TW202140564A - 結合ｉｌ４ｒ的抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供了特異性結合人IL4Rα的分離的單株抗體或其抗原結合部分。本發明還提供了編碼抗體或其抗原結合部分的核酸分子、用於表現抗體或其抗原結合部分的表現載體、宿主細胞和方法。本發明進一步提供了包含抗體或其抗原結合部分的雙特異性分子、溶瘤病毒和藥物組成物，以及使用本發明的抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分進行治療的方法。

Description

結合IL4R的抗體及其用途

相關申請及以引用方式併入：本申請要求2020年2月27日提交的美國臨時申請No.62/982,521的優先權。

上述申請以及本申請引用或其審查程序中的所有文獻(“申請引用的文獻”)、本申請引用或參考的所有文獻(包括但不限於本申請引用的所有文獻、專利、已公開的專利申請)(“本申請引用的文獻”)以及本申請引用的文獻中引用或參考的所有文獻，連同本申請或透過引用併入本申請的任何文獻提及的任何產品的任何製造商的說明、描述、產品規格和產品頁，均透過引用的方式併入，並可以用於本發明的實踐。更具體地，本申請引用的所有參考文獻都以相同程度透過引用的方式併入，就如同各文獻被具體地和單獨地指出透過引用的方式併入本申請一樣。本發明提及的任何Genbank序列均透過引用Genbank序列的方式併入，以此引用日期作為本發明最早生效的申請日。

本發明涉及一種分離的單株抗體，特別涉及一種小鼠、嵌合或人源化單株抗體或其抗原結合部分，其以高親和力和功能性結合人IL4R特別是IL4Rα。本發明還提供了編碼本發明的抗體或其抗原結合部分的核酸分子，用於表現本發明的抗體或其抗原結合部分的表現載體、宿主細胞和方法。本發明進一步提供了包含本發明的抗體或其抗原結合部分的雙特異性分子、免疫綴合物、嵌合抗原受體、溶瘤病毒和藥物組成物，以及使用本發明的抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分進行治療的方法。

2型發炎相關的過敏性疾病，例如異位性皮膚炎、過敏反應、過敏性鼻炎和過敏性哮喘，困擾著全世界超過30億人並且發病率持續上升。根據衛生假說，高發病率的部分原因是隨著生活水平的提高，接觸傳染源的機會減少，使免疫系統對某些原本無害的過敏原更加敏感(Stephen J. Galliet al. , (2008) Nature 454 (7203):445-454)。介白素4 (IL-40)和IL-13是2型免疫中兩個關鍵因子。它們是驅動大多數2型發炎相關的關鍵標誌所必需的，例如，免疫球蛋白E的產生，和先天性細胞在發炎部位的募集(Gruning Get al. , (1998)Science 282:2261-2263; Rankin JAet al ., (1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:7821-7825; Wills-Karp Met al. , (1998)Science 282:2258-2261)。

IL-4和IL-13在人的5號染色體上彼此相鄰，並且共享調控元件。在2型輔助性T細胞(T_H 2)中，觀察到這兩種細胞激素的協調和非協調表現(Katherine Baoet al. , (2015) Cytokine 75(1):25-37)。這兩種細胞激素結合細胞表面受體以調節細胞功能並活化轉錄機制。具體而言，IL-4首先以皮莫耳級親和力與IL-4Rα鏈結合，然後募集IL-2Rγ鏈γc形成I型受體複合物，或募集IL-13Rα1形成II型受體複合物。IL-2Rγ γc和IL-13Rα1的位準或可用性決定了其中哪一個會被募集以形成受體複合物。已經發現，非造血細胞不表現或低度表現IL-2Rγ γc，但高度表現IL-13Rα1，而淋巴細胞則反之。骨髓細胞則介於這兩類細胞之間。II型IL-4受體複合物的形成也可以透過IL-13與IL-13Rα1鏈的結合(以納莫耳級親和力結合)而啟動，並進一步募集IL-4Rα鏈。除了II型IL-4受體外，IL-13還能夠以皮莫耳級親和力結合IL-13Rα2，該受體被認為是誘餌受體(Irina G. Luzinaet al. , (2012)J Leukoc Biol 92 (4):753-764)。IL-4受體複合物一旦形成，細胞內的信號分子就會被活化，其中STAT6和IRS信號轉導會響應I型IL-4受體的活化，而II型IL-4受體則無法顯著活化IRS (Heller NMet al. , (2008)Sci Signal 1 (51):ra17-ra17)。STAT6信號轉導對於T_H 2的細胞分化和IL-4的產生非常重要，而IRS分子能夠活化PI3K和mTOR信號途徑(Gadani SPet al. , (2012)J Immunol 189:4213-4219)。

研究表明，過度的IL-4/IL-13信號轉導可能會引起過敏性疾病，因此一些調節IL-4和IL-13媒介的信號轉導的治療性抗體已被開發。例如，結合IL-13的Leprikizumab、Anrukinzumab和Tralokinumab，和標靶IL-4的Pascolizumab。Dupilumab和Pitrakinra是IL-4Rα拮抗劑，其中Pitrakinra與IL-4Rα結合後會同時阻斷I型和II型IL-4受體(Antoniu SA (2010)Curr Opin Investig Drugs 11:1286-1294)。此外，已發現STAT6抑制劑可以抑制前列腺癌細胞的生長，表明IL-4/IL-13的標靶治療可能有利於癌症治療(Nappo Get al. , (2017)Oncogenesis 2017, 6(5):e342)。因此，需要更多具有更理想治療特性的標靶IL-4、IL-13及其受體(特別是IL-4Rα)的抗體。

發明概述

本發明提供了一種分離的單株抗體，例如小鼠、人、嵌合或人源化單株抗體或其抗原結合部分，其與IL4Rα (例如，人IL4Rα)結合，並且與現有技術中的抗IL4Rα抗體例如Dupilumab相比，具有相當的或更高的人IL4Rα和/或猴IL4Rα結合親和力/能力，以及對IL4Rα-IL4/IL13-IL13Rα1相互作用和相應的胞內信號轉導具有相當的或更高的阻斷活性。

本發明的抗體或其抗原結合部分具有多種用途，包括檢測IL4Rα蛋白，以及治療和預防IL4、IL13或IL4R相關疾病，例如過敏性疾病和癌症。

因此，在一方面，本發明提供了一種分離的單株抗體(例如，小鼠、嵌合或人源化抗體)或其抗原結合部分，所述單株抗體或其抗原結合部分與IL4Rα結合，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含CDR1區、CDR2區和CDR3區，其中CDR1區、CDR2區和CDR3區包含：(1)分別與SEQ ID NOs：1、5和10所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：1、6和11所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：2、7和12所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：3、8和13所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：4、8和13所示的胺基酸序列；或(6)分別與SEQ ID NOs：3、9和14所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。

在一方面，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與SEQ ID NOs：32、33 (X1=W、X2=S；X1=L、X2=A；X1=W、X2=A)、34、38、40、41 (X1=A、X2=K、X3=V、X4=H；X1=V、X2=K、X3=V、X4=H；X1=A、X2=Q、X3=V、X4=H；X1=A、X2=K、X3=M、X4=H；X1=A、X2=K、X3=V、X4=Y；X1=V、X2=K、X3=M、X4=H)、42 (X1=R、X2=A、X3=S、X4=N；X1=K、X2=V、X3=S、X4=N；X1=K、X2=A、X3=T、X4=N；X1=K、X2=A、X3=S、X4=D；X1=R、X2=V、X3=T、X4=N)、43、44、47、49、51或53所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列，其中所述抗體或其抗原結合部分結合IL4Rα。如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列可以由SEQ ID NOs：59或60所示的核苷酸序列編碼。如SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列可以由SEQ ID NOs：65或66所示的核苷酸序列編碼。如SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=A)和41 (X1=V、X2=K、X3=M、X4=H)所示的胺基酸序列可以分別由SEQ ID NOs：61或67所示的核苷酸序列編碼。

在一方面，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分與IL4Rα結合，所述單株抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含CDR1區、CDR2區和CDR3區，其中CDR1區、CDR2區和CDR3區包含：(1)分別與SEQ ID NOs：15、22和26所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：16、22和27所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：17、23和28所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：18、24和29所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：19、24和30所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：20、25和31所示的胺基酸序列；或(7)分別與SEQ ID NOs：21、25和31所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。

在一方面，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含與SEQ ID NOs：35、36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)、37、39、45、46、48、50、52或54所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列，其中所述抗體或其抗原結合部分結合IL4Rα。如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列可以由SEQ ID NOs：62或63所示的核苷酸序列編碼。如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列可以由SEQ ID NOs：68或69所示的核苷酸序列編碼。如SEQ ID NOs：36 (X1=F、X2=V)和46所示的胺基酸序列可以分別由SEQ ID NOs：64或70所示的核苷酸序列編碼。

在一方面，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含CDR1區、CDR2區和CDR3區，其中重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3包含：(1)分別與SEQ ID NOs：1、5、10、15、22和26所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：1、6、11、16、22和27所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：2、7、12、17、23和28所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：3、8、13、18、24和29所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：4、8、13、19、24和30所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：3、9、14、20、25和31所示的胺基酸序列；或(7)分別與SEQ ID NOs：3、9、14、21、25和31所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列，其中所述抗體或其抗原結合部分結合IL4Rα。

在一方面，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含：(1)分別與SEQ ID NOs：32和35所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=S)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=S)和37所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：34和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：34和37所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=L、X2=A)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(7)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=L、X2=A)和37所示的胺基酸序列；(8)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=A)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(9)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=A)和37所示的胺基酸序列；(10)分別與SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列；(11)分別與SEQ ID NOs：40和45所示的胺基酸序列；(12)分別與SEQ ID NOs：41 (X1=A、X2=K、X3=V、X4=H；X1=V、X2=K、X3=V、X4=H；X1=A、X2=Q、X3=V、X4=H；X1=A、X2=K、X3=M、X4=H；X1=A、X2=K、X3=V、X4=Y；X1=V、X2=K、X3=M、X4=H)和46所示的胺基酸序列；(13)分別與SEQ ID NOs：42 (X1=R、X2=A、X3=S、X4=N；X1=K、X2=V、X3=S、X4=N；X1=K、X2=A、X3=T、X4=N；X1=K、X2=A、X3=S、X4=D；X1=R、X2=V、X3=T、X4=N)和46所示的胺基酸序列；(14)分別與SEQ ID NOs：43和46所示的胺基酸序列；(15)分別與SEQ ID NOs：44和46所示的胺基酸序列；(16)分別與SEQ ID NOs：47和48所示的胺基酸序列；(17)分別與SEQ ID NOs：49和50所示的胺基酸序列；(18)分別與SEQ ID NOs：51和52所示的胺基酸序列；或(19)分別與SEQ ID NOs：53和54所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列，其中所述抗體或其抗原結合部分結合IL4Rα。

在一個實施方案中，本發明的分離的單株抗體或其抗原結合部分包含重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈通過二硫鍵連接，所述重鏈包含重鏈可變區和重鏈恆定區，所述輕鏈包含輕鏈可變區和輕鏈恆定區，其中重鏈可變區的C末端連接至重鏈恆定區的N末端，輕鏈可變區的C末端連接至輕鏈恆定區的N末端，其中重鏈可變區和輕鏈可變區包含上述的胺基酸序列，並且所述抗體或其抗原結合部分結合IL4Rα。重鏈恆定區可以是具有如SEQ ID NO：55所示胺基酸序列的人IgG4恆定區，輕鏈恆定區可以是具有如SEQ ID NO：56所示胺基酸序列的人κ恆定區。如SEQ ID NOs：55和56所示的胺基酸序列可以分別由SEQ ID NOs：71和72所示的核苷酸序列編碼。

在一些實施方案中，本發明的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈，或由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中每條重鏈包含上述的重鏈恆定區、上述的重鏈可變區或CDR序列，並且每條輕鏈包含上述的輕鏈恆定區、上述的輕鏈可變區或CDR序列，其中所述抗體結合IL4Rα。本發明的抗體可以是全長抗體，例如IgG1、IgG2或IgG4同種型全長抗體，優選為具有弱ADCC活性的IgG4同種型全長抗體。輕鏈恆定區可以是κ恆定區。在其他實施方案中，本發明的抗體可以是單鏈可變區(scFv)抗體，或抗體片段，例如Fab或F(ab′)₂ 片段。

與現有技術中的抗IL4Rα抗體例如Dupilumab相比，本發明的抗體或其抗原結合部分具有相當的(如果不是更高的話)人IL4Rα和/或猴IL4Rα結合親和力/能力，以及對IL4Rα-IL4/IL13-IL13Rα1相互作用和相應的胞內信號轉導具有相當的(如果不是更高的話)阻斷活性。

本發明還提供了包含本發明的抗體或其抗原結合部分的雙特異性分子，其中所述抗體或其抗原結合部分和與其具有不同結合特異性的第二功能分子(例如，第二抗體)相連接。本發明還提供了包含本發明的抗體或其抗原結合部分的免疫綴合物，例如抗體藥物偶聯物，其中所述抗體或其抗原結合部分與治療劑(例如細胞毒素)相連接。在另一方面，本發明的抗體或其抗原結合部分可以是嵌合抗原受體(CAR)的一部分。本發明還提供了包含嵌合抗原受體的免疫細胞，例如T細胞。本發明的抗體或其抗原結合部分還可以由溶瘤病毒編碼或與溶瘤病毒一起使用。

本發明還提供了組成物，其包含本發明的抗體或其抗原結合部分、免疫綴合物、雙特異性分子、溶瘤病毒、CAR或CAR-T細胞，以及藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，藥物組成物可進一步包含抗過敏劑或抗腫瘤劑。

本發明還提供了包含編碼本發明的抗體或其抗原結合部分的核酸分子，以及包含所述核酸分子的表現載體和包含所述表現載體的宿主細胞。本發明還提供了一種使用包含表現載體的宿主細胞製備抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分的方法，其包括以下步驟：(i)在宿主細胞中表現抗體，和(ii)從宿主細胞或其細胞培養物中分離抗體。

在另一方面，本發明提供了減少IL4/IL13信號轉導的方法。IL4透過包含IL-4Rα和γC的受體轉導信號，而IL13透過包含IL-4Rα和IL13 Rα1的受體轉導信號。IL4/IL13信號轉導的非限制性實例包括B細胞、嗜酸性顆粒細胞、巨噬細胞(例如，活化的巨噬細胞)的活化和/或增殖，纖維母細胞的增殖，和平滑肌的增殖例如氣道平滑肌細胞的增殖。

在另一方面，本發明提供了一種治療與過度的IL4/IL13信號轉導相關的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本發明的抗體或其抗原結合部分。

所述疾病可以是過敏性疾病。所述過敏性疾病可以是異位性皮膚炎、過敏反應、過敏性鼻炎或過敏性哮喘。在一些實施方案中，治療過敏性疾病的方法包括向所述受試者施用本發明的組成物、雙特異性分子、或編碼抗體或帶有抗體的溶瘤病毒，或者能夠在受試者中表現前述相同成分的核酸分子或載體。該方法還包含施用抗過敏劑。所述抗過敏劑可以是抗組織胺藥物、皮質類固醇、β-腎上腺素能受體促效劑、標靶cyc-LTs的藥物或標靶IgE的藥物。

所述疾病可以是腫瘤疾病。所述腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤是前列腺癌。在一些實施方案中，所述方法包括向所述受試者施用本發明的組成物、雙特異性分子、免疫綴合物如抗體藥物偶聯物、CAR-T細胞、或編碼抗體或帶有抗體的溶瘤病毒，或者能夠在受試者中表現前述相同成分的核酸分子或載體。在一些實施方案中，至少一種另外的抗癌抗體可以與本發明的抗體或其抗原結合部分一起施用，例如抗VISTA抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM 3抗體、抗STAT3抗體和/或抗ROR1抗體。在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分可以與細胞激素(例如，IL-2、IL-21和/或GM-CSF)或共刺激抗體(例如，抗CD137和/或抗GITR抗體)一起施用。本發明的抗體可以是例如，小鼠、人、嵌合或人源化抗體。

