TW202246515A - 富含組胺酸之肽作為轉染試劑用於產生ｒＡＡＶ及ｒＢＶ之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供用於製備及使用腺相關病毒及桿狀病毒之方法、組合物及套組。用於產生腺相關病毒及桿狀病毒粒子之方法包括使用富含組胺酸之肽及其他陽離子肽作為轉染試劑。腺相關病毒經衣殼假模式化，尤其用於基因療法及/或診斷學中。桿狀病毒亦用於製備腺相關病毒。

Description

富含組胺酸之肽作為轉染試劑用於產生rAAV及rBV之用途

本發明係針對使用富含組胺酸之肽（histidine rich peptide, HRP）作為轉染試劑產生重組腺相關病毒（rAAV）及重組桿狀病毒（rBV）粒子之方法及製程。

本發明係針對改良腺相關病毒（AAV）產生之方法。AAV為具有20-25 nm（4.7 kb）單股DNA基因體之無包膜病毒。AAV具有大約4.7千鹼基（kb）之線性單股DNA（ssDNA）基因體，在末端具有兩個145個核苷酸長之反向末端重複序列（inverted terminal repeat，ITR）。病毒不編碼聚合酶且因此依賴於細胞聚合酶進行基因體複製。ITR側接兩種病毒基因，亦即rep（複製）及cap（衣殼），分別編碼非結構蛋白及結構蛋白。經由使用兩種啟動子及替代性剪接，rep基因編碼四種調控蛋白質，稱為Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。此等蛋白質參與AAV基因體複製及封裝。經由替代性剪接及起始轉譯，cap基因產生三種衣殼蛋白，亦即VP1（病毒體蛋白質1）、VP2及VP3，分子量分別為87、72及62 kDa。此等衣殼蛋白組裝成具有60個次單元之近似球形的蛋白質殼。

AAV不能獨立地複製且需要與輔助病毒，通常為腺病毒或疱疹病毒共感染。當AAV單獨感染人類細胞時，其基因表現程式為自動抑制的且發生細胞之潛伏感染。然而，當潛伏感染之細胞經諸如腺病毒或單純疱疹病毒之輔助病毒共感染時，活化AAV基因表現，使得原病毒DNA自宿主細胞染色體切除，隨後複製且封裝病毒基因體。

哺乳動物或昆蟲細胞中病毒載體之產生需要遞送編碼所關注之基因之外來核酸及參與病毒載體產生之必需蛋白質。外來核酸被動吸收至細胞中受到限制，以保護細胞免受可能的感染。因此需要促進核酸之遞送。最常使用轉染試劑使核酸穿梭至細胞中。用於大規模製造病毒載體之轉染試劑之選擇由其效率、安全性、一致性、可縮放性及成本決定。

合適轉染試劑成為大規模生產病毒載體之成功候選物應滿足若干準則：1）較佳結合呈質體、桿狀病毒質體之形式或任何其他形式提供的外來核酸；2）外來DNA與轉染試劑之複合物較佳穩定超過10分鐘；3）外來DNA:轉染試劑之複合物結合於細胞表面且為細胞所吸收；4）轉染試劑較佳提供胞內體釋放外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物之方式；5）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳能夠達到細胞核；6）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳可用於轉錄蛋白質及複製基因；7）較佳地，細胞對轉染試劑及外來DNA:轉染試劑複合物具有良好耐受性；8）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳與所選生產培養基相容；及9）轉染試劑較佳能夠有效轉染生產細胞。

當前市售轉染試劑缺乏上文提及之準則中之一或多者。例如，PEIPRO®（GMP級，PolyPlus），一種廣泛使用之選擇用於產生病毒載體及疫苗的轉染試劑，其包括線性聚乙烯亞胺（PEI），已知DNA:PEI複合物之穩定性較差（Sang Y.等人 Salt ions and related parameters affect PEI-DNA particle size and transfection efficiency in Chinese hamster ovary cellsCytotechnology 2015, 67（1）:67-74；Han X.等人, The heterogeneous nature of polyethylenimine-DNA complex formation affects transient gene expressionCytotechnology 2009, 60（1-3）:63）。

對於不同生產系統，轉染試劑直接影響生物材料之生產規模。為此，諸如PEI之轉染試劑無法擴大生產規模。例如，應注意，人類胚胎腎293（HEK293）細胞培養物生產限於500公升（L）或更少之體積。

另外，基於脂質之轉染試劑在與DNA形成複合物之前在稀釋形式下不穩定。此外，用於昆蟲及哺乳動物細胞之轉染試劑（例如，CELLFECTIN®、TRANSIT®及FECTOVIR®）尚未以優良藥品製造規範（GMP）級獲得，GMP級係用於臨床目的之rAAV生產所期望的。

因此，需要適合於在GMP背景下大規模製造病毒載體之更佳轉染試劑。

在各個實施例中，揭示用於製備重組腺相關病毒（rAAV）及重組桿狀病毒（rBV）之方法。亦在各個實施例中，揭示用於產生穩定表現用於產生rAAV之元件（elements）之細胞的方法。方法包括使用陽離子肽作為轉染試劑，其中該等肽在6至8範圍內之pH（例如，7.4）下具有正電荷。一些示例性陽離子肽包括富含組胺酸之肽（HRP），其能夠與去氧核糖核酸（DNA）發生靜電相互作用且滲透細胞膜以使得DNA遞送至細胞中。因此，HRP可用作將質體及桿狀病毒質體遞送至細胞之轉染試劑。

各個實施例之rAAV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染，培養經轉染之細胞以產生rAAV，且視情況回收rAAV。

在其他實施例中，rAAV產生方法包括以下步驟：使用轉染試劑將懸浮於超過500公升（L）培養物體積之細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體短暫共轉染，培養經轉染之細胞以產生rAAV，且視情況回收rAAV。

各個實施例之rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用具有異源核苷酸序列之重組桿狀病毒質體轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用異源核苷酸序列轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分。在培養步驟期間，異源核苷酸序列及桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用環狀或線性化的完整或部分桿狀病毒基因體及含有與桿狀病毒基因體同源之區域的異源核苷酸序列（其可併入轉移載體中）共轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。在培養步驟期間，完整或部分桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列經由同源區域重組而形成能夠產生rBV且攜帶異源核苷酸序列之至少一部分的重組桿狀病毒基因體。

各個實施例之rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用具有提供rAAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列的重組桿狀病毒質體轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分。在培養步驟期間，核苷酸序列及桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用環狀或線性化的完整或部分桿狀病毒基因體及含有rAAV載體基因體或AAV rep及/或cap基因且亦含有與桿狀病毒基因體同源之區域的異源核苷酸序列（其可併入轉移載體中）共轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。在培養步驟期間，完整或部分桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列經由同源區域重組而形成能夠產生rBV，攜帶異源核苷酸序列之至少一部分的重組桿狀病毒基因體。

各個實施例之細胞產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用具有編碼用於產生rAAV之元件之核苷酸序列的載體轉染，且分離具有含有該核苷酸序列之基因體的經轉染之細胞。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽包括與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列。

在各個實施例中，揭示一種組合物，其包括具有與SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123或124中之任一者至少85%一致之胺基酸序列的一種或多種陽離子肽。在其他實施例中，揭示包括具有SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123或124之胺基酸序列之一種或多種陽離子肽的組合物。

在各個實施例中，揭示包括具有與SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123、124或其組合中之任一者至少85%一致之胺基酸序列的一種或多種陽離子肽的組合物。在其他實施例中，揭示包括具有SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123、124之胺基酸序列的一種或多種陽離子肽的組合物。

視需要，本文中揭示本發明之詳細實施例；然而，應理解，所揭示之實施例僅為示例性的且可以各種及替代形式體現。

除實例外，或除非明確指示，否則本說明書中指示材料之量或反應及/或使用之條件的所有數量皆應理解為由字「約」修飾。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。在一個實例中，術語「約」理解為在此項技術中正常公差之範圍內，例如在平均值之2個標準偏差內。在不同實例中，「約」係指±0.0001%、±0.0005%、±0.001%、±0.005%、±0.01%、±0.05%、±0.1%、±0.5%、±1%、±5%或±10%之變化性。在其他實例中，「約」可理解為在±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%或±2%內。

除非上下文另有明確說明，否則本文所提供之所有數值均藉由術語約修飾。所有範圍包括範圍之終點。字首語或其他縮寫之第一定義適用於同一縮寫在本文中之所有後續使用，並且在細節上作必要修改後適用於最初定義之縮寫之正常語法變體。除非明確地相反陳述，否則特性之量測藉由與先前或稍後針對相同特性所參考相同的技術測定。

除非另外指示，否則本文中所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。

亦應瞭解，本發明不限於下述特定實施例及方法，因為特定組分及/或條件當然可變化。此外，本文中所用之術語僅用於描述特定實施例，且不意欲以任何方式限制。

貫穿本申請案，在參考公開案之情況下，此等公開案之揭示內容在此以引用之方式全部併入本申請案中，以更充分地描述本發明關於之目前先進技術。

亦較佳地指出，除非上下文另外明確地指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一（a/an）」及「該（the）」包含複數個指示物。舉例而言，以單數形式提及一種組件意欲包含複數個組件。

術語「或」及「及」可互換地使用且可理解為意謂「及/或」。

術語「包含」與「包括」、「具有」、「含有」或「特徵在於」同義。此等術語為包括性且開放的，且不排除其他未列出之要素或方法步驟。

片語「由……組成」排除申請專利範圍中未規定之任何要素、步驟或成分。當此片語出現在一個技術方案主體之子句中而非緊接在前言之後時，其僅限制該子句中所闡述之要素；該技術方案總體上不排除其他要素。

片語「基本上由……組成」將技術方案之範疇限於指定材料或步驟及實質上不影響所主張主題之基本及新穎特徵的彼等材料或步驟。

術語「包含」、「由……組成」及「基本上由……組成」可替代性地使用。當使用此三個術語中之一者時，本發明揭示及主張之主題可包括使用其他兩個術語中之任一者。

根據本發明，本發明者意外地發現，鑑別為富含組胺酸之肽（HRP）的陽離子肽以及其他陽離子肽能夠有效轉染細胞，從而在諸如人類胚胎腎293（HEK293）細胞之不同細胞類型中產生更大效價之重組型腺相關病毒（rAAV）。為此目的，使用HRP作為轉染試劑意外地解決生物材料（例如，重組蛋白、諸如反義寡核苷酸之核苷酸、小干擾核糖核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、生物製劑及基因療法載體，諸如rAAV及重組慢病毒）生產規模化之限制，該等生物材料之規模化尚未由當前最新技術解決且為行業長期切身需要。此外，為產生一些生產類型，包括昆蟲細胞，根據優良藥品製造規範（GMP）製備HRP，而其他轉染試劑不能或未產生為GMP級。HRP亦為生物可降解的，且受限於不削弱細胞存活率/對細胞存活率無作用。

雖然本文所述之方法可揭示及描述為步驟，但應瞭解該等方法不一定受步驟次序限制，因為根據此等方法，一些步驟可以不同次序進行，及/或與本文所述及/或此項技術中已知之其他步驟同時進行。

各個實施例之rAAV產生方法包括以下步驟：使用陽離子肽/HRP將細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染，培養經轉染之細胞以產生rAAV，且回收rAAV。術語「陽離子肽/HRP」係指HRP以及其他描述之陽離子肽。例如，陽離子肽包括與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%、90%、95%、99%、99%+或100%一致的胺基酸序列。在兩個或更多個核苷酸或肽胺基酸序列之情況下術語「一致性百分比」、「一致百分比」或「%一致」係指當為求最大對應性進行比較及比對時相同之核苷酸或胺基酸殘基之百分比。例如，使用NCBI blastp（胺基酸）使用預設設置確定一致性百分比。

在其他實例中，具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124之胺基酸序列的陽離子肽可具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個或55個胺基酸取代，諸如保守胺基酸交換。保守胺基酸交換之例示性實例為維持胺基酸側鏈之結構及/或功能特性的胺基酸取代，例如芳族胺基酸取代另一芳族胺基酸，酸性胺基酸取代另一酸性胺基酸，鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸，且脂族胺基酸取代另一脂族胺基酸。在一些實施例中，保守胺基酸取代為胺基酸殘基經側鏈具有類似電荷之胺基酸殘基置換的取代。側鏈具有類似電荷之胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、不帶電之極性側鏈（例如，天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性側鏈（例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β-分支鏈側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及芳族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）之胺基酸。表1中呈現標準化及公認之功能上同等的胺基酸取代。相比之下，非保守胺基酸交換之實例為不維持胺基酸側鏈之結構及/或功能特性之胺基酸取代，例如芳族胺基酸取代鹼性、酸性或脂族胺基酸，酸性胺基酸取代芳族、鹼性或脂族胺基酸，鹼性胺基酸取代酸性、芳族或脂族胺基酸，且脂族胺基酸取代芳族、酸性或鹼性胺基酸。

表1. 保守胺基酸取代

胺基酸組	保守取代
非極性側鏈	丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、甘胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸
不帶電之極性側鏈	天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸
β-分支鏈側鏈	蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸
芳族側鏈	酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸
鹼性側鏈或帶正電荷之R基團	離胺酸、精胺酸、組胺酸
酸性側鏈或帶負電荷之R基團	天冬胺酸、麩胺酸

在其他實施例中，rAAV產生方法包括以下步驟：使用轉染試劑將懸浮於超過500公升（L）培養物體積之細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體短暫共轉染，培養經轉染之細胞以產生rAAV，且視情況回收rAAV。如先前所述，本發明解決利用培養物之當前最新技術之限制，最新技術限制以超過500 L規模生產rAAV或生物製品之能力。例如，使用HEK293細胞生產rAAV或其他生物製品之當前最新技術限於500 L或更少。因此，如本申請案中所描述之本發明克服當前最新技術之限制。

各個實施例之rBV產生方法包括以下步驟：使用陽離子肽/HRP將細胞用具有桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列之重組桿狀病毒質體轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用異源核苷酸序列轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分。在培養步驟期間，異源核苷酸序列及桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用環狀或線性化的完整或部分桿狀病毒基因體及含有與桿狀病毒基因體同源之區域的異源核苷酸序列（其可併入轉移載體中）共轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。在培養步驟期間，完整或部分桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列經由同源區域重組而形成能夠產生rBV，攜帶異源核苷酸序列之至少一部分的重組桿狀病毒基因體。

各個實施例之rBV產生方法包括以下步驟：使用陽離子肽/HRP將細胞用具有提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列的重組桿狀病毒質體轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分。在培養步驟期間，核苷酸序列及桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。

在其他實施例中，rBV產生方法包括以下步驟：使用諸如HRP之陽離子肽將細胞用環狀或線性化的完整或部分桿狀病毒基因體及含有rAAV載體基因體或AAV rep及/或cap基因且亦含有與桿狀病毒基因體同源之區域的異源核苷酸序列（其可併入轉移載體中）共轉染，培養經轉染之細胞以產生rBV，且視情況回收rBV。在培養步驟期間，完整或部分桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列經由同源區域重組而形成能夠產生rBV，攜帶異源核苷酸序列之至少一部分的重組桿狀病毒基因體。

各個實施例之細胞產生方法包括以下步驟：使用陽離子肽/HRP將細胞用具有編碼用於產生rAAV之元件之核苷酸序列的載體轉染，且分離具有含有該核苷酸序列之基因體的經轉染之細胞。

在rAAV產生方法之各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染於至少1個細胞中。在各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染於至少1%、至少5%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、至少99%+或至少100%細胞中。在其他實施例中，用一種或多種載體轉染之細胞之百分比在以上提供之任兩個百分比之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比大於使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比，其中轉染條件最佳化以最大化用一種或多種載體轉染或替代地在相同或類似轉染條件下轉染之細胞的百分比。

在rAAV產生方法之各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體及任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑之一以小於細胞培養物體積10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%的體積添加至細胞中。在各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體及任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑之一以細胞培養物體積之0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%之體積添加至細胞中。在其他實施例中，一種或多種載體與陽離子肽/HRP及轉染試劑中之至少一者的混合物之體積為細胞培養物體積之分數，其中該分數在以上提供之任兩個百分比之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體及任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑之一在共轉染步驟之前混合在一起。考慮到較大細胞培養物體積中細胞之轉染，混合物長時間穩定。在各個實施例中，任何實施例之一種或多種載體與肽/HRP及轉染試劑之混合物在共轉染步驟之前培育至少1分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少20分鐘、至少50分鐘、至少100分鐘、至少200分鐘、至少500分鐘、至少1000分鐘或至少2000分鐘。在各個實施例中，任何實施例之一種或多種載體與肽/HRP及轉染試劑之混合物在共轉染步驟之前培育1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、11分鐘、12分鐘、13分鐘、14分鐘、15分鐘、16分鐘、17分鐘、18分鐘、19分鐘、20分鐘、21分鐘、22分鐘、23分鐘、24分鐘、25分鐘、26分鐘、27分鐘、28分鐘、29分鐘、30分鐘、31分鐘、32分鐘、33分鐘、34分鐘、35分鐘、36分鐘、37分鐘、38分鐘、39分鐘、40分鐘、41分鐘、42分鐘、43分鐘、44分鐘、45分鐘、46分鐘、47分鐘、48分鐘、49分鐘、50分鐘、51分鐘、52分鐘、53分鐘、54分鐘、55分鐘、56分鐘、57分鐘、58分鐘、59分鐘、60分鐘、61分鐘、62分鐘、63分鐘、64分鐘、65分鐘、66分鐘、67分鐘、68分鐘、69分鐘、70分鐘、71分鐘、72分鐘、73分鐘、74分鐘、75分鐘、76分鐘、77分鐘、78分鐘、79分鐘、80分鐘、81分鐘、82分鐘、83分鐘、84分鐘、85分鐘、86分鐘、87分鐘、88分鐘、89分鐘、90分鐘、91分鐘、92分鐘、93分鐘、94分鐘、95分鐘、96分鐘、97分鐘、98分鐘、99分鐘、100分鐘、101分鐘、102分鐘、103分鐘、104分鐘、105分鐘、106分鐘、107分鐘、108分鐘、109分鐘、110分鐘、111分鐘、112分鐘、113分鐘、114分鐘、115分鐘、116分鐘、117分鐘、118分鐘、119分鐘、120分鐘、120分鐘、130分鐘、140分鐘、150分鐘、160分鐘、170分鐘、180分鐘、190分鐘、200分鐘、210分鐘、220分鐘、230分鐘、240分鐘、250分鐘、260分鐘、270分鐘、280分鐘、290分鐘、300分鐘、310分鐘、320分鐘、330分鐘、340分鐘、350分鐘、360分鐘、370分鐘、380分鐘、390分鐘、400分鐘、410分鐘、420分鐘、430分鐘、440分鐘、450分鐘、460分鐘、470分鐘、480分鐘、490分鐘、500分鐘、510分鐘、520分鐘、530分鐘、540分鐘、550分鐘、560分鐘、570分鐘、580分鐘、590分鐘、600分鐘、700分鐘、800分鐘、900分鐘、1000分鐘、1500分鐘或2000分鐘。在各個實施例中，培育時間在以上提供之任兩個時間之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比大於使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比，其中在共轉染步驟之前將陽離子肽/HRP及包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑混合且與一種或多種載體一起培育相同時間段。在各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比比使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的百分比大至少1%、至少10%、至少50%、至少100%、至少500%、至少1000%、至少5000%或至少10000%，其中在共轉染步驟之前將陽離子肽/HRP及包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑混合且與一種或多種載體一起培育相同時間段。

在rAAV產生方法之各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的比生產率（載體基因體（vg）/細胞）大於使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的比生產率，其中轉染條件最佳化以最大化用一種或多種載體轉染或替代地在相同或類似轉染條件下轉染之細胞的百分比。可使用微滴式數位聚合酶鏈反應（ddPCR）評估比生產率，且藉由將最終效價（載體基因體（vg）/mL收穫流體）除以峰值活細胞密度（細胞數目/毫升）來計算。在各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的比生產率比使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的比生產率大至少1%、至少10%、至少50%、至少100%、至少500%、至少1000%、至少5000%、至少10000%、至少3 log、至少4 log、或至少5 log，其中轉染條件最佳化以最大化用一種或多種載體轉染或替代地在相同或類似轉染條件下轉染之細胞的百分比。

在各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的比生產率為至少1×10 ²載體基因體（vg）/細胞、至少1×10 ³vg/細胞、至少1×10 ⁴vg/細胞、至少1×10 ⁵vg/細胞、至少1×10 ⁶vg/細胞或至少1×10 ⁷vg/細胞。

在rAAV產生方法之各個實施例中，使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞產生的rAAV效價大於使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞的rAAV效價，其中包括細胞培養物體積之轉染條件最佳化以最大化用一種或多種載體轉染或替代地在相同或類似轉染條件下轉染之細胞的百分比。

在rAAV產生方法之各個實施例中，由使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞產生的rAAV效價比由使用包括聚乙烯亞胺或其衍生物之轉染試劑用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞產生的rAAV效價大至少1%、至少10%、至少50%、至少100%、至少500%、至少1000%、至少5000%、至少10000%或至少3 log，其中包括細胞培養物體積之轉染條件最佳化以最大化用一種或多種載體轉染或替代地在相同或類似轉染條件下轉染之細胞的百分比。

在rAAV產生方法之各個實施例中，由使用陽離子肽/HRP用一種或多種用於產生rAAV之載體轉染之細胞產生的rAAV效價為至少0.1×10 ¹⁰vg/mL、至少0.5×10 ¹⁰vg/mL、至少1×10 ¹⁰vg/mL、至少1×10 ¹¹vg/mL、至少1×10 ¹²vg/mL、至少1×10 ¹³vg/mL或至少1×10 ¹⁴vg/mL。

