百分比及活力，特定言之在洗滌步驟中的細胞損失百分比(圖75A)，在電穿孔之後之細胞損失百分比(圖75B)，及在電穿孔之後之細胞活力(圖75C)。 [圖76A-76C]：CD3+ (圖76A)、CD8+ (圖76B)及CD4+ (圖76C)細胞上之剔除效率。 [圖77A-77B]：REP收集之細胞活力(圖77A)及擴增倍數(圖77B)。 [圖78A-78B]：在電穿孔之後之細胞損失百分比(圖78A)及細胞活力(圖78B)。 [圖79A-79C]：CD3+ (圖79A)、CD4+ (圖79B)及CD8+ (圖79C)細胞中之剔除效率。 [圖80A-80B]：REP收集之擴增倍數(圖80A)及細胞活力(圖80B)。 [圖81A-81C]：細胞生長(圖81A)，第一次電穿孔剔除效率(圖81B)，及第二次電穿孔剔除效率(圖81C)。 [圖82]：3天休止後之生長百分比。 [圖83A-83C]：PD-1剔除效率。 [圖84]：由NGS進行之 PDCD1基因修飾。 [圖85A-85B]：TCR Vβ亞型在主體PD-1 KO TIL產品中及NE TIL在CD3+PD-1-子集中之分佈。 [圖86A-86B]：PD-1 KO TIL效應子功能，如藉由MLR (圖86A)及多功能性(圖86B)所量測。 [圖87]：M1152 PD-1 KO TIL產品之活體內抗腫瘤活性。 [圖88A-88B]：自體TIL中之TALEN蛋白持久性，隨藉由西方墨點量測之時間而變。 [圖89A-F]：例示性TIL製造過程。 [圖90A-B]：實例22中所述之1/2期研究之模式。 [圖91]：實例23中所述之資料之概述。 [圖92A-D]：實例23之Demo日實驗之結果。 [圖93A-C]：實例23之氖實驗1之結果。 [圖94A-C]：實例23之氙實驗1之結果。 [圖95A-B]：實例23之氙實驗3之結果。 [圖96A-C]：實例23之氙實驗4之結果。

TW202331735A_111140925_SEQL.xml

Claims

一種協調用於治療患者之癌症之經擴增T細胞之製造的方法，該方法包括：藉由將獲自患者之腫瘤之細胞群體擴增成細胞療法產品來製造該細胞療法產品，該製造包括：經由計算裝置提供患者登記入口以使醫院人員能夠安全地登記患者，向該患者指派獨特患者標識符，提交包括與該患者標識符相關之訂單標識符的產品訂單請求，選擇用於由該患者之生物樣品製造細胞療法產品之製造設施，其中與該患者相關之資訊及該產品訂單請求儲存於中央資料庫中；經由計算裝置提供包括智能檢查表之腫瘤摘取入口，該智能檢查表經組態以促進醫院人員安全地自該患者抽取該生物樣品、使該生物樣品與該訂單標識符相關且創建用於抽取該生物樣品之程序的記錄，包括該生物樣品之監管鏈及該程序期間使用之材料的庫存之記錄，該腫瘤摘取入口使得醫院人員能夠生成用於該抽取之生物樣品之容器的標籤，該標籤包含該訂單標識符，其中該等醫院人員在執行該程序時輸入該智能檢查表中之資料經儲存及/或更新至該中央資料庫；經由計算裝置，使得能夠維持監管鏈之記錄，同時安全地接收自該醫院設施運輸之該生物樣品，經由計算裝置，使得能夠實現用於由該生物樣品製造該細胞療法產品之過程的自動化，使用細胞擴增技術自獲自該患者之該生物樣品中所含的該細胞群體之至少一些擴增該細胞療法產品，且確定在第一時間點及在該第一時間點之後的第二時間點該擴增細胞療法產品之接受參數，經由計算裝置，使得製造人員能夠經由製造設施入口記錄與該製造過程及品質控制相關之資料，包括將監管鏈記錄至該中央資料庫，該與品質控制相關之資料包括在該第一及該第二時間獲得的接受參數，該等接受參數包含活力、無菌性、細胞計數、支原體計數、CD3+細胞計數、內毒素分析結果及革蘭氏染色分析結果中之一或多者，經由計算裝置生成用於製造該細胞療法產品之該過程期間所用的容器及用於將製造之細胞療法產品運輸至該醫院設施之容器的標籤，及經由計算裝置協調製造排程及運輸及更換監管鏈及身份鏈記錄之排程；及經由計算裝置協調在該患者之該生物樣品及該製造之細胞療法產品的該運輸期間運輸及維持監管鏈記錄之該排程；基於進行製造品質審查及釋出產品所需之時間、往返於該選擇之製造設施進行運輸所需之時間及不同患者治療事件之時間排程，經由計算裝置生成在自該製造設施接收該細胞療法產品後將發生的患者治療事件之初步排程，且生成快遞排程且自動訂購對應提貨及接收；及經由計算裝置生成自該患者抽取該生物樣品至將該製造之細胞療法產品輸注至該患者中之端對端過程的報告，該報告包括該監管鏈記錄。