在另一方面，本發明提供了降低2型免疫反應的方法，其包括向受試者施用治療有效量的本發明的抗體或其抗原結合部分。在一些實施方案中，所述方法包括向所述受試者施用本發明的組成物、雙特異性分子、或編碼抗體或帶有抗體的溶瘤病毒，或者能夠在受試者中表現前述相同成分的核酸分子或載體。

在另一方面，本發明提供了診斷的方法、組成物和套組。在一個實施方案中，本發明的抗體用於確定IL4Rα在細胞或組織中的存在和表現，來確定預後以及合適的治療和隨訪。

基於以下的具體描述與實施例，本發明的其他特徵與優點將變得清晰，具體描述與實施例不應解讀為限制性的。本申請引用的所有文獻、Genbank記錄、專利、以及已公開的專利申請的內容透過引用的方式明確地併入本文中。

發明詳述

為了更好地理解本發明，首先定義一些術語。其他定義則貫穿詳述部分而列出。

術語“IL4Rα”是指介白素4受體α亞基。術語“IL4Rα”包括變體、亞型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情況下，對人IL4Rα蛋白具有特異性的抗體可與人以外的物種(例如猴)的IL4Rα蛋白發生交叉反應。在其他實施方案中，對人IL4Rα蛋白具有特異性的抗體可以對人IL4Rα蛋白完全特異，並且不與其他物種或其他類型的蛋白發生交叉反應，或者可以與來源於某些其他物種但並非所有其他物種的IL4Rα發生交叉反應。

術語“人IL4Rα”是指具有人胺基酸序列的IL4Rα蛋白，例如Genbank登錄號為NP_001244335.1的人IL4Rα的胺基酸序列。術語“食蟹猴IL4Rα”和“狨猴IL4Rα”是指IL4Rα序列，其分別具有例如Genbank登錄號為NOs. EHH60265.1和NP_001244161.1的胺基酸序列。

本文中的術語“抗體”包括全長抗體及其任何抗原結合片段(即，抗原結合部分)或其單鏈。全長抗體是包含兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，重鏈和輕鏈由二硫鍵連接。每條重鏈由重鏈可變區(簡稱V_H )和重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域構成，即C_H1 、C_H2 和C_H3 。每條輕鏈由輕鏈可變區(簡稱V_L )和輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域C_L 構成。V_H 和V_L 區還可以劃分為稱作互補決定區(CDR)的高度變異區，其由較為保守的框架區(FR)區分隔開。每個V_H 和V_L 由三個CDR以及四個FR構成，從胺基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序排布。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括多種免疫系統細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)。

如本文所用，抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)，是指抗體中保留特異性結合抗原(例如，IL4Rα蛋白)能力的一個或多個片段。已證實，抗體的抗原結合功能可以透過全長抗體的片段來實施。涵蓋在抗體的“抗原結合部分”中的結合片段的例子包括：(i) Fab片段，由V_L 、V_H 、C_L 和C_H1 結構域構成的單價片段；(ii) F(ab')₂ 片段，包含在樞紐區透過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由V_H 和C_H1 構成的Fd片段；(iv)由抗體單臂V_L 和V_H 構成的Fv片段；(v)由V_H 構成的dAb片段(Wardet al. , (1989)Nature 341:544-546)；(vi)分離的互補決定區(CDR)；以及(vii)奈米抗體，即一種包含單可變結構域和兩個恆定結構域的重鏈可變區。此外，儘管Fv片段的兩個結構域V_L 和V_H 由不同的基因編碼，它們可以透過重組的方法，使兩者經合成連接子連接成為蛋白單鏈，其中V_L 和V_H 區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Birdet al. , (1988)Science 242:423-426；和Hustonet al. , (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”中。這些抗體片段可以透過本領域技術人員已知的常用技術獲得，且可以透過與全長抗體相同的方式進行功能篩選。

如本文所用，術語“分離的抗體”是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與IL4Rα蛋白特異性結合的分離抗體基本不含特異性結合IL4Rα蛋白以外抗原的抗體)。但是，特異性結合人IL4Rα蛋白的分離抗體可能對其他抗原例如其他物種的IL4Rα蛋白具有交叉反應性。此外，分離的抗體基本不含其他細胞材料和/或化學物質。

本文所用的術語“單株抗體”或“單株抗體組成”是指單一分子組成的抗體分子製品。單株抗體組成呈現出對於特定表位的單一結合特異性和親和力。

如本文所用，術語“小鼠抗體”是指可變區中框架區和CDR區均來自小鼠種系免疫球蛋白序列的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也來自小鼠種系免疫球蛋白序列。本發明的小鼠抗體可以包含不由小鼠種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，透過體外隨機突變或點突變、或透過體內體細胞突變而插入的突變)。但本文所用的術語“小鼠抗體”不包括在小鼠框架區序列中插入來自其他哺乳動物物種的CDR序列的抗體。

術語“嵌合抗體”是指透過組合非人來源的遺傳物質與人來源的遺傳物質而得來的抗體。或者更籠統地說，嵌合抗體是指組合某一物種的遺傳物質與另一物種遺傳物質的抗體。

如本文所用，術語“人源化抗體”是指來源於非人物種但其蛋白序列已經被修改以增加其與人天然抗體的相似度的抗體。

術語“同種型”是指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類(例如IgM或IgG1)。

短語“辨識抗原的抗體”以及“對抗原特異的抗體/對抗原具有特異性的抗體”在本文中與術語“特異性結合抗原的抗體”可互換使用。

如本文所用，“特異性結合人IL4Rα”的抗體是指與人IL4Rα蛋白(還可能是一個或多個非人物種的IL4Rα蛋白)結合但基本不與非IL4Rα蛋白結合的抗體。優選地，抗體以“高親和力”結合人IL4Rα蛋白，即以5.0×10^-8 M或更小，優選為1.0×10^-8 M或更小，更優選為7.0×10^-9 M或更小的K_D 結合人IL4Rα蛋白。

如本文所用，術語“基本不結合”蛋白或細胞是指不與蛋白或細胞結合，或者不以高親和力與其結合，即以1.0×10^-6 M或更大，優選為1.0×10^-5 M或更大，更優選為1.0×10^-4 M或更大，更優選為1.0×10^-3 M或更大，更優選為1.0×10^-2 M或更大的K_D 結合蛋白或細胞。

術語“高親和力”對於IgG抗體而言，是指對於抗原，抗體具有1.0×10^-6 M或更小，優選為5.0×10^-8 M或更小，更優選為1.0×10^-8 M或更小，更優選為7.0×10^-9 M或更小，更優選為1.0×10^-9 M或更小的K_D 。但是對於其他抗體同種型，“高親和力”結合可能有所不同。例如，對於IgM同種型，“高親和力”是指抗體具有1.0×10^-6 M或更小，優選為1.0×10^-7 M或更小，更優選為1.0×10^-8 M或更小的K_D 。

本文所用的術語“K_assoc ”或“K_a ”是指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本文所用的術語“K_dis ”或“K_d ”是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文所用的術語“K_D ”是指解離常數，其為K_d 與K_a 之比(即K_d /K_a )並用莫耳濃度(M)表示。抗體的K_D 值可以使用本領域熟知的方法測定。測定抗體K_D 值的優選方法是使用表面等離子體共振，優選使用生物感測器系統，例如Biacore^TM 系統進行測定。

術語“EC₅₀ ”，又叫半數最大效應濃度，是指在特定暴露時間後，誘導反應達到基線和最大值之間的一半的抗體濃度。

術語“IC₅₀ ”，又叫半數最大抑制濃度，是指相對於不存在抗體時，將特異性生物學或生化功能抑制50%的抗體濃度。

術語“受試者”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類、羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類和爬行類；優選為哺乳動物，例如非人靈長類、羊、狗、貓、牛和馬。

術語“治療有效量”是指足以防止或改善與疾病或病症(例如癌症)相關的症狀，和/或減輕疾病或病症的嚴重性的本發明的抗體的量。應當理解，治療有效量與被治療的疾病相關，其中本領域技術人員可以方便地判別出實際的有效量。

本發明所用的術語“相同性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。兩個序列之間的序列比較和相同性百分比可以透過美國國家生物技術資訊中心網站上的BLASTN/BLASTP算法的默認設置進行測定。

本發明的多個方面在以下更加具體地被描述。

抗 IL4Rα 抗體具有更強的人 IL4Rα 結合親和力以及對 IL4/IL13 信號轉導的阻斷能力

本發明的抗體或其抗原結合部分與人IL4Rα特異性結合，與已報導的抗IL4Rα抗體(如Dupilumab)相比，具有相當的(如果不是更好的話)結合親和力/能力。

本發明的抗體或其抗原結合部分能夠阻斷IL4Rα與IL4或IL13-IL13Rα1的結合，從而阻斷相應的胞內信號轉導，與已報導的抗IL4Rα抗體(如Dupilumab)相比，具有相當的或更高的阻斷活性。

優選地，本發明的抗體是人源化單株抗體。此外，或者，本發明的抗體可以是例如，嵌合單株抗體。

抗 IL4Rα 單株抗體

本發明的抗體是結構和化學特性如下文和實施例中所述的單株抗體。抗體的重/輕鏈可變區的胺基酸序列ID匯總在下表1中，一些抗體具有相同的V_H 或V_L 。抗體的重鏈恆定區可以是具有如SEQ ID NO：55所示胺基酸序列的人IgG4重鏈恆定區，且抗體的輕鏈恆定區可以是具有如SEQ ID NO：56所示胺基酸序列的人κ恆定區。 表1. 重/輕鏈可變區的胺基酸序列ID

抗體ID	VH -CDR1	VH -CDR2	VH -CDR3	VH	VL -CDR1	VL -CDR2	VL -CDR3	VL
C2C1A1A1	1	5	10	32	15	22	26	35
huC2C1A1A1-V1	33, X1=W, X2=S	36, X1=L, X2=I
huC2C1A1A1-V2	33, X1=W, X2=S	37
huC2C1A1A1-V3	33, X1=W, X2=S	36, X1=F, X2=V
huC2C1A1A1-V4	33, X1=W, X2=S	36, X1=F, X2=I
huC2C1A1A1-V5	34	36, X1=L, X2=I
huC2C1A1A1-V6	34	37
huC2C1A1A1-V7	34	36, X1=F, X2=V
huC2C1A1A1-V8	34	36, X1=F, X2=I
huC2C1A1A1-V9	33, X1=L, X2=A	36, X1=L, X2=I
huC2C1A1A1-V10	33, X1=L, X2=A	37
huC2C1A1A1-V11	33, X1=L, X2=A	36, X1=F, X2=V
huC2C1A1A1-V12	33, X1=L, X2=A	36, X1=F, X2=I
huC2C1A1A1-V13	33, X1=W, X2=A	36, X1=L, X2=I
huC2C1A1A1-V14	33, X1=W, X2=A	37
huC2C1A1A1-V15	33, X1=W, X2=A	36, X1=F, X2=V
huC2C1A1A1-V16	33, X1=W, X2=A	36, X1=F, X2=I
C2B2F7B7	1	6	11	38	16	22	27	39
B8G11F2B7G5E8	2	7	12	40	17	23	28	45
huB8G11F2B7G5E8-V1	41, X1=A, X2=K, X3=V, X4=H	46
huB8G11F2B7G5E8-V2	41, X1=V, X2=K, X3=V, X4=H	46
huB8G11F2B7G5E8-V3	41, X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H	46
huB8G11F2B7G5E8-V4	41, X1=A, X2=K, X3=M, X4=H	46
huB8G11F2B7G5E8-V5	42, X1=R, X2=A, X3=S, X4=N	46
huB8G11F2B7G5E8-V6	42, X1=K, X2=V, X3=S, X4=N	46
huB8G11F2B7G5E8-V7	42, X1=K, X2=A, X3=T, X4=N	46
huB8G11F2B7G5E8-V8	2	7	12	42, X1=K, X2=A, X3=S, X4=D	17	23	28	46
huB8G11F2B7G5E8-V9	41, X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y	46
huB8G11F2B7G5E8-V10	42, X1=R, X2=V, X3=T, X4=N	46
huB8G11F2B7G5E8-V11	43	46
huB8G11F2B7G5E8-V13	44	46
huB8G11F2B7G5E8-V14	41, X1=V, X2=K, X3=M, X4=H	46
B8D10G7G6E4	3	8	13	47	18	24	29	48
B9A7C9A4H5	4	8	13	49	19	24	30	50
B9D1D11F8D8	3	9	14	51	20	25	31	52
B1D2F7D3B5	3	9	14	53	21	25	31	54

表1中的重鏈可變區CDRs和輕鏈可變區CDRs已由Kabat編號系統定義。然而，如本領域所熟知的，CDR區也可以基於重/輕鏈可變區序列由其他編號系統例如Chothia、IMGT、AbM或Contact編號系統/方法確定。

與人IL4Rα結合的其他抗IL4Rα抗體的V_H 和V_L 序列(或CDR序列)可以與本發明的抗IL4Rα抗體的V_H 和V_L 序列(或CDR序列)“混合並配對”。優選地，當V_H 和V_L 鏈(或這些鏈中的CDR)混合並配對時，來自特定V_H /V_L 對中的V_H 序列被結構相似的V_H 序列取代。同樣地，優選將來自特定V_H /V_L 對中的V_L 序列替換為結構相似的V_L 序列。

因此，在一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分包括： (a) 重鏈可變區，其包含列於表1中胺基酸序列；和 (b) 輕鏈可變區，其包含列於表1中胺基酸序列，或另一種抗IL4Rα抗體的V_L ，其中所述抗體特異性結合人IL4Rα。

在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分包含： (a) 列於表1中的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3；和 (b) 列於表1中的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3，或另一種抗IL4Rα抗體的CDRs，其中所述抗體特異性結合人IL4Rα。

在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分包括抗IL4Rα抗體的重鏈可變區的CDR2以及其他結合人IL4Rα的抗體的CDRs，例如來自另一抗IL4Rα抗體的重鏈可變區的CDR1和/或CDR3，和/或輕鏈可變區的CDR1、CDR2和/或CDR3。

此外，本領域所熟知的是，不依賴於CDR1和/或CDR2結構域，單獨的CDR3結構域能夠確定抗體對同源抗原的結合特異性，並且基於共同的CDR3序列可以預測性地產生具有相同結合特異性的多種抗體。參見例如，Klimkaet al. ,British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)；Beiboeret al. ,J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)；Raderet al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)；Barbaset al. ,J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)；Barbaset al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)；Ditzelet al. ,J. Immunol. 157:739-749 (1996)；Berezovet al. ,BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001)；Igarashiet al. ,J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995)；Bourgeoiset al. ,J. Virol 72:807-10 (1998)；Leviet al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993)；Polymenis and Stoller,J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)和Xu and Davis,Immunity 13:37-45 (2000)。另參見美國專利NOs. 6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。這些參考文獻均透過引用的方式全部併入本文。

因此，在另一個實施方案中，本發明的抗體包含抗IL4Rα抗體的重鏈可變區的CDR2以及至少抗IL4Rα抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的CDR3，或另一抗IL4Rα抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的CDR3，其中該抗體特異性結合人IL4Rα。這些抗體優選與本發明的抗IL4Rα抗體(a)競爭結合IL4Rα；(b)保留功能特性；(c)結合相同表位；和/或(d)具有相似的結合親和力。在另一個實施方案中，本發明的抗體還可以包含抗IL4Rα抗體的輕鏈可變區的CDR2，或者另一抗IL4Rα抗體的輕鏈可變區的CDR2，其中該抗體特異性結合人IL4Rα。在另一個實施方案中，本發明的抗體還可以包括抗IL4Rα抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的CDR1，或另一抗IL4Rα抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的CDR1，其中該抗體特異性結合人IL4Rα。