在rAAV產生方法之各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體與任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑中之一者的重量比為50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49或1:50。在各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體與任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑中之一者的重量比在以上提供之任兩個重量比之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，細胞培養物中陽離子肽/HRP之濃度為至少0.001微克（µg）/mL、至少0.01 µg/ mL、至少0.1 µg/mL、至少0.5 µg/mL、至少1 µg/mL、至少10 µg/mL、至少50 µg/mL、至少100 µg/mL、1-200 µg/mL、5-50 µg/mL、10-150 µg/mL或100-200 µg/mL。在各個實施例中，細胞培養物中陽離子肽或HRP之濃度為1 µg/mL、1.5 µg/mL、2 µg/mL、2.5 µg/mL、3 µg/mL、3.5 µg/mL、4 µg/mL、4.5 µg/mL、5 µg/mL、5.5 µg/mL、6、µg/mL、6.5 µg/mL、7 µg/mL、7.5 µg/mL、8 µg/mL、8.5 µg/mL、9 µg/mL、9.5 µg/mL、10 µg/mL、10.5 µg/mL、11 µg/mL、11.5 µg/mL、12 µg/mL、12.5 µg/mL、13 µg/mL、13.5 µg/mL、14 µg/mL、14.5 µg/mL、15 µg/mL、15.5 µg/mL、16 µg/mL、16.5 µg/mL、17 µg/mL、17.5 µg/mL、18 µg/mL、18.5 µg/mL、19 µg/mL、19.5 µg/mL、20 µg/mL、20.5 µg/mL、21 µg/mL、21.5 µg/mL、22 µg/mL、22.5 µg/mL、23 µg/mL、23.5 µg/mL、24 µg/mL、24.5 µg/mL、25 µg/mL、26 µg/mL、27 µg/mL、28 µg/mL、29 µg/mL、30 µg/mL、31 µg/mL、32 µg/mL、33 µg/mL、34 µg/mL、35 µg/mL、36 µg/mL、37 µg/mL、38 µg/mL、39 µg/mL、40 µg/mL、41 µg/mL、42 µg/mL、43 µg/mL、44 µg/mL、45 µg/mL、46 µg/mL、47 µg/mL、48 µg/mL、49 µg/mL、50 µg/mL、51 µg/mL、52 µg/mL、53 µg/mL、54 µg/mL、55 µg/mL、56 µg/mL、57 µg/mL、58 µg/mL、59 µg/mL、60 µg/mL、61 µg/mL、62 µg/mL、63 µg/mL、64 µg/mL、65 µg/mL、66 µg/mL、67 µg/mL、68 µg/mL、69 µg/mL、70 µg/mL、71 µg/mL、72 µg/mL、73 µg/mL、74 µg/mL、75 µg/mL、76 µg/mL、77 µg/mL、78 µg/mL、79 µg/mL、80 µg/mL、81 µg/mL、82 µg/mL、83 µg/mL、84 µg/mL、85 µg/mL、86 µg/mL、87 µg/mL、88 µg/mL、89 µg/mL、90 µg/mL、91 µg/mL、92 µg/mL、93 µg/mL、94 µg/mL、95 µg/mL、96 µg/mL、97 µg/mL、98 µg/mL、99 µg/mL、100 µg/mL、101 µg/mL、102 µg/mL、103 µg/mL、104 µg/mL、105 µg/mL、106 µg/mL、107 µg/mL、108 µg/mL、109 µg/mL、110 µg/mL、111 µg/mL、112 µg/mL、113 µg/mL、114 µg/mL、115 µg/mL、116 µg/mL、117 µg/mL、118 µg/mL、119 µg/mL、120 µg/mL、121 µg/mL、122 µg/mL、123 µg/mL、124 µg/mL、125 µg/mL、126 µg/mL、127 µg/mL、128 µg/mL、129 µg/mL、130 µg/mL、131 µg/mL、132 µg/mL、133 µg/mL、134 µg/mL、135 µg/mL、136 µg/mL、137 µg/mL、138 µg/mL、139 µg/mL、140 µg/mL、141 µg/mL、142 µg/mL、143 µg/mL、144 µg/mL、145 µg/mL、146 µg/mL、147 µg/mL、148 µg/mL、149 µg/mL、150 µg/mL、151 µg/mL、152 µg/mL、153 µg/mL、154 µg/mL、155 µg/mL、156 µg/mL、157 µg/mL、158 µg/mL、159 µg/mL、160 µg/mL、161 µg/mL、162 µg/mL、163 µg/mL、164 µg/mL、165 µg/mL、166 µg/mL、167 µg/mL、168 µg/mL、169 µg/mL、170 µg/mL、171 µg/mL、172 µg/mL、173 µg/mL、174 µg/mL、175 µg/mL、176 µg/mL、177 µg/mL、178 µg/mL、179 µg/mL、180 µg/mL、181 µg/mL、182 µg/mL、183 µg/mL、184 µg/mL、185 µg/mL、186 µg/mL、187 µg/mL、188 µg/mL、189 µg/mL、190 µg/mL、191 µg/mL、192 µg/mL、193 µg/mL、194 µg/mL、195 µg/mL、196 µg/mL、197 µg/mL、198 µg/mL、199 µg/mL或200 µg/mL。在各個實施例中，細胞培養物中陽離子肽/HRP之濃度在以上提供之任兩個濃度之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，細胞培養物中一種或多種用於產生rAAV之載體的濃度為至少0.0001 µg/ml、至少0.001 µg/ml、至少0.01 µg/ml、至少0.1 µg/ml、至少0.5 µg/ml、至少1 µg/ml、0.1-15 µg/ml或0.5-200 µg/ml。在各個實施例中，細胞培養物中一種或多種用於產生rAAV之載體的濃度為0.0001 µg/ml、0.001 µg/ml、0.01 µg/ml、0.05 µg/ml、0.1 µg/ml、0.5 µg/ml、1 µg/ml、1.5 µg/ml、2 µg/ml、2.5 µg/ml、3 µg/ml、3.5 µg/ml、4 µg/ml、4.5 µg/ml、5 µg/ml、5.5 µg/ml、6、µg/ml、6.5 µg/ml、7 µg/ml、7.5 µg/ml、8 µg/ml、8.5 µg/ml、9 µg/ml、9.5 µg/ml、10 µg/ml、10.5 µg/ml、11 µg/ml、11.5 µg/ml、12 µg/ml、12.5 µg/ml、13 µg/ml、13.5 µg/ml、14 µg/ml、14.5 µg/ml、15 µg/ml、15.5 µg/ml、16 µg/ml、16.5 µg/ml、17 µg/ml、17.5 µg/ml、18 µg/ml、18.5 µg/ml、19 µg/ml、19.5 µg/ml、20 µg/ml、20.5 µg/ml、21 µg/ml、21.5 µg/ml、22 µg/ml、22.5 µg/ml、23 µg/ml、23.5 µg/ml、24 µg/ml、24.5 µg/ml、25 µg/ml、26 µg/mL、27 µg/mL、28 µg/mL、29 µg/mL、30 µg/mL、31 µg/mL、32 µg/mL、33 µg/mL、34 µg/mL、35 µg/mL、36 µg/mL、37 µg/mL、38 µg/mL、39 µg/mL、40 µg/mL、41 µg/mL、42 µg/mL、43 µg/mL、44 µg/mL、45 µg/mL、46 µg/mL、47 µg/mL、48 µg/mL、49 µg/mL、50 µg/mL、51 µg/mL、52 µg/mL、53 µg/mL、54 µg/mL、55 µg/mL、56 µg/mL、57 µg/mL、58 µg/mL、59 µg/mL、60 µg/mL、61 µg/mL、62 µg/mL、63 µg/mL、64 µg/mL、65 µg/mL、66 µg/mL、67 µg/mL、68 µg/mL、69 µg/mL、70 µg/mL、71 µg/mL、72 µg/mL、73 µg/mL、74 µg/mL、75 µg/mL、76 µg/mL、77 µg/mL、78 µg/mL、79 µg/mL、80 µg/mL、81 µg/mL、82 µg/mL、83 µg/mL、84 µg/mL、85 µg/mL、86 µg/mL、87 µg/mL、88 µg/mL、89 µg/mL、90 µg/mL、91 µg/mL、92 µg/mL、93 µg/mL、94 µg/mL、95 µg/mL、96 µg/mL、97 µg/mL、98 µg/mL、99 µg/mL、100 µg/mL、101 µg/mL、102 µg/mL、103 µg/mL、104 µg/mL、105 µg/mL、106 µg/mL、107 µg/mL、108 µg/mL、109 µg/mL、110 µg/mL、111 µg/mL、112 µg/mL、113 µg/mL、114 µg/mL、115 µg/mL、116 µg/mL、117 µg/mL、118 µg/mL、119 µg/mL、120 µg/mL、121 µg/mL、122 µg/mL、123 µg/mL、124 µg/mL、125 µg/mL、126 µg/mL、127 µg/mL、128 µg/mL、129 µg/mL、130 µg/mL、131 µg/mL、132 µg/mL、133 µg/mL、134 µg/mL、135 µg/mL、136 µg/mL、137 µg/mL、138 µg/mL、139 µg/mL、140 µg/mL、141 µg/mL、142 µg/mL、143 µg/mL、144 µg/mL、145 µg/mL、146 µg/mL、147 µg/mL、148 µg/mL、149 µg/mL、150 µg/mL、151 µg/mL、152 µg/mL、153 µg/mL、154 µg/mL、155 µg/mL、156 µg/mL、157 µg/mL、158 µg/mL、159 µg/mL、160 µg/mL、161 µg/mL、162 µg/mL、163 µg/mL、164 µg/mL、165 µg/mL、166 µg/mL、167 µg/mL、168 µg/mL、169 µg/mL、170 µg/mL、171 µg/mL、172 µg/mL、173 µg/mL、174 µg/mL、175 µg/mL、176 µg/mL、177 µg/mL、178 µg/mL、179 µg/mL、180 µg/mL、181 µg/mL、182 µg/mL、183 µg/mL、184 µg/mL、185 µg/mL、186 µg/mL、187 µg/mL、188 µg/mL、189 µg/mL、190 µg/mL、191 µg/mL、192 µg/mL、193 µg/mL、194 µg/mL、195 µg/mL、196 µg/mL、197 µg/mL、198 µg/mL、199 µg/mL或200 µg/mL。在各個實施例中，細胞培養物中一種或多種用於產生rAAV之載體的濃度在以上提供之任兩個濃度之間的範圍內。

在rAAV產生方法之各個實施例中，任何實施例之一種或多種用於產生rAAV之載體包括AAV基因體載體、AAV輔助載體及具有提供非AAV輔助功能之核苷酸的載體。一種或多種用於產生rAAV之載體的實例包括呈質體或黏質體之形式的核苷酸序列，其在轉染至細胞中時表現Rep及Cap蛋白，產生AAV基因體載體，且提供病毒輔助功能（例如，轉錄因子等）用於產生rAAV。

在rAAV產生方法及細胞產生方法之各個實施例中，細胞為真核細胞，諸如哺乳動物細胞。哺乳動物細胞之實例包括人類細胞。哺乳動物細胞之其他實例包括HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5細胞。

在rBV產生方法之各個實施例中，任何實施例之重組桿狀病毒質體及任何實施例之陽離子肽/HRP在轉染步驟之前混合在一起。

在rBV產生方法之各個實施例中，回收步驟包括回收經桿狀病毒感染之昆蟲細胞（BIIC）。在rBV產生方法之各個實施例中，回收步驟包含回收BIIC且將回收之BIIC與先前在培養物中未經桿狀病毒感染之細胞一起培養以產生rAAV。

在rBV產生方法及細胞產生方法之各個實施例中，細胞為來源於草地黏蟲（ Spodoptera frugiperda）、白紋伊蚊（ Aedes albopictus）、家蠶（ Bombyxmori）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）、黑巫婆飛蛾（ Ascalapha odorata）、果蠅（ Drosphila）、瘧蚊屬（ Anophele）、家蚊屬（ Culex）或斑蚊屬（ Aedes）之昆蟲細胞。昆蟲細胞之實例包括Sf9、High Five、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5或Ao38細胞。

在rAAV或rBV產生方法之各個實施例中，細胞培養物在體積為至少1 mL、至少10 mL、至少20 mL、至少50 mL、至少100 mL、至少500 mL、至少1公升（L）、至少10 L、至少50 L、至少100L、至少250 L、至少500 L、至少1000 L、至少1500 L、至少2000 L或至少2500 L之搖瓶或生物反應器中產生。在各個實施例中，細胞培養物體積為1 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 L、2 L、3 L、4 L、5 L、6L、7L、8 L、9 L、10 L、11 L、12 L、13 L、14 L、15 L、16 L、17 L、18 L、19 L、20 L、21 L、22 L、23 L、24 L、25 L、26 L、27 L、28 L、29 L、30 L、31 L、32 L、33 L、34 L、35 L、36 L、37 L、38 L、39 L、40 L、41 L、42 L、43 L、44 L、45 L、46 L、47 L、48 L、49 L、50 L、51 L、52 L、53 L、54 L、55 L、56 L、57 L、58 L、59 L、60 L、61 L、62 L、63 L、64 L、65 L、66 L、67 L、68 L、69 L、70 L、71 L、72 L、73 L、74 L、75 L、76 L、77 L、78 L、79 L、80 L、81 L、82 L、83 L、84 L、85 L、86 L、87 L、88 L、89 L、90 L、91 L、92 L、93 L、94 L、95 L、96 L、97 L、98 L、99 L、100 L、110 L、120 L、130 L、140 L、150 L、160 L、170 L、180 L、190 L、200 L、210 L、220 L、230 L、240 L、250 L、260 L、270 L、280 L、290 L、300 L、310 L、320 L、330 L、340 L、350 L、360 L、370 L、380 L、390 L、400 L、410 L、420 L、430 L、440 L、450 L、460 L、470 L、480 L、490 L、500 L、510 L、520 L、530 L、540 L、550 L、560 L、570 L、580 L、590 L、600 L、610 L、620 L、630 L、640 L、650 L、660 L、670 L、680 L、690 L、700 L、710 L、720 L、730 L、740 L、750 L、760 L、770 L、780 L、790 L、800 L、810 L、820 L、830 L、840 L、850 L、860 L、870 L、880 L、890 L、900 L、910 L、920 L、930 L、940 L、950 L、960 L、970 L、980 L、990 L、1000 L、1010 L、1020 L、1030 L、1040 L、1050 L、1060 L、1070 L、1080 L、1090 L、1100 L、1110 L、1120 L、1130 L、1140 L、1150 L、1160 L、1170 L、1180 L、1190 L、1200 L、1210 L、1220 L、1230 L、1240 L、1250 L、1260 L、1270 L、1280 L、1290 L、1300 L、1310 L、1320 L、1330 L、1340 L、1350 L、1360 L、1370 L、1380 L、1390 L、1400 L、1410 L、1420 L、1430 L、1440 L、1450 L、1460 L、1470 L、1480 L、1490 L、1500 L、1510 L、1520 L、1530 L、1540 L、1550 L、1560 L、1570 L、1580 L、1590 L、1600 L、1610 L、1620 L、1630 L、1640 L、1650 L、1660 L、1670 L、1680 L、1690 L、1700 L、1710 L、1720 L、1730 L、1740 L、1750 L、1760 L、1770 L、1780 L、1790 L、1800 L、1810 L、1820 L、1830 L、1840 L、1850 L、1860 L、1870 L、1880 L、1890 L、1900 L、1910 L、1920 L、1930 L、1940 L、1950 L、1960 L、1970 L、1980 L、1990 L、2000 L、2010 L、2020 L、2030 L、2040 L、2050 L、2060 L、2070 L、2080 L、2090 L、2100 L、2110 L、2120 L、2130 L、2140 L、2150 L、2160 L、2170 L、2180 L、2190 L、2200 L、2210 L、2220 L、2230 L、2240 L、2250 L、2260 L、2270 L、2280 L、2290 L、2300 L、2310 L、2320 L、2330 L、2340 L、2350 L、2360 L、2370 L、2380 L、2390 L、2400 L、2410 L、2420 L、2430 L、2440 L、2450 L、2460 L、2470 L、2480 L、2490 L、2500 L、2510 L、2520 L、2530 L、2540 L、2550 L、2560 L、2570 L、2580 L、2590 L、2600 L、2610 L、2620 L、2630 L、2640 L、2650 L、2660 L、2670 L、2680 L、2690 L、2700 L、2710 L、2720 L、2730 L、2740 L、2750 L、2760 L、2770 L、2780 L、2790 L、2800 L、2810 L、2820 L、2830 L、2840 L、2850 L、2860 L、2870 L、2880 L、2890 L、2900 L、2910 L、2920 L、2930 L、2940 L、2950 L、2960 L、2970 L、2980 L、2990 L或3000 L。在其他實施例中，培養物體積在以上提供之任兩個體積之間的範圍內。

在各個實施例中，完整或部分桿狀病毒基因體為環狀或線性化桿狀病毒基因體，其在與異源序列重組時能夠產生rBV。在一個實施例中，該方法利用環狀桿狀病毒基因體，因為與攜帶同源區之異源序列重組之頻率低。在另一實施例中，該方法利用線性化桿狀病毒基因體，此減少非重組桿狀病毒之產生且增加與該異源序列重組之頻率，藉此提高產生重組桿狀病毒之機率。在另一實施例中，該方法利用缺乏一種或多種必需桿狀病毒基因或其部分之線性化桿狀病毒基因體，藉此防止非重組桿狀病毒之產生。必需基因在與該異源序列重組及桿狀病毒基因體環化時補充，確保以高頻率產生重組桿狀病毒。

在各個實施例中，異源核苷酸序列或提供rAAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白且攜帶與桿狀病毒基因體同源之區域的核苷酸序列呈線性或環狀形式存在，或整合於轉移載體內。

在各個實施例中，完整或部分桿狀病毒基因體及至少一種異源核苷酸或提供rAAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白且攜帶與桿狀病毒基因體同源之區域的核苷酸序列共轉染至細胞中引起至少一種異源核苷酸或提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列同源重組至完整或部分桿狀病毒基因體中。

在各個實施例中，完整或部分桿狀病毒基因體及至少一種異源核苷酸或提供rAAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白且攜帶與桿狀病毒基因體同源之區域的核苷酸序列共轉染至細胞中引起完整或部分線性化桿狀病毒基因體及該至少一種異源核苷酸或提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列的末端同源重組，以使得形成環化重組桿狀病毒基因體。

在細胞產生方法之各個實施例中，載體包括表現控制元件，該表現控制元件可操作地連接至核苷酸以使得表現控制元件控制用於產生rAAV之元件之表現。

在細胞產生方法之各個實施例中，載體包括編碼選擇元件之核苷酸。方法包括在分離步驟之前施加對選擇元件（例如，抗生素抗性蛋白）具有特異性之選擇壓力（例如，抗生素）的步驟。可替代地，方法包括在分離步驟之前鑑別（例如，經由流式細胞測量術發射螢光波長至細胞）選擇元件（例如，螢光蛋白）之步驟。

在細胞產生方法之各個實施例中，用於產生rAAV之元件為提供AAV輔助功能之元件或提供AAV非輔助功能之元件。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基。舉例而言，當細胞膜存在時線性陽離子肽/HRP可形成α-螺旋構形。

在各個實施例中，極性胺基酸殘基包括組胺酸殘基（His或H）。極性胺基酸殘基之其他實例包括麩醯胺酸（Gln或Q）、天冬醯胺（Asn或N）、絲胺酸（Ser或S）、蘇胺酸（Thr或T）、酪胺酸（Tyr或Y）及半胱胺酸（Cys或C）。

在各個實施例中，疏水性胺基酸殘基包括丙胺酸殘基（Ala或A）或白胺酸殘基（Leu或L）。疏水性胺基酸殘基之其他實例包括甲硫胺酸（Met或M）、苯丙胺酸（Phe或F）、纈胺酸（Val或V）、脯胺酸（Pro或P）或甘胺酸（Gly或G）。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP具有含有在中性pH值（例如，pH 7.4）下帶正電荷之胺基酸殘基，諸如離胺酸或精胺酸殘基之N端或C端末端部分。例如，帶正電荷之胺基酸可位於陽離子肽/HRP之N端或C端。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP包含酪胺酸（Tyr或Y）或色胺酸（Trp或W）。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP包括至少5個胺基酸殘基、至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少19個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少21個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少30個胺基酸殘基、至少35個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少45個胺基酸殘基或至少50個胺基酸殘基。在各個實施例中，陽離子肽/HRP之長度為10個胺基酸殘基、11個胺基酸殘基、12個胺基酸殘基、13個胺基酸殘基、14個胺基酸殘基、15個胺基酸殘基、16個胺基酸殘基、17個胺基酸殘基、18個胺基酸殘基、19個胺基酸殘基、20個胺基酸殘基、21個胺基酸殘基、22個胺基酸殘基、23個胺基酸殘基、24個胺基酸殘基、25個胺基酸殘基、26個胺基酸殘基、27個胺基酸殘基、28個胺基酸殘基、29個胺基酸殘基、30個胺基酸殘基、31個胺基酸殘基、32個胺基酸殘基、33個胺基酸殘基、34個胺基酸殘基、35個胺基酸殘基、36個胺基酸殘基、37個胺基酸殘基、38個胺基酸殘基、39個胺基酸殘基、40個胺基酸殘基、41個胺基酸殘基、42個胺基酸殘基、43個胺基酸殘基、44個胺基酸殘基、45個胺基酸殘基、46個胺基酸殘基、47個胺基酸殘基、48個胺基酸殘基、49個胺基酸殘基、50個胺基酸殘基、51個胺基酸殘基、52個胺基酸殘基、53個胺基酸殘基、54個胺基酸殘基、55個胺基酸殘基、56個胺基酸殘基、57個胺基酸殘基、58個胺基酸殘基、59個胺基酸殘基、60個胺基酸殘基、61個胺基酸殘基、62個胺基酸殘基、63個胺基酸殘基、64個胺基酸殘基、65個胺基酸殘基、66個胺基酸殘基、67個胺基酸殘基、68個胺基酸殘基、69個胺基酸殘基、70個胺基酸殘基、71個胺基酸殘基、72個胺基酸殘基、73個胺基酸殘基、74個胺基酸殘基、75個胺基酸殘基、76個胺基酸殘基、77個胺基酸殘基、78個胺基酸殘基、79個胺基酸殘基、80個胺基酸殘基、81個胺基酸殘基、82個胺基酸殘基、83個胺基酸殘基、84個胺基酸殘基、85個胺基酸殘基、86個胺基酸殘基、87個胺基酸殘基、88個胺基酸殘基、89個胺基酸殘基、90個胺基酸殘基、91個胺基酸殘基、92個胺基酸殘基、93個胺基酸殘基、94個胺基酸殘基、95個胺基酸殘基、96個胺基酸殘基、97個胺基酸殘基、98個胺基酸殘基、99個胺基酸殘基或100個胺基酸殘基。在各個實施例中，陽離子肽/HRP之長度在以上提供之任兩種長度之間的範圍內。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP/轉染試劑係根據優良藥品製造規範製備。

