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TW202118792A - 抗hk2嵌合抗原受體(car) - Google Patents

抗hk2嵌合抗原受體(car) Download PDF

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TW202118792A
TW202118792A TW109124996A TW109124996A TW202118792A TW 202118792 A TW202118792 A TW 202118792A TW 109124996 A TW109124996 A TW 109124996A TW 109124996 A TW109124996 A TW 109124996A TW 202118792 A TW202118792 A TW 202118792A
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拉庫瑪 甘尼桑
雪莉 里普瑞特
約翰 李
金泉 羅
泰瑞莎 麥克德維特
沈飛
桑賈亞 辛格
宋德剛
薩耶德維 文卡塔拉瑪尼
伊方
永紅 趙
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美商健生生物科技公司
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Abstract

本揭露提供特異性靶向人類血管舒緩素2 (hK2)之嵌合抗原受體(CAR)、及包含此類CAR之免疫反應性細胞，其等係用於治療癌症。

Description

抗HK2嵌合抗原受體(CAR)
發明係關於靶向hK2之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)，其包含靶向hK2之單鏈可變片段，並關於表現該等CAR之經工程改造的靶向hK2之免疫細胞。亦提供編碼該等CAR之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞、及包含表現該等靶向hK2之CAR之該等經工程改造的免疫細胞之組成物。亦提供製造該等CAR、及經工程改造之免疫細胞的方法、及使用該等經工程改造之免疫細胞來治療包括癌症之病況的方法。
前列腺癌是男性第二常被診斷出的癌症及第六大癌症死亡原因，佔全世界男性新癌症病例總數的14% (903,500)及癌症死亡總數的6% (258,400)。前列腺癌從診斷到死亡的病程最能基於疾病程度、激素狀態、及可檢測的轉移存在與否分類為一系列臨床階段：局部疾病、輻射療法或手術後前列腺特異性抗原(PSA)水平上升且無可檢測的轉移、及在無去勢或去勢階段中的臨床轉移。雖然手術、輻射、或這兩者之組合可能可以治癒患有局部性疾病的患者，但這些患者中有顯著比例病情會反覆發作，如由PSA水平上升所證實，其可能導致轉移的發展，尤其是在高危險群（轉變到該疾病之致命期）中。
雄性激素去除療法(androgen depletion therapy, ADT)是具有通常可預測結果的標準治療：PSA減少，一段腫瘤沒有擴散的穩定期，接著是PSA上升及再生長為去勢抗性疾病。歷來，ADT已是轉移性前列腺癌病患的標準照護。
血管舒緩素(kallikrein)相關肽酶2 (hK2, HK2)係一種類胰蛋白酶的酶，其表現係由雄性激素受體(AR)驅動且對於前列腺組織及前列腺癌具有特異性。hK2係由跨膜蛋白酶、絲胺酸2 (TMPRSS2)活化並分泌至前列腺導管中，且在其中起始切斷精囊凝固蛋白（semenogelin，精液中之胞外基質）之級聯反應以增強精子活力。hK2表現限於前列腺及前列腺癌組織，然而近來已顯示在以類固醇激素適當活化AR路徑後，可在乳癌細胞系及原始患者樣本中檢測到hK2（美國專利公開案第2018/0326102號）。類似於PSA，當前列腺之高度結構化組織因肥大或惡性轉變而受損時，會發生無催化活性(catalytically inactive)之hK2逆行釋放至血液中。
T細胞療法利用已進行基因修飾之經單離T細胞，以增強彼等對於特定腫瘤相關聯抗原之特異性。基因修飾可涉及嵌合抗原受體(CAR)或外源性T細胞受體之表現，以在T細胞上提供新的抗原特異性。表現嵌合抗原受體之T細胞（CAR-T細胞）可誘發腫瘤免疫反應性。需要更好的利用CAR-T細胞之癌症療法。
本文中所揭示者係嵌合抗原受體(CAR)（例如靶向人類血管舒緩素2 (hK2)之CAR）、包含該等CAR之細胞、編碼該等CAR之載體（例如重組表現載體）、及編碼該等CAR之核酸分子、製造該等CAR、組成物、多肽、蛋白質、核酸、宿主細胞、細胞群之方法、及使用所揭示之CAR來治療病症（例如癌症）的方法。
在一個態樣中，提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a)包含特異性結合至人類血管舒緩素2 (hK2)抗原之scFv的胞外域、 (b)跨膜域、及 (c)視情況包含至少一個共刺激域之胞內信號傳導域。
在一些實施例中，CAR進一步包含 (d) CD8a鉸鏈區， 其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽；且 其中該胞內信號傳導域包含含有TNF受體超家族成員9 (CD137)組分之共刺激域及含有T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分之初級信號傳導域。
在一些實施例中，該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272至少90%同一的胺基酸序列； 該跨膜域包含與SEQ ID NO: 26至少90%同一的胺基酸序列；且/或 該胞內信號傳導域包含具有與SEQ ID NO: 27至少90%同一的胺基酸序列之共刺激域、及具有與SEQ ID NO: 28至少90%同一的胺基酸序列之初級信號傳導域。
在另一態樣中，提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3， 其中胞外抗原結合域結合hK2抗原。
在另一態樣中，提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3， 其中胞外抗原結合域結合hK2抗原。
在一些實施例中，胞外抗原結合域進一步包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在另一態樣中，提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、74、75、147、148、149、150、151、152、及318之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；及/或 包含選自SEQ ID NO: 4、5、6、76、77、140、141、142、143、144、145、146、及317之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)； 其中該胞外抗原結合域結合該人類血管舒緩素2 (hK2)抗原。
在一些實施例中，胞外抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施例中，胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)。在一些實施例中，scFv包含在輕鏈可變區(VL)與重鏈可變區(VH)之間的連接子多肽(linker polypeptide)。在一些實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含選自由SEQ ID NO: 8至23、169至184、及340至343所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含信號多肽。在一些實施例中，信號多肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9 (CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。在一些實施例中，CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。
在各種實施例中，CAR進一步包含將跨膜域連接至胞外抗原結合域之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種表現任何上述CAR之經單離淋巴球。在一些實施例中，淋巴球係T淋巴球。在一些實施例中，淋巴球係自然殺手(NK)細胞。
亦提供一種編碼任何上述CAR之經單離核酸分子。亦提供一種包含該核酸分子之載體。此外，亦提供一種表現該核酸分子之細胞。
進一步提供一種醫藥組成物，其包含有效量的任何上述淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。
a)          在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療方法中的CAR。
在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療方法中的淋巴球。
在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療方法中的組成物（例如，醫藥組成物）。
在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療癌症之方法中的CAR。
在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療癌症之方法中的淋巴球。
在一個態樣中，本揭露提供一種根據本揭露之用於治療癌症之方法中的組成物（例如，醫藥組成物）。
在一個實施例中，癌症係前列腺癌。
在一些實施例中，癌症係表現雄性激素受體(AR)之乳癌。
在另一態樣中，提供一種治療患有癌症之對象的方法。該方法包含向有需要之對象投予治療有效量的任何上述淋巴球，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。在一些實施例中，癌症係前列腺癌。在一些實施例中，癌症係表現雄性激素受體(AR)之乳癌。
在一個態樣中，提供一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含使該癌細胞接觸任何上述淋巴球，藉此該淋巴球誘發該癌細胞之殺滅。在一些實施例中，癌細胞係前列腺癌細胞。在一些實施例中，癌症係表現雄性激素受體(AR)之乳癌。
在另一態樣中，提供一種檢測對象中癌症之存在的方法，其包含： (a)使獲自該對象之細胞樣本接觸任何上述CAR，藉以形成CAR-細胞複合物；及 (b)檢測該複合物，其中檢測到該複合物係代表該對象中存在癌症。
例示實施例說明如下。
本揭露提供靶向人類血管舒緩素2 (hK2)之嵌合抗原受體(CAR)、包含此類CAR之細胞、及使用本文所述之CAR來治療癌症（例如，前列腺癌或表現AR之乳癌）的方法。
本發明之CAR對於hK2具有抗原特異性。如本文中所使用，片語「具有抗原特異性(have antigen specificity)」及「誘發抗原特異性反應(elicit antigen-specific response)」意指CAR可與抗原特異性結合並免疫辨識該抗原，使得該CAR與hK2抗原之結合誘發免疫反應。測試CAR之抗原特異性及辨識目標細胞之能力的方法在所屬技術領域中係已知的。
本揭露亦提供相關核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分、及與本發明之CAR相關之醫藥組成物。
以下參照實例並僅出於說明之目的描述本發明之數個態樣。應理解的是，闡述許多具體細節、關係、及方法以提供對本發明之完整理解。然而，所屬技術領域中具有通常知識者將輕易瞭解到，本發明可在沒有一或多個具體細節之情況下實踐，或用其他方法、規程、試劑、細胞系、及動物來實踐。本發明不受限於所說明之動作或事件的順序，因為一些動作可能以不同順序發生且/或與其他動作或事件同時發生。此外，並非所有說明之動作、步驟、或事件都是實施根據本發明之方法所需的。許多本文中所描述或參考之技術及程序係所屬技術領域中具有通常知識者充分理解並使用習知方法普遍採用的。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術用語、符號、及其他科學用語或術語係意欲具有與本發明有關之技術領域中具有通常知識者所共同理解之意義。在一些情況下，出於清晰及/或易於參考之目的，本文中定義具有共同理解之意義的用語，且本文中包括此類定義不一定要被解讀為表示與所屬技術領域中所通常理解的有實質差異。將進一步理解的是，諸如在常用字典中定義的用語應被解釋為具有與其在相關技術領域的背景中及/或如本文中另外定義之意義一致的意義。
當呈現清單時，除非另有陳述，否則應理解該清單之各個別元件及該清單之每種組合皆係分開的實施例。舉例而言，呈現為「A、B、或C」的實施例清單將解讀為包括實施例「A」、「B」、「C」、「A或B」、「A或C」、「B或C」、或「A、B、或C」。定義
於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
連接詞「包含(comprising)」、「基本上由…組成(consisting essentially of)」、及「由…組成(consisting of)」意欲意味著彼等在專利語言中一般公認的意義；亦即，(i)「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」、或「其特徵在於(characterized by)」同義，係包括式或開放式，且不排除額外、未列舉之元件或方法步驟；(ii)「由…組成」排除請求項中未指明的任何元件、步驟、或成分；且(iii)「基本上由…組成」將請求項的範疇限制在所指明的材料或步驟「及不實質影響（所請發明的）（多個）基本及新穎特徵者」。以片語「包含」（或其均等詞）描述的實施例亦提供以「由…組成」及「基本上由…組成」所獨立描述之實施例。
「活化(activation)」或「刺激(stimulation)」或「經活化(activated)」或「經刺激(stimulated)」係指誘發細胞之生物狀態的變化，從而導致活化標記之表現、細胞介素生產、目標細胞之增生或介導目標細胞之細胞毒性。細胞可藉由初級刺激信號活化。共刺激信號可放大初級信號之幅度並抑制初始刺激後之細胞死亡，從而導致更持久之活化狀態及因而更高之細胞毒性能力。「共刺激信號(co-stimulatory signal)」係指在與初級信號（諸如TCR/CD3連接）結合時會導致T細胞及/或NK細胞增生及/或關鍵分子之上調或下調的信號。
「抗原結合片段(antigen binding fragment)」或「抗原結合域(antigen binding domain)」係指蛋白質結合抗原之部分。抗原結合片段可係合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括免疫球蛋白結合抗原之部分，諸如VH、VL、VH及VL、Fab、Fab’、F(ab')2 、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域(camelized VH domain)、VHH域、由模擬抗體之CDR（諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3）的胺基酸殘基所組成之最小識別單元、結合抗原之替代支架、及包含該等抗原結合片段之多特異性蛋白質。抗原結合片段（諸如VH及VL）可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈表現的情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合域，諸如單鏈Fv (scFv)或雙鏈抗體(diabody)。抗原結合片段亦可偶聯至可為單特異性或多特異性的其他抗體、蛋白質、抗原結合片段、或替代支架，以工程改造雙特異性及多特異性蛋白質。
「癌症(cancer)」係指一群廣泛的各種疾病，其特徵在於身體中異常細胞的不受控制生長。未經調節之細胞分裂及生長導致侵犯鄰近組織的惡性腫瘤形成且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體的遠距部分。「癌症(cancer)」或「癌症組織(cancer tissue)」可包括腫瘤。
「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體（例如IgM）。各重鏈包含重鏈可變域(VH)及重鏈恆定域，重鏈恆定域包含CH1次結構域、鉸鏈次結構域、CH2次結構域、及CH3次結構域。各輕鏈包含輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定域(CL)。VH及VL可進一步細分成散佈於架構區(FR)的多個高變區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段構成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。
「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此等例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物（諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠或大鼠）。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入體細胞突變或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體(human antibody)」可含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如在Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如在Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96及國際專利公開號WO2009/085462中所述。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。
「經單離(isolated)」係指已自產出該分子的系統（諸如重組細胞）的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群（諸如合成多核苷酸或多肽）、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物之分子，且涵蓋經單離成更高純度之分子，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純度。
「調節(modulate)」係指當相較於由對照組或媒劑介導之反應時，測試分子介導增強或減少反應（即，下游效應）之能力增強或降低。
「自然殺手細胞(natural killer cell)」及「NK細胞(NK cell)」在本文中係可互換且同義地使用。NK細胞係指具有CD16+ CD56+ 及/或CD57+ TCR- 表型之分化淋巴球。NK細胞之特徵在於其能夠結合並藉由活化特定溶細胞酶來殺滅無法表現「自體(self)」MHC/HLA抗原之細胞、能夠殺滅腫瘤細胞或其他表現NK活化受體之配體的病變細胞、及能夠釋放刺激或抑制免疫反應之蛋白質分子（稱為細胞介素）。
「特異性結合(specifically binds/secific binding/specifically binding)」或「結合(bind)」係指蛋白質分子以比對其他抗原更大之親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，蛋白質分子係以下列平衡解離常數(KD )結合至抗原或抗原內之表位：約1×10-7 M或更小，例如約5×10-8 M或更小、約1×10-8 M或更小、約1×10-9 M或更小、約1×10-10 M或更小、約1×10-11 M或更小、或約1×10-12 M或更小，一般以小於其結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）之KD 至少一百倍的KD 結合。在此處所述之前列腺新抗原的上下文中，「特異性結合(specific binding)」係指蛋白質分子結合至前列腺新抗原而對野生型蛋白質（該新抗原係該野生型蛋白質之變體）沒有可檢測之結合。
「腫瘤細胞(tumor cell)」或「癌細胞(cancer cell)」係指在體內(in vivo )、離體(ex vivo )、或在組織培養物中具有自發或誘發的表型改變的癌性(cancerous)、癌前(pre-cancerous)或轉化細胞。這些變化不一定涉及新遺傳物質的攝取。儘管轉化可能來自轉化病毒的感染及新基因組核酸的摻入或外源核酸的攝取，其也可以自發地發生或在暴露於致癌物後發生，從而突變內源基因。轉化/癌症的例子如下：在體外(in vitro )、體內(in vivo )、及離體(ex vivo )的形態變化、細胞永生化、異常的生長控制、病灶形成、增殖、惡性腫瘤、腫瘤特異性標記水平的調節、侵襲性、在合適的動物宿主例如裸鼠中的腫瘤生長等等。
如本文中所使用，用語「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」係定義為包含胞外目標結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域的細胞表面受體，所有這些域之組合不會一起天然存在於單一蛋白質上。此尤其包括其中胞外域及胞內信號傳導域不會一起天然存在於單一受體蛋白質上之受體。本發明之嵌合抗原受體主要意欲用於與諸如T細胞及自然殺手(NK)細胞之淋巴球搭配使用。
用語「T細胞(T cell)」及「T淋巴球(T lymphocyte)」在本文中係可互換的且同義地使用。如本文中所使用，T細胞包括胸腺細胞、初始(naive) T淋巴球、未成熟T淋巴球、成熟T淋巴球、休止T淋巴球、或活化T淋巴球。T細胞可係輔助T (Th)細胞，例如第1型輔助T (Th1)細胞或第2型輔助T (Th2)細胞。T細胞可係輔助T細胞（HTL；CD4+ T細胞）CD4+ T細胞、細胞毒性T細胞（CTL；CD8+ T細胞）、腫瘤浸潤細胞毒性T細胞（TIL；CD8+ T細胞）、CD4+CD8+ T細胞、或T細胞之任何其他子集。適用於特定實施例中之T細胞的其他說明性族群包括初始T細胞及記憶T細胞。亦包括的是「NKT細胞」，其係指T細胞之特化族群，其表現半不變αβ T細胞受體(semi-invariant αβ T-cell receptor)，但亦表現出一般與NK細胞相關聯之各種分子標記，諸如NK1.1。NKT細胞包括NK1.1+及NK1.1-、以及CD4+、CD4-、CD8+、及CD8-細胞。NKT細胞上之TCR的獨特之處在於，其會辨識類MHC I分子CD Id所呈現之醣脂質(glycolipid)抗原。NKT細胞由於其能夠產生促進發炎或免疫耐受性之細胞介素而可具有保護性或有害效應。亦包括的是「γ-δ T細胞（gamma-delta T cell，γδ T細胞）」，其係指特化族群，即在表面上具有不同TCR之T細胞小亞群，且不像大多數T細胞（其中TCR係由兩條指定為α-TCR鏈及β-TCR鏈之醣蛋白鏈構成），γδ T細胞中之TCR係由γ鏈及δ鏈組成。γδ T細胞可在免疫監視及免疫調控中發揮作用，且發現其係IL-17之重要來源並誘發穩健的CD8+細胞毒性T細胞反應。亦包括的是「調控T細胞(regulatory T cell)」或「Treg」，其係指抑制異常或過度免疫反應且在免疫耐受性中發揮作用之T細胞。Treg一般係轉錄因子Foxp3陽性CD4+T細胞，且亦可包括轉錄因子Foxp3陰性調節性T細胞，其係生產IL-10之CD4+T細胞。
用語「自然殺手細胞」及「NK細胞」在本文中係可互換的且係同義地使用。如本文中所使用，NK細胞係指具有CD 16+ CD56+及/或CD57+ TCR-表型之分化淋巴球。NK細胞之特徵在於其能夠結合並藉由活化特定溶細胞酶來殺滅無法表現「自體(self)」MHC/HLA抗原之細胞、能夠殺滅腫瘤細胞或其他表現NK活化受體之配體的病變細胞、及能夠釋放刺激或抑制免疫反應之蛋白質分子（稱為細胞介素）。
如本文中所使用，用語「抗原(antigen)」係指能夠由T細胞受體結合之任何作用物（例如蛋白質、肽、多醣、醣蛋白、醣脂、核酸、其部分、或其組合）分子。抗原也能夠引起免疫反應。免疫反應之實例可能涉及但不限於抗體生產、或特定免疫機能健全細胞之活化、或兩者。所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，抗原完全不需由「基因」編碼。顯而易見的是，抗原可合成產生或可衍生自生物樣本，或者可係多肽以外之巨分子。此類生物樣本可包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞、或具有其他生物組分、生物體、蛋白質/抗原之次單元、已殺滅或去活化之全細胞或溶解物(lysate)的流體。
用語「抗體(antibody)」係指單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、雙硫鍵連接之Fv (sdFv)、胞內抗體(intrabody)、微抗體(minibody)、雙鏈抗體、及抗獨特型（anti-idiotypic，抗Id）抗體（包括例如，抗原特異性TCR之抗Id抗體）、及任何上述者之表位結合片段。用語「抗體」亦指共價雙鏈抗體（諸如美國專利申請公開案2007/0004909中所揭示者）及Ig-DARTS（諸如美國專利申請公開案2009/0060910中所揭示者）。可用作為TCR結合分子之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段，即含有抗原結合部位之分子。免疫球蛋白可係任何類型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及IgY）、類別（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、及IgA2）、或子類別。
用語「宿主細胞(host cell)」意指含有異源核酸之任何細胞。異源核酸可係載體（例如，表現載體）。例如，宿主細胞可係來自以任何方式加以選擇、修飾、轉化、生長、使用、或操縱之任何生物體的細胞，其用於由該細胞生產出物質，例如由該細胞表現基因、DNA或RNA序列、蛋白質、或酶。可決定適當宿主。例如，可基於載體主鏈及所欲結果來選擇宿主細胞。舉實例而言，可將質體或黏質體(cosmid)引入原核宿主細胞中以用於複製數種類型之載體。細菌細胞（諸如但不限於DH5α、JM109、及KCB、SURE®勝任細胞、及SOLOPACK Gold細胞）可用作為用於載體複製及/或表現之宿主細胞。此外，細菌細胞（諸如大腸桿菌LE392）可用作為用於噬菌體病毒之宿主細胞。可用作為宿主細胞之真核細胞包括但不限於酵母（例如，YPH499、YPH500、及YPH501）、昆蟲、及哺乳動物。用於載體複製及/或表現之哺乳動物真核宿主細胞的實例包括但不限於HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、CHO、Saos、及PC12。
本揭露之宿主細胞包括含有編碼該CAR之DNA或RNA序列且在細胞表面上表現該CAR之T細胞及自然殺手細胞。宿主細胞可用於增強T細胞活性、自然殺手細胞活性、治療癌症、及治療自體免疫疾病。
「活化」或「刺激」意指誘發細胞之生物狀態改變，藉此使該等細胞（例如，T細胞及NK細胞）表現活化標記、生產細胞介素、增生及/或變得對目標細胞具有細胞毒性。所有這些變化皆可藉由初級刺激信號產生。共刺激信號可放大初級信號之幅度並抑制初始刺激後之細胞死亡，從而導致更持久之活化狀態及因而更高之細胞毒性能力。「共刺激信號(co-stimulatory signal)」係指在與初級信號（諸如TCR/CD3連接）結合時會導致T細胞及/或NK細胞增生及/或關鍵分子之上調或下調的信號。
用語「增生(proliferation)」係指細胞分裂之增加，對稱或不對稱細胞分裂皆是。用語「擴增(expansion)」係指細胞分裂及細胞死亡之結果。
用語「分化(differentiation)」係指減少細胞之潛能或增生的方法或將細胞移至發育上更受限之狀態的方法。
用語「表現(express/expression)」意指允許或造成基因或DNA序列中之信息被產生，例如藉由啟動涉及對應基因或DNA序列之轉錄及轉譯的細胞功能來產生蛋白質。DNA序列係表現在細胞中或由細胞表現以形成「表現產物」，諸如蛋白質。亦可將表現產物本身（例如，所得蛋白質）表示為由該細胞「表現」。可將表現產物表徵為胞內、胞外、或跨膜的。
用語「轉染(transfection)」意指使用重組DNA技術將「外來(foreign)」（即，外在或胞外）核酸引入細胞中。用語「基因修飾(genetic modification)」意指將「外來」（即，外在或胞外）基因、DNA、或RNA序列引入宿主細胞，使得該宿主細胞將表現所引入之基因或序列以生產所欲之物質，一般是由所引入之基因或序列編碼的蛋白質或酶。所引入之基因或序列亦可稱為「選殖(cloned)」或「外來」基因或序列，可包括可操作地連接至編碼嵌合抗原受體之多核苷酸的調控或控制序列，諸如起始、終止、啟動子、信號、分泌、或細胞遺傳機制(genetic machinery)所使用之其他序列。基因或序列可包括非功能性序列或具有未知功能之序列。接收並表現所引入之DNA或RNA的宿主細胞已經「基因工程改造(genetically engineered)」。引入宿主細胞之DNA或RNA可來自任何來源（包括與宿主細胞同屬或同種之細胞）或來自不同屬或種。
用語「轉導(transduction)」意指使用病毒載體將外來核酸引入細胞中。
用語「調控元件(regulatory element)」係指控制核酸序列表現之某些方面的任何順式作用(cis-acting)基因元件。在一些實施例中，用語「啟動子(promoter)」基本上包含起始轉錄所需之最少量序列。在一些實施例中，用語「啟動子」包括起始轉錄之序列，且此外亦包括可上調或下調轉錄且常分別稱為「強化子元件(enhancer element)」及「抑制子元件(repressor element)」之序列。
如本文中所使用，用語「操作性連接(operatively linked)」及類似片語當用以指涉核酸或胺基酸時，分別係指核酸序列或胺基酸序列之操作性鍵聯，其等彼此處於功能性關係。例如，操作性連接之啟動子、強化子元件、開讀框、5'及3' UTR、及終止子序列會導致核酸分子（例如，RNA）之精確生產。在一些實施例中，操作性連接之核酸元件會導致開讀框之轉錄且最終生產出多肽（即，開讀框之表現）。作為另一實例，操作性連接之肽係其中功能域彼此以適當距離放置以賦予各域之意欲功能者。
所謂「強化(enhance)」或「促進(promote)」或「增加(increase)」或「擴增(expand)」或「改善(improve)」通常係指相較於媒劑或對照組分子/組成物所造成之反應，本文中所設想到之組成物生產、誘發、或造成較大生理反應（即，下游效應）之能力。可測量之生理反應可包括T細胞擴增、活化、效應子功能、持久性增加、及/或癌細胞死亡殺滅能力增加、以及由所屬技術領域中之理解及本文中之說明而顯而易見的其他生理反應。在某些實施例中，「經增加」或「經增強」之量可係「統計顯著」量，且可包括由媒劑或對照組組成物產生之反應的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、或更多倍（例如，500、1000倍）（包括其間及高於1之所有整數及小數，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）之增加。
所謂「減少(decrease)」或「減低(lower)」或「減輕(lessen)」或「降低(reduce)」或「減弱(abate)」通常係指相較於媒劑或對照組分子/組成物所造成之反應，本文中所設想到之組成物生產、誘發、或造成較小生理反應（即，下游效應）之能力。在某些實施例中，「經減少」或「經降低」之量可係「統計顯著」量，且可包括由媒劑、對照組組成物產生之反應、或特定細胞譜系中之反應的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、或更多倍（例如，500、1000倍）（包括其間及高於1之所有整數及小數，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）之減少。
應用於劑量或量之用語「有效(effective)」係指在投予至有需要之對象時足以產生所欲活性之化合物或醫藥組成物的量。應注意的是，當投予活性成分之組合時，該組合之有效量可或可不包括各成分如果個別投予時會是有效的量。所需之確切量將隨對象而有所變化，取決於對象之物種、年齡、及一般狀況、所治療病況之嚴重性、所採用之具體（多種）藥物、投予模式、及類似者。
如與本文中所述之組成物連接使用，用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指當向哺乳動物（例如，人類）投予時為生理上可耐受且一般不會產生不利反應之此類組成物的分子實體及其他成分。較佳地，用語「醫藥上可接受」意指經美國聯邦或州政府之管理機構批准，或列在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認藥典中以用於哺乳動物、且尤其是人類中。
本文中所使用之用語「蛋白質(protein)」涵蓋所有種類的天然存在及合成蛋白質，包括所有長度之蛋白質片段、融合蛋白質、及經修飾蛋白質，包括但不限於醣蛋白、以及所有其他類型的經修飾蛋白質（例如，由磷酸化、乙醯化、肉豆蔻醯化(myristoylation)、棕櫚醯化(palmitoylation)、醣基化、氧化、甲醯化、醯胺化、聚麩胺醯化(polyglutamylation)、ADP-核糖基化、聚乙二醇化(pegylation)、生物素化(biotinylation)等產生之蛋白質）。
用語「核酸(nucleic acid)」、「核苷酸(nucleotide)」、及「多核苷酸(polynucleotide)」涵蓋DNA及RNA兩者，除非另有指定。所謂「核酸序列(nucleic acid sequence)」或「核苷酸序列(nucleotide sequence)」意指編碼胺基酸之核酸序列；這些用語亦可指包括編碼作為選殖人造物(artifact)添加之任何胺基酸的部分之核酸序列，包括編碼連接子之任何胺基酸。
用語「載劑(carrier)」係指與化合物一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等醫藥載劑可係無菌液體，諸如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜、或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、及類似者。水或水溶液鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液較佳地係用作為載劑，尤其是用於可注射溶液。替代地，載劑可係固體劑型載劑，包括但不限於一或多種黏合劑（用於壓製丸劑）、助滑劑、封裝劑、調味劑、及著色劑。合適的醫藥載劑係描述於E.W. Martin之「Remington’s Pharmaceutical Sciences」中。
用語「約(about)」或「大約(approximately)」包括在值之統計上有意義範圍內。此一範圍可在給定值或範圍之一數量級內、較佳地50%內、更佳地20%內、再更佳地10%內、且甚至更佳地5%內。用語「約」或「大約」所涵蓋之可允許變化取決於所研究之具體系統，且可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易理解。
「血管舒緩素相關肽酶2」、「hK2」、或「klk2」係指一種亦稱為血管舒緩素2、腺血管舒緩素2、或HK2的已知蛋白質。hK2係生產為前蛋白原(preproprotein)並在蛋白水解期間裂解而產生活性蛋白酶。所有hK2異構體及變體皆涵蓋於「hK2」中。各種異構體之胺基酸序列可取自GenBank存取號NP_005542.1、NP_001002231.1、及NP_001243009。全長hK2之胺基酸序列係示於SEQ ID NO: 62。序列包括信號肽（殘基1至18）及前肽區(pro-peptide region)（殘基19至24）。
本文中所使用的用語係僅用於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性。如本文中所使用，不定冠詞「一(a/an)」及「該(the)」應被理解為包括複數指稱，除非上下文另有明確指示。嵌合抗原受體
本發明大致上係關於經基因修飾以穩定地表現所欲之嵌合抗原受體的T細胞之用途。嵌合抗原受體(CAR)係一種人工建構之雜交蛋白質或多肽，其含有連接至T細胞信號傳導域的抗體之抗原結合域(scFv)。CAR之特性可包括其利用單株抗體之抗原結合性質，以非MHC限制性(non-MHC-restricted)方式將T細胞特異性及反應性重定向至所選目標的能力。非MHC限制性抗原辨識給予表現CAR之T細胞辨識與抗原加工(antigen processing)無關之抗原的能力，因此繞過腫瘤逃逸(tumor evasion)之主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源性T細胞受體(TCR) α及β鏈二聚化。
本文中所述之CAR提供重組多肽建構體，其至少包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域（在本文中亦稱為「細胞質信號傳導域(cytoplasmic signaling domain)」），該胞內信號傳導域包含衍生自如下文所定義之刺激分子的功能性信號傳導域。表現CAR之T細胞在本文中稱為CAR T細胞、CAR-T細胞、或經CAR修飾之T細胞，且這些用語在本文中可互換使用。細胞可經基因修飾以在其表面上穩定地表現抗體結合域，從而賦予MHC非依賴性之新的抗原特異性。
在一些情況下，T細胞經基因修飾以穩定地表現CAR，其將特定抗體之抗原辨識域與CD3ζ鏈或FcγRI蛋白之胞內域組合成為單一嵌合蛋白。在一個實施例中，刺激分子係與T細胞受體複合物相連之ζ鏈。
如本文中所使用，「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」或「細胞質信號傳導域(cytoplasmic signaling domain)」係指分子之胞內部分。其係蛋白質之功能性部分，該功能性部分藉由在細胞內傳輸信息而發揮作用，以經由已定義之信號傳導路徑藉由產生第二傳訊者或藉由回應於此類傳訊者而作用為效應子來調控細胞活性。胞內信號傳導域產生促進含CAR細胞（例如CAR-T細胞）的免疫效應功能之信號。免疫效應功能之實例（例如在CAR-T細胞中）包括溶細胞活性及輔助活性，其包括細胞介素之分泌。
在一實施例中，胞內信號傳導域可包含初級胞內信號傳導域。例示初級胞內信號傳導域包括衍生自負責初級刺激、或抗原依賴性刺激之分子者。在一實施例中，胞內信號傳導域可包含共刺激胞內域。例示共刺激胞內信號傳導域包括衍生自負責共刺激信號、或抗原非依賴性刺激之分子者。例如，在CAR-T之情況下，初級胞內信號傳導域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激胞內信號傳導域可包含來自輔受體(co-receptor)或共刺激分子之細胞質序列。
初級胞內信號傳導域可包含已知為免疫受體酪氨酸活化基序或ITAM的信號傳導基序。含有初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括但不限於衍生自下列者：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d DAP10、及DAP12。
用語「ζ(zeta)」或替代地「ζ鏈(zeta chain)」、「CD3ζ(CD3-zeta)」、或「TCRζ(TCR-zeta)」係定義為以GenBank Acc. No. BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種（例如鼠類、兔、靈長類、小鼠、囓齒動物、猴、猿、及類似者）之等效殘基，且「ζ刺激域(zeta stimulatory domain)」或替代地「CD3ζ刺激域(CD3-zeta stimulatory domain)」或「TCRζ刺激域(TCR-zeta stimulatory domain)」係定義為來自ζ鏈之細胞質域的胺基酸殘基，其足以在功能上傳輸T細胞活化所必需之初始信號。有時，例如在本揭露之態樣及/或實施例中，「ζ刺激域」或「CD3ζ刺激域」亦稱為「初級信號傳導域(primary signaling domain)」。在一個態樣中，CD3ζ刺激域之細胞質域包含GenBank Acc. No. BAG36664.1之殘基52至164或來自其功能異種同源物的非人類物種（例如小鼠、囓齒動物、猴、猿、及類似者）之等效殘基。在一較佳實施例中，胞內信號傳導域包含CD3ζ刺激域。在一個態樣中，「ζ刺激域」或「CD3ζ刺激域」係以SEQ ID NO: 28提供之序列、或與SEQ ID NO: 28具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列。
用語「共刺激分子(co-stimulatory molecule)」係指T細胞上之同源結合伙伴(cognate binding partner)，其與共刺激配體特異性結合，從而介導由T細胞所致之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子係除抗原受體或其配體之外的細胞表面分子，其係有效免疫反應所需的。共刺激分子包括但不限於MHC 1類分子、BTLA、及鐸配體受體(Toll ligand receptor)、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、及4-1BB (CD137)。
共刺激胞內信號傳導域可係共刺激分子之胞內部分。共刺激分子可以下列蛋白質家族代表：TNF受體蛋白、類免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、及活化NK細胞受體。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、GITR、CD30、MyD88、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及與CD83特異性結合之配體、及類似者。
胞內信號傳導域可包含分子（衍生出該胞內信號傳導域）的整個胞內部分或整個天然胞內信號傳導域、或其功能片段。
用語「4-1BB」或替代地「CD137」係指具有以GenBank Acc. No. AAA62478.2提供之胺基酸序列、或來自非人類物種（例如，小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者）之等效殘基的TNFR超家族成員；且「4-1BB共刺激域(4-1BB co-stimulatory domain)」係定義為GenBank存取號AAA62478.2之胺基酸殘基214至255、或來自非人類物種（例如，小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者）之等效殘基。有時，例如在本揭露之態樣及/或實施例中，「4-1BB共刺激域」亦稱為「共刺激域」。
