TW202003540A - 誘導型t細胞受體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係有關(核酸編碼之)誘導型T細胞受體(iTCRs)、組成物與套組、含有此類(核酸編碼之)誘導型T細胞受體之載體與宿主細胞，其在製備誘導型T細胞受體與含有此類T細胞受體之宿主細胞的用途，用於製備此類誘導型T細胞受體與用於二聚合化T細胞受體之方法，以及此類化合物與含有其之醫藥組成物的醫療用途，具體而言用於治療癌症。本發明係有關含有一或多個核酸分子之組合，該一或多個核酸分子包含一編碼TCRα鏈鍵聯二聚合結構域的核酸序列A與一編碼TCRβ鏈鍵聯二聚合結構域的核酸序列B，以及利用此類核酸分子編碼之蛋白質及相應之用途與方法。

Description

誘導型T細胞受體及其用途

本發明係有關(核酸編碼之)誘導型T細胞受體、組成物與套組、含有此類(核酸編碼之)誘導型T細胞受體之載體與宿主細胞，其在製備誘導型T細胞受體與含有此類T細胞受體之宿主細胞的用途，用於製備此類誘導型T細胞受體與用於二聚合化T細胞受體之方法，以及此類化合物與含有其之醫藥組成物的醫療用途，具體而言用於治療癌症。具體而言，本發明係有關含有一或多個核酸分子之組合，該一或多個核酸分子包含一編碼TCRα鏈鍵聯二聚合結構域的核酸序列A與一編碼TCRβ鏈鍵聯二聚合結構域的核酸序列B，以及利用此類核酸分子編碼之蛋白質及相應之用途與方法，如本文與申請專利範圍之定義。

強效T細胞療法的發展伴隨著不良事件風險的增加，例如靶向(on-target)與脫靶(off-target)副作用。隨著T細胞療法變得更有效，急性毒性，如細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome)，變得更加明顯。針對安全的過繼性T細胞療法(adoptive T cell therapy)，控制基改T細胞(genetically modified T cells)的能力至關重要。發展控制基改T細胞的方法一直以來都是積極的研究焦點。投予T細胞抑制藥物常是不完整且非特異性。 利用額外的安全開關，如自殺基因(suicide genes)，基因工程T細胞最終導致彼等細胞的耗盡。然而，由此導致的基礎細胞凋亡增加及剩餘T細胞的擴增，可能限制其功效。

據此，本發明的技術問題符合上述目的。技術問題已由本文所述方式與方法解決，在實例中說明，且如申請專利範圍之定義。

發明人解決了上述問題，並針對重組型T細胞受體(TCR)進行開發修飾，產生可控的TCR蛋白表達。本發明之誘導型TCR包含恆定之α及/或β鏈的突變，導致兩鏈的配對喪失。此外，本發明之誘導型TCRs包含在恆定之α與β鏈下游添加二聚合化結構域。二聚合化結構域之特徵在於，二聚合作用的條件狀態取決於添加的二聚合化試劑。在以個別的二聚合化試劑誘導二聚合作用後，達成所給定TCR之膜表達。

因此，本發明提供重組型抗原特異性T細胞受體(TCR)的修飾，其中彼等修飾引發抗原特異性重組型TCR之蛋白質膜表現的控制。在進一步態樣中，本發明提供編碼此類TCR改良體之核酸、包含此類核酸之載體、包含此類載體與核酸之宿主細胞、及其各用途與應用。

特別的是，如同本發明上下文中令人驚訝的發現，TCR之C端恆定型α鏈及/或β鏈的點突變，導致阻斷或抑制二鏈之天然配對。其結果為，TCR無法與T細胞受體複合體CD3一起形成正確配對的α鏈與β鏈複合體。因此，重組型T細胞表面上的TCRs不表現或僅表現極小量，造成T細胞不能辨識抗原並隨後驅動功能。

此外，二聚合作用結構域係導入TCR之α鏈與β鏈恆定區下游，使得在加入二聚合作用試劑時，容許TCR的二聚合作用，其中二聚合作用結構域與二聚合作用試劑克服由於點突變造成的TCR配對阻斷/抑制。因此，重疊之原則為誘導型二聚合作用，如TCRα鏈與β鏈之化學誘導型二聚合作用(CID)，其中各鏈在沒有二聚合作用試劑之情況下不配對。

據此，本發明係有關誘導型T細胞受體(TCR)分別與恆定型α鏈與β鏈下游之二聚合作用結構域，其二聚合化，因此，當以二聚合作用試劑誘導時，在細胞膜表面上表現。

在一態樣，本發明係有關一含有一或多個核酸分子的組合，該一或多個核酸分子包含： (a) 核酸序列A，其包含(i)編碼與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，及(ii)編碼誘導型二聚合作用結構域之核酸序列，其下游鍵聯該編碼與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列；以及(b)核酸序列B，其包含(i)編碼與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，及(ii)編碼誘導型二聚合作用結構域之核酸序列，其下游鍵聯該編碼與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，類似於與該編碼與(a)(ii)之SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列鍵聯之二聚合作用結構域之位置，該二聚合作用結構域相應於鍵聯該編碼與(a)(ii)之SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列的二聚合作用結構域，其中相較於SEQ ID NO: 2，該與(a)(i)之SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同之胺基酸序列包含至少一個，較佳為至少二個胺基酸取代，及/或相較於SEQ ID NO: 4，該與(b)(i)之SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同之胺基酸序列包含至少一個，較佳為至少二個，更佳地至少三個胺基酸取代。

依據本發明，核酸序列A或B之描述包含了編碼誘導型二聚合作用結構域之核酸序列，其下游分別鍵聯該編碼與SEQ ID NO: 2 (編碼TCR恆定型α鏈)或SEQ ID NO: 4 (編碼TCR恆定型β鏈等位基因2)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，亦指由該核酸序列A或B編碼之相對應胺基酸序列(亦即，蛋白質)，該胺基酸序列包含一誘導型二聚合作用結構域，其下游分別鍵聯由該編碼與SEQ ID NO: 2或4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列編碼之胺基酸序列(亦即，蛋白質)。換言之，不僅是編碼TCR恆定型α鏈或β鏈之編碼核酸序列與二聚合作用結構域鍵聯，還有經編碼與經表現之胺基酸序列，因此，多胜肽係經鍵聯(亦即，分別產生一包含TCR恆定型α鏈鍵聯誘導型二聚合作用結構域之蛋白質及/或一包含TCR恆定型β鏈鍵聯誘導型二聚合作用結構域之蛋白質)。如本發明上下文中所理解的，該編碼胺基酸序列之核酸序列係分別與編碼TCR恆定型α鏈或β鏈之SEQ NO: 2或4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97.5%、98%、98.5%或99%相同。由核酸序列A與B (以及，因此含有該序列之核酸分子)編碼之胺基酸序列(亦即，蛋白質)，在本發明上下文中較佳地理解為，分別編碼含有誘導型二聚合作用結構域的TCRα鏈與β鏈(包括個別的可變區與恆定區)，因此，適用於提供與製備本文所述之誘導型TCR。

依據本發明，核酸序列A較佳為編碼包括可變區與恆定區之TCRα鏈，且核酸序列B較佳為編碼包括可變區與恆定區之TCRβ鏈。如本領域中習知，TCR主要由α鏈與β鏈組成，各鏈含有一可變區與一恆定區，TCR進一步包含一鄰近之跨膜區與細胞質區。TCR之恆定區位於可變區下游且鄰近細胞膜，緊接著為一跨膜區與一短的細胞質區。在正常情況下，α鏈與β鏈之恆定區利用細胞外結構域之半胱胺酸為主的雙硫鍵進行配對(參見，例如，Glusman et al., Immunity (2001), 15: 337-349；Call et al., Cell (2002), 111: 967-979)。本發明之要點在於，TCR之α鏈及/或β鏈之恆定區包含一或多個突變，其導致喪失該α鏈與β鏈之配對(亦即，與編碼核酸序列A組成之相應TCR恆定區α鏈之SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同的胺基酸序列，及與編碼核酸序列B組成之相應TCR恆定區β鏈之SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同的胺基酸序列，其中由於TCR恆定區α鏈及/或β鏈中一或多個突變，彼等鏈出現配對能力失常)。據此，分別相較於SEQ ID NO: 1及/或3，由核酸序列A及/或B造成的核苷酸差異，導致本文所述之胺基酸取代，較佳為造成TCR之α鏈與β鏈的天然配對能力喪失。依據本發明，此天然配對能力喪失，可利用誘導型(控制型)二聚合作用解決，係通過由導入核酸序列A與B中之序列編碼之二聚合作用結構域，其中該二聚合作用結構域在加入本文所述之合適的二聚合作用試劑時進行二聚合化。亦即，該二聚合作用結構域不進行或至少在實質程度上不進行二聚合化，除非藉由添加合適的二聚合作用試劑誘導，因此亦稱作誘導型二聚合作用結構域。因此，本文所述與提供之核酸分子組合，可提供或用於製備誘導型TCR (iTCR)，其可在添加本文所述之二聚合作用試劑時經誘導(亦即，誘導個別α鏈與β鏈的二聚合作用)。本文中使用的「組合（combination）」乙詞可包含或意指「組成物（composition）」，其中一或多個該核酸分子包含或結合在一起。

