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TW202115257A - 利用即時聚合酶連鎖反應之核酸檢測方法 - Google Patents

利用即時聚合酶連鎖反應之核酸檢測方法 Download PDF

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TW202115257A
TW202115257A TW109131271A TW109131271A TW202115257A TW 202115257 A TW202115257 A TW 202115257A TW 109131271 A TW109131271 A TW 109131271A TW 109131271 A TW109131271 A TW 109131271A TW 202115257 A TW202115257 A TW 202115257A
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TW
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nucleic acid
target nucleic
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filter paper
pcr reaction
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Application number
TW109131271A
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海老沼宏幸
井上昭
內山徹
Original Assignee
日商積水醫療股份有限公司
國立研究開發法人國立成育醫療研究中心
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Abstract

本發明之目的在於提供一種藉由即時聚合酶連鎖反應，對利用核酸擴增反應來擴增濾紙中含有血液後乾燥所得之濾紙血之紙片中所含之目標核酸的產物進行光學檢測之方法及定量之方法、以及該等方法所使用之套組。 根據本發明，藉由將乾燥濾紙血沖裁片之大小或沖裁片中所含之全血量、PCR反應試劑之量設定為特定範圍內、於蓋上PCR反應管之狀態下進行PCR反應等，能夠提供不進行繁雜之預處理而利用即時聚合酶連鎖反應自乾燥濾紙血光學檢測及定量目標核酸之方法及套組。

Description

利用即時聚合酶連鎖反應之核酸檢測方法
本發明係關於一種利用即時聚合酶連鎖反應之核酸檢測方法。詳細而言，係關於一種對濾紙中含有血液後乾燥所得之濾紙血中之目標核酸進行光學檢測之方法、利用該檢測方法之核酸定量方法及核酸定量套組。
作為用以篩查及診斷疾病之檢體，濾紙中含有血液後乾燥所得之濾紙血其試樣穩定性高、無飛散之可能性，因此就保管及運輸之觀點而言有用。又，作為自通常不易採血之新生兒採集檢體之方法，可使用新生兒群體篩查。又，為了篩查及診斷疾病，PCR反應廣泛用於相關基因是否存在變異之判定或基因之定量。具體而言，篩檢中，以美國為中心正在普及「作為嚴重複合型免疫缺乏症之指標的環狀DNA之TREC（T-cell receptor excision circles）」及「作為X性聯無γ球蛋白血症之指標的環狀DNA之KREC（kappa-deleting recombination excision circles）」定量。進而，亦存在開發針對脊髓性肌萎縮症之治療劑之情況，利用作為其致病基因之SMN1（Survival Motor Neuron 1）之同型合子缺失進行篩查之需求提高。