在一較佳實施例中，胞內信號傳導域包含共刺激胞內信號傳導域，其中該共刺激胞內信號傳導域係4-1BB共刺激域或「CD137共刺激域」。在一個態樣中，「4-1BB共刺激域」或「CD137共刺激域」係以SEQ ID NO: 27提供之序列、或來自非人類物種（例如，小鼠、嚙齒動物、猴、猿、及類似者）之等效殘基、或與SEQ ID NO: 27具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列。在一較佳實施例中，4-1BB共刺激域係以SEQ ID NO: 27提供之序列。
在一個實施例中，使用天然與CAR中之一個域相連的跨膜域。在另一實施例中，跨膜域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾，以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，以最小化與受體複合物之其他成員的交互作用。在一個例示實施例中，跨膜域包含CD8α鉸鏈域。在一個實施例中，CDR包含CD8α鉸鏈域及CD8α跨膜域。
在一些實施例中，細胞質信號傳導域進一步包含一或多個衍生自至少一種如本文中所定義之共刺激分子的功能性信號傳導域。在一個實施例中，共刺激分子係選自4-1BB（即CD137）、CD27、CD3ζ、及/或CD28。CD28係在T細胞共刺激中重要的T細胞標記。CD27係腫瘤壞死因子受體超家族成員且作用為共刺激免疫檢查點分子。4-1BB傳輸強共刺激信號至T細胞，促進分化並增強T淋巴球之長期存活率。CD3ζ與TCR相連以產生訊號，並含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。在另一實施例中，共刺激分子係MyD88或CD40。
在一個實施例中，CAR包含胞內鉸鏈域，其包含CD8及胞內T細胞受體信號傳導域（包含CD28、4-1BB、及CD3ζ）。在另一實施例中，CAR包含胞內鉸鏈域及胞內T細胞受體信號傳導域（包含CD28、4-1BB、及CD3ζ），其中該鉸鏈域包含CD8、CD4、或CD28之胞外區的全部或部分；抗體恆定區的全部或部分；FcyRIIIa受體、IgG鉸鏈、IgM鉸鏈、IgA鉸鏈、IgD鉸鏈、IgE鉸鏈、或Ig鉸鏈的全部或部分。IgG鉸鏈可來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE、或其嵌合體。
本文中所述之CAR提供重組多肽建構體，其至少包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域（在本文中亦稱為「細胞質信號傳導域」），該胞內信號傳導域包含例如衍生自如下文所定義之刺激分子的功能性信號傳導域在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及包含衍生自刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自共刺激分子之功能性信號傳導域及衍生自刺激分子之功能性信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原辨識域、跨膜域、及胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含至少兩個衍生自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導域及衍生自刺激分子之功能性信號傳導域。
本發明之CAR可經設計以自身包含CD28及/或4-1BB信號傳導域，或與可用於本發明之CAR的背景下之任何其他所欲（多種）細胞質域組合。在一個實施例中，CAR之細胞質域可進一步包含CD3ζ之信號傳導域。舉例而言，CAR之細胞質域可包括但不限於CD3ζ、4-1BB、及CD28信號傳導模組及其組合。
在一個實施例中，CAR包含含有CD8α鉸鏈域之鉸鏈域、CD8α跨膜域、及含有4-1BB及CD3ζ之胞內信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含含有CD8α鉸鏈域之鉸鏈域、CD8α跨膜域、及含有CD28、4-1BB、及CD3ζ之胞內信號傳導域。
在另一實施例中，CAR包含CD8α鉸鏈域、CD8α跨膜域、及含有CD3ζ及4-1BB共刺激域之信號傳導域的胞內信號傳導域。
在另一實施例中，CAR包含CD8a鉸鏈區，其包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列；跨膜域，其包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列；及胞內信號傳導域，其包含含有SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的共刺激域、及含有SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的初級信號傳導域。
因此，本發明提供CAR T細胞及其用於過繼性療法之方法。
本揭露進一步提供本文中所述之CAR、核酸、多肽、及蛋白質的變體，例如功能性變體。「變體(variant)」係指因一或多個修飾（例如取代、插入、或缺失）而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。如本文中所使用，用語「功能性變體(functional variant)」係指具有與親本CAR、多肽、或蛋白質實質或顯著的序列同一性或相似性之CAR、多肽、或蛋白質，其中功能性變體保留就其而言為變體之CAR、多肽、或蛋白質的生物活性。功能性變體涵蓋例如本文中所述之CAR、多肽、或蛋白質（親本CAR、多肽、或蛋白質）的變體，其保留以與親本CAR、多肽、或蛋白質相似程度、相同程度、或更高程度辨識目標細胞的能力。參照親本CAR、多肽、或蛋白質，功能性變體在胺基酸序列上可與親本CAR、多肽、或蛋白質例如至少約30%、約40%、約約50%、約60%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更高同一。
在本文中，多肽之結構在某些地方係基於與所述參考序列（具有給定SEQ ID NO）之序列同一性%來定義。在此背景下，兩個胺基酸序列之間的序列同一性%可藉由比較以最佳方式比對之這兩個序列來判定，且其中所要比較之胺基酸序列相對於參考序列可包含添加或刪除以在這兩個序列之間達到最佳比對。同一性百分比係藉由下列方式計算：判定兩個序列之間胺基酸殘基為同一的相同位置數目，將此相同位置數目除以比較窗中之位置總數，然後將所獲得之結果乘以100，以獲得這兩個序列之間的同一性百分比。一般而言，比較窗將對應於所要比較之序列的全長。例如，可以使用BLAST程式「BLAST 2 sequences」(Tatusova et al，「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」，FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)，此程式可在網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html上取得，所使用之參數係預設所給予者（尤其是針對參數「開放缺口罰分(open gap penalty)」：5、及「延伸缺口罰分(extension gap penalty)」：2；所選用之矩陣係例如程式所建議之矩陣「BLOSUM 62」），兩個所要比較之序列之間的同一性百分比係由程式直接計算得到。判定查詢序列與參考序列之序列同一性係所屬技術領域中具有通常知識者之能力所及，且可使用市售可得之分析軟體（諸如BLAST™）執行。
功能性變體可例如包含具有至少一個保守性胺基酸取代的親本CAR、多肽、或蛋白質之胺基酸序列。在另一實施例中，功能性變體可包含具有至少一個非保守性胺基酸取代的親本CAR、多肽、或蛋白質之胺基酸序列。在此情況下，非保守性胺基酸取代不會干擾或抑制功能性變體之生物活性。非保守性胺基酸取代可增強功能性變體之生物活性，使得功能性變體之生物活性相較於親本CAR、多肽、或蛋白質增加。
本發明CAR之胺基酸取代可係保守性胺基酸取代。保守性胺基酸取代在所屬技術領域中係已知的，並包括將具有某些物理及/或化學性質之一個胺基酸交換為具有相同或類似化學或物理性質之另一胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，保守性胺基酸取代可係酸性胺基酸取代另一酸性胺基酸（例如Asp或Glu）、具有非極性側鏈之胺基酸取代具有非極性側鏈之另一胺基酸（例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等）、鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸（Lys、Arg等）、具有極性側鏈之胺基酸取代具有極性側鏈之另一胺基酸（Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等）等。
CAR、多肽、或蛋白質可基本上由本文中所述之一或多個指明的胺基酸序列所組成，使得其他組分（例如其他胺基酸）不會實質上改變功能性變體之生物活性。
本揭露之實施例的CAR、多肽、及蛋白質（包括功能性部分及功能性變體）可係任何長度，即可包含任何數目的胺基酸，前提為CAR、多肽、或蛋白質（或其功能性部分或功能性變體）保留其生物活性，例如與抗原特異性結合、檢測宿主中患病細胞（例如癌細胞）、或治療或預防宿主之疾病的能力等。舉例而言，多肽可係約50至約5000個胺基酸長，諸如長度為約50個、約70個、約75個、約100個、約125個、約150個、約175個、約200個、約225個、約250個、約275個、約300個、約325個、約350個、約375個、約400個、約425個、約450個、約475個、約500個、約525個、約550個、約575個、約600個、約625個、約650個、約675個、約700個、約725個、約750個、約775個、約800個、約825個、約850個、約875個、約900個、約925個、約950個、約975個、約1000個、或更多個胺基酸。本發明之多肽亦包括寡肽。
本發明之實施例的CAR、多肽、及蛋白質（包括本發明之功能性部分及功能性變體）可包含合成胺基酸以代替一或多種天然存在的胺基酸。此類合成胺基酸在所屬技術領域中係已知的，並包括例如胺基環己烷羧酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸(homoserine)、S-乙醯基胺基甲基-半胱胺酸、反3-及反4-羥脯胺酸、4-胺基苯基丙胺酸、4-硝基苯基丙胺酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯基丙胺酸、4-氯苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、β-苯基絲胺酸、β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、N'-苄基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苄基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷羧酸、α-胺基環己烷羧酸、α-胺基環庚烷羧酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、及α-三級丁基甘胺酸。
本發明之實施例的CAR、多肽、及蛋白質（包括功能性部分及功能性變體）可經受轉譯後修飾。可將彼等醣基化、酯化、N-醯化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、經由例如雙硫鍵環化、或轉變成酸加成鹽(acid addition salt)。在一些實施例中，彼等經二聚化、或聚合、或接合。
本發明之實施例的CAR、多肽、及/或蛋白質（包括其功能性部分及功能性變體）可藉由所屬技術領域中已知的方法獲得。從頭(de novo )合成多肽及蛋白質之合適方法係描述於參考文獻中，諸如Chan et al.,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis , Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；Peptide and Protein Drug Analysis , ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc.,2000；及Epitope Mapping , ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001。同樣，多肽及蛋白質可使用標準重組方法使用本文中所述之核酸重組生產。參見例如Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。此外，本發明之一些CAR、多肽、及/或蛋白質（包括其功能性部分及功能性變體）可自來源（諸如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物等）單離及/或純化。單離及純化之方法在所屬技術領域中係已知的。替代地，本文中所述之CAR、多肽、及/或蛋白質（包括其功能性部分及功能性變體）可經商業合成。在此方面，CAR、多肽、及蛋白質可係合成的、重組的、經單離、及/或經純化。
可用於產生用於生產本文中所述之多肽的重組核酸之經修飾核苷酸的實例包括但不限於5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、羧基甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N6 -取代腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧碇、β-D-甘露糖基Q核苷、5″-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6 -異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、偽尿嘧啶、Q核苷(queuosine)、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷(inosine)、N6 -異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲基酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、及2,6-二胺基嘌呤。
核酸可包含編碼CAR、多肽、或蛋白質、或其功能性部分或功能性變體中任一者之經單離或純化的任何核苷酸序列。替代地，核苷酸序列可包含簡併成該等序列中任一者的核苷酸序列或簡併序列之組合。
本發明之一些實施例亦提供一種經單離或經純化之核酸，其包含與本文中所述之任何核酸的核苷酸序列互補之核苷酸序列、或在嚴格條件下與本文中所述之任何核酸的核苷酸序列雜交之核苷酸序列。
在嚴格條件下雜交之核苷酸序列可在高嚴格度條件下雜交。所謂「高嚴格度條件(high stringency condition)」意指核苷酸序列與目標序列（本文中所述之任何核酸的核苷酸序列）以可檢測地比非特異性雜交更強之量特異性雜交。高嚴格度條件包括能自恰巧具有少數小區域（例如3至12個鹼基）匹配核苷酸序列之隨機序列中區別出具有精確互補序列之多核苷酸、或僅含有少數零散不匹配之多核苷酸的條件。此類小區域互補性比14至17個或更多個鹼基之全長互補體更容易解鏈(melted)，且高嚴格度雜交使其可容易地區別出來。相對高嚴格度條件會包括例如低鹽及/或高溫條件，諸如由約0.02至0.1 M NaCl或等效物在約50至70℃之溫度下所提供之條件。此類高嚴格度條件在核苷酸序列與模板或目標鏈之間容許少許的不匹配（若有的話），且特別適用於檢測本文中所述之CAR中任一者之表現。一般認為，藉由添加增加量的甲醯胺可使條件變得更嚴格。
在一實施例中，本發明之核酸可併入重組表現載體中。本揭露提供包含本發明之核酸中任一者的重組表現載體。如本文中所使用，用語「重組表現載體(recombinant expression vector)」意指經基因修飾之寡核苷酸或多核苷酸建構體，當建構體包含編碼mRNA、蛋白質、多肽、或肽之核苷酸序列，且載體係在足以使mRNA、蛋白質、多肽、或肽在宿主細胞內表現之條件下與宿主細胞接觸時，建構體允許由宿主細胞表現該mRNA、蛋白質、多肽、或肽。本文中所述之載體整體上不是天然存在的；然而，載體之部分可係天然存在的。所述重組表現載體可包含任何類型的核苷酸（包括但不限於DNA及RNA），其可係單股或雙股的、合成或部分自天然來源獲得的，且其可含有天然、非天然或經改變之核苷酸。重組表現載體可包含天然存在或非天然存在的核苷間鍵聯、或兩種類型的鍵聯。非天然存在或經改變之核苷酸或核苷間鍵聯不會阻礙載體之轉錄或複製。
在一實施例中，本發明之重組表現載體可係任何合適的重組表現載體，且可用於轉化或轉染任何合適的宿主。適合的載體包括經設計用於增殖及擴增、或用於表現、或兩者的載體，諸如質體及病毒。載體可選自由下列所組成之群組：pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、及pEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)。可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λEMBL4、及λNM1149、λZapII (Stratagene)。植物表現載體之實例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3、及pBIN19 (Clontech)。動物表現載體之實例包括pEUK-Cl、pMAM、及pMAMneo (Clontech)。重組表現載體可係病毒載體，例如反轉錄病毒載體，例如γ反轉錄病毒載體。
在一實施例中，本發明之重組表現載體係使用描述於例如上述Sambrook等人及上述Ausubel等人之標準重組DNA技術來製備。可製備環狀或線形表現載體的建構體，以在原核或真核宿主細胞中含有複製系統功能。複製系統可衍生自例如ColE1、SV40、2 µ質體、λ、牛乳頭狀瘤病毒、及類似者。
重組表現載體可包含調控序列（諸如轉錄及轉譯起始密碼子及終止密碼子），在適當時並考慮到載體是基於DNA或基於RNA，該調控序列係特定於引入該載體之宿主（例如細菌、植物、真菌、或動物）類型。
重組表現載體可包括一或多種標記基因，其允許選擇經轉化或經轉染宿主。標記基因包括殺生物劑抗性（例如對抗生素、重金屬等具有抗性）、在營養缺陷型宿主(auxotrophic host)有互補作用以提供原養型(prototrophy)、及類似者。用於所述表現載體之適合標記基因包括例如新黴素/G418抗性基因、組胺醇x抗性基因、組胺醇抗性基因、四環素抗性基因、及安比西林(ampicillin)抗性基因。
重組表現載體可包含內源(native)或標準(normative)啟動子，其可操作地連接至編碼CAR、多肽、或蛋白質（包括其功能性部分及功能性變體）之核苷酸序列，或可操作地連接至與編碼該CAR、多肽、或蛋白質之核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列。選擇例如強、弱、組織特異性、誘發性、及發育特異性之啟動子係在技術人員之通常知識範圍內。類似地，將核苷酸序列與啟動子組合亦在技術人員之知識範圍內。啟動子可係非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子、或存在於鼠類幹細胞病毒之長末端重複序列(long-terminal repeat)中的啟動子。
重組表現載體可經設計以用於暫時表現、或用於穩定表現、或用於兩者。同樣，重組表現載體可經製造以用於持續性表現(constitutive expression)或誘發性表現(inducible expression)。
此外，重組表現載體可製造為包括自殺基因。如本文中所使用，用語「自殺基因(suicide gene)」係指造成表現自殺基因之細胞死亡的基因。自殺基因可係賦予表現該基因之細胞對藥劑（例如藥物）之敏感性、且當該細胞與該藥劑接觸或暴露於該藥劑時造成該細胞死亡之基因。自殺基因在所屬技術領域係已知的，並包括例如單純疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶、及硝基還原酶。
包括在本發明之範疇中係偶聯物，例如生物偶聯物，其包含CAR、多肽、及蛋白質（包括其功能性部分或功能性變體）、宿主細胞、核酸、重組表現載體、宿主細胞群、或抗體或其抗原結合部分中之任一者。偶聯物、以及一般合成偶聯物之方法在所屬技術領域中係已知的（參見例如Hudecz, F.,Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) and Kirin et al.,Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)）。
本發明之一實施例進一步提供一種抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分與本發明之CAR的表位結合（例如特異性結合）。
抗體可係所屬技術領域中已知之任何類型的免疫球蛋白。免疫球蛋白可被分為五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。IgA及IgG被進一步分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。脊椎動物物種之抗體輕鏈可被分為兩種類型（kappa (κ)及lambda (λ)）中之一者，此係基於其恆定域之胺基酸序列。抗體可屬於任何類別或同型。
抗體包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體（包括鼠類、人類、人源化(humanized)、及嵌合單株抗體）、多株抗體、抗原結合片段、雙特異性或多特異性抗體、單聚體、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾組態。抗體可係天然存在的抗體，例如自哺乳動物（例如鼠類、靈長類、小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人類等）單離及/或純化之抗體。替代地，抗體可係經工程改造（例如經基因工程改造）之抗體。
人源化抗體具有衍生自非人類物種之抗原結合部位，且可變區架構係衍生自人類免疫球蛋白序列。人類抗體具有重鏈及輕鏈可變區，其中架構及抗原結合部位兩者皆衍生自人源序列。
同樣，抗體可對CAR之功能性部分具有任何水平的親和力或親留力(avidity)。在一些實施例中，抗體可以一範圍之親和力(KD )結合hK2抗原。在根據本發明之一個實施例中，及在下列每一個編號實施例之一些實施例中，抗體以高親和力與hK2抗原結合，例如KD等於或小於約10−7 M，諸如但不限於1至9.9（或其中任何範圍或值，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、或9）×10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M、10−12 M、10−13 M、10−14 M、10−15 M、或其中任何範圍或值，如藉由表面電漿共振或Kinexa方法判定，如所屬技術領域中具有通常知識者所實踐。一個例示親和力等於或小於1×10−8 M。另一例示親和力等於或小於1×10−9 M。
測試抗體之與CAR之任何功能性部分結合的能力之方法在所屬技術領域中係已知的，並包括任何抗體-抗原結合檢定，諸如例如放射免疫檢定(RIA)、西方墨點法、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫沉澱法、及競爭性抑制檢定。
製造抗體之適合方法在所屬技術領域中係已知的。例如，標準融合瘤方法係描述於例如Köhler and Milstein,Eur. J. Immunol. , 5, 511-519 (1976)、Harlow and Lane (eds.),Antibodies: A Laboratory Manual , CSH Press (1988)、及C. A. Janeway et al. (eds.),Immunobiology , 5th Ed., Garland Publishing, New York, N.Y. (2001)）。替代地，其他方法在所屬技術領域中係已知的，諸如EBV-融合瘤方法（Haskard and Archer, J.Immunol. Methods , 74(2), 361-67 (1984)及Roder et al.,Methods Enzymol. , 121, 140-67 (1986)）、及噬菌體載體表現系統（參見例如Huse et al.,Science , 246, 1275-81 (1989)）。此外，在非人類動物中生產抗體之方法係描述於例如美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、及第5,714,352號、及美國專利申請公開案第2002/0197266 A1號中。
噬菌體展示亦可用於產生抗體。就此而言，可使用標準分子生物學及重組DNA技術來產生編碼抗體之抗原結合可變(V)域的噬菌體庫（參見例如上述Sambrook等人及上述Ausubel等人）。選擇編碼具有所欲特異性之可變區的噬菌體以與所欲抗原（即，hK2）特異性結合，並重構包含所選可變域之完整或部分抗體。將編碼經重構抗體之核酸序列引入適合細胞系（諸如用於融合瘤生產之骨髓瘤細胞）中，此得由細胞分泌具有單株抗體之特性的抗體（參見例如上述Janeway等人、上述Huse等人、及美國專利第6,265,150號）。
抗體可藉由經過特定重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因基因轉殖的基因轉殖小鼠生產。此類方法在所屬技術領域中係已知的，且係描述於例如美國專利第5,545,806號及第5,569,825號、及上述Janeway等人中。
用於產生人源化抗體之方法在所屬技術領域中係已知的，且係描述於例如上述Janeway等人、美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、及第5,693,761號、歐洲專利第0239400 B1號、及英國專利第2188638號中。亦可使用描述於美國專利第5,639,641號及Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994)中之抗體表面重塑技術(resurfacing technology)產生人源化抗體。
如本文中所使用，抗體可係多鏈或單鏈、或完整免疫球蛋白，並可衍生自天然來源或衍生自重組來源。抗體可係免疫球蛋白分子之四聚體。
用語「抗體片段(antibody fragment)」係指完整抗體或其重組變體之至少一部分，該抗體片段保留親本全長抗體之抗原結合性質。舉例而言，其係指抗原結合域，例如完整抗體之抗原決定可變區，其係足以賦予抗體片段對目標（諸如抗原）之辨識及結合（例如特異性結合）。「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指免疫球蛋白分子之一部分。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、單鏈抗體(scFv)、線性抗體、單域抗體（諸如sdAb（VL或VH））、駱駝科(camelid) VHH域、及由抗體片段形成之多特異性抗體。
用語「scFv」係指一種蛋白質，其包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段。在一些實施例中，輕鏈可變區及重鏈可變區經由短可撓性多肽連接子相鄰地連接，並能夠以單鏈多肽表現，且其中scFv保留完整抗體（衍生出該scFv）的特異性。除非有指明，否則如本文中所使用，scFv可具有呈任一順序之VL及VH可變區，例如就多肽之N端及C端而言，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
本發明之一實施例亦提供本文中所述之抗體之任一者的抗原結合部分。抗原結合部分可係具有至少一個抗原結合部位之任何部分，諸如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、雙鏈抗體、及三鏈抗體(triabody)。
在一些實施例中，抗原結合片段係重鏈互補決定區(HCDR) 1、2、及/或3、輕鏈互補決定區(LCDR) 1、2、及/或3、重鏈可變區(VH)、或輕鏈可變區(VL)、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、及包含一個VH域或一個VL域（例如由其組成）的域抗體(dAb)。VH及VL域可經由連接子（例如合成連接子）連接在一起。
「互補決定區(complementarity determining region, CDR)」係抗體中的抗原結合部位。CDR可使用各種用語來定義：(i)互補決定區(CDR)，三個在VH（HCDR1、HCDR2、HCDR3）且三個在VL（LCDR1、LCDR2、LCDR3），其係基於序列變異性（Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）。(ii)「高度變異區(hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」，三個在VH（H1、H2、H3）且三個在VL（L1、L2、L3），其係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異之抗體可變域中的區域(Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics, IMGT)資料庫(http://www_imgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003。如本文中所使用，用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、或IMGT中之任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明。
同樣，抗體、或其抗原結合部分可經修飾以包含可檢測之標示，諸如例如放射性同位素、螢光團（例如螢光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(Pe)）、酶（例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶）、及元素粒子（例如金粒子）。
本揭露亦提供一種核酸，其包含編碼本文中所述之CAR、多肽、或蛋白質（包括其功能性部分及功能性變體）中之任一者的核苷酸序列。
CAR包含抗體或其抗體片段之部分可以各種形式存在，其中抗原結合域係以相鄰多肽鏈之部分表現，該部分包括例如單域抗體片段(sdAb)、scFv、及人類嵌合抗體或人源化抗體（Harlow et al., 1999,In: Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.；Harlow et al., 1989,In: Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, N.Y.；Houston et al., 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988,Science 242:423-426）。在一個態樣中，本發明之CAR組成物的抗原結合域包含抗體片段。在一個態樣中，CAR包含抗體片段，該抗體片段包含scFv。
用語「重組抗體(recombinant antibody)」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如例如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該用語亦應解讀為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子或指定該抗體之胺基酸序列來產生的抗體，且該DNA分子表現抗體蛋白質，其中該DNA或胺基酸序列已使用所屬技術領域中可得且已知的重組DNA或胺基酸序列技術來獲得。
用語「抗原(antigen)」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體生產、或特定免疫機能健全細胞之活化、或兩者。所屬技術領域中具有通常知識者會理解任何巨分子（包括實際上所有蛋白質或肽）皆可作為抗原。此外，抗原可衍生自重組或基因組DNA。所屬技術領域中具有通常知識者會理解，包含編碼誘發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因而編碼如本文中所使用之用語「抗原」。此外，所屬技術領域中具有通常知識者會理解，抗原不需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。顯然，本揭露包括但不限於使用多於一個基因之部分核苷酸序列，且此等核苷酸序列係以各種組合排列以編碼誘發所欲免疫反應的多肽。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域結合hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 來自包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3； 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含來自包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的可變區之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，及來自包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的可變區之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 309、及SEQ ID NO: 314之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR1，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 310、及SEQ ID NO: 315之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR2，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 122、及SEQ ID NO: 311之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的重鏈CDR3，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3， 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3；
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 136、及SEQ ID NO: 312之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR1，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 137、及SEQ ID NO: 313之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR2，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有選自由SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 138、及SEQ ID NO: 139之胺基酸序列、及其保守性修飾所組成之群組的輕鏈CDR3，其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3， 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 輕鏈可變區(LCVR)，其包含選自由SEQ ID NO: 1至3所組成之群組的胺基酸序列；或重鏈可變區(HCVR)，其包含選自由SEQ ID NO: 4至6所組成之群組的胺基酸序列；或包含選自由SEQ ID NO: 1至3所組成之群組的胺基酸序列之LCVR、與包含選自由SEQ ID NO: 4至6所組成之群組的胺基酸序列之HCVR的組合，其中該胞外抗原結合域結合hK2抗原。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區；包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區、及含有SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含： 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 74具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 76具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 77具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 147具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 140具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 141具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 140具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 148具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 142具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 149具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 143具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 150具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 144具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 151具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 145具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 152具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 146具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列； 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 318具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 317具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 5具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 74具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 76具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 77具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 147具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 140具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 141具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 75具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 140具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 148具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 142具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 149具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 143具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 150具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 144具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 151具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 145具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 152具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 146具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 318具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 317具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含scFv。在一些實施例中，scFv包含在輕鏈可變區與重鏈可變區之間的連接子多肽(linker polypeptide)。在某些實施例中，胞外抗原結合域係scFv，其包含選自由SEQ ID NO: 8至23、169至184、及340至343所組成之群組的胺基酸序列，並與hK2多肽（例如，具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的人類hK2多肽或其片段）特異性結合。