在各個實施例中，任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑為生物可降解的。術語「生物可降解」係指材料一旦添加至細胞培養物中且暴露於細胞培養物之生理環境則可藉由化學（pH、水解、酶催化作用）及/或物理方法分解或侵蝕。此過程之動力學可耗費數分鐘至數天。

腺相關病毒

在各個實施例中，揭示藉由任何實施例之方法產生之rAAV衣殼。rAAV衣殼之VP1、VP2或VP3蛋白之濃度大於在相同條件下產生之rAAV衣殼之VP1、VP2或VP3蛋白的濃度。

在各個實施例中，揭示藉由任何實施例之方法產生之rAAV衣殼。

rAAV及rAAV衣殼包括例如US 9,504,762、WO 2018/022608、WO 2019/222136及US 2019/0376081（揭示內容以全文引用的方式併入本文中）中所揭示或可根據已知方法，例如如其中所教示製備的rAAV粒子。

「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為具有由衣殼囊封之基因體的單股DNA細小病毒。當前存在十三種已表徵之AAV血清型。AAV之總體資訊及評論可見於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁；及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press,（New York）。然而，完全預期此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為熟知各種血清型在結構上及功能上相當緊密相關，甚至在基因層面上亦如此。（參見例如Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease第165-174頁, J. R. Pattison編輯；及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61（1974））。舉例而言，所有AAV血清型明顯展現由同源rep基因介導之極類似複製特性；且全部攜有三種相關衣殼蛋白。相關性程度藉由以下進一步表明：沿基因體長度在血清型之間展現廣泛交叉雜交之異雙螺旋分析；及對應於反向末端重複序列（ITR）之末端處之類似自黏合區段的存在。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調控控制。

如本文所用，「AAV病毒粒子」係指由至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化AAV基因體構成之感染性病毒粒子。「重組AAV」或「rAAV」、「rAAV病毒體」或「rAAV病毒粒子」或「rAAV載體粒子」或「AAV病毒」係指由至少一種衣殼或Cap蛋白及如本文所述之衣殼化rAAV載體基因體（vg）構成的病毒粒子。若粒子包含異源聚核苷酸（亦即除野生型AAV基因體以外之聚核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因），則其通常稱為「rAAV載體粒子」或簡稱為「rAAV載體」。因此，AAV載體粒子之產生必定包括rAAV載體之產生，因此此類載體含於rAAV載體粒子內。

如本文所用，術語「異源基因」、「異源序列」、「異源」、「異源調控序列」、「異源轉殖基因」或「轉殖基因」意謂所提及之基因或調控序列非AAV載體或粒子中天然存在的且已人工引入其中。例如，此等術語係指包含異源基因及控制宿主細胞中基因之表現之異源調控序列兩者的核酸，該異源調控序列可操作地連接於異源基因。經考慮本文中之轉殖基因可編碼生物分子（例如，治療性生物分子），諸如蛋白質（例如，酶）、多肽、肽、RNA（例如，tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化RNA、siRNA、miRNA、前miRNA、lncRNA、snoRNA、小髮夾RNA、反式剪接RNA及反義RNA）、基因或鹼基編輯系統（例如CRISPR基因編輯系統）之一種或多種組分、反義寡核苷酸（AON）、反義寡核苷酸（AON）介導之外顯子跳躍、觸發無義介導之衰變（NMD）之毒性外顯子或顯性負性突變體。

術語「重組」係指藉由重組DNA技術使用形成之核酸分子或蛋白質。例如，重組核酸分子可藉由組合核酸序列及序列元件而形成。重組蛋白可為藉由已接受重組核酸分子之細胞產生之蛋白質。

術語「編碼（encodes）」、「編碼（encoded）」及「編碼（encoding）」係指諸如基因、互補DNA（cDNA）或訊息RNA（mRNA）之核酸分子中核苷酸之特定序列用作生物過程中合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性。因此，若藉由基因產生之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。

「衣殼」係指封裝rAAV載體基因體之結構。衣殼包括VP1蛋白或VP3蛋白，但更通常，VP1、VP2及VP3蛋白全部三種，如天然AAV中所發現。衣殼蛋白之序列決定rAAV病毒粒子之血清型。rAAV病毒粒子包括來源於多種AAV血清型之彼等rAAV病毒粒子，該等血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-rh.10（AAVrh10）、AAV-DJ（AAVDJ）、AAV-DJ8（AAVDJ8）、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV- LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-前miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV（ttAAV）、UPENN AAV10或日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_蝙蝠_YNM、AAV_蝙蝠_巴西、AAV_mo.1、AAV_禽類_DA-1或AAV_小鼠_NY1、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65或其任何變異體（參見例如美國專利第8,318,480號關於非天然混合血清型之揭示內容）。示例性衣殼亦提供於國際申請公開案第WO 2018/022608號及第WO 2019/222136號中，該等申請公開案全文併入本文中。衣殼蛋白亦可為天然VP1、VP2及VP3之變異體，包括突變、嵌合或改組蛋白。衣殼蛋白可為rh.10或AAV多種進化枝內之其他亞型的衣殼蛋白；多種進化枝及亞型揭示於例如美國專利第7,906,111號中。在各個實施例中，AAV病毒粒子之衣殼具有胺基酸序列與來自AAV-1（Genbank寄存編號AAD27757.1）、AAV-2（NCBI參考序列號YP_680426.1）、AAV-3（NCBI參考序列號NP_043941.1）、AAV-3B（Genbank寄存編號AAB95452.1）、AAV-4（NCBI參考序列號NP_044927.1）、AAV-5（NCBI參考序列號YP_068409.1）、AAV-6（Genbank寄存編號AAB95450.1）、AAV-7（NCBI參考序列號YP_077178.1）、AAV-8（NCBI參考序列號YP_077179.1）、AAV-9（Genbank寄存編號AAS99264.1）、AAV-10（Genbank寄存編號AAT46337.1）、AAV-11（Genbank寄存編號AAT46339.1）、AAV-12（Genbank寄存編號ABI16639.1）、AAV-13（Genbank寄存編號ABZ10812.1）之胺基酸序列之一部分或WO 2018/022608及WO 2019/222136中揭示之任何胺基酸序列至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VP1、VP2或VP3蛋白。不同血清型AAV蛋白之構築及使用論述於以下中：Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000；Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000；Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998；Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000；Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001。

在一個實施例中，rAAV粒子經AAV衣殼假模式化，其中該VP1蛋白包含SEQ ID NO:2-76中之任一者之胺基酸序列；或包含在SEQ ID NO:2-76中之任一者之全長上至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列。

AAV病毒粒子可為「假模式化」或「雜交」AAV病毒粒子。術語「雜交」及「假模式化」在關於AAV病毒粒子時在本文中可互換地使用且意欲指示Rep蛋白、反向末端重複序列（ITR）及/或衣殼蛋白具有不同血清型。已自例如人類、狒狒、豬、狨、黑猩猩及恆河猴、短尾猴及/或食蟹獼猴鑑別大量替代衣殼變異體，例如以下所揭示：美國專利第9,737,618號；及Gao, G.等人, Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues, J. Virol., 78（12）:6381-8（2004），各者以全文引用的方式併入本文中。假模式化AAV病毒粒子之產生揭示於例如WO 2018/022608及WO 2001/83692中，各者以全文引用的方式併入本文中。亦考慮其他類型AAV病毒粒子變異體，例如具有衣殼突變之AAV病毒粒子。參見例如Marsic等人, Molecular Therapy, 22（11）: 1900-1909（2014），其以全文引用的方式併入本文中。例如（不限於），ITR及/或Rep蛋白可具有，例如衣殼蛋白來源於在哺乳動物中發現之AAV之序列，諸如本文中所揭示且稱為以下之衣殼序列：Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34或Bfm35或其變異體。

如本文所用，「AAV載體基因體」、「載體基因體」或「rAAV載體基因體」係指單股核酸。rAAV病毒粒子具有在衣殼內衣殼化之rAAV載體基因體。rAAV載體基因體具有側接蛋白質編碼序列（較佳功能性治療性蛋白質編碼序列；例如FVIII、FIX及PAH）之AAV 5'反向末端重複（ITR）序列及AAV 3' ITR，該蛋白質編碼序列可操作地連接於相對於AAV病毒基因體異源之轉錄調控元件，例如一種或多種啟動子及/或強化子，及視情況多腺苷酸化序列及/或一種或多種插入調控元件中或調控元件與蛋白質編碼序列之間或蛋白質編碼序列之外顯子之間的內含子。rAAV載體基因體係指rAAV病毒粒子中存在之核酸，且可為本文所揭示之核酸序列之有義股或反義股。此類單股核酸之尺寸以鹼基提供。如本文所用之術語「反向末端重複序列」及「ITR」係指順式充當病毒DNA複製起點及病毒基因體之封裝訊號的在rAAV基因體之5'及3'端處發現之技術公認的區域。AAV ITR連同Rep蛋白一起提供自插入兩個側接ITR之間的核苷酸序列自宿主細胞基因體之有效切除及救援以及核苷酸序列整合至宿主細胞基因體中。Yan等人, J. Virol. 79（1）:364-379 （2005）揭示某些AAV相關ITR之序列。亦發現ITR呈「翻轉」或「觸發」組態，其中AA'反向重複序列（形成髮夾之臂）之間的序列存在於反向補體中（Wilmott, Patrick等人, Human gene therapy methods30.6 （2019）: 206-213）。不同血清型AAV載體基因體之構築及使用論述於以下中：Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000；Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000；Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998；Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000；Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001。由於廣泛的構築體可利用性及廣泛表徵，以下揭示之例示性AAV載體基因體來源於血清型2。

術語「治療有效之AAV」、「治療有效之AAV粒子」、「治療性AAV」、「治療有效之rAAV」、「治療有效之rAAV粒子」、「治療性rAAV」及「治療有效之rAAV」係指能夠感染細胞以使得感染細胞表現（例如，藉由轉錄及/或藉由轉譯）所關注之元件（例如，核苷酸序列、蛋白質等）的重組AAV。在此程度上，治療有效之rAAV粒子可包括含有具有不同特性之衣殼或載體基因體（vgs）之AAV粒子。例如，治療有效之rAAV粒子可含有具有不同轉譯後修飾之衣殼。在其他實例中，治療有效之AAV粒子可含有具有不同尺寸/長度、正或負股序列、不同翻轉/觸發ITR組態翻轉/觸發、觸發/翻轉、翻轉/翻轉、觸發/觸發等）、不同數目ITR（1、2、3等）或截短的vg。舉例而言，重疊同源重組發生於具有5'端截短與3'端截短之核酸之間的rAAV感染細胞中以便產生編碼大型蛋白之「完整」核酸，藉此重構功能性全長基因。在其他實例中，具有5'端截短及3'端截短之互補核酸序列彼此相互作用以便在第二股合成期間形成「完整」核酸。「完整」核酸編碼大型蛋白，藉此重構功能性全長基因。治療有效之rAAV粒子亦稱為重衣殼、完整衣殼或部分完整衣殼。

術語「轉導（transduction）」及「轉導（transduce）」係指遺傳物質（例如，載體基因體）自rAAV輸送至接受細胞中且在接受細胞中轉殖基因自rAAV遺傳物質表現。遺傳物質之輸送經由感染接受細胞之rAAV粒子介導。為此，術語「效力」係指經rAAV粒子感染之接受細胞中轉殖基因之表現量。因此，具有更大效力之rAAV強調經rAAV感染之接受細胞具有更大轉殖基因表現。

術語「治療有效量」意謂治療劑在向罹患或易患疾病、病症或病狀之個體投予時足以治療、診斷、預防該疾病、病症或病狀及/或延遲其症狀發作的量。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，通常經由包含至少一個單位劑量之給藥方案投予治療有效量。術語「治療有效」係指治療劑之任何元件或組合物起足夠作用，使得治療有效量之治療劑在向罹患或易患疾病、病症及/或病狀之個體投予時足以治療、診斷、預防該疾病、病症及/或病狀及/或延遲其症狀發作。舉例而言，如先前所述，治療有效rAAV能夠感染細胞，使得受感染細胞表現（例如藉由轉錄及/或藉由轉譯）所關注之元件（例如核苷酸序列、蛋白質等）。治療有效rAAV具有一載體基因體，經治療有效rAAV感染之細胞使用該載體基因體產生治療有效之核苷酸序列，受感染細胞使用該核苷酸序列藉由諸如複製、轉錄或轉譯之各種方法產生所關注之元件（例如，核苷酸序列、蛋白質等）。亦應注意，「治療劑」包括治療有效之rAAV或治療性rAAV病毒。

作為一實例，「治療性rAAV病毒」係指包含編碼治療性蛋白質之異源聚核苷酸的rAAV病毒體、rAAV病毒粒子、rAAV載體粒子或rAAV病毒，可用於在活體內替代或補充蛋白質。「治療性蛋白質」為一種具有替代或補償對應內源性蛋白質之活性損失或降低之生物活性的多肽。舉例而言，功能性苯丙胺酸羥化酶（PAH）為苯酮尿症（PKU）之治療性蛋白質。因此，舉例而言，重組rAAV PAH病毒可用於治療罹患PKU之個體之藥劑。藥劑可藉由靜脈內（IV）投予來投予且藥劑之投予引起PAH蛋白質在個體血流中表現，足以改變個體中之神經傳遞素代謝物或神經傳遞素含量。視情況，藥劑亦可包含用於預防及/或治療與投予rAAV PAH病毒相關之任何肝毒性的防治性及/或治療性皮質類固醇。包含防治性或治療性皮質類固醇治療之藥劑可包含每天至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60毫克或更多的皮質類固醇。包含防治性或治療性皮質類固醇之藥劑可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更多週之連續時段投予。PKU療法可視情況亦包括酪胺酸補充劑。

併入至AAV衣殼中之轉殖基因不受限制且可為所關注之治療劑之任何異源基因。轉殖基因係側接該轉殖基因之載體序列的異源核酸序列，其編碼所關注之多肽、蛋白質或其他產物。核酸編碼序列以允許轉殖基因在宿主細胞中轉錄、轉譯及/或表現之方式可操作地連接於調控組件。

轉殖基因序列之組成將視所得載體之用途而定。舉例而言，一種類型之轉殖基因序列包括報導序列，其在表現時產生可偵測訊號。這類報導序列包括但不限於編碼以下之DNA序列：b-內醯胺酶、b-半乳糖苷酶（LacZ）、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、螢光素酶、膜結合蛋白（包括例如CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白及所屬領域中熟知之其他存在或可藉由習知方法產生針對其之高親和力抗體的蛋白質）及融合蛋白，包含與尤其來自血球凝集素或Myc之抗原標籤域適當融合的膜結合蛋白。

此等編碼序列在與驅動其表現之調控元件相關時，提供可藉由習知方法偵測之訊號，習知方法包括酶促、放射性、比色、螢光或其他光譜分析、螢光活化細胞分選分析及免疫分析，包括酶聯免疫吸附分析（ELISA）、放射免疫分析（RIA）及免疫組織化學。舉例而言，在標記序列為LacZ基因之情況下，藉由針對β-半乳糖苷酶活性之分析來偵測攜帶訊號之載體的存在。在轉殖基因為綠色螢光蛋白或螢光素酶之情況下，攜帶訊號之載體可藉由光度計中之顏色或光產生而目視量測。

然而，轉殖基因通常為編碼可用於生物學及醫學中之產物，諸如蛋白質、肽、RNA、酶、顯性負性突變體或催化性RNA的非標記序列。所期望的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化性RNA、siRNA、小髮夾RNA、反式剪接RNA及反義RNA。適用之RNA序列之一個實例為抑制或消除目標核酸序列在經處理動物中之表現的序列。通常，適合之目標序列包括致癌目標及病毒性疾病。對於此類目標之實例，參見下文在與免疫原相關之部分中鑑定的致癌目標及病毒。

轉殖基因可用於校正或改善基因缺陷，該等基因缺陷可包括正常基因之表現量低於正常表現量之缺陷或功能基因產物未表現之缺陷。較佳類型之轉殖基因序列編碼在宿主細胞中表現之治療性蛋白質或多肽。載體可進一步包括使用多個轉殖基因，例如以校正或改善由多次單元蛋白質引起之基因缺陷。在某些情況下，不同的轉殖基因可用於編碼蛋白質之各次單元，或用於編碼不同的肽或蛋白質。此係編碼蛋白質次單元之DNA的尺寸很大時，例如對於免疫球蛋白、血小板衍生生長因子或肌肉萎縮蛋白所期望的。為使細胞產生多次單元蛋白質，用含有不同次單元中之每一者的重組病毒感染細胞。替代地，可由相同的轉殖基因編碼蛋白質之不同次單元。在此情況下，單個轉殖基因包括編碼次單元中之每一者的DNA，各次單元之DNA由內部核糖核酸酶進入位點（IRES）隔開。此係編碼次單元中之每一者之DNA的尺寸很小，例如，編碼次單元之DNA及IRES的總尺寸小於五千鹼基（Kb）時所期望的。亦應注意，由於目標細胞中部分基因體重組，故較長基因體（亦即，＞ 5（Kb））有可能。作為IRES之替代方案，DNA可由編碼2A肽之序列隔開，肽在轉譯後事件中自裂解。參見例如Donnelly等人, J. Gen. Virol., 78（Pt 1）: 13-21（1997年1月）；Furler,等人, Gene Ther., 8（1 1）:864-873（2001年6月）；Klump等人, Gene Ther., 8（lO）:8 11-817（2001年5月）。此2A肽顯著地小於IRES，此使其非常適合在空間為限制因素時使用。通常，當轉殖基因較大，由多個次單元組成，或兩個轉殖基因共同遞送時，共同投予攜帶所要轉殖基因或次單元之rAAV以允許其在活體內多連體化（concatamerize）從而形成單一載體基因體。在此類實施例中，第一AAV可攜帶表現單一轉殖基因之表現卡匣且第二AAV可攜帶表現不同轉殖基因以在宿主細胞中共表現之表現卡匣。然而，所選擇之轉殖基因可編碼任何生物活性產物或其他產物，例如研究所需之產物。