該檢查中所使用之乾燥濾紙血含有大量阻礙PCR反應之物質（血紅蛋白等），因此一般使用自濾紙血提取核酸並純化而製成反應試樣之方法。另一方面，減少檢體中之夾雜物所產生之PCR反應阻礙物質之影響之試劑亦得到商業利用（島津製作所股份有限公司製造之Ampdirect（註冊商標））。若使用該試劑，則可直接由濾紙血切片進行PCR反應，藉由利用電泳檢測其擴增產物來確認（專利文獻1）。然而，於此種試劑中，於使用光學手段進行檢測之情形時，血中所含之血紅蛋白、或因PCR反應時之熱變性而產生之血液成分之沈澱會阻礙光學路徑，故而亦無法獲得準確之結果。因此，揭示有一種於PCR反應時對反應液規定全血試樣之添加比率之方法（專利文獻2）。然而，除了來自全血成分之影響以外，PCR反應液中存在之來自乾燥濾紙血之濾紙切片本身有時亦會阻礙光學檢測之光路，亦有無法充分減輕影響之虞。
為了解決此種問題，實施如下方法：藉由進行將濾紙血切片洗淨、浸於預處理液、或浸於預處理液並加溫等簡易預處理步驟，而去除上述反應阻礙物質、抑制反應阻礙物質於反應液內擴散，於預處理步驟結束後，添加PCR反應試劑，於放入濾紙血切片之狀態下直接進行PCR反應（非專利文獻1）。 然而，因需要多階段之操作，故污染之可能性增加，並且於新生兒篩查等中進行多檢體解析之情形時，因花費時間及功夫，故解析之成本增加，不可謂最佳之方法。 又，於進行定量之情形時，為了抵消濾紙血之影響，亦考慮設定濾紙血基質之校準品（標準品）之方法，但由於自濾紙血提取之成分之變動所產生之影響程度之偏差等，而有招致準確性及再現性變差之虞。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本特開2004-283165號公報 專利文獻2：日本專利第5144518號公報 非專利文獻
非專利文獻1：Clinical Chemistry、61:2、412-419、2015
[發明所欲解決之課題]
本發明之目的在於提供一種對藉由利用即時聚合酶連鎖反應之核酸擴增反應來擴增濾紙中含有血液後乾燥所得之濾紙血之切片中所含之目標核酸的產物進行光學檢測之方法及定量之方法、以及該等方法所使用之套組。 [解決課題之技術手段]
乾燥濾紙血係使濾紙中含有血液後乾燥，藉由開孔沖裁工具形成沖孔形狀之紙片（本說明書中，有時簡稱為沖裁片）並取出。本發明人等對此種沖裁片之大小或沖裁片中所含之全血量、PCR反應試劑之量、PCR反應時於PCR反應管上安裝蓋子一事等進行了各種研究，結果發現能夠不進行如以往繁雜之預處理而藉由即時聚合酶連鎖反應自乾燥濾紙血對目標核酸直接進行光學檢測及定量，從而完成了本發明。 即，本發明具有以下構成。 ＜1＞一種利用即時聚合酶連鎖反應檢測乾燥濾紙血中所含之目標核酸之方法，上述檢測方法包括下述步驟（A）～（D）。 （A）向PCR反應用管中添加乾燥濾紙血之步驟，其中，濾紙為直徑1.2 mm～2.0 mm之圓形之沖裁片或相對於總反應溶液量包含0.95 v/v%～6.6 v/v%全血之沖裁片； （B）向PCR反應用管中添加20～50 μL之PCR試劑之步驟； （C）於藉由蓋將添加有PCR試劑與乾燥濾紙血之管加以密閉之狀態下，進行PCR反應之步驟； （D）經時性地對藉由PCR反應而擴增之目標核酸進行光學檢測之步驟 ＜2＞如＜1＞記載之檢測目標核酸之方法，其中，於（A）步驟之後，進行（B）步驟。 ＜3＞如＜1＞或＜2＞記載之檢測目標核酸之方法，其中，PCR反應用管為PCR反應用96孔管或8聯管。 ＜4＞如＜1＞至＜3＞中任一項記載之檢測目標核酸之方法，其中，PCR試劑至少包含引子、聚合酶、dNTP、及嵌入劑或螢光標記探針。 ＜5＞如＜4＞記載之檢測目標核酸之方法，其藉由檢測因對上述嵌入劑照射激發光而產生之螢光，而檢測上述經擴增之目標核酸。 ＜6＞如＜4＞記載之檢測目標核酸之方法，其中，上述螢光標記探針具有螢光物質與淬滅劑，且含有與核酸擴增反應之模板互補之部分序列，藉由檢測因對上述螢光物質照射激發光而產生之螢光，而檢測上述經擴增之目標核酸。 ＜7＞如＜1＞至＜6＞中任一項記載之檢測目標核酸之方法，其中，目標核酸係選自由TREC、KREC及SMN1所組成之群中之1種以上之基因片段及/或基因。 ＜8＞一種定量目標核酸之方法，其係於藉由＜1＞至＜7＞中任一項記載之利用即時聚合酶連鎖反應檢測目標核酸之方法而定量目標核酸之方法中，使用以下標準品； （1）含有包含目標核酸之序列之人工核酸，且非包含於乾燥濾紙血之標準品，該標準品直接溶解於反應容器中使用。 ＜9＞一種定量套組，其用於藉由＜1＞至＜7＞中任一項記載之利用即時聚合酶連鎖反應檢測目標核酸之方法而定量目標核酸之方法，上述定量套組至少包含以下標準品； （1）含有包含目標核酸之序列之人工核酸，且非包含於乾燥濾紙血之標準品，該標準品直接溶解於反應容器中使用。 [發明之效果]