保守修飾

在另一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3序列不同於本發明的抗IL4Rα抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述不同是源於一個或多個保守修飾。本領域中應理解，某些保守的序列修飾不會使抗原結合性消失。參見，例如Brummellet al. , (1993)Biochem 32:1180-8；de Wildtet al. , (1997)Prot. Eng. 10:835-41；Komissarovet al. , (1997)J. Biol. Chem. 272:26864-26870；Hallet al. , (1992)J. Immunol. 149:1605-12；Kelley and O'Connell (1993)Biochem. 32:6862-35；Adib-Conquyet al. , (1998)Int. Immunol. 10:341-6和Beerset al. , (2000)Clin. Can. Res. 6:2835-43。

因此，在一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含CDR1、CDR2和CDR3，其中： (a) 重鏈可變區的CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和/或 (b) 重鏈可變區的CDR2包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和/或 (c) 重鏈可變區的CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和/或 (d) 輕鏈可變區的CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和 (e) 該抗體特異性結合人IL4Rα。

本發明的抗體具有一種或多種上述功能特性，例如對人IL4Rα的高親和力以及對IL4Rα-IL4結合或IL4Rα-IL13-IL13Rα1結合的阻斷活性。

在多個實施方案中，抗體可以是例如，小鼠、人、人源化或嵌合抗體。

如本文所用，術語“保守序列修飾”是指不會顯著影響或改變抗體結合特性的胺基酸修飾。這樣的保守修飾包括胺基酸替換、添加和缺失。可以透過本領域已知的標準技術將修飾引入本發明的抗體中，例如點突變和PCR媒介的突變。保守胺基酸替換是指將胺基酸殘基替換為具有相似側鏈的胺基酸殘基。具有相似側鏈的胺基酸殘基組在本領域中已知。這些胺基酸殘基組包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。因此，本發明的抗體的CDR區中的一個或多個胺基酸殘基可以用來自相同側鏈組的其他胺基酸殘基進行替換，且得到的抗體可以使用本發明所述的功能檢測對其進行保留功能(即，上述的功能)測試。

工程化和修飾的抗體

本發明的抗體可以用包含本發明抗IL4Rα抗體的一個或多個V_H /V_L 序列的抗體作為起始材料來工程化產生修飾抗體。抗體可以透過修飾一個或兩個可變區(即，V_H 和/或V_L )內(例如，在一個或多個CDR區和/或一個或多個框架區)的一個或多個殘基來進行工程化修飾。此外，或者，可以對恆定區中的殘基進行修飾，例如改變抗體的效應功能。

在某些實施方案中，CDR移植可以用來修飾抗體的可變區。抗體主要透過位於重鏈和輕鏈的六個互補決定區(CDRs)中的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。因此，CDRs內的胺基酸序列比CDRs外的胺基酸序列在各種抗體之間更加的多樣。因為CDR序列負責主要的抗體-抗原相互作用，可以透過構建這樣的表現載體，其中特定天然抗體的CDR序列移植到具有不同特性的另一抗體的框架區序列，來表現模擬特定天然抗體特性的重組抗體(參見，例如，Riechmannet al. , (1998)Nature 332:323-327；Joneset al. , (1986)Nature 321:522-525；Queenet al. , (1989)Proc. Natl. Acad 。另外參見U.S.A. 86:10029-10033；美國專利NOs.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本發明的另一個實施方案涉及分離的單株抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含本發明上述的CDR1、CDR2和CDR3，所述輕鏈可變區包含本發明上述的CDR1、CDR2和CDR3。儘管這些抗體包含本發明的單株抗體V_H 和V_L 的CDR序列，它們可以含有不同的框架序列。

這樣的框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公開DNA資料庫或發表的參考文獻中獲得。例如，人重鏈可變區基因和人輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在”Vbase”人種系序列資料庫(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabatet al. , (1991)，同上；Tomlinsonet al. , (1992)J. Mol. Biol. 227:776-798；和Coxet al. , (1994)Eur. J. Immunol. 24:827-836文獻中獲得，其內容各以引用的方式明確地併入本文。另一個實施方案中，人重鏈可變區基因和人輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在Genbank資料庫中獲得。例如，下列來自HCo7 HuMAb小鼠的重鏈種系序列的Genbank登錄號為：1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333)、3-33 (NG--0010109 & NT--024637)和3-7 (NG--0010109 & NT--024637)。另一個實施方案中，以下來自HCo12 HuMAb小鼠的重鏈種系序列的Genbank登錄號為：1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333)、5-51 (NG--0010109 & NT--024637)、4-34 (NG--0010109 & NT--024637)、3-30.3 (CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

使用本領域技術人員所熟知的序列相似性搜索方法之一Gapped BLAST (Altschulet al. , (1997)，同上)，將抗體蛋白序列與編譯蛋白序列資料庫進行比較。

本發明所用的抗體框架序列，優選在結構上與本發明的抗體框架序列相似的那些。V_H 的CDR1、CDR2和CDR3序列可以移植到與得到該框架序列的種系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架區中，或者CDR序列可以移植到包含與種系序列相比具有一個或多個突變的框架區中。例如，在某些情況下，將框架區中的殘基進行突變是有益的，可以保持或增強抗體的抗原結合能力(參見例如美國專利NOs.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一類的可變區修飾是將V_H 和/或V_L 的CDR1、CDR2和/或CDR3區內的胺基酸殘基進行突變，從而改進目標抗體的一種或多種結合特性(例如，親和力)。可以透過點突變或PCR媒介的突變插入突變，並且可以透過本領域已知的體外或體內檢測來評估突變對抗體結合或其他功能特性的影響。優選地，引入本領域已知的保守修飾。突變可以是胺基酸替換、添加或缺失，但優選為替換。而且，通常改變一個CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個的殘基。

因此，在另一個實施方案中，本發明提供分離的抗IL4Rα單株抗體或其抗原結合部分，包含重鏈可變區，其包含：(a) V_H CDR1區，其包含本發明的V_H CDR1序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列；(b) V_H CDR2區，其包含本發明的V_H CDR2序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列；(c) V_H CDR3區，其包含本發明的V_H CDR3序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列；(d) V_L CDR1區，其包含本發明的V_L CDR1序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列；(e) V_L CDR2區，其包含本發明的V_L CDR2序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列；和(f) V_L CDR3區，其包含本發明的V_L CDR3序列，或具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸替換、缺失或添加的胺基酸序列。

本發明的工程化抗體包括在V_H 和/或V_L 的框架區殘基中進行修飾以例如改善抗體特性的那些抗體。通常而言，此類框架區修飾可用來降低抗體的免疫原性。例如，將一個或多個框架區殘基“回復突變”成相應的種系序列。更具體地，經歷體細胞突變的抗體可能包含不同於得到該抗體的種系序列的框架殘基。這些殘基可以透過將抗體框架序列與得到該抗體的種系序列相比較而鑑別出來。

另一類的框架區修飾包括對框架區的、或者甚至一個或多個CDR區的一個或多個殘基進行突變，以去除T細胞表位，從而減少抗體可能導致的免疫原性。該方法也稱為“去免疫化”，在美國專利公開NO.20030153043中有更加詳細的描述。

此外，或作為框架區或CDR區修飾之外的另一種選擇，可以對本發明的抗體進行Fc修飾，通常用來改變抗體的一個或多個功能特性，例如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合、和/或抗體依賴的細胞毒性。此外，可以對本發明的抗體進行化學修飾(例如，可以將一個或多個化學功能基團連接至抗體)，或者修飾改變其糖基化，來改變抗體的一個或多個功能特性。

在一個實施方案中，對C_H1 -樞紐區進行修飾，從而改變(例如增加或減少)樞紐區的半胱胺酸殘基的數量。該方法在美國專利No.5,677,425中有具體描述。改變C_H1 -樞紐區的半胱胺酸殘基的數量，例如可以促進重鏈和輕鏈的組裝、或增加/降低抗體的穩定性。

在另一個實施方案中，對抗體的Fc-樞紐區進行突變，以降低抗體的生物半衰期。更具體地，將一個或多個胺基酸突變插入Fc-樞紐片段的C_H2 -C_H3 結構域界面區，使得抗體相對於天然Fc-樞紐結構域，具有減弱的葡萄球菌A蛋白(SpA)結合力。該方法在美國專利No.6,165,745中有更詳細的描述。

在另一個實施方案中，改變抗體的糖基化。例如，可以製備去糖基化的抗體(即，抗體缺少糖基化)。改變糖基化，可以例如增加抗體對抗原的親和力。這樣的糖化修飾可以透過例如改變抗體序列中的一個或多個糖基化位址來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸替換，以消除一個或多個可變區的框架區的糖基化位址，從而消除該位址的糖基化。這樣的去糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。參見，例如美國專利NOs.5,714,350和6,350,861。

此外，或者，可以製備糖基化類型改變的抗體，例如岩藻糖殘基量減少的低岩藻糖基化抗體，或者具有平分型GlcNac結構增加的抗體。已經證明這種糖基化形式的改變能增加或減少抗體的ADCC活性。這樣的糖化修飾可以透過例如在糖基化機制改變的宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制改變的細胞在本領域中已知，且可以用作表現本發明的重組抗體的宿主細胞，以製備糖基化改變的抗體。例如，細胞株Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基轉移酶基因FUT8 (α (1,6)-岩藻糖基轉移酶基因)，從而在Ms704、Ms705和Ms709細胞株中表現的抗體在其糖中缺失岩藻糖。使用兩種替換載體標靶破壞CHO/DG44細胞中的FUT8基因，來製備Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-細胞株(參見美國專利公開No.20040110704和Yamane-Ohnukiet al. , (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作為另一個例子，EP1,176,195記載了FUT8基因功能破壞的細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶，從而使在該細胞株中表現的抗體因減少或消除了α-1,6鍵相關的酶而表現出低岩藻糖基化。EP1,176,195也描述了一種細胞株，其具有較低的或缺乏向結合抗體Fc區的N-乙醯葡萄糖胺添加岩藻糖的酶活性，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。PCT公開WO03/035835描述了一種CHO變體細胞株，Lec13細胞，其具有降低的向Asn (297)-連接的糖上添加岩藻糖的能力，從而導致該宿主細胞中表現的抗體為低岩藻糖基化(另外參見Shieldset al. , (2002)J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。如WO06/089231中所述，也可以在雞蛋中製備糖基化圖譜改變的抗體。或者，可以在植物細胞如Lemna中製備糖基化圖譜改變的抗體。在植物系統中生產抗體的方法披露於美國專利申請中，該專利申請對應於2006年8月11日提交的Alston & Bird LLP代理案卷號040989/314911。可以使用岩藻糖苷酶將抗體的岩藻糖殘基切割，例如，利用α-L-岩藻糖苷酶移除抗體的岩藻糖殘基(Tarentinoet al. , (1975)Biochem. 14:5516-23)。

本發明抗體的另一種修飾是聚乙二醇化(PEG化)。將抗體PEG化，可以例如增加抗體的生物(例如，血清)半衰期。為使抗體PEG化，抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應性酯或醛類衍生物，在使一個或多個PEG基團附於抗體或抗體片段的條件下進行反應。優選地，透過與反應性PEG分子(或類似的有反應性的水溶性聚合物)的醯化反應或烷化反應進行PEG化。本文所用的術語“聚乙二醇”包括用於衍生其他蛋白的任何形式的PEG，例如單(C₁ -C₁₀ )烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施方案中，PEG化的抗體是去糖基化的抗體。PEG化蛋白的方法在本領域是已知的，且可以用於本發明的抗體。參見，例如EP0154316和EP0401384。

抗體的物理特性

本發明的抗體可以用它們的多種物理特性進行表徵，以檢測和/或區分其類別。

例如，抗體可以在輕鏈可變區或重鏈可變區包含一個或多個糖基化位址。這些糖基化位址可能導致抗體免疫原性的增加，或由於抗原結合的改變而引起的抗體pK值的改變(Marshallet al (1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala and Morrison (2004)J Immunol 172:5489-94；Wallicket al (1988)J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekhet al (1985)Nature 316:452-7；Mimuraet al. , (2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化發生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情況下，優選可變區不包含糖基化的抗IL4Rα抗體。可以選擇可變區不包含糖基化基序的抗體或透過突變糖基化區域的殘基來實現。

在優選的實施方案中，抗體不包含天冬醯胺異構位址。天冬醯胺的脫醯胺作用可能發生在N-G或D-G序列，並導致異天冬胺酸殘基的產生，其向多肽框架中引入一個扭結並降低其穩定性(異天冬胺酸作用)。

各抗體具有獨特的等電點(pI)，通常落在6-9.5的pH範圍內。IgG1抗體的pI通常落在7-9.5的pH範圍內，而IgG4抗體的pI基本落在6-8的pH範圍內。推測pI在正常範圍外的抗體在體內可能會發生一些解折疊且不穩定。因此，優選pI值落在正常範圍內的抗IL4Rα抗體。這可以選擇pI在正常範圍內的抗體或透過突變帶電的表面殘基來實現。

編碼本發明的抗體的核酸分子

在另一方面，本發明提供編碼本發明的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區或CDR的核酸分子。核酸可以存在於完整細胞中、細胞裂解液中、或以部分純化或基本上純的形式存在。透過標準技術將核酸從其他細胞組分或其他污染物例如其他細胞核酸或蛋白中純化出來後，核酸是“分離的”或“基本上純的”。本發明的核酸可以是DNA或RNA，且可包含或不包含內含子序列。在優選的實施方案中，核酸是cDNA分子。

本發明的核酸可以透過標準的分子生物學技術獲得。對於由融合瘤(例如，由下文所述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備的融合瘤)表現的抗體，可以透過標準PCR擴增或cDNA轉殖技術獲得編碼融合瘤製備的抗體的輕鏈和重鏈的cDNA。對於從免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)中獲得的抗體，可以從基因文庫中回收編碼這類抗體的核酸。

優選地，本發明的核酸分子包括編碼IL4Rα單株抗體的V_H 和V_L 序列或CDR的那些。一旦獲得了編碼V_H 和V_L 的DNA片段，這些DNA片段可以進一步透過標準重組DNA技術進行操作，例如將可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，將編碼V_H 或V_L 的DNA片段與編碼另一蛋白質的DNA片段例可操作地連接，如採用抗體恆定區或柔性連接子可操作地連接。這種情況下所使用的術語“可操作地連接”是指兩個DNA片段連接在一起，從而使兩個DNA片段編碼的胺基酸序列都在閱讀框內。

將編碼V_H 的DNA與編碼重鏈恆定區(C_H1 、C_H2 和C_H3 )的另一DNA分子可操作地連接，可以將編碼V_H 區的分離的DNA轉變成全長重鏈基因。人重鏈恆定區基因的序列是本領域已知的，且可以透過標準PCR擴增獲得包括人重鏈恆定區基因的DNA片段。重鏈恆定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但是優選為IgG1或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因，可將編碼V_H 區的DNA可操作地連接至僅編碼重鏈C_H1 恆定區的另一DNA分子。

將編碼V_L 的DNA與編碼輕鏈恆定區C_L 的另一DNA分子可操作地連接，可以將編碼V_L 區的分離的DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恆定區基因的序列是本領域已知的，且可以透過標準PCR擴增獲得包括人輕鏈恆定區基因的DNA片段。在優選的實施方案中，輕鏈恆定區是κ或λ恆定區。

為了製備scFv基因，將編碼V_H 和V_L 的DNA片段可操作地連接至編碼柔性連接子例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得V_H 和V_L 序列可以作為連續的單鏈蛋白進行表現，其中V_L 和V_H 區域透過該柔性連接子連接(參見，例如Birdet al. , (1988)Science 242:423-426；Hustonet al. , (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCaffertyet al. , (1990)Nature 348:552-554)。