適合之轉殖基因可藉由所屬技術領域中具有通常知識者容易地選擇。不認為轉殖基因之選擇係對本發明之限制。轉殖基因可為異源蛋白質，且此異源蛋白質可為治療性蛋白質。示例性治療性蛋白質包括但不限於血液因子，諸如b-球蛋白、血紅蛋白、組織纖維蛋白溶酶原活化劑及凝血因子；群落刺激因子（CSF）；介白素，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生長因子，諸如角質細胞生長因子（KGF）、幹細胞因子（SCF）、纖維母細胞生長因子（FGF，諸如鹼性FGF及酸性FGF）、肝細胞生長因子（HGF）、類胰島素生長因子（IGF）、骨成形性蛋白質（BMP）、表皮生長因子（EGF）、生長分化因子-9（GDF-9）、肝瘤衍生生長因子（HDGF）、肌肉抑制素（GDF-8）、神經生長因子（NGF）、神經滋養素、血小板衍生生長因子（PDGF）、血小板生成素（TPO）、轉型生長因子α（TGF-a.）、轉型生長因子β（TGF-b）及其類似物；可溶性受體，諸如可溶性TNF-a.受體、可溶性VEGF受體、可溶性介白素受體（例如，可溶性IL-1受體及可溶性II型IL-1受體）、可溶性g/d T細胞受體、可溶性受體之配位體結合片段及其類似物；酶，諸如a-葡萄糖苷酶、伊米苷酶、b-葡萄糖腦苷酶及阿糖腦苷酶；酶活化劑，諸如組織纖維蛋白溶酶原活化劑；趨化介素，諸如1P-10、由干擾素-γ誘導之單核球激素（Mig）、Groa/IL-8、RANTES、MIP-1a、MIP-1b、MCP-1、PF-4及其類似物；血管生成劑，諸如血管內皮生長因子（VEGF，例如VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2）、神經膠質瘤衍生生長因子、血管生成素、血管生成素-2及其類似物；抗血管生成劑，諸如可溶性VEGF受體；蛋白質疫苗；神經活性肽，諸如神經生長因子（NGF）、緩激肽、膽囊收縮素、胃泌素、胰泌素、催產素、促性腺激素釋放激素、β-腦內啡、腦啡肽、P物質、生長抑素、催乳素、甘丙胺素、生長激素釋放激素、鈴蟾素、強啡肽、華法林、神經調壓素、腸動素、促甲狀腺素、神經肽Y、黃體成長激素、降血鈣素、胰島素、升糖素、血管加壓素、血管收縮素II、促甲狀腺素釋放激素、血管活性腸肽、睡眠肽及其類似物；血栓溶解劑；心房利鈉肽；鬆弛素；膠質原纖維酸性蛋白；激濾泡素（FSH）；人類α-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子（LIF）；組織因子、黃體成長激素；巨噬細胞活化因子；腫瘤壞死因子（TNF）；嗜中性白血球趨化因子（NCF）；金屬蛋白酶之組織抑制劑；血管活性腸肽；血管生成素；促血管素；纖維蛋白；水蛭素；IF-1受體拮抗劑；及其類似物。所關注之蛋白質之一些其他非限制性實例包括睫狀神經滋養因子（CNTF）；大腦衍生神經滋養因子（BDNF）；神經滋養素3及4/5（NT-3及4/5）；神經膠細胞衍生神經滋養因子（GDNF）；芳族胺基酸去羧酶（AADC）；血友病相關之凝血蛋白，諸如因子VIII、因子IX、因子X；遺傳性血管水腫相關之蛋白質，諸如C1-抑制因子；肌肉萎縮蛋白、微型肌肉萎縮蛋白或微小肌肉萎縮蛋白；溶酶體酸性脂肪酶；苯丙胺酸羥化酶（PAH）；肝醣貯積病相關酶，諸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麥芽糖酶、糖原去分支酶、肌醣原磷酸化酶、肝醣原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶（例如，PHKA2）、葡萄糖轉運蛋白（例如，GLUT2）、醛縮酶A、b-烯醇酶及糖原合成酶；溶酶體酶（例如，β-N-乙醯基己糖胺酶A）；及其任何變異體。其他轉殖基因包括編碼心肌肌凝蛋白結合蛋白C、β-肌凝蛋白重鏈、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌凝蛋白心室必需輕鏈1、肌凝蛋白心室調控輕鏈2、心臟α肌動蛋白（ACTC）、α-肌旋蛋白、肌聯蛋白、四加半LIM蛋白1之轉殖基因，及美國專利號國際申請公開案第WO 2014/170470號中所揭示之其他轉殖基因。AAV載體亦包括習知控制元件或序列，其以允許轉殖基因在用質體載體轉染或經病毒感染之細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式可操作地連接於轉殖基因。如本文所用，「可操作地連接」之序列包括與所關注基因相鄰（GOI）之表現控制序列及以反式作用或以一定距離作用以控制所關注基因之表現控制序列二者。合適基因包括以下中論述之彼等基因：Anguela等人 「Entering the Modern Era of Gene Therapy」 ,Annual Rev. of Med. 第70卷, 第272-288頁（2019）及Dunbar等人, 「Gene Comes of Age」, Science, 第359卷, 第6372期, eaan4672（2018）。

表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工訊號，諸如剪接及聚腺苷酸化（polyA）訊號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列（例如，克紮克共有序列（Kozak consensus sequence））；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強編碼產物分泌之序列。所屬領域中已知且可採用大量表現控制序列，包括原生、組成性、誘導性及/或組織特異性之啟動子。

組成性啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus；RSV）LTR啟動子（視情況具有RSV強化子）、細胞巨大病毒（CMV）啟動子（視情況具有CMV強化子）（參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530（1985））、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶（PGK）啟動子及EF1啟動子[Invitrogen]。誘導性啟動子允許基因表現之調控且可藉由以下來調控：外源提供之化合物；環境因素，諸如溫度；或特定生理狀態（例如急性期，細胞之特定分化狀態）之存在，或僅存在於複製細胞中。誘導性啟動子及誘導性系統購自多種商業來源，包括但不限於Invitrogen、Clontech及Ariad。已描述許多其他系統且所屬技術領域中具有通常知識者可容易地進行選擇。藉由外源提供之化合物調控之誘導性啟動子的實例包括鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白（MT）啟動子、地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導性小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）啟動子、T7聚合酶啟動子系統[WO 98/10088]；蛻皮激素昆蟲啟動子[No等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:3346-3351（1996）]、四環素可抑制型系統[Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89:5547-5551（1992）]、四環素誘導性系統[Gossen等人, Science, 268:1766-1769（1995）, 亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518（1998）]、RU486誘導性系統[Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243（1997）及Wang等人, Gene Ther., 4:432-441（1997）]及雷帕黴素（rapamycin）誘導性系統[Magari等人, J. Clin. Invest., 100:2865-2872（1997）]。可適用於此背景下之其他類型的誘導性啟動子為藉由特定生理狀態（例如溫度、急性期、細胞之特定分化狀態或僅存在於複製細胞中）調控之彼等啟動子。

視情況，可使用轉殖基因之天然啟動子。當期望轉殖基因之表現模擬天然表現時，天然啟動子可為較佳。當較佳在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或響應於特定轉錄刺激來調控轉殖基因之表現時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或克紮克共有序列，亦可用於模擬天然表現。

轉殖基因亦可包括可操作地連接於組織特異性啟動子之基因。舉例而言，若骨骼肌中之表現為所期望的，則應使用在肌肉中有活性之啟動子。此等啟動子包括來自編碼骨骼b-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌縮蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，以及具有高於天然存在之啟動子之活性的合成肌肉啟動子（參見Li等人, Nat. Biotech., 17:241-245（1999））。已知針對以下之組織特異性啟動子的實例：肝臟（白蛋白，Miyatake等人, J. Virol., 71:5124-32（1997）；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther., 3:1002-9（1996）；α-胎蛋白（AFP），Arbuthnot等人, Hum. Gene Ther., 7:1503-14（1996））；骨骼骨鈣化素（Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96（1997））；骨骼唾液蛋白（Chen等人, J. Bone Miner. Res., 11:654-64（1996））；淋巴球（CD2，Hansal等人, J. Immunol., 161:1063-8（1998）；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈）；神經元，諸如神經元特異性烯醇酶（NSE）啟動子（Andersen等人, Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15（1993））、神經絲輕鏈基因（Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 88:5611-5（1991））及神經元特異性vgf基因（Piccioli等人, Neuron, 15:373-84（1995））以及其他。

重組AAV可用於在活體外，例如在細胞培養物中產生所關注之蛋白質。例如，可在用於產生所關注之蛋白質之方法中使用AAV，其中該方法包括提供重組AAV，該重組AAV包含編碼異源蛋白質之核苷酸序列；及在細胞培養物中使重組AAV與細胞接觸，其中重組AAV在細胞中表現所關注之蛋白。編碼所關注之蛋白質之核苷酸序列的尺寸可變化。例如，核苷酸序列可為至少約0.1千鹼基kb）、至少約0.2 kb、至少約0.3 kb、至少約0.4 kb、至少約0.5 kb、至少約0.6 kb、至少約0.7 kb、至少約0.8 kb、至少約0.9 kb、至少約1 kb、至少約1.1 kb、至少約1.2 kb、至少約1.3 kb、至少約1.4 kb、至少約1.5 kb、至少約1.6 kb、至少約1.7 kb、至少約1.8 kb、至少約2.0 kb、至少約2.2 kb、至少約2.4 kb、至少約2.6 kb、至少約2.8 kb、至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb長、至少約4.0 kb長、至少約5.0 kb長、至少約6.0 kb長、至少約7.0 kb長、至少約8.0 kb長、至少約9.0 kb長或至少約10.0 kb長。在一些實施例中，核苷酸長度為至少約1.4 kb。

重組AAV亦可用於在活體內，例如在諸如哺乳動物之動物中產生所關注之蛋白質。一些實施例提供一種用於在活體內產生所關注之蛋白質的方法，其中該方法包括：提供重組AAV，該重組AAV包含編碼所關注之蛋白質之核苷酸序列；及向個體投予重組AAV，其中重組AAV在個體中表現所關注之蛋白質。在一些實施例中，個體可為非人類哺乳動物，例如猴、狗、貓、小鼠或牛。編碼所關注之蛋白質之核苷酸序列的尺寸可變化。例如，核苷酸序列可為至少約0.1 kb、至少約0.2 kb、至少約0.3 kb、至少約0.4 kb、至少約0.5 kb、至少約0.6 kb、至少約0.7 kb、至少約0.8 kb、至少約0.9 kb、至少約1 kb、至少約1.1 kb、至少約1.2 kb、至少約1.3 kb、至少約1.4 kb、至少約1.5 kb、至少約1.6 kb、至少約1.7 kb、至少約1.8 kb、至少約2.0 kb、至少約2.2 kb、至少約2.4 kb、至少約2.6 kb、至少約2.8 kb、至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb長、至少約4.0 kb長、至少約5.0 kb長、至少約6.0 kb長、至少約7.0 kb長、至少約8.0 kb長、至少約9.0 kb長或至少約10.0 kb長。在一些實施例中，核苷酸長度為至少約1.4 kb。

尤其關注重組AAV表現一種或多種治療性蛋白質以治療多種疾病或病症之用途。疾病之非限制性實例包括癌症，諸如癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤；及自體免疫性疾病，諸如多發性硬化症。癌瘤之非限制性實例包括食道癌；肝細胞癌；基底細胞癌、鱗狀細胞癌（多種組織）；膀胱癌，包括移形細胞癌；支氣管癌；結腸癌；大腸直腸癌；胃癌；肺癌，包括肺之小細胞癌及非小細胞癌；腎上腺皮質癌；甲狀腺癌；胰臟癌；乳癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳頭狀癌；乳頭狀腺癌；囊腺癌；髓性癌；腎細胞癌；乳管原位癌或膽管癌瘤；絨毛膜癌；精原細胞瘤；胚胎性癌；威爾姆氏腫瘤（Wilm's tumor）；子宮頸癌；子宮癌；睪丸癌；成骨性癌；上皮癌；及鼻咽癌。肉瘤之非限制性實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤（Ewing's sarcoma）、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。實體腫瘤之非限制性實例包括神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡突神經膠質瘤、血管瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。白血病之非限制性實例包括慢性骨髓增生性症候群；急性骨髓性白血病；慢性淋巴球性白血病，包括B細胞CLL、T細胞CLL、前淋巴球性白血病及毛細胞白血病；及急性淋巴母細胞性白血病。淋巴瘤之實例包括但不限於B細胞淋巴瘤，諸如伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）；霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）；及類似淋巴瘤。

可使用本文所揭示之rAAV及方法治療之疾病的其他非限制性實例包括遺傳病症，包括鐮狀細胞貧血、囊腫性纖維化、溶酶體酸脂肪酶（LAL）缺乏症1、泰-薩克斯病（Tay-Sachs disease）、苯酮尿症、黏多醣貯積症、肝醣貯積病（GSD，例如GSD I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII及XIV型）、半乳糖血症、肌肉萎縮症（例如，杜興氏肌肉失養症（Duchenne muscular dystrophy））、心肌病（例如，肥厚性心肌症、擴張型心肌症、致心律失常性右室心肌病等）及血友病（諸如A型血友病（經典血友病）及B型血友病（克氏病（Christmas Disease）））、威爾森氏病（Wilson's disease）、法布立病（Fabry Disease）、高歇氏病（Gaucher Disease）遺傳性血管水腫（HAE）及α1抗胰蛋白酶不足。另外，本文所揭示之rAAV及方法可用於治療其他病症，其可藉由轉殖基因在肝臟中之局部表現或藉由自肝臟或肝細胞之分泌性蛋白質之表現來治療。

在個體（例如，個體之血清）中表現之異源蛋白質之量可變化。例如，在一些實施例中，蛋白質在個體血清中之表現量可為至少約9毫克（mg）/mL、至少約10 mg/mL、至少約11 mg/mL、至少約12 mg/mL、至少約13 mg/mL、至少約14 mg/mL、至少約15 mg/mL、至少約16 mg/mL、至少約17 mg/mL、至少約18 mg/mL、至少約19 mg/mL、至少約20 mg/mL、至少約21 mg/mL、至少約22 mg/mL、至少約23 mg/mL、至少約24 mg/mL、至少約25 mg/mL、至少約26 mg/mL、至少約27 mg/mL、至少約28 mg/mL、至少約29 mg/mL、至少約30 mg/mL、至少約31 mg/mL、至少約32 mg/mL、至少約33 mg/mL、至少約34 mg/mL、至少約35 mg/mL、至少約36 mg/mL、至少約37 mg/mL、至少約38 mg/mL、至少約39 mg/mL、至少約40 mg/mL、至少約41 mg/mL、至少約42 mg/mL、至少約43 mg/mL、至少約44 mg/mL、至少約45 mg/mL、至少約46 mg/mL、至少約47 mg/mL、至少約48 mg/mL、至少約49 mg/mL或至少約50 mg/mL。所關注之蛋白質在個體血清中之表現量可為約9 pg/mL、約10 pg/mL、約50 pg/mL、約100 pg/mL、約200 pg/mL、約300 pg/mL、約400 pg/mL、約500 pg/mL、約600 pg/mL、約700 pg/mL、約800 pg/mL、約900 pg/mL、約1000 pg/mL、約1500 pg/mL、約2000 pg/mL、約2500 pg/mL或此等值中之任兩者之間的範圍。熟練技術人員將理解，治療功效所需之所關注之蛋白質的表現量可視非限制性因素而變化，諸如特定的所關注之蛋白質及接受治療之個體，且蛋白質之有效量可容易由熟練技術人員使用所屬領域中已知之習知方法確定而無需過多的實驗。

在其他實施例中，本發明係針對本發明之AAV病毒粒子之醫藥調配物，其可用於投予至個體。

在一個實施例中，本發明之醫藥調配物為包含本文所揭示之AAV病毒粒子的液體調配物，其中該調配物中之AAV病毒粒子之濃度可廣泛變化。AAV病毒粒子及組合物可呈單位劑型調配以易於投予且達成劑量均一性。如本文所用，「單位劑型」係指適合作為單位劑量用於待治療之個體的實體離散單元；各單元含有經計算以產生所要治療作用之預定量之活性化合物，與所需醫藥載劑結合。單位劑型視產生所要作用所需要之AAV病毒粒子之量而定。所需量可以單次劑量調配或可以多個劑量單元調配。劑量可調節至適合AAV病毒粒子濃度，視情況與一種或多種其他藥劑組合且經封裝以供使用。

在另一實施例中，醫藥組合物將包括足以提供預防或治療有效量，亦即足以預防、減少或改善所討論之疾病病況之症狀之量或足以賦予所要益處之量的遺傳物質。

在其他實施例中，含有本發明之醫藥調配物的AAV病毒粒子包含一種或多種醫藥學上可接受之賦形劑以提供具有有利於儲存及/或投予至個體之性質的調配物。在某些實施例中，本發明之醫藥調配物能夠儲存於＜65℃下達至少2週、較佳至少4週、更佳至少6週且更佳至少約8週之時段，穩定性未發生可偵測之變化。就此而言，術語「穩定」意謂存在於調配物中之AAV病毒粒子在儲存期間基本上保持其物理穩定性、化學穩定性及/或生物活性。在本發明之其他實施例中，存在於醫藥調配物中之AAV病毒粒子在-65℃下儲存確定時間段期間保留其在個體中之生物活性的至少約80%，更佳其在個體中之生物活性的至少約85%、90%、95%、98%或99%。

在一些實施例中，磷酸氫二鈉之濃度為約0.1 mg/ml至約3 mg/ml、約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、約1 mg/ml至約2 mg/ml或約1.4 mg/ml至約1.6 mg/ml。在一尤其較佳實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物包含約1.42 mg/ml磷酸氫二鈉（乾燥）。

在其他實施例中，可用於本發明之AAV病毒粒子調配物中之另一緩衝劑為磷酸二氫鈉單水合物，在一些實施例中，其以約0.1 mg/ml至約3 mg/ml、約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、約1 mg/ml至約2 mg/ml或約1.3 mg/ml至約1.5 mg/ml之濃度使用。在一個實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物包含約1.38 mg/ml之磷酸二氫鈉單水合物。在另一實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物包含約1.42 mg/ml之磷酸氫二鈉及約1.38 mg/ml之磷酸二氫鈉單水合物。

在一個實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物可包含一種或多種等張劑，諸如氯化鈉，較佳濃度為約1 mg/ml至約20 mg/ml，例如約1 mg/ml至約10 mg/ml、約5 mg/ml至約15 mg/ml或約8 mg/ml至約20 mg/ml。在另一實施例中，本發明之調配物包含約8.18 mg/ml氯化鈉。所屬領域中已知之其他緩衝劑及等張劑為適合的，且可常規地適用於本揭示案之調配物中。

在另一實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物可包含一種或多種增積劑。例示性增積劑包括但不限於甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮（PVP K24）。在某些較佳實施例中，本發明之調配物包含甘露糖醇，其可以約5 mg/ml至約40 mg/ml，或約10 mg/ml至約30 mg/ml，或約15 mg/ml至約25 mg/ml之量存在。在一尤其較佳實施例中，甘露糖醇以約20 mg/ml之濃度存在。

在一些實施例中，本發明之AAV病毒粒子調配物可包含一種或多種界面活性劑，其可為非離子界面活性劑。

示例性界面活性劑包括但不限於離子界面活性劑、非離子界面活性劑及其組合。舉例而言，界面活性劑可為但不限於TWEEN 80（亦稱為聚山梨醇酯80，或其化學名稱為聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯）、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、月桂基硫酸銨、TRITON AG 98（Rhone-Poulenc）、泊洛沙姆（poloxamer）407、泊洛沙姆188及其類似物以及其組合。

在一些實施例中，本發明之調配物包含泊洛沙姆188，其可以約0.1 mg/ml至約4 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約3 mg/ml、約1 mg/ml至約3 mg/ml、約1.5 mg/ml至約2.5 mg/ml或約1.8 mg/ml至約2.2 mg/ml之濃度存在。在一尤其較佳實施例中，泊洛沙姆188以約2.0 mg/ml之濃度存在。

在其他實施例中，本發明之醫藥調配物包含在包含以下之液體溶液中調配之AAV病毒粒子：約1.42 mg/ml磷酸氫二鈉、約1.38 mg/ml磷酸二氫鈉單水合物、約8.18 mg/ml氯化鈉、約20 mg/ml甘露糖醇及約2 mg/ml泊洛沙姆188。

在一些實施例中，本揭示案之含AAV病毒粒子之調配物係穩定的且可在品質、效力或純度未發生不可接受之變化的情況下長時段儲存。

在一個實施例中，調配物在約5℃（例如，2℃至8℃）之溫度下穩定至少1個月、例如至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。

在另一實施例中，調配物在低於或等於約-20℃之溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。

在一些實施例中，調配物在低於或等於約-40℃之溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。

在其他實施例中，調配物在低於或等於約-60℃之溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。

在一個實施例中，本發明提供本發明之AAV病毒粒子用於有效轉導所關注之細胞、組織及/或器官及/或用於基因療法的用途。

在一個實施例中，本發明提供一種用於轉導所關注之細胞、組織及/或器官之方法，其包含將包含有效量之本發明之AAV病毒粒子的組合物引入至細胞中。

在一些實施例中，本發明之AAV病毒粒子用於轉導個體之所關注之細胞、組織及/或器官。

在其他實施例中，提供一種用於轉導所關注之細胞、組織及/或器官之方法，其包含，該方法包含將包含本發明之有效量之AAV病毒粒子的組合物引入至細胞中。

在一個實施例中，提供用於防治性或治療性治療個體之方法。

在另一實施例中，個體需要防治性或治療性治療。

在一些實施例中，個體包含病狀或疾病，其中該個體需要治療該病狀或疾病。

在其他實施例中，個體為哺乳動物。

在其他實施例中，個體為非嚙齒類哺乳動物、靈長類動物、人類、家畜、馬、綿羊、山羊、豬、犬或貓。

在另一實施例中，本發明之AAV病毒粒子可經由多種已知之投予技術投予至個體。

在一些實施例中，AAV病毒粒子藉由呈單次推注或經長時段靜脈內注射而投予，時段可為至少約1、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210或240分鐘或更久。

在一個實施例中，包含個體之腦脊髓液（CSF）之細胞（例如，室管膜細胞）藉由該等AAV病毒粒子轉導。在一些實施例中，經AAV病毒粒子轉導之細胞（例如，室管膜細胞）表現且分泌轉殖基因至該哺乳動物之CSF中。

在另一實施例中，AAV病毒粒子之投予包含投予至個體之大池（cisterna magna）、心室內腔、腦室、蛛膜下腔、鞘內腔及/或室管膜。

在其他實施例中，AAV病毒粒子之投予包含投予至該個體之腦脊髓液（CSF）。

在一些實施例中，AAV病毒粒子之投予包含使該個體之室管膜細胞與AAV病毒粒子接觸。

在一個實施例中，AAV病毒粒子之投予包含使該個體之軟膜細胞、內皮細胞或腦膜細胞與該等AAV病毒粒子接觸。

在另一實施例中，AAV病毒粒子之投予包含將AAV病毒粒子注射至該個體之大腦或脊髓之組織或流體中。

在一些實施例中，AAV病毒粒子之投予包含將AAV病毒粒子注射至該個體之腦脊髓液中。

在另一實施例中，本發明提供一種套組，其用於本文所述之方法及組合物。組合物及病毒調配物可提供於套組中。套組亦可包括合適容器且視情況包括一種或多種額外藥劑。在一些實施例中，容器為小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器及/或其他容器。在其他實施例中，套組包含AAV病毒粒子、醫藥學上可接受之載劑及關於其使用，例如用於指導AAV病毒粒子之投予的指導材料。