本文所述核酸分子之核酸序列A包含編碼與SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2編碼人類TCRα鏈恆定區之aa序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，較佳為至少97,5%、98%、98,5%或99%，更佳地至少98,5%，或甚而99%。本文所述核酸分子之核酸序列B包含一編碼與SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 4編碼人類TCRβ鏈恆定區之aa序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99%相同胺基酸序列之核酸序列，較佳為至少97,5%、98%、98,5%或99%，更佳地至少98%或甚而98,5%。在本發明上下文中，相較於SEQ ID NO: 2，胺基酸取代較佳為保留型胺基酸取代。保留型胺基酸取代為本領域中習知，包括將具有特定物理及/或化學性質之胺基酸交換成另一具有相同化學或物理性質之胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，保留型胺基酸取代可為酸性胺基酸取代成另一酸性胺基酸、一具有非極性側鏈之胺基酸取代成另一具有非極性側鏈之胺基酸、一鹼性胺基酸取代成另一鹼性胺基酸、一具有極性側鏈之胺基酸取代成另一具有極性側鏈之胺基酸等，其進行係基於所涉及殘基之，例如，極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、及/或兩親性質的相似性。舉例而言，「保留型」取代可指該取代如下表1所列之「示例性取代」。本文中使用的「高度保留型」取代意指該取代如下表1所示之標題「較佳之取代」。 表1 胺基酸取代

在本發明之一具體實施例中，相較於SEQ ID NO: 2，該與(a)(i)之SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同之胺基酸序列包含位置44及/或47的胺基酸取代，及/或相較於SEQ ID NO: 4，該與(b)(i)之SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同之胺基酸序列包含位置4、5、37、63、77及/或79的胺基酸取代。在本發明之一具體實施例中，相較於SEQ ID NO: 2，位置44及/或47的胺基酸取代為保留型胺基酸取代。

SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列可由SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列編碼。此外，由本文所述(a)(i)之核酸序列編碼的與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同之胺基酸序列，可由SEQ ID NO: 1之核苷酸序列編碼，其中相較於SEQ ID NO: 2，個別的核苷酸係經取代，以產生相應之胺基酸取代。SEQ ID NO: 2之胺基酸序列亦可由SEQ ID NO: 1之核苷酸序列編碼，其中一或多個核苷酸係經取代，其中此類取代不會轉譯成胺基酸取代體(緘默突變)。此外，編碼與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同胺基酸序列之核酸序列可對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸序列，其中相較於SEQ ID NO: 2，個別的核苷酸係經取代，以產生相應之胺基酸取代，且其進一步包含額外的核苷酸取代，其不產生胺基酸取代。

同樣地，SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列可由SEQ ID NO: 3所示之核苷酸序列編碼。此外，由本文所述(b)(i)之核酸序列編碼的與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同之胺基酸序列，可由SEQ ID NO: 3之核苷酸序列編碼，其中相較於SEQ ID NO: 4，個別的核苷酸係經取代，以產生相應之胺基酸取代。SEQ ID NO: 4之胺基酸序列亦可由SEQ ID NO: 3之核苷酸序列編碼，其中一或多個核苷酸係經取代，其中此類取代不會轉譯成胺基酸取代體(緘默突變)。此外，編碼與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同胺基酸序列之核酸序列可對應於SEQ ID NO: 3之核苷酸序列，其中相較於SEQ ID NO: 4，個別的核苷酸係經取代，以產生相應之胺基酸取代，且其進一步包含額外的核苷酸取代，其不產生胺基酸取代。

表 1 顯示導入人類TCRα鏈與β鏈之α與β恆定區的胺基酸變化(分別參照SEQ ID NO: 2與4)，其中相較於SEQ ID NO: 2 (針對TCR恆定型α鏈)與SEQ ID NO: 4 (針對TCR恆定型β鏈)，胺基酸序列之改變導致α鏈與β鏈配對受損，但仍容許TCR之α鏈與CD3 ε與δ次單元及TCR之β鏈與CD3 γ與ε次單元的正確組裝，如實施例1-6中可見。參考序列表及參考IMGT編號系統，可顯示取代之胺基酸位置，如圖11與圖12所示。技術人員在遵循IMGT編號後清楚，位置84.1為人類TCR胺基酸序列位置84與85間之位置(Lefranc, M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997))。

表 2 顯示導入人類TCR之β恆定區的胺基酸變化(SEQ ID NO: 4)，其中相較於SEQ ID NO: 4 (針對TCR恆定型β鏈)，胺基酸序列之改變導致α鏈與β鏈配對受損，但仍容許TCR之α鏈與CD3 ε與δ次單元及TCR之β鏈與CD3 γ與ε次單元的正確組裝，如實施例7與8中可見。TCRβ鏈恆定區有二個等位基因，稱作C1與C2。參考序列表及參考IMGT編號系統，可顯示取代之胺基酸位置，如圖12所示。下表2顯示β恆定鏈的二個等位基因間之差異。SEQ ID NO:4意指C2恆定鏈，其顯示位於位置4、5及37的胺基酸K、N及Y (利用下表所示之IMGT編號則為1.3、1.4及29)，而圖12則顯示C1恆定鏈。表2中所列位置之恆定鏈突變，導致α鏈與β鏈的配對減少。

在本發明之一具體實施例中，該二聚合作用結構域係下游分別鍵聯核酸序列A與B，且在表現時位於TCR之C端，較佳為在TCR表現與定位後，位於細胞質區域。在本文中，技術人員清楚的是，在α鏈與β鏈之複合體形成後(與CD3複合體一起)，(參見，例如，Call et al.，同上)，亦即，在本文所定義與提供之核酸序列A與核酸序列B編碼的該二聚合作用結構域的二聚合作用之後，TCR在正常情況下位於細胞膜。

在本發明之一具體實施例中，針對本文所述與提供之組合(或組成物)，該核酸序列A與核酸序列B可由單獨的核酸分子組成或含於一核酸分子中。舉例而言，核酸序列A與核酸序列B可位於相同的核酸分子上，例如，在表現片匣上。在此一表現片匣中，核酸序列A與核酸序列B較佳為可在相同的表現控制之下，例如，在相同啟動子或相同啟動子類型之控制下，以容許相當的表現量。

在本發明之一具體實施例中，相較於SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該(a)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同且包含至少一個胺基酸取代，該取代選自於由T44A與T47A組成之群組；及/或相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同且包含至少一個胺基酸取代，該取代選自於由L63A、S77A及R79A組成之群組。在另一具體實施例中，相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同且包含至少一個胺基酸取代，該取代選自於由K4V、N5P及Y37K組成之群組。

在本發明之一較佳具體實施例中，相較於SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該(a)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同且包含二個胺基酸取代，該二取代為T44A與T47A；以及相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同且包含三個胺基酸取代，該三取代為L63A、S77A及R79A。

在另一較佳具體實施例中，該(a)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同，且相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸序列編碼之胺基酸序列係與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97.5%、98%、98.5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同且包含三個胺基酸取代，該三取代為K4V、N5P及Y37K。

在本發明之一具體實施例中，核酸序列A編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

在本發明之一具體實施例中，核酸序列B編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。

在本發明上下文中，誘導型二聚合作用結構域為一在添加二聚合作用試劑時可二聚合化的二聚合作用結構域。在分別由核酸序列A與核酸序列B編碼的胺基酸序列(亦即，蛋白質)中，二聚合作用結構域係鍵聯且位於恆定型α鏈或β鏈下游(亦即，C端)(由核酸序列編碼，係分別與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98,5%或99%相同)，其表現出配對能力受損。較佳地，誘導型二聚合作用結構域係位於iTCR之細胞質結構域。如本領域技術人員習知，TCR在內質網(ER)形成，之後在α鏈與β鏈配對時，與CD3形成複合體，接著經由高爾基氏體(Golgi apparatus)定位至細胞膜/細胞表面。在本發明上下文中，由於本文所述與提供之各恆定區的突變，iTCR之α鏈與β鏈未配對，因此，在經由誘導型二聚合作用結構域而二聚合作用時，不離開ER (其在加入合適的二聚合作用試劑時，進行二聚合化)。在本發明上下文中，誘導型二聚合作用結構域可為同二聚合作用結構域或異二聚合作用結構域，較佳為同二聚合作用結構域。在本發明上下文中，此類二聚合作用結構域之適用實例為本領域中習知，除其他之外，包含雌性激素受體(例如，ERT2；參照Ballister, Publicly Accessible Penn Dissertations (2014), 1202: Inducible Protein Dimerization: New Tools and Applications to Understanding the Mitotic Checkpoint), FKBP (參照Ballister，同上)、FKBP/鈣調磷酸酶A (Calcineurin A；CNA)(參照Ho et al., Nature (1996), 382: 822-826)；FKBP/CyP-Fas (參照Belshaw et al., PNAS (1996), 93: 4304-4607)、mTOR之FKBP/FRB結構域(參照Ballister, Publicly Accessible Penn Dissertations (2014), 1202: Inducible Protein Dimerization: New Tools and Applications to Understanding the Mitotic Checkpoint)、GyrB (M.A. Farrar et al., Methods in Enzymology, Volume 327, 2000, pages 421-429).)、GAI/GID1 (Miyamato et al., Nature Chemical Biology (2012), 8: 465-470)、Snap-Tag/HaloTag (參照Erhart et al., Chem & Biol (2013), 20: 549-557)、及eDHFR/HaloTag (Ballister et al., Nature Communications 5, Article number: 5475 (2014), doi: 10.1038/ncomms6475)。