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：提供第三用戶界面，該第三用戶界面經組態以使得包括該患者(或其代表)、該醫院設施(或其人員)或該計算裝置之管理者在內的第三方能夠存取與患者治療事件之該排程相關之資訊及/或安全地編輯與該患者相關之資訊。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：與客戶關係管理(CRM)資料庫通訊，該資料庫儲存與有資格與該患者相互作用的人員相關之資訊，以執行與使用該細胞療法產品治療該患者相關的任務，其中該CRM資料庫包括有資格與該患者相互作用之該等人員之訓練狀態。
如請求項1之方法，其中該患者登記入口進一步使得該等醫院人員能夠審查、核對且批准該產品訂單請求，其中該計算裝置進一步經組態以基於該訂單標識符及該患者標識符生成採購單且生成用於製造該細胞療法產品之批號。
如請求項1之方法，其中該產品訂單包含該訂單標識符、患者確認、製造之初步排程、與預期製造過程相關之資訊及與該醫院設施及醫院設施人員相關之資訊以及與該細胞療法產品之預期品質控制參數相關之資訊中的一或多者。
如請求項1之方法，其中生成患者治療事件之該初步排程進一步基於在該製造設施處之製造槽的可用性及與各種治療過程相關之醫院人員的排程。
如請求項1之方法，其中選擇用於製造細胞療法產品之製造設施係基於該製造設施之製造槽、地理位置的可用性及用於製造該細胞療法產品之所需過程的可用性。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：使得能夠基於製造過程期間之後果或結果及該製造過程期間之品質控制結果來修改患者治療事件之該初步排程，以便生成患者治療事件之經修改排程。
如請求項8之方法，該方法進一步包括：根據患者治療事件之該經修改排程來修改該運輸排程。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：使得該等醫院人員、該患者或該患者之代表能夠協調患者支持服務，包括與保險投保率及報銷、該患者之旅行及/或對該患者之財務支持相關的活動，同時維持HIPAA法規遵從性。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：使得能夠對該製造過程及/或該生物樣品在該醫院設施與該製造設施之間及/或內部的移動進行限制性觀察。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：使用該智能檢查表，基於儲存於該中央資料庫中之資料及由執行該生物樣品之該抽取的該等醫院人員提供之資料來限制某些資訊之展示。
如請求項1之方法，其中用於該容器之該標籤包括該訂單標識符、與執行當前過程步驟之該等醫院人員相關之資訊以及該當前過程步驟期間使用之物件的可使用性資訊。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：在該生物樣品之該抽取期間，使用該智能檢查表來限制用於後續過程步驟之資料錄入，以回應欲用於該後續過程之容器之標籤上所印刷的資訊與當前過程步驟期間輸入之資訊不匹配，該資訊包括訂單標識符及一或多個參數，該一或多個參數包括該後續過程步驟中所用之試劑或材料的類型、該後續過程步驟中所用之試劑或材料的到期日以及對應於該後續過程步驟之醫院人員的身份及訓練狀態。