本發明單株抗體的製備

本發明的單株抗體(mAbs)可以使用本領域熟知的Kohler and Milstein (1975)Nature 256: 495的體細胞雜交(融合瘤)技術進行製備。製備單株抗體的其他實施方案包括B淋巴細胞的病毒或致癌性轉化以及噬菌體展示技術。嵌合或人源化抗體也是本領域熟知的。參見，例如美國專利NOs.4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，其全部內容透過引用的方式明確地併入本文。

製備本發明單株抗體的轉染瘤的生成

本發明的抗體還可以使用例如本領域熟知的重組DNA技術結合基因轉染的方法，在宿主細胞轉染瘤中製備(例如Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。在一個實施方案中，將透過標準分子生物技術得到的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入一個或多個表現載體中，使得基因可操作地連接至轉錄和轉譯調控序列。在這種情況下術語“可操作地連接”是指抗體基因連接到載體中，使得載體內的轉錄和轉譯調控序列行使它們既定的調控抗體基因轉錄和轉譯的功能。

術語“調控序列”包括控制抗體基因轉錄或轉譯的啟動子、增強子和其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這樣的調控序列在例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))中有過描述。優選的用於哺乳動物宿主細胞表現的調控序列包括在哺乳動物細胞中的引導高位準蛋白表現的病毒元件，例如源自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。或者，可以使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。另外，調控元件由不同來源的序列構成，例如SRα啟動子系統，其包含來自SV40早期啟動子的序列和人T細胞白血病病毒1型的長末端重複序列(Takebeet al. , (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。選擇與所使用的表現宿主細胞相容的表現載體和表現調控序列。

抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入到同一或不同的表現載體中。在優選的實施方案中，將可變區插入到已經編碼所需同種型的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表現載體中構建全長抗體基因，使V_H 與載體中的C_H 可操作地連接，V_L 與載體中的C_L 可操作地連接。此外，或者，重組表現載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分泌的訊息胜肽。抗體鏈基因可以轉殖到載體中，使得訊息胜肽在閱讀框內連接到抗體鏈基因的胺基端。訊息胜肽可以是免疫球蛋白訊息胜肽或異源訊息胜肽(即，來自非免疫球蛋白的訊息胜肽)。

為了表現輕鏈和重鏈，透過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表現載體轉染到宿主細胞中。不同形式的“轉染”包括多種常用於將外源DNA導入原核或真核宿主細胞的技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染等。儘管在原核或真核宿主細胞中表現本發明的抗體在理論上是可行的，但抗體優選在真核細胞中表現，最優選在哺乳動物宿主細胞中表現，因為真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝抗體並分泌適當折疊且有免疫活性的抗體。

優選的用於表現本發明的重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括與DHFR選擇性標記物一起使用的dhfr-CHO細胞，在Urlaub and Chasin, (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中有過描述，DHFR選擇性標記物在例如R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982)J. Mol. Biol. 159:601-621中描述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別是在使用NSO骨髓瘤細胞時，另一優選的表現系統是GS基因表現系統，記載於WO87/04462、WO89/01036和EP338,841。當編碼抗體基因的重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞後，透過將宿主細胞培養足以使得抗體在宿主細胞中表現、或優選足以使得使抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中的一段時間，來製備抗體。可以使用標準蛋白純化方法從培養基中回收抗體。

雙特異性分子

另一方面，本發明提供一種雙特異性分子，其包含一種或多種本發明的抗體，所述抗體與至少一個其他功能分子如另一種胜肽或蛋白(例如，另一抗體或受體的配體)相連接，以產生與至少兩個不同結合位址或標靶分子結合的雙特異性分子。因此，本發明所用的“雙特異性分子”包括具有三種或更多種特異性的分子。

在一個實施方案中，除Fc結合特異性和IL4Rα結合特異性外，雙特異性分子還具有第三特異性。

雙特異性分子可以多種形式和尺寸出現。在尺寸譜的一端，雙特異性分子保留了傳統的抗體形式，不同的是兩個結合臂具有不同的特異性而不是具有相同的特異性。在尺寸譜的另一端，雙特異性分子由兩個經胜肽鏈連接的單鏈抗體片段(scFv)構成，即所謂的Bs(scFv)2建構物。中間尺寸的雙特異性分子包括由胜肽類連接子連接的兩個不同的F(ab)片段。這些和其他形式的雙特異性分子可以透過基因改造、體細胞雜交或化學法進行製備。參見，例如See, e.g., Kuferet al , cited supra; Cao and Suresh,Bioconjugate Chemistry , 9 (6), 635-644 (1998)；和van Sprielet al. ,Immunology Today , 21 (8), 391-397 (2000)，以及其中所引用的參考文獻。

免疫綴合物

本發明的抗體可以與治療劑偶聯形成免疫綴合物，例如抗體-藥物偶聯物(ADC)。合適的治療劑包括細胞毒素、烷化劑、DNA小溝結合分子、DNA嵌入劑、DNA交聯劑、組蛋白去乙醯化酶抑制劑、核輸出抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶I或II的抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗生素和抗有絲分裂劑。在ADC中，抗體和治療劑優選地透過可裂解的連接子偶聯，例如胜肽類連接子、二硫類連接子或腙類連接子。更優選的連接子是胜肽類連接子，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以根據美國專利NOs.7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公開WO02/096910；WO07/038,658；WO07/051,081；WO07/059,404；WO08/083,312；和WO08/103,693；美國專利公開NOs.20060024317；20060004081；和20060247295中的描述進行製備，其公開的內容透過引用的方式併入本文。

編碼抗體或帶有抗體的溶瘤病毒

溶瘤病毒偏好地感染並殺滅癌細胞。本發明的抗體可與溶瘤病毒一起使用。或者，可以將編碼本發明抗體的溶瘤病毒引入人體中。

嵌合抗原受體

本發明還提供了包含抗IL4Rα scFv的嵌合抗原受體(CAR)，該抗IL4Rα scFv包含本發明所述的CDR和重/輕鏈可變區。

抗IL4Rα CAR可以包含(a)包含抗IL4Rα scFv的胞外抗原結合結構域；(b)跨膜結構域；(c)胞內信號轉導結構域。

CAR可以在胞外抗原結合結構域的N端包含指導新生受體進入內質網的訊息胜肽，和在胞外抗原結合結構域的N端包含使受體更易於結合的樞紐胜肽。優選地，CAR的胞內信號轉導結構域包括初級胞內信號轉導結構域和一個或多個共刺激信號轉導結構域。常用且最有效的初級胞內信號轉導結構域是CD3-zeta胞質結構域，其包含ITAMs，ITAMs的磷酸化導致T細胞活化。共刺激信號轉導結構域可源自共刺激蛋白，例如CD28、CD137和OX40。

CARs可以進一步添加增強T細胞擴增、持久性和抗腫瘤活性的要素，例如細胞激素和共刺激配體。

本發明還提供了工程化免疫效應細胞，其包含本發明提供的CAR。在一些實施方案中，免疫效應細胞是T細胞、NK細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、造血幹細胞、多能幹細胞或胚胎幹細胞。在一些實施方案中，免疫效應細胞是T細胞。

藥物組成物

在另一方面，本發明提供一種藥物組成物，其包含與藥學上可接受的載體配製在一起的本發明的一種或多種抗體(或抗體的抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒或免疫綴合物)。當組合物包含一種以上抗體(或抗體的抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒或免疫綴合物)時，可以分開施用抗體(或抗體的抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒或免疫綴合物)。藥物組成物可以任選地包含一種或多種其他藥物活性成分，例如另一種抗體或藥物，例如抗腫瘤藥物或抗過敏劑。

藥物組成物可以包含任何數量的賦形劑。可以使用的賦形劑包括載體、表面活性劑、增稠或乳化劑、固體粘合劑、分散或懸浮劑、增溶劑、著色劑、矯味劑、包衣、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、防腐劑、等滲劑及其組合。合適的賦形劑的選擇和使用在Gennaro, ed., Remington:The Science and Practice of Pharmacy , 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)中有教導，其公開的內容透過引用的方式併入本文。

優選地，藥物組成物適合於靜脈內、肌內、皮下、腸道外、脊柱或表皮施用(例如透過注射或輸液)。基於給藥途徑，可以將活性成分包被在材料中，以保護其不受酸和可能使其失活的其他自然條件的影響。本發明所用的短語“腸道外施用”是指除腸內和局部施用以外的施用方式，通常採用注射，包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸液。或者，本發明的抗體可以透過非腸道外途徑施用，例如局部、表皮或粘膜途徑施用，如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部施用。

藥物組成物可以是無菌水溶液或分散液的形式。它們也可以配製在微乳劑、脂質體或其他適於高濃度藥物的有序結構中。

與載體材料一起製備成單一劑量的活性成分的量根據所治療的受試者和特定給藥方式而變化，通常是產生療效的組成物的量。通常，以百分比計算，該量為約0.01%至約99%的，優選為約0.1%至約70%的，最優選為約1%至約30%的與藥學上可接受的載體組合的活性成分。

調整給藥方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單次大劑量，可以隨時間推移施用多個分劑量，或者可以隨治療情況的危急程度按比例降低或提高劑量。特別有利的是，以易於施用和劑量均勻的劑量單位形式配製腸道外施用的組成物。此處所用的劑量單位形式是指適於待治療受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每個單位包含經計算可與所需的藥物載體一起產生所需的治療效果的預定量的活性成分。或者，抗體可以作為緩釋製劑施用，這種情況下所需的施用頻率降低。

對於組成物的施用，劑量可以為約0.0001至100 mg/kg宿主體重，更通常為0.01至5 mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重，或在1-10 mg/kg體重的範圍內。例示性治療方案需要每週給藥一次、每兩周給藥一次、每三周給藥一次、每四周給藥一次、每月給藥一次、每三個月給藥一次或每三到六個月給藥一次。本發明的抗IL4Rα抗體的優選劑量方案包括經靜脈給藥1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，該抗體的給予使用以下給藥方案之一：(i)每四周一次，共6次，然後每三個月一次；(ii)每三週一次；(iii) 3 mg/kg體重一次，然後每三周1 mg/kg體重。在一些方法中，調整劑量以達到約1-1000 µg/mL的血漿抗體濃度，在一些方法中，達到約25-300 µg/ml的血漿抗體濃度。

“治療有效量”的本發明的抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒或免疫綴合物，優選能引起疾病症狀嚴重程度降低、疾病無症狀期頻率和持續時間增加，或預防疾病病痛引起的損傷或殘疾。例如，對於腫瘤受試者的治療，與未治療的受試者相比，“治療有效量”優選為抑制至少約20%、優選為抑制至少約40%，更優選為抑制至少約60%，更優選為抑制至少約80%的腫瘤生長。治療有效量的治療性抗體可以減小腫瘤尺寸，或者減輕受試者的症狀，受試者通常是人或其他哺乳動物。

藥物組成物可以是控釋製劑，包括植入物、經皮貼劑和微膠囊遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。

可以透過下述醫療裝置施用藥物組成物，例如(1)無針皮下注射裝置(例如，美國專利NOs.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量輸液泵(美國專利No.4,487,603)；(3)經皮給藥裝置(美國專利No.4,486,194)；(4)輸液裝置(美國專利NOs.4,447,233和4,447,224)；和(5)滲透裝置(美國專利NOs.4,439,196和4,475,196)，其公開內容透過引用的方式併入本文。

在某些實施方案中，本發明的單株抗體可以經配製，以確保合適的體內分佈。例如，為確保本發明的治療性抗體穿過血腦屏障，可以將抗體配製在脂質體中，該包含抗體的脂質體還可以額外地包含具有標靶功能的基團，以增強對特定細胞或器官的選擇性輸送。參見，例如美國專利NOs.4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V. V. Ranade (1989)J. Clin.Pharmacol. 29:685；Umezawaet al. , (1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038；Bloemanet al ., (1995)FEBS Lett. 357:140；M. Owaiset al. , (1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39:180；Briscoeet al. , (1995)Am. J. Physiol. 1233:134；Schreieret al. , (1994)J. Biol. Chem. 269:9090；Keinanen and Laukkanen (1994)FEBS Lett. 346:123；和Killion and Fidler (1994)Immunomethods 4:273。

本發明的用途和方法

本發明的包含抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒、或免疫綴合物的組成物具有多種體外和體內的用途，涉及例如，過度的IL4和/或IL13信號轉導相關的過敏性疾病的治療。

鑑於本發明的抗IL4Rα抗體具有阻斷IL4Rα與IL4或IL13-IL13Rα1結合以降低2型免疫的能力，本發明提供了治療2型免疫相關的過敏性疾病的方法，包括向受試者施用本發明的組成物。過敏性疾病可以是異位性皮膚炎、過敏反應、過敏性鼻炎或過敏性哮喘。

在另一方面，由於IL4或IL13信號轉導能夠活化STAT6，並且已經發現STAT6抑制劑可以抑制癌細胞生長，本發明提供了一種抑制受試者腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括向受試者施用本發明的組成物，從而抑制受試者中腫瘤的生長。可以透過本發明的抗體治療的腫瘤的非限制性實例包括但不限於黑色素瘤、肺癌、腎癌、前列腺癌、子宮頸癌、結直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌和尿路上皮癌。

在另一方面，本發明提供了一種減少或抑制對IL-4或IL-13反應的細胞活化的方法。在一些實施方案中，抑制活化包括抑制細胞激素的產生或分泌。在一些實施方案中，抑制活化包括抑制增殖。透過活化雜合IL-4Rα/γC受體來反應IL-4的細胞包括但不限於B細胞、嗜酸性顆粒細胞和巨噬細胞。透過活化雜合IL-4Rα/IL-3Rα1受體來反應IL-13的細胞包括但不限於纖維母細胞和平滑肌細胞。因此，在一個實施方案中，本發明提供了抑制平滑肌細胞增殖的方法。在另一個實施方案中，本發明提供了抑制纖維母細胞增殖的方法。

在另一方面，本發明提供了診斷的方法、組成物和套組。在一個實施方案中，本發明的抗體用於確定IL4Rα在細胞或組織中的存在和表現。在一個實施方案中，所述診斷可以指示預後和/或指導治療和/或隨訪。例如，已發現人膀胱癌中IL4Rα的過度表現與疾病的病理等級和階段相關。在一個實施方案中，本發明的抗體用於診斷膀胱癌的等級和階段。已發現IL-4Rα高度表現與口腔癌的發生或復發的增加相關。在一個實施方案中，本發明的抗體可用於口腔癌診斷套組或診斷方法中，來確定預後以及合適的治療和隨訪。腫瘤的IL-4Rα表現與上皮惡性胸膜間皮瘤(MPM)手術切除患者的生存率呈負相關。在一個實施方案中，本發明的抗體可用於診斷套組或診斷方法中，來確定MPM的預後以及合適的治療和/或隨訪。

聯合療法

在一方面，本發明提供了聯合療法，所述聯合療法是將本發明的抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或溶瘤病毒與一種或多種可有效緩解2型免疫相關的過敏性疾病的其他藥物共同施用。所述藥物可以是臨床上用於過敏性鼻炎治療的抗組織胺藥物(標靶H₁ 組胺受體)，或臨床上用於哮喘治療的皮質類固醇、β-腎上腺素能受體促效劑和標靶cyc-LTs的藥物。Omalizumab，一種抗IgE抗體，也可以與本發明的抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或溶瘤病毒一起用於過敏性疾病的治療。在某些實施方案中，受試者是人。