根據本發明，能夠直接藉由即時聚合酶連鎖反應特異性地、且迅速地對乾燥濾紙血中所含之少量之目標核酸進行檢測及定量。例如，如TREC、KREC或SMN1、SMN2般，針對新生兒之篩檢中，以沖裁片之形式自乾燥濾紙血中取出一部分作為檢體，因此會節約寶貴之檢體。進而，由於亦不需要預處理步驟，因此能夠提高篩檢之解析效率及削減成本。
（PCR反應用管） 本發明中所使用之管為PCR反應用管，只要為可供濾紙血之沖裁片順利地插入，可藉由蓋密閉之構造即可。又，管上部之開口部為圓形（例如內徑2.5 mm～10 mm左右）且底部為較上部之開口部窄之形狀為佳，較佳為倒圓錐形等。 上述管之容量只要為「添加PCR反應試劑後即便因PCR反應導致溫度變化，亦能夠充分地收容反應溶液」之容量即可，較佳為0.1 mL～0.3 mL容量，進而較佳為0.15 mL～0.25 mL容量，最佳為0.2 mL容量。 本發明中所使用之PCR反應用管較佳為96個管連續之PCR反應用96孔管或8個管連續之8聯管，作為市售品，可使用以96孔PCR板、PCR 8聯管等名稱販賣者。作為市售品，可列舉：LightCycler480 Multiwell Plate 96（Roche公司）、96-Well PCR Plate, Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux（Scientific Specialties, Inc.公司）、艾本德PCR plate 96，無裙邊，150 μL，無色（艾本德公司）、PCR Plate 96well Thin Plate 0.1 ml Natural（BM Equipment Co.,Ltd.）、LightCycler（註冊商標）8-Tube Strips（Roche公司）等。 該等反應用管之材質理想為反應溶液之污染較少，且具有不會因PCR反應之溫度變化引起之內部壓力變動而形狀發生變化的剛性，例如可列舉聚丙烯製。
（蓋） 本發明中所使用之蓋只要為能夠與PCR反應管之開口部嵌合進行密閉之構造即可。又，材質與PCR反應管同樣地，理想為不會因PCR反應所產生之內部壓力變動而發生變形之材質，又，理想為透光性較高之材質，可列舉聚丙烯製。具體而言，可列舉：LightCycler（註冊商標）8-Tube Strips（Roche公司）、Optical Flat 8-Cap Strips（Bio-Rad公司）、MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips（Thermo Fisher Scientific公司）、Strips of 8 Flat Optical Caps（Nippon Genetics公司）、Cap Strip, 8 Strip, Flat（艾本德公司）等。 於本發明中，藉由於利用蓋將PCR反應管加以密閉之狀態下進行PCR反應，能夠抑制熱循環所引起之氣泡之產生。因此，可抑制反應溶液中之沖裁片之振動或沖裁片之浮升。因此，認為可抑制沖裁片中所含之干擾物質超過需要地向反應液溶出。又，由於能夠抑制因氣泡之產生所導致之沖裁片之浮升，因此，能夠不被沖裁片遮擋光路而再現性良好地實施藉由即時聚合酶連鎖反應進行之光學檢測。
（血液試樣/乾燥濾紙血） 本發明中所使用之血液試樣係使濾紙（filter paper）含有血液（全血）後乾燥所得之濾紙中之血液（全血），有時簡稱為乾燥濾紙血。關於乾燥濾紙血，藉由開孔沖裁工具取出成為沖孔形狀之紙片（沖裁片）。關於上述沖裁片之大小，由於需要使所含之血液之量處於適當之範圍，故理想為直徑1.2～2.0 mm，更理想為1.5 mm～1.8 mm。又，作為上述沖裁片中所含之全血量，相對於PCR總反應溶液量，理想為0.95 v/v%～6.6 v/v%，更理想為1.4 v/v%～5.2 v/v%。又，作為沖裁片中所含之全血量，相對於PCR總反應溶液量，理想為0.95 v/v%～6.6 v/v%，更理想為1.4 v/v%～5.2 v/v%。再者，上述全血量係表示為基於實測值（於將全血30 μL添加到切取沖裁片前之濾紙並使之乾燥時形成之圓形血液部分之直徑為9.5 mm）算出將直徑1.2～2.0 mm之圓形之沖裁片、直徑1.5 mm～1.8 mm之沖裁片添加到20～50 μL之PCR反應溶液中溶解血液之情形時之比率所得的值。 作為本發明中所使用之乾燥濾紙血，例如可使用新生兒群體篩查等自新生兒之腳後跟採血之濾紙血、同時作為可選篩查（optional screening）而採血之濾紙血等，但並不限定於該等。