產生腺相關病毒之方法

本揭示案提供用於在諸如哺乳動物及昆蟲細胞之細胞中產生rAAV病毒粒子之材料及方法。

在各個實施例中，任何實施例之方法包括培養具有一種或多種用於產生rAAV之載體之宿主細胞的步驟。在其他實施例中，一種或多種用於產生rAAV之載體包括至少一種提供AAV輔助功能之核酸分子，或至少一種提供非AAV輔助功能之核酸分子，或至少一種產生AAV基因體載體之核酸分子或其任何組合。任何實施例之方法進一步包括在允許產生rAAV之條件下培養細胞。該方法視情況包括回收rAAV。舉例而言，可在共轉染之後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時、約144小時、約168小時、約192小時、約216小時、約240小時或任何此兩個時間點之間的時間收集AAV病毒粒子。

在一些實施例中，用於產生AAV病毒粒子之培養物包含以下各者中之一或多者：宿主細胞、由野生型或突變腺病毒（諸如溫度敏感性腺病毒）提供之合適輔助病毒功能、疱疹病毒、桿狀病毒或提供輔助功能之質體構築體、AAVrep及cap基因及基因產物、側面為AAV ITR序列之轉殖基因（諸如診斷性及/或治療性轉殖基因）及支持AAV病毒粒子產生之合適培養基及培養基組分。

在一些實施例中，昆蟲或哺乳動物細胞可用輔助質體或輔助病毒、病毒構築體及編碼AAV cap基因之質體轉染；且rAAV粒子可在共轉染之後的各個時間點收集。

在一些實施例中，在昆蟲細胞（例如，Sf9）中產生新穎rAAV病毒粒子。在一些實施例中，AAV病毒粒子藉由向宿主細胞提供包含轉殖基因連同Rep及Cap基因之AAV基因體載體來製備。在一些實施例中，AAV基因體載體包含轉殖基因、AAV Rep基因及AAV Cap基因。在一些實施例中，rAAV病毒粒子藉由向宿主細胞提供兩種或更多種載體來製備。舉例而言，在一些實施例中，將包含轉殖基因之AAV基因體載體用包含AAV Rep基因及AAV Cap基因之載體（例如，質體或桿狀病毒）引入（例如，轉染或轉導）至細胞中。在一些實施例中，細胞經包含轉殖基因之AAV基因體載體、包含AAV Rep基因之載體（例如，質體或桿狀病毒）及包含AAV Cap基因之載體（例如，質體或桿狀病毒）轉染或轉導。

在各個實施例中，任何實施例之方法包括用rBV感染宿主細胞之步驟。rBV包括一種或多種編碼Rep蛋白之核酸分子、一種或多種編碼衣殼蛋白之核酸分子及至少一種產生AAV基因體載體之核酸分子。任何實施例之方法進一步包括在允許產生rAAV之條件下培養細胞。該方法視情況包括回收rAAV。

存在多種用於產生AAV病毒粒子之方法；例如但不限於使用載體及AAV輔助序列之轉染以及使用一種AAV輔助病毒（例如，腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒）的共感染或使用重組AAV載體、AAV輔助載體及附加功能載體之轉染。製備AAV病毒粒子之方法描述於例如以下中：美國專利第US6204059號、第US5756283號、第US6258595號、第US6261551號、第US6270996號、第US6281010號、第US6365394號、第US6475769號、第US6482634號、第US6485966號、第US6943019號、第US6953690號、第US7022519號、第US7238526號、第US7291498號及第US7491508號、第US5064764號、第US6194191號、第US6566118號、第US8137948號；或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號、第WO2001023597號、第WO2015191508號、第WO2019217513號、第WO2018022608號、第WO2019222136號、第WO2020232044號、第WO2019222132號；Methods In Molecular Biology編輯, Richard, Humana Press, NJ （1995）；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press （1994）；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 （1989）；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 （1991）；Ruffing等人, J. Vir.66:6922-30 （1992）；Kimbauer等人, Vir., 219:37-44 （1996）；Zhao等人, Vir.272:382-93 （2000）；該等文獻中之各者之內容均以全文引用之方式併入本文中。關於用於產生AAV病毒粒子之方法的詳細描述，參見例如美國專利第6,001,650號、第6,004,797號及第9,504,762號，各以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，使用三重轉染方法（參見例如美國專利第6,001,650號，以全文引用之方式併入本文中）產生AAV病毒粒子。此方法不需要使用感染性輔助病毒，使AAV病毒粒子能夠在無任何可偵測之輔助病毒存在下產生。此藉由使用三種用於產生AAV病毒粒子之載體，亦即AAV輔助功能載體、附加功能載體及AAV病毒粒子表現載體來實現。然而，所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解，由此等載體編碼之核酸序列可呈多種組合提供於兩種或更多種載體上。在其他實施例中，宿主細胞可用輔助質體或輔助病毒、病毒構築體及編碼AAV cap基因之質體轉染；且可在共轉染後的多個時間點收集AAV病毒粒子。

舉例而言，野生型AAV及輔助病毒可用於提供產生AAV病毒粒子所必需之複製功能（參見例如美國專利第5,139,941號，以全文引用之方式併入本文中）。可替代地，含有輔助功能基因之質體結合經熟知輔助病毒中之一者感染可用作複製功能來源（參見例如美國專利第5,622,856號及美國專利第5,139,941號，兩者以全文引用的方式併入本文中）。類似地，可使用含有附加功能基因之質體結合經野生型AAV感染來提供必需之複製功能。熟練技術人員亦可採用本文所描述及/或此項技術中熟知之其他方法來產生AAV病毒粒子。

在各個實施例中，任何實施例之培養步驟在至少20毫升（mL）、至少50 mL、至少100 mL、至少500 mL、至少1公升（L）、至少10 L、至少50 L、至少100L、至少250 L、至少500 L、至少1000 L、至少1500 L、至少2000 L或至少2500 L之體積中進行。

在實例中，培養步驟可在一個搖瓶或多個搖瓶中進行。在各個實施例中，任何實施例之培養步驟在20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 L、2 L、3 L、4 L或5 L之體積中進行。在其他實施例中，培養步驟之體積在以上提供之任兩個體積之間的範圍內。

在其他實例中，培養步驟可在一個生物反應器或多個生物反應器中進行。在各個實施例中，任何實施例之培養步驟在1 L、2 L、3 L、4 L、5 L、6L、7L、8 L、9 L、10 L、11 L、12 L、13 L、14 L、15 L、16 L、17 L、18 L、19 L、20 L、21 L、22 L、23 L、24 L、25 L、26 L、27 L、28 L、29 L、30 L、31 L、32 L、33 L、34 L、35 L、36 L、37 L、38 L、39 L、40 L、41 L、42 L、43 L、44 L、45 L、46 L、47 L、48 L、49 L、50 L、51 L、52 L、53 L、54 L、55 L、56 L、57 L、58 L、59 L、60 L、61 L、62 L、63 L、64 L、65 L、66 L、67 L、68 L、69 L、70 L、71 L、72 L、73 L、74 L、75 L、76 L、77 L、78 L、79 L、80 L、81 L、82 L、83 L、84 L、85 L、86 L、87 L、88 L、89 L、90 L、91 L、92 L、93 L、94 L、95 L、96 L、97 L、98 L、99 L、100 L、110 L、120 L、130 L、140 L、150 L、160 L、170 L、180 L、190 L、200 L、210 L、220 L、230 L、240 L、250 L、260 L、270 L、280 L、290 L、300 L、310 L、320 L、330 L、340 L、350 L、360 L、370 L、380 L、390 L、400 L、410 L、420 L、430 L、440 L、450 L、460 L、470 L、480 L、490 L、500 L、510 L、520 L、530 L、540 L、550 L、560 L、570 L、580 L、590 L、600 L、610 L、620 L、630 L、640 L、650 L、660 L、670 L、680 L、690 L、700 L、710 L、720 L、730 L、740 L、750 L、760 L、770 L、780 L、790 L、800 L、810 L、820 L、830 L、840 L、850 L、860 L、870 L、880 L、890 L、900 L、910 L、920 L、930 L、940 L、950 L、960 L、970 L、980 L、990 L、1000 L、1010 L、1020 L、1030 L、1040 L、1050 L、1060 L、1070 L、1080 L、1090 L、1100 L、1110 L、1120 L、1130 L、1140 L、1150 L、1160 L、1170 L、1180 L、1190 L、1200 L、1210 L、1220 L、1230 L、1240 L、1250 L、1260 L、1270 L、1280 L、1290 L、1300 L、1310 L、1320 L、1330 L、1340 L、1350 L、1360 L、1370 L、1380 L、1390 L、1400 L、1410 L、1420 L、1430 L、1440 L、1450 L、1460 L、1470 L、1480 L、1490 L、1500 L、1510 L、1520 L、1530 L、1540 L、1550 L、1560 L、1570 L、1580 L、1590 L、1600 L、1610 L、1620 L、1630 L、1640 L、1650 L、1660 L、1670 L、1680 L、1690 L、1700 L、1710 L、1720 L、1730 L、1740 L、1750 L、1760 L、1770 L、1780 L、1790 L、1800 L、1810 L、1820 L、1830 L、1840 L、1850 L、1860 L、1870 L、1880 L、1890 L、1900 L、1910 L、1920 L、1930 L、1940 L、1950 L、1960 L、1970 L、1980 L、1990 L、2000 L、2010 L、2020 L、2030 L、2040 L、2050 L、2060 L、2070 L、2080 L、2090 L、2100 L、2110 L、2120 L、2130 L、2140 L、2150 L、2160 L、2170 L、2180 L、2190 L、2200 L、2210 L、2220 L、2230 L、2240 L、2250 L、2260 L、2270 L、2280 L、2290 L、2300 L、2310 L、2320 L、2330 L、2340 L、2350 L、2360 L、2370 L、2380 L、2390 L、2400 L、2410 L、2420 L、2430 L、2440 L、2450 L、2460 L、2470 L、2480 L、2490 L、2500 L、2510 L、2520 L、2530 L、2540 L、2550 L、2560 L、2570 L、2580 L、2590 L、2600 L、2610 L、2620 L、2630 L、2640 L、2650 L、2660 L、2670 L、2680 L、2690 L、2700 L、2710 L、2720 L、2730 L、2740 L、2750 L、2760 L、2770 L、2780 L、2790 L、2800 L、2810 L、2820 L、2830 L、2840 L、2850 L、2860 L、2870 L、2880 L、2890 L、2900 L、2910 L、2920 L、2930 L、2940 L、2950 L、2960 L、2970 L、2980 L、2990 L或3000 L之體積中進行。在其他實施例中，培養步驟之體積在以上提供之任兩個體積之間的範圍內。

應理解術語「載體」係指當與適當控制元件相關聯時能夠複製且可在細胞之間輸送基因序列的任何基因元件，諸如質體、噬菌體、轉座子、黏質體、桿狀病毒質體、微型質體（例如，缺乏細菌元件之質體）、狗骨頭DNA（例如，最小的閉合線性構築體）、染色體、病毒、病毒體（例如，桿狀病毒）等。如本文所用，「哺乳動物細胞相容性載體」或「載體」係指能夠富有成效地轉型或轉染哺乳動物或哺乳動物細胞之核酸分子。如本文所用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠富有成效地轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞之核酸分子。示例性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可採用任何載體，只要其與昆蟲細胞相容即可。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但昆蟲細胞中之載體之存在不必永久且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知方法，例如藉由細胞之化學處理、電穿孔或感染來引入。載體及其使用方法描述於上文所引用之關於細胞之分子工程改造的參考文獻中。

細胞自其中產生rAAV載體基因體之載體可含有啟動子及在啟動子下游之限制位點，以允許編碼一種或多種所關注之蛋白質之聚核苷酸的插入，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR下游及3' AAV ITR上游。載體亦可含有轉錄後調控元件，該轉錄後調控元件在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。病毒構築體可進一步包含插入在限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含所關注之蛋白質之編碼區。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括啟動子及在啟動子下游之限制位點，以允許編碼一種或多種所關注之蛋白質之聚核苷酸的插入，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR下游及3' AAV ITR上游。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括轉錄後調控元件，該轉錄後調控元件在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括插入在限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包括所關注之蛋白質之編碼區。如熟練技術人員將瞭解，本申請案中所揭示之AAV載體中的任一者可如病毒構築體用於產生rAAV病毒粒子之方法中。

術語「AAV輔助（AAV helper）」係指AAV衍生之編碼序列，其可經表現以提供AAV基因產物，該等AAV基因產物又在反式起作用以進行富有成效之AAV複製。因此，AAV輔助功能包括主要AAV開放閱讀框架（ORF）rep及cap兩者。Rep表現產物已證明具有許多功能，尤其包括：DNA複製之AAV起點的識別、結合及切口；DNA解旋酶活性；及AAV（或其他異源）啟動子之轉錄調節。衣殼（Cap）表現產物供應必需封裝功能。AAV輔助功能在本文中用以反式補充AAV載體基因體中缺失之AAV功能。

對於產生而言，具有AAV輔助功能之細胞產生足以形成衣殼之重組衣殼蛋白。此至少包括VP1蛋白及VP3蛋白，但更通常，VP1、VP2及VP3蛋白全部三種，如天然AAV中所發現。衣殼蛋白之序列決定由宿主細胞產生之AAV病毒粒子之血清型。可用於本發明中之衣殼包括來源於多種AAV血清型之衣殼，包括1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或混合血清型（關於非天然混合血清型之揭示內容，參見例如美國專利第8,318,480號）。衣殼蛋白亦可為天然VP1、VP2及VP3之變異體，包括突變、嵌合或改組蛋白。衣殼蛋白可為rh.10或AAV多種進化枝（clade）內之其他亞型的衣殼蛋白；多種進化枝及亞型揭示於例如美國專利第7,906,111號中。由於廣泛的構築體可利用性及廣泛表徵，以下揭示之例示性AAV載體來源於血清型2。不同血清型AAV載體及AAV蛋白之構築及使用論述於以下中：Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000；Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000；Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998；Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000；Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001。

在各個實施例中，編碼VP蛋白質之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列。在各個實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列，諸如真核啟動子。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接於真核啟動子，諸如SV40啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、UBC啟動子、EF1A啟動子、PGK啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、TRE（Tet、Tet-On、Tet-Off）啟動子、Cumate控制系統（CuR/CuO）（參見US2004/0205834）、溫度誘導之HSP70啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子及p40啟動子。在另一實例中，核苷酸序列可操作地連接於桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白（Polh）啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

對於產生而言，具有AAV輔助功能之細胞產生Rep蛋白以促進rAAV產生。已發現當在細胞中表現至少一種大Rep蛋白（Rep78或Rep68）及至少一種小Rep蛋白（Rep52及Rep40）時可產生感染性粒子。在一特定實施例中，表現Rep 78、Rep68、Rep52及Rep 40全部四種。或者，表現Rep78及Rep52、Rep78及Rep40、Rep 68及Rep52、或Rep68及Rep40。以下實例展示Rep78/Rep52組合之使用。Rep蛋白可來源於AAV-2或其他血清型。在各個實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列。在各個實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列，諸如真核啟動子。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接於真核啟動子，諸如SV40啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、UBC啟動子、EF1A啟動子、PGK啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、TRE（Tet、Tet-On、Tet-Off）啟動子、Cumate控制系統（CuR/CuO）（參見US2004/0205834）及溫度誘導之HSP70啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子及p40啟動子。在其他實例中，核苷酸序列可操作地連接於桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白（Polh）啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

在一些實施例中，AAV cap基因存在於質體或桿狀病毒質體中。質體可進一步包括AAV rep基因，其可對應於或可不對應於與cap基因相同的血清型。cap基因及/或rep基因來自任何AAV血清型。

具有AAV輔助功能之細胞亦可產生組裝活化蛋白（AAP），該等蛋白質幫助組裝衣殼。在各個實施例中，編碼AAP之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接於真核啟動子。在其他實例中，核苷酸序列可操作地連接於桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白（Polh）啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

術語「非AAV輔助功能」係指AAV複製所依賴之非AAV衍生之病毒及/或細胞功能。因此，術語包括在AAV複製中所需要之蛋白質及RNA，包括彼等涉及AAV基因轉錄之活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、Cap表現產物之合成及AAV衣殼組裝的部分。基於病毒之附加功能可衍生自已知輔助病毒（諸如腺病毒、疱疹病毒（除1型單純疱疹病毒以外）及痘瘡病毒）中之任一者。

術語「非AAV輔助功能載體」通常係指包括提供附加功能之核苷酸序列的核酸分子。附加功能載體可經轉染至合適宿主細胞中，其中該載體接著能夠支持AAV病毒粒子在宿主細胞中產生。該術語中明確排除感染性病毒粒子，因為其存在於自然界中，諸如腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒粒子。因此，附加功能載體可呈質體、噬菌體、轉座子或黏質體之形式。詳言之，已證實附加輔助功能不需要腺病毒基因之完整互補序列。舉例而言，不能夠進行DNA複製及後期基因合成之腺病毒突變體已顯示容許AAV複製。Ito等人, （1970） J. Gen. Virol. 9:243；Ishibashi等人, （1971） Virology 45:317。類似地，E2B及E3區域內之突變體已顯示支持AAV複製，此表明E2B及E3區域可能不參與提供附加功能。Carter等人, （1983） Virology 126:505。然而，在E1區域中為缺陷性的或具有缺失之E4區域之腺病毒無法支持AAV複製。因此，AAV複製可能直接或間接需要E1A及E4區。Laughlin等人, （1982）. J. Virol. 41:868；Janik等人, （1981） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925；Carter等人, （1983） Virology 126:505。其他表徵之Ad突變體包括：E1B（Laughlin等人（1982）, 如上述；Janik等人（1981）, 如上述；Ostrove等人,（1980） Virology 104:502）；E2A（Handa等人,（1975） J. Gen. Virol. 29:239；Strauss等人,（1976） J. Virol. 17:140；Myers等人,（1980） J. Virol. 35:665；Jay等人,（1981） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927；Myers等人,（1981） J. Biol. Chem. 256:567）；E2B（Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses（P. Tijssen編輯, 1990））；E3（Carter等人（1983）, 如上述）；以及E4（Carter等人（1983）, 如上述；Carter（1995））。雖然對由具有E1B編碼區中之突變的腺病毒提供之附加功能的研究已產生衝突結果，但Samulski等人,（1988） J. Virol. 62: 206-210最近報導，AAV病毒粒子產生需要E1B55k，而E1B19k則不需要。另外，國際公開案WO 97/17458及Matshushita等人,（1998） Gene Therapy 5:938-945描述編碼各種Ad基因之附加功能載體。尤其較佳之附加功能質體包含腺病毒VA RNA編碼區、腺病毒E4 ORF6編碼區、腺病毒E2A 72 kD編碼區、腺病毒E1A編碼區及缺乏完整E1B55k編碼區之腺病毒E1B區。此類載體描述於國際公開案第WO 01/83797號中。

有大量文件記載使用昆蟲細胞表現異源蛋白質，以及將核酸，諸如載體，例如昆蟲-細胞相容載體引入至此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法。（參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 編輯Richard, Humana Press, N J（1995）；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press（1994）；Samulski等人, J. Vir.（1989）第63卷, 第3822-3828頁；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA（1991） 第88卷, 第4646-4650頁；Ruffing等人, J. Vir.（1992） 第66卷, 第6922-6930頁；Kirnbauer等人, Vir.（1996） 第219卷, 第37-44頁；Zhao等人, Vir.（2000） 第272卷, 第382-393頁；以及美國專利第6,204,059號）。在一些實施例中，編碼昆蟲細胞中之AAV的核酸構建體為昆蟲細胞相容性載體。「表現載體」係指包括重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包括與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包括足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括此項技術中已知之彼等表現載體全部，諸如黏質體、質體（例如，裸露的或包含於脂質體中）、人工染色體及併入重組聚核苷酸之病毒。如本文所用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠富有成效地轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞之核酸分子。示例性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可採用任何載體，只要其與昆蟲細胞相容即可。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但昆蟲細胞中之載體之存在不必永久且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知方法，例如藉由細胞之化學處理、電穿孔或感染來引入。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在一更佳實施例中，載體為桿狀病毒，亦即，構築體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法描述於上文所引用之關於桿狀病毒載體細胞之分子工程改造的參考文獻中。

使用桿狀病毒穿梭載體或桿狀病毒質體來產生桿狀病毒。桿狀病毒質體在諸如大腸桿菌之細菌中繁殖，呈大型質體。當經轉染至昆蟲細胞中時，桿狀病毒質體產生桿狀病毒。

在一些實施例中，培養基為感染或轉染培養基（例如，將產生AAV病毒粒子之宿主細胞用基因感染或轉染的培養基（感染或轉染培養基））。

在另一實施例中，培養基為生產培養基（例如，宿主細胞產生AAV病毒粒子之培養基）。此等培養基包括但不限於由Life Technologies生產之培養基，包括經修飾之伊格爾培養基（Modified Eagle Medium；MEM）、杜爾貝科氏經修飾之伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM）；常規調配物，諸如美國專利第6,566,118號中所描述之彼等調配物；及Sf-900 II SFM培養基，如美國專利第6,723,551號中所描述，該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中，尤其在用於產生AAV病毒粒子之常規培養基調配物方面。

rAAV粒子亦可使用各個實施例中揭示之方法產生。在一些情況下，可藉由使用穩定表現rAAV粒子產生所需之一些組分的昆蟲或哺乳動物細胞來產生rAAV粒子。舉例而言，包括AAVrep及cap基因及可選標記（諸如新黴素抗性基因）之質體（或多個質體）可整合至細胞基因體中。在另一實例中，包括可選標記（諸如新黴素抗性基因）之質體（或多個質體）可整合於細胞基因體中。接著昆蟲、真菌或哺乳動物細胞可用輔助病毒（例如，提供輔助功能之腺病毒或桿狀病毒）及包括5'及3' AAV ITR（及必要時編碼異源蛋白質之核苷酸序列）之病毒載體雙重感染。此方法之優勢在於，該等細胞係可選擇的且適合於大規模生產rAAV。作為另一非限制性實例，可使用腺病毒或桿狀病毒而非質體將宿主調控基因、rep基因及cap基因引入至封裝細胞中。