在重組表現系統中，連接子係肽連接子並可包括任何天然存在的胺基酸。可被包括至連接子中之例示性胺基酸係Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His、及The。連接子應具有適當之長度，以將VH及VL以使彼等相對於彼此形成正確構形之方式連接，使得彼等保留所欲活性，諸如與hK2結合。
連接子可係約5至50個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至40個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約15至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係6個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係7個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係8個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係9個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係10個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係11個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係12個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係13個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係14個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係15個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係16個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係17個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係18個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係19個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係21個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係22個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係23個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係24個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係26個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係27個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係28個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係29個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係31個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係32個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係33個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係34個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係36個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係37個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係38個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係39個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係40個胺基酸長。可使用之例示性連接子係富含Gly之連接子、含Gly及Ser之連接子、含Gly及Ala之連接子、含Ala及Ser之連接子、及其他可撓性連接子。
在一個實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一個實施例中，連接子多肽包含與SEQ ID NO: 7具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，連接子多肽包含SEQ ID NO: 237至268中任一者之胺基酸序列。在一個實施例中，連接子多肽包含與SEQ ID NO: 237至268中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，scFv包含選自由SEQ ID NO: 8至23、169至184、及340至343所組成之群組的胺基酸序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 8具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 8之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 9具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 9之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 10具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 10之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 11具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 11之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 12具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 12之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 13具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 13之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 14具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 14之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 15具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 15之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 16具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 16之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 17具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 17之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 18具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 18之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 19具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 19之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 20具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 20之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 21具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 21之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 22具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 22之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 23具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 23之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 169具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 169之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 170具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 170之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 171具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 171之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 172具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 172之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 173具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 173之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 174具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 174之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 175具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 175之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 176具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 176之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 177具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 177之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 178具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 178之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 179具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 179之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 180具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 180之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 181具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 181之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 182具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 182之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 183具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 183之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 184具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 184之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 340具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 340之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 341具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 341之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 342具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 342之序列。在一個實施例中，scFv包含與SEQ ID NO: 343具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 343之序列。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含信號多肽。信號多肽可位於結合hK2之胞外抗原結合域的N端。信號多肽視情況可在細胞處理及CAR定位至細胞膜期間自胞外抗原結合域切割。所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何各種信號多肽皆可用作為信號多肽。可衍生出信號多肽之肽的非限制性實例包括FcεR、人類免疫球蛋白(IgG)重鏈(HC)可變區、CD8α、或T細胞所分泌之任何各種其他蛋白質。在各種實施例中，信號多肽與T細胞之分泌路徑相容。在一些實施例中，信號多肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在一個實施例中，信號多肽包含與SEQ ID NO: 24具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個態樣中，本揭露提供一種CAR，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。具有包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列之胞外抗原結合域的CAR之另一特徵係該胞外抗原結合域結合hK2抗原。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9 (CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員（諸如例如CD28或誘發性T細胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator, ICOS)）組分、及其組合。
在一個實施例中，CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在一個實施例中，CD137組分包含與SEQ ID NO: 27具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一個實施例中，CD3z組分包含與SEQ ID NO: 28具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 45具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8a-TM多肽包含與SEQ ID NO: 26具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，跨膜域至少包含下列者之（多個）跨膜區：T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在另一實施例中，跨膜域至少包含下列者之跨膜域：ζ、η、或FcεR1γ及-β、MB1 (Igα.)、B29、或CD3-γ、ζ、或η。在另一實施例中，跨膜域係合成的，例如其主要包含疏水性殘基（諸如白胺酸及纈胺酸）、苯丙胺酸三聯體(triplet)、或色胺酸。
在一個實施例中，CAR進一步包含將跨膜域連接至胞外抗原結合域之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 269)，或包含與EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 269)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 270)，或包含與ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 270)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID NO: 271)，或包含與ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID NO: 271)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含序列ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 272)，或包含與ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 272)具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一個實施例中，CAR包含胞外抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域、及胞內信號傳導域。在一個此類實施例中，鉸鏈區係CD8α鉸鏈區，跨膜域係CD8α-TM域，且胞內信號傳導域包含CD3ζ域及4-1BB/CD137域。
在一個此類實施例中，鉸鏈區係包含SEQ ID No: 25之胺基酸序列的CD8α鉸鏈區，跨膜域係包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CD8α-TM域，且胞內信號傳導域包含CD3ζ域及4-1BB/CD137域，其包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列。
在另一實施例中，鉸鏈區係包含SEQ ID No: 25之胺基酸序列的CD8α鉸鏈區，跨膜域係包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CD8α-TM域，且胞內信號傳導域包含含有SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的4-1BB/CD137域、及含有SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的CD3ζ域。
在一個實施例中，胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 29具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 29之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 30具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 30之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 31具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 31之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 32具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 32之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 33具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 33之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 34具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 34之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 35具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 35之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 36具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 36之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 37具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 37之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 38具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 38之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 39具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 39之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 40具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 40之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 41具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 41之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 42具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 42之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 43具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 43之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 44具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 44之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 78具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 78之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 79具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 79之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 80具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 80之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 81具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 81之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 221具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 221之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 222具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 222之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 223具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 223之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 224具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 224之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 225具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 225之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 226具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 226之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 227具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 227之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 228具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 228之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 229具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 229之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 230具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 230之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 231具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 231之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 232具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 232之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 233具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 233之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 234具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 234之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 235具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 235之序列。在一個實施例中，胞外抗原結合域包含與SEQ ID NO: 236具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 236之序列。CAR 建構體及表現CAR 之免疫反應性細胞
用語「編碼(encoding)」係指多核苷酸（諸如基因、cDNA、或mRNA）中核苷酸之特定序列在生物程序中作為合成其他聚合物及巨分子之模板的固有性質，該等聚合物及大分子具有所定義之核苷酸序列（例如rRNA、tRNA、及mRNA）或所定義之胺基酸序列、及自其得到之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中生產蛋白質，則該基因、cDNA、或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列同一的編碼股及用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股兩者皆可稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA之其他產物。
除非另有指明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括係彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到使編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有（多個）內含子之程度。
用語「表現載體(expression vector)」係指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含足以供表現之順式作用元件(cis-acting element)；其他表現元件可由宿主細胞或在體外表現系統中供應。表現載體包括所屬技術領域中已知之所有表現載體，包括併入重組多核苷酸之黏質體、質體（例如裸露或含於脂質體中）、及病毒（例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒）。
在一個實施例中，本揭露提供一種細胞，其表現編碼CAR之核酸分子。在一個實施例中，本揭露之CAR包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 46具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 46之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 47具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 47之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 48具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 48之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 49具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 49之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 50具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 50之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 51具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 51之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 52具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 52之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 53具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 53之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 54具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 54之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 55具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 55之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 56具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 56之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 57具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 57之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 58具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 58之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 59具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 59之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 60具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 60之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 61具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 82具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 82之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 83具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 83之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 84具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 84之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 85具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 85之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 205具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 205之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 206具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 206之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 207具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 207之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 208具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 208之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 209具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 209之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 210具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 210之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 211具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 211之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 212具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 212之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 213具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 213之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 214具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 214之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 215具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 215之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 216具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 216之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 217具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 217之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 218具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 218之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 219具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 219之序列。在一些實施例中，本揭露之CAR包含與SEQ ID NO: 220具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 220之序列。
在某些實施例中，CAR可包含信號多肽。在某些實施例中，信號肽係在CAR序列之N端。在某些實施例中，信號肽係在CAR序列之C端。在某些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或係由該胺基酸序列所組成。