（PCR試劑） 本發明中所使用之PCR試劑至少包含引子組、聚合酶、各種dNTP（去氧核苷三磷酸）、嵌入劑或螢光標記探針。又，典型而言，於該試劑中亦包含緩衝液。作為緩衝液，只要為具有抑制存在於生物體液中之正電荷物質（某種蛋白質等）或負電荷物質（某種糖、色素等）等阻礙DNA擴增反應之物質之作用之功能的緩衝液即可，並無特別限定。作為市售者，例如可列舉Ampdirect、Ampdirect plus（均為（股）島津製作所製造）等。 本發明中所使用之PCR試劑向反應用管中之添加量為20～50 μL。
（即時聚合酶連鎖反應） 即時聚合酶連鎖反應法一般意指於PCR中經時性地監測擴增產物之生成過程之方法。於本發明中，藉由即時聚合酶連鎖反應進行檢測意指藉由光學手段對PCR反應後擴增之目標核酸（以下，亦簡稱為擴增產物）進行檢測。再者，擴增產物之檢測例如可於PCR反應結束時或結束後進行，亦可與PCR反應步驟同時進行。於同時進行之情形時，擴增產物之檢測例如可經時性地進行。經時性檢測（監測）例如可連續，亦可非連續（間斷）。
PCR反應中之各步驟之溫度變化只要例如使用溫控循環機等自動控制即可。本發明藉由於PCR反應中利用蓋將管加以密閉後開始PCR反應，能夠抑制上述溫度變化引起之氣泡之產生，能夠不使沖裁片浮升，抑制振動。因此，能夠抑制自沖裁片提取多餘之干擾物質，能夠不進行繁雜之預處理而對沖裁片中所含之目標核酸進行光學檢測及定量。又，於即時聚合酶連鎖反應這一持續之PCR反應之監測中，由於在中途無法藉由離心分離等將沖裁片強制地收納於底部，因此沖裁片之浮升對光學檢測而言是致命的。根據本發明，能夠防止沖裁片之浮升，故於即時聚合酶連鎖反應中，能夠不被沖裁片遮擋光路地進行連續之光學檢測。
藉由PCR反應而生成之擴增產物例如可藉由檢測自上述擴增產物產生之螢光強度而進行檢測。作為螢光檢測，並無特別限制，有先前公知之嵌入劑法、TaqMan（註冊商標）探針法、雜交法、環狀探針法等。
螢光強度之檢測例如可利用螢光光度計進行。又，一般使用具備PCR反應單元（例如溫控循環機）與光學系統單元（例如螢光光度計）之兩者之裝置。作為具體例，可列舉市售之SmartCycler（商品名，Takara Bio公司製造）、Light Cycler（商品名，Roche Diagnostics公司製造）、ABI PRISM7000（商品名，Applied Biosystems公司製造）等。
（目標核酸之定量方法） 本發明之目標核酸之定量方法係生成與乾燥濾紙血中之目標核酸互補之擴增產物，藉由光學手段檢測上述擴增產物，對上述擴增產物進行定量之方法。可為下述方法，即藉由對上述擴增產物成為特定量之PCR循環數進行計數，而對上述乾燥濾紙血中所含之目標核酸進行定量。又，亦可如後述之實施例所示，根據由標準品算出之Cq值之校準曲線換算乾燥濾紙血中之全血1 μL之複製數進行定量。
本發明係一種利用即時聚合酶連鎖反應檢測乾燥濾紙血之目標核酸之方法，上述檢測方法包含下述步驟（A）～（D）。 （A）向PCR反應用管中添加乾燥濾紙血之步驟，其中，濾紙為直徑1.2 mm～2.0 mm之圓形之沖裁片或相對於總反應溶液量包含0.95 v/v%～6.6 v/v%全血之沖裁片； （B）向PCR反應用管中添加20～50 μL之PCR試劑之步驟； （C）於藉由蓋將添加有PCR試劑與濾紙之管加以密閉之狀態下，進行PCR反應之步驟； （D）經時性地對藉由PCR反應而擴增之目標核酸進行光學檢測之步驟 此處，（A）步驟與（B）步驟可先進行任一個，又可同時進行，但理想為於（A）步驟之後，進行（B）步驟。其原因在於，藉由先進行（A），即便於濾紙附著於管壁面等之情形時，亦可藉由試劑溶液將濾紙更確實地收容至管底部。又，於PCR反應開始前，為了將沖裁片確實地收納於管之底部，亦理想為進行離心分離等。 