宿主細胞

宿主細胞可為允許產生AAV病毒粒子且可在培養物中維持之任何無脊椎或脊椎動物細胞類型。

在一個實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

在另一實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞。

在另一實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。

在另一實施例中，哺乳動物細胞為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vera、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5細胞。

在一些實施例中，昆蟲細胞來自草地黏蟲，諸如SF9、SF21、SF900+；果蠅細胞株；蚊子細胞株，例如白紋伊蚊來源之細胞株；家蠶細胞株，例如家蠶細胞株；粉紋夜蛾細胞株，諸如High Five細胞；或鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲細胞株，諸如黑巫婆飛蛾細胞株。較佳昆蟲細胞為來自易受桿狀病毒感染之昆蟲物種的細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCRl、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B 1-4、MG-1、Tn368、HzAml、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

AAV 血清型

已表徵至少十三種AAV血清型，如下表2所示。本發明涵蓋但不限於此等特定AAV血清型。 表2. AAV血清型

AAV血清型	NCBI參考序列號/ Genbank寄存編號 （各以引用的方式併入本文中）
AAV-1	NC_002077.1
AAV-2	NC_001401.2
AAV-3	NC_001729.1
AAV-3B	AF028705.1
AAV-4	NC_001829.1
AAV-5	NC_006152.1
AAV-6	AF028704-1
AAV-7	NC_006260.1
AAV-8	NC_006261.1
AAV-9	AX7S3250.1
AAV-10	AY631965.1
AAV-11	AY631966.1
AAV-12	DQ813647.1
AAV-13	EU28SS62.1

AAV之總體資訊及評論可見於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁；及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press,（New York）。然而，完全預期此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為熟知各種血清型在結構上及功能上相當緊密相關，甚至在基因層面上亦如此。（參見例如Blacklowe, 1988,  Parvoviruses and Human Disease第165-174頁, J. R. Pattison編輯；及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61（1974））。舉例而言，所有AAV血清型明顯展現由同源rep基因介導之極類似複製特性；且全部攜有三種相關衣殼蛋白，諸如AAV-6中表現之彼等衣殼蛋白。相關性程度藉由以下進一步表明：沿基因體長度在血清型之間展現廣泛交叉雜交之異雙螺旋分析；及對應於ITR之末端處之類似自黏合區段的存在。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調控控制。

AAV「rep」及「cap」基因分別為編碼複製及衣殼化蛋白之基因。AAV rep及cap基因已在檢查之所有AAV血清型中發現，且描述於本文及所引用之參考文獻中。在野生型AAV中，一般發現rep及cap基因在病毒基因體中彼此相鄰（亦即，其以鄰接或重疊轉錄單元「偶聯」在一起），且其一般在AAV血清型中為保守的。AAV rep及cap基因亦獨立地且統稱為「AAV封裝基因」。根據本發明之AAV cap基因編碼能夠在rep及腺輔助功能存在之情況下封裝AAV載體且能夠結合目標細胞受體之Cap蛋白。在一些實施例中，AAV cap基因編碼具有以下胺基酸序列之衣殼蛋白：來源於特定AAV血清型，例如表2中所示之血清型；或來源於在哺乳動物中發現的AAV之替代衣殼變異序列，該等哺乳動物例如人類、狒狒、豬、狨、黑猩猩或獼猴（例如，恆河猴（恆河獼猴（ Macaca mulatta））、食蟹獼猴（「長尾」）（馬來獼猴（ M. fascicularis））或短尾猴（豚尾猴（ M.nemestrina））。

用於產生AAV之AAV序列可來源於任何AAV血清型之基因體。AAV血清型可具有在胺基酸及核酸層面具有顯著同源性之基因體序列，提供一組類似遺傳功能，產生基本上在物理上及在功能上同等之病毒粒子，且藉由實際上相同之機制複製及組裝。關於AAV血清型之基因體序列及/或基因體類似性之論述，參見例如GenBank寄存編號U89790；GenBank寄存編號J01901；GenBank寄存編號AF043303；GenBank寄存編號AF085716；Chlorini等人, J. Vir. 71: 6823-33 （1997）；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 （1983）；Chlorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 （1999）；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 （1998）；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 （2000），該等文獻以引用的方式併入本文中。

許多已知AAV血清型之基因體組織極其類似。AAV之基因體為長度小於約5,000個核苷酸（nt）之線性單股DNA分子。反向末端重複序列（ITR）側接非結構複製（Rep）蛋白及結構（VP）蛋白之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白形成衣殼。末端145 nt自身互補且經組織以使得可形成能量穩定性分子內雙螺旋，其形成T形髮夾。此等髮夾結構充當病毒DNA複製起點，充當細胞DNA聚合酶複合物之引子。Rep基因編碼Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。Rep78及Rep68自p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40自p19啟動子轉錄。cap基因編碼VP蛋白VP1、VP2及VP3。cap基因自p40啟動子轉錄。

在各個實施例中，提供AAV輔助功能之載體包括編碼衣殼蛋白、Rep蛋白或AAP蛋白之核苷酸序列。來自任何AAV血清型（包括但不限於AAV1（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_002077.1）、AAV2（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001401.2）、AAV3（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001729.1）、AAV3B（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AF028705.1）、AAV4（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001829.1）、AAV5（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006152.1）、AAV6（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AF028704.1）、AAV7（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006260.1）、AAV8（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006261.1）、AAV9（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AX753250.1）、AAV10（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AY631965.1）、AAV11（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AY631966.1）、AAV12（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號DQ813647.1）、AAV13（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號EU285562.1），為AAV-rh.10（AAVrh10）、AAV-DJ（AAVDJ）、AAV-DJ8（AAVDJ8）、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV- LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-前miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV（ttAAV）、UPENN AAV10或日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_蝙蝠_YNM、AAV_蝙蝠_巴西、AAV_mo.1、AAV_禽類_DA-1或AAV_小鼠_NY1、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65或其任何變異體）之cap基因、rep基因及/或AAP基因可在本文中用於產生重組AAV。示例性衣殼亦提供於國際申請案第WO 2018/022608號及第WO 2019/222136號中，該等申請案全文併入本文中。以上提供之各NCBI參考序列號或Genbank寄存編號亦以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，AAV cap基因編碼來自血清型1、血清型2、血清型3、血清型3B、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體之衣殼。

除衣殼、Rep及AAP基因之外，實施例包括表現輔助蛋白質之外源聚核苷酸。可在宿主細胞中以多種組合表現之輔助基因產物包括不限於草地黏蟲FKBP46、人類FKBP52、腺病毒E1A、E1B、E2A、E4及VA、單純疱疹病毒UL29、UL30、UL42、Ul5、UL8、UL52及UL9。在一實施例中，細胞表現至少一種免疫親和素類似物（亦即，免疫親和素或類似蛋白質）及至少一種輔助病毒基因產物。

在一些實施例中，三種AAV衣殼蛋白，亦即VP1、VP2及VP3，以重疊方式自cap開放閱讀框架（ORF）使用轉錄本之替代性mRNA剪接及替代轉譯起始密碼子使用來產生。舉例而言，VP1可自mRNA上之ATG起始密碼子（胺基酸M1）轉譯，而VP2及VP3可由更短mRNA，例如使用不同起始密碼子產生VP2及連讀轉譯成隨後可得到之起始密碼子，用於產生VP3來產生。

Cap蛋白可為VP1及VP3或VP1、VP2及VP3。VP1、VP2 VP3基因可表現以下AAV血清型之衣殼蛋白：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-rh.10（AAVrh10）、AAV-DJ（AAVDJ）、AAV-DJ8（AAVDJ8）、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV- LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-前miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV（ttAAV）、UPENN AAV10或日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_蝙蝠_YNM、AAV_蝙蝠_巴西、AAV_mo.1、AAV_禽類_DA-1或AAV_小鼠_NY1、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAVanc80L65。在另一實施例中，VP1、VP2或VP3基因表現混合血清型之衣殼，其中VP1、VP2及VP3基因並非全來自相同血清型。示例性衣殼提供於全文併入本文中之國際申請案第WO 2018/022608號中。

桿狀病毒病毒粒子

在一些實施例中，採用桿狀病毒系統。

桿狀病毒為節肢動物之包封DNA病毒，熟知其兩個成員用於在細胞培養物中產生重組蛋白質。桿狀病毒具有環狀雙鏈基因體（80-200 kbp），其可經工程改造以允許將大基因體內含物遞送至特定細胞。用作載體之病毒通常為加洲苜蓿夜蛾多囊核多角體病毒（ Autographa californica multicapsid nucleopolyhedro，AcMNPV）或家蠶（Bm）NPV）。

桿狀病毒常用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。詳言之，異源基因在昆蟲中之表現可如以下中所述實現：例如美國專利第4,745,051號；Friesen等人（1986）；EP 127,839；及EP 155,476。可用於產生蛋白質之大量桿狀病毒病毒株及變異體以及對應的容許昆蟲宿主細胞係此項技術中已知的。

舉例而言，市售Bac-to-Bac®系統（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）（目錄號10359016）包括用於表現重組蛋白之表現載體。pFastBac™ 1載體（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）具有用於高水準表現蛋白質之強多角體蛋白啟動子及用於簡化選殖之大型多選殖位點。pFastBac™ Dual（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）為單個載體，其在單個載體中具有兩種強啟動子、多角體蛋白啟動子及p10啟動子，用於同時在昆蟲細胞中表現兩種蛋白質。

簡言之，藉助於說明，諸如Bac-to-Bac®之桿狀病毒系統依賴於藉由大腸桿菌中之位點特異性轉位而非昆蟲細胞中之同源重組來產生重組桿狀病毒。舉例而言，所關注之基因可選殖至pFastBac™載體中且轉型為DH10Bac™感受態大腸桿菌（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）。DH10Bac™含有具有lacZ-mini-attTn7融合之親本桿狀病毒質體。在由輔助質體提供之轉位蛋白質存在下pFastBac™載體與親本桿狀病毒質體之元件之間發生轉位。當轉位成功時，表現卡匣破壞lacZ基因且新表現之桿狀病毒質體可目測為白色細菌群落。可分離新表現之桿狀病毒質體且使用任何實施例之轉染試劑用於轉染例如Sf9或Sf21細胞。在培養物中適當量之時間之後，可分離重組桿狀病毒。重組桿狀病毒可用於感染細胞以產生AAV病毒粒子及/或表現所關注之基因。

純化 AAV 病毒粒子

在其他實施例中，AAV病毒粒子可使用多種習知純化方法，諸如管柱層析法、CsCl梯度及其類似方法自宿主細胞純化。例如，可使用複數個管柱純化步驟，諸如陰離子交換管柱、親和管柱及/或陽離子交換管柱純化。參見例如國際公開案第WO 02/12455號。此外，若感染用以表現附加功能，則可使用已知方法使殘餘輔助病毒失活。例如，可藉由加熱至大約60℃之溫度例如20分鐘或更久使腺病毒失活。此處理僅有效地使輔助病毒失活，因為AAV極其熱穩定，而輔助腺病毒係熱不穩定的。

在一個實施例中，接著處理AAV病毒粒子儲備液以例如使用管柱層析技術移除空衣殼。

在另一實施例中，藉由溶解經轉染細胞以獲得粗細胞溶解產物來獲得AAV病毒粒子製劑。接著可藉由所屬領域中熟知之技術，諸如過濾、離心及其類似技術使粗細胞溶解產物澄清以移除細胞碎片，產生澄清細胞溶解產物。可含有AAV病毒粒子與AAV空衣殼兩者之粗細胞溶解產物或澄清細胞溶解產物接著可在非分離條件下施加至第一陽離子交換基質，其中該第一陽離子交換管柱用以進一步將AAV病毒粒子及AAV空衣殼與細胞溶解產物製劑中存在之細胞及其他組分分離。已知用於進行細胞溶解產物初始純化之方法。一種代表性方法描述於美國專利第6,593,123號中，該專利以全文引用的方式併入本文中。

分析技術

一般而言，vg及衣殼（cp）效價可以適合於量測相應vg及衣殼之任何方式評估。例如，可使用定量聚合酶鏈反應（qPCR）量測vg效價且可使用酶聯免疫吸附分析（ELISA）量測Cp效價。可替代地，可使用SEC（尺寸排阻層析）-HPLC量測vg及cp效價。另外，可使用RP（逆相）-HPLC或毛細電泳分析評估製程參數對VP比率之潛在影響。

藉由定量聚合酶鏈反應（qPCR），使用標準qPCR系統，諸如Applied Biosystems 7500快速即時PCR系統，qPCR可用於定量vg。可替代地，微滴式數位PCR（ddPCR）可用於定量Vg。引子及探針可經設計以靶向AAV之DNA，在其在PCR期間積聚時允許定量該DNA。ddPCR之實例描述於Pasi, K. John等人, 「Multiyear Follow-Up of AAV5-hFVIII-SQ Gene Therapy for Hemophilia A.」 New England Journal of Medicine382.1 （2020）: 29-40；Regan, John F.等人, 「A Rapid Molecular Approach for Chromosomal Phasing.」 PloS one10.3 （2015）: e0118270；及Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi, 及Eriko Uchida. 「Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors」 Human gene therapy methods30.4 （2019）: 127-136。其他用於定量vg之系統包括SEC、SEC-HPLC及尺寸交換層析法多角度光散射，均描述於以引用的方式全文併入之WO 2021/062164中。

衣殼ELISA（cp-ELISA）分析使用例如AAV5或AAV9衣殼ELISA方法量測完整衣殼，且可利用市售套組（例如Progen PRAAV5）。此套組ELISA採用對組裝AAV5或其他衣殼上之構形抗原決定基具有特異性的單株抗體。衣殼可捕捉在培養盤結合之單株抗體上，接著，偵測抗體隨後結合。分析訊號可藉由添加結合之鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶來產生，接著添加比色TMB受質溶液，且添加硫酸來終止反應。自目標衣殼標準之四參數校準曲線內推測試樣品之效價。另一用於定量衣殼效價之系統為SEC-MALS，其描述於WO 2021/062164中。

rBV之效價可使用焦點/病毒斑塊分析法來測定。此分析法首先包括用含有rBV之溶液之連續稀釋液來感染細胞之步驟。感染發生預定時間後，自培養物移除rBV且培育細胞預定時間。在預定時間過去之後，將成斑培養基（plaquing media）（例如含有瓊脂糖）添加至培養物且使其硬化。使細胞進一步培育預定時間且在預定時間之後對斑塊數目進行計數。使用下式計算效價：效價（斑塊形成單位/mL）=斑塊數目×稀釋因子×（1/（mL接種物/孔））。

陽離子肽及富含組胺酸之肽

方法包括使用陽離子肽作為轉染試劑，其中該等肽在6至8範圍內之pH（例如，7.4）下具有正電荷。合適轉染試劑成為大規模生產病毒載體之成功候選物應滿足若干準則：1）較佳結合呈質體、桿狀病毒質體之形式或任何其他形式提供的外來核酸；2）外來DNA與轉染試劑之複合物較佳穩定超過10分鐘；3）外來DNA：轉染試劑之複合物結合於細胞表面且為細胞所吸收；4）轉染試劑較佳提供胞內體釋放外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物之方式；5）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳能夠達到細胞核；6）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳可用於轉錄蛋白質及複製基因；7）較佳地，細胞對轉染試劑及外來DNA:轉染試劑複合物具有良好耐受性；8）外來DNA或外來DNA:轉染試劑複合物較佳與所選生產培養基相容；及9）轉染試劑較佳能夠以可縮放之方式轉染生產細胞。

陽離子肽之實例包括富含組胺酸之肽（HRP）。HRP已用於遞送不同類型載物至細胞中（Moulay G.等人, Histidine-rich designer peptides of the LAH4 family promote cell delivery of a multitude of cargo.Journal of Peptide Science, 2017, 23（4）:320-328）。

如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用，意謂包含兩種或更多種彼此藉由肽鍵或經修飾之肽鍵，亦即肽同電子排列體接合的胺基酸聚合物。多肽係指短鏈（通常稱為肽、糖肽或寡聚物）及長鏈（通常稱為蛋白質）兩者。多肽可含有除20種基因編碼之胺基酸以外之胺基酸。多肽包括藉由諸如轉譯後處理之天然方法或藉由所屬領域中熟知之化學修飾技術修飾之胺基酸序列。

然而，HRP之前未曾用作在哺乳動物或昆蟲細胞中產生病毒載體之轉染試劑。

HRP為約20個胺基酸長且含有促進其結合於細胞膜之疏水性胺基酸殘基、促進其水溶性之親水性殘基及若干組胺酸殘基（家族中良好表徵之成員的四個組胺酸殘基，LAH4）。在中性pH下之組胺酸帶正電荷且可結合於帶負電荷之載物。此使得載物:肽複合物之總電荷為正的。針對LAH4及既定質體，看到3.6之正電荷比率（+/-）[4]。載物:肽複合物之此正電荷促進與通常認為帶負電荷之細胞質膜的結合。亦報導，受體介導之胞吞作用可經由細胞表面上之醣蛋白進行（Kichler A.等人, Cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery, Biochimica et biophysica acta 2006, 1758（3）:301-307）。內吞DNA:肽複合物沿著內吞路徑自早期胞內體移動至晚期胞內體。沿著該路徑，pH變得酸性更大且組胺酸變得更質子化，將其淨電荷自+5改變至+9（對於LAH4肽）。此造成肽之大約一半自DNA:肽複合物解離。釋放之游離肽使胞內體膜不穩定且允許含有DNA之複合物逃至細胞溶質中。

HRP為大約10-50個胺基酸長之組胺酸-肽。合適HRP在pH 7.4下具有5、6、7、8、9或10之標稱電荷且在pH 5下具有6、7、8、9或10之標稱電荷。HRP進一步在pH 7下具有0.02至0.4之疏水矩，例如在pH 7下疏水矩可為0.03、0.04、0.05. 0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50；及20-160之極角，例如大約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160。較佳HRP具有由丙胺酸及白胺酸製成之核心，穿插有四個組胺酸。

在各個實例中，當在細胞膜存在下時及當根據希弗埃德蒙遜輪狀示意圖（Schiffer-Edmundson's wheel representation）表示時HRP之至少一部分形成α-螺旋構形（Schiffer M, Edmundson AB. Biophys J. 1967年3月;7（2）:121-35）。α-螺旋可為兩性螺旋，其在螺旋之一側上具有一簇疏水性胺基酸殘基且在螺旋之另一側上具有兩個至四個組胺酸殘基，在希弗埃德蒙遜輪狀示意圖中界定60°與180°之間的親水角。α-螺旋亦可為非極性螺旋，其在螺旋之一側上具有一簇疏水性胺基酸殘基且在螺旋之另一側上具有連續丙胺酸殘基，在希弗埃德蒙遜輪狀示意圖中該等連續丙胺酸殘基界定60°至180°之角度。在其他實例中，HRP之N端及C端部分包括一個或多個在pH值7.4下帶正電荷之胺基酸殘基。例如，LAH4肽（SEQ ID NO: 1）在N端及C端具有離胺酸或精胺酸殘基。參見國際公開案WO 2013/001041，其以全文引用的方式併入本文中。

為轉染DNA，示例性HRP之特徵包括如下肽，其相對較短，呈現允許與DNA發生靜電相互作用但具有有限正電荷密度之陽離子殘基，可溶於水溶液中且能夠與膜相互作用且使膜不穩定。參見國際公開案WO 2002/096928；Kichler, Antoine, A. James Mason, 及Burkhard Bechinger. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes1758.3（2006）: 301-307；Kichler, Antoine等人, Journal of Molecular Medicine85.2（2007）: 191-201。所有此等參考文獻均以全文引用的方式併入。

在各個實施例中，陽離子肽或HRP包括共價修飾。共價修飾之實例包括醯化、乙醯化、連接（例如，至N端）至非肽之大分子載體基團；醯胺化、連接（例如，至C端）至非肽之大分子載體基團；醣基化（例如，胺基酸側鏈）；連接至可促進肽吸收至細胞中之轉接蛋白，或連接至疏水性基團，諸如脂質、脂肪酸、丹醯基、苄氧羰基或第三丁氧基羰基；氧化、硫酸鹽化、酯化、內酯形成及/或磷酸化。在其他實施例中，陽離子肽包括允許定量陽離子肽之標記物。例如，陽離子肽可包括酪胺酸（Tyr或Y）或色胺酸（Trp或W）。

應注意，如各個實施例中描述之陽離子肽不限於HRP且亦包括亦在各個實施例中描述之其他陽離子肽。例如，表3中揭示多種陽離子肽或HRP。 表3：陽離子肽及富含組胺酸之肽