本發明係有關一表現片匣，其包含本文所述與提供之核酸序列A與核酸序列B，或至少二表現片匣，其中至少一表現片匣包含本文所述與提供之核酸序列A且至少一表現片匣包含本文所述與提供之核酸序列B。在本發明之一具體實施例中，核酸序列A與核酸序列B係於相同元件(例如，啟動子及/或強化子、操作子、抑制子、及轉錄終止信號及其類似物)控制之下，且若由相同的表現控件(expression control)組成，則可由相同元件共同控制。啟動子可為，例如，組成型啟動子或誘導型啟動子。用於哺乳類動物宿主細胞之適用啟動子/強化子為本領域習知，且包含，例如，SV40、AdMLP、金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子、7.5K啟動子、MIEP、EF1A、CMV、PGK及其他。

本發明進一步係有關載體，其包含本文所述與提供之核酸序列A及/或B，或本文所述與提供之表現片匣。適用之載體取決於個別的宿主細胞，其中載體係經導入(轉形、轉導)且為本領域習知。本文中使用的「載體」乙詞涵蓋但不侷限於，質體、病毒載體(包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘瘡病毒載體、多瘤病毒載體、及腺病毒相關載體(AAV)；本發明上下文中較佳之反轉錄病毒與慢病毒載體)、噬菌體、噬菌粒(phagemids)、黏接質體(cosmids)及人工染色體(包括BACs與YACs)。載體本身常為核苷酸序列，常為包含插入子(轉基因)之DNA序列與作為載體「骨架」之較大序列。在宿主細胞中，基因工程載體典型上包含用於自主複製之起源(若需要穩定表現多核苷酸)、篩選標記物、及限制酶切割位點(例如，多重選殖位點，MCS)。載體可額外包含啟動子/強化子及本文所述與本領域習知之其他控制元件，如操作子、抑制子、及轉錄終止信號，以及基因標記物、報導子基因、標靶序列、及/或蛋白質純化標籤。如本領域之技術人員習知，可得到大量合適載體，且許多為商業上可購。適用載體的實例如J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)所提供。

本發明之載體亦可為表現載體。「表現載體」或「表現構築體」可用於異源性多核苷酸序列之轉錄作用，例如彼等編碼本發明文中描述與提供之TCR鏈(由核酸序列A與核酸序列B編碼)，及其mRNA在適用宿主細胞中之轉譯作用。除了複製起源以外，篩選標記物，以及限制酶切割位點、表現載體典型上包括一或多個調節序列可操作地鍵聯欲表現之異源性多核苷酸。「調節序列」乙詞意指在特定宿主有機體或宿主細胞中，用於表現可操作地鍵聯之(異源性)多核苷酸編碼序列所需之核酸序列，因此包括轉錄與轉譯調節序列。典型而言，在原核細胞中，用於表現異源性多核苷酸序列所需之調節序列包括啟動子，任意地操作子序列，及核糖體結合位點。在真核細胞中，典型上需要啟動子、多腺核苷酸化(polyadenylation)信號、強化子及任意地剪接(splice)信號。此外，載體亦可導入特定起始與分泌信號，以容許感興趣之多胜肽分泌進入培養基。當核酸與另一核酸序列，特別是相同的多核苷酸分子，處於功能關係時，其係「可操作地鍵聯」。舉例而言，當一啟動子能影響編碼序列的表現時，其係可操作地鍵聯異源基因的該編碼序列。啟動子典型上位於編碼感興趣之多胜肽基因上游，並調節該基因的表現。用於哺乳類動物宿主細胞表現的示例性調節序列包括在哺乳類動物細胞中引導高蛋白表現量之病毒元件，如源自巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/強化子)、猴病毒40 (SV40)(如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如，腺病毒主晚啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或強化子。如前所述，表現載體亦可包括複製起源及可篩選標記物。本發明載體可進一步包含一或多個篩選標記物。用於真核宿主細胞之適用篩選標記物包括但不侷限於，單純皰疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase；tk)、 次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase；hgprt)、及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(adenine phosphoribosyltransferase；aprt)基因。其他基因包括dhfr (甲胺蝶呤抗藥性)、gpt (黴酚酸抗藥性)、neo (G-418抗藥性)及hygro (濕黴素抗藥性)。載體放大可用於增加表現量。一般而言，篩選標記基因可直接鍵聯欲表現之多核苷酸序列，或利用共同轉形作用(co-transformation)導入相同宿主細胞。鑑於上述情況，本發明從而進一步提供一或多個本文所述之核苷酸序列插入(亦即，組成自)一載體。特別的是，本發明提供之(可複製)載體包含本文所述與提供之核酸序列A及/或B。

技術人員將能依據，例如，旨在表現核苷酸序列A及/或B編碼之胺基酸序列(蛋白質)的宿主細胞，易於選擇合適的表現載體。適用之表現載體的特定實例為病毒載體，如反轉錄病毒載體，如MP71載體或反轉錄病毒SIN載體；以及慢病毒載體或慢病毒SIN載體。病毒載體係，舉例而言，能感染淋巴細胞，其設想隨後表現核苷酸序列A及/或B編碼的胺基酸序列(蛋白質)。適用之表現載體之另一實例為睡美人(Sleeping Beauty；SB)轉位子轉位酶DNA質體系統，SB DNA質體。本發明之核酸及/或特別是表現構築體亦可利用短暫RNA轉染移至細胞內。目前使用的原始TCR表現病毒載體典型上以內部核醣體進入位點(internal ribosomal entry site；IRES)序列或源自豬鐵士古病毒(porcine tsechovirus)之2A胜肽序列，將TCR-α與TCR-β鏈基因鍵連至一載體，造成在轉導細胞內的病毒啟動子控制下，單一傳訊RNA (mRNA)分子的表現。然而，技術人員將易於篩選，且亦使用其他習知系統，將本發明之核苷酸序列A及/或B導入適用的表現系統，如CRISPR/Cas或睡美人(SB)轉位子。

本發明亦有關由本文所述與提供之核酸序列編碼的，尤其是由核酸序列A及/或B編碼的，胺基酸序列與蛋白質(在本文中可互用)。結合由含有核酸序列A與核酸序列B之核酸編碼的胺基酸序列(蛋白質)，可提供或適於製備本文所述與提供之iTCR。因此，本發明亦有關由含有核酸序列A與核酸序列B之核酸編碼的胺基酸序列(蛋白質)製備的或由含有核酸序列A與核酸序列B之核酸製備的iTCR。如本文所述，iTCR為α鏈與β鏈出現配對破壞的TCR，且α鏈與β鏈兩者包含C端誘導型二聚合作用結構域(如本文所述)，但在加入適用之二聚合作用試劑時會二聚合化。在本發明全文中，相較於細胞膜中原始人類TCR (具有TCR恆定區α鏈與β鏈，分別如SEQ ID NO: 2與4所述)的量，若一給定之TCR產生細胞的細胞膜中可測到小於至少2、3、4、或5倍的TCR，則TCR的配對能力可視為「破壞的」。適用之測定方法為本領域中習知，包含例如，如本文所示之流式細胞術。

本發明亦有關胺基酸序列與蛋白質之編碼核酸序列，其係與SEQ ID NO: 2和編碼TCR恆定型α鏈至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同，其不能與SEQ ID NO: 4之原始人類TCR恆定型β鏈配對。本發明亦有關胺基酸序列與蛋白質之編碼核酸序列，其係與SEQ ID NO: 4和編碼TCR恆定型β鏈至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98%或98,5%)相同，其不能與SEQ ID NO: 2之原始人類TCR恆定型α鏈配對。

如本文所述，鍵聯胺基酸序列之誘導型二聚合作用結構域，其與SEQ ID NO: 2或4 (分別編碼TCR恆定型α鏈或β鏈)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同，且由核酸A或B編碼(分別編碼TCRα鏈或β鏈，其中下游鍵聯二聚合作用結構域)，係二聚合化，因此，在加入適當的二聚合作用試劑時，將兩鏈連接在一起。此二聚合作用試劑取決於鍵聯欲製備之iTCRα鏈與β鏈之相對應二聚合作用結構域，其係使用本文提供之組合或組成物核酸分子，如本領域之技術人員習知。舉例而言，適用之二聚合作用試劑包含(取決於個別的二聚合作用結構域)太莫西芬(例如，4-羥基太莫西芬)、因多西芬、AP21967、4-(1-[4-(二甲基胺基乙氧基)苯基]-2-苯基-1-丁烯基)酚、及23,27-環氧基-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧雜氮雜環三十一烷、FK1012、FK506、FKCsA、雷帕黴素、香豆黴素、赤黴素、HaXS、及TMP-Htag。在本發明之一具體實施例中，特別是針對雌性激素受體(例如，ERT2)為由核酸序列A與核酸序列B編碼的二聚合作用結構域，二聚合作用試劑為太莫西芬或因多西芬，較佳為因多西芬。適當之二聚合作用結構域/二聚合作用試劑配對之實例如表3所示。