如此，本發明之特徵在於，不進行自乾燥濾紙血分離、純化等預處理，而將濾紙血直接供至即時聚合酶連鎖反應。此種不進行預處理之試樣中通常包含阻礙DNA擴增反應之物質。阻礙DNA擴增反應之物質係指血中所含之血紅蛋白、或因PCR反應時之熱變性所產生之血液成分之沈澱物等。 綜上所述，預想到若欲不進行預處理而進行PCR反應，則會受到干擾物質之影響。但根據本發明，藉由如上所述將沖裁片之大小、或沖裁片中所含之全血量、PCR反應試劑量設定為特定範圍內，將沖裁片收納於管之底部，進而利用蓋將管加以密閉後進行PCR反應，能夠抑制溫度變化所引起之氣泡之產生，能夠不使紙片浮升，抑制振動。因此，能夠抑制自沖裁片提取多餘之干擾物質，能夠不進行繁雜之預處理而直接藉由即時聚合酶連鎖反應對沖裁片中所含之目標核酸進行光學檢測及定量。
（目標核酸） 藉由本發明之即時聚合酶連鎖反應所檢測之目標核酸並無特別限制，除了來自全血之DNA、RNA，還包括藉由病毒等導入至全血之外來核酸等。 作為本發明之目標核酸，其中，例如較佳為來自新生兒之全血之核酸，可列舉TREC（T-cell receptor excision circles ）、KREC （kappa-deleting recombination excision circles）之基因片段、SMN1（Survival Motor Neuron 1）、SMN2（Survival Motor Neuron 2）等基因中所含之核酸。
（標準品/套組） 本發明之標準品（亦稱為校準品）係指於藉由上述之檢測目標核酸之方法對目標核酸進行定量之方法中所使用之標準物質。本發明之標準品之特徵在於含有包含目標核酸之序列之人工核酸，且不包含於乾燥濾紙血。 關於標準品之形態，為了抵消乾燥濾紙血之影響，亦考慮有使其含於乾燥濾紙血中用於定量之方法，但由於自乾燥濾紙血提取之成分之變動所產生之影響程度、或自乾燥濾紙血溶出之標準品之偏差等，而有導致準確性及再現性變差之虞。 對此，本案發明之標準品故意採用不包含於乾燥濾紙血之形態，例如為以溶液狀態或者冷凍乾燥品等形態存在之標準品。本發明之標準品藉由採用此種形態，能夠直接溶解於反應溶液中使用，從而能夠實現準確之定量。 本發明亦能夠提供包含此種標準品之目標核酸之定量套組。 實施例
以下，藉由實施例對本發明進行詳細說明，但本發明不限定於以下實施例。 本實施例係自乾燥濾紙血取出沖裁片，直接實施PCR反應，藉由即時聚合酶連鎖反應對擴增產物進行光學檢測之例。
[實施例1]TREC/KREC基因定量系統 （a）試驗材料 （a-1）TREC、KREC、RNaseP擴增用引子 作為TREC、KREC、內部標準基因（RNaseP）擴增用之引子，使用將下述引子委託給Sigma-Aldrich公司合成而獲得者。 TREC用正向引子 5'-CCCTTTCAACCATGCTGACΑ-3'（序列編號1） TREC用反向引子 5'-GTGCCAGCTGCAGGGTTTAG-3'（序列編號2） KREC用正向引子 5'-CAGCTCAGCGCCCATTACG-3'（序列編號3） KREC用反向引子 5'-TGGGACTCCAGGAGCCAG-3'（序列編號4） RNaseP用正向引子 5'-GCGGAGGGAAGCTCATCΑ-3'（序列編號5） RNaseP用反向引子 5'-GTCTGACCTCGCGCGGΑ-3'（序列編號6）
（a-2）TREC、KREC、RNaseP檢測探針 作為用以確認TREC、KREC、RNaseP之PCR擴增之探針，使用將實施了螢光標記之下述檢測探針委託給Primetech公司合成而製成者。
TREC用檢測探針 5'-(Quasar670)-CCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-(BHQ3)-3'（鹼基序列部分為序列編號7） KREC用檢測探針 5'-(ROX)-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-(BHQ2)-3'（鹼基序列部分為序列編號8） RNaseP用檢測探針 5'-(FAM)-CCACGAGCTGAGTGCGTCCTG-(BHQ1)-3'（鹼基序列部分為序列編號9）