在本文中，核酸分子之結構在某些地方係基於與所述參考序列（具有給定SEQ ID NO）之序列同一性%來定義。在此背景下，關於核酸分子之序列同一性%係指至少兩種不同核酸序列之間的相似性。當兩個比較序列兩者中的位置係由相同的鹼基佔據時，例如如果兩個DNA分子之各者中的位置係由腺嘌呤佔據，則分子在該位置係同一的，兩個序列之間的同一性百分比係以下者之函數：由兩個序列共有之匹配或同源位置數目除以所比較之位置數目然後乘以100。例如，如果兩個序列中之位置10個中有6個係匹配或同源的，則兩個序列為60%同一（或同源）。舉實例而言，DNA序列ATTGCC與TATGGC共享50%同一性（或同源性）。通常而言，比較係在將兩個序列比對以給出最大同源性時進行。各別同一性百分比可藉由標準比對演算法判定，例如Altshul等人所述之Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ((1990) J. MoI. Biol. 215:403-10)；Needleman等人之演算法((1970) J. MoI. Biol. 48:444-53)；或Meyers等人之演算法((1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)。一組參數可係Blosum 62計分矩陣，其中缺口罰分(gap penalty)為12，缺口延伸罰分為4，且框移缺口罰分(frameshift gap penalty)為5。兩個核酸序列之間的同一性百分比亦可使用Meyers及Miller之演算法((1989) CABIOS 4:11-17)（其已被併入ALIGN程式（2.0版）中）來判定，其使用PAM120權重殘基表(weight residue table)、12之缺口長度罰分(gap length penalty)、及4之缺口罰分。同一性百分比通常係藉由比較類似長度的序列來計算。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 153至160中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 153至160中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 161至168中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 161至168中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 195至204中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 195至204中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 320至325中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 320至325中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 326至331中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 326至331中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含SEQ ID NO: 336至339中任一者之核酸序列。在各種實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 336至339中任一者具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列的核酸序列。
在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 153具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 153之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 154具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 154之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 155具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 155之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 156具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 156之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 157具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 157之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 158具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 158之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 159具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 159之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 160具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 160之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 161具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 161之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 162具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 162之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 163具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 163之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 164具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 164之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 165具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 165之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 166具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 166之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 167具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 167之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 168具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 168之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 195具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 195之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 196具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 196之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 197具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 197之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 198具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 198之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 199具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 199之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 200具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 200之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 201具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 201之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 202具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 202之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 203具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 203之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 204具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 204之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 320具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 320之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 321具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 321之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 322具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 322之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 323具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 323之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 324具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 324之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 325具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 325之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 326具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 326之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 327具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 327之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 328具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 328之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 329具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 329之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 330具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 330之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 331具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 331之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 336具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 336之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 337具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 337之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 338具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 338之序列的核酸序列。在一實施例中，編碼CAR之核酸分子包含含有與SEQ ID NO: 339具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之序列、或SEQ ID NO: 339之序列的核酸序列。
在一個態樣中，本揭露提供包含本文中所述之CAR的經單離之免疫反應性細胞。在一些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞用CAR轉導，例如使CAR在免疫反應性細胞之表面上持續表現。在某些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞進一步用至少一種共刺激配體轉導，使得該免疫反應性細胞表現該至少一種共刺激配體。在某些實施例中，至少一種共刺激配體係選自由下列所組成之群組：4-1BBL、CD48、CD70、CD80、CD86、OX40L、TNFRSF14、及其組合。在某些實施例中，將經單離之免疫反應性細胞進一步用至少一種細胞介素轉導，使得該免疫反應性細胞分泌該至少一種細胞介素。在某些實施例中，至少一種細胞介素係選自由下列所組成之群組：IL-2、IL-3，IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、及其組合。在一些實施例中，經單離之免疫反應性細胞係選自由下列所組成之群組：T淋巴球（T細胞）、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、人類胚胎幹細胞、淋巴樣前驅細胞(lymphoid progenitor cell)、T細胞前體細胞(T cell-precursor cell)、及多能性幹細胞（自其可分化出淋巴樣細胞）。
在一個實施例中，本揭露之CAR T細胞可藉由將包含所欲CAR（例如包含抗hK2、CD8α鉸鏈及跨膜域、及人類4-1BB及CD3ζ信號傳導域之CAR）之慢病毒載體引入細胞中來產生。本發明之CAR T細胞能夠在體內複製導致長期持續存在，致使腫瘤控制得以持續。
本發明之實施例進一步提供宿主細胞，其包含本文中所述之重組表現載體中之任一者。如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」係指可含有重組表現載體之任何類型的細胞。宿主細胞可係真核細胞（例如植物、動物、或藻類、真菌）或可係原核細胞（例如細菌或原生動物）。宿主細胞可係經培養之細胞或初代細胞，即直接自生物（例如人類）單離。宿主細胞可係貼附性細胞或懸浮細胞（即在懸浮液中生長之細胞）。合適的宿主細胞在所屬技術領域中係已知的，並包括例如DH5α大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞、及類似者。出於擴增或複製重組表現載體之目的，宿主細胞可係原核細胞，例如DH5α細胞。出於產生重組CAR、多肽、或蛋白質之目的，宿主細胞可係哺乳動物細胞。宿主細胞可係人類細胞。雖然宿主細胞可屬於任何細胞類型，可源自於任何類型的組織，且可處於任何發展階段，但宿主細胞可係周邊血液淋巴球(PBL)。宿主細胞可係T細胞。
出於本文中之目的，T細胞可係任何T細胞，諸如經培養之T細胞（例如初代T細胞）、或來自經培養之T細胞系（例如Jurkat、SupT1等）的T細胞、或獲自哺乳動物之T細胞。若獲自哺乳動物，則T細胞可獲自許多來源，包括但不限於骨髓、血液、淋巴結、胸腺、或其他組織或流體。T細胞亦可經富集或純化。T細胞可係人類T細胞。T細胞可係單離自人類之T細胞。T細胞可係任何類型的T細胞且可處於任何發展階段，包括但不限於CD4+ /CD8+ 雙陽性T細胞、CD8+ T細胞（例如細胞毒性T細胞）、CD4+ 輔助T細胞（例如Th1及Th2細胞）、周邊血液單核細胞(PBMC)、周邊血液白血球(PBL)、腫瘤浸潤細胞(tumor infiltrating cell)、記憶T細胞、初始T細胞、及類似者。T細胞可係CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
亦提供一種細胞群，其包含至少一種本文所述之宿主細胞。細胞群可係非均質族群，其除了至少一種其他細胞以外包含含有所述重組表現載體中之任一者的宿主細胞，其他細胞例如不包含該等重組表現載體中之任一者的宿主細胞（例如T細胞）或T細胞以外之細胞（例如B細胞、巨噬細胞、紅血球、嗜中性球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等）。替代地，細胞群可係實質上均質族群，其中族群主要包含宿主細胞（例如基本上由其所組成），該等宿主細胞包含該重組表現載體。族群亦可係細胞之殖株族群，在其中該族群之所有細胞係單一宿主細胞之殖株，該宿主細胞包含重組表現載體，使得該族群之所有細胞包含該重組表現載體。在一個實施例中，細胞群係包含宿主細胞之殖株族群，該等宿主細胞包含如本文中所述之重組表現載體。醫藥組成物/ 投予
在本揭露之實施例中，表現CAR之細胞可以組成物形式提供，例如適合的（多種）醫藥組成物，其包含表現CAR之細胞及醫藥上可接受之載劑。在一個態樣中，本揭露提供醫藥組成物，其包含有效量的表現一或多種所述CAR的淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。本揭露之醫藥組成物可包含表現CAR之細胞（例如複數個表現CAR之細胞，如本文中所述）與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑的組合。如本文中所使用，用語「與 … 組合(in combination with) 」意指將二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，其係並行以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。
醫藥上可接受之載劑可係活性成分以外之醫藥組成物中的成分，其對對象係無毒的。
醫藥上可接受之載劑可包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。醫藥上可接受之載劑的實例係生理上相容的溶劑、分散介質、覆膜(coating)、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及類似者，諸如鹽、緩衝劑、抗氧化劑、醣、水性或非水性載劑、防腐劑、潤濕劑、界面活性劑、或乳化劑、或其組合。醫藥組成物中醫藥上可接受之載劑的量可基於載劑之活性及配方之所欲特性（諸如穩定性及/或最小氧化）來實驗判定。
此類組成物可包含緩衝劑，諸如乙酸、檸檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、蘋果酸、天冬胺酸、組胺酸、硼酸、Tris緩衝劑、HEPPSO、HEPES、中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似者；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（如氫氧化鋁）；抗細菌劑及抗真菌劑；及防腐劑。
本揭露之組成物可經配製以用於經腸或非腸外投予之各種手段。在一個實施例中，組成物可經配製以用於輸注或靜脈內投予。本文中所揭示之組成物可例如以無菌液體製劑提供，例如等滲水溶液、乳化液、懸浮液、分散夜、黏性組成物，其可經緩衝至所欲的pH。適合用於口服投予之配方可包括液體溶液、膠囊、囊劑(sachet)、錠劑、口含錠(lozenge)、及口含錠(troche)、於適當液體中之粉末液體懸浮液、及乳化液。
如本文中關於醫藥組成物所使用，用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」意指經美國聯邦或州政府的管理機構批准，或列在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認的藥典中以用於動物及/或人類。
在一個態樣中，本揭露係關於使用淋巴球輸注投予表現CAR之經基因修飾之T細胞，以用於治療患有癌症或有患癌症之風險的患者。在至少一個實施例中，在治療中使用自體淋巴球輸注。自有需要治療之對象收集自體PBMC，並將T細胞使用本文中所述及所屬技術領域中已知之方法活化並擴增，然後將其輸注回至該對象中。
在一個態樣中，本揭露大致上係關於治療有發展癌症之風險的對象。本發明亦包括治療對象之化學療法及/或免疫療法導致顯著免疫抑制從而增加對象發展癌症之風險的惡性疾病或自體免疫疾病。在一個態樣中，本揭露提供預防癌症之方法，該等方法包含向有需要之對象投予一定量的表現一或多種所述CAR之淋巴球。
在一個態樣中，本揭露提供治療患有癌症之對象的方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種所述CAR之淋巴球，藉此該淋巴球誘發或調節該對象中癌細胞之殺滅。
在另一態樣中，本揭露提供減少患有癌症之對象的腫瘤負荷之方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種本文中所述之CAR的淋巴球，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。在另一態樣中，本揭露提供增加患有癌症之對象的存活之方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現一或多種所述CAR之淋巴球，藉此延長該對象之存活。通常而言，表現（多種）CAR之淋巴球誘發對象中癌細胞之殺滅，並導致對象中腫瘤/癌細胞之減少或根除。可靶向的癌症（包括轉移性病灶）之非限制性清單包括前列腺癌及前列腺衍生癌症。在一個實施例中，對象中正接受治療的癌症係前列腺癌。在一些實施例中，癌症係表現雄性激素受體(AR)之乳癌。
在一個態樣中，本文中所述之方法適用於治療具有發展為癌性病況之風險的非癌性病況，諸如例如前列腺肥大、良性前列腺增生(BPH)、及沒有診斷出前列腺癌下之高PSA水平。
在一個態樣中，提供治療患有癌症之對象的方法，該等方法包含向有需要之對象投予治療有效量的表現CAR之淋巴球，該CAR具有結合hK2抗原之胞外抗原結合域，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。在一些實施例中，CAR中之至少一者包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 46具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 46之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 47具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 47之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 48具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 48之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 49具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 49之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 50具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 50之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 51具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 51之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 52具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 52之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 53具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 53之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 54具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 54之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 55具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 55之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 56具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 56之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 57具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 57之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 58具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 58之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 59具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 59之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 60具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 60之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 61具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 82具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 82之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 83具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 83之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 84具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 84之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 85具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 85之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 205具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 205之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 206具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 206之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 207具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 207之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 208具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 208之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 209具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 209之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 210具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 210之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 211具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 211之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 212具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 212之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 213具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 213之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 214具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 214之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 215具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 215之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 216具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 216之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 217具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 217之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 218具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 218之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 219具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 219之序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 220具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO: 220之序列。
在一個態樣中，揭示一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含使該癌細胞接觸表現一或多種所述CAR的淋巴球，藉此該淋巴球誘發該癌細胞之殺滅。可靶向的癌細胞（包括轉移性癌細胞）之非限制性清單包括前列腺癌及其組合。在一個實施例中，癌細胞係前列腺癌細胞。
本揭露之醫藥組成物可以適於待治療（或預防）疾病之方式投予。儘管適當劑量可藉由臨床試驗判定，但投予的數量及頻率將由諸如下列之因子判定：對象的病況、及對象的疾病之類型及嚴重性。
用語「治療（treat或treatment）」係指治療性處理，其中目的係在於減緩（減輕）非所欲之生理變化或疾病，或在治療期間提供有益或所欲之臨床結果。有益或所欲之臨床結果包括症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定化（即不惡化）、疾病進程的延緩或減緩、疾病狀態的改善或緩和、及/或緩解（無論部分或完全），無論是可檢測或不可檢測的。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象之預期存活而延長存活。那些需要治療的對象包括那些已經患有不想要的生理變化或疾病的對象，以及那些易患有該生理變化或疾病的對象。
疾病或病症之「預防(prevent/preventing/prevention/prophylaxis)」意指預防病症出現在對象中。「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「有效量(effective amount)」在本文中可互換使用，且係指有效達到所欲治療結果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在個體中誘發所欲反應的能力。有效治療劑或治療劑組合之例示指標包括例如病患幸福感的提高、腫瘤負荷的減少、腫瘤生長的停止或減緩、及/或癌細胞沒有轉移至身體的其他位置。
如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指動物。用語「對象(subject)」及「患者(patient)」在本文中提及對象時可互換使用。因此，「對象(subject)」包括作為患者正接受疾病治療或疾病預防之人類。本文中所述之方法可用來治療屬於任何分類之動物對象。此類動物之實例包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於嚙齒目之哺乳動物（諸如小鼠及倉鼠）及兔形目（諸如兔）之哺乳動物。哺乳動物可係來自食肉目，其包括貓科動物（貓）及犬科動物（狗）。哺乳動物可係來自偶蹄目，其包括牛科動物（牛）及豬科動物（豬），或屬於奇蹄目，其包括馬科動物（馬）。哺乳動物可屬於靈長目、新世界猴類(Ceboid)、或猴類(Simoid)（猴）或屬於類人猿亞目（人類及猿）。在一個實施例中，哺乳動物係人類。
當指示治療有效量時，所投予之本揭露之組成物的準確量可由醫師考慮個體在年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度、及對象病況之差異來判定。通常可陳述為，包含本文中所述之T細胞的醫藥組成物可以約104 至約1010 個細胞/kg體重之劑量、在一些情況下約105 至約106 個細胞/kg體重之劑量（包括在該等範圍內之全部整數值）投予。在一些實施例中，包含本文中所述之T細胞的醫藥組成物可以約106 個細胞/kg體重之劑量投予。T細胞組成物亦可以此等劑量投予多次。可藉由使用免疫療法中一般已知的輸注技術投予細胞（參見例如Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988）。
可用於本發明之實施例的背景中的遞送系統可包括延時釋放(time-released)、延緩釋放(delayed release)、及持續釋放(sustained release)遞送系統，使得T細胞組成物之遞送在待治療部位之敏化前發生，且有足夠的時間以引起待治療部位之敏化。組成物可與其他治療劑或療法結合使用。此類系統可避免組成物之重複投予，從而增加對對象及醫師的便利性，且可特別適用於本發明之某些組成物實施例。
許多類型的釋放遞送系統為所屬技術領域中具有通常知識者可得且已知的。彼等包括聚合物基底系統(polymer base system)，諸如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚己內酯、聚羥基丁酸、及聚酐。前述含有藥物之聚合物的微膠囊係描述於例如美國專利第5,075,109號中。遞送系統亦包括非聚合物系統，其係脂質，包括固醇（諸如膽固醇、膽固醇酯）、及脂肪酸或中性脂肪（諸如單酸、二酸、及三酸甘油酯）；矽橡膠系統；基於肽之系統；水凝膠釋放系統；蠟覆膜；使用習知黏合劑及賦形劑之壓製錠；部分融合型植入物；及類似者。具體實例包括但不限於：(a)侵蝕式系統(erosional system)，其中活性組成物係以某種形式含於基質內，諸如美國專利第4,452,775號；第4,667,014號；第4,748,034號；及第5,239,660號中所述者；及(b)擴散式系統，其中活性組分以受控制速率自聚合物滲透出來，諸如美國專利第3,854,480號及第3,832,253號中所述。此外，可使用基於泵之硬體遞送系統，其中一些經調適以用於植入。
在某些態樣中，可能所欲的是將經活化之T細胞投予至對象，隨後再抽血（或執行血球分離術），根據本揭露活化T細胞，並將這些經活化並擴增之T細胞再輸注至對象。此程序可每幾週執行多次。在某些態樣中，T細胞可由抽取10 cc至400 cc的血液來活化。在某些態樣中，T細胞係由抽取20 cc、30 cc、40 cc、50 cc、60 cc、70 cc、80 cc、90 cc、或100 cc的血液來活化。
CAR-T細胞及組成物之投予可以任何方式進行，例如藉由腸胃外或非腸胃外投予，包括藉由氣霧劑吸入、注射、輸注、攝食、輸血、植入、或移植。舉例而言，本文中所述之CAR-T細胞及組成物可經動脈、皮內、皮下、腫瘤內、髓內、結內(intranodally)、肌內、藉由靜脈(i.v.)注射、或腹膜內投予至患者。在一個態樣中，本揭露之組成物係藉由i.v.注射投予。在一個態樣中，本揭露之組成物係藉由皮內或皮下注射投予至對象。T細胞之組成物可例如直接注射至腫瘤、淋巴結、組織、器官、或感染部位中。
投予可係自體的或非自體的。例如，表現人類血管舒緩素2（例如，hK2）特異性CAR之免疫反應性細胞可獲自一個對象，並將其投予至相同對象或不同、相容的對象。本揭露之周邊血液衍生之T細胞、或經擴增之T細胞（例如，體內、離體、或體外衍生）可經由例如靜脈內注射、局部注射、全身性注射、導管投予、或腸胃外投予來投予。
在具體實施例中，對象可經歷白血球分離術(leukapheresis)，其中白血球經離體收集、富集、或去除，以選擇及/或單離出所關注之細胞（例如T細胞）。可將此等T細胞單離物藉由所屬技術領域中已知的方法擴增並處理，使得可引入本揭露之一或多種CAR建構體，從而產生CAR-T細胞。有需要之對象隨後可經歷高劑量化學療法的標準治療，接著經歷周邊血液幹細胞移植。在某些態樣中，在移植之後或與移植同時，對象接受經擴增之CAR-T細胞輸注。在一個態樣中，經擴增之細胞係在手術之前或之後投予。
投予至患有惡性疾病之患者的劑量係足以減輕或至少部分地停止所治療之疾病（「治療有效量」）。投予至患者之以上治療之劑量將隨所治療病況之準確性質及治療之接受者而變化。用於人類投予之劑量可根據所屬技術領域中一般接受之實務進行調整。
本發明之CAR T細胞可經歷體內T細胞擴增並可建立hK2特異性記憶細胞，該等記憶細胞在血液及骨髓中保持在高水平達很長的時間量。在一些情況下，將本發明之CAR T細胞輸注至對象中可在體內消除患有晚期化學療法抗性癌症之對象的癌細胞，例如前列腺癌細胞或表現AR之乳癌。
在一個實施例中，將本揭露之CAR引入T細胞中（例如使用體外轉錄），且對象（例如人類）接受本揭露之CAR-T細胞的初次投予、及CAR-T細胞之一或多次後續投予，其中一或多次後續投予係在前次投予之後少於15天投予，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天。在一個實施例中，每週向對象（例如人類）投予一次以上的CAR-T細胞投予，例如每週投予2、3、或4次的CAR-T細胞投予。在一個實施例中，對象每週接受一次以上的CAR-T細胞投予（例如每週2、3、或4次投予）（本文中亦稱為週期），之後一週沒有CAR-T細胞投予，然後向對象投予一或多次額外的CAR-T細胞投予（例如每週一次以上的CAR-T細胞投予）。在另一實施例中，對象接受一個週期以上的CAR-T細胞，且各週期之間的時間少於10、9、8、7、6、5、4、或3天。在一個實施例中，CAR-T細胞係每隔一天投予，每週3次投予。在一個實施例中，投予CAR-T細胞至少二、三、四、五、六、七、八、或更多週。
在一個實施例中，投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。
CAR-T細胞可在本發明之方法中藉由維持療法來投予，諸如例如一週一次持續6個月或更久的期間。
在一個實施例中，CAR-T細胞係使用慢病毒病毒載體（諸如慢病毒）產生。用此類病毒載體產生的CAR-T細胞通常將具有穩定的CAR表現。
在一個實施例中，CAR-T細胞在轉導之後暫時表現CAR載體達4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR之暫時表現可受RNA CAR載體遞送影響。在一個實施例中，CAR RNA係藉由電穿孔轉導至T細胞中。
若患者在暫時CAR療法療程期間有產生抗CAR抗體反應之高風險（諸如因RNA轉導而產生者），則CAR-T輸注間歇期不應持續多於十至十四天。
本文中所述之表現CAR之細胞可與其他已知的藥劑及療法組合使用。如本文中所使用，「組合(in combination)」投予意指在對象的治療療程期間將二（或更多）種不同的療法遞送至對象，例如在對象已經診斷有癌症之後及在癌症已經治癒或消除或治療已因其他原因中止之前遞送二（或更多）種療法。在一些實施例中，一種療法之遞送在第二療法之遞送開始時仍存在，使得就投予而言存在重疊。在本文中此有時被稱為「同時(simultaneous)」或「並行遞送(concurrent delivery)」。在其他實施例中，一種療法之遞送在另一種療法之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法因組合投予而更有效。舉例而言，第二療法更有效，例如用較少的第二療法見到等效效應，或第二療法減少症狀的程度大於若在不存在第一療法下投予第二療法所見到的程度，或用第一療法見到類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀或與病症相關之其他參數的減少大於在不存在另一療法下用一種療法遞送時所觀測到的減少。兩種療法之效應可係部分相加的、完全相加、的或大於相加的。遞送可使得當遞送第二療法時，仍可檢測到所遞送之第一療法之效應。