在另一方面，本發明提供了聯合治療的方法，所述方法是將本發明的抗IL4Rα抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子、CAR-T細胞、溶瘤病毒或免疫綴合物與一種或多種可有效抑制受試者腫瘤生長的其他抗體共同施用。在一個實施方案中，本發明提供了一種在受試者中抑制腫瘤生長的方法，其包括向受試者施用抗IL4Rα抗體(或其抗原結合部分、雙特異性分子、溶瘤病毒、CAR-T細胞或免疫綴合物)和一種或多種其他抗體，例如抗OX40抗體、抗TIM-3抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、抗LAG-3抗體、抗PD-L1抗體和抗PD-1抗體。在某些實施方案中，受試者是人。IL4Rα途徑抑制劑還可以進一步聯合癌症的標準治療方法。例如，可以將IL4Rα途徑抑制劑與LAG-3和/或PD-1抑制劑以及化療方案組合。例如，可以將化療藥物與抗IL4Rα抗體一起施用，所述化療藥物可以是細胞毒性藥物。例如，可以向正在接受抗IL4Rα治療的患者施用表柔比星、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶。任選地，抗IL4Rα和一種或多種其他抗體(例如抗LAG-3和/或抗PD-1抗體)的組合可以進一步聯合免疫原性劑，所述免疫原性劑如癌細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、胜肽和糖分子)和經編碼免疫刺激細胞激素的基因轉染的細胞(Heet al. , (2004)J. Immunol. 173:4919-28)。可用的腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑色素瘤抗原胜肽如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪胺酸酶，或經轉染以表現細胞激素GM-CSF的腫瘤細胞。可以與抗IL4Rα抗體聯合的其他療法包括但不限於施用介白素2 (IL-2)、放射、手術或激素阻斷。

本發明討論的治療劑的組合或聯合可以作為在藥學可接受載體中的單一組成物同時施用，或者作為分開的組成物同時施用，其中各藥劑處於藥學可接受載體中。在另一個實施方案中，治療劑的組合可以按序施用。

此外，如果按序進行多次聯合療法施用，則在各時間點的按序施用的次序可以反轉或保持相同，按序施用可以與同時施用或其任何組合相結合。

本發明透過以下實施例進行進一步描述，實施例不應當解讀為限制性的。本申請的所有附圖以及本申請中引用的所有參考文獻、Genebank序列、專利和已公開的專利申請都透過引用的方式明確併入本文。實施例 實施例 1. 使用融合瘤技術產生小鼠抗 IL4Rα 單株抗體

免疫接種

根據E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998中所述的方法免疫小鼠。重組人IL4Rα-his蛋白(Sino biological inc.，產品目錄10402-H08H)作為免疫原，內部製備的人IL4Rα-his蛋白(胺基酸序列如SEQ ID NO：57所示)用於確定抗血清的效價和篩選分泌抗原特異性抗體的融合瘤。初次免疫和加強免疫的免疫劑量均為每隻小鼠每次注射20 µg人IL4Rα-his蛋白。為了增加免疫反應，初次免疫和加強免疫分別使用了完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑(Sigma, St. Louis, Mo., USA)。簡而言之，佐劑-免疫原混合物的製備如下：首先透過渦旋儀將佐劑溫和混合於小瓶中；將所需量的佐劑轉移至高壓滅菌過的1.5 mL微量離心管中；用PBS或鹽水稀釋免疫原至濃度範圍為0.2-0.3 mg/mL；然後將計算量的免疫原與佐劑一起添加到微量離心管中，並溫和渦旋混合2分鐘，使混合物形成油包水型乳液。用合適的注射器吸入佐劑-免疫原乳液進行動物注射。總共以150-200 µL的體積注射了20 µg免疫原。每隻動物免疫後，根據抗血清效價加強免疫2至3次。在細胞融合前，透過腹腔注射對效價較好的動物進行最後一次加強免疫。

融合瘤融合與篩選

在細胞融合之前，培養鼠骨髓瘤細胞株(SP2/0-Ag14, ATCC#CRL-1581)的細胞至對數期。根據Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497 (1975)中所述的方法，無菌取出免疫小鼠的脾細胞，並將其與骨髓瘤細胞融合。隨後將存在於DMEM/20% FCS/HAT培養基中的融合“雜交細胞”加到96孔板中。融合後7至10天，在顯微鏡下觀察到存活的融合瘤細胞集落。兩周後，使用重組人IL4Rα-his蛋白對每個孔的上清液進行ELISA檢測。簡而言之，溶於PBS的人IL4Rα-his蛋白(2.0 µg/mL)以60 µL/孔塗佈於ELISA板中，於4℃培育過夜。用PBST洗滌板4次，然後每孔加入200 μL阻斷緩衝液(含5% w/v脫脂牛奶的PBST)進行阻斷。每孔加入60 µL稀釋的融合瘤上清液，於37℃培育40分鐘。然後洗滌板4次，使用HRP-山羊抗鼠IgG (Jackson Immuno research，產品目錄115-036-071)進行檢測，並在450 nm下檢測結合的OD值。篩選出分泌結合人IL4Rα-his蛋白的抗體的陽性融合瘤，並將其轉移至24孔板中。透過極限稀釋法，對產生具有IL4Rα高特異性結合活性和IL4Rα-IL4或IL4Rα-13Rα1-IL13阻斷活性的抗體的融合瘤選殖株進行次選殖，以確保細胞株的單株性，然後純化單株抗體。簡而言之，以5至10倍管柱體積的PBS緩衝液洗滌蛋白A瓊脂糖管柱(bestchrom (Shanghai) Biosciences，產品目錄AA0273)。使細胞上清液流過蛋白A瓊脂糖管柱，然後用PBS緩衝液洗滌管柱直到蛋白質的吸光度達到基線。用洗提緩衝液(0.1 M甘胺酸-HCl，pH 2.7)洗提管柱，並立即將洗提液收集到1.5 mL管中，用中和緩衝液(1 M Tris-HCl，pH 9.0)中和。合併含免疫球蛋白的部分，並在PBS中於4℃透析過夜。隨後，根據如下所述的方法對純化的單株抗體的體外功能活性進行表徵。實施例 2. 使用 BIACORE 表面等離子共振對小鼠抗 IL4Rα 單株抗體進行親和力測定

透過Biacore T200系統(GE Healthcare，Pittsburgh，PA，USA)對實施例1中純化的抗IL4Rα小鼠單株抗體(mAb)的結合親和力和結合動力學進行表徵。

簡而言之，使用Biacore (GE Healthcare，Pittsburgh，PA，USA)提供的標準胺偶聯套組，透過伯胺基團將山羊抗鼠IgG (GE healthcare，產品目錄BR100838，Mouse Antibody Capture Kit)共價連接至CM5晶片(羧甲基化葡聚糖塗層晶片)上。用乙醇胺阻斷生物感測器表面上未反應的部分。然後，將濃度為66.67 nM的純化的本發明的抗IL4Rα抗體和濃度為10 µg/mL的抗IL4Rα抗體參照品(Dupilumab^® ，也稱為BM)以10 µL/分鐘的流速流過晶片。然後，將HBS EP緩衝液(由Biacore提供)連續稀釋的重組人IL4Rα-his (內部製備，胺基酸序列如SEQ ID NO：57所示)、食蟹猴IL4Rα-his蛋白(Sino biological inc.，產品目錄90897-C08H)、或狨猴IL4Rα-his蛋白(Sino biological inc.定制產品，也稱為cal-IL4Rα-his，胺基酸序列如SEQ ID NO：58所示)以30 µL/min的流速流過晶片。追蹤抗原-抗體結合動力學2分鐘，並追蹤解離動力學10分鐘。使用BIA evaluation軟體將結合和解離曲線擬合至1:1 Langmuir結合模型。測定K_D 、K_a 和K_d 值，並將其匯總在下表2中。 表2. 小鼠抗IL4Rα抗體的結合親和力

小鼠單株抗體ID#	Biacore動力學
人IL4Rα	食蟹猴IL4Rα	狨猴IL4Rα
Ka	Kd	KD	KD	KD
(M-1 s-1 )	(s-1 )	(M)	(M)	(M)
B1D2F7D3B5	4.27E+05	2.66E-04	6.23E-10	*	*
B8G11F2B7G5E8	1.97E+05	2.93E-04	1.49E-09	*	*
B9D1D11F8D8	4.18E+05	2.74E-04	6.55E-10	*	*
C2C1A1A1	2.90E+05	1.16E-05	4.01E-11	*	*
C2B2F7B7	2.51E+05	1.39E-04	5.54E-10	*	*
參照品	2.22E+05	3.77E-05	1.70E-10	*	*

*未檢測。

本發明所有的小鼠抗體均與人IL4Rα特異性結合，其中大多數抗體與參照品相比具有相當的或更高的結合親和力。實施例 3. 小鼠抗 IL4Rα 單株抗體與 IL4Rα 的結合活性

透過捕獲ELISA、流式細胞術(FACS)和間接ELISA測定本發明的小鼠抗IL4Rα抗體與IL4Rα的結合活性。

3.1 捕獲 ELISA

簡而言之，溶於PBS的濃度為2 μg/mL的山羊抗鼠IgG (Fcγ片段特異性)(Jackson Immuno Research，產品目錄115-005-008)以100 µL/孔塗佈在96孔板中，於4℃培育過夜。用洗滌緩衝液(PBS + 0.05% w/v Tween-20，PBST)洗滌板1次，然後加入200 μL/孔的阻斷緩衝液(含5% w/v脫脂牛奶的PBST)，於37℃阻斷2小時。再次洗滌板，每孔加入100 µL連續稀釋(以66.7 nM為起始濃度，在含2.5% w/v脫脂牛奶的PBST中5倍連續稀釋)的本發明的抗IL4Rα抗體、參照品或陰性對照品hIgG (用於靜脈注射的人免疫球蛋白(pH 4)，Hualan Biological Engineering Inc.)，於37℃共培育40分鐘，然後洗滌板4次。在含有捕獲抗IL4Rα抗體的96孔板中加入100 µL/孔的生物素標記的人IL4Rα-his蛋白(SEQ ID NO：57，內部製備，溶於含2.5% w/v脫脂牛奶的PBST中，濃度為0.14 nM)，於37℃共培育40分鐘，洗滌板4次，然後加入100 μL/孔的HRP標記鏈黴親和素(在PBST中以1:10000的比例稀釋，Jackson Immuno Research，產品目錄016-030-084)，於37℃培育40分鐘。最後一次洗滌後，加入100 µL/孔的ELISA底物TMB (Innoreagents，產品目錄TMB-S-002)進行培育。10分鐘後，於25℃加入50 μL/孔的1 M H₂ SO₄ 終止反應，並在450 nm處讀取吸光度值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到EC₅₀ 值。

3.2 基於細胞的結合 FACS

透過流式細胞術(FACS)檢測小鼠抗IL4Rα抗體與表現於293F-IL4Rα細胞表面的IL4Rα的結合活性。簡而言之，用pCMV-T-P質粒建構物轉染293F細胞(Thermofisher Inc.，產品目錄11625019)，該建構物在EcoRI和XbaI之間具有編碼人IL4Rα (uniprot＃P24394-1的第1-825位胺基酸殘基)的核苷酸，並選擇穩定細胞池(命名為293F-IL4Rα)進行後續基於細胞的結合FACS和基於細胞的配體阻斷FACS分析。從細胞培養瓶中收取293F-IL4Rα細胞，洗滌兩次，並重新懸浮於FACS緩衝液(含有2% v/v胎牛血清的磷酸鹽緩衝液(PBS))中。然後，在含有2×10⁵ 個細胞/孔的96孔板中加入100 μL/孔於FACS緩衝液的連續稀釋(以80 nM為起始濃度，4倍連續稀釋)的抗IL4Rα抗體或對照品，冰浴40分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次後，加入100 µL/孔的R-藻紅蛋白標記的親和純化F(ab')₂ 片段化山羊抗鼠IgG (H+L)(在FACS緩衝液中以1:1000的比例稀釋，Jackson Immunoresearch，產品目錄115-116-146)。於4℃避光培育40分鐘後，將細胞洗滌3次後重新懸浮於FACS緩衝液中。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS測量螢光值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到EC50值。

3.3 間接 ELISA

檢測抗IL4Rα抗體與食蟹猴IL4Rα蛋白或cal-IL4Rα-his蛋白的交叉反應。簡而言之，溶於碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)的濃度為2 µg/mL的食蟹猴IL4Rα-his蛋白(Sino biological inc.，產品目錄90897-C08H)或溶於碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)的濃度為0.2 µg/mL cal-IL4Rα-his蛋白(Sino biological inc.定制產品，產品目錄BAX2)以100 µL/孔塗佈在96孔板中，於37℃培育2小時。用洗滌緩衝液(PBS + 0.05% w/v Tween-20，PBST)洗滌板1次，然後加入200 μL/孔的阻斷緩衝液(含5% w/v脫脂牛奶的PBST)，於37℃阻斷2小時。再次洗滌板，每孔加入100 µL連續稀釋的本發明的抗IL4Rα抗體或對照品(0.004-66.7 nM，以66.7 nM為起始濃度，在含2.5% w/v脫脂牛奶的PBST中5倍連續稀釋)，於37℃培育40分鐘。洗滌板4次，然後加入100 µL/孔的過氧化物酶標記的親和純化山羊抗鼠IgG (Fcγ片段特異性)(在PBST緩衝液中以1:5000的比例稀釋，Jackson Immunoresearch，產品目錄115-036-071)，於37℃培育40分鐘。最後一次洗滌後，加入100 µL/孔的TMB (Innoreagents)進行培育。3-10分鐘後，於25℃加入50 μL/孔的1 M H₂ SO₄ 終止反應，並在450 nm處讀取吸光度值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到EC₅₀ 值。

三種測定的結果如表3和圖1A-1C、2A-2D、3所示。

結果顯示，本發明的小鼠抗IL4Rα抗體能夠以高結合力特異性結合人IL4Rα，並且其中一些抗體與猴IL4Rα蛋白的結合活性高於參照品。 表3. 小鼠抗IL4Rα抗體的結合活性

小鼠單株抗體ID#	結合：捕獲ELISA (EC50 , nM)	細胞結合：FACS (EC50 , nM)	食蟹猴IL4Rα交叉反應：間接ELISA (EC50 , nM)	狨猴IL4Rα交叉反應：間接ELISA (EC50 , nM)
B1D2F7D3B5	0.06	0.25	不結合	*
B8G11F2B7G5E8	0.04	0.25	0.29	*
B9D1D11F8D8	0.07	0.22	不結合	*
C2C1A1A1	0.08	0.16	0.33	*
C2B2F7B7	0.13	0.18	108.2	*
參照品	0.05	0.08	0.95	*

*未檢測。實施例 4. 小鼠抗 IL4Rα 抗體對 IL4Rα- 參照品或 IL4Rα-IL4 相互作用的阻斷活性

4.1 配體阻斷 ELISA

透過競爭ELISA測定本發明的抗IL4Rα抗體阻斷IL4-IL4Rα相互作用的能力。簡而言之，溶於PBS的濃度為2 µg/mL的人IL4Rα-his蛋白(SEQ ID NO：57，內部製備)以100 μL/孔塗佈於96孔板中，於4℃培育過夜。第二天，用洗滌緩衝液(PBS + 0.05% w/v Tween-20，PBST)洗滌板，並加入含5% w/v脫脂牛奶的PBST，在37℃中阻斷2小時。然後，用洗滌緩衝液再次洗滌板。

用含2.5% w/v脫脂牛奶的PBST緩衝液連續稀釋抗IL4Rα抗體或對照品(以80 nM為起始濃度，4倍連續稀釋)，並將連續稀釋的抗IL4Rα抗體或對照品以100 μL/孔添加到塗佈有IL4Rα的板中，在37℃下與人IL4Rα-his蛋白共培育40分鐘。用洗滌緩衝液洗滌板4次，然後每孔加入100 μL濃度為0.56 nM的生物素標記的人IL4蛋白(Sino biological inc.，產品目錄11846-HNAE)，於37℃培育40分鐘。再次用洗滌緩衝液洗滌板。然後加入100 μL/孔的HRP標記鏈黴親和素(在PBST緩衝液中以1:10000的比例稀釋，Jackson Immunoresearch，產品目錄016-030-084)，於37℃共培育40分鐘。再次用洗滌緩衝液洗滌板。最後，加入TMB，並用1 M H₂ SO₄ 終止反應，在450 nm處讀取吸光度值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到IC₅₀ 值。