（a-3）質體 為了對PCR擴增產物進行定量，將把如下所示之TREC、KREC、RNaseP之基因部分序列組入至載體而獲得之質體委託給Eurofins公司合成，將藉此而獲得者用作校準曲線用之標準品。
TREC部分序列（序列編號10）
Figure 02_image001
Figure 02_image003
KREC部分序列（序列編號11）
Figure 02_image005
RNaseP部分序列（序列編號12）
Figure 02_image007
（b）PCR試劑 將PCR試劑之組成示於以下。 PCR緩衝液（Ampdirect Plus，島津製作所公司） 0.25 μM（最終濃度）TREC用正向引子 0.25 μM（最終濃度）TREC用反向引子 0.125 μM（最終濃度）KREC用正向引子 0.125 μM（最終濃度）KREC用反向引子 0.125 μM（最終濃度）RNaseP用正向引子 0.125 μM（最終濃度）RNaseP用反向引子 0.135 μM（最終濃度）TREC用檢測探針 0.135 μM（最終濃度）KREC用檢測探針 0.135 μM（最終濃度）RNaseP用檢測探針 0.03 U/μL BIOTAQ HSDNA聚合酶
（c）含有校準曲線用標準品之PCR試劑 向上述PCR試劑添加各質體，製備含有以下標準品（稀釋系列：STD1～4）之PCR試劑。括號內表示各個基因之每個PCR反應之複製數。本試劑不含於乾燥濾紙血，而是以溶液狀態使用。 STD1（TREC 10,000 copy/反應、KREC 10,000 copy/反應、RNaseP 100,000 copy/反應） STD2（TREC 1,000 copy/反應、KREC 1,000 copy/反應、RNaseP 10,000 copy/反應） STD3（TREC 100 copy/反應、KREC 100 copy/反應、RNaseP 1,000 copy/反應） STD4（TREC 10 copy/反應、KREC 10 copy/反應、RNaseP 100 copy/反應）
（d）對照乾燥濾紙血 向豬全血中以分別成為12.5 copy/μL之方式添加TREC質體及KREC質體，進而以成為13.5 ng/μL之方式添加自K562細胞株（來自慢性骨髓性白血病細胞；由國立研究開發法人醫藥基盤．健康．營養研究所細胞庫出讓）提取之基因組DNA，其後使40 μL滲入採血用濾紙（Advantech公司）中，直接乾燥。
（e）PCR反應之條件 （i）95℃：15分鐘 （ii）95℃：15秒、63℃：80秒（45個循環） （iii）37℃：5分鐘
（f）即時聚合酶連鎖反應測定 （f-1）測定方法 按照以下程序測定。 （i）使用打孔機自對照乾燥濾紙血採集直徑1.2 mm、1.5 mm、1.8 mm、2.0 mm、3.0 mm之圓形之沖裁片。 （ii）向PCR反應用管（Roche公司製造之LightCycler（註冊商標）8聯管，聚丙烯製）中投入上述沖裁片。 （iii）向該管中分別添加20 μL、30 μL、40 μL、50 μL之PCR試劑後，加蓋（與上述管成套者）進行密閉。 （iv）準備含有校準曲線用標準品之PCR試劑亦與添加量相應地分注到管中所得者。 （v）使用溫控循環機裝置（LightCycler96，Roche公司），進行TREC、KREC及RNaseP之3項同時即時聚合酶連鎖反應測定。 （vi）對各組合分別測定4次，根據由標準品算出之Cq值之校準曲線，換算為沖裁片中之全血每1 μL之複製數，算出4次之複製數之平均值。又，將平均值除以設定值所得之值設為回收率。
（f-2）測定結果 將結果示於表1～3中。關於沖裁片之尺寸差異，於直徑為1.5 mm～2.0 mm之情形時，擴增之再現性及回收率均良好。直徑為1.2 mm時，存在無法發生擴增之情形，但回收率良好。另一方面，於直徑為3.0 mm之情形時，由於無法描繪出擴增曲線，故存在無法測定者（表中之灰色之陰影部）。作為其主要原因，認為係由於沖裁片之尺寸大而未到達管之底部，因此紙片遮擋光路，故，光未到達反應溶液，從而影響螢光檢測。
[表1]
表1 TREC測定結果
PCR反應液量 沖裁片尺寸 TREC（copy/μLW.B.） N＝1 N＝2 N＝3 N＝4 平均 （copy/μL W.B.） 回收率 %