在一個實施例中，其他治療劑（諸如因子）可在投予CAR-T細胞之前、之後投予、或與CAR-T細胞在相同時間（同時）投予，包括但不限於介白素、以及群落刺激因子（諸如G-CSF、M-CSF、及GM-CSF）、及干擾素。
本文中所述之表現CAR之細胞及至少一種額外治療劑可以同一個組成物或以分開的組成物同時投予、或依序投予。針對依序投予，可先投予本文中所述之表現CAR之細胞，其次可投予另一種藥劑，或投予順序可顛倒。
在進一步實施例中，本文所述之表現CAR之細胞可與手術、輻射、化學療法、免疫抑制劑、抗劑、或其他免疫消融劑(immunoablative agent)組合使用於治療方案中。在另一實施例中，本文中所述之表現CAR之細胞可與抗雄性激素治療組合使用。在一個實施例中，可向對象投予使表現CAR之細胞之活性增強的藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制性分子之藥劑。
例示實施例說明如下。 1.       一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a)包含特異性結合至人類血管舒緩素2 (hK2)抗原之scFv的胞外域、 (b)跨膜域、及 (c)視情況包含至少一個共刺激域之胞內信號傳導域。 2.       如實施例1之CAR，其進一步包含 (d) CD8a鉸鏈區， 其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽；且 其中該胞內信號傳導域包含含有TNF受體超家族成員9 (CD137)組分之共刺激域及含有T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分之初級信號傳導域。 3.       如實施例2之CAR，其中 (b)該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272至少90%同一的胺基酸序列； (c)該跨膜結構域包含與SEQ ID NO: 26至少90%同一的胺基酸序列；且/或 (d)該胞內信號傳導域包含具有與SEQ ID NO: 27至少90%同一的胺基酸序列之共刺激域、及具有與SEQ ID NO: 28至少90%同一的胺基酸序列之初級信號傳導域。 4.       一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的重鏈CDR3 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3； 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。 5.       一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3， 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。 6.       如實施例4之CAR，其中該胞外抗原結合域進一步包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。 7.如實施例6之CAR，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。 8.如實施例6之CAR，其中該胞外抗原結合域包含：具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。 9.       一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、74、75、147、148、149、150、151、152、及318之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；及/或 包含選自SEQ ID NO: 4、5、6、76、77、140、141、142、143、144、145、146、及317之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)； 其中該胞外抗原結合域結合該人類血管舒緩素2 (hK2)抗原。 10.     如實施例9之CAR，其中該胞外抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區；或 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。 11.     如實施例1至10中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。 12.     如實施例11之CAR，其中該scFv包含在該輕鏈可變區(VL)與該重鏈可變區(VH)之間的連接子多肽。 13.     如實施例12之CAR，其中該連接子多肽包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 14.     如實施例11至12中任一者之CAR，其中該scFv包含選自由SEQ ID NO: 8至23、169至184、及340至343所組成之群組的胺基酸序列。 15.     如實施例1至14中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含信號多肽。 16.     如實施例15之CAR，其中該信號多肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。 17.     如實施例4至16中任一者之CAR，其中該胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9 (CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。 18.     如實施例17之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 19.     如實施例17或實施例18之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 20.     如實施例17至19中任一者之CAR，其中該胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列。 21.     如實施例2至20中任一者之CAR，其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。 22.     如實施例21之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 23.     如實施例4至22中任一者之CAR，其進一步包含將該跨膜域連接至該胞外抗原結合域之鉸鏈區。 24.     如實施例23之CAR，其中該鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。 25.     如實施例24之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25、279、280、281、或282之胺基酸序列。 26.     如實施例1至25中任一者之CAR，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。 27.     如實施例1至26中任一者之CAR，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。 28.     一種經單離淋巴球，其表現如請求項1至27中任一項所述之CAR。 29.     如實施例28之經單離淋巴球，其中該淋巴球係T淋巴球。 30.     如實施例28之經單離淋巴球，其中該淋巴球係自然殺手(NK)細胞。 31.     一種經單離核酸分子，其編碼如實施例1至30中任一者之CAR。 32.     一種載體，其包含如實施例31之核酸分子。 33.     一種細胞，其表現如實施例31之核酸分子。 34.     一種醫藥組成物，其包含有效量的如實施例28至30中任一者之淋巴球。 35.     一種醫藥組成物，其包含有效量的如實施例28至30中任一者之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。 36. 如實施例1至27中任一者之CAR或實施例34或35之醫藥組成物，其用於治療中。 37. 如實施例1至27中任一者之CAR或實施例34或35之醫藥組成物，其用於治療患有癌症之對象的方法中。 38.     一種治療患有癌症之對象之方法，該方法包含： 向有需要之對象投予治療有效量的如實施例28至30中任一者之淋巴球，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。 39.     如實施例38之方法、或如實施例37之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係前列腺癌或表現雄性激素受體之乳癌。 40.     如實施例38之方法、或如實施例37之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係前列腺癌。 41.     如實施例38之方法、或如實施例37之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係表現雄性激素受體之乳癌。 42.     一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含： 使該癌細胞接觸如實施例28至30中任一者之淋巴球，藉此該淋巴球誘發該癌細胞之殺滅。 43.     如實施例42之方法，其中該癌細胞係前列腺癌細胞或表現雄性激素受體之乳癌細胞。 44.     一種檢測對象中癌症之存在的方法，其包含： (c)使獲自該對象之細胞樣本接觸如實施例1至27中任一者之CAR，從而形成CAR-細胞複合物；及 (b)檢測該複合物，其中檢測到該複合物係代表該對象中存在癌症。 較佳地，實施例係在體外執行。 45.     如實施例1之CAR，其中該跨膜域包含含有SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CD8a-TM多肽。 46.     如實施例2之CAR，其中該跨膜域包含含有SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CD8a-TM多肽。 47.     如實施例2或46之CAR，其中該其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。 48.     如實施例2或47之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 49.    如實施例2、47、或48之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 50.如實施例3之CAR，其中 (b)該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一的胺基酸序列，較佳地其中該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一的胺基酸序列； (c)該跨膜域包含與SEQ ID NO: 26至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一的胺基酸序列；且/或 (d)該胞內信號傳導域包含具有與SEQ ID NO: 27至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一的胺基酸序列之共刺激域、及具有與SEQ ID NO: 28至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一的胺基酸序列之初級信號傳導域。 51.     如實施例3之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。 52.     如實施例3之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 53.     如實施例3之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 54.     如實施例3之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 55.如實施例3之CAR，其中 (b)該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列； (c)該跨膜域包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列；且 (d)該胞內信號傳導域包含含有SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的共刺激域、及含有SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的初級信號傳導域。 56.     如實施例45至55之CAR，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。 57.     如實施例45至55中任一者之CAR，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。 58. 一種經單離淋巴球，其表現如請求項45至55中任一項所述之CAR。 59.     如實施例58之經單離淋巴球，其中該淋巴球係T淋巴球。 60.     如實施例58之經單離淋巴球，其中該淋巴球係自然殺手(NK)細胞。 61.     一種經單離核酸分子，其編碼如實施例45至55中任一者之CAR。 62.     一種載體，其包含如實施例61之核酸分子。 63.     一種細胞，其表現如實施例61之核酸分子。 64.     一種醫藥組成物，其包含有效量的如實施例58至60中任一者之淋巴球。 65.     一種醫藥組成物，其包含有效量的如實施例58至60中任一者之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。 66. 如實施例45至55中任一者之CAR或實施例64或65之醫藥組成物，其用於治療中。 67. 如實施例45至55中任一者之CAR或實施例64或65之醫藥組成物，其用於治療患有癌症之對象的方法中。 68.     一種治療患有癌症之對象之方法，該方法包含： 向有需要之對象投予治療有效量的如實施例58至60中任一者之淋巴球，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。 69.     如實施例68之方法、或如實施例67之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係前列腺癌或表現雄性激素受體之乳癌。 70.     如實施例68之方法、或如實施例67之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係前列腺癌。 71.     如實施例68之方法、或如實施例67之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係表現雄性激素受體之乳癌。 72.     一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含： 使該癌細胞接觸如實施例58至60中任一者之淋巴球，藉此 該淋巴球誘發該癌細胞之殺滅。 73.     如實施例72之方法，其中該癌細胞係前列腺癌細胞或表現雄性激素受體之乳癌細胞。 74.     一種檢測對象中癌症之存在的方法，其包含： (a)使獲自該對象之細胞樣本接觸如實施例45至55中任一者之CAR，從而形成CAR-細胞複合物；及 (b)檢測該複合物，其中檢測到該複合物係代表該對象中存在癌症。 較佳地，實施例係在體外執行。 實例
下列實例係經提供以進一步描述本文中所揭露之一些實施例。該等實例意欲說明而非限制所揭露之實施例。實例1 ：具有11B6 scFv 之hK2 scFv CAR 的建構及表現
包含衍生自靶向hK2之抗體11B6之scFv的hK2 CAR建構體係如圖 1A 中所繪示建構。使經Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28刺激之T細胞經受電穿孔，接著用OPTI-MEM (Invitrogen)洗滌三次，然後以50E6/ml之最終濃度再懸浮於OPTI-MEM中。隨後，將0.1 ml的細胞(5E6)與10ug的編碼IVT CAR之RNA混合，然後使用BTX ECM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)，藉由按壓「脈衝(pulse)」按鈕一次在2-mm間隙比色管(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)中進行電穿孔。（設定：500伏特，750 µsec脈衝強度(Pulse Length)及單次(1)脈衝，100mSec間隔。）電穿孔後，將T細胞轉移至6孔盤然後立即放回至37℃培養箱中。將初級人類T細胞在沒有mRNA之情況下（模擬物，MOCK）、或在有表現hK2 scFv CAR或不相關對照CAR之10 µg mRNA之情況下進行電穿孔。電穿孔後24小時，在用2 µg/ml生物素化L-蛋白及鏈黴親和素接合PE（圖 1B ）、或生物素化hK2 (1 µg/ml)及鏈黴親和素接合PE（圖 1C ）染色後，藉由流動式細胞測量術測量CAR表面表現。
電穿孔後二十四小時，計數T細胞。收集各者之1E5個T細胞。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，針對微量滴定盤使用200 µL/孔的FACS緩衝液，並丟棄上清液。將所有孔用100 µl含有蛋白L之染色緩衝液（Genscript，目錄號M000971:500；2ug/ml）染色，在4℃下培養至少30分鐘，同時保護其免於照光。將細胞藉由添加FACS緩衝液來洗滌兩次，針對微量滴定盤使用150 µL/孔的FACS緩衝液。在室溫下以400× g執行離心4分鐘。接著丟棄上清液。將所有孔用100 µl鏈黴親和素-R-藻紅素(SA-PE; 1:250)及LIVE/DEAD可固定近紅外死細胞染色染料(1:1000)染色，在4℃下培養至少30分鐘，同時保護其免於照光。然後細胞便準備好用於流動式細胞測量術分析。
如圖 1B 中所示，在HK2 HL及LH CAR兩者上皆觀察到蛋白L染色（分別為41.4%及66.3%），而在對照T細胞（未經mRNA電穿孔之T細胞）中僅見到背景染色(~5.5%)。如圖 1C 中所示，初級人類T細胞上的CAR表現亦可經由J&J內部生物素標示之重組HK2蛋白（生物素-Hk2蛋白，批號：20180810，CBIS ID:KL2W12.CB.003，2.4 mg/ml，1 mM苯甲脒）接著SA-PE來檢測。如所示，T細胞可有效率地表現HK2 LH CAR (82.7%)，如藉由流動式細胞測量術所測量，而在對照T細胞（未經mRNA電穿孔或未揭示之對照CAR（非HK2特異性）的T細胞）中僅見到背景染色（~1.73%或1.19%）。結果係針對代表性捐贈者T細胞顯示，且可在多位捐贈者（至少n = 3）中再現。+生物素標示（EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin，Thermo Fisher Scientific目錄號：21327）實例2 ：由hK2 CAR-T 細胞所致之腫瘤細胞殺滅
使用流動式細胞儀，執行基於CellTrace Violet（CTV，Thermo Fisher Scientific目錄號：C34557）共培養之細胞毒性檢定如下。
T細胞係製備如下。EP後二十四小時，計數T細胞，並以針對最濃縮/所欲E:T所需之濃度將其再懸浮。將T細胞以100 µl/檢定之孔添加（2×106 個細胞/ml；以10:1 E:T比接種100 µl，即每2E4個目標細胞有2E5個T細胞）。製作10:1 E:T濃度之儲備液，並用完整T細胞培養基（Optimizer w/CTS、5%人類血清、1% GlutaMax）進行兩倍連續稀釋至0.3125:1。使用96孔圓底組織培養處理盤，將T細胞以三重複接種（100 µl/孔）。
經CTV標示之目標細胞係製備如下。將20 µL DMSO添加至CTV染色溶液之小瓶中。將此儲備溶液稀釋至20 mL的PBS（溫熱至37℃）中以獲得5 µM染色溶液。收集10E6個腫瘤細胞，將其用PBS洗滌兩次，然後以4E6/ml (2.5 ml)再懸浮。添加相等體積(2.5 ml)的CTV染色溶液。將細胞在37℃培養箱中培養20分鐘。將40 ml PRMI+20% FBS添加至細胞以吸收任何未結合之染料。將細胞培養5分鐘。將細胞以400 × g離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於預溫熱之RPMI+10%FBS培養基中。在此期間，將T細胞以上述所欲之E/T比接種。再計數腫瘤細胞系Vcap (HK2+)及DU145(HK2-)，接著將細胞用二重複以2E5/ml及100 µl再懸浮。將細胞與經標示之腫瘤細胞系在平底96孔盤中共培養。
使用流動式細胞儀，執行細胞毒性檢定如下。在20小時的共培養之後，將所有細胞轉移至U底96孔盤中然後洗滌。在20小時的共培養之後，自平底96孔盤收集所有細胞並將其轉移至U底96孔盤，接著洗滌。將30 µl的0.25%胰蛋白酶添加至所有的孔中，然後在37℃培養箱中培養5分鐘。在5分鐘之後，將所有腫瘤細胞收集至U底96孔盤。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘兩次。接著將細胞沉澱物再懸浮於稀釋(1:1000) LIVE/DEAD™可固定近紅外染色染料(100 µl)中。將細胞在4℃下培養30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌兩次（藉由將細胞以400 × g離心5分鐘）。在洗滌之後，使用100 µl的BD Cytofix™固定緩衝液（50 µl FACS緩衝液+50 µl固定緩衝液），將所有細胞固定10分鐘。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘一次。將細胞沉澱物再懸浮於FACS緩衝液中。在培養期結束之後，藉由多色流動式細胞測量術分析經染色之樣本。
使用下列方程式計算細胞毒性活性之百分比： 特異性死亡% =近紅外+CTV+（死）細胞% -自發近紅外+CTV+% /（100% -自發近紅外+CTV+（死）細胞%）× 100%。
暫時轉染後二十四小時，將目標細胞（Vcap及DU145）用Cell Trace Violet (CTV)螢光染料標示，然後與hK2 CAR-T細胞共培養。模擬物T細胞作為陰性效應細胞對照組。以圖 2 中所示之指示的效應細胞對目標細胞(E/T)比將細胞共培養20小時。殺滅百分比係共培養物中剩餘之活（活力染料呈陰性）目標（CTV呈陽性）細胞的絕對數目相對於沒有與CAR-T細胞培養之活目標細胞的數目之比率。如所示，hK2 CAR LH T細胞特異性地且有效率地裂解hK2(+)人類前列腺癌細胞系VCap細胞，但不會裂解K2 (-) DU145細胞（10:1至0.3125:1之E/T比），而在為模擬物或hK2 HL CAR之T細胞中僅見到背景細胞毒性。
亦使用xCELLigence作為即時細胞分析系統，測試hK2特異性CAR-T細胞之即時細胞毒性，以作為目標細胞之免疫細胞介導細胞溶解的效價檢定。
將50 µL的目標癌細胞培養基添加至96孔E-Plate (ACEA Biosciences)之各孔，然後測量背景阻抗並顯示為細胞指數。接著，將貼附性目標細胞VCap及DU145解離，並以5E4 (VCap)、5E3 (DU145)個細胞/E-Plate之孔的濃度以100 µL之體積接種，然後使其被動地貼附於電極表面。接種後，在層流櫃內將E-Plate保持在環境溫度下30分鐘，接著轉移至細胞培養箱內之RTCA MP儀器中。立即起始數據記錄，並在實驗的整個持續期間（96小時）以15分鐘間隔進行。
在施加處理時（癌細胞接種後24小時），暫停數據擷取，將50 µL的培養基自各孔移除，然後以不同之效應細胞對目標細胞(E:T)比以50 µL之體積添加效應CART細胞。將HK2 CAR+及未揭示之對照CAR（非HK2特異性）T細胞再懸浮。接著以二重複在96孔盤中執行兩倍稀釋（從5:1至0.156:1 E/T比）。亦將目標加上模擬物效應細胞對照組（無RNA電穿孔T細胞）添加至目標細胞。
在不同E/T比下，將目標細胞VCap (5E4)及DU145 (5E3)與模擬物、10 µg mRNA電穿孔（轉染後24小時）hK2 11B6 CAR LH、或對照CAR-T細胞培養大約72小時。VCap及DU145之標準化細胞指數(CI)圖係分別示於圖 3A 及圖 3B 中。在單獨接種時，目標細胞會貼附在盤上並增生，從而增加CI讀數。當將T細胞添加至目標細胞時，hK2 CAR-T細胞及對照CAR-T細胞會造成細胞溶解及隨後之CI漸進式減少。實例3 ：hK2 CAR-T 細胞之細胞介素生產
不希望受理論束縛，由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ可允許發揮腫瘤免疫監控，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。為了判定hK2 CAR修飾之人類T細胞是否能夠辨識hK2 (+)腫瘤細胞並由其活化，從基於xCELLigence之殺滅檢定收集上清液，如實例2及圖 3A 至圖 3B 中所述。在約70小時共培養之後，收集上清液並藉由ELISA根據ELISA套組（Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe，BioLegend，目錄號：430106）提供之指示進行檢定。
經抗原刺激之CAR-T細胞的Th1細胞介素干擾素-γ (IFN-γ)生產係示於圖 4 中。hK2 CAR LH T細胞及對照CAR修飾之T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養期間會分泌IFN-γ（以E:T比依賴性方式），但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。未揭示之對照CAR由於遠比hK2高之抗原表現水平而會分泌更為高量的IFN-γ。顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度± SD (pg/ml)。實例4 ：熱穩定化scFv CAR 建構體之產生及表徵
抗HK2抗體殖株11B6係依據Väisänen等人(Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004)，藉由將BALB/c小鼠用重組HK2免疫而識別。鼠類衍生殖株11B6之人源化係藉由下列文獻中所述之方法執行：Singh et al., MAbs. 2015; 7(4):778-91。由於野生型11B6之外域(exodomain)作為scFv在升溫(55℃)下不會保持結合，人源化係以scFv執行，並將來自人源化變體之大腸桿菌表現上清液在60℃下培養15分鐘，接著使用ELISA針對與重組HK2之結合進行篩選。
產生含有衍生自抗體11B6之熱穩定化scFv的十種靶向hK2之CAR。
這十種含有熱穩定化scFv之CAR建構體的描述及SEQ ID NO係提供於表1中。〔表1 〕具有11B6 熱穩定化scFv 之CAR 建構體
建構體編號 說明 SEQ ID NO
1 HL_HCG5_LCD6_20AA 46
2 HL_HCG5_LC人源化_20AA 47
3 HL_HCF3_LCB7_20AA 48
4 HL_HCG5_LCB7_20AA 49
5 LH_LCD6_HCG5_20AA 50
6 LH_LC人源化_HCF3_20AA 51
7 LH_LC人源化_HCG5_20AA 52
8 LH_LCB7_HCF3_20AA 53
9 LH_LCB7_HCG5_20AA 54
10 LH_LCD6_HCF3_20AA 55
利用抗原非依賴性活化經由Jurkat-Lucia™ NFAT細胞(JNL)識別不同基於scFv之CAR。經活化T細胞(NFAT)之核因子係首先作為免疫細胞之調控子而被識別出來的轉錄因子家族。T細胞活化會導致鈣流入(calcium influx)，從而活化鈣調磷酸酶(calcineurin)，其會使NFAT之N端處富含絲胺酸的核定位信號去磷酸化，導致NFAT之核輸入。不希望受理論束縛，由於scFv群集所致之滋養信號傳導(tonic signaling)後續可由JNL報導子細胞系中由NFAT啟動子驅動之螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)檢測。
將JNL細胞（即，含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞）用各種CAR建構體轉導。CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。
慢病毒轉導係執行如下。採集JNL細胞並再懸浮至1E6/ml。將500 µl的JNL細胞及慢病毒以3之MOI添加，然後藉由上下移液混合。將混合物在37℃培養箱中培養24小時。將500 µl JNL培養基添加至各孔，並持續在37℃培養箱中培養。在第4天將細胞轉移至T25燒瓶。在第5至6天，執行轉導驗證。採集150 µl的細胞，以經由適用於所使用之具體CAR的檢測試劑檢測CAR表現（例如，使用生物素-hk2蛋白來檢測hk2 CAR）。將JNL細胞維持在5×105 /ml，直到獲得足夠細胞以進行凍結或用於檢定中。
在JNL報導子檢定中評估熱穩定化scFv CAR之抗原依賴性活性。將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用各種hK2 CAR建構體轉導。檢定係執行如下。與目標細胞系之共培養係以2:1之效應細胞對目標細胞比執行。將JNL細胞離心沉降以移除培養基中之任何分泌的螢光素酶；接著將JNL細胞以4×105 /ml再懸浮於新鮮培養基中。採集細胞。接著，將抗原陽性目標細胞系及抗原陰性目標細胞系兩者以2E5/ml製備。將100 µl JNL添加至100 µl目標細胞。針對單純JNL之對照組，添加100 µl培養基而非目標細胞。針對陽性對照組，將單純JNL細胞或CAR JNL細胞添加至1×細胞刺激混合物中，然後在37℃培養箱中培養24小時。將150 µl的上清液採集至96孔盤中，然後離心以移除細胞。將100 µl的上清液從盤轉移至硬底黑色盤。接著，添加100 µl QUANTI-luc lucia檢測試劑。將混合物在室溫下培養5分鐘，之後用Envision多盤讀取儀進行讀取。
CAR表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定，結果係示於圖 5A 中。全部所選殖株皆確認在經轉導JNL細胞中有CAR表現，且在不同殖株及親本11B6 CAR之間有60至75%的細胞顯示可檢測之表現。將含有所指示CAR殖株之JNL細胞及未經轉導之JNL細胞(UTD)與目標細胞系（VCap或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將殖株視為具有活性。
CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現（圖 5B ）。將含有所指示CAR殖株之JNL細胞及JNL細胞（未經轉導，在下文中稱為「UTD」）與目標細胞系（VCap或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將殖株視為具有活性。針對所有十種殖株及親本11B6 HL及LH皆未發現抗原依賴性活化。實例5 ：熱穩定化scFv CAR 在T 細胞上之表現
為了評估熱穩定化11B6 CAR T細胞之功能並挑選最佳候選建構體，使用慢病毒轉導產生11B6熱穩定化且基於親本scFv之CAR T細胞。將初級人類T細胞用11B6熱穩定化且基於親本scFv之CAR慢病毒轉導，且病毒感染劑量(MOI)為3。轉導後14天，藉由生物素化hK2(1 µg/ml)接著鏈黴親和素接合PE來判定CAR表現。
實驗規程如下。
進行慢病毒包裝。每150 mm2 圓底Corning™ BioCoat™ I型膠原蛋白塗佈培養皿接種14E6個Lenti-X™ 293T細胞，然後使用DMEM+10% FBS培養基在37℃下培養整夜。
在Lenti-X™ 293T細胞處於80至85%之理想匯合度(confluency)下，製備下列。將培養基置換為21 ml 293T生長培養基。將Lipofectamine 2000在室溫下稀釋並平衡OptiMEM。將稀釋之Lipofectamine 2000逐滴添加至混合質體，並充份混合。將混合物在室溫下培養25分鐘。將轉染混合物逐滴添加至Lenti-X 293T細胞，並將盤溫和旋動以進行混合。將混合物在37℃培養箱中培養。轉染後24及48小時採集慢病毒。以上試劑係彙總於表2中。〔表2 〕
試劑 每15 cm 培養皿之量
pMDLg/p 18 µg
pRSV.Rev 18 µg
pMD2.G 7 µg
轉移(CAR)質體 15 µg
OptiMEM 1500 µl
慢病毒濃縮係執行如下。採集含慢病毒之上清液，如果過多293T細胞漂浮則以500 × g離心10 min，之後使其通過0.45 µm乙酸纖維素過濾器過濾。將上清液轉移至無菌容器，與1/3體積的Lenti-X Concentrator（Clontech，目錄號631232）組合，然後藉由溫和倒轉進行混合。將混合物在4℃下培養整夜。將樣本在4℃下以1,500 × g離心45分鐘，且在離心之後可看見白色沉澱物。將上清液小心地移出而不擾動沉澱物。在以1,500 × g短暫離心之後，將殘餘上清液用移液管移除。使用冷T細胞生長將沉澱物溫和地再懸浮於1/10的原始體積。將病毒以200 µl進行等分然後立即儲存於-80℃下。
病毒效價測量(viral titering)係執行如下。使指數期SupT1生長於完整RPMI中。將每孔100 µl 20,000個SupT1細胞/ml接種於96孔平盤中。接著在96孔圓底盤中執行病毒效價測量。將100 µl培養基添加至盤中的所有孔。用手將病毒等分試樣自-80℃冷凍器解凍。將等分試樣上下移液以充份混合，並將50 µl病毒添加至第一個孔，接著徹底混合。藉由將50 µl病毒移液至下一個孔來執行連續1:3稀釋。接著，將50 µl培養基添加至單純初級Ab、單純二級Ab、及未經轉導對照組。用多通道移液管將50 µl的各者自效價測量盤轉移至檢定盤中之100 µl SupT1細胞，然後在37℃下培養整夜。將100 µl的預溫熱培養基添加至各樣本，然後再培養兩天。轉導效率係藉由流動式細胞測量術判定。將樣本轉移至圓底96孔盤，然後以1400 RPM旋轉3分鐘。將上清液快速丟棄，接著在櫃中吸乾(blotting)以移除過量的培養基。用150 µl FACS緩衝液重複洗滌。接著進行適用於CAR建構體之染色規程。將樣本再懸浮於150 µl FACS緩衝液中，之後進行流動式細胞測量術分析。 病毒效價計算：效價=（CAR陽性%/100）× 2×104 × 20 ×稀釋因數
為了排除多複本整合，使用最接近20%轉導之效價。
T細胞活化、轉導、及擴增係執行如下。將初始T細胞小瓶在水浴中解凍，然後逐滴添加至含有9 ml的預溫熱T細胞培養基（TCM CTS OpTmizer T細胞擴增SFM+5%人類血清+IL-2 100IU/ml）之15 ml錐形管。將冷凍小瓶用1 ml的培養基洗滌以恢復最大數量，然後在室溫下以300 × g旋轉8分鐘。將沉澱物再懸浮於新鮮10 ml TCM中，計數然後再懸浮至每毫升1E6個細胞。將每孔5E5個細胞添加於24孔盤中。每孔1.5×106 個CD3/CD28珠係以500 µl體積添加，使得總體積為每孔1 ml。活化後二十四小時，在室溫下將病毒解凍。將病毒以3之病毒感染劑量(MOI)添加，溫和旋動以進行混合，然後送回在培養箱之盤。（慢病毒功能效價先前係用SupT1效價檢定判定。）保留一個孔給未經轉導(UTD)組，其中未添加病毒。
轉導後二十四小時，添加1 ml TCM至各孔。自此點起開始（第2天）添加青黴素-鏈黴素。在第3至5天，針對每2 ml的細胞添加4 ml TCM，然後轉移至T25組織培養處理燒瓶。將燒瓶水平置於培養箱中（第3天）。針對T細胞培養添加等體積的TCM（第4天）。在第5至14天，每隔一天檢查細胞，並記錄存活率、大小、及總細胞計數。將細胞密度調整至每mL一百萬個細胞。理想採集時間係取決於捐贈者，且係由細胞大小及擴增倍數決定。當細胞大小小於8 µm（基於MOXI流動式細胞計數器）且擴增為100至200倍時，將細胞大致地冷凍。
慢病毒轉導效率係在採集日檢查如下。將培養物充份混合。用100 µl FACS緩衝液將100 µl的T細胞採集至96孔盤中之對應孔，混合，然後在室溫下以1300 RPM旋轉3分鐘。將細胞再懸浮於200 µl FACS緩衝液中，然後在4℃下重複離心。
將細胞再懸浮於100 µl的經生物素標示hK2（1 µg/ml稀釋於FACS緩衝液中）中，然後在冰上培養30分鐘。添加100 µl的FACS緩衝液，然後在4℃下旋轉洗滌。在添加額外的200 µl FACS緩衝液之後重複旋轉洗滌。用100 µl的母液（含有二級抗體SA-PE (1:250)、LIVE/DEAD可固定染料(1:500)、αCD3、αCD4、及αCD8抗體）在冰上執行染色30分鐘。添加100 µl FACS緩衝液，然後在4℃下旋轉洗滌，丟棄並再懸浮於200 µl FACS緩衝液中，之後在4℃下旋轉洗滌。將樣本再懸浮於100 µl FACS緩衝液中，之後藉由流動式細胞測量術進行分析。
細胞採集及冷凍係執行如下。判定最終細胞計數。採集培養物並在室溫下以300 × g離心10分鐘。將培養物再懸浮於較小體積的培養基中以裝在50 ml錐形管中。在4℃下將管置於磁鐵中10分鐘以「移除珠(de-bead)」。將細胞溫和地自管轉移以儘量避免擾動珠/磁鐵，並記錄確切體積。重複計數。以300 × g執行離心10分鐘，並丟棄上清液。將細胞冷凍於冷卻容器中之CS-10 CryoStor®細胞凍存培養基中。將容器立即轉移至-80℃下24至48小時，之後長久儲存於液態氮中。結果係示於圖 6 中，並確認經轉導T細胞表面上之hK2 CAR表現。提供由所分析之10種熱穩定化殖株及親本11B6 HL及LH之各者檢測的hK2 CAR + T細胞百分比（陽性%）之彙總。如所示，不同之殖株具有不同之CAR表現水平，範圍在17.9%至42.7%。將所有CAR T細胞標準化至相等CAR+ T細胞以進行後續功能性檢定。實例6 ：11B6 熱穩定化scFv CAR-T 細胞所致之腫瘤細胞殺滅
在即時IncuCyte殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性評估11B6熱穩定化scFv CAR-T細胞。將熱穩定化hK2 CAR-T細胞及親本11B6 CAR-T細胞與VCaP細胞（圖 7A ）及PC3細胞（圖 7B ）共培養88小時。效應細胞對目標細胞(E/T)比係基於CAR表現數據（圖 6 ）計算。穩定表現紅色核染料之目標細胞係藉由IncuCyte成像系統以即時方式測量。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。
亦在即時IncuCyte腫瘤殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性評估scFv CAR-T細胞。以1:1或0.5:1之效應細胞：目標細胞比（此係基於CAR表現數據計算），將熱穩定化hK2 CAR-T細胞及親本11B6 CAR-T細胞與VCaP細胞（圖 7C ）或PC3細胞（圖 7D ）共培養88小時。以1:1或0.5:1之效應細胞對目標細胞(ET)比（此係基於CAR表現數據計算），將用CAR17、CAR18、CAR19、及CAR20轉導之CAR-T細胞與hK2陽性VCaP細胞及hK2陰性DU145細胞共培養96小時。用CAR17、CAR18、CAR19、及CAR20轉導之CAR-T細胞隨時間的腫瘤細胞生長抑制係示於圖 7E （針對VCap細胞）及圖 7F （針對DU145細胞）。穩定表現紅色核染料之目標細胞係藉由IncuCyte成像系統以即時方式測量。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。所測試之CAR-T細胞達到大約100% TGI，而未經轉導對照組未展現任何TGI。對於所測試之CAR-T細胞在hK2陰性DU145細胞中未觀察到TGI。實例7 ：11B6 熱穩定化scFv CAR-T 細胞之細胞介素生產
使用13-plex Milliplex Human High Sensitivity T細胞套組(HSTCMAG28SPMX13)，分析自hK2 CAR-T細胞與VCap細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物所收集的上清液。hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養期間會分泌細胞介素，但未經轉導之T細胞(UTD)則僅分泌極少量。hK2 lenti-CAR-T細胞所致之細胞介素釋放結果係示於圖 8 中。
自hK2 CAR-T細胞與VCap、DU145（5E4細胞）細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物收集上清液。hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養期間會分泌IFN-γ，但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。hK2 lenti-CAR-T細胞所致之IFN-γ釋放結果係示於圖 9 中。（使用實例3之規程。）顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度± SD (pg/ml)。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。如所示，當與hK2 (+) VCap細胞共培養時，不同之熱穩定化CAR T細胞會生產不同量的IFN-γ，這係與細胞介導之免疫反應期間的細胞毒性活性相關聯。實例8 ：hK2 CAR-T 細胞之增生
在增生檢定中評估hK2 CAR-T細胞。T細胞增生是體內免疫功能之重要體外參數。為了進一步評估熱穩定化11B6 CAR T細胞之功能並挑選最佳候選建構體，用CTV標示11B6熱穩定化且基於親本scFv之CAR T細胞，以評估T細胞增生。