表 3 ：適用之二聚合作用結構域/二聚合作用試劑配對之實例

本發明亦有關含有組合或組成物之套組，其包含一或多個含有本文所述與提供之核酸序列A及/或B的核酸分子、本文所述與提供之表現片匣、本文所述與提供之宿主細胞、及/或本文所述與提供之載體，伴隨二聚合作用試劑，其相應於二聚合作用結構域，其鍵聯之胺基酸序列係分別與SEQ ID NO: 2或4 (SEQ ID NO: 2針對核酸序列A，且SEQ ID NO: 4針對核酸序列B)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97,5%、98%、98,5%或99% (較佳為至少98,5%或99%)相同，該二聚合作用試劑係能誘導該二聚合作用結構域之二聚合作用。可利用本領域習知之方法，測定二聚合作用結構域之二聚合作用誘導能力，並於本文中示例。本質上，一試劑能二聚合化本發明所述之誘導型二聚合作用結構域，當加入該試劑時，可在細胞膜測量到以本發明之方法、組合、組成物、化合物、載體、宿主細胞、或套組製備之iTCRs的表現與定位增加；較佳地，在一給定之宿主細胞的細胞膜，比未添加該二聚合作用試劑，有至少2倍、3倍、4倍或5倍(較佳為至少5倍)以上的iTCRs。用於測定細胞表面TCR之適用方法係本領域習知，且包括流式細胞術(參見例如，圖2)。二聚合作用結構域與二聚合作用試劑之適用配對係示例於表3。

本發明亦有關含有核酸分子之宿主細胞，其包含本文所述與提供之核酸序列A與核酸序列B、本文所述與提供之表現片匣、及/或本文所述與提供之載體。適用之宿主細胞為本領域習知，且包含尤其是原核與真核細胞，較佳為真核細胞，例如，哺乳類動物細胞。宿主細胞可包含，例如，生產用宿主細胞或效應子宿主細胞。

有多種宿主細胞可用於本發明。本文中使用的「宿主細胞」 乙詞涵蓋可為或已是本文所述核酸分子或載體之接受體(recipients)及/或表現(且任意地分泌)本發明之胺基酸序列(亦即，蛋白質)(例如，iTCRs)的細胞。除非另有明確規定，「細胞」與「細胞培養基」等詞可互換使用。「宿主細胞」乙詞亦包括「宿主細胞株」。一般而言，「宿主細胞」乙詞包括 原核或真核細胞，且亦包括但不侷限於，細菌、酵母菌細胞、真菌細胞、植物細胞、及動物細胞，如昆蟲細胞與哺乳類動物細胞，例如，鼠科、大鼠、獼猴或人類細胞。鑑於上述情況，本發明從而提供尤其是，含有多核苷酸或載體之宿主細胞，如含有編碼如本文所述胺基酸序列(例如，iTCRs)之核苷酸序列的表現載體。本發明之多核苷酸及/或載體可利用本領域之常規方法導入宿主細胞，如轉染、轉形、或其類似方法。

「轉染」為刻意地將核酸分子或多核苷酸(包括載體)導入標靶細胞之方法。一實例為RNA轉染，亦即，將RNA (如體外轉錄之RNA，ivtRNA)導入宿主細胞之方法。本詞最常用於真核細胞之非病毒性方法。「轉導」乙詞常用於描述病毒介導的核酸分子或多核苷酸轉移。動物細胞之轉染典型上涉及在細胞膜上開啟短暫性孔隙或「孔洞」，以容許材料之攝取。轉染可利用磷酸鈣法、電穿孔法、細胞擠壓法、或將陽離子性脂質與材料混合以產生微脂體進行，其與細胞膜融合並將其載物存放於內部。用於轉染真核宿主細胞之示例性技術包括，脂質囊泡介導之攝入法、熱休克介導之攝入法、磷酸鈣介導之轉染法(磷酸鈣/DNA共沉澱法)、顯微注射法及電穿孔法。

「轉形」乙詞用於描述核酸分子或多核苷酸(包括載體)之非病毒性轉移至細菌，還有非動物真核細胞，包括植物細胞。因此，轉形為細菌或非動物真核細胞的遺傳變異，係因從周圍環境直接攝入細胞膜，且隨後併入外源性遺傳物質(核酸分子)。轉形可利用人工方式實現。針對轉形的發生，細胞或細菌必須處於勝任(competence)狀態，這可能是其對飢餓與細胞密度等環境條件的時間限制反應。針對原核轉形，其技術可包括熱休克介導之攝入法、細菌原生質體與完整細胞融合、顯微注射法及電穿孔法。用於植物轉形之技術包括農桿菌屬(Agrobacterium )介導之轉移法，如利用根癌土壤桿菌(A. tumefaciens )、快速推進之鎢或金微粒法、電穿孔法、顯微注射法及聚乙二醇介導之攝入法。鑑於上述情況，本發明從而進一步提供含有至少一如本文所述之多核苷酸序列及/或載體的宿主細胞。

針對表現本發明之胺基酸序列(亦即，蛋白質)，可選擇調控插入之多核苷酸序列之表現及/或修飾與加工所需之基因產物(亦即，RNA及/或蛋白質)的宿主細胞。基因產物之此類修飾(例如，醣化)與加工(例如，切割)對TCR的功能很重要。不同宿主細胞具有基因產物轉譯後加工與修飾的特徵與特異性機制。可選擇合適的細胞株或宿主系統，以確保產物的正確修飾與加工。為此，可使用能產生細胞機制體(machinery)且正確加工基因產物之初級轉錄子、醣化、及磷酸化的真核宿主細胞。本文設想提供(a)用於表現與取得本發明之蛋白質(例如，iTCRs)的宿主細胞，特別是可溶形式(「生產用宿主細胞」)及(b)表現本發明之TCR且具有效應子功能(「效應子宿主細胞」)的宿主細胞。此類「效應子宿主細胞」在治療應用時特別有用，並設想用於投予有需求之受試者。較佳之「效應子宿主細胞」包括淋巴細胞，如細胞毒性T淋巴球(CTLs)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、γ/δ-T-細胞。

用於表現本發明蛋白質之「生產用宿主細胞」較佳為能表現高量的重組型蛋白質。可作為「生產用宿主細胞」的示例性哺乳類動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)，包括DHFR^- CHO細胞，如DG44與DUXBl 1、NSO、COS (具備SV40 T抗原之CVI衍生株)、HEK293 (人類腎臟)、及SP2 (小鼠骨髓瘤)細胞。其他示例性宿主細胞株包括但不侷限於，HELA (人類子宮頸癌)、CVI (猴腎臟株)、VERY、BHK (幼倉鼠腎臟)、MDCK、293、WI38、R1610 (中國倉鼠纖維母細胞) BALBC/3T3 (小鼠纖維母細胞)、HAK (倉鼠腎臟株)、P3x63-Ag3.653 (小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT (牛內皮細胞)、及RAJI (人類淋巴細胞)。宿主細胞株係典型上可商購自American Tissue Culture Collection (ATCC)或公開文獻。非哺乳類動物細胞，如細菌、酵母菌、昆蟲、或植物細胞亦易於取得，且亦可作為如上述之「生產用宿主細胞」。示例性細菌宿主細胞包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)，如大腸桿菌(Escherichia coli )、沙門氏菌(Salmonella )；芽孢桿菌科(Bacillaceae )，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )；肺炎球菌(Pneumococcus )；鏈球菌(Streptococcus )及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza )。其他宿主細胞包括酵母菌細胞，如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )及畢赤酵母菌(Pichia pastoris )。昆蟲細胞包括但不侷限於，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。依據前述，可想像的表現系統(亦即，含有上述表現載體之宿主細胞)包括微生物，如細菌微生物，如以重組型噬菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉形之細菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；以重組型酵母菌表現載體體轉形之酵母菌(例如，啤酒酵母菌、畢赤酵母菌)；以重組型病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；以重組型病毒表現載體(例如，花椰菜鑲嵌病毒(cauliflower mosaic virus；CaMV)；煙草鑲嵌病毒(tobacco mosaic virus；TMV))感染或以重組型質體表現載體(例如，Ti質體)轉形之植物細胞系統。較佳為具有重組型表現構築體之哺乳類動物表現系統，其含有源自哺乳類動物細胞(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳類動物病毒(例如，腺病毒晚啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子、巨細胞病毒(CMV)主立即早期啟動子(MIEP))基因體之啟動子。適用之哺乳類動物宿主細胞可選自習知之細胞株(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)，然而，亦可考慮使用淋巴細胞，如細胞毒性T淋巴球(CTLs)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、γ/δ-T-細胞。

依據前述，本發明亦提供用於產生與取得如本文所述之蛋白質(例如，TCR)的方法，其步驟包含(i)在導致該蛋白質表現的條件下培養宿主細胞(亦即，生產用宿主細胞)及(ii)純化該蛋白。具備表現載體之宿主細胞係於適合產生本文所提供蛋白質之條件下生長，特別是分別由如本文所述之核酸序列A與核酸序列B編碼的恆定型α鏈及/或β鏈，並進行α鏈及/或β鏈蛋白質合成分析。針對雙鏈TCRs之表現，編碼α鏈與β鏈之載體可在宿主細胞中共同表現，以表現整個分子。