胺基酸序列	替代名稱	SEQ ID NO:	註釋
KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	LAH4	1
KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA	LAH4-L1	2
KKALLALALHHLAHLAHHLALALKKA	LAH5	3
KKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	LAH4-L1-F4	4
KKALLAHFLHLLALLALHLFHALKKA	LAH4-L1-F2D	5
KKALLALALHHALHLALHLALALKKA	LAH4 INV-AL	6
KKALAHALHLLALALLHLAHALAKK	LAH4-L1-β	7
KKLAKALAKALAKALKLALALAKK	LAK4	8
KKLALALALALHALALALALKKA	LAH1	9
KKLAHLALALALGLALAHLAKKA	LAH2	10
KKALALGLHLAHLALHLALALKKA	LAH3	11
KKALLALALHHLAHPALHLALALKKA	LAH4-P15	12
KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	D-LAH4	13	D-對映異構體
KKLALAHALHLALLLALHLAHALKKA	LAH4-L1-Opt	14
KKALLALAXHHLAHLALHXALALKKA	LAH4X2	15	X為α-胺基丁酸
KKALLALAXHHLAHLAHHXALALKKA	LAH5X2	16	X為α-胺基丁酸
KKALLALAXKKWAKLWKKXALALKKA	LAK5X2W2	17	X為α-胺基丁酸
KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA		18
KKALLALALHHLALLAHLLALHLKKA		19
KKKGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYGKKK		20
RRRRRRRRGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYG		21
CKKKGLFHAIHGFIHNGWHGMIHGWYGKKKC		22
KKKGLFHALLHLLHSLWHLLLHAKKK		23
KKALLAHALHLLALLALHLAHALA		24
RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA		25
KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA		26
KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA		27
KKALLHAALAHLLPLAHHLLALLKKA		28
KKALLAKALKLLALLALKLAKALKKA		29
HHALLAHALHLLALLALHLAHALHHA		30
ALLAHALHLLALLALHLAHALA		31
ALLAHALHLLALLALHLAHALKKA		32
ALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA		33
KKALLAAALAALLALAHHLLALLKKA		34
GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY		35
KKKKALLHLHLLALHLHLLALLALKKK		36
KWKLFKKIGAVLKVLTTG		37
CLLKKLLKKLLKKC		38
WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		39
YGRKKRRQRRRC		40
RQIKIWFQNRRMKWKKC		41
YARAAARQARA		42
HHHHHHYARAAARQARA		43
YGRKKRRQRRRCKWKLFKKIGAVLKVLTTG		44
YGRKKRRQRRRCWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		45
YARAAARQARAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		46
RRRRRRRRRWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		47
KETWWETWWTEWSQPKKKRKVWEAKLAKALAKALAKHLAKAL AKALKACEA		48
LCLRPVGWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		49
RRLSYSRRRFWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA		50
KWKLFKKIGAVLKVLTTGYGRKKRRQRRRC		51
KWKLFKKIGAVLKVLTTGRQIKIWFQNRRMKWKKC		52
KWKLFKKIGAVLKVLTTGYGRKKRRQRRRC		53	包括經由半胱胺酸之間的二硫橋鍵連接之二聚體
KWKLFKKIGAVLKVLTTGRQIKIWFQNRRMKWKKC		54	包括經由半胱胺酸之間的二硫橋鍵連接之二聚體
KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPYARAAARQARA		55
LIRLWSHLI HIWFQNRRLKWKKKYARAAARQARA		56
GLFEALLELLESL WELLLEAYARAAARQARA		57
KWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		58
CCCCCCKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		59
KWKLFKKIGAVLKVLTTGGGSYARAAARQARA		60
KWKLFKKIGAVLKVLTTGGGSGGGSYARAAARQARA		61
KWKLFKKIGAVLKVLTTGGGSGGGSGGGSGYARAAARQARA		62
MHHHHHHKWKLFKKIGAVLKV LTTGYGRKKRRQRRRC		63
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYGRKKRRQRRR		64
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		65
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLT TGYARAAARQARACCCCCC		66
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGRRRRRRRRR		67
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLT TGGWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL		68
HHHHHHKKALLALALHHLAHLALHLALALKKAYARAAARQARA		69
HHHHHHCLLKKLLKKLLKKCYARAAARQARA		70
HHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		71
HHHHHHHHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		72
HHHAHHHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		73
HAHHAHHAHKWKLFKKIGAVLKVLTTGYARAAARQARA		74
KWKLFKKIGAVLKVLTTGHHHH HHYARAAARQARA		75
HHHHHHKWKLFKKIGAVLKVLT TGYARAAARQARAHHHHHH		76
HHHHHHYARAAARQARAGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		77
YARAAARQARAGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		78
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		79
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		80
HHHHHHYARAAARQARAGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		81
YARAAARQARAGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		82
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		83
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		84
KKWALLALALHHLAHLALHLALALKKA		85
KKWALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		86
PKKKRKVGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		87
PKKKRKVGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		88
KRPAATKKAGQAKKKKGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA		89
KRPAATKKAGQAKKKKGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		90
PARKRLNGGGGSKKWALLALALHHLAHLALHLALALKKA		91
PARKRLNGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA		92
HHHHHHYARAAARQARAGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	His-PTD4-LAH4	93
YARAAARQARAGGGGSKKALLALALHHL	PTD4-LAH4	94
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	His-穿膜肽-LAH4	95
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	穿膜肽-LAH4	96
HHHHHHYARAAARQARAGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	His-PTD4-LAH4-L1-F4	97
YARAAARQARAGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	PTD4-LAH4-L1-F4	98
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	His-穿膜肽-LAH4-L1-F4	99
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	穿膜肽-LAH4-L1-F4	100
KKWALLALALHHLAHLALHLALALKKA	LAH4（W）	101
KKWALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	LAH4-L1-F4（W）	102
PKKKRKVGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	SV40 T NLS-間隔子-LAH4	103
PKKKRKVGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	SV40 T NLS-間隔子-LAH4-L1-F4	104
KRPAATKKAGQAKKKKGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	核質蛋白NLS-間隔子-LAH4	105
KRPAATKKAGQAKKKKGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	核質蛋白NLS-間隔子-LAH4-L1-F4	106
PARKRLNGGGGSKKWALLALALHHLAHLALHLALALKKA	AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4	107
PARKRLNGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4-L1-F4	108
KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA	LAH4-L0	109
KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA	LAH4-L2	110
KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA	LAH4-L3	111
KKALLHLALLHAALLAHHLALALKKA	LAH4-L4	112
KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA	LAH4-L5	113
KKALLHLALLLAALHAHLAALHLKKA	LAH4-L6	114
KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA	LAH4-A1	115
KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA	LAH4-A2	116
KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA	LAH4-A3	117
KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA	LAH4-A4	118
KKALLHALLAHLAALLHALLAHLKKA	LAH4-A5	119
KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA	LAH4-A6	120
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	His-穿膜肽-LAH4-2	121
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGSKKALLALALHHLAHLALHLALALKKA	穿膜肽-LAH4-2	122
HHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKKGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	His-穿膜肽-LAH4-L1-F4-2	123
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGGSKKALLAHFFHLLALLALHFFHALKKA	穿膜肽-LAH4-L1-F4-2	124

可用作轉染試劑之陽離子肽及HRP之其他實例揭示於國際公開案WO 2017/175072；美國專利第8,652,483號；及Mello, Lucas R.等人, 「Self-assembly and intracellular delivery of DNA by a truncated fragment derived from the Trojan peptide Penetratin.」 Soft matter16.20（2020）: 4746-4755。所有此等參考文獻均以全文引用的方式併入。

轉染方法之效率可以多種方式表示，例如自與外來DNA一起遞送之基因產生蛋白質之細胞%、在轉染之後在細胞中偵測到之外來DNA之複本數目、由遞送之基因產生之蛋白質的酶活性及其他方式。例如，轉染效率可確定為在攜帶GFP基因之質體轉染之後的既定時間點的綠色螢光蛋白陽性（GFP ⁺）細胞%。

HRP可用於改良昆蟲細胞（諸如sf9細胞）中利用AAV產物之轉染。關於此，在產生含有所關注之基因之桿狀病毒質體之後，來自桿狀病毒質體之質體可與HRP轉染劑一起使用以建立經桿狀病毒感染之昆蟲細胞（BIIC）。當需要擴增時，先前低溫保存之BIIC可用昆蟲細胞擴增，且產生含有治療基因之AAV衣殼。因此，在昆蟲細胞之情況下，轉染劑可用於建立BIIC之上游階段。

HRP亦可用於改良哺乳動物細胞之轉染。在此情況下，HRP連同質體一起轉染哺乳動物細胞，諸如HEK293細胞。

HRP具有長期穩定性且適合於低轉染體積之優點。就此而言，HRP可以1%轉染體積使用且穩定至少60分鐘。不同於其他的許多其他轉染試劑，諸如PEI及FECTOVIR®，亦可商購GMP級HRP。另外，不同於假定保留在細胞中之PEI及FECTOVIR®，HRP在細胞中分解且具有低細胞毒性。HRP亦可用於高細胞密度培養下之轉染，例如2-8×10 ⁶個細胞/毫升，其中高轉染效率為至少70%且至多90%或更多。因此，轉染效率為約70%、75%、80%、85%或90%。在使用HRP轉染試劑的本發明之轉染方法下，載體/轉染試劑複合物穩定超過10分鐘，或超過15分鐘，超過20分鐘，超過25分鐘。HRP轉染試劑提供之一個優點為可使用低體積。就此而言，用於產生rAAV之載體及轉染試劑以≤15%培養物體積、≤10%培養物體積、≤5%培養物體積之體積混合在一起。因此，用於產生rAAV之載體及轉染試劑以≤ 15%、≤ 14%、≤ 13%、≤ 12%、≤ 11%、≤ 10%、≤ 9%、≤ 8%、≤ 7%、≤ 6%或≤ 5%培養物體積之體積混合在一起。

陽離子肽或HRP可添加至細胞培養物達至少0.001 µg/mL、至少0.01 µg/ mL、至少0.1 µg/mL、至少0.5 µg/mL、至少1 µg/mL、至少10 µg/mL、至少50 µg/mL、至少100 µg/mL、1-200 µg/mL、5-50 µg/mL、10-150 µg/mL或100-200 µg/mL之濃度。

如先前所述，HRP亦以GMP級製造。片語「優良藥品製造規範」或「GMP」係指由美國美國食品藥物管理局（FDA）建立之生產意欲用於人類用途之產品的方法、方案及程序集合。縮寫「cGMP」特定表示當前經FDA（例如，根據21 Code of Federal Regulations，部分211）批准之彼等方案及程序。任何實施例之陽離子肽/HRP及轉染試劑亦為生物可降解的，且限制於對細胞存活無影響。

本發明人第一次發現HRP亦可用作在哺乳動物細胞中產生rAAV及在昆蟲細胞中產生rBV之轉染劑。本發明將進一步描述於以下實例中，該等實例不限制申請專利範圍中所描述之本發明的範疇。 實例實例1：Bba41衣殼之產生

在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中培養之人類胚胎腎293（HEK293）細胞中產生Bba41衣殼。使用固相肽合成以合成方式產生所有轉染試劑、陽離子肽及HRP，此可在GMP條件下進行。使用PEIPRO®及不同HRP，包括LAH4、LAH4-L1、LAH4-L1-F4及LAH4-L1-F2D，將HEK293細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。PEIPRO®為基於線性聚乙烯亞胺（PEI）之轉染試劑，其為陽離子聚合物。PEIPRO®經最佳化用於產生載體且在行業中被視為用於產生可靠病毒載體生產及高感染效價產率之金標準轉染試劑。使用ddPCR測定效價。如圖1中所示，用不同HRP轉染之HEK293細胞產生與用PEIPRO®轉染之HEK293細胞（約0.6×10e11 vg/mL）相比實質上更大效價之Bba41衣殼（＞2.3×10e11載體基因體（vg）/毫升（mL））。藉由attune流式細胞儀量測GFP強度。圖1亦展示，當用不同HRP（約58%至約74%）轉染時在轉染之後24小時與用PEIPRO®（約44%）轉染之HEK293細胞相比更大百分比之HEK293細胞展現GFP表現。在轉染之後66小時，展現GFP表現之經HRP轉染之HEK293細胞的百分比增加（約83%至98%）且保持大於經PEIPRO®轉染之HEK293細胞（約77%）。

在搖瓶（30 mL工作體積）中，在HEK293細胞中產生Bba41衣殼，使用不同濃度及不同複合體積之LAH4肽將該等細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之前，將質體與5、6、7、8、9、10、11、12及13微克（µg）/mL濃度之LAH4肽混合。LAH4/質體混合物之體積為HEK293細胞培養物體積之0%、1%及10%。舉例而言，添加0%複合體積至HEK293細胞培養物中指示LAH4肽及質體彼此獨立地直接添加至培養物。使用ddPCR測定效價且藉由attune流式細胞儀量測GFP強度。

如圖2中所示，5-13 µg/ml濃度之LAH4肽能夠在0%、1%及10%複合體積下高效率轉染HEK293細胞。圖3亦展示當用不同LAH4肽濃度及複合體積轉染時展現高GFP螢光的經轉染之HEK293細胞。

如圖4中所示，經0%、1%及10%複合體積下5-13 µg/ml濃度之LAH4肽轉染產生在約1.25×10e11至約2.8×10e11 vg/mL範圍內的高rAAV效價。

如圖5A、5B及5C中所示，經0%、1%及10%複合體積下5-13 µg/ml濃度之LAH4肽轉染在不同時間點具有類似細胞密度。圖6A、6B及6C亦展示經0%、1%及10%複合體積下5-13 µg/ml濃度之LAH4肽轉染在不同時間點具有類似存活率。圖5A、5B及5C中所示之存活率突出顯示在用於轉染之濃度下HRP未誘發細胞毒性。

在搖瓶（30 mL工作體積）中，在HEK293細胞中使用多種HRP產生Bba41衣殼。使用不同HRP，包括LAH4、LAH4-L1、LAH4-L1-F4及LAH4-L1-F2D，將HEK293細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之前，將不同HRP與質體混合在一起且培育10及60分鐘。使用ddPCR測定效價且藉由attune流式細胞儀量測GFP強度。圖7展示在轉染之前HEK293細胞中產生之Bba41衣殼之效價，將PEIPRO®與質體混合在一起且培育10、20及30分鐘。使用不同HRP產生之Bba41衣殼之效價（大於6×10e11 vg/mL）實質上大於使用PEIPRO®產生之Bba41衣殼之效價（小於1.25×10e11 vg/mL）。當使用不同HRP時在10及60分鐘之複合時間下Bba41衣殼效價亦保持較高。

對於圖8A及圖8B，藉由表現GFP之細胞之百分比確定轉染效率。如圖8A中所示，在轉染之後24小時不同HRP之轉染效率實質上高於PEIPRO®之轉染效率。在10及60分鐘之複合時間下，在轉染之後24小時不同HRP之轉染效率亦保持較高。圖8B進一步展示在10及60分鐘之複合時間下，在轉染之後48小時不同HRP之轉染效率保持較高（＞85%）。

圖1、2、3、4、5A-5C、6A-6C、7、8A及8B突出顯示與PEI（視為用於產生病毒載體之金標準轉染試劑）相比，HRP展現在諸如HEK293細胞之經短暫轉染之細胞中更佳的轉染效率。當與質體混合且培育長時段時，與PEI相比，HRP亦產生較高效價之Bba41衣殼，且展現增強之穩定性。PEI在與質體混合時在長時段內不保持穩定。在此程度上，HRP允許轉染更大體積之細胞。舉例而言，當前HEK293細胞產生病毒載體之主要限制為無法進行超過500公升（L）之規模生產。

為測試HRP轉染大於500 L之HEK293細胞培養物體積的能力，在使用生物反應器以不同體積培養之HEK293細胞中產生Bba41衣殼。生物反應器包括具有100 L、500 L、750 L、1000 L及2000 L之體積的培養物。在轉染之前，將不同濃度之不同HRP與用於產生Bba41衣殼之質體以不同重量比混合。將HRP/質體培育不同時段，接著添加至細胞培養物。對於不同體積之生物反應器培養物中之每一者，產生Bba41衣殼。 實例2：AAV9衣殼之產生

在1.6 L搖瓶（500 mL工作體積）中，在HEK293細胞中產生AAV9衣殼，使用LAH4肽及PEIPRO®將該等細胞用產生AAV9衣殼且提供含有所關注之基因之AAV基因體載體的質體轉染。使用ddPCR測定效價。圖9展示AAV9衣殼效價。TRM1、TRM2及TRM3為在經LAH4肽轉染之前置換細胞培養基之三種重複培養物。CCM1、CCM2及CCM3為在經LAH4肽轉染之前不置換細胞培養基之三種重複培養物。CTL1、CTL2及CTL3為HEK293細胞用PEIPRO®轉染之三種重複培養物。如圖9中所示，用LAH4肽轉染之培養物（例如，TRM1-3及CCM1-3）產生的AAV9衣殼效價（6×10e10 vg/mL至約1.2×10e11 vg/mL）實質上大於在用PEIPRO®轉染之培養物（例如，CTL1-3）中產生的AAV9衣殼效價（小於2.2×10e10 vg/mL）。

在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中，在使用不同複合體積之LAH4肽用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染的HEK293細胞中產生AAV9衣殼。在轉染之前，將質體與一定濃度之LAH4肽混合且培育10分鐘及60分鐘。LAH4/質體混合物之體積為HEK293細胞培養物體積之1%及10%。使用ddPCR測定效價且藉由attune流式細胞儀量測GFP強度。

對於圖10A、10B、10E及10F，藉由表現GFP之細胞之百分比確定轉染效率。如圖10A中所示，用1%及10%複合體積之LAH肽及質體轉染之HEK293細胞在48小時產生大於87.5%及95%之高平均轉染效率。如圖10B中所示，用1%及10%複合體積LAH4肽及質體轉染之HEK293細胞在24小時產生大於約67.5%及大於70%之高平均轉染效率。對於10及60分鐘複合時間，圖10E展示用LAH4肽/質體混合物轉染之HEK293細胞在48小時產生約90%之高平均轉染效率且圖10F展示用LAH4肽/質體混合物轉染之HEK293細胞在24小時產生約70%及約67.5%之高平均轉染效率。

如圖10C中所示，用1%及10%複合體積之LAH4肽及質體轉染之HEK293細胞產生在約5×10e11至約2×10e12 vg/mL範圍內的高效價AAV9衣殼。對於10及60分鐘複合時間，圖10G展示用LAH4肽/質體混合物轉染之HEK293細胞產生兩種複合時間之平均效價在約1×10e12 vg/mL範圍內的高AAV9衣殼效價。

如圖10D中所示，用1%及10%複合體積之LAH4肽及質體轉染之HEK293細胞的平均存活率高，具有大於75%及約72.5%之細胞存活率。對於10及60分鐘複合時間，圖10H亦展示用LAH4肽與質體混合物轉染之HEK293細胞的平均存活率高，具有約72.5%及大於75%之細胞存活率。圖10D及10H中所示之存活率突出顯示在用於轉染之濃度下HRP未誘發細胞毒性。

使用LAH4肽作為轉染試劑製備AAV9衣殼之額外3L生物反應器生產。使用LAH4肽將HEK293細胞用產生AAV9衣殼且提供具有所關注之基因之AAV基因體載體的質體轉染。使用ddPCR測定效價。如圖11中所示，額外生產之效價產生在大於1×10e12 vg/mL至約2.2×10e12 vg/mL範圍內之高AAV9衣殼效價。

圖9、10A-10H及11突出顯示HRP展現高轉染效率且產生高效價AAV9衣殼。當與質體混合且培育長時段時，HRP亦產生較高效價之AAV9衣殼，且展現增強之穩定性。PEI在與質體混合時在長時段內不保持穩定。在此程度上，HRP允許轉染更大體積之細胞。舉例而言，當前HEK293產生病毒載體之主要限制為無法進行超過500 L之規模生產。

構築額外HRP。將不同元件添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽。

例如，將用於增強細胞結合及滲透之蛋白質轉導域4（PDT4）添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（His-PTD4-LAH4及SEQ ID NO: 93；PTD4-LAH4及SEQ ID NO: 94；His-PTD4-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 97；PTD4-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 98）中。

將用於增強胞內體逃逸之組胺酸殘基添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（His-PTD4-LAH4及SEQ ID NO: 93；His-穿膜肽-LAH4及SEQ ID NO: 95；His-PTD4-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 97；His-穿膜肽-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 99；His-穿膜肽-LAH4-2及SEQ ID NO: 121；His-穿膜肽-LAH4-L1-F4-2及SEQ ID NO: 123）中。

將用於儲備溶液定量之N端處之色胺酸殘基添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（LAH4（W）及SEQ ID NO: 101；LAH4-L1-F4（W）及SEQ ID NO: 102）中。

將用於增強細胞及DNA結合以及細胞滲透之穿膜肽添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（His-穿膜肽-LAH4及SEQ ID NO: 95；穿膜肽-LAH4及SEQ ID NO: 96；His-穿膜肽-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 99；穿膜肽-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 100；His-穿膜肽-LAH4-2及SEQ ID NO: 121；穿膜肽-LAH4-2及SEQ ID NO: 122；His-穿膜肽-LAH4-L1-F4-2及SEQ ID NO: 123；穿膜肽-LAH4-L1-F4-2及SEQ ID NO: 124）中。

將用於增強質體之核遞送的猿猴病毒40（SV40）核定位訊號（NLS）添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（SV40 T NLS-間隔子-LAH4及SEQ ID NO: 103；SV40 T NLS-間隔子-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 104）中。

將用於增強質體之核遞送的核質蛋白NLS添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（核質蛋白NLS-間隔子-LAH4及SEQ ID NO: 105；核質蛋白NLS-間隔子-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 106）中。

將用於增強質體之遞送的AAV2 VP1-2 BR3添加至LAH4及LAH4-L1-L4肽（AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4及SEQ ID NO: 107；AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4-L1-F4及SEQ ID NO: 108）中。