20 μL 1.2 mm 12.5 5.6 22.3 8.6 10.3 11.7 94
1.5 mm 12.5 16.8 23.5 115 22.0 18.4 147
1.8 mm 12.5 17.6 4.8 13.3 14.5 12.5 100
2.0 mm 12.5 22.8 14.3 10.8 16.5 16.1 129
3.0 mm 12.5                  
30 μL 1.2 mm 12.5 8.1 3.2 17.4 18.4 11.8 94
1.5 mm 12.5 26.1 20.1 10.2 20.8 19.3 154
1.8 mm 12.5 6.1 6.6 16.8 6.4 8.9 72
2.0 mm 12.5 5.5 14.3 20.0 2.4 10.6 85
3.0 mm 12.5                  
40 μL 1.2 mm 12.5    7.1 6.0 19.9 11.0 88
1.5 mm 12.5 10.2 5.6 12.0 19.8 11.9 95
1.8 mm 12.5 23.3 14.7 9.2 10.1 14.3 115
2.0 mm 12.5 10.5 91 8.4 7.1 8.8 70
3.0 mm 12.5 44.8       33.8 39.3 314
50 μL 1.2 mm 12.5 23.0 9.9 11.5 26.1 17.6 141
1.5 mm 12.5 5.6 20.2 16.5 11.8 13.5 108
1.8 mm 12.5 44.6 6.8 11.3 8.0 17.7 141
2.0 mm 12.5 6.7 20.8 19.4 11.0 14.5 116
3.0 mm 12.5 65.2 220.2 10.8    98.7 790
[表2]
表2 KREC測定結果
PCR反應液量 沖裁片尺寸 KREC （copy/μL W.B.） N＝1 N＝2 N＝3 N＝4 平均 （copy/μL W.B.） 回收率%
20 μL 1.2 mm 12.5    7.8 21.9 9.9 13.2 106
1.5 mm 12.5 6.5 20.3 9.0 20.8 14.2 113
1.8 mm 12.5 22.2 10.0 14.7 10.1 14.2 114
2.0 mm 12.5 10.0 17.2 7.6 13.0 11.9 96
3.0 mm 12.5                  
30 μL 1.2 mm 12.5 31 2.4 13.8 36.7 14.0 112
1.5 mm 12.5 9.4 5.7 11.1 8.2 8.6 69
1.8 mm 12.5 5.6 8.1 6.7 6.1 6.6 53
2.0 mm 12.5 14.2 7.6 14.2 14.5 12.6 101
3.0 mm 12.5 56.3          56.3 450
40 μL 1.2 mm 12.5 15.6 14.1    14.7 14.8 119
1.5 mm 12.5 13.1 5.3 11.9 6.7 9.3 74
1.8 mm 12.5 9.3 28.4 4.5 15.3 14.4 115
2.0 mm 12.5 8.7 14.8 11.7 17.0 13.0 104
3.0 mm 12.5       98.7 31.4 65.0 520
50 μL 1.2 mm 12.5 34.3 7.6 23.9 29.4 23.8 190
1.5 mm 12.5 21.6 27.9 20.8 33.0 25.8 207
1.8 mm 12.5 14.1 17.6 6.4 8.7 11.7 93
2.0 mm 12.5 31.7 16.1 20.2 21.1 22.3 178
3.0 mm 12.5 129.5 101.9 20.2 131.1 95.7 765
[表3]
表3 RNaseP測定結果（參考）
PCR反應液量 沖裁片尺寸 N＝1 N＝2 N＝3 N＝4 平均 （copy/μL W.B.）
20 μL 1.2 mm 795 770 958 643 791
1.5 mm 972 700 723 657 763
1.8 mm 517 497 603 527 536