一旦表現本發明之蛋白質(亦即，iTCR)，可利用本領域習知之任何純化方法純化，舉例而言，利用層析法(例如，離子交換層析法(如氫氧磷灰石層析法)、親和性層析法，特別是蛋白質A、蛋白質G、或凝集蛋白親和性層析法、粒篩管柱層析法)、離心法、差異性溶解度法、疏水性交互作用層析法、或利用任何其他標準的蛋白質純化技術。技術人員將依據欲回收的蛋白質個別特徵，易於選擇適用之純化方法。

如前面所述，本發明亦提供「效應子宿主細胞」，其包含本發明之核苷酸序列、載體或蛋白質。該效應子宿主細胞利用常規方法改良，以包含編碼本發明蛋白質之核酸序列，且設想表現本文所述之蛋白質，特別是在細胞表面。針對本發明之目的，「表現本發明蛋白質之改良宿主細胞」一般而言係指(效應子或生產用)宿主細胞經處理或改變以表現本發明之蛋白質，例如利用所附實例中提及的RNA轉染。亦考慮其他修飾或轉染或轉導方法，如本文中彼等其他說明。因此，「改良之宿主細胞」乙詞包括「轉染之」、「轉導之」及「基因工程之」宿主細胞，其較佳為表現本發明之蛋白質。較佳地，此類「(改良之)效應子宿主細胞」(特別是「(改良之)效應子淋巴細胞」)在蛋白質結合至其特異性抗原標靶時，能通過細胞內傳訊轉導作用，媒介效應子功能。此類效應子功能包括，例如，釋放穿孔蛋白(perforin)(其在標靶細胞膜產生孔洞)、顆粒酶(granzymes)(其係在細胞內作用以驅使細胞凋亡的蛋白酶)、Fas配體之表現(含有Fas之標靶細胞中活化細胞凋亡作用)及釋放細胞介素，較佳為Th1/Tc1細胞介素，如IFN-γ、IL-2及TNF-α。因此，效應子宿主細胞經基因工程以表現本發明之蛋白質，其能辨識與結合至其欲治療受試者之抗原標靶，設想能進行上述之效應子功能，從而殺死標靶(如癌症)細胞。標靶細胞之細胞溶解(cytolysis)可利用如CTL螢光撲殺試驗(CTL，USA)評估，以檢測在與轉染的接受體T細胞共培養期間，標記之標靶細胞的螢光消失。

鑑於上述情況，效應子宿主細胞較佳為表現功能性iTCR，亦即，其典型上包含本文所述之iTCRα鏈與β鏈；還有訊息傳遞次單元CD3 γ、δ、ε及ζ (CD3複合體)。此外，亦需要表現共受體CD4或CD8。一般而言，淋巴細胞含有參與抗原結合、受體活化、及下游傳訊(如，Lck、FYN、CD45、及/或Zap70)所需的基因，T細胞特別適合作為效應子宿主細胞。然而，本文亦考慮表現本發明之TCR以作為「結合結構域」而無CD3訊息傳遞次單元及/或前述之下游傳訊分子(亦即，係能辨識本文所述之抗原標靶，但不影響由CD3及/或前述下游傳訊分子介導之功能)的效應子宿主細胞。設想此類效應子細胞能辨識本文所述之抗原標靶，且任意地影響其他與CD3傳訊及/或前述之下游傳訊分子之傳訊無關的功能。實例包括表現本發明蛋白質之NK或NKT細胞，且在辨識其抗原標靶時，例如，能釋放細胞毒性顆粒。因此，細胞毒性T淋巴球(CTLs)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、γ/δ-T-細胞可視為本發明之有用的淋巴細胞效應子宿主細胞。本文中，此類表現本發明重組型iTCR之淋巴細胞亦稱作「改良之效應子淋巴細胞」。然而，技術人員將易於理解到，通常利用本領域習知之重組型基因工程方法，可將導致所需效應子功能之蛋白質傳訊途徑的任何組分導入適用之宿主細胞。效應子宿主細胞特別是淋巴細胞，如T細胞，可為取自欲治療之受試者的自體宿主細胞，並經轉形或轉導，以表現本發明之蛋白質。典型而言，利用所附實例中描述的病毒載體，可完成蛋白質的重組型表現。用於從病患取得與分離出細胞之技術為本領域習知。如前面所述，本文提供之效應子宿主細胞特別設想用於治療應用。宿主細胞可能需要進一步的遺傳修飾，以增加治療功效。例如，當以自體CD8+ T細胞作為「效應子宿主細胞」，適用之額外修飾包括內源性TCR、CTLA-4及/或PD-1表現的向下調節；及/或共刺激分子如CD28、CD134、CD137的放大作用。達成前述遺傳修飾之工具與方法，在本領域中已有描述。

宿主細胞的靶向基因體工程方法為本領域習知，且包括，除了以siRNA進行基因敲除以外，使用所謂的「可編程核酸酶」，如鋅手指核酸酶(zinc-finger nucleases；ZFNs)、轉錄類活化子效應子核酸酶(TALENs)、及RNA導引之基因工程核酸酶(RGENs)，其係源自細菌叢集之規則性間隔短回文重複(clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR)–Cas (CRISPR相關聯)系統，尤其是如Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321–334 (2014)之回顧文獻所述。舉例而言，可編程核酸酶如TALENs可用於切割「不需要之」蛋白質之密碼的DNA區，如PD-1、CTLA-4或內源性 TCR，從而減少其表現。當T細胞作為(效應子)宿主細胞時，內源性TCR的向下調節具有減少內源性與外源性TCRα/β鏈之不需要之「配對錯誤(mispairing)」的益處。

本發明亦有關本文所述二聚合作用試劑之用途，用於二聚合化本文所述與提供之核酸序列A編碼之蛋白質與核酸序列B編碼之蛋白質。在本發明之一具體實施例中，用於二聚合化本文所述與提供之核酸序列A編碼之蛋白質與核酸序列B編碼之蛋白質的二聚合作用試劑可為因多西芬。

本發明係進一步有關用於二聚合化本文所述與提供之核酸序列A編碼之蛋白質與核酸序列B編碼之蛋白質的方法，其包含將本文所述之二聚合作用試劑(例如，太莫西芬或因多西芬，較佳為因多西芬)加入該蛋白質的步驟。

本發明係進一步有關用於製備誘導型T細胞受體 (iTCR)的方法，其包含導入本文所述與提供之核酸序列A與核酸序列B的步驟、本文所述與提供之表現片匣、或本文所述與提供之載體在容許表現核酸序列A與核酸序列B之條件下體外導入宿主細胞。適用之轉形/轉導方法與表現方法為本領域習知，且在本文中描述。

本發明係進一步有關本文所述與提供之組合或組成物、本文所述與提供之表現片匣、或本文所述與提供之載體以產生改良之T細胞，如T淋巴細胞，的用途。

本發明係進一步有關本文所述與提供之組合或組成物、本文所述與提供之表現片匣、本文所述與提供之載體、本文所述與提供之宿主細胞、或本文所述與提供之蛋白質，以用於T細胞療法。

本發明係進一步有關本文所述與提供之組合或組成物、本文所述與提供之表現片匣、本文所述與提供之載體、本文所述與提供之宿主細胞、或本文所述與提供之蛋白質，以用於治療癌症。本發明可治療的癌症包括各類癌症，特別是實體癌(例如，小細胞肺癌、乳癌、結直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌、前列腺癌、腦癌或神經系統癌、頭頸癌、睾丸癌、肺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胃腸癌、骨癌、內分泌系統癌、淋巴系統癌、纖維肉瘤、神經外胚層腫瘤、間皮瘤(mesothelioma)、表皮樣癌(epidermoid carcinoma)、或卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma))、及血癌(白血病)。

本發明係進一步有關醫藥組成物，其包含本文所述與提供之組合組成物、本文所述與提供之表現片匣組成物、本文所述與提供之載體組成物、本文所述與提供之宿主細胞組成物、或本文所述與提供之蛋白質組成物。

「醫藥組成物」乙詞特別指適合投予人類之組成物。然而，適合投予非人類動物之組成物通常亦包含在該術語中。醫藥組成物及其組分(亦即，活性劑與任意地賦形劑)係較佳為醫藥上可接受，亦即，能夠引發所需之治療效果而不會導致接受體任何不需要的局部或全身性影響。本發明之醫藥上可接受組成物可為諸如無菌的。特別的是，「醫藥上可接受」乙詞可指由管理機構或其他公認的藥典批准用於動物，更特別地用於人類。前述之活性劑(例如，宿主細胞或iTCR)較佳為以一治療上有效量存在於醫藥組成物中。「治療上有效量」乙詞意指可引發所需治療效果之一定量活性劑。治療功效與毒性可以標準程序測定，如細胞培養或動物測試，例如，ED₅₀ (在50%群體中的治療上有效劑量)與LD₅₀ (在50%群體中的致死劑量)。治療與毒性效應間之劑量比率為治療指數(index)，其可以一比率ED₅₀ /LD₅₀ 表示。醫藥組成物較佳為具有大的治療指數。