hK2 CAR及未經轉導(UTD) T細胞係用CellTrace Violet (CTV; 5 µM)標示，並與hK2 (+) VCap及hK2 (-) DU145細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並且判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR-T細胞的頻率。藉由對hK2+ T細胞進行閘控，如所示，hK2(+) Vcap細胞而非hK2(-) DU145細胞會促進所有經CAR建構體工程改造之T細胞增生及活化標記CD25之上調（圖 10A 、圖 10C ）。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。未經任何刺激之單純T細胞不會增生，而經CD3/28珠刺激之T細胞則顯示相等之增生模式（圖 10B 、圖 10D ）。如圖 10E 所示，在與VCap細胞共培養5天後，hK2 CAR+ T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。經不同CAR建構體工程改造之T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR+ T細胞計數。CAR+ T細胞計數基於來自三次技術重複之平均絕對細胞計數+/- SEM。
規程如下。收集腫瘤細胞Vcap及DU145，用PBS洗滌兩次，然後在37℃培養箱中以10E6/ml再懸浮於含有100ug/ml Mitomycin C (MMC)之PBS中歷時1.5小時，從而阻斷腫瘤細胞增生。將20 µL的DMSO添加至CTV染色溶液之小瓶中。將5 µl的溶液稀釋至5 mL (1:1000) PBS（溫熱至37℃）中以提供5 µM染色溶液。計數並收集2E6個T細胞，將其用PBS洗滌兩次，然後以4E6/ml (0.5 ml)再懸浮。添加相等體積(0.5 ml)的CTV染色溶液。將細胞在37℃下培養20分鐘。接著，將4 ml PRMI+20% FBS添加至細胞以吸收任何未結合之染料。將細胞培養5分鐘，然後以400 × g離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於預溫熱之RPMI+10%FBS培養基中。計數T細胞，並將1E5個細胞(100 µl)接種於96孔平底盤中。
在此期間，收集經MMC處理之腫瘤細胞hK2(+) VCap及HK2(-) DU145並在1.5小時後計數，接著以1E6/ml再懸浮。將1E5個細胞(100 µl)與T細胞共培養於96孔盤中。使用單純T細胞、及以3:1 CD3/28珠對細胞比添加之T細胞分別作為陰性及陽性對照組。
在5天的共培養之後，自各孔收集所有細胞。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘兩次，接著於96孔U底盤中用hK2CAR、CD3、CD8及CD25、LIVE/DEAD（近紅外）染色。在洗滌之後，使用100 µl BD Cytofix™固定緩衝液（50 µl FACS緩衝液+50 µl固定緩衝液），將所有細胞固定10分鐘。在培養期結束之後，藉由多色流動式細胞測量術分析經染色之樣本。
數據分析係執行如下。製備CTV直方圖。設定CTV未稀釋閘以涵蓋單獨培養T細胞之遠右方峰（CTV亮），並且設定CTV稀釋閘以捕捉其餘群體。此會套用至所有樣本。實例9 ：具有抗HK2 scFv 之hK2 scFv CAR 的建構及表現
包含衍生自新穎抗hK2 scFv的hK2 CAR建構體係如圖 11A 中所繪示建構。
為了評估此等新穎抗HK2 scFv CAR T細胞之功能並挑選最佳候選建構體，使用慢病毒轉導產生hK2 HL及\ LH CAR-T細胞。將初級人類T細胞用hK2 CAR HL及LH、新穎的基於scFv之CAR慢病毒轉導，且病毒感染劑量(MOI)為3。轉導後14天，藉由生物素化hK2(1 µg/ml)接著鏈黴親和素接合PE來判定CAR表現。
實驗規程如下。
將慢病毒包裝打開。每150 mm2 圓底Corning™ BioCoat™ I型膠原蛋白塗佈培養皿接種14E6個Lenti-X™ 293T細胞，然後使用DMEM+10% FBS培養基在37℃下培養整夜。
在Lenti-X™ 293T細胞處於80至85%之理想匯合度(confluency)下，製備下列。將培養基置換為21 ml 293T生長培養基。將Lipofectamine 2000在室溫下稀釋並平衡OptiMEM。將稀釋之Lipofectamine 2000逐滴添加至混合質體，並充份混合。將混合物在室溫下培養25分鐘。將轉染混合物逐滴添加至Lenti-X 293T細胞，並將盤溫和旋動以進行混合。將混合物在37℃培養箱中培養。轉染後24及48小時採集慢病毒。以上試劑係彙總於表3中。〔表3 〕
試劑 每15 cm 培養皿之量
pMDLg/p 18 µg
pRSV.Rev 18 µg
pMD2.G 7 µg
轉移(CAR)質體 15 µg
OptiMEM 1500 µl
慢病毒濃縮係執行如下。採集含慢病毒之上清液，如果過多293T細胞漂浮則以500 × g離心10 min，之後使其通過0.45 µm乙酸纖維素過濾器過濾。將上清液轉移至無菌容器，與1/3體積的Lenti-X Concentrator（Clontech，目錄號631232）組合，然後藉由溫和倒轉進行混合。將混合物在4℃下培養整夜。將樣本在4℃下以1,500 × g離心45分鐘，且在離心之後可看見白色沉澱物。將上清液小心地移出而不擾動沉澱物。在以1,500 × g短暫離心之後，將殘餘上清液用移液管移除。使用冷T細胞生長將沉澱物溫和地再懸浮於1/10的原始體積。將病毒以200 µl進行等分然後立即儲存於-80℃下。
病毒效價測量(viral titering)係執行如下。使指數期SupT1生長於完整RPMI中。將每孔100 µl 20,000個SupT1細胞/ml接種於96孔平盤中。接著在96孔圓底盤中執行病毒效價測量。將100 µl培養基添加至盤中的所有孔。用手將病毒等分試樣自-80℃冷凍器解凍。將等分試樣上下移液以充份混合，並將50 µl病毒添加至第一個孔，接著徹底混合。藉由將50 µl病毒移液至下一個孔來執行連續1:3稀釋。接著，將50 µl培養基添加至單純初級Ab、單純二級Ab、及未經轉導對照組。用多通道移液管將50 µl的各者自效價測量盤轉移至檢定盤中之100 µl SupT1細胞，然後在37℃下培養整夜。將100 µl的預溫熱培養基添加至各樣本，然後再培養兩天。轉導效率係藉由流動式細胞測量術判定。將樣本轉移至圓底96孔盤，然後以1400 RPM旋轉3分鐘。將上清液快速丟棄，接著在櫃中吸乾(blotting)以移除過量的培養基。用150 µl FACS緩衝液重複洗滌。接著進行適用於CAR建構體之染色規程。將樣本再懸浮於150 µl FACS緩衝液中，之後進行流動式細胞測量術分析。 病毒效價計算：效價=（CAR陽性%/100）× 2×104 × 20 ×稀釋因數
為了排除多複本整合，使用最接近20%轉導之效價。
T細胞活化、轉導、及擴增係執行如下。將初始T細胞小瓶在水浴中解凍，然後逐滴添加至含有9 ml的預溫熱T細胞培養基（TCM CTS OpTmizer T細胞擴增SFM+5%人類血清+IL-2 100IU/ml）之15 ml錐形管。將冷凍小瓶用1 ml的培養基洗滌以恢復最大數量，然後在室溫下以300 × g旋轉8分鐘。將沉澱物再懸浮於新鮮10 ml TCM中，計數然後再懸浮至每毫升1E6個細胞。將每孔5E5個細胞添加於24孔盤中。每孔1.5×106 個CD3/CD28珠係以500 µl體積添加，使得總體積為每孔1 ml。活化後二十四小時，在室溫下將病毒解凍。將病毒以3之病毒感染劑量(MOI)添加，溫和旋動以進行混合，然後送回在培養箱之盤。（慢病毒功能效價先前係用SupT1效價檢定判定。）保留一個孔給未經轉導(UTD)組，其中未添加病毒。
轉導後二十四小時，將1 ml TCM添加至各孔。自此點起開始（第2天）添加青黴素-鏈黴素。在第3至5天，針對每2 ml的細胞添加4 ml TCM，然後轉移至T25組織培養處理燒瓶。將燒瓶水平置於培養箱中（第3天）。針對T細胞培養添加等體積的TCM（第4天）。在第5至14天，每隔一天檢查細胞，並記錄存活率、大小、及總細胞計數。將細胞密度調整至每mL一百萬個細胞。理想採集時間係取決於捐贈者，且係由細胞大小及擴增倍數決定。當細胞大小小於8 µm（基於MOXI流動式細胞計數器）且擴增為100至200倍時，將細胞大致地冷凍。
慢病毒轉導效率係在採集日檢查如下。將培養物充份混合。用100 µl FACS緩衝液將100 µl的T細胞採集至96孔盤中之對應孔，混合，然後在室溫下以1300 RPM旋轉3分鐘。將細胞再懸浮於200 µl FACS緩衝液中，然後在4℃下重複離心。
將細胞再懸浮於100 µl的經生物素標示hK2（1 µg/ml稀釋於FACS緩衝液中）中，然後在冰上培養30分鐘。添加100 µl的FACS緩衝液，然後在4℃下旋轉洗滌。在添加額外的200 µl FACS緩衝液之後重複旋轉洗滌。用100 µl的母液（含有二級抗體SA-PE (1:250)、LIVE/DEAD可固定染料(1:500)、αCD3、αCD4、及αCD8抗體）在冰上執行染色30分鐘。添加100 µl FACS緩衝液，然後在4℃下旋轉洗滌，丟棄並再懸浮於200 µl FACS緩衝液中，之後在4℃下旋轉洗滌。將樣本再懸浮於100 µl FACS緩衝液中，之後藉由流動式細胞測量術進行分析。
細胞採集及冷凍係執行如下。判定最終細胞計數。採集培養物並在室溫下以300 × g離心10分鐘。將培養物再懸浮於較小體積的培養基中以裝在50 ml錐形管中。在4℃下將管置於磁鐵中10分鐘以「移除珠(de-bead)」。將細胞溫和地自管轉移以儘量避免擾動珠/磁鐵，並記錄確切體積。重複計數。以300 × g執行離心10分鐘，並丟棄上清液。將細胞冷凍於冷卻容器中之CS-10 CryoStor®細胞凍存培養基中。將容器立即轉移至-80℃下24至48小時，之後長久儲存於液態氮中。結果係示於圖 11B 中，並且確認經轉導T細胞表面上之hK2 CAR表現。提供hK2 CAR + T細胞之百分比（陽性%）的彙總，此係藉由所分析之新穎KL2B413 HL&LH及再人源化之11B6 KL2B359 HL&LH CARS檢測。如所示，不同之殖株具有不同之CAR表現水平，範圍在45.1%至59.9%。將所有CAR T細胞標準化至相等CAR+ T細胞以進行後續功能性檢定。實例10 ：抗hK2 抗體及scFv 之產生 來自親本m11B6 抗體之人源化的抗體產生
親本小鼠抗HK2抗體m11B6已描述於Väisänen等人(Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004))中。人源化11B6（本文中稱為hu11B6）已產生並描述於美國專利第9,345,782號及美國專利第10,100,125號中。
開始hu11B6之工程改造以產生具有改良性質之額外抗HK2抗體，諸如改良之熱穩定性。在hu11B6架構中識別殘基位置，該架構有可能使用模擬來修改以改良hu11B6之熱穩定性。識別出之位置係VH中之殘基P41、I49、M70、及A88與VL中之S80、L82、A88、及Y91（殘基編號根據SEQ ID NO: 5 之hu11B6_VH及SEQ ID NO: 2 之hu11B6_VL的胺基酸序列）。
以VH-連接子-VL之定向產生二進位組合式scFv庫，其中可變區之一者代表組合式庫而第二者係親本hu11B6 VH或VL。使用GGSEGKSSGSGSESKSTGGS (SEQ ID NO: 7) 之連接子序列來偶聯VH/VL區。將經工程改造之scFv表現於大腸桿菌中，然後藉由ELISA針對與人類hK2之結合測試上清液中之所生產scFv並與hu11B6之結合比較。將展現相當於hu11B6之結合的任何新變體合併，並且在55℃、60℃、及65℃下培養上清液10分鐘之後，針對與人類hK2之結合進一步進行測試。將在55℃、60℃、及65℃下培養之後仍保留相當之與hu11B6結合及改良之熱穩定性的分子呈兩種定向（VH-連接子-VL；VL-連接子-VH）基質化並轉換為哺乳動物scFv以供進一步表徵。亦將基質化之scFv結合至CAR建構體中並進一步表徵，如實例11中進一步所述。
此外，依照Singh等人所述之方法執行親本小鼠11B6之另一次人源化(MAbs. 2015; 7(4):778-91)，並且針對增進熱穩定性進行廣泛之生殖細胞系變化和仔細之變體篩選。基於序列保守性，選擇人類重鏈生殖細胞系IGHV4-30及輕鏈生殖細胞系IGKV3D-11以進行架構調適。用殘基建構二進位scFv庫，其包含選定組的體細胞超突變位點及小鼠/人類生殖細胞系變異。如上所述將變體選殖及表現於大腸桿菌中。針對增進熱穩定性，在不同溫度下在單點ELISA中篩選上清液。使用小鼠/人類嵌合11B6 scFv作為親本對照組。將維持類似於鼠類11B6之結合活性及67℃之Tm值的殖株KL2B359轉換為scFv-Fc及CAR-T以進行額外剖析。由SPR所測量之KL2B359與hK2親和力(KD )係~0.7至1nM。HCF3-LCD6、HCG5-LCB7、KL2B357、KL2B358、及KL2B360亦產生自此運動並針對功能性進一步進行表徵。使用表現人類免疫球蛋白基因座之轉殖小鼠 (Ablexis®) 及轉殖大鼠 (OmniRat®) 的抗體產生。
OmniRat®含有嵌合人類/大鼠IgH基因位點（包含22個人類VH 、所有呈天然組態的人類D及JH 區段，該等區段係連接至大鼠CH 基因位點）再加上完整的人類IgL基因位點（12個Vκ連接到Jκ-Cκ，且16個Vλ連接到Jλ-Cλ）。（見例如Osborn, et al. (2013) J Immunol 190(4): 1481-1490）。因此，該等大鼠展現減少表現的大鼠免疫球蛋白，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因回應於免疫會經歷類型轉換(class switching)及體細胞突變，以產生具有完整人類可變區之高親和力嵌合人類/大鼠IgG單株抗體。OmniRat®的製備及使用、及此類大鼠所攜帶的基因體修飾係描述於WO14/093908中。
Ablexis® 小鼠會產生具有連接至人類CH1及CL域、嵌合人類/小鼠鉸鏈區、及小鼠Fc區之人類可變域的抗體。Ablexis Kappa Mouse及Lambda Mouse品系的區別在於其等之重鏈係人類或小鼠，如下所陳述。由Kappa Mouse所生產之抗體缺乏衍生自小鼠VH 、DH 、及JH 外顯子及小鼠Vκ、Jκ、及Cκ外顯子之序列。內源小鼠Igλ在Kappa Mouse中係活躍的。人類Igκ鏈包含大約90至95%的初始組庫，而小鼠Igλ鏈包含大約5至10%的初始組庫在此品系中。由Lambda Mouse所生產之抗體缺乏衍生自小鼠VH 、DH 、及JH 外顯子及小鼠Vλ、Jλ、及Cλ外顯子之序列。內源小鼠Igκ在Lambda Mouse中係活躍的。人類Igλ鏈包含大約至40%的初始組庫，而小鼠Igκ鏈包含大約至60%的初始組庫在此品系中。Ablexis®的製備及使用、及此類大鼠所攜帶之基因體修飾係描述於WO11/123708中。
將Ablexis小鼠及OmniRat大鼠用可溶全長KLK2蛋白（人類血管舒緩素2 6-His蛋白）免疫。人類血管舒緩素2 6-His 蛋白 VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHHH (SEQ ID NO: 319)
來自Ablexis小鼠及OniRats大鼠之白血球係萃取自淋巴結及依定群(cohort)所執行之融合。將細胞組合並針對CD138表現進行排序。融合瘤篩選係使用可溶hK2抗原以高處理通量小型化MSD格式來執行。識別出大約＞300個樣本為hK2結合者。＞300個抗hKLK2上清液樣本與人類KLK2蛋白之結合係藉由依據Biacore 8K SPR之單循環動力學方法來測量。此外，上清液樣本亦針對與人類KLK3蛋白之結合進行測試。同時，上清液亦藉由流動式細胞測量法針對與表現KLK2之細胞系VCap及陰性細胞系DU145之結合進行測試。使所選細胞結合者呈VH-VL及VL/VH兩種定向向前移動至scFv轉換及熱穩定性測試，如上所述。KL2B413、KL2B30、KL2B53、及KL2B242係產生自Ablexis小鼠免疫活動。KL2B467及KL2B494係產生自OmniRat免疫活動。
透過上述各種免疫及人源化活動所產生之抗體係以fab格式、mAb格式、scFv格式呈VH-連接子-VL定向或以scFv格式呈VL-連接子-VH定向來表現並如下所述進一步進行分析。使用上述SEQ ID NO: 7之連接子序列來偶聯VH/VL區。實例11. 抗KLK2 抗體之結構表徵
在胞內檢定中顯示最高效能之抗體可變域及scFv抗體片段的序列係提供於本文中。可變域係以Fab格式、scFv格式呈VH-連接子-VL定向或以scFv格式呈VL-連接子-VH定向來表現。可變域VH 、VL 、及CDR
表4 顯示所選抗hK2抗體之VH及VL胺基酸序列。表 5 顯示所選抗hK2所選抗體之Kabat HCDR1、HCDR2、及HCDR3。表 6 顯示抗hK2抗體之Kabat LCDR1、LCDR2、及LCDR3。表 7 顯示所選抗hK2抗體之AbM HCDR1、HCDR2、及HCDR3。表 8 顯示抗hK2之AbM LCDR1、LCDR2、及LCDR3。表 9 彙總所選hK2抗體之可變域序列及SEQ ID NO。表 10 顯示VH及VL區之蛋白及DNA SEQ ID NO。〔表4 〕所選抗hK2 抗體之VH 及VL 胺基酸序列。
mAb 名稱 VH 名稱 VH 胺基酸序列 VH SEQ ID NO: VL 名稱 VL 胺基酸序列 VL SEQ ID NO:
m11B6 m11B6_VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 317 m11B6_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK 318
h11B6 hu11B6_VH QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 5 hu11B6_VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 2
HCF3-LCD6 HCF3_VH QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 6 LCD6_VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 1
HCG5-LCB7 HCG5_VH QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 4 LCB7_VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 3
KL2B357 KL2B357_VH QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 140 KL2B357_VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 147
KL2B358 KL2B358_VH QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 141 KL2B358_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B359 KL2B359_VH QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 77 KL2B359_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B360 KL2B360_VH QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 140 KL2B360_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B413 KL2B413_VH evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssywmtwvrqapgkglewvanikqdgseryyvdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycardqnydiltghygmdvwgqgttvtvss 76 KL2B413_VL eivltqspsflsasvgdrvtitcrasqgissylswyqqkpgkapklliyatstlqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqlnsyprtfgqgtkveik 74
KL2B30 KL2B30_VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS 142 KL2B30_VL DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK 148
KL2B53 KL2B53_VH EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVED SAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS 143 KL2B53_VL DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIK   149
KL2B242 KL2B242_VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS 144 KL2B242_VL SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVL 150
KL2B467 KL2B467_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSS 145 KL2B467_VL QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTV 151
KL2B494 KL2B494_VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS   146 KL2B494_VL SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 152
〔表5 〕所選抗KLK2 抗體之Kabat HCDR1 、HCDR2 、及HCDR3 胺基酸序列。
  Kabat HCDR1 Kabat HCDR2 Kabat HCDR3
mAb名稱 序列 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO:
m11B6 SDYAWN 63 YISYSGSTTYSPSLKS 64 GYYYGSGF 66
hu11B6 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
HCF3-LCD6 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
HCG5-LCB7 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
KL2B357 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
KL2B358 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
KL2B359 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
KL2B360 SDYAWN 63 YISYSGSTTYNPSLKS 65 GYYYGSGF 66
KL2B413 SYWMT 314 NIKQDGSERYYVDSVKG 315 DQNYDILTGHYGMDV 311
KL2B30 SYYWS 102 YIYYSGSTNYNPSLKS 103 TTIFGVVTPNFYYGMDV 104
KL2B53 SYDIH 107 IISYDGSKKDYTDSVKG 108 ESGWSHYYYYGMDV 109
KL2B242 SYYWS 102 RLYVSGFTNYNPSLKS 112 DSGNYWGWFDP 113
KL2B467 YYGMH 115 FISYDGSNKYYADSVKG 116 LPYSGSYWAFDY 117
KL2B494 HYAMS 120 TIGGSGGSTYYADSVKG 121 PHIVMVTALLYDGMDV 122
〔表6 〕所選抗hK2 抗體之Kabat LCDR1 、LCDR2 、及LCDR3 胺基酸序列。
  Kabat LCDR1 Kabat LCDR2 Kabat LCDR3
mAb名稱 序列 SEQ ID NO 序列 SEQ ID NO 序列 SEQ ID NO
m11B6 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 69 QQTRKVPYT 71
hu11B6 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
HCF3-LCD6 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
HCG5-LCB7 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
KL2B357 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B358 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B359 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 69 QQTRKVPYT 71
KL2B360 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B413 RASQGISSYLS 312 ATSTLQS 313 QQLNSYPRT 91
KL2B30 RASQGISSYLA 128 AASTLQS 129 QQLNSYPLT 130
KL2B53 RASQDISNYLA 125 AASTLHS 131 QKYNSAPYT 132
KL2B242 SGDQLGENYAC 133 QDSKRPS 134 QAWDNSIVV 135
KL2B467 GGDNIGSKSVH 136 DNSDRPS 137 QVWDSSSDHPVV 138
KL2B494 GGNNIGSKSVH 97 DDSDRPS 127 QVWDSSSDHVV 139
〔表7 〕所選抗hK2 抗體之AbM HCDR1 、HCDR2 、及HCDR3 胺基酸序列。
  AbM HCDR1 AbM HCDR2 AbM HCDR3
mAb名稱 序列 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO 序列 SEQ ID NO:
m11B6 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
hu11B6 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
HCF3-LCD6 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
HCG5-LCB7 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
KL2B357 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
KL2B358 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
KL2B359 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
KL2B360 GNSITSDYAWN 72 YISYSGSTT 73 GYYYGSGF 66
KL2B413 GFTFSSYWMT 309 NIKQDGSERY 310 DQNYDILTGHYGMDV 311
KL2B30 GGSISSYYWS 105 YIYYSGSTN 106 TTIFGVVTPNFYYGMDV 104
KL2B53 GFTFSSYDIH 110 IISYDGSKKD 111 ESGWSHYYYYGMDV 109
KL2B242 GGSISSYYWS 105 RLYVSGFTN 114 DSGNYWGWFDP 113
KL2B467 GFTFSYY 118 FISYDGSNKY 119 LPYSGSYWAFDY 117
KL2B494 GFTFSHYAMS 123 TIGGSGGSTYY 124 PHIVMVTALLYDGMDV 122
〔表8 〕所選抗hK2 抗體之AbM LCDR1 、LCDR2 、及LCDR3 胺基酸序列。
  AbM LCDR1 AbM LCDR2 AbM LCDR3
mAb名稱 序列 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO 序列 SEQ ID NO:
m11B6 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 69 QQTRKVPYT 71
hu11B6 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
HCF3-LCD6 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
HCG5-LCB7 KASESVEYFGTSLMH 68 AASNRES 70 QQTRKVPYT 71
KL2B357 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B358 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B359 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 69 QQTRKVPYT 71
KL2B360 RASESVEYFGTSLMH 67 AASNVES 126 QQTRKVPYT 71
KL2B413 RASQGISSYLS 312 ATSTLQS 313 QQLNSYPRT 91
KL2B30 RASQGISSYLA 128 AASTLQS 129 QQLNSYPLT 130
KL2B53 RASQDISNYLA 125 AASTLHS 131 QKYNSAPYT 132
KL2B242 SGDQLGENYAC 133 QDSKRPS 134 QAWDNSIVV 135
KL2B467 GGDNIGSKSVH 136 DNSDRPS 137 QVWDSSSDHPVV 138
KL2B494 GGNNIGSKSVH 97 DDSDRPS 127 QVWDSSSDHVV 139
〔表9 〕所選抗hK2 抗體之可變域的胺基酸序列及SEQ ID NO 彙總
抗體 區 胺基酸序列 SEQ ID NO:
m11B6 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYSPSLKS 64
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 RASESVEYFGTSLMH 67
LCDR2 AASNVES 69
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (m11B6_VH) DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 317
VL (m11B6_VL) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK 318
h11B6 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 KASESVEYFGTSLMH 68
LCDR2 AASNRES 70
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (hu11B6_VH) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 5
VL (hu11B6_VL) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 2
HCF3-LCD6 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 KASESVEYFGTSLMH 68
LCDR2 AASNRES 70
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (HCF3_VH) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 6
VL (LCD6_VL) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 1
HCG5-LCB7 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 KASESVEYFGTSLMH 68
LCDR2 AASNRES 70
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (HCG5_VH) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 4
VL (LCB7_VL) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 3
KL2B357 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 100或65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 RASESVEYFGTSLMH 67
LCDR2 AASNVES 126
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (KL2B357_VH) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 140
VL (KL2B_357_VL) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 147
KL2B358 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 RASESVEYFGTSLMH 67
LCDR2 AASNVES 126
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (KL2B358_VH) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 141
VL (KL2B_358_VL) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B359 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 RASESVEYFGTSLMH 67
LCDR2 AASNVES 69
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (KL2B359_VH) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 77
VL (KL2B_359_VL) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B360 HCDR1 SDYAWN 63
HCDR2 YISYSGSTTYNPSLKS 65
HCDR3 GYYYGSGF 66
LICDR1 RASESVEYFGTSLMH 67
LCDR2 AASNVES 69
LCDR3 QQTRKVPYT 71
VH (KL2B360_VH) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 140
VL (KL2B_360_VL) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 75
KL2B413 HCDR1 SYWMT 314
HCDR2 NIKQDGSERYYVDSVKG 315
HCDR3 DQNYDILTGHYGMDV 311
LICDR1 RASQGISSYLS 312
LCDR2 ATSTLQS 313
LCDR3 QQLNSYPRT 91
VH (KL2B413_VH) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS 76
VL (KL2B_413_VL) EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK 74
KL2B30 HCDR1 SYYWS 102
HCDR2 YIYYSGSTNYNPSLKS 103
HCDR3 TTIFGVVTPNFYYGMDV 104
LICDR1 RASQGISSYLA 128
LCDR2 AASTLQS 129
LCDR3 QQLNSYPLT 130
VH (KL2B30_VH) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS 142
VL (KL2B30_VL) DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK 148
KL2B53 HCDR1 SYDIH 107
HCDR2 IISYDGSKKDYTDSVKG 108
HCDR3 ESGWSHYYYYGMDV 109
LICDR1 RASQDISNYLA 125
LCDR2 AASTLHS 131
LCDR3 QKYNSAPYT 132
VH (KL2B53_VH) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVED SAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS 143
VL (KL2B53_VL) DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIK 149
KL2B242 HCDR1 SYYWS 102
HCDR2 RLYVSGFTNYNPSLKS 112
HCDR3 DSGNYWGWFDP 113
LICDR1 SGDQLGENYAC 133
LCDR2 QDSKRPS 134
LCDR3 QAWDNSIVV 135
VH (KL2B242_VH) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS 144
VL (KL2B242_VL) SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVL 150
KL2B467 HCDR1 YYGMH 115
HCDR2 FISYDGSNKYYADSVKG 116
HCDR3 LPYSGSYWAFDY 117
LICDR1 GGDNIGSKSVH 136
LCDR2 DNSDRPS 137
LCDR3 QVWDSSSDHPVV 138
VH (KL2B467_VH) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSS 145
VL (KL2B467_VL) QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTV 151
KL2B494 HCDR1 HYAMS 120
HCDR2 TIGGSGGSTYYADSVKG 121
HCDR3 PHIVMVTALLYDGMDV 122
LICDR1 GGNNIGSKSVH 97
LCDR2 DDSDRPS 127
LCDR3 QVWDSSSDHVV 139
VH (KL2B494_VH) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS 146
VL (KL2B494_VL) SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 152
〔表10 〕所選抗hK2 抗體之VH 及VL 的SEQ ID NO: DNA 序列。
抗體 VH 蛋白質SEQ ID NO: VL 蛋白質SEQ ID NO VH cDNA SEQ ID NO: VL cDNA SEQ ID NO:
m11B6 317 318 320 326
hu11B6 5 2 321 327
HCF3-LCD6 6 1 322 328
HCG5-LCB7 4 3 323 329
KL2B357 140 147 153 161
KL2B358 141 75 154 162
KL2B359 77 75 324 330
KL2B360 140 75 155 163
KL2B413 76 74 325 331
KL2B30 142 148 156 164
KL2B53 143 149 157 165
KL2B242 144 150 158 166
KL2B467 145 151 159 167
KL2B494 146 152 160 168
共有VH 及VL 序列
圖17A 顯示mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3、及HCG5之VH域的序列比對。圖2顯示mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、LDC6、及LCB7之VL域的序列比對。分別針對VH及VH域來判定SEQ ID NO: 344及SEQ ID NO:345之共有胺基酸序列。將HCDR及LCDR殘基加底線。SEQ ID NO: 344 QVQLQESGPGLVKPSX1 TLSLTCX2 VSGNSITSDYAWN WIRQX3 PGKGLEWX4 GYISYSGSTT YNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTX5 X6 DTAVYYCATGYYYGSGF WGQGTLVTVSS 其中， X1係D或Q； X2係A或T； X3係P或F； X4係I或M； X5係A或P；或 X6係V或A。SEQ ID NO: 345 X1 IVLTQSPX2 x3 LX4 X5 SX6 GERATX6 X8 CX9 ASESVEYFGTSLMH WYQQKPGQPPX10 LLIYAASNX11 ES GX12 PX13 RFSGSGSGTDFTLTIX14 SLQX15 EDX16 AVYX17 CQQTRKVPYT FG X18 GTKX19EIK X1係D或E； X2係D或A； X3係S或T； X4係A或S； X5係V或L； X6係L或P； X7係I或L； X8係N或S； X9係R或K； X10係K或R； X11係V或R； X12係V或I； X13係A或D； X14係Q或S； X15係P或A； X16係F或V； X17係Y或F； X18係Q或G；且 X19係L或V。Fab-Fc 及scFv