如請求項14之方法，其中匹配該標籤上所印刷之資訊包括掃描該標籤且使用機器讀取算法來提取該標籤上所印刷之該資訊。
如請求項1之方法，其中該腫瘤摘取入口進一步使得能夠生成及印刷用於將包括該生物樣品之運輸容器運輸至該製造設施之運輸標籤，該運輸標籤至少包括該訂單標識符，及與將該容器移交至快遞人員的該等醫院人員相關之資訊、與該等快遞人員相關之資訊、與該運輸容器相關之參數及在該等醫院人員與該等快遞人員之間之移交證明中的一或多者。
如請求項1之方法，其中該製造設施入口進一步經組態以使得能夠驗證接收來自該醫院設施之含有該患者之該生物樣品的運輸容器之製造人員之訓練狀態。
如請求項1之方法，其中該製造設施入口進一步經組態以使得能夠在接收來自該醫院設施之含有該患者之生物樣品的運輸容器後錄入與該運輸容器相關之一或多個參數及其中所含之該生物樣品的品質，使該一或多個參數與儲存於該中央資料庫中之對應資料匹配以便驗證該監管鏈、該患者之身份及該生物樣品之所需品質對應於該產品訂單。
如請求項1之方法，其中該製造設施入口進一步經組態以使得能夠藉由即時展示該細胞療法產品之狀態來實現製造過程之自動化，其中該狀態包括當前過程、與該當前過程之前一過程相關的品質控制資訊以及完成該當前過程之預期時間。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：使得能夠將與活動且可用製造槽相關之資訊更新至該中央資料庫中且使得能夠展示該等活動且可用製造槽以便允許確定製造設施及庫存。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：更新與該製造過程相關之材料之庫存相關的資訊。
如請求項1之方法，其中在用於製造該細胞療法產品之該過程期間使用的容器之該標籤包括該訂單標識符及以下至少一者：品質控制報告、與處理該等容器之製造人員相關之資訊、與欲使用該等容器之過程步驟相關之資訊以及對應於印刷該等標籤之原因的原因碼。
如請求項23之方法，其中在各過程步驟中，使該等標籤上所印刷之資訊與前一過程步驟期間或完成後輸入該中央資料庫中之對應資訊匹配。
如請求項23之方法，其中使用一維或二維機器可讀碼對該等標籤上所印刷之該資訊中的一些或所有進行編碼。
如請求項24之方法，其中匹配該標籤上所印刷之資訊包括掃描該標籤且使用機器讀取算法來提取該標籤上所印刷之該資訊。
如請求項26之方法，其中將自該等標籤提取之資訊記錄於該中央資料庫中以使得能夠生成監管鏈及/或身份鏈報告。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：藉由使針對該細胞療法產品之該製造期間執行的各種過程步驟中之每一者印刷之多個標籤及其上印刷之資訊與該中央資料庫中之對應資訊匹配來驗證及核對該等標籤。
如請求項1之方法，該方法進一步包括：基於在該製造過程期間之一或多個時間點獲得的品質資訊來確定製造排程之變化，以確定經修改之製造排程。
如請求項30之方法，該方法進一步包括：使得該計算裝置之授權用戶能夠回應於該經修改之製造排程對一或多個患者治療事件再排程。
如請求項1之方法，其中該製造設施入口進一步使得能夠生成及印刷用於將包括該製造之細胞療法產品之運輸容器運輸至該醫院設施之運輸標籤，該運輸標籤至少包括該訂單標識符，及與將該容器移交至快遞人員的該等製造人員相關之資訊、與該等快遞人員相關之資訊、與該運輸容器相關之參數及在該等製造人員與該等快遞人員之間之移交證明中的一或多者。
如請求項32之方法，該方法進一步包括：藉由使物流提供者能夠生成包括訂單標識符、批號及與在中間運輸及/或轉運階段期間處理該運輸容器之處理者相關之資訊的轉運標籤，使該物流提供者能夠在維持監管鏈記錄的同時包括該等中間運輸及/或轉運階段。