本領域技術人員可以習知技術確定核酸、蛋白質、載體、或宿主細胞的確切劑量。適用之劑量可提供足夠量的本發明活性劑，且較佳為治療上有效，亦即，引發所需治療功效。如本領域習知，可能需要基於治療目的而調整(例如，緩解維持對比疾病之急性發作)、投予途徑、時間與頻率、投予配方之時間與頻率、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、疾病狀態的嚴重程度、藥物組合、反應敏感性、及對治療的耐受性/反應。適用之劑量範圍可利用細胞培養試驗與動物研究所得之數據確定，且可包括ED₅₀ 。典型而言，劑量可在0.1至100000微克之間變化，總劑量至多約為2 g，取決於投予途徑。本發明活性劑之示例性劑量範圍為約0.01 mg/kg至約10 mg/kg、從約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、從約1 mg/kg至約10 mg/kg、從約1 mg/kg至約5 mg/kg、從約0.01 mg/kg至約1 mg/kg、或從約0.1 mg/kg至約1 mg/kg。文獻中提供了關於特定劑量與運輸方法的指導。應體認到，治療可能需要單次投予治療上有效劑量或多次投予治療上有效劑量之本發明活性劑。舉例而言，一些醫藥組成物可每3至4天、每週、或每兩週一次、或一個月內一次投予，其取決於特定組成物之配方、半衰期及清除率。醫藥組成物可任意地包含一或多個賦形劑及/或額外的活性劑。

乙詞「賦形劑」包括填充劑、黏合劑、崩解劑、塗料、吸附劑、抗黏附劑、助流劑、防腐劑、抗氧化劑、調味劑、著色劑、甜味劑、溶劑、共溶劑、緩衝劑、螯合劑、黏度賦予劑、表面活性劑、稀釋劑、保濕劑、載劑、稀釋劑、防腐劑、乳化劑、安定劑及張力調節劑。在技術人員之知識範圍內，選擇適用之賦形劑以製備所需之本發明醫藥組成物。用於本發明醫藥組成物之示例性載劑包括鹽液、緩衝鹽液、葡萄糖、及水。典型而言，適用賦形劑之選擇，將尤其取決於所使用之活性劑、欲治療之疾病、及所需之醫藥組成物配方。

本發明進一步提供醫藥組成物，其包含前面指定之一或多個本發明活性劑(例如，宿主細胞或iTCR構築體)，及適用於治療及/或預防欲治療疾病之一或多個額外的活性劑。組合適用之活性成分的較佳實例包括習知之抗癌藥物，如順鉑(cis-platin)、美登素(maytansine)衍生物、拉奇黴素(rachelmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、多西紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、吉西他濱(gemcitabine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、美法崙(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、索菲莫德索替芬II (sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替康(topotecan)、三甲曲沙(trimetreate)葡萄醣醛酸、奧里斯他汀E (auristatin E)、長春新鹼(vincristine)及多柔比星(doxorubicin)；以及胜肽細胞毒素，如蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假單胞菌細菌外毒素A、DNAase及RNAase；放射性核素，如碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210與213、錒225及砈213；前藥，如抗體導向酵素前藥；免疫刺激劑，如IL-2、趨化因子，如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白質等、抗體或其片段，如抗CD3抗體或其片段、補體活化劑、異種蛋白質結構域、同種異體蛋白質結構域、病毒/細菌蛋白質結構域及病毒/細菌胜肽。有多種途徑適合投予本發明醫藥組成物。典型而言，進行腸胃投予。腸胃外運輸方法包括局部、動脈內、肌肉、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈、腹膜內、子宮內、陰道內、舌下或鼻內投予。

本發明醫藥組成物可配製成多個形式，尤其取決於所使用之活性劑，如固體、液體、氣體或凍乾形式，且可為尤其是，軟膏、乳膏、透皮貼劑、凝膠、粉末、片劑、溶液、氣溶膠、顆粒、丸劑、懸浮液、乳液、膠囊、糖漿、液體、酏劑、提取物、酊劑或液體提取物之形式，或特別適合所需投予方法的形式。習知用於生產藥劑之方法描述於22nd edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012)，且可包括，例如，常規之混合、溶解、製粒、製糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或凍乾方法。醫藥組成物包含，例如，本文所述之宿主細胞，其典型上將以液體形式提供，且較佳為包含一醫藥上可接受緩衝液。在製備本發明之醫藥組成物後，其可置於合適的容器中，並標記用於治療指定的病症。此標記將包括，例如，投予之量、頻率及方法。

鑑於上述情況，本發明因此提供如本文所述之蛋白質(例如，iTCR)、核酸、載體及/或宿主細胞，以作為藥劑。「治療」乙詞在其所有語法形式中包括對有需求之受試者的治療或預防性治療。「治療或預防性治療」包含旨在完全預防臨床及/或病理表現的預防性治療，或旨在改善或緩解臨床及/或病理表現的治療。因此，「治療」乙詞亦包括改善或預防疾病。

在本文中，「受試者」或「個體」或「動物」或「病患」等詞可互換使用，其意指任何受試者，特別是需要治療的哺乳類動物受試者。哺乳類動物受試者通常包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、乳牛、及其類似物。然而，易理解的是，本文提供之蛋白質(例如，iTCR)、核酸、載體、宿主細胞及醫藥組成物特別地設想用於治療人類受試者。

在治療方面，本發明之蛋白質(例如，iTCR)、核酸、載體(如病毒載體)或宿主細胞可直接投予有需求之受試者。該方法之步驟可包含(a)提供一或多個本發明之(i)蛋白質(例如，iTCR)、(ii)核酸、(iii)載體、(iv)宿主細胞、及/或(v)醫藥組成物；以及(b)投予有需求之受試者一或多個(i)-(v)。任意地，該方法可包含一進一步之癌症治療步驟，如放射線治療，或投予一或多個抗癌試劑。

本發明之治療步驟亦可包含(a)提供一受試者樣本，該樣本包含淋巴細胞；(b)提供一或多個本發明之蛋白質(例如，iTCR)、核酸、載體、宿主細胞及/或醫藥組成物；(c)將步驟(b)之(i)至(v)之一或多者導入步驟(a)之淋巴細胞中，從而取得改良之淋巴細胞；(d)將步驟(c)之改良之淋巴細胞投予有需求之受試者或病患。步驟(a)提供之淋巴細胞可特別設想為前述之「效應子宿主細胞」，並有利地選自於T細胞、NK細胞及/或NKT細胞，尤其是CD8⁺ T細胞；以及可取自一先前之步驟(a’)，其係利用本領域習知之常規方法，從受試者之樣本，特別是由血液樣本取得。然而，還可想到使用其他淋巴細胞，其較佳為能表現本發明蛋白質(例如，iTCR)及發揮本文所述之所需生物學效應子功能。此外，該淋巴細胞之選擇，典型上將與受試者的免疫系統兼容，亦即，其較佳為將不引發免疫原性反應。舉例而言，可想像使用「通用型接受體細胞」，亦即，普遍相容的淋巴細胞，且發揮所需的生物效應子功能，在體外可生長與擴增。因此，使用此類細胞將不需要如步驟(a)之取得與提供受試者自身的淋巴細胞。步驟(c)之離體導入可利用將本文所述之核酸或載體通過電穿孔法導入淋巴細胞中，或利用病毒載體感染淋巴細胞來進行，如先前在效應子宿主細胞說明中所述之慢病毒或反轉錄病毒載體。其他可想到的方法包括使用轉染試劑，如微脂體或暫時性RNA轉染。利用諸如(反轉錄)病毒載體或暫時性RNA轉染，將抗原特異性TCR基因轉移至(初代) T細胞中，代表用於產生腫瘤相關抗原特異性T細胞的有力工具，其隨後可重新導入供體中，其中其特異性地靶向並破壞表現該抗原之腫瘤細胞。

鑑於上述情況，本發明之進一步態樣從而為本文他處所述之蛋白質(例如，iTCR)、核酸序列、載體及/或宿主細胞的用途，以產生改良之淋巴細胞。用於將諸如核酸與載體導入淋巴細胞之工具與方法為本領域習知，且如本文之前述。

必須注意的是，除非文中另有明確指明，本文中使用的單數形式「一」、「一者」、及「該」等詞包括其複數參考體。因此，舉例而言，參考「試劑」時，其包括一或多個此類不同試劑，且參考「該方法」時，包括參考本領域普通技術人員習知之同等步驟與方法，以改良或取代本文所述之方法。

除非另有指明，「至少」乙詞在一系列或最小量的元件之前，應理解為意指該系列之每一元件。本領域之技術人員應理解或能確認，使用不超過常規之實驗，許多等同於本發明之特定具體實施例。此類等同物旨在包含於本發明中。同時，「至少」乙詞包括確切數量與上限，例如，「至少5」亦涵蓋「確切為5」或「至少3」包含「確切為3」之意思。