4.2 參照品阻斷 ELISA

透過競爭ELISA測定本發明的抗IL4Rα抗體阻斷參照品-人IL4Rα結合的能力。簡而言之，溶於PBS的濃度為2 µg/mL的參照品以100 µL/孔塗佈於96孔板中，於4℃培育過夜。第二天，用洗滌緩衝液(PBS + 0.05% w/v Tween-20，PBST)洗滌板，並加入含5% w/v脫脂牛奶的PBST，於37℃阻斷2小時。在阻斷96孔板期間，用生物素標記的人IL4Rα-his蛋白(SEQ ID NO：57，內部製備，溶於含2.5% w/v脫脂牛奶的PBST中，濃度為0.55 nM)稀釋本發明的抗IL4Rα抗體或對照品(以100 nM為起始濃度，4倍連續稀釋)，於25℃培育40分鐘。洗滌板之後，將100 μL/孔的抗體/IL4Rα-his混合物加到塗佈有參照品的板中。於37℃培育40分鐘，再用洗滌緩衝液洗滌板。然後向板中加入100 µL/孔的HRP標記鏈黴親和素，於37℃培育40分鐘，以檢測結合到板上的生物素標記的人IL4Rα-his。再次用洗滌緩衝液洗滌板。最後，加入TMB，並用1 M H₂ SO₄ 終止反應，在450 nm處讀取吸光度值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到IC₅₀ 值。

4.3 基於細胞的配體阻斷 FACS

使用上述製備的293F-IL4Rα細胞，利用流式細胞術(FACS)評估抗IL4Rα抗體阻斷IL4蛋白與細胞表面IL4Rα的結合活性。

簡而言之，從細胞培養瓶中收取293F-IL4Rα細胞，洗滌兩次，並重新懸浮於FACS緩衝液(含有2% v/v胎牛血清的PBS)中。然後，在含有1×10⁵ 個細胞/孔的96孔板中加入100 μL/孔溶於FACS緩衝液的連續稀釋(以80 nM為起始濃度，4倍連續稀釋)的抗IL4Rα抗體或對照品，冰浴40分鐘。將板用FACS緩衝液洗滌兩次後，每孔加入100 μL濃度為1.67 nM的生物素標記的人IL4蛋白(Sino biological inc.，產品目錄11846-HNAE)，於4℃避光培育40分鐘。用FACS緩衝液洗滌板兩次後，每孔加入100 μL R-藻紅蛋白標記鏈黴親和素(用FACS緩衝液以1:500的比例稀釋，Jackson Immunoresearch，產品目錄016-110-084)，於4℃避光培育40分鐘。將細胞洗滌兩次後，重新懸浮於FACS緩衝液中。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS測定螢光值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到IC₅₀ 值。

三種測定的結果如表4和圖4A-4B、5A-5B、6A-6C所示。

如表4和圖4A-4B所示，本發明所有的抗IL4Rα抗體均能以與參照品相當的阻斷活性阻斷人IL4-人IL4Rα相互作用。

圖5A和5B顯示，本發明的一些抗體能夠阻斷人IL4Rα-參照品的結合，表明他們結合的表位可能與參照品結合的表位相同或相似。

此外，如表4和圖6A-6C所示，所有抗IL4Rα抗體均能夠阻斷IL4與細胞表面IL4Rα的結合，並且其阻斷能力與參照品非常接近(儘管其IC₅₀ 值略高於參照品)。 表4. 抗IL4Rα抗體對參照品-IL4Rα或IL4-IL4Rα結合的阻斷活性

小鼠單株抗體	競爭ELISA (IC50 , nM)	基於細胞的測定 (IC50 , nM)
IL4-IL4Rα	IL4Rα-參照品	基於細胞的配體阻斷FACS
B1D2F7D3B5	1.80	0.02	0.78
B8G11F2B7G5E8	0.81	0.02	0.80
B9D1D11F8D8	2.88	0.02	0.75
C2C1A1A1	0.81	0.04	0.44
C2B2F7B7	0.73	0.72	0.40
參照品	0.68	0.02	0.22

實施例 5. 小鼠抗 IL4Rα 抗體基於細胞的功能測定

IL4和IL13能夠與IL4Rα結合並誘導HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中的STAT6磷酸化。STAT6磷酸化在IL4/IL13信號途徑中至關重要。

簡而言之，用pcDNA3.1-Puro (YouBio biological inc.，產品目錄VT9222)質粒建構物(在BamHI和XhoI之間具有編碼人IL4Rα的核苷酸)、STAT6質粒(Sino biological inc.，產品目錄HG13190-NH)(在KpnI和XbaI之間具有編碼人STAT6的核苷酸)、和STAT6螢光素酶報告基因質粒STAT6-Luc(Yeasen biological inc.，產品目錄11588ES03)穩定轉染天然表現IL13Rα1的HEK293T細胞(ATCC CRL-11268)，在內部製備HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞。然後選擇單細胞選殖株LB2進行所有後續的功能測定。

檢測本發明的抗IL4Rα抗體對IL4和IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制作用。

簡而言之，將對數期的HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞重新懸浮於培養基(RPMI1640+10% FBS)中，以100 μL/孔接種到96孔板中，每孔含5×10⁵ 個細胞。然後，每孔加入50 μL連續稀釋的抗IL4Rα抗體或對照品(包括內部製備的抗CD22抗體)(以100 nM為起始濃度，5倍連續稀釋)，並於37℃培育30分鐘。然後每孔加入50 μL IL4蛋白(600 pg/mL，Sino biological inc.，產品目錄11846-HNAE)或IL13蛋白(50 ng/mL，Sino biological inc.，產品目錄10369-HNAC)，於37℃培育20分鐘。將板離心並用染色緩衝液(內部製備，DPBS+0.5% w/v BSA+2 mM EDTA)洗滌板兩次，然後每孔加入50 µL固定緩衝液(BD biosciences inc.，產品目錄5545655)，於4℃培育30 分鐘。將細胞洗滌兩次，每孔加入200 μL透化緩衝液(BD biosciences inc.，目錄號558050)，冰浴30分鐘。用染色緩衝液將板洗滌3次。然後加入抗pSTAT6抗體(pSTAT6儲備液稀釋20倍，BD biosciences inc.，產品目錄562079)，於冰上靜置60分鐘。最後將板洗滌兩次，並重新懸浮於染色緩衝液中。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS測量螢光值。使用Graphpad Prism軟體分析數據，並得到IC₅₀ 值。

結果如表5和圖7、8所示。

結果顯示，所有抗IL4Rα抗體均能以與參照品相當的或更高的阻斷活性，阻斷HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL4或IL13誘導的STAT6磷酸化。 表5. 抗IL4Rα抗體的功能測定結果

小鼠單株抗體ID#	對IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制 (IC50 , nM)	對IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制 (IC50 , nM)
B1D2F7D3B5	0.17	0.48
B8G11F2B7G5E8	0.23	0.47
B9D1D11F8D8	0.23	0.36
C2C1A1A1	0.16	0.23
C2B2F7B7	0.17	0.31
參照品	0.28	0.53

實施例 6. 嵌合抗體的產生和表徵

對抗IL4Rα小鼠單株抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區進行了定序，序列ID匯總在表1中。

將抗IL4Rα小鼠單株抗體C2C1A1A1和B8G11F2B7G5E8的重鏈可變區和輕鏈可變區分別轉殖至含人IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：55)的載體和含人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：56)的載體中，其中可變區的C末端與相應恆定區的N末端相連。

包含編碼連接至人IgG4重鏈恆定區的重鏈可變區的核苷酸的載體，和包含編碼連接至人κ輕鏈恆定區的輕鏈可變區的核苷酸的載體，按60%:40%的輕鏈建構物：重鏈建構物的比例，用1 mg/mL PEI瞬時轉染至50 mL 293F懸浮細胞中。

在搖瓶中培養六天後收取細胞上清液，透過離心沉澱上清液中的細胞，並透過0.22 µm濾器過濾以進行免疫球蛋白分離。嵌合抗體透過蛋白A親和層析進行純化。簡而言之，以5至10倍管柱體積的PBS緩衝液洗滌蛋白A瓊脂糖管柱(bestchrom (Shanghai) Biosciences，產品目錄AA0273)。使細胞上清液流過蛋白A瓊脂糖管柱，然後用PBS緩衝液洗滌管柱直到蛋白質的吸光度達到基線。用洗提緩衝液(0.1 M甘胺酸-HCl，pH 2.7)洗提管柱，並立即將洗提液收集到1.5 mL管中，用中和緩衝液(1 M Tris-HCl，pH 9.0)中和。合併含免疫球蛋白的部分，並在PBS中於4℃透析過夜。

按照前述實施例中的方案(對其進行了如下所述的小幅修改)，透過捕獲ELISA、競爭ELISA、BIAcore親和力測定、基於細胞的結合FACS測定和基於細胞的功能測定檢測純化的抗體。

對於捕獲ELISA，用2 μg/mL山羊抗人IgG (親和純化的山羊抗人IgG，Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-005-098)替代山羊抗鼠IgG (Fcγ片段特異性)，100 µL/孔。

對於間接ELISA，用過氧化物酶標記的親和純化F(ab')₂ 片段化山羊抗人IgG (Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-036-098)替代過氧化物酶標記的親和純化山羊抗鼠IgG (Fcγ片段特異性)，100 µL/孔。

對於BIAcore，用山羊抗人IgG (GE healthcare，產品目錄BR100839，Human Antibody Capture Kit)替代山羊抗鼠IgG，共價連接至CM5晶片。

對於基於細胞的結合FACS，用R-藻紅蛋白標記的親和純化山羊抗人IgG (Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-115-098)替代R-藻紅蛋白標記的親和純化F(ab')₂ 片段化山羊抗鼠IgG (H+L)，在FACS緩衝液中以1:1000的比例稀釋，100 µL/孔。

結果如表6和圖9-13所示。數據表明，嵌合抗體與其親本小鼠抗體具有相似的結合親和力/能力和阻斷活性。 表6. 嵌合抗體的結合和功能活性

單株抗體ID#	對人IL4R的捕獲ELISA (EC50 , nM)	對人IL4R的BIAcore親和力 (KD , M)	基於細胞的結合FACS (EC50 , nM)	IL4-IL4Rα阻斷ELISA (IC50 , nM)	基於細胞的功能測定
對IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制 (IC50 , nM)	對IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制(IC50 , nM)
小鼠抗體 B8G11F2B7G5E8	0.14	2.976E-9	0.41	1.64	0.26	0.60
嵌合抗體 B8G11F2B7G5E8	0.27	2.987E-9	0.78	1.82	0.26	0.76
小鼠抗體 C2C1A1A1	0.03	1.195E-10	0.31	1.89	0.19	0.27
嵌合抗體 C2C1A1A1	0.05	5.219E-10	0.63	3.12	0.27	0.56
參照品	0.05	4.656E-10	0.46	2.06	0.37	0.48

實施例 7. 抗 IL4Rα 單株抗體 B8G11F2B7G5E8 和 C2C1A1A1 的人源化

對小鼠抗IL4Rα抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1進行人源化並進行進一步表徵。小鼠抗體的人源化是使用已建立的CDR移植方法進行的，如下所述。

為了選擇用於小鼠抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1人源化的接受體框架，將各個小鼠抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的序列與人免疫球蛋白基因資料庫進行BLAST。選擇具有最高同源性的人種系抗體作為用於人源化的接受體框架。將小鼠抗體重/輕鏈可變區CDRs插入到選出的框架中，並進一步回復突變框架中的殘基以獲得更多候選的重/輕鏈可變區。總共獲得13個例示性人源化B8G11F2B7G5E8抗體，即huB8G11F2B7G5E8-V1至huB8G11F2B7G5E8-V11、huB8G11F2B7G5E8-V13和huB8G11F2B7G5E8-V14，以及16個例示性人源化C2C1A1A1抗體，即huC2C1A1A1-V1至huC2C1A1A1-V16，其重/輕鏈可變區序列ID如表1中所示。

包含編碼連接至人IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：55)的人源化重鏈可變區的核苷酸的載體，和包含編碼連接至人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：56)的人源化輕鏈可變區的核苷酸的載體，按60%：40%的輕鏈建構物：重鏈建構物的比例，用1 mg/mL PEI瞬時轉染至50 mL 293F懸浮細胞中。

在搖瓶中培養六天後收取細胞上清液，透過離心沉澱上清液中的細胞，並通過0.22 µm濾器過濾以進行免疫球蛋白分離。抗體透過蛋白A親和層析進行純化。簡而言之，以5至10倍管柱體積的PBS緩衝液洗滌蛋白A瓊脂糖管柱(bestchrom (Shanghai) Biosciences，產品目錄AA0273)。使細胞上清液流過蛋白A瓊脂糖管柱，然後用PBS緩衝液洗滌管柱直到蛋白質的吸光度達到基線。用洗提緩衝液(0.1 M甘胺酸-HCl，pH 2.7)洗提管柱，並立即將洗提液收集到1.5 mL管中，用中和緩衝液(1 M Tris-HCl，pH 9.0)中和。合併含免疫球蛋白的部分，並在PBS中於4℃透析過夜。實施例 8. 人源化抗體的表徵 表7. 人源化B8G11F2B7G5E8單株抗體的結合親和力

單株抗體	BIAcore動力學
人IL4Rα
Ka	Kd	KD
(1/Ms)	(s-1)	(M)
嵌合抗體B8G11F2B7G5E8	5.29E+05	0.001426	2.69E-09
huB8G11F2B7G5E8-V1	5.57E+05	0.002079	3.73E-09
huB8G11F2B7G5E8-V2	5.21E+05	0.001616	3.10E-09
huB8G11F2B7G5E8-V3	5.58E+05	0.001991	3.57E-09
huB8G11F2B7G5E8-V4	5.77E+05	0.001851	3.21E-09
huB8G11F2B7G5E8-V5	5.84E+05	0.002414	4.13E-09
huB8G11F2B7G5E8-V6	5.54E+05	0.002188	3.95E-09
huB8G11F2B7G5E8-V7	5.92E+05	0.002219	3.75E-09
huB8G11F2B7G5E8-V8	5.78E+05	0.002827	4.89E-09
huB8G11F2B7G5E8-V9	6.21E+05	0.003305	5.32E-09
huB8G11F2B7G5E8-V10	5.85E+05	0.002803	4.79E-09
huB8G11F2B7G5E8-V11	1.65E+09	24.57	1.49E-08
參照品	7.42E+05	3.30E-04	4.44E-10
嵌合抗體 B8G11F2B7G5E8	3.06E+05	0.001124	3.68E-09
huB8G11F2B7G5E8-V13	3.10E+05	0.0012	3.87E-09
huB8G11F2B7G5E8-V14	3.06E+05	0.001129	3.69E-09

按照前述實施例中的方案，通過BIAcore技術評估了人源化抗體對人IL4Rα的結合親和力。測定K_a ，K_d 和K_D 值，並將其匯總在表7和8中。 表8. 人源化C2C1A1A1單株抗體的結合親和力