2.0 mm 1462 1337 469 1891 1290
3.0 mm               
30 μL 1.2 mm 695 499 942 672 702
1.5 mm 556 724 590 854 681
1.8 mm 525 479 466 576 511
2.0 mm 574 483 527 452 509
3.0 mm               
40 μL 1.2 mm 567 517 556 638 570
1.5 mm 651 864 830 1350 924
1.8 mm 525 615 2426 561 1032
2.0 mm 489 512 1320 806 782
3.0 mm               
50 μL 1.2 mm 645 560 1336 593 783
1.5 mm 670 649 522 911 688
1.8 mm 635 531 580 664 602
2.0 mm 618 551 681 668 629
3.0 mm       1283    1283
[產業上之可利用性]
根據本發明，能夠藉由即時聚合酶連鎖反應特異性地、且迅速地對乾燥濾紙血中所含之少量之目標核酸進行檢測及定量。
無
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (13)

  1. 一種利用即時聚合酶連鎖反應檢測乾燥濾紙血中所含之目標核酸之方法，上述檢測方法包括下述步驟（A）～（D）： （A）向PCR反應用管中添加乾燥濾紙血之步驟，其中，濾紙為直徑1.2 mm～2.0 mm之圓形沖裁片或相對於總反應溶液量包含0.95 v/v%～6.6 v/v%全血之沖裁片； （B）向PCR反應用管中添加20～50 μL之PCR試劑之步驟； （C）於藉由蓋將添加有PCR試劑與乾燥濾紙血之管加以密閉之狀態下，進行PCR反應之步驟； （D）經時性地對藉由PCR反應而擴增之目標核酸進行光學檢測之步驟。
  2. 如請求項1之檢測目標核酸之方法，其中，於（A）步驟之後，進行（B）步驟。
  3. 如請求項1之檢測目標核酸之方法，其中，PCR反應用管為PCR反應用96孔管或8聯管。
  4. 如請求項2之檢測目標核酸之方法，其中，PCR反應用管為PCR反應用96孔管或8聯管。
  5. 如請求項1至4中任一項之檢測目標核酸之方法，其中，PCR試劑至少包含引子、聚合酶、dNTP、及嵌入劑或螢光標記探針。
  6. 如請求項5之檢測目標核酸之方法，其藉由檢測因對上述嵌入劑照射激發光而產生之螢光，而檢測上述經擴增之目標核酸。
  7. 如請求項5之檢測目標核酸之方法，其中，上述螢光標記探針具有螢光物質與淬滅劑，且含有與核酸擴增反應之模板互補之部分序列，藉由檢測因對上述螢光物質照射激發光而產生之螢光，而檢測上述經擴增之目標核酸。
  8. 如請求項1至4中任一項之檢測目標核酸之方法，其中，目標核酸係選自由TREC、KREC及SMN1所組成之群中之1種以上之基因片段及/或基因。
  9. 如請求項5之檢測目標核酸之方法，其中，目標核酸係選自由TREC、KREC及SMN1所組成之群中之1種以上之基因片段及/或基因。
  10. 如請求項6之檢測目標核酸之方法，其中，目標核酸係選自由TREC、KREC及SMN1所組成之群中之1種以上之基因片段及/或基因。
  11. 請求項7之檢測目標核酸之方法，其中，目標核酸係選自由TREC、KREC及SMN1所組成之群中之1種以上之基因片段及/或基因。
  12. 一種定量目標核酸之方法，其係於藉由請求項1至11中任一項之利用即時聚合酶連鎖反應檢測目標核酸之方法而定量目標核酸之方法中，使用以下標準品； （1）含有包含目標核酸之序列之人工核酸，且非包含於乾燥濾紙血之標準品，該標準品直接溶解於反應容器中使用。
  13. 一種定量套組，其用於藉由請求項1至11中任一項之利用即時聚合酶連鎖反應檢測目標核酸之方法而定量目標核酸之方法，上述定量套組至少包含以下標準品； （1）含有包含目標核酸之序列之人工核酸，且非包含於乾燥濾紙血之標準品，該標準品直接溶解於反應容器中使用。
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