此等肽經化學合成且在不同濃度下將HEK293細胞用含有GFP及多種治療轉殖基因之質體轉染。詳言之，在96深孔盤之孔（0.5 mL），使用不同濃度之不同HRP，使用His-PTD4-LAH4、PTD4-LAH4、LAH4（W）、AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4、His-PTD4-LAH4-L1-F4、PTD4-LAH4-L1-F4、LAH4-L1-F4（W）、SV40 T NLS-間隔子-LAH4-L1-F4及AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4-L1-F4，將HEK293細胞用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之後24小時，藉由鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。使用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，監測細胞群體中具有完整質膜（DAPI陰性）之細胞的百分比以反映經修飾之肽之細胞毒性。使用流式細胞測量術閘控表現GFP蛋白之細胞，轉染效率表示為具有完整質膜之細胞群體中表現GFP之陽性細胞之百分比。如圖12及13中所示，不同HRP轉染高達約80%之HEK293細胞。細胞活力之量測顯示，不同HRP受限於無毒性作用。因此，不同肽展現接近於或相當於LAH4及LAH4-L1-F4肽之轉染效率。

在預定時間，自培養物分離AAV衣殼。使用ddPCR及載體基因體之引子定量AAV9衣殼效價。如圖14及15中所示，用不同HRP轉染之HEK293細胞產生10e11 vg/mL規模之效價。 實例3：富含組胺酸之肽的轉染效率

引言

該研究之目標為填補當前關於LAH4肽之兩種特性之知識的空白，從而實現其作為轉染試劑用於生物技術行業中大規模短暫轉染。兩種特性為：1）在轉染之前DNA:LAH4複合物之穩定性；2）在哺乳動物細胞轉染之後LAH4肽之天然清除率。

使LAH4肽與質體一起培育超過1小時，以大規模（超過或等於100 L）短暫轉染，因為此培育時間使轉染複合物之穩定性提高，使得方法穩固且可再現。發現LAH4:DNA複合物至少穩定1小時。在跟蹤研究中，當儲存於2-8℃及/或室溫下且暴露或未暴露於周圍光時評估LAH:DNA複合物之穩定性長達1週。

結果

強調在生物處理期間諸如轉染試劑之輔助材料的清除率。假設在轉染過程結束之後LAH4主要由細胞蛋白酶降解。為證實LAH4之生物可降解性，研發出液體層析-質譜法（LC/MS）方法來偵測細胞溶解產物之複合基質中之LAH4肽。將不同濃度之LAH4肽添加至3 L及100 L之細胞培養物體積（亦即，生物反應器）中。在轉染之後4小時，相對於初始LAH4肽濃度，LAH4肽濃度減少約45%至約85%。在轉染之後24小時，相對於初始LAH4肽濃度，LAH4肽濃度減少約83%至約97%。在轉染之後48小時，相對於初始LAH4肽濃度，LAH4肽濃度減少約93%至約99%。在轉染之後72小時，相對於初始LAH4濃度，LAH4肽濃度減少約96%至約99%。資料顯示，至轉染之後72小時，相對於初始LAH4肽濃度，LAH4肽清除率超過95%。

材料與方法

細胞培養：根據製造商說明書在所提供之細胞培養基中培養懸浮HEK293細胞。對於小規模轉染研究，在轉染當日將HEK293細胞以預定細胞密度之範圍接種於125 ml愛倫美氏搖瓶（Erlenmeyer shake flask）中。

轉染：將來自相同批次之LAH4溶液呈單次使用等分試樣保持在-20℃下。使LAH4在室溫下解凍且與含有GFP報導基因之質體DNA混合。將DNA:LAH4複合物保持於封閉蓋之試管中指定時段以防止在室溫或2-8℃下蒸發，隨後轉染。

LAH4:DNA 複合物之穩定性：對LAH4:DNA複合物進行生物物理學表徵。方法可包括量測尺寸及電荷。

轉染效率：在轉染之後24及48小時使用流式細胞儀量測轉染效率且表示為具有完整質膜之單細胞群體中GFP+細胞%。

細胞中之 LAH4 偵測：在轉染之後不同時間點收集樣品且使用LC/MS分析來分析。 實例4：HEK293細胞中AAV9衣殼之大規模產生

為測試HRP轉染大於500 L之HEK293細胞培養物體積的能力，在使用生物反應器以不同體積培養之HEK293細胞中產生AAV9衣殼。生物反應器包括具有100 L、500 L、750 L、1000 L及2000 L之體積的培養物。在轉染之前，將不同濃度之不同HRP與用於產生AAV9衣殼之質體以不同重量比混合。將HRP/質體培育不同時段，接著添加至細胞培養物。對於不同體積之生物反應器培養物中之每一者，產生AAV9衣殼。在不同實例中，LAH4肽用於在兩個獨立的100 L生物反應器生產中轉染懸浮之HEK293細胞。尤其如圖16中所示，兩種100 L生產產生＞1.4×10e12 vg/mL及＞1×10e12 vg/mL效價。因此，本發明允許使用質體/HEK293系統大規模生產rAAV。因此，產生之效價穩固且經濟上可行，使得質體/HEK293系統現為可行的大規模rAAV生產系統。 實例5：Sf9細胞中rBV及AAV5衣殼之產生

如先前突出顯示，rAAV可在昆蟲細胞（例如，Sf9細胞）中藉由用重組桿狀病毒（rBV）感染細胞而產生，該重組桿狀病毒具有編碼衣殼及Rep蛋白及/或提供具有表現卡匣之AAV基因體載體之核苷酸序列。為產生rBV，將昆蟲細胞（諸如Sf9細胞）用重組桿狀病毒基因體轉染，該等重組桿狀病毒基因體具有編碼衣殼及Rep蛋白質及/或提供具有表現卡匣之AAV基因組載體之核苷酸序列。為產生重組桿狀病毒基因體（亦即，桿狀病毒質體），存在能夠將異源核苷酸序列插入桿狀病毒基因體中之不同載體系統（例如，Bac-to-Bac™桿狀病毒表現系統，ThermoFisher Scientific）。

在Sf9細胞中使用不同HRP，諸如LAH4、LAH4-L1、LAH5、LAH4-L1-F2D及對照轉染試劑（CELLFECTIN®，Thermo Fisher）轉染具有GFP表現卡匣之質體。如圖17中所示，15%至大於50%之經不同HRP轉染之Sf9細胞表現GFP。不同HRP之轉染效率與對照轉染試劑之轉染效率相當。

亦在Sf9細胞中產生AAV5衣殼。為產生AAV5衣殼，使用對照轉染試劑及不同HRP將Sf9細胞用桿狀病毒質體轉染，該桿狀病毒質體具有用於產生AAV5衣殼或提供AAV基因體載體之核苷酸序列。圖18展示自轉染產生之rBV效價。在培養物中，由初始桿狀病毒質體轉染產生之rBV隨後感染其他Sf9細胞，又產生更多rBV。如圖18中所示，來自經LAH4、LAH5及LAH4-L1-F4轉染之Sf9細胞的rBV效價與來自經對照試劑轉染之Sf9細胞的rBV效價相當。

收集不同rBV且用於進一步感染原始Sf9細胞以產生AAV5衣殼，其中rBV具有用於產生AAV5衣殼之核苷酸序列。使用ddPCR測定效價。如圖19中所示，由經及LAH4-L1-F4轉染之Sf9細胞產生的rBV產生與經對照試劑轉染之Sf9細胞中產生的rBV相當的AAV5衣殼效價。使用LAH4-L1-F4產生之AAV5衣殼具有與使用對照轉染試劑產生之AAV5衣殼相同的VP1衣殼蛋白濃度及衣殼與載體基因體之比率。

為大規模產生AAV5衣殼，將不同體積之Sf9細胞用不同HRP及用於產生AAV5衣殼之桿狀病毒質體轉染。由轉染產生之rBV感染體積為100 L、500 L、750 L、1000 L及2000 L之培養物，從而產生AAV5衣殼。

雖然上文描述示例性實施例，但並不意欲此等實施例描述本發明之所有可能形式。實際上，本說明書中所使用之字詞為描述而非限制之字詞，且應理解，在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可進行各種改變。另外，各種執行實施例之特徵可經組合而形成本發明之另外實施例。

無

圖1揭示在Ambr15微型生物反應器（15毫升（mL）體積）中培養之人類胚胎腎293（HEK293）細胞中產生之Bba41衣殼的效價及不同的富含組胺酸之肽（HRP）及PEIPRO®在轉染之後24及66小時的轉染效率。將細胞用產生Bba41衣殼且提供含有綠色螢光蛋白（GFP）表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。使用微滴式數位聚合酶鏈反應（digital droplet polymerase chain reaction，ddPCR）定量AAV效價。

圖2展示在搖瓶（30 mL工作體積）中當用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後24小時HEK293細胞中之LAH4肽之轉染效率。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖3展示在搖瓶（30 mL工作體積）中在轉染之後24小時HEK293細胞之GFP螢光強度，使用不同LAH4肽濃度及複合體積將該等細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖4展示在搖瓶（30 mL工作體積）中在轉染之後72小時HEK293細胞中產生之Bba41衣殼之效價，使用不同LAH4肽濃度及複合體積將該等細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。使用ddPCR定量AAV效價。

圖5A、5B及5C展示在搖瓶（30 mL工作體積）中HEK293細胞之細胞密度，使用不同LAH4肽濃度及複合體積將該等細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之後0小時、24小時、48小時及72小時評估細胞密度。使用自動化細胞計數器及錐蟲藍排染定量細胞密度。

圖6A、6B及6C展示在搖瓶（30 mL工作體積）中HEK293細胞之存活率，使用不同LAH4肽濃度及複合體積將該等細胞用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之後0小時、24小時、48小時及72小時評估存活率。使用自動化細胞計數器及錐蟲藍排染定量細胞存活率。

圖7揭示在HEK293細胞中產生之Bba41衣殼之效價，該等細胞在搖瓶（30 mL工作體積）中培養，且使用不同HRP及PEIPRO®用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。將不同HRP及PEIPRO®與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用ddPCR定量AAV效價。

圖8A展示在搖瓶（30 mL工作體積）中培養之HEK293細胞中當用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後24小時不同HRP及PEIPRO®之轉染效率。將不同HRP及PEIPRO®與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖8B展示在搖瓶（30 mL工作體積）中培養之HEK293細胞中當用產生Bba41衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後48小時不同HRP之轉染效率。將不同HRP與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖9展示1.6 L搖瓶（500 mL工作體積）中HEK293細胞中產生之AAV9衣殼之效價，使用LAH4肽及PEIPRO®將該等細胞用產生AAV9衣殼且提供含有所關注之基因之AAV基因體載體的質體轉染。使用ddPCR定量AAV效價。

圖10A展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中HEK293細胞中當用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後48小時不同複合體積之LAH4肽之轉染效率。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖10B展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中HEK293細胞中當用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後24小時不同複合體積之LAH4肽之轉染效率。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖10C展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中且使用不同複合體積之LAH4肽用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染的HEK293細胞中產生之AAV9衣殼之效價。使用ddPCR定量AAV效價。

圖10D展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中且使用不同複合體積之LAH4肽用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染的HEK293細胞之存活率。使用自動化細胞計數器及錐蟲藍排染定量細胞存活率。

圖10E展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中HEK293細胞中當用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後48小時LAH4肽之轉染效率，其中將LAH4肽與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖10F展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中HEK293細胞中當用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染時在轉染之後24小時LAH4肽之轉染效率，其中將LAH4肽與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖10G揭示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中當使用LAH4肽用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染至HEK293細胞中時HEK293細胞中產生之AAV9衣殼之效價，其中將LAH4肽與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用ddPCR定量AAV效價。

圖10H展示在Ambr15微型生物反應器（15 mL體積）中且使用LAH4肽用產生AAV9衣殼且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染的HEK293細胞之存活率，其中將LAH4肽與質體混合且培育不同時間，然後轉染。使用自動化細胞計數器及錐蟲藍排染定量細胞存活率。

圖11展示3 L生物反應器中且使用LAH4肽用產生AAV9衣殼且提供含有所關注之基因之AAV基因體載體的質體轉染的HEK293細胞中產生之AAV9衣殼之效價。使用ddPCR定量AAV效價。

圖12展示不同濃度之不同HRP（His-PTD4-LAH4、PTD4-LAH4、LAH4（W）及AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4）的轉染效率。使用不同濃度之不同HRP將96深孔盤之孔（0.5 mL）中之HEK293細胞用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之後24小時，使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖13展示不同濃度之不同HRP（His-PTD4-LAH4-L1-F4、PTD4-LAH4-L1-F4、LAH4-L1-F4（W）、AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4-L1-F4及SV40-T-NLS-間隔子-LAH4-L1-F4）的轉染效率。使用不同濃度之不同HRP將96深孔盤之孔（0.5 mL）中之HEK293細胞用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。在轉染之後24小時，使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖14展示不同濃度之不同HRP（His-PTD4-LAH4、PTD4-LAH4、LAH4（W）及AAV2 VP1-2 BR3-間隔子-LAH4）的AAV9衣殼效價。使用不同濃度之不同HRP將96深孔盤之孔（0.5 mL）中之HEK293細胞用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。預定時間之後，自培養物分離AAV9衣殼且使用ddPCR定量效價。

圖15展示不同濃度之不同HRP（His-PTD4-LAH4-L1-F4、PTD4-LAH4-L1-F4、LAH4-L1-F4（W）及SV40-T-NLS-間隔子-LAH4-L1-F4）的AAV9衣殼效價。使用不同濃度之不同HRP將96深孔盤之孔（0.5 mL）中之HEK293細胞用產生rAAV且提供含有GFP表現卡匣之AAV基因體載體的質體轉染。預定時間之後，自培養物分離AAV9衣殼且使用ddPCR定量效價。

圖16展示大規模（例如，100 L）下使用LAH4肽之HEK293細胞之AAV9衣殼效價。在100 L生物反應器中將HEK293細胞用產生rAAV且提供AAV基因體載體的質體轉染。預定時間之後，自培養物分離AAV9衣殼且使用ddPCR定量AAV效價。

圖17展示當最初使用不同HRP及對照轉染試劑（CELLFECTIN®，Thermo Fisher）用具有GFP表現卡匣之質體轉染時在轉染之後24小時表現GFP之Sf9細胞的百分比。使用流式細胞測量術鑑別表現GFP蛋白之細胞來量測轉染效率。

圖18展示Sf9細胞中藉由使用不同HRP及對照轉染試劑轉染用於產生rAAV之桿狀病毒質體而產生之rBV的效價。

圖19展示經使用來自圖13之HRP及對照轉染試劑產生之rBV及提供具有所關注之基因之AAV基因體載體的rBV感染的Sf9細胞中產生的rAAV之效價。使用ddPCR定量AAV效價。

Claims (57)

1. 一種用於製備重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染，其中在共轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基； 培養該些經轉染之細胞以產生rAAV；及 回收該rAAV。
2. 一種用於製備重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染，其中該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）； 培養該些經轉染之細胞以產生rAAV；及 回收該rAAV。
3. 一種用於製備重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將懸浮於超過500公升（L）之培養物體積中的細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體短暫共轉染； 培養該些經轉染之細胞以產生rAAV；及 回收該rAAV。
4. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用具有異源核苷酸序列之重組桿狀病毒質體轉染，其中在該轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV；及 視情況回收該rBV。
5. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用具有桿狀病毒基因體及異源核苷酸序列之重組桿狀病毒質體轉染，其中該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV；及 視情況回收該rBV。
6. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用異源核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且在該轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV，其中該異源核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
7. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用異源核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV，其中該異源核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
8. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用具有提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列的重組桿狀病毒質體轉染，其中在該轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV；及 視情況回收該rBV。
9. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用具有提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列的重組桿狀病毒質體轉染，其中該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV；及 視情況回收該rBV。
10. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且在該轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV，其中該核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
11. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV，其中該核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
12. 一種製備能夠表現用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之元件之細胞的方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用具有編碼用於產生rAAV之元件之核苷酸序列的載體轉染，其中在該轉染步驟期間該陽離子肽之至少一部分具有α-螺旋構形，其包含安置於該構形之一側上的疏水性胺基酸殘基及安置於該構形之相對側上的極性胺基酸殘基；及 分離具有含有該核苷酸序列之基因體的經轉染之細胞。
13. 一種製備能夠表現用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之元件之細胞的方法，該方法包含以下步驟： 使用轉染試劑將細胞用具有編碼用於產生rAAV之元件之核苷酸序列的載體轉染，其中該轉染試劑包含富含組胺酸之肽（HRP）；及 分離具有含有該核苷酸序列之基因體的經轉染之細胞。
14. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該一種或多種載體共轉染至至少70%之該些細胞中。
15. 如請求項1之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體及該陽離子肽以比該些細胞之培養物體積小10%的體積添加至細胞。
16. 如請求項2或3之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體及該轉染試劑以比該些細胞之培養物體積小10%的體積添加至細胞。
17. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體包含AAV基因體載體、AAV輔助載體及非AAV輔助功能載體。
18. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該些極性胺基酸殘基包含組胺酸殘基。
19. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該些疏水性胺基酸殘基包含丙胺酸殘基。
20. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該些疏水性胺基酸殘基包含白胺酸殘基。
21. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽具有包含在pH 7.4下帶正電荷之胺基酸殘基的N端末端部分。
22. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽具有包含在pH 7.4下帶正電荷之離胺酸或精胺酸殘基的N端末端部分。
23. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽具有包含在pH 7.4下帶正電荷之胺基酸殘基的C端末端部分。
24. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽具有包含在pH 7.4下帶正電荷之離胺酸或精胺酸殘基的C端末端部分。
25. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽包含19個或更多個胺基酸。
26. 如請求項2、5、7、9、11或13之方法，其中該HRP包含19個或更多個胺基酸。
27. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽包含50個或更多個胺基酸。
28. 如請求項2、5、7、9、11或13之方法，其中該HRP包含19個或更多個胺基酸。
29. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽係根據優良藥品製造規範製備。
30. 如請求項1、4、6、8、10或12之方法，其中該陽離子肽係生物可降解的。
31. 如請求項2、5、7、9、11或13之方法，其中該HRP係根據優良藥品製造規範製備。
32. 如請求項2、5、7、9、11或13之方法，其中該HRP係生物可降解的。
33. 如請求項3之方法，其中該轉染試劑係根據優良藥品製造規範製備。
34. 如請求項3之方法，其中該轉染試劑係生物可降解的。
35. 如請求項1、2、3、12或13之方法，其中該些細胞為哺乳動物細胞。
36. 如請求項1、2、3、12或13之方法，其中該些細胞為HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5細胞。
37. 如請求項4至11中任一項之方法，其中該些細胞為來源於草地黏蟲（ Spodoptera frugiperda）、白紋伊蚊（ Aedes albopictus）、家蠶（ Bombyxmori）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）、黑巫婆飛蛾（ Ascalapha odorata）、果蠅（ Drosphila）、瘧蚊屬（ Anophele）、家蚊屬（ Culex）或斑蚊屬（ Aedes）之昆蟲細胞。
38. 如請求項4至11中任一項之方法，其中該些細胞為Sf9、High Five、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5或Ao38細胞。
39. 如請求項1或2之方法，其中該生物反應器具有至少500 L之體積。
40. 如請求項4至11中任一項之方法，其中該些細胞在具有至少250 L之體積的生物反應器中。
41. 如請求項1之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體及該陽離子肽在該共轉染步驟之前混合在一起。
42. 如請求項2之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體及該HRP在該共轉染步驟之前混合在一起。
43. 如請求項3之方法，其中該一種或多種用於產生rAAV之載體及該轉染試劑在該共轉染步驟之前混合在一起。
44. 如請求項4或8之方法，其中該些重組桿狀病毒質體及該陽離子肽在該轉染步驟之前混合在一起。
45. 如請求項5或9之方法，其中該些重組桿狀病毒質體及該HRP在該轉染步驟之前混合在一起。
46. 如請求項8至11中任一項之方法，其中該回收之rBV添加至先前在培養物中未經桿狀病毒感染之細胞中以產生rAAV。
47. 如請求項4至11中任一項之方法，其中該回收步驟包含回收經桿狀病毒感染之昆蟲細胞（BIIC）。
48. 如請求項8至11中任一項之方法，其中該回收步驟包含回收經桿狀病毒感染之昆蟲細胞（BIIC）且將該些回收之BIIC與先前在培養物中未經桿狀病毒感染之細胞一起培養以產生rAAV。
49. 一種用於製備重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用一種或多種用於產生rAAV之載體共轉染，其中該陽離子肽包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列； 培養該些經轉染之細胞以產生rAAV；及 回收該rAAV。
50. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用具有異源核苷酸序列之重組桿狀病毒質體轉染，其中該陽離子肽包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV；及 視情況回收該rBV。
51. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用異源核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且該陽離子肽包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列； 培養該些經轉染之細胞以產生rBV，其中該異源核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
52. 一種製備能夠表現用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之元件之細胞的方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，其中該陽離子肽包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列；及 分離具有含有該核苷酸序列之基因體的經轉染之細胞。
53. 一種製備重組桿狀病毒（rBV）之方法，該方法包含以下步驟： 使用陽離子肽將細胞用提供AAV基因體載體或編碼Rep或Cap蛋白之核苷酸序列轉染，其中該些細胞具有桿狀病毒基因體之至少一部分且該陽離子肽包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列； 培養該等經轉染之細胞以產生rBV，其中該核苷酸序列及該桿狀病毒基因體之至少一部分組合而形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體；及 視情況回收該rBV。
54. 一種陽離子肽，其包含與SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123或124中之任一者至少85%一致的胺基酸序列。
55. 一種組合物，其包含如請求項54之陽離子肽。
56. 一種陽離子肽，其包含SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、121、122、123或124之胺基酸序列。
57. 一種組合物，其包含如請求項56之陽離子肽。

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