當本文中使用「及/或」乙詞時，其包括「及」、「或」與「由該詞連接之元件的全部或任何其他組合」之意思。

本文中使用的「約」或「近似」等詞意指一給定數值或範圍之20%以內，較佳為10%以內，且更佳地5%以內。然而，其亦包括具體數字，例如，「約20」包括20。

乙詞「小於」、「至少」或「大於」包括具體數字。舉例而言，小於20意指小於或等於。同樣地，超過或大於分別意指超過或等於，或大於或等於。

在整個說明書及其後之申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則「包含」乙詞，以及諸如「包含有」與「其包含」等變化詞，將理解為暗示涵蓋陳述之整數或步驟或一組整數或步驟，但不排除任何其他整數或步驟，或一組整數或步驟。使用於此，「其包含」乙詞可以「其含有」或「其包括」等詞，或使用於此時有時可以「其具有」乙詞取代。同時，「其包含」及其變化詞亦包括「由~組成」之意思。

使用於此，「由~組成」排除申請專利範圍要素中未指定之任何元件、步驟、或成分。使用於此，「基本上由~組成」不排除不會對申請專利範圍中基本與新穎特徵產生實質性影響的材料或步驟。

在本文之各實例中，「其包含」、「基本上由~組成」及「由~組成」等詞之任一者可以其他二詞替換。

應理解到，本發明不侷限於本文所述之特定方法、方案、材料、試劑、及物質等，因此可變。於此使用之術語係僅旨在描述特定具體實施例，且非旨在侷限本發明之範疇，其僅由申請專利範圍定義。

本說明書全文中引用的所有出版品與專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版品、製造商說明書、指示等)，不論上下文，在此全部併入本案以作為參考資料。本文中任何內容均不應理解為，承認本發明無權憑藉先前之發明，而先於揭露此類內容。若併入參照之材料與本說明書相矛盾或不一致，則說明書優先於任何此類材料。

本文中使用的「多核苷酸」或「核酸」等詞包含一序列之多核糖核苷酸與多去氧核糖核苷酸，如修飾或未修飾之RNA或DNA，各為單股及/或雙股形式之線性或環形、或其混合物，包括雜合分子。本發明之核酸從而包含DNA (如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA (如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivt RNA)、其組合或其衍生物(如PNA)。「核酸序列」或「(多)核苷酸序列」等詞於此可互換使用。同樣地，技術人員清楚的是，「胺基酸序列」、「多胜肽」或蛋白質等詞於此可互換使用。

多核苷酸可包含常規之磷酸二酯鍵或非常規之鍵(例如，醯胺鍵，如在胜肽核酸(PNA)中所發現者)。本發明之多核苷酸亦可含有一或多個修飾之鹼基，例如，三苯基化鹼基(tritylated bases)及異常之鹼基，例如，肌苷(inosine)。亦可想到其他修飾，包括化學、酵素或代謝修飾，只要本發明之結合分子可從多核苷酸表現即可。多核苷酸可以本文他處定義之分離形式供應。多核苷酸可包括調節序列，例如，轉錄控制元件(包括啟動子、強化子、操作子、抑制子、及轉錄中止信號)、核醣體結合位點、內含子(introns)、或其類似物。

本發明係進一步有關用於篩選或測試iTCR功能之方法，其步驟包含導入報導子基因(例如，螢光蛋白，如GFP、YFP、CFP、eGFP、ieGFP；較佳為ieGFP)，其利用一載體(例如，慢病毒載體，如pCDH)導入宿主細胞(例如，TCR^- 宿主細胞；較佳為T淋巴細胞，如Jurkat-76細胞)；進一步將一或多個核酸分子導入相同的宿主細胞，其包含本文所述與提供之核酸序列A與核酸序列B (較佳為位於表現片匣上；「iTCR構築體」)，其利用一載體(例如，慢病毒載體，如pCDH；較佳為與報導子基因相同的載體)；培養該宿主細胞與一抗原胜肽，其可由(i)TCR伴隨本文所述之二聚合作用試劑(例如，以太莫西芬或因多西芬用於雌性激素受體(例如，ETR2)，其為二聚合作用結構域)辨識；以及比較報導子與對照組細胞之基因傳訊，其中導入相同載體構築體，除了人類原始TCR基因片匣以外(亦即，分別為SEQ ID NOs. 2與4之TCR恆定型α鏈與β鏈，而無二聚合作用結構域 鍵聯恆定型α鏈與β鏈之下游)。可利用本領域之習知方法測定(i)TCR併入細胞膜，例如，利用本文所示之流式細胞術(比照例如，圖4與實施例3)。iTCR構築體處理之宿主細胞與原始TCR處理之彼等細胞具有可比較的傳訊能力，表示成功之本發明iTCR功能。本文中「可比較的」可指，例如，若具有iTCR構築體之宿主細胞與具有原始TCR構築體之宿主細胞有一樣強的傳訊能力，為至少60%、70%、80%、或90%，較佳為與具有原始TCR構築體之宿主細胞有一樣強的傳訊能力，為至少93%、95%、96%、98%、98,5%或99%。

下列實例用於說明本發明，然而，不侷限本發明之範疇與申請專利範圍。

實施例

縮寫與同義詞

實施例 1 ：使得 T 細胞受體可誘導

由於目標在於破壞TCRα鏈與β鏈配對，發明人搜尋TCRα恆定區與TCRβ恆定區的胺基酸突變，以破壞TCRα鏈與β鏈配對，但不會干擾TCRα鏈與CD3 ε和CD3 δ的配對及TCRβ鏈與CD3 γ和CD3 ε的配對。欲鑑定此類胺基酸，發明人進行大量的文獻搜尋，並考慮習知TCR的晶體結構，以使TCRα鏈與β鏈與CD3次單元的交互作用保持不變(表1與表2)。欲使TCR變成可誘導，將二聚合化(如ERT2)或雜二聚合化(如FKBP、FRB)之結構域插入各突變之非配對α鏈與β鏈恆定區的C端。藉由將含有此iTCR的細胞暴露於二聚合化試劑(如4-羥基太莫西芬，4-(1-[4-(二甲基胺基乙氧基)苯基]-2-苯基-1-丁烯基)酚，Sigma-Aldrich)或雜二聚合化試劑(如AP21967，23,27-環氧基-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧雜氮雜環三十一烷；Sigma-Aldrich)，TCRα-CD3εδ 複合體應在內質網與TCRβ-CD3εγ複合體配對，且隨後TCRα-CD3εδ-TCRβ-CD3εγ應在高爾基氏體與CD3ζ結合，併運送至細胞表面(Feige MJ., et al. J Biol Chem. 2015 Oct 30; 290(44):26821-31)。一旦iTCR位於細胞表面，應可辨識其pMHC複合體，其存在於抗原呈現細胞(APC)，等同於原本的非誘導型TCR (圖1)。

實施例 2 ：測試 MHC 第 II 類限制型 iTCRα 鏈與 β 鏈配對之破壞及利用 4- 羥基太莫西芬誘導 Jurkat-76 細胞中 α 鏈與 β 鏈配對 將含有iTCR-G11-3之合成片匣選殖至慢病毒載體pCDH，並轉導至0.5x10⁶ TCR^-/- Jurkat-76細胞(圖2-6)。iTCR-G11-3 TCR片匣含有MHC第II類限制型TCR G11-3的V-α與V-β序列(Milosevic S. et al., J Virol 2006 Nov 80(21):10357-64)，α鏈與β鏈恆定區之突變顯示於表1，且ERT2位於各α鏈與β鏈恆定區之C端。ERT2為雌性激素受體之人類配體結合結構域的突變形式，其可結合太莫西芬活性代謝物，而非雌二醇(estradiol)(Feil R., et al., Biochem Biophys Res Commun. 1997 Aug 28;237(3):752-7)。ERT2核苷酸與胺基酸序列係分別列於SEQ ID NO: 7與8。iTCR-G11-3的表現缺失，可利用攜帶iTCR-G11-3之非誘導型Jurkat細胞進行測試，其係利用流式細胞術結合抗CD3抗體(CD3-PECy7，SK7，557851，BD)與抗TCR抗體(panTCR-PE，IP26，B49177，Beckman Coulter)進行染色。若不以4-羥基太莫西芬誘導，則細胞表面上無法檢測出CD3或TCR。相反地，以10 µM 4-羥基太莫西芬誘導攜帶iTCR-G11-3的Jurkat細胞，在誘導後6h，細胞表面可檢測到TCR與CD3 (圖2)。欲確定可檢測到iTCR表面表現之最早與最晚時間點，以5或10µM 4-羥基太莫西芬誘導攜帶iTCR-G11-3的Jurkat細胞，並在處理後0.5h、1h、4h、6h及24h，測定CD3與TCR表現(圖3a與3b)。以非誘導型Jurkats與未轉導的TCR^-/- Jurkats作為檢測TCR/CD3表面表現的陰性對照組。表面iTCR表現可在誘導後4小時檢出，其表現甚至在24小時後持續。