單株抗體	BIAcore動力學
人IL4Rα
Ka (1/Ms)	Kd (1/s)	KD (M)	Start (RU)	End (RU)	解離%
嵌合抗體 C2C1A1A1	3.29E+05	＜1.00E-05	＜3.04E-11	67.1	65.8	-1.94%
含嵌合抗體C2C1A1A1的上清液	3.64E+05	4.04E-05	1.11E-10	40	40.4	1.00%
huC2C1A1A1-V1	1.29E+05	＜1.00E-05	＜7.73E-11	43.9	44	0.23%
huC2C1A1A1-V2	2.26E+05	＜1.00E-05	＜4.42E-11	50.4	50.3	-0.20%
huC2C1A1A1-V3	2.57E+05	＜1.00E-05	＜3.89E-11	48.6	48.3	-0.62%
huC2C1A1A1-V4	4.55E+05	＜1.00E-05	＜2.20E-11	49.5	49.6	0.20%
huC2C1A1A1-V5	2.65E+06	7.50E-05	2.83E-11	65.8	64.3	-2.28%
huC2C1A1A1-V6	3.83E+05	＜1.00E-05	＜2.61E-11	50.9	50.6	-0.59%
huC2C1A1A1-V7	2.63E+05	＜1.00E-05	＜3.80E-11	60.5	60.1	-0.66%
huC2C1A1A1-V8	2.78E+05	＜1.00E-05	＜3.60E-11	65.2	64.4	-1.23%
huC2C1A1A1-V9	1.97E+05	＜1.00E-05	＜5.07E-11	41.2	41.1	-0.24%
huC2C1A1A1-V10	3.29E+05	＜1.00E-05	＜3.04E-11	64.9	63.9	-1.54%
huC2C1A1A1-V11	3.30E+05	＜1.00E-05	＜3.03E-11	54.2	53.7	-0.92%
huC2C1A1A1-V12	3.02E+05	1.42E-05	4.70E-11	53.1	52.1	-1.88%
huC2C1A1A1-V13	1.193E+05	＜1.00E-05	＜8.38E-11	36.4	36.7	0.82%
huC2C1A1A1-V14	1.53E+05	＜1.00E-05	＜6.54E-11	50.1	50.5	0.80%
huC2C1A1A1-V15	2.30E+05	＜1.00E-05	＜4.35E-11	69	69.2	0.29%
huC2C1A1A1-V16	2.96E+05	＜1.00E-05	＜3.38E-11	47.3	47.1	-0.42%
參照品	3.33E+05	6.25E-05	1.88E-10	71.9	70	-2.64%

解離%=( End (RU)- Start (RU))/ Start (RU)

結果表明，人源化抗體與嵌合抗體具有相似的人IL4Rα結合親和力，並且與參照品相比，所有的人源化huC2C1A1A1抗體均顯示出更高的人IL4Rα結合親和力。

按照前述實施例中的方案(對其進行了如下所述的小幅修改)，透過Biacore、捕獲ELISA、間接ELISA、基於細胞的結合FACS、競爭ELISA和基於細胞的功能測定，對人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4、huB8G11 F2B7G5E8-V14、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15進行了進一步檢測。

對於捕獲ELISA，用2 μg/mL山羊抗人IgG (親和純化的山羊抗人IgG，Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-005-098)替代山羊抗鼠IgG (Fcγ片段特異性)，100 µL/孔。

對於間接ELISA，用過氧化物酶標記的親和純化F(ab')₂ 片段化山羊抗人IgG (Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-036-098)替代過氧化物酶標記的親和純化山羊抗鼠IgG(Fcγ片段特異性)，100 µL/孔。

對於BIAcore，用山羊抗人IgG (GE healthcare，產品目錄BR100838，Human Antibody Capture Kit)替代山羊抗鼠IgG，共價連接至CM5晶片。

對於基於細胞的結合FACS，用R-藻紅蛋白標記的親和純化山羊抗人IgG (Fcγ片段特異性，Jackson Immunoresearch，產品目錄109-115-098)替代R-藻紅蛋白標記的親和純化F(ab')₂ 片段化山羊抗鼠IgG (H+L)在FACS緩衝液中以1:1000的比例稀釋，100 µL/孔。

還檢測了人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V14和huC2C1A1A1-V15的熱穩定性。簡而言之，使用GloMelt^TM Thermal Shift Protein Stability Kit (Biotium，產品目錄33022-T，批號181214)，透過蛋白質熱位移測定法測定Tm (熔解溫度)。簡而言之，將GloMelt^TM 染料解凍至室溫。將含有染料的小瓶渦旋並離心。然後，將5 µL 200×染料添加至95 µL PBS中製備10×染料。反應體系中加入2 µL 10×染料和10 µg人源化抗體，並添加PBS至總反應體積為20 µL。將含有染料和抗體的離心管短暫離心，並置於實時PCR熱循環儀(Roche，LightCycler 480 II)中，該熱循環儀中Melt Curve程序使用表9中的參數進行設置。 表9. Melt Curve程序的參數

Profile步驟	溫度	升溫速率	持續時間
Initial hold	25°C	NA	30 s
Melt curve	25-99°C	0.1°C/s	NA

結果如表10-1至10-3和圖14A-14B至22所示。 表10-1. 人源化單株抗體的結合活性和功能活性

單株抗體ID#	結合測定
人IL4Rα-his	食蟹猴IL4Rα-his
捕獲ELISA (EC50 , nM)	Biacore (KD , M)	細胞結合FACS (EC50 , nM)	Biacore (KD , M)	間接ELISA (EC50 , nM)
嵌合抗體 C2C1A1A1	0.05	3.88E-10	0.33	弱結合	0.60
huC2C1A1A1-V15	0.05	4.47E-10	0.31	弱結合	0.52
huC2C1A1A1-V14	0.06	6.42E-10	0.39	弱結合	0.68
參照品	0.05	7.46E-10	0.40	未結合	0.67
小鼠抗體B8G11F2B7G5E8	0.21	*	0.33	*	0.50
嵌合抗體B8G11F2B7G5E8	0.32	3.23E-09	0.44	弱結合	1.06
huB8G11F2B7G5E8-V14	0.24	3.88E-09	0.52	弱結合	137.4
huB8G11F2B7G5E8-V2	0.27	4.10E-09	0.43	弱結合	914.1
huB8G11F2B7G5E8-V4	0.27	5.50E-09	0.41	弱結合	7.12
參照品	0.05	7.46E-10	0.53	未結合	3.34

*未檢測。 表10-2. 人源化單株抗體的結合活性和功能活性

單株抗體ID#	結合測定	競爭ELISA	IL4-IL4Rα阻斷FACS (IC50 , nM)
狨猴IL4Rα-his	IL4-IL4Rα阻斷ELISA (IC50 , nM)	參照品阻斷ELISA (IC50 , nM)
Biacore (KD , M)	間接ELISA (EC50 , nM)
嵌合抗體 C2C1A1A1	弱結合	0.62	2.46	0.17	0.48
huC2C1A1A1-V15	弱結合	0.41	2.03	0.16	0.50
huC2C1A1A1-V14	弱結合	0.55	2.17	0.17	0.58
參照品	未結合	1.72	1.74	0.19	0.42
小鼠抗體B8G11F2B7G5E8	*	0.87	1.00	*	0.50
嵌合抗體B8G11F2B7G5E8	弱結合	1.01	1.42	1.52	0.36
huB8G11F2B7G5E8-V14	弱結合	1.06	1.02	0.76	0.60
huB8G11F2B7G5E8-V2	弱結合	0.80	1.00	1.20	0.54
huB8G11F2B7G5E8-V4	弱結合	0.73	0.82	1.24	0.51
參照品	未結合	1.84	1.56	0.13	0.51

*未檢測。 10-3. 人源化單株抗體的結合活性和功能活性

單株抗體ID#	基於細胞的功能測定 (IC50 , nM)	Tm (熔解溫度) ℃
對IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制	對IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制	Tm1	Tm2
chC2C1A1A1	0.26	0.39	*	*
huC2C1A1A1-V15	0.61	0.60	NA	72.0
huC2C1A1A1-V14	0.64	0.73	65.5	74.0
參照品	0.70	0.84	*	*
mAb B8G11F2B7G5E8	*	*	*	*
chB8G11F2B7G5E8	0.45	0.50	*	*
huB8G11F2B7G5E8-V14	0.26	0.66	65.5	80.5
huB8G11F2B7G5E8-V2	0.40	0.63	65.0	80.0
huB8G11F2B7G5E8-V4	0.30	0.81	65.0	80.0
參照品	0.70	0.84	*	*

*未檢測。

數據顯示，與參照品相比，人源化C2C1A1A1抗體顯示出相當的(如果不是更好的話)人IL4Rα結合親和力/活性和對IL4Rα-IL4/IL13的阻斷能力，而人源化B8G11F2B7G5E8抗體對IL4/IL13-IL13Rα1-IL4Rα相互作用明顯具有更好的阻斷能力。

儘管本發明已結合一個或多個實施方案進行了描述，應當理解的是，本發明不僅涵蓋這些實施方案，還意在涵蓋包括在所附請求項的精神和範圍內的所有可替代、修飾和等同物。本文引用的所有文獻均透過引用的方式全部併入本文。

本申請的序列資訊總結於下表。

描述 序列/ SEQ ID NO.

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VH-CDR1 TYGMS (SEQ ID NO:1)

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VH-CDR2 TINSNGGSTSYPDSVKG (SEQ ID NO:5)

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VH-CDR3 FFRFRNAMDY (SEQ ID NO:10)

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VL-CDR1 RTSENIYSYLA (SEQ ID NO:15)

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VL-CDR2 NAKTLAE (SEQ ID NO:22)

小鼠、嵌合和人源化C2C1A1A1的VL-CDR3 QHYYGPPTWT (SEQ ID NO:26)

小鼠和嵌合C2C1A1A1的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWVRQTPDKRLELVATINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCARFFRFRNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:32) 小鼠C2C1A1A1的VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACTTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAACCATTAATAGTAATGGTGGTAGTACCAGTTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTTTTACTGTGCAAGATTTTTCCGCTTTAGGAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:59) 嵌合C2C1A1A1的VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACATACGGCATGTCCTGGGTGAGACAGACCCCTGATAAGAGACTGGAGCTGGTGGCCACCATCAACAGCAACGGCGGCAGCACCAGCTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGTCCAGCCTGAAGAGCGAGGATACAGCCATGTTCTACTGTGCCAGGTTCTTTAGGTTCAGAAATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACAGTGAGCAGC (SEQ ID NO:60)

huC2C1A1A1-V1至huC2C1A1A1-V4的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVX1VX2TINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) X1=W, X2=S EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVWVSTINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS

huC2C1A1A1-V5至huC2C1A1A1-V8的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQSPDKRLEWVSTINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMRSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:34)

huC2C1A1A1-V9至huC2C1A1A1-V12的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVX1VX2TINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) X1=L, X2=A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVLVATINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS

huC2C1A1A1-V13至huC2C1A1A1-V16的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVX1VX2TINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) X1=W, X2=A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLVWVATINSNGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFFRFRNAMDYWGQGTLVTVSS GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCCGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCACCTACGGCATGAGCTGGGTGAGACAAGCCCCCGGCAAAGGACTGGTGTGGGTGGCTACCATCAACAGCAACGGCGGCTCCACAAGCTACCCCGACAGCGTGAAGGGAAGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACACTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGAGCCGAAGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTAGATTCTTTAGATTTAGAAACGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGCACACTGGTGACAGTGTCCTCC (SEQ ID NO:61)

小鼠和嵌合C2C1A1A1的VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLNINSLQSEDFGSYYCQHYYGPPTWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:35) 小鼠C2C1A1A1的VL GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGTTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAATATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTATTATGGTCCTCCCACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:62) 嵌合C2C1A1A1的VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCCGCCAGCCTGTCCGCCTCCGTTGGAGAGACCGTGACCATCACCTGTAGGACCTCCGAGAATATCTACAGCTACCTGGCCTGGTATCAACAGAAGCAGGGCAAGTCCCCTCAGTTTCTGGTGTACAACGCCAAGACCCTGGCCGAGGGCGTGCCCTCTAGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCCAGTTCAGCCTGAATATCAACAGCCTGCAGAGCGAGGACTTTGGCAGCTACTACTGTCAGCACTACTACGGCCCTCCCACCTGGACATTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:63)

huC2C1A1A1-V1、huC2C1A1A1-V5、huC2C1A1A1-V9和huC2C1A1A1-V13的VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKX1LX2YNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:36) X1=L, X2=I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK

huC2C1A1A1-V2、huC2C1A1A1-V6、huC2C1A1A1-V10和huC2C1A1A1-V14的VL DIQMTQSPSSLSASVGQRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKPPRFLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTEFTLTITSLQAEDFGVYYCQHYYGPPTWTFGPGTKLEIK (SEQ ID NO:37)

huC2C1A1A1-V3、huC2C1A1A1-V7、huC2C1A1A1-V11和huC2C1A1A1-V15的VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKX1LX2YNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:36) X1=F, X2=V DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCTCTGAGCGCTTCCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACATGCAGAACCTCCGAGAACATCTACAGCTATCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGTTCCTGGTGTACAACGCCAAGACACTGGCTGAGGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTTTACACTGACAATCAGCTCTCTGCAACCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACTACTATGGCCCCCCTACATGGACCTTTGGCCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:64)

huC2C1A1A1-V4、huC2C1A1A1-V8、huC2C1A1A1-V12和huC2C1A1A1-V16的VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKX1LX2YNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:36) X1=F, X2=I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYGPPTWTFGQGTKVEIK

小鼠C2B2F7B7的VH CDR1 TYGMS (SEQ ID NO:1)

小鼠C2B2F7B7的VH CDR2 TINSNGGSTNYPDSVKG (SEQ ID NO:6)

小鼠C2B2F7B7的VH CDR3 FFRIRNAMDY (SEQ ID NO:11)

小鼠C2B2F7B7的VL CDR1 RASENIYSYLA (SEQ ID NO:16)

小鼠C2B2F7B7的VL CDR2 NAKTLAE (SEQ ID NO:22)

小鼠C2B2F7B7的VL CDR3 QHYYGTPTWT (SEQ ID NO:27)

小鼠C2B2F7B7的VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWVRQTPDKRLELVATINSNGGSTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARFFRIRNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:38)

小鼠C2B2F7B7的VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHYYGTPTWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:39)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VH CDR1 DTYMH (SEQ ID NO:2)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VH CDR2 RIDPTNGYTIYASKFQG (SEQ ID NO:7)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VH CDR3 RRPWFAY (SEQ ID NO:12)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VL CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:17)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VL CDR2 KVTNRFS (SEQ ID NO:23)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VL CDR3 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:28)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VH EVQLQQSGADLVRPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSGDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:40) 小鼠B8G11F2B7G5E8的VH GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGATCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGGTTGGAAGGATTGATCCTACGAATGGTTATACTATATATGCCTCAAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCATCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGGGGACACTGCCGTCTATCATTGTGTTAGTCGGAGGCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO:65) 嵌合B8G11F2B7G5E8的VH GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCCGACCTGGTGAGGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGCACAGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACATACATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGAGCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGAAGAATCGACCCCACCAACGGCTACACCATCTACGCCTCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCATCACAGCCGATACCTCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACAAGCGGCGATACCGCCGTGTACCACTGCGTGTCCAGAAGGCCTTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO:66)

huB8G11F2B7G5E8-V1的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=A, X2=K, X3=V, X4=H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V2的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=V, X2=K, X3=V, X4=H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V3的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V4的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=A, X2=K, X3=M, X4=H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWMGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V5的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGX1X2TITADTSX3X4TAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42) X1=R, X2=A, X3=S, X4=N EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGRATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V6的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGX1X2TITADTSX3X4TAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42) X1=K, X2=V, X3=S, X4=N EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V7的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGX1X2TITADTSX3X4TAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42) X1=K, X2=A, X3=T, X4=N EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V8的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGX1X2TITADTSX3X4TAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42) X1=K, X2=A, X3=S, X4=D EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSDTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V9的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V10的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGX1X2TITADTSX3X4TAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42) X1=R, X2=V, X3=T, X4=N EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS

huB8G11F2B7G5E8-V11的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGLIDPTNGYTIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:43)

huB8G11F2B7G5E8-V13的VH QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:44)

huB8G11F2B7G5E8-V14的VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX1SGFNIKDTYMHWVX2QAPGKGLEWX3GRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYX4CVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41) X1=V, X2=K, X3=M, X4=H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVKQAPGKGLEWMGRIDPTNGYTIYASKFQGKATITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYHCVSRRPWFAYWGQGTLVTVSS GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCACCGTGAAGATCAGCTGCAAGGTGAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGAAGCAAGCCCCCGGCAAAGGACTGGAGTGGATGGGAAGAATCGACCCCACCAACGGCTACACCATCTACGCCAGCAAGTTCCAAGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCTCCAGCAATACCGCCTACATGGAGCTGAGCTCTCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACCACTGTGTGAGCAGAAGACCTTGGTTCGCCTACTGGGGCCAAGGCACACTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:67)