hK2特異性VH/VL區係工程改造為VH-CH1-連接子CH2-CH3及VL-CL且表現為IgG2或IgG4或工程改造為呈VH-連接子-VL或VL-連接子-VH定向之scFv。使用在scFv中之連接子係上述SEQ ID NO: 7 之連接子。使用scFv來產生如實例7中所述之雙特異性或如實例11中所述之所產生CAR。
表11 顯示所選抗hK2抗體呈mAb格式之HC胺基酸序列。表 12 顯示所選抗hK2抗體呈mAb之LC胺基酸序列。表 13 彙總所選抗hK2抗體呈mAb格式之HC及LC DNA SEQ ID NO。表 14 顯示所選scFv呈VH-連接子-VL或VL-連接子-VH定向之胺基酸序列。〔表11 〕所選抗hK2 抗體呈mAb 格式之HC （VH-CH1- 連接子CH2-CH3 ）的胺基酸序列。
KLK2 重鏈 HC 蛋白質SEQ ID NO: HC 胺基酸序列
m11B6_HC 332 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
h11B6_HC 334 QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KL2B30_HC 185 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
K2B53_HC 187 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
KL2B242_HC 189 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
KL2B467_HC 191 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Kl2B494_HC 193 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
〔表12 〕所選抗hK2 抗體呈mAb (Fab-Fc) 格式之LC (VL-CL) 的胺基酸序列。
KLK2 輕鏈 LC 蛋白質SEQ ID NO: LC 胺基酸序列
m11B6_LC 333 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
h11B6_LC 335 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
KL2B30_LC 186 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
KL2B53_LC 188 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
KL2B242_LC 190 SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
KL2B467_LC 192 QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
KL2b494_LC 194 SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
〔表13 〕所選抗hK2 抗體之HC 及LC 的SEQ ID No
抗體 HC 蛋白質SEQ ID NO: LC 蛋白質SEQ ID NO: HC cDNA SEQ ID NO: LC cDNA SEQ ID NO:
m11B6 332 333 336 337
hu11B6 334 335 338 339
KL2B30 185 186 195 196
KL2B53 187 188 197 198
KL2B242 189 190 199 200
KL2B467 191 192 201 202
KL2B494 193 194 203 204
〔表14 〕所選抗hK2 scFv 抗體呈VH- 連接子-VL (HL) 或呈VL- 連接子-VH (LH) 格式之可變域的胺基酸序列。
scFv 名稱 頭字語 scFv 之胺基酸序列 SEQ ID NO:
scFv1 HCG5_LDC6_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 8
scFv2 HCG5_hu11B6_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 9
scFv3 HCF3_hu11B6_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 10
scFv4 HCG5_LCB7_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 11
scFv5 LCD6_HCG5_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 12
scFv6 hu11B6_HCF3_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 13
scFv7 hu11B6_HCG5_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 14
scFv8 LCB7_HCF3_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 15
scFv9 LCB7_HCG5_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 16
scFv10 LCD6_HCF3_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 17
scFv11 hu11B6_LCB7_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 18
scFv12 hu11B6_LCD6_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 19
scFv13 hu11B6_HL QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK 20
scFv14 LCD6_hu11B6_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 21
scFv15 hu11B6_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 22
scFv16 LCB7_hu11B6_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 23
scFv17 KL2B413_HL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK 340
scFv18 KL2B413_LH EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS 341
scFv19 KL2B359_HL QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 342
scFv20 KL2B359_LH EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 343
scFv21 KL2B357_HL QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 169
scFv22 KL2B357_LH DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 170
scFv23 KL2B358_HL QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 171
scFv24 KL2B358_LH EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 172
scFv25 KL2B360_HL QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK 173
scFv26 KL2B360_LH EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS 174
scFv27 KL2B30_HL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK 175
scFv28 KL2B30_LH DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS 176
scFv29 KL2B53_HL EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIK 177
scFv30 KL2B53_LH DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS 178
scFv31 KL2B242_HL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVL 179
scFv32 KL2B242_LH SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS 180
scFv33 KL2B467 HL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTV 181
scFv34 KL2B467 LH QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSS 182
scFv35 KL2B494_HL QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS GGSEGKSSGSGSESKSTGGSSSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 183
scFv36 KL2B494_LH SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS 184
實例12. 抗hK2 抗體之生物物理表徵 抗hK2 抗體之親和力及熱穩定性
所選hK2抗體對可溶hK2之親和力係藉由表面電漿子共振(SPR)來測量。SPR是一種免標示技術，藉由測量複合物形成及解離時之質量變化來研究兩個結合夥伴之間的交互作用強度。抗體係捕集於塗佈有抗Fc抗體之感測器晶片上接著以各種濃度及指定締合及解離時間注射可溶hK2。在解離後，用適當溶液使表現再生以準備下一次交互作用。動力學資訊（締合速率(on-rate)及解離速率(off-rate)常數）係藉由將感測器圖譜對1:1 Langmuir模型進行適配來擷取。結合親和力(KD )係記述為速率常數之比率(koff /kon )。所選hK2抗體之KD 值係列示於表 15 。
熱穩定性係藉由微差掃描螢光測定法(NanoDSF)使用自動化Prometheus儀器來判定。使用NanoDSF以0.5 mg/mL之濃度（在磷酸鹽緩衝鹽水中，pH 7.4）來測量分子之Tm 。測量係藉由將樣本裝入來自384孔樣本盤之24孔毛細管中來進行。針對各樣本執行二重複運行。熱掃描以1.0℃/分鐘之速率從20℃跨到95℃。內在色胺酸及酪胺酸螢光係在330 nm及350 nm之發射波長下監測，並且將F350/F330 nm比率對溫度作圖以產生去折疊曲線。所測得之Tm值係列於表 15 中。〔表15 〕所選分子之KD 及Tm
分子 KD (nM) Tm (℃)
KL2B413 (scFv) 34.3 67
KL2B359 (scFv) 0.7 - 1 67
KL2B30 (Fab) 0.460 ＞70
KL2B242 (Fab) 0.040 ＞70
KL2B53 (Fab) 0.080 ＞70
KL2B467 (Fab) 0.078 ＞70
KL2B494 (Fab) 0.053 ＞70
產生自Ablexis免疫活動之KL2B413 scFv如藉由Nano DSF所測量具有67℃之熱穩定性(Tm)且具有約34 nM之與人類hK2親和力(KD )。將針對再人源化運動所獲得且維持類似於鼠類11B6之結合親和力的殖株KL2B359轉換為scFv-Fc及CAR-T以進行額外剖析。KL2B359 scFv顯示67℃之Tm及~0.7至1nM之與hK2結合親和力(KD )。KL2B30、KL2B242、KL2B53、KL2B467、及KL2B494 Fab顯示低於0.5 nM之結合親和力及高於70℃之Tm值。表位定位(epitope mapping)
所選KL2B抗體之表位係藉由氫-氘交換質譜法(HDX-MS)來判定。使用人類KLK2抗原進行表位定位實驗。
簡言之，將純化KLK2抗原與或未與抗KLK2抗體於氧化氘標示緩衝液中培養。在不同時點，藉由添加8 M脲，1M TCEP，pH 3.0來淬熄氫-氘交換(HDX)混合物。使經淬熄樣本在室溫下以600 µL/min通過固定化胃蛋白酶/FPXIII管柱並用緩衝液A（1%乙腈，0.1% FA於H2O中）來平衡。將胃蛋白酶片段用緩衝液A以600 µL/min裝至逆相捕捉管柱上然後去鹽1 min（600 µL緩衝A）。藉由C18管柱及8%至35%緩衝液B（95%乙腈，5% H2O，0.0025% TFA）之線性梯度以100 µL/min在20分鐘內分開去鹽片段並藉由質譜法進行分析。使用LTQ™ Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(Thermo Fisher Scientific)來進行質譜分析，毛細管溫度在275℃，解析度150,000，及質量範圍(m/z) 300至1,800。在HDX實驗前，使用BioPharma Finder 3.0 (Thermo Fisher Scientific)來進行非氘化樣本之肽識別。使用HDExaminer版本2.5 (Sierra Analytics, Modesto, CA)來擷取HDX實驗之MS原始數據檔案的質心(centroid)值。
hK2抗體hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413、及KL2B53與可溶hK2蛋白之培養會導致不同之氫交換及整體保護模式。將受保護區段定位至hK2抗原之序列上以視覺化結合表位（圖 17B ）。KL2B494、KL2B467、及KL2B30結合至由殘基173至178 (SEQ ID NO: 346 , KVTEF)及殘基230至234 (SEQ ID NO: 347 , HYRKW)所組成之共同序列。KL2B53顯示不同之保護模式，並結合至由殘基27至32 (Seq ID NO:348 , SHGWAH)、60至75 (SEQ ID NO: 349 , RHNLFEPEDTGQRVP)、及138至147 (SEQ ID NO: 350 , GWGSIEPEE)所組成之序列。實例13. 額外scFv CAR 建構體之產生及表徵
選殖為scFv之胞外域11B6在升溫(55℃)下不會保持結合，因而開始額外運動以自親本11B6產生新人源化抗體。
產生含有衍生自抗體11B6之熱穩定化scFv的hK2 CAR。含有熱穩定化scFv之CAR建構體的描述及SEQ ID NO:係提供於表 16 中。描述中之名稱係回指以上識別出來之VH或VL，20AA係指scFv中VH/VL對之間的20個胺基酸長度連接子。將CAR中之scFv選殖為呈VH-L-VL或VL-L-VH定向。
亦將所產生之scFv KL2B413_HL、KL2B413_LH、KL2B359_HL、及KL2B359_LH結合至CAR建構體中並進一步進行表徵。表 16 顯示所產生之CAR建構體及其SEQ ID NO。所使用之信號序列係MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 24)〔表16 〕
CAR建構體之名稱 CAR中scFv之描述 CAR中scFv胺基酸序列之SEQ ID NO: CAR之完整ECD域的SEQ ID NO:（包括信號序列） CAR胺基酸序列之SEQ ID NO:
CAR1 HL_HCG5_LCD6_20AA (scFv1) 8 273 46
CAR2 HL_HCG5_LCh11B6_20AA (scFv2) 9 274 47
CAR3 HL_HCF3_LCB7_20AA (scFv3) 10 275 48
CAR4 HL_HCG5_LCB7_20AA (scFv4) 11 276 49
CAR5 LH_LCD6_HCG5_20AA (scFv5) 12 277 50
CAR6 LH_LC人源化_HCF3_20AA (scFv6) 13 278 51
CAR7 LH_LC人源化_HCG5_20AA (scFv7) 14 279 52
CAR8 LH_LCB7_HCF3_20AA (scFv8) 15 280 53
CAR9 LH_LCB7_HCG5_20AA (scFv9) 16 281 54
CAR10 LH_LCD6_HCF3_20AA (scFv10) 17 282 55
CAR11 HL_HC人源化_LCB7_20AA (scFv11) 18 283 56
CAR12 HL_HC人源化_LCD6_20AA (scFv12) 19 284 57
CAR13 HL_HC人源化_LC人源化_20AA (scFv13) 20 285 58
CAR14 LH_LCD6_HC人源化_20AA (scFv14) 21 286 59
CAR15 LH_LC人源化_HC人源化_20AA (scFv15) 22 287 60
CAR16 LH_LCB7_HC人源化_20AA (scFv16) 23 288 61
CAR17 KL2B413_HL (scFv17) 340 289 82
CAR18 KL2B413_LH (scFv18) 341 290 83
CAR19 KL2B359_HL (scFv19) 342 291 84
CAR20 KL2B359_LH (scFv20) 343 292 85
CAR21 KL2B357 HL (scFv21) 169 319 205
CAR22 KL2B357 LH (scFv22) 170 320 206
CAR23 KL2B358 HL (scFv23) 171 321 207
CAR24 KL2B358 LH (scFv24) 172 322 208
CAR25 KL2B360 HL (scFv25) 173 323 209
CAR26 KL2B360 LH (scFv26) 174 324 210
CAR27 KL2B30 HL (scFv27) 175 325 211
CAR28 KL2B30 LH (scFv28) 176 326 212
CAR29 KL2B53 HL (scFv29) 177 327 213
CAR30 KL2B53 LH (scFv30) 178 328 214
CAR31 KL2B242 HL (scFv31) 179 329 215
CAR32 KL2B242 LH (scFv32) 180 330 216
CAR33 KL2B467 HL (scFv33) 181 331 217
CAR34 KL2B467 LH (scFv34) 182 332 218
CAR35 KL2B494 HL (scFv35) 183 333 219
CAR36 KL2B494 LH (scFv36) 184 334 220
LC人源化係指hu11B6_VL。 HC人源化係指hu11B6_VH
實例14 ：經由Jurkat-Lucia ™ NFAT 細胞識別不同基於scFv 具有抗原非依賴性活化之CAR 。
經活化T細胞(NFAT)之核因子係首先作為免疫細胞之調控子而被識別出來的轉錄因子家族。不希望受理論束縛，T細胞活化會導致鈣流入，此會活化鈣調磷酸酶，其會使NFAT之N端處富含絲胺酸的核定位信號去磷酸化，導致NFAT之核輸入。由於scFv群集所致之滋養信號傳導後續可由JNL報導子細胞系中由NFAT啟動子驅動之螢火蟲螢光素酶檢測。
將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用各種CAR建構體轉導。CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。新穎hK2 KL2B413及再人源化11B6 CAR殖株係根據下列規程在JNL報導子檢定中針對抗原依賴性活性進行分析。
慢病毒轉導係執行如下。採集JNL細胞並再懸浮至1E6/ml。將500 µl JNL細胞及慢病毒以3之MOI添加，然後藉由上下移液混合。將混合物置於37℃培養箱中24小時。接著，將500 µl的JNL培養基添加至各孔。培養在37℃培養箱中持續進行。在第4天將細胞轉移至T25燒瓶。在第5至6天，執行轉導驗證。採集150 µl的細胞，以經由適用於所關注之具體CAR的檢測試劑檢測CAR表現（例如，使用生物素-hK2蛋白來檢測hK2 CAR）。將JNL細胞維持在5×105 /ml，直到有足夠細胞以進行凍結或用於下述JNL檢定中。
JNL檢定係執行如下。與目標細胞系之共培養係以2:1之效應細胞對目標細胞比來進行。將JNL細胞離心沉降以移除培養基中之任何分泌的螢光素酶，然後以4×105 /ml再懸浮於新鮮培養基中。採集JNL細胞。將抗原陽性目標細胞系及抗原陰性目標細胞系兩者以2E5/ml製備。接著，將100 µl JNL添加至100 µl目標細胞。針對僅JNL之對照組，添加100 µl的培養基而非目標細胞。針對陽性對照組，將單純JNL細胞或CAR JNL細胞添加至1×細胞刺激混合物中，然後在37℃培養箱中培養24小時。將150 µl的上清液採集至96孔盤中，然後離心以移除細胞。將100 µl的上清液從盤轉移至硬底黑色盤，接著添加100 µl QUANTI-luc lucia檢測試劑，並在室溫下培養5分鐘，之後用Envision多盤讀取儀進行讀取。
將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用各種hK2 CAR建構體轉導。表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定。數據係示於圖 12A 中。針對在人源化11B6 KL2B359 CAR上具有46-50%細胞表現及在KL2B413 CAR上具有73.7-96%細胞的所選細胞，確認經轉導JNL細胞中之CAR表現。
圖12B 中之數據顯示hK2 CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。將含有所指示CAR殖株之JNL細胞及JNL細胞(UTD)與目標細胞系（VCap、LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將殖株視為具有活性。針對新穎KL2B413及再人源化之11B6 HL&LH CAR未發現抗原依賴性活化。實例15 ：在即時IncuCyte 殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性評估HK2 CAR-T 細胞。
將HK2 CAR-T細胞與HK2+ VCaP細胞及HK2- DU145細胞共培養96小時。效應細胞對目標細胞(ET)比係基於圖 11A 至圖 11B 中所示之CAR表現數據計算。將穩定表現紅色核染料之目標細胞藉由IncuCyte成像系統以即時方式來測量。數據係示於圖 13A （針對與HK2+ VCaP細胞共培養之HK2 CAR-T細胞）及圖 13B （針對與HK2- DU145細胞共培養之HK2 CAR-T細胞）。在這些圖式中，腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始存活目標細胞數目-目前存活目標細胞數目）/初始存活目標細胞數目*100(%)實例16. 用KL2B413_HL 、KL2B413_LH 、KL2B359_HL 、或KL2B359_LH 轉導之CAR-T 細胞的表徵 CAR-T 細胞之活化之抗原依賴性的
所產生之CAR-T細胞係在JNL報導子檢定中針對抗原依賴性活性進行評估，如實例中4中所述。簡言之，將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用CAR17 (KL2B413_HL)、CAR18 (KL2B413_LH)、CAR19 (KL2B359_HL)、或CAR20 (KL2B359_LH)建構體轉導。各CAR之表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定。經轉導JNL細胞中之CAR表現係針對所選殖株進行確認，並且46至50%的細胞表現基於KL2B359之CAR且73.7至96%的細胞表現基於KL2B413之CAR，如圖 6 中所示。表現各CAR之JNL細胞百分比如下：KL2B413_HL: 73.7%，KL2B413_LH: 93.6%，KL2B359_HL: 46%，KL2B359_LH: 50.8%。
hK2 CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。為此，將用測試CAR建構體轉導之JNL細胞或未經轉導之JNL細胞(UTD)與目標細胞系（VCap、LNCap/hK2（重組地表現hK2之LNCaP細胞）、LNCaP、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將建構體其視為具有活性。針對所測試之CAR建構體未發現抗原依賴性活化。圖 13A 顯示產生自CAR-T細胞與測試目標細胞之結合的RLU（相對光單位），如圖中所指示。CAR-T 細胞在抗原刺激時會生產細胞介素
由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ對於發揮腫瘤免疫監控而言非常重要，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。為了判定經hK2 CAR修飾之人類T細胞是否能夠辨識hK2陽性腫瘤細胞並由其活化，將用所指示CAR殖株轉導之初級T細胞及對照未經轉導之T細胞(UTD)與目標細胞系（LNCaP/hK2、LNCaP、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，並收集上清液以進行IFN-γ濃度測量。如圖 14 中所示，用hK2 CAR細胞轉導之CAR-T細胞在與重組地表現hK2之LNCaP細胞(LNCap/hK2)共培養期間會分泌IFN-γ，且在與表現極低hK2之C4-2B及LNCap細胞共培養期間亦會，但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。來自重複培養物之平均IFN-γ濃度±SD (pg/ml)係示於圖 14 。CAR-T 細胞以抗原依賴性方式增生
使用如實例4中所述之T細胞增生檢定規程來評估CAR T細胞之增生。hK2 CAR-T細胞及未經轉導(UTD) T細胞係用CellTrace Violet (CTV; 5 µM)標示並與hK2陽性VCap及hK2陰性DU145細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並且判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR-T細胞的頻率。藉由對CD3+ T細胞進行閘控，hK2陽性Vcap細胞而非hK2陰性DU145細胞會促進各所測試CAR-T細胞系之增生（如圖 10C 、圖 10D 、及圖 10E 中所示）及活化標記CD25之上調（如圖 11B 及圖 12A 中所示）。未經任何刺激之單純T細胞不會增生，而經CD3/28珠刺激之T細胞顯示相等之增生模式。在與VCap細胞共培養5天後，hK2 CAR+ T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。不同所測試CAR-T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR-T細胞計數。增生T細胞及表現CD25之T細胞的百分比係基於來自二重複之平均絕對細胞計數+/-SEM。實例17 ：經抗原刺激CAR-T 細胞之Th1 細胞介素IFN- γ生產。
不希望受理論束縛，由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ對於發揮腫瘤免疫監控而言非常重要，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。
為了判定經hK2 CAR修飾之人類T細胞是否能夠辨識hK2 (+)腫瘤細胞並由其活化，將含有所指示CAR殖株之初級T細胞及對照未經轉導之T細胞(UTD)與目標細胞系（LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，並收集上清液以進行IFN-g濃度測量。數據在圖 14 中係顯示為來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度±SD (pg/ml)。如所示，經hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之LNCap/hK2細胞共培養期間會分泌IFN-γ，甚至與表現極低Hk2之C4-2B及LNCap細胞共培養期間也會，但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。未揭示之對照CAR由於遠比hK2高之抗原表現水平而會分泌遠為較高量的IFN-γ。實例18 ：用來評估 hK2 CAR T 細胞之抗腫瘤活性的CD107a 去顆粒檢定。
不希望受理論束縛，腫瘤細胞可由細胞毒性淋巴球（諸如CD8+ T淋巴球）及自然殺手(NK)細胞所辨識及殺滅，主要透過免疫分泌殺滅目標細胞之溶解性顆粒(lytic granule)。此過程涉及顆粒薄膜與免疫效應細胞之細胞質體薄膜的融合，導致胞溶體相關聯蛋白質之表面暴露，該等蛋白質一般存在於溶解性顆粒周圍之雙層脂質上，諸如CD107a。因此，CD107a之薄膜表現會構成免疫細胞活化及細胞毒性去顆粒之標記。
去顆粒檢定係執行如下。將目標細胞(5 × 104 )與相同數目之效應細胞在96孔盤中以每孔0.1 ml進行共培養。對照孔含有單純T細胞。除了1 µl/樣本的莫能菌素(BD Biosciences)外再添加抗CD107a（每孔5 µl），然後在37℃下培養4小時。將細胞用PBS洗滌兩次，針對hK2 CAR、CD3、及CD8表現對細胞進行染色，然後在流動式細胞儀BD Fortessa上進行分析。數據係示於圖 15 中。
如所示，Vcap細胞上存在hK2抗原會導致CD107A+ hK2 CAR(+) T細胞增加，但hK2 CAR(-)及UTD T細胞則不會增加（以流動式細胞測量術測量）。在未經腫瘤細胞刺激之CAR T細胞中僅見到背景染色(＜2%)。佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)結合離子黴素（eBioscience™細胞刺激混合物；500X）在此4小時細胞培養模型中是CD107a細胞表面表現之一致誘發劑，其用作為陽性對照組。圖 15 中所示之結果係針對代表性捐贈者T細胞而顯示並且在多位捐贈者中皆可重現。實例19 ：T 細胞增生是體內免疫功能之重要體外參數。
為了進一步評估新穎KL2B413及再人源化11B6 (KL2B359) CAR T細胞之功能及協助挑選最佳候選建構體，將CAR T細胞用CellTrace™ Violet (CTV; 5uM)標示以用於T細胞增生檢定。依照下列規程，並且結果示於圖 16A 至圖 16D 。
收集腫瘤細胞Vcap及DU145並用PBS洗滌兩次。在37℃培養箱中將細胞以10E6/ml再懸浮於含有100ug/ml Mitomycin C (MMC)之PBS中歷時1.5小時，從而阻斷腫瘤細胞增生。將20 µL DMSO添加至CTV染色溶液之小瓶中。接著，將5 µl的溶液稀釋至5 mL (1:1000)的PBS（溫熱至37℃）中以產出5 µM染色溶液。計數並收集2E6個T細胞，將其用PBS洗滌兩次，接著以4E6/ml (0.5 ml)再懸浮。添加相等體積(0.5 ml)的CTV染色溶液。將細胞在37℃下培養20分鐘。在20分鐘之後，將4 ml PRMI+20% FBS添加至細胞以吸收任何未結合之染料，然後將細胞培養5分鐘。將細胞以400 × g離心5分鐘，接著將細胞沉澱物再懸浮於預溫熱之RPMI+10%FBS培養基中。計數T細胞，並且將1E5個細胞(100 µl)接種於96孔平底盤中。
在此期間，收集經MMC處理之腫瘤細胞hK2(+) VCap及HK2(-) DU145並在1.5小時後計數，接著以1E6/ml再懸浮。將1E5個細胞(100 µl)與T細胞共培養於96孔盤中。使用單純T細胞、及以3:1 CD3/28珠對細胞比添加之T細胞分別作為陰性及陽性對照組。
在五天的共培養之後，自各孔收集所有細胞。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘兩次，然後於96孔U底盤中用hK2CAR、CD3、CD8及CD25、LIVE/DEAD（近紅外）染色。在洗滌之後，使用100 µl BD Cytofix™固定緩衝液（50 µl FACS緩衝液+ 50 µl固定緩衝液），將所有細胞固定10分鐘。在培養期結束之後，藉由多色流動式細胞測量術分析經染色之樣本。
流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR+T細胞的頻率。
為了製備CTV直方圖，設定CTV未稀釋閘以涵蓋單獨培養T細胞之遠右方峰（CTV亮），並且設定CTV稀釋閘以捕集其餘群體。此設定會套用至所有樣本。增加統計量以包括CTV稀釋群體中之細胞絕對#。用此統計量建立表格，接著將數據（細胞計數）匯出至Excel以在轉移至Prism前進行格式重訂。
圖16A 至圖 16D 顯示hK2 CAR-T細胞增生檢定之結果。藉由對CD3+ T細胞進行閘控，如圖 16A 至圖 16B 中所示，hK2(+) Vcap細胞而非hK2(-) DU145細胞會促進所有經CAR建構體工程改造之T細胞增生及活化標記CD25之上調，如圖 16C 至圖 16D 中所示。使用經CD3/28珠刺繳之T細胞作為陽性對照組，並且使用單純T細胞作為陰性對照組。未經任何刺激之單純T細胞不會增生，而經CD3/28珠刺激之T細胞則顯示相等之增生模式。如所示，在與VCap細胞共培養5天後，hK2 CAR+ T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。不同CAR建構體工程改造之T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR+T細胞計數。基於來自重複之平均絕對細胞計數+/- SEM的增生T細胞及表現CD25之T細胞的百分比之彙總係顯示於圖 16B 及圖 16D 中。實例20 ：hK2 scFv CAR 之建構及表現
建構包含下列scFv序列之hK2 CAR建構體：
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hK2 CAR構建體包含下列序列：
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KL2B467 LH: QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 218)
KL2B494 HL: QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 219)
KL2B494 LH: SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 220)
使經Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28刺激之T細胞經受電穿孔，接著用OPTI-MEM (Invitrogen)洗滌三次，然後以50E6/ml之最終濃度再懸浮於OPTI-MEM中。隨後，將0.1 ml的細胞(5E6)與10ug的編碼IVT CAR之RNA混合，然後使用BTX ECM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)，藉由按壓「脈衝(pulse)」按鈕一次在2-mm間隙比色管(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)中進行電穿孔。（設定：500伏特，750 µsec脈衝強度(Pulse Length)及單次(1)脈衝，100mSec間隔。）電穿孔後，將T細胞轉移至6孔盤然後立即放回至37℃培養箱中。將初級人類T細胞在沒有mRNA之情況下（模擬物）、或在有表現hK2 scFv CAR或不相關對照CAR之10 µg mRNA之情況下進行電穿孔。電穿孔後24小時，在用2 µg/ml生物素化L-蛋白及鏈黴親和素接合PE、或生物素化hK2 (1 µg/ml)及鏈黴親和素接合PE染色後，藉由流動式細胞測量術測量CAR表面表現。
電穿孔後二十四小時，計數T細胞。收集各者之1E5個T細胞。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，針對微量滴定盤使用200 µL/孔的FACS緩衝液，並丟棄上清液。將所有孔用100 µl含有蛋白L之染色緩衝液（Genscript，目錄號M000971:500；2 ug/ml）染色，並在4℃下培養至少30分鐘，同時保護其免於照光。將細胞藉由添加FACS緩衝液來洗滌兩次，針對微量滴定盤使用150 µL/孔的FACS緩衝液。在室溫下執行400× g離心4分鐘。接著丟棄上清液。將所有孔用100 µl鏈黴親和素-R-藻紅素(SA-PE; 1:250)及LIVE/DEAD可固定近紅外死細胞染色染料(1:1000)染色，在4℃下培養至少30分鐘，同時保護其免於照光。然後細胞便準備好進行流動式細胞測量術分析。
針對hK2 CAR見到蛋白L染色之觀察結果，而在對照T細胞（沒有mRNA電穿孔之T細胞）中僅見到背景染色(~5.5%)。初級人類T細胞上的CAR表現亦可經由J&J內部生物素標示之重組KLK2蛋白接著SA-PE來檢測。如所示，T細胞有效率地表現hK2 CAR，如藉由流動式細胞測量術所測量，而在對照T細胞（未經mRNA電穿孔或未揭示之對照CAR（非hK2特異性）的T細胞）中僅見到背景染色。實例21 ：由hK2 CAR-T 細胞所致之腫瘤細胞殺滅
使用流動式細胞儀，執行基於CellTrace Violet（CTV，Thermo Fisher Scientific目錄號：C34557）共培養之細胞毒性檢定如下。
T細胞係製備如下。EP後二十四小時，計數T細胞，並以針對最濃縮/所欲E:T所需之濃度將其再懸浮。將T細胞以100 µl/檢定之孔添加（2×106 個細胞/ml；以10:1 E:T比接種100 µl，即每2E4個目標細胞有2E5個T細胞）。製作10:1 E:T濃度之儲備液，並用完整T細胞培養基（Optimizer w/CTS、5%人類血清、1% GlutaMax）進行兩倍連續稀釋至0.3125:1。使用96孔圓底組織培養處理盤，將T細胞以三重複接種（100ul/孔）。
經CTV標示之目標細胞係製備如下。將20 µL DMSO添加至CTV染色溶液之小瓶中。將此儲備溶液稀釋至20 mL的PBS（溫熱至37℃）中以獲得5 µM染色溶液。收集10E6個腫瘤細胞，將其用PBS洗滌兩次，然後以4E6/ml (2.5 ml)再懸浮。添加相等體積(2.5 ml)的CTV染色溶液。將細胞在37℃培養箱中培養20分鐘。將40 ml PRMI+20% FBS添加至細胞以吸收任何未結合之染料。將細胞培養5分鐘。將細胞以400 × g離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於預溫熱之RPMI+10%FBS培養基中。在此期間，將T細胞以上述所欲之E/T比接種。再計數hK2+腫瘤細胞系及hK2-腫瘤細胞系，接著將細胞用二重複以2E5/ml及100ul再懸浮。將細胞與經標示之腫瘤細胞系在平底96孔盤中共培養。
使用流動式細胞儀，執行細胞毒性檢定如下。在20小時的共培養之後，將所有細胞轉移至U底96孔盤中然後洗滌。在20小時的共培養之後，自平底96孔盤收集所有細胞並將其轉移至U底96孔盤，接著洗滌。將30 µl的0.25%胰蛋白酶添加至所有的孔中，然後在37℃培養箱中培養5分鐘。在5分鐘之後，將所有腫瘤細胞收集至U底96孔盤。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘兩次。接著將細胞沉澱物再懸浮稀釋(1:1000) LIVE/DEAD™可固定近紅外染色染料(100 µl)中。將細胞在4℃下培養30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌兩次（藉由將細胞以400 × g離心5分鐘）。在洗滌之後，使用100 µl的BD Cytofix™固定緩衝液（50ul FACS緩衝液+50 µl固定緩衝液），將所有細胞固定10分鐘。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘一次。將細胞沉澱物再懸浮於FACS緩衝液中。在培養期結束之後，藉由多色流動式細胞測量術分析經染色之樣本。使用下列方程式計算細胞毒性活性之百分比： 特異性死亡% =近紅外+CTV+（死）細胞% -自發近紅外+CTV+% /（100% -自發近紅外+CTV+（死）細胞%）× 100%。
暫時轉染後二十四小時，將目標細胞（hK2陽性Vcap及hK2陰性DU145細胞）用Cell Trace Violet (CTV)螢光染料標示，然後與hK2 CAR-T細胞共培養。模擬物T細胞作為陰性效應細胞對照組。以範圍在0.3125:1至10:1之效應細胞對目標細胞(E/T)比將細胞共培養20小時。殺滅百分比係測量為共培養物中剩餘之活（活力染料呈陰性）目標（CTV呈陽性）細胞的絕對數目相對於沒有與CAR-T細胞培養之活目標細胞的數目之比率。如所示，hK2 CAR T細胞特異性地且有效率地裂解hK2(+)人類癌細胞系，但不會裂解hK2(-)細胞（在10:1至0.3125:1之E/T比下），而在為模擬物或hK2 CAR之T細胞中僅見到背景細胞毒性。
亦使用xCELLigence作為即時細胞分析系統，測試hK2 CAR-T細胞之即時細胞毒性，以作為目標細胞之免疫細胞介導細胞溶解的效價檢定。
將50 µL的目標癌細胞培養基添加至96孔E-Plate (ACEA Biosciences)之各孔，然後測量背景阻抗並顯示為細胞指數。接著，將貼附性目標細胞hK2(+)及hK2(-)解離，並以5E4 (VCap)、5E3個細胞/E-Plate之孔的濃度以100 µL之體積接種，然後使其被動地貼附於電極表面。接種後，在層流櫃內將E-Plate保持在環境溫度下30分鐘，接著轉移至細胞培養箱內之RTCA MP儀器中。立即起始數據記錄，並在實驗的整個持續期間（96小時）以15分鐘間隔進行。
在施加處理時（癌細胞接種後24小時），暫停數據擷取，將50 µL的培養基自各孔移除，然後以不同之效應細胞對目標細胞(E:T)比以50 µL之體積添加效應CAR-T細胞。將hK2(+) CAR-T及未揭示之對照CAR（非HK2特異性）T細胞再懸浮。接著以二重複在96孔盤中執行兩倍稀釋（從5:1至0.156:1 E/T比）。亦將目標加上模擬物效應細胞對照組（無RNA電穿孔T細胞）添加至目標細胞。