實施例 3 ：以 4- 羥基太莫西芬誘導 Jurkat-76 細胞中 iTCRα 鏈與 β 鏈配對後測試 MHC 第 II 類限制型 iTCR 功能 由於TCR轉導之Jurkat細胞在pMHC辨識時通常不會分泌細胞介素，故發明人以誘導型NFAT反應型GFP報導子片匣(ieGFP)作為功能性TCR傳訊的判讀。將ieGFP片匣選殖至慢病毒載體pCDH (System Biosciences)並轉導至0.5x10⁶ TCR^-/- Jurkat-76細胞。攜帶ieGFP之相同Jurkat細胞係隨後以攜帶iTCR-G11-3片匣之慢病毒載體(圖4-6)轉導。亦將wt G11-3 TCR轉導至攜帶ieGFP之Jurkat細胞，作為G11-3 TCR傳訊之陽性對照組(圖4與5c)。將充填不相關之胜肽「PEV」 (PEVWILSPLLRHG)或G11-3 TCR可辨識之胜肽「TDA」 (TDAWRFAMNYPRNPT)的LCL細胞(作為抗原呈現細胞)培養於iTCR-G11-3-ieGFP Jurkat細胞或wt-G11-3-ieGFP Jurkat細胞。胜肽之充填濃度為1x10^-5 M。如預期，在以5µM 4-羥基太莫西芬誘導並與LCL+TDA培養後，GFP訊號，亦即功能性TCR傳訊，僅見於表現wt-G11-3之Jurkat細胞或表現iTCR-G11-3之Jurkat細胞(圖4)。進行流式細胞術分析，其中以抗CD3抗體(CD3-PECy7，SK7，557851，BD)與抗TCR抗體(panTCR-PE，IP26，B49177，Beckman Coulter)染色。

實施例 4 ：測定 pMHC 辨識後之 iTCR 傳訊速度及 TCR 訊息瀑流在移除 4- 羥基太莫西芬後之關閉速度 欲測定iTCR-G11-3之傳訊速度，以1µM 4-羥基太莫西芬誘導攜帶iTCR-G11-3與ieGFP之1x10⁴ Jurkat細胞隔夜(ON)。欲監測無誘導之TCR表現缺失，以維持不處理之攜帶iTCR-G11-3與ieGFP的Jurkat細胞作為對照組。將充填PEV不相關之胜肽的LCL (圖5a)或充填TDA相關之胜肽的LCL (圖5b)加入培養基中，並以Incucyte裝置隨時間追蹤GFP訊號。GFP訊號在以充填相關之胜肽的APC (抗原呈現細胞)培養後1小時開始產生(圖5b與5c)，且訊號在培養後約7小時繼續增加(圖5c)。胜肽之充填濃度為1x10^-5 M。有趣的是，隨著時間推移，由iTCR-G11-3 TCR引發的GFP訊號，總是比由wt-G11-3 TCR引發的訊號更高(圖5c)。當不相關之胜肽存在於LCL上表現iTCR的T細胞以作為APCs時，未觀察到GFP的誘導。 欲分析在移除4-羥基太莫西芬後，iTCR可向下調節的速度，首先以0.05µM或0.1µM 4-羥基太莫西芬誘導攜帶iTCR-G11-3與ieGFP之Jurkat細胞隔夜。隔天洗去細胞的4-羥基太莫西芬或不清洗(陽性對照組)，並在移除4-羥基太莫西芬後，以充填相關之TDA胜肽的LCL培養1h、2h或4h，隨後以Incucyte檢測GFP訊號(圖6)。相較於不清洗之對照組，細胞在以0.05µM 4-羥基太莫西芬誘導1h後洗去二聚合化試劑及4h後洗去0.1µM 4-羥基太莫西芬，可見到GFP訊號下降。因此，在移除二聚合化試劑後，可迅速誘導iTCR且迅速向下調節。

實施例 5 ：在以 4- 羥基太莫西芬誘導 Jurkat-76 細胞中 iTCRα 鏈與 β 鏈配對後測試 MHC 第 I 類限制型 iTCR 之表現與功能 將含有iTCR-NY-ESO TCR與由P2A隔開的mTag-BFP之合成片匣選殖至慢病毒載體pCDH，並轉導至0.5x10⁶ TCR^-/- Jurkat-76細胞(圖7與8)。由於編碼iTCR之載體亦含有藍色螢光蛋白(mTag-BFP)以作為報導子基因，其係分開表現，所有轉導細胞皆為BFP陽性。iTCR-NY-ESO TCR片匣含有MHC第I類限制型TCR之V-α與V-β序列，其辨識NY-ESO抗原 (Benchmark NY-ESO TCR；參照WO 2005/113595)，α鏈與β鏈恆定區之突變顯示於表1，且ERT2位於各α鏈與β鏈恆定區之C端。iTCR-NY-ESO的表現缺失，可利用攜帶iTCR-NY-ESO之非誘導型Jurkat細胞進行測試，其係利用流式細胞術結合抗CD3抗體與抗TCR抗體進行染色，且不以4-羥基太莫西芬誘導的細胞表面無法檢測到CD3或TCR (圖7a)。相反地，以1µM 4-羥基太莫西芬誘導攜帶iTCR-NY-ESO之Jurkat細胞後，細胞表面上可檢測到TCR與CD3 (圖7b)。進行流式細胞術分析，其中以抗CD3抗體(CD3-PECy7，SK7，557851，BD)與抗TCR抗體(panTCR-PE，IP26，B49177，Beckman Coulter)染色。 欲確定是否iTCR-NY-ESO在誘導後具有功能，以攜帶iTCR-NY-ESO片匣之慢病毒載體轉導攜帶ieGFP之Jurkat細胞。亦將wt NY-ESO TCR轉導至攜帶ieGFP之Jurkat細胞，以作為NY-ESO TCR傳訊之陽性對照組。將充填不相關之胜肽VLDGLDVLL (圖8a)或NY-ESO TCR可辨識之相關胜肽SLLMWITQC (圖8b)的T2細胞培養於iTCR-NY-ESO-ieGFP Jurkats或wt-NY-ESO-ieGFP Jurkats。胜肽之充填濃度為1x10^-5 M。如預期，在以1µM 4-羥基太莫西芬誘導並與T2+相關胜肽培養後，GFP訊號，亦即功能性TCR傳訊，僅見於表現wt-NY-ESO之Jurkats或表現iTCR-NY-ESO之Jurkats。閘控策略為閘控CD19^陰性 、BFP陽性細胞，且隨後測定ieGFP螢光(CD19-APCeF780，HIB19，47-0199-42，eBioscience)。

實施例 6 ：在以因多西芬誘導 CD8⁺ PBL 中 iTCRα 鏈與 β 鏈配對後測試 MHC 第 I 類限制型 iTCR 之表現與功能 以商用細胞分離套組(CD8+未接觸型)富集化取自健康供體PBL的CD8⁺ 細胞，並以攜帶iTCR-NY-ESO片匣之慢病毒載體轉導或以攜帶wt-NY-ESO之慢病毒載體作為陽性對照組。由於以4-羥基太莫西芬誘導 iTCR-NY-ESO，在所嘗試的任何濃度下皆無法在PBL中誘導iTCR-NY-ESO (數據未顯示)，發明人使用另一活性太莫西芬代謝物，稱作因多西芬。攜帶iTCR-NY-ESO之CD8⁺ 細胞以20µM因多西芬誘導隔夜或不處理。細胞隨後進行CD3 (CD3-PECy7，SK7，557851，BD)與特異性V-β家族BV6-5 (抗體：TRBV6-5-PE，IMMU 222，IM2292，Beckman Coulter)染色。以因多西芬處理，造成細胞表面誘導iTCR-NY-ESO (圖9)。不處理則僅可見到內源性表現BV6-5陽性細胞。 欲確定是否iTCR-NY-ESO在PBL中誘導後具有功能，將充填相關之胜肽SLLMWITQC或不相關之胜肽VLDGLDVLL的T2細胞培養於1、5、10或20µM因多西芬誘導之iTCR-NY-ESO CD8⁺ PBL或無誘導之iTCR-NY-ESO CD8⁺ PBL或攜帶wt-NY-ESO之CD8⁺ PBL以作為陽性對照組。胜肽之充填濃度為1x10^-5 M。在一天後，收集培養基上清液，並進行標準IFN-γ ELISA分析。在wt-NY-ESO，可檢測到高程度之IFN-γ，其與因多西芬處理無關，而在iTCR-NY-ESO，則僅在以因多西芬誘導後(圖9)。彼等結果顯示，iTCR-NY-ESO可在PBL表面上誘導，且具有如同wt-NY-ESO TCR的功能特徵。 在進一步之實驗中，發現攜帶i-TCR之T細胞具有細胞毒性，且可消除標靶。再次，以i-NY-ESO (MHC-I限制型TCR)轉導之CD8⁺ PBL或表現wt-NY-ESO之CD8⁺ PBL，係以10µM因多西(+ induction)誘導20h或不處理(無誘導)。隨後，細胞以表現NuclightRed且充填相關之胜肽(+pept)的T2細胞或以NuclightRed細胞且充填不相關之對照組胜肽(+ctrl)的T2細胞進行誘導。利用Incucyte Zoom裝置，隨時間追蹤T2細胞之毒殺效果。圖10 A顯示T細胞與標靶細胞在誘導後42h之圖示。在上面部分，T細胞不以因多西芬誘導。下面部分顯示，T細胞以因多西芬誘導。T2 NuclightRed細胞出現在中間，且為深灰色。效應子細胞為淺灰色