小鼠和嵌合B8G11F2B7G5E8的VL DILMTQTPLSLPVSLGAQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:45) 小鼠B8G11F2B7G5E8的VL GATATTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGCTCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCAAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTACCAATCGATTTTCTGGGGTCCCAGATAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:68) 嵌合B8G11F2B7G5E8的VL GACATCCTGATGACACAGACACCCCTGTCCCTGCCTGTGTCCCTGGGCGCTCAGGCCTCCATCTCCTGTAGGAGCAGCCAGTCCATCGTGCACAGCAATGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACTTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGACCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCATCTACTACTGCTTCCAGGGCTCCCACGTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:69)

huB8G11F2B7G5E8-V1至huB8G11F2B7G5E8-V11、huB8G11F2B7G5E8-V13和huB8G11F2B7G5E8-V14的VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:46) GACATCGTGATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGACACCCGGCCAGCCTGCCAGCATCAGCTGTAGGAGCTCCCAGTCCATCGTGCACTCCAATGGCAATACATACCTGGAGTGGTACTTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGACCAATAGATTCTCCGGCGTGCCCGATAGGTTCTCCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCTCCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:70)

小鼠B8D10G7G6E4的VH CDR1 SYAMS (SEQ ID NO:3)

小鼠B8D10G7G6E4的VH CDR2 GIRSGGSYTYYPDTVKG (SEQ ID NO:8)

小鼠B8D10G7G6E4的VH CDR3 GDKLRPYHFDY (SEQ ID NO:13)

小鼠B8D10G7G6E4的VL CDR1 KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:18)

小鼠B8D10G7G6E4的VL CDR2 SASYRYT (SEQ ID NO:24)

小鼠B8D10G7G6E4的VL CDR3 QQHYSDPYT (SEQ ID NO:29)

小鼠B8D10G7G6E4的VH EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVAGIRSGGSYTYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAIYYCARGDKLRPYHFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:47)

小鼠B8D10G7G6E4的VL DIVMTQSHKFMSTSVGDKVSITCKASQDVTTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFAGSGSGTDFTVTISTVQAEDLAVYYCQQHYSDPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:48)

小鼠B9A7C9A4H5的VH CDR1 NYAMS (SEQ ID NO:4)

小鼠B9A7C9A4H5的VH CDR2 GIRSGGSYTYYPDTVKG (SEQ ID NO:8)

小鼠B9A7C9A4H5的VH CDR3 GDKLRPYHFDY (SEQ ID NO:13)

小鼠B9A7C9A4H5的VL CDR1 KASQDVSTAVV (SEQ ID NO:19)

小鼠B9A7C9A4H5的VL CDR2 SASYRYT (SEQ ID NO:24)

小鼠B9A7C9A4H5的VL CDR3 QQHYSAPYT (SEQ ID NO:30)

小鼠B9A7C9A4H5的VH EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVAGIRSGGSYTYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAIYYCARGDKLRPYHFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:49)

小鼠B9A7C9A4H5的VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTIITVQAEDLAVYYCQQHYSAPYTFGGGTQLEIK (SEQ ID NO:50)

小鼠B9D1D11F8D8的VH CDR1 SYAMS (SEQ ID NO:3)

小鼠B9D1D11F8D8的VH CDR2 SISSGDSTYYLDSVKG (SEQ ID NO:9)

小鼠B9D1D11F8D8的VH CDR3 SGGSAPY (SEQ ID NO:14)

小鼠B9D1D11F8D8的VL CDR1 SASSSVNYMY (SEQ ID NO:20)

小鼠B9D1D11F8D8的VL CDR2 RTSNLAS (SEQ ID NO:25)

小鼠B9D1D11F8D8的VL CDR3 QQYHSFPLT (SEQ ID NO:31)

小鼠B9D1D11F8D8的VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGDSTYYLDSVKGRFTISRDNARNILYLQVSSLRSEDTAMYYCERSGGSAPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:51)

小鼠B9D1D11F8D8的VL QIVLTQSPAIMSASPGDMVTISCSASSSVNYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:52)

小鼠B1D2F7D3B5的VH CDR1 SYAMS (SEQ ID NO:3)

小鼠B1D2F7D3B5的VH CDR2 SISSGDSTYYLDSVKG (SEQ ID NO:9)

小鼠B1D2F7D3B5的VH CDR3 SGGSAPY (SEQ ID NO:14)

小鼠B1D2F7D3B5的VL CDR1 SASSSVSYMY (SEQ ID NO:21)

小鼠B1D2F7D3B5的VL CDR2 RTSNLAS (SEQ ID NO:25)

小鼠B1D2F7D3B5的VL CDR3 QQYHSFPLT (SEQ ID NO:31)

小鼠B1D2F7D3B5的VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGDSTYYLDSVKGRFTISRDNAMNILYLQMSSLRSEDTAVYYCERSGGSAPYWGQGTLVSVSA (SEQ ID NO:53)

小鼠B1D2F7D3B5的VL QIVLTQSPAIMSASPGEMVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:54)

嵌合和人源化抗體的重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:55) GCCAGCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGGAGCACCTCTGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAATTCCGGCGCCCTGACATCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACATGTAATGTGGATCACAAGCCCAGCAACACAAAGGTGGATAAGAGAGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGTCCTGCCCCAGAGTTCCTGGGCGGCCCCTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGACACACTGATGATCTCCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTTAATTCCACATACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAATAACTACAAGACAACACCCCCCGTGCTGGATTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAGTGA (SEQ ID NO:71)

嵌合和人源化抗體的輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NO:56) CGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA (SEQ ID NO:72)

人IL4Rα-his MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGNMKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEAHTCIPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWAQCYNTTWSEWSPSTKWHNSYREPFEQHHHHHHHHHHH (SEQ ID NO:57)

狨猴IL4Rα-his MGWLCSGLLFPVSYLVLLQVAGSGSMKVLQEPTCVSDYISLSTCEWKMGGPTNCSAELRLVYQLVFLISETNMCVPENNGAAGCVCHLFMEDMVGADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPKAPENLTVYTNVSETLLLTWSNPYPPDNYLYEKLTYAVNIWNENDPTDSRIYDVTYQEPTLRIAASTLKSGVSYRARVRAWAQSYNSTWSEWSPSTKWYNAYKEPFEKHHHHHHHHHHH (SEQ ID NO:58)

圖1A-1C示出小鼠抗體B1D2F7D3B5 (A)、B8G11F2B7G5E8和B9D1D11F8D8 (B)、C2C1A1A1和C2B2F7B7 (C)與人IL4Rα的結合能力。

圖2A-2D示出小鼠抗體B1D2F7D3B5 (A)、B8G11F2B7G5E8 (B)、B9D1D11F8D8 (C)、C2C1A1A1和C2B2F7B7 (D)與細胞表面人IL4Rα的結合能力。

圖3示出小鼠抗體B1D2F7D3B5、B8G11F2B7G5E8、B9D1D11F8D8、C2C1A1A1和C2B2F7B7與食蟹猴IL4Rα的結合能力。

圖4A-4B示出小鼠抗體B1D2F7D3B5、B8G11F2B7G5E8和B9D1D11F8D8 (A)、C2C1A1A1和C2B2F7B7 (B)對人IL4Rα-IL4相互作用的阻斷能力。

圖5A-5B示出小鼠抗體B1D2F7D3B5、B8G11F2B7G5E8和B9D1D11F8D8 (A)、C2C1A1A1和C2B2F7B7 (B)對參照品與人IL4Rα結合的阻斷能力。

圖6A-6C示出小鼠抗體B1D2F7D3B5和B8G11F2B7G5E8 (A)、B9D1D11F8D8 (B)、C2C1A1A1和C2B2F7B7 (C)對人IL4與細胞表面人IL4Rα相互作用的阻斷能力。

圖7示出小鼠抗體B1D2F7D3B5、B8G11F2B7G5E8、B9D1D11F8D8、C2C1A1A1和C2B2F7B7對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

圖8示出小鼠抗體B1D2F7D3B5、B8G11F2B7G5E8、B9D1D11F8D8、C2C1A1A1和C2B2F7B7對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

圖9示出嵌合抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1與人IL4Rα的結合能力。

圖10示出嵌合抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1與細胞表面人IL4Rα的結合能力。

圖11示出嵌合抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1對人IL4Rα-IL4相互作用的阻斷能力。

圖12示出嵌合抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

圖13示出嵌合抗體B8G11F2B7G5E8和C2C1A1A1對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

圖14A-14B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)與人IL4Rα的結合能力。

圖15A-15B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)與食蟹猴IL4Rα的結合能力。

圖16A-16B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)與cal-IL4Rα的結合能力。

圖17A-17B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)與細胞表面人IL4Rα的結合能力。

圖18A-18B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)對人IL4與表達人IL4Rα的293F細胞的相互作用的阻斷能力。

圖19A-19B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)對人IL4Rα-IL4相互作用的阻斷能力。

圖20A-20B示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)對參照品與人IL4Rα結合的阻斷能力。

圖21示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL4誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

圖22示出人源化抗體huB8G11F2B7G5E8-V2、huB8G11F2B7G5E8-V4和huB8G11F2B7G5E8-V14 (A)、huC2C1A1A1-V14和huC2C1A1A1-V15 (B)對HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2細胞中IL13誘導的STAT6磷酸化的抑制活性。

透過結合以示例給出的以下詳細描述和附圖，可以得到最好的理解，但不應該將本發明僅限於所述的特定實施方案。

Claims (20)

1. 一種分離的單株抗體或其抗原結合部分，所述單株抗體或其抗原結合部分結合介白素4受體α亞基(IL4Rα)，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1、CDR2和CDR3包含(1)分別與SEQ ID NOs：1、5和10所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：1、6和11所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：2、7和12所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：3、8和13所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：4、8和13所示的胺基酸序列；或(6)分別與SEQ ID NOs：3、9和14所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
2. 根據請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其中所述重鏈可變區包含與SEQ ID NOs：32、33 (X1=W、X2=S；X1=L、X2=A；X1=W、X2=A)、34、38、40、41 (X1=A、X2=K、X3=V、X4=H；X1=V、X2=K、X3=V、X4=H；X1=A、X2=Q、X3=V、X4=H；X1=A、X2=K、X3=M、X4=H；X1=A、X2=K、X3=V、X4=Y；X1=V、X2=K、X3=M、X4=H)、42 (X1=R、X2=A、X3=S、X4=N；X1=K、X2=V、X3=S、X4=N；X1=K、X2=A、X3=T、X4=N；X1=K、X2=A、X3=S、X4=D；X1=R、X2=V、X3=T、X4=N)、43、44、47、49、51或53所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
3. 根據請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1、CDR2和CDR3包含：(1)分別與SEQ ID NOs：15、22和26所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：16、22和27所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：17、23和28所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：18、24和29所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：19、24和30所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：20、25和31所示的胺基酸序列；或(7)分別與SEQ ID NOs：21、25和31所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
4. 根據請求項3所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其中所述輕鏈可變區包含與SEQ ID NOs：35、36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)、37、39、45、46、48、50、52或54所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
5. 根據請求項3所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其中所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含：(1)分別與SEQ ID NOs：1、5、10、15、22和26所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：1、6、11、16、22和27所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：2、7、12、17、23和28所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：3、8、13、18、24和29所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：4、8、13、19、24和30所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：3、9、14、20、25和31所示的胺基酸序列；或(7)分別與SEQ ID NOs：3、9、14、21、25和31所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
6. 根據請求項5所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其中所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含：(1)分別與SEQ ID NOs：32和35所示的胺基酸序列；(2)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=S)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(3)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=S)和37所示的胺基酸序列；(4)分別與SEQ ID NOs：34和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(5)分別與SEQ ID NOs：34和37所示的胺基酸序列；(6)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=L、X2=A)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(7)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=L、X2=A)和37所示的胺基酸序列；(8)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=A)和36 (X1=L、X2=I；X1=F、X2=V；X1=F、X2=I)所示的胺基酸序列；(9)分別與SEQ ID NOs：33 (X1=W、X2=A)和37所示的胺基酸序列；(10)分別與SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列；(11)分別與SEQ ID NOs：40和45所示的胺基酸序列；(12)分別與SEQ ID NOs：41 (X1=A、X2=K、X3=V、X4=H；X1=V、X2=K、X3=V、X4=H；X1=A、X2=Q、X3=V、X4=H；X1=A、X2=K、X3=M、X4=H；X1=A、X2=K、X3=V、X4=Y；X1=V、X2=K、X3=M、X4=H）和46所示的胺基酸序列；(13)分別與SEQ ID NOs：42 (X1=R、X2=A、X3=S、X4=N；X1=K、X2=V、X3=S、X4=N；X1=K、X2=A、X3=T、X4=N；X1=K、X2=A、X3=S、X4=D；X1=R、X2=V、X3=T、X4=N)和46所示的胺基酸序列；(14)分別與SEQ ID NOs：43和46所示的胺基酸序列；(15)分別與SEQ ID NOs：44和46所示的胺基酸序列；(16)分別與SEQ ID NOs：47和48所示的胺基酸序列；(17)分別與SEQ ID NOs：49和50所示的胺基酸序列；(18)分別與SEQ ID NOs：51和52所示的胺基酸序列；或(19)分別與SEQ ID NOs：53和54所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的胺基酸序列。
7. 根據請求項6所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其包含連接至所述重鏈可變區的重鏈恆定區，和連接至所述輕鏈可變區的輕鏈恆定區，所述重鏈恆定區具有SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，所述輕鏈恆定區具有SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
8. 根據請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其中所述單株抗體或其抗原結合部分(a)與人IL4Rα結合；(b)與猴IL4Rα結合；(c)阻斷IL4Rα-IL4的相互作用；和(d)阻斷IL4Rα-IL13-IL13Rα1的相互作用。
9. 根據請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，所述單株抗體或其抗原結合部分是小鼠、人、嵌合或人源化抗體。
10. 根據請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，所述單株抗體或其抗原結合部分是IgG1、IgG2或IgG4同種型。
11. 一種核苷酸，其編碼請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分。
12. 一種表現載體，其包含請求項11所述的核苷酸。
13. 一種宿主細胞，其包含請求項11所述的核苷酸或請求項12所述的表現載體。
14. 一種藥物組成物，其包含請求項1所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分、請求項11所述的核苷酸、請求項12所述的表現載體或請求項13所述的宿主細胞，以及藥學上可接受的載體。
15. 根據請求項14所述的藥物組成物，其進一步包含抗過敏劑或抗腫瘤劑。
16. 根據請求項15所述的藥物組成物，其中所述抗過敏劑是抗組織胺藥物、皮質類固醇、β-腎上腺素能受體促效劑、標靶cyc-LTs的藥物或標靶IgE的藥物。
17. 一種治療與過度的IL4和/或IL13信號轉導相關的過敏性疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的請求項14或16所述的藥物組成物。
18. 根據請求項17所述的方法，其中所述過敏性疾病是異位性皮膚炎、過敏反應、過敏性鼻炎或過敏性哮喘。
19. 一種治療受試者中與STAT6活化增加相關的腫瘤的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的請求項14所述的藥物組成物。
20. 根據請求項19所述的方法，其中所述腫瘤是實體瘤。

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