在不同E/T比下，將目標細胞hK2(+)及hK2(-)與模擬物、10 µg mRNA電穿孔（轉染後24小時）培養成hK2(+)及hK2(-) CAR-T細胞歷時大約72小時。產生hK2(+)及hK2(-)之標準化細胞指數(CI)圖。在單獨接種時，目標細胞會貼附在盤上並增生，從而增加CI讀數。實例22 ：hK2 CAR-T 細胞所致之細胞介素生產
由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ允許發揮腫瘤免疫監控，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。為了判定hK2 CAR-T細胞是否能夠辨識hK2 (+)腫瘤細胞並由其活化，從基於xCELLigence之殺滅檢定收集上清液，如實例21中所述。在約70小時共培養之後，收集上清液並藉由ELISA根據ELISA套組（Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe，BioLegend，目錄號：430106）提供之指示進行檢定。
發生經抗原刺激之CAR-T細胞的IFN-γ生產。hK2 CAR T細胞及對照CAR-T細胞在與表現hK2之細胞共培養期間會分泌IFN-γ（以E:T比依賴性方式），但與hK2陰性細胞共培養期間則不會。未揭示之對照CAR由於遠比hK2高之抗原表現水平而會分泌更為高量的IFN-γ。實例21 ：由hK2 CAR-T 細胞所致之腫瘤細胞殺滅
在即時IncuCyte腫瘤殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性評估hK2 CAR-T細胞。以1:1或0.5:1之效應細胞:目標細胞比（此係基於CAR表現數據計算），將hK2 CAR-T細胞與目標細胞共培養88小時。辨識出穩定表現紅色核染料之目標細胞，如藉由IncuCyte成像系統以即時方式所測量。執行下列計算：腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始存活目標細胞數目-目前存活目標細胞數目）/初始存活目標細胞數目*100(%)實例22 ：hK2 CAR-T 細胞所致之細胞介素生產
使用13-plex Milliplex Human High Sensitivity T細胞套組(HSTCMAG28SPMX13)，分析自hK2CAR-T細胞與細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物所收集的上清液。hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之細胞共培養期間會分泌細胞介素，但未經轉導之T細胞(UTD)則僅分泌極少量。hK2 CAR-T細胞所致之細胞介素釋放結果
自hK2 CAR-T細胞與細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物收集上清液。hK2 CAR-T細胞在與表現hK2之細胞共培養期間會分泌IFN-γ，但與hK2陰性細胞共培養期間則不會。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。hK2 CAR-T細胞所致之IFN-γ釋放。顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度± SD (pg/ml)。不同之熱穩定化CAR-T細胞在與hK2 (+)細胞共培養時會生產不同量的IFN-γ。實例23 ：hK2 CAR-T 細胞之增生
在增生檢定中評估hK2 CAR-T細胞。T細胞增生是體內免疫功能之重要體外參數。為了進一步評估hK2 CAR-T細胞之功能，用CTV標示hK2 CAR-T細胞以評估T細胞增生。
hK2 CAR-T及未經轉導(UTD) T細胞係用CellTrace Violet (CTV; 5 µM)標示並與hK2(+)及hK2(-)細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並且判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR-T細胞的頻率。藉由對hK2 CAR+ T細胞進行閘控，如所示，hK2 (+)細胞而非hK2 (-)細胞會促進所有CAR建構體。分別使用經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞作為陽性及陰性對照組。未經任何刺激之單純T細胞不會增生，而經CD3/28珠刺激之T細胞顯示相等之增生模式。在與細胞共培養5天後，hK2CAR-T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。不同CAR建構體工程改造之T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR-T細胞計數。CAR-T細胞計數係基於來自三次技術重複之平均絕對細胞計數+/-SEM。
規程係執行如下。收集腫瘤細胞，用PBS洗滌兩次，然後在37℃ 培養箱中以10E6/ml再懸浮於含有100ug/ml Mitomycin C (MMC)之PBS中歷時1.5小時，從而阻斷腫瘤細胞增生。將20 µL的DMSO添加至CTV染色溶液之小瓶中。將5 µl的溶液稀釋至5 mL (1:1000) PBS（溫熱至37℃）以提供5 µM染色溶液。計數並收集2E6個T細胞，將其用PBS洗滌兩次，然後以4E6/ml (0.5 ml)再懸浮。添加相等體積(0.5 ml)的CTV染色溶液。將細胞在37℃下培養20分鐘。接著，將4 ml PRMI+20% FBS添加至細胞以吸收任何未結合之染料。將細胞培養5分鐘，然後以400 × g離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於預溫熱之RPMI+10%FBS培養基中。計數T細胞，並且將1E5細胞(100ul)接種於96孔平底盤中。
在此期間，收集經MMC處理之腫瘤細胞並在1.5小時後計數，接著以1E6/ml再懸浮。將1E5個細胞(100 µl)與T細胞共培養於96孔盤中。使用單純T細胞、及以3:1 CD3/28珠對細胞比添加之T細胞分別作為陰性及陽性對照組。
在5天的共培養之後，自各孔收集所有細胞。將細胞以400 × g離心並洗滌5分鐘兩次，接著於96-孔U底盤中用hK2 CAR、CD3、CD8及CD25、LIVE/DEAD（近紅外）染色。在洗滌之後，使用100 µl BD Cytofix™固定緩衝液（50ul FACS緩衝液+50 µl固定緩衝液），將所有細胞固定10分鐘。在培養期結束之後，藉由多色流動式細胞測量術分析經染色之樣本。
數據分析係執行如下。製備CTV直方圖。設定CTV未稀釋閘以涵蓋單獨培養T細胞之遠右方峰（CTV亮），並且設定CTV稀釋閘以捕集其餘群體。此會套用至所有樣本。實例24 ：用本文中所述之各種建構體所轉導的CAR-T 細胞之表徵。
所產生之CAR-T細胞係在JNL報導子檢定中針對抗原依賴性活性進行評估。簡言之，將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用包含SEQ ID NO: 153至160、161至168、195至204、320至325、326至331、及336至339中之一或多個核酸序列的任何建構體轉導。
替代地，建構體可包含編號下列者之核酸序列： 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。
各CAR之表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定。
hK2 CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。為此，將用測試CAR建構體轉導之JNL細胞或未經轉導之JNL細胞(UTD)與目標腫瘤細胞系共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將建構體其視為具有活性。CAR-T 細胞以抗原依賴性方式介導腫瘤細胞殺滅
以1:1或0.5:1之效應細胞對目標細胞(ET)比（此係基於CAR表現數據計算），將用CAR17、CAR18、CAR19、及CAR20轉導之CAR-T細胞與hK2陽性細胞及hK2陰性細胞共培養96小時。目標細胞會穩定表現紅色核染料，此係藉由IncuCyte成像系統以即時方式來測量。腫瘤細胞生長抑制(TGI) (%) =（初始存活目標細胞數目-目前存活目標細胞數目）/初始存活目標細胞數目*100(%)所測試之CAR-T細胞可達到大約100% TGI，而未經轉導對照組可能未展現任可TGI。對於所測試之CAR-T細胞在hK2陰性細胞中未能觀察到TGI。CAR-T 細胞在抗原刺激時會生產細胞介素
由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ對於發揮腫瘤免疫監控而言非常重要，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。為了判定經hK2 CAR修飾之人類T細胞是否能夠辨識hK2陽性腫瘤細胞並由其活化，將用所指示CAR殖株轉導之初級T細胞及對照未經轉導之T細胞(UTD)與目標細胞系共培養，並收集上清液以進行IFN-γ濃度測量。用hK2 CAR細胞轉導之CAR-T細胞在與重組地表現hK2細胞之LNCaP細胞共培養期間會分泌IFN-γ，且在與表現極低hK2之細胞共培養期間亦會，但與hK2陰性細胞共培養期間則不會。CAR-T 細胞係以抗原依賴性方式活化並上調去顆粒標記
腫瘤細胞可由細胞毒性淋巴球（諸如CD8+ T淋巴球）及自然殺手(NK)細胞所辨識及殺滅，主要透過免疫分泌殺滅目標細胞之溶解性顆粒(lytic granule)。此過程涉及顆粒薄膜與免疫效應細胞之細胞質體薄膜的融合，導致胞溶體相關聯蛋白質之表面暴露，該等蛋白質一般存在於溶解性顆粒周圍之雙層脂質上，諸如CD107a。因此，CD107a之薄膜表現會構成免疫細胞活化及細胞毒性去顆粒之標記。
去顆粒檢定係如下所述執行。將目標細胞(5 × 104 )與相同數目之效應細胞在96孔盤中以每孔0.1 ml進行共培養。對照孔含有單純T細胞。除了1 µl/樣本的莫能菌素(BD Biosciences)外再添加抗CD107a（每孔5 µl），然後在37℃下培養4小時。將細胞用PBS洗滌兩次，針對hK2 CAR、CD3、及CD8表現對細胞進行染色，然後在流動式細胞儀BD Fortessa上進行分析。hK2 CAR-T 細胞以抗原依賴性方式增生
使用如實例23中所述之T細胞增生檢定規程來評估CAR T細胞之增生。hK2 CAR-T細胞及未經轉導(UTD) T細胞係用CellTrace Violet (CTV; 5 µM)標示並與hK2陽性及hK2陰性細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並且判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR-T細胞的頻率。增生T細胞及表現CD25之T細胞的百分比係基於來自重複之平均絕對細胞計數+/-SEM。
本文所述的所有專利、已公開申請案和參考文獻的教示該等文獻全文以引用的方式併入本文中。
儘管已具體顯示並描述例示實施例，但所屬技術領域中具有通常知識者將理解可於其中進行形式及細節之各種改變而不脫離由隨附申請專利範圍所涵蓋的本實施例範疇。 序列表SEQ ID NO: 1 - VL 1 (LCD6) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 2 - VL 2 （ LC 人源化） DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 3 - VL 3 (LCB7) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 4 - VH 1 (HCG5) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 5 - VH 2 （ HC 人源化） QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 6 - VH 3 (HCF3) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 7 - 連接子序列 GGSEGKSSGSGSESKSTGGSSEQ ID NO: 8 - scFV 1 (HL_HCG5_LCD6_20AA) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 9 - scFV 2 （ HL_HCG5_LC 人源化 _20AA ） QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 10 - scFV 3 (HL_HCF3_LCB7_20AA) QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO: 11 - scFV 4 (HL_HCG5_LCB7_20AA) 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ID NO: 337 -mu11B6 LC DNA GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCGACTGTGTCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTSEQ ID NO: 338 -hu11B6 HC DNA 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ID NO: 339 -hu11B6 LC DNA GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTSEQ ID NO: 340 -scFv 17 (KL2B413 HL) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKSEQ ID NO: 341 -scFv 18 (KL2B413 LH) EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSSEQ ID NO: 342 -scFv 19 (KL2B359 HL) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKSEQ ID NO: 343 -scFv 20 (KL2B359 LH) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 344 VH 共有序列 QVQLQESGPGLVKPSX1 TLSLTCX2 VSGNSITSDYAWN WIRQX3 PGKGLEWX4 GYISYSGSTT YNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTX5 X6 DTAVYYCATGYYYGSGF WGQGTLVTVSS X1係D或Q；X2係A或T；X3係P或F；X4係I或M；X5係A或P；或X6係V或A。將HCDR殘基加底線。SEQ ID NO: 345 VL 共有序列 X1 IVLTQSPX2 x3 LX4 X5 SX6 GERATX6 X8 CX9 ASESVEYFGTSLMH WYQQKPGQPPX10 LLIYAASNX11 ES GX12 PX13 RFSGSGSGTDFTLTIX14 SLQX15 EDX16 AVYX17 CQQTRKVPYT FG X18 GTKX19EIK X1係D或E；X2係D或A；X3係S或T；X4係A或S；X5係V或L；X6係L或P；X7係I或L；X8係N或S；X9係R或K；X10係K或R；X11係V或R；X12係V或I；X13係A或D；X14係Q或S；X15係P或A；X16係F或V；X17係Y或F；X18係Q或G；且X19係L或V。將LCDR殘基加底線。SEQ ID NO: 346 -表位 KVTEFSEQ ID NO: 347 -表位 HYRKWSEQ ID NO: 348 -表位 SHGWAHSEQ ID NO: 349 -表位 RHNLFEPEDTGQRVPSEQ ID NO: 350 -表位 GWGSIEPEE
前述內容由下列例示實施例之更具體描述將顯而易見，如附圖所示。
本專利申請文件含有至少一個以彩色製成之圖式。具有彩圖之本專利申請文件的副本將由專利局依要求並支付必要的費用後提供。 〔圖 1A 〕至〔圖 1C 〕顯示hK2 CAR在人類T細胞上之建構及表現。圖 1A 顯示hK2 CAR建構體之示意圖；TM：跨膜。圖 1B 及圖 1C 顯示T細胞表面上之hK2 CAR表現。將初級人類T細胞在沒有mRNA之情況下（模擬物，MOCK）、或在有表現hK2 scFv CAR或不相關對照CAR之10 µg mRNA之情況下進行電穿孔。電穿孔後24小時，在用2 µg/ml生物素化L-蛋白及鏈黴親和素接合PE（圖 1B ）、或生物素化hK2 (1 µg/ml)及鏈黴親和素接合PE（圖 1C ）染色後，藉由流動式細胞測量術測量CAR表面表現。 〔圖 2 〕顯示在20小時基於流動式之檢定中在指定之效應細胞對目標細胞(E/T)比下，CAR-T細胞對於表現hK2之腫瘤細胞的細胞毒性。暫時轉染後24小時，將目標細胞（Vcap及DU145）用Cell Trace Violet (CTV)螢光染料標示，然後與hK2 CAR-T細胞共培養。模擬物T細胞作為陰性效應細胞對照組。殺滅百分比係共培養物中剩餘之活（活力染料呈陰性）目標（CTV呈陽性）細胞的絕對數目相對於沒有與CAR-T細胞培養之活目標細胞的數目之比率。 〔圖 3A 〕至〔圖 3B 〕顯示即時hK2特異性CAR-T細胞介導之細胞毒性。在不同E:T比下與模擬物、10 µg mRNA電穿孔（轉染後24小時）hK2 11B6 CAR LH、或對照CAR-T細胞培養大約72小時後，目標細胞（圖 3A ）VCap (5E4)及（圖 3B ）DU145 (5E3)之標準化細胞指數(CI)圖。在單獨接種時，目標細胞會貼附在盤上並增生，從而增加CI讀數。當將T細胞添加至目標細胞時，hK2 CAR-T細胞及對照CAR-T細胞會造成hK2 (+) VCap細胞溶解及隨後之CI漸進式減少（在5:1至0.156:1之E/T比下）。添加效應細胞後之CI值減少反映出目標細胞之活力損失。亦執行使用hK2(-) DU145目標細胞之平行實驗，如（圖 3B ）所示；在此實驗中所測試之E:T比下，hK2及對照CAR T細胞在添加後不會減少CI，顯示無細胞溶解活性。Y軸係由RTCA軟體所產生之標準化CI並即時顯示。X軸係以小時計之細胞培養及處理時間。繪製CI之平均值±標準偏差。 〔圖 4 〕顯示經抗原刺激CAR-T細胞之Th1細胞介素干擾素-γ (IFN-γ)生產。上清液係收集自大約70小時共培養(VCap#5E4, DU145#5E3)之基於xCELLigence的殺滅檢定（請參見圖 3A 至圖 3B ）。hK2 CAR LH T細胞及對照CAR修飾T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養期間會分泌IFN-γ，但在與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度±標準偏差(pg/ml)。 〔圖 5A 〕至〔圖 5B 〕顯示在JNL報導子檢定中針對抗原依賴性活性(antigen-dependent activity)評估11B6熱穩定化scFv CAR殖株。圖 5A 顯示將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用各種hK2 CAR建構體轉導。表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定。圖 5B 顯示CAR建構體與其同源(cognate)細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。將含有所指示CAR殖株之JNL細胞及未經轉導之JNL細胞(UTD)與目標細胞系（VCap或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將殖株視為具有活性。 〔圖 6 〕顯示T細胞表面上之hK2 CAR表現。將初級人類T細胞用11B6熱穩定化且基於親本scFv之CAR慢病毒（感染倍數(multiplicity of infection, MOI)：3）轉導，並在轉導後14天藉由生物素化hK2 (1 µg/ml)接著鏈黴親和素接合PE來判定CAR表現。 〔圖 7A 〕至〔圖 7B 〕顯示在即時IncuCyte殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性評估11B6熱穩定化scFv CAR-T細胞。將熱穩定化hK2 CAR-T細胞及親本11B6 CAR-T與VCaP細胞（圖 7A ）及PC3細胞（圖 7B ）共培養88小時。效應細胞對目標細胞(E/T)比係基於CAR表現數據（參見圖 6 ）計算。穩定表現紅色核染料之目標細胞係藉由IncuCyte成像系統以即時方式測量。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。 〔圖 7C 〕顯示在評估抗原依賴性細胞毒性之即時IncuCyte殺滅檢定中，在1:1或0.5:1之效應細胞：目標細胞比下，由經CAR1-10或親本11B6_HL或11B6_LH轉導之T細胞所致之hK2陽性VCaP細胞的腫瘤細胞生長抑制百分比。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。 〔圖 7D 〕顯示在評估抗原依賴性細胞毒性之即時IncuCyte殺滅檢定中，在1:1之效應細胞：目標細胞比下，由經CAR1-10或親本11B6_HL或11B6_LH轉導之T細胞所致之PC3細胞的腫瘤細胞生長抑制百分比。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。 〔圖 7E 〕顯示在評估抗原依賴性細胞毒性之即時IncuCyte殺滅檢定中，由經CAR17（圖中之B413HL）、CAR18（圖中之B413LH）、CAR19（圖中之B359HL）、及CAR20（圖中之B359LH）轉導之CAR-T細胞所致之hK2陽性VCaP細胞的腫瘤細胞生長抑制百分比。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。 〔圖 7F 〕顯示在評估抗原依賴性細胞毒性之即時IncuCyte殺滅檢定中，由經CAR17（圖中之B413HL）、CAR18（圖中之B413LH）、CAR19（圖中之B359HL）、及CAR20（圖中之B359LH）轉導之CAR-T細胞所致之hK2陰性DU145細胞的腫瘤細胞生長抑制百分比。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%)。 〔圖 8 〕顯示hK2 lenti-CAR-T細胞所致之細胞介素釋放。使用13-plex Milliplex人類高敏感性T細胞套組(HSTCMAG28SPMX13)，分析自hK2 CAR-T細胞與VCap細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物收集的上清液。hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養的期間分泌細胞介素，但未經轉導之T細胞(UTD)則僅分泌極少量。顯示來自二重複培養物之平均細胞介素濃度±標準偏差(pg/ml)。 〔圖 9 〕顯示hK2 lenti-CAR-T細胞所致之IFN-γ釋放。自hK2 CAR-T細胞與VCap、DU145（5E4細胞）細胞（以1:1的E/T比）之整夜（大約20小時）共培養物收集的上清液。hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之VCap細胞共培養期間會分泌IFN-γ，但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度±標準偏差(pg/ml)。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。 〔圖 10A 〕至〔圖 10E 〕顯示來自hK2 CAR-T細胞增生檢定之結果。（圖 10A 、圖 10C ）將hK2 CAR及未經轉導(UTD)之T細胞用CellTrace Violet (CTV; 5 µM)標示，並與hK2 (+) VCap及hK2 (-) DU145細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR+T細胞的頻率。（圖 10B 、圖 10D ）經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。圖 10E 中之數據顯示在與VCap細胞共培養5天後，hK2 CAR+ T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。經不同CAR建構體工程改造之T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR+ T細胞計數。CAR+ T細胞計數基於來自三次技術重複之平均絕對細胞計數+/- SEM。 〔圖 11A 〕至〔圖 11B 〕顯示使用生物素標示之hK2蛋白來判定初級T細胞上之hK2 CAR表現水平的檢定結果。圖 11A 係hK2 CAR建構體之示意圖；TM：跨膜。在圖 11B 中，將初級人類T細胞用新穎的基於hK2 scFv之KL2B413 HL&LH及再人源化(rehumanized)之11B6 KL2B359 HL&LH CARS慢病毒(MOI 3)轉導，並在轉導後14天藉由生物素化hK2 (1ug/ml)接著鏈黴親和素接合PE來判定CAR表現。圖 11B 提供hK2 CAR + T細胞之百分比（陽性%）的彙總，此係藉由所分析之新穎KL2B413 HL&LH及再人源化之11B6 KL2B359 HL&LH CARS檢測。如所示，不同之殖株具有不同之CAR表現水平，範圍在45.1%至59.9%。將所有CAR T細胞標準化至相等CAR+ T細胞以進行後續功能性檢定。 〔圖 12A 〕至〔圖 12B 〕顯示新穎hK2 KL2B413及再人源化之11B6 CAR殖株在JNL報導子檢定中針對抗原依賴性活性之評估結果。在圖 12A 中，將含有由信號傳導反應性NFAT啟動子驅動之螢光素酶基因的Jurkat細胞（稱為JNL細胞）用各種hK2 CAR建構體轉導。表現係藉由生物素化hK2接著鏈黴親和素接合PE來判定。針對所選殖株確認經轉導JNL細胞中之CAR表現，其中在再人源化之11B6 KL2B359 CAR上有46至50%的細胞表現而在KL2B413 CAR上有73.7至96%的細胞。圖 12B 中所示之數據指示hK2 CAR建構體與其同源細胞抗原（目標細胞上之hK2）之間的結合會導致JNL細胞中之螢光素酶表現。將含有所指示CAR殖株之JNL細胞及JNL細胞(UTD)與目標細胞系（VCap、LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，且螢光素酶活性係以發光強度測量。在抗原表現細胞存在下，當發光強度超過UTD細胞水平之1.5倍時，便將殖株視為具有活性。針對新穎KL2B413及再人源化之11B6 HL&LH CAR未發現抗原依賴性活化。 〔圖 13A 〕至〔圖 13B 〕顯示HK2 CAR-T細胞在即時IncuCyte殺滅檢定中針對抗原依賴性細胞毒性之評估結果。將HK2 CAR-T細胞與HK2+ VCaP細胞（圖 13A ）及HK2- DU145細胞（圖 13B ）共培養96小時。效應細胞對目標細胞(ET)比係基於CAR表現數據（圖 11B ）計算。穩定表現紅色核染料之目標細胞係藉由IncuCyte成像系統以即時方式測量。腫瘤細胞生長抑制(%) =（初始活目標細胞數目-目前活目標細胞數目）/初始活細胞數目*100 (%) 〔圖 14 〕繪示顯示經抗原刺激CAR-T細胞之Th1細胞介素IFN-γ生產的數據。由細胞毒性T細胞產生之IFN-γ對於發揮腫瘤免疫監控(immune surveillance)而言非常重要，此可直接抑制增生並在體內及體外誘發一些惡性病變之凋亡。為了判定經hK2 CAR修飾之人類T細胞是否能夠辨識hK2 (+)腫瘤細胞並由其活化，將含有所指示CAR殖株之初級T細胞及對照未經轉導之T細胞(UTD)與目標細胞系（LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1、或DU145細胞）共培養，並收集上清液以進行IFN-g濃度測量。如所示，經hK2 CAR修飾之T細胞在與表現hK2之LNCap/hK2細胞共培養期間會分泌IFN-γ，甚至與表現極低Hk2之C4-2B及LNCap細胞共培養期間也會，但與hK2陰性DU145細胞共培養期間則不會。未揭示之對照CAR由於遠比hK2高之抗原表現水平而會分泌更為高量的IFN-γ。顯示來自二重複培養物之平均IFN-γ濃度± SD (pg/ml)。 〔圖 15 〕顯示CD107a去顆粒(degranulation)檢定評估hK2 CAR T細胞之抗腫瘤活性的結果。將目標細胞(5 × 104 )與相同數目之效應細胞在96孔盤中以每孔0.1 ml共培養。對照孔含有單純T細胞。除了1 µl/樣本的莫能菌素(monensin, BD Biosciences)外再添加抗CD107a（每孔5 µl），然後在37℃下培養4小時。將細胞用PBS洗滌兩次，針對hK2 CAR、CD3、及CD8表現對細胞進行染色，然後在流動式細胞儀BD Fortessa上進行分析。如所示，Vcap細胞上存在hK2抗原導致CD107A+ hK2 CAR(+) T細胞增加，但hK2 CAR(-)及UTD T細胞則不會增加（以流動式細胞測量術測量），而在單純CAR T細胞（未經腫瘤細胞刺激）中僅見到背景染色(＜2%)。佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)結合離子黴素（ionomycin，eBioscience™細胞刺激混合物；500X）在此4小時細胞培養模型中是CD107a細胞表面表現之一致誘發劑，其用作為陽性對照組。結果係針對代表性捐贈者T細胞顯示，且可在多位捐贈者中再現。 〔圖 16A 〕至〔圖 16D 〕顯示hK2 CAR T細胞增生檢定的結果。hK2 CAR及未經轉導(UTD)之T細胞係用CellTrace Violet (CTV; 5uM)標示，並與HK2 (+) VCap及HK2 (-) DU145細胞共培養。共培養後五天，採集細胞並用CD3、CD25、近紅外LIVE/DEAD染料、及hK2 CAR染色。流動式細胞測量分析係在具有Flowjo軟體之Fortessa流動式細胞儀上執行。以活CD3識別淋巴球，並判定具有CTV染料稀釋及活化標記CD25之CAR+T細胞的頻率。藉由對CD3+ T細胞進行閘控，如圖 16A 至圖 16B 中所示，hK2(+) Vcap細胞而非hK2(-) DU145細胞會促進所有經CAR建構體工程改造之T細胞增生及活化標記CD25之上調，如圖 16C 至圖 16D 中所示。經CD3/28珠刺激之T細胞及單純T細胞分別用作為陽性及陰性對照組。未經任何刺激之單純T細胞不會增生，而經CD3/28珠刺激之T細胞則顯示相等之增生模式。如所示，在與VCap細胞共培養5天後，hK2 CAR+ T細胞之增生比CD3/28珠陽性對照組更穩健。經不同CAR建構體工程改造之T細胞具有不同的增生活性且顯示不同的CAR+ T細胞計數。基於來自重複之平均絕對細胞計數+/- SEM的增生T細胞及表現CD25之T細胞的百分比之彙總係顯示於圖 16B 及圖 16D 中。 〔圖 17A 〕顯示mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3、及HCG5之VH域的序列比對。圖17A以出現順序分別揭示SEQ ID NO 317、5、140、141、77、140、6、4、及345。圖 17B 顯示定位至hK2抗原之序列上的受保護區段，以視覺化透過HDX-MS識別之hK2抗體的結合表位。圖17B以出現順序分別揭示SEQ ID NO 351、351、351、351、351、及351。
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Claims (42)

  1. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a)特異性結合至人類血管舒緩素2 (human Kallikrein-2, hK2)抗原之胞外域、 (b)跨膜域、及 (c)視情況包含至少一個共刺激域之胞內信號傳導域。
  2. 如請求項1所述之CAR，其進一步包含 (d) CD8a鉸鏈區， 其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽；且 其中該胞內信號傳導域包含含有TNF受體超家族成員9 (CD137)組分之共刺激域及含有T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分之初級信號傳導域。
  3. 如請求項2所述之CAR，其中 該CD8a鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272至少90%同一的胺基酸序列； 該跨膜域包含與SEQ ID NO: 26至少90%同一的胺基酸序列；且/或 該胞內信號傳導域包含具有與SEQ ID NO: 27至少90%同一的胺基酸序列之共刺激域、及具有與SEQ ID NO: 28至少90%同一的胺基酸序列之初級信號傳導域。
  4. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3；具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 309之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3， 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
  5. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3， 其中該胞外抗原結合域結合該hK2抗原。
  6. 如請求項4所述之CAR，其中該胞外抗原結合域進一步包含： 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  7. 如請求項6所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含： 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 314之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 315之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 311之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 312之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 313之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的輕鏈CDR3； 具有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 具有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  8. 如請求項6所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含：具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的重鏈CDR3、及具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的輕鏈CDR2、具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  9. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合域、跨膜域、及胞內信號傳導域，其中該胞外抗原結合域包含： 包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、74、75、147、148、149、150、151、152、及318之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；及/或 包含選自SEQ ID NO: 4、5、6、76、77、140、141、142、143、144、145、146、及317之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)； 其中該胞外抗原結合域結合該人類血管舒緩素2 (hK2)抗原。
  10. 如請求項9所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含： 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的重鏈可變區； 包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列的重鏈可變區。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)。
  12. 如請求項11所述之CAR，其中該scFv包含在該輕鏈可變區(VL)與該重鏈可變區(VH)之間的連接子多肽。
  13. 如請求項12所述之CAR，其中該連接子多肽包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
  14. 如請求項11至13中任一項所述之CAR，其中該scFv包含選自由SEQ ID NO: 8至23、169至184、及340至343所組成之群組的胺基酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之CAR，其中該胞外抗原結合域包含信號多肽。
  16. 如請求項15所述之CAR，其中該信號多肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
  17. 如請求項4至16中任一項所述之CAR，其中該胞內信號傳導域包含選自由下列所組成之群組的多肽組分：TNF受體超家族成員9 (CD137)組分、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(CD3z)組分、分化簇(CD27)組分、分化簇超家族成員組分、及其組合。
  18. 如請求項17所述之CAR，其中該CD137組分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。
  19. 如請求項17或請求項18所述之CAR，其中該CD3z組分包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
  20. 如請求項17至19中任一項所述之CAR，其中該胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，或者，視情況地，該胞內信號傳導域包含含有SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的共刺激域、及含有SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的初級信號傳導域。
  21. 如請求項4至20中任一項所述之CAR，其中該跨膜域包含CD8a跨膜區(CD8a-TM)多肽。
  22. 如請求項21所述之CAR，其中該CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。
  23. 如請求項4至22中任一項所述之CAR，其進一步包含將該跨膜域連接至該胞外抗原結合域之鉸鏈區。
  24. 如請求項23所述之CAR，其中該鉸鏈區係CD8a鉸鏈區。
  25. 如請求項24所述之CAR，其中該CD8a鉸鏈區包含SEQ ID NO: 25、269、270、271、或272之胺基酸序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之CAR，其中該胞外抗原結合域包含選自由SEQ ID NO: 29至44、78至81、221至236、及273至308所組成之群組的胺基酸序列。
  27. 如請求項1至26中任一項之CAR，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO: 46至61、82至85、及205至220所組成之群組的胺基酸序列。
  28. 一種經單離淋巴球，其表現如請求項1至27中任一項所述之CAR。
  29. 如請求項28所述之經單離淋巴球，其中該淋巴球係T淋巴球。
  30. 如請求項28所述之經單離淋巴球，其中該淋巴球係自然殺手(NK)細胞。
  31. 一種經單離核酸分子，其編碼如請求項1至27中任一項所述之CAR。
  32. 一種載體，其包含如請求項31所述之核酸分子。
  33. 一種細胞，其表現如請求項31所述之核酸分子。
  34. 一種醫藥組成物，其包含有效量的如請求項28至30中任一項所述之淋巴球。
  35. 一種醫藥組成物，其包含有效量的如請求項28至30中任一項所述之淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑。
  36. 如請求項1至27中任一項所述之CAR或如請求項34或35所述之醫藥組成物，其用於治療中。
  37. 如請求項1至27中任一項所述之CAR或如請求項34或35所述之醫藥組成物，其用於治療患有癌症之對象的方法中。
  38. 一種治療患有癌症之對象之方法，該方法包含： 向有需要之對象投予治療有效量的如請求項28至30中任一項所述之淋巴球，藉此該淋巴球在該對象中誘發癌細胞之殺滅。
  39. 如請求項38所述之方法、或如請求項37所述之用於方法中的CAR或醫藥組成物，其中該癌症係前列腺癌或表現雄性激素受體之乳癌。
  40. 一種靶向殺滅癌細胞之方法，該方法包含： 使該癌細胞接觸如請求項28至30中任一項所述之淋巴球，藉此該淋巴球誘發該癌細胞之殺滅。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該癌細胞係前列腺癌細胞或表現雄性激素受體之乳癌細胞。
  42. 一種檢測對象中癌症之存在的方法，其包含： 使獲自該對象之細胞樣本接觸如請求項1至27中任一項所述之CAR，從而形成CAR-細胞複合物；及 檢測該複合物，其中檢測到該複合物係代表該對象中存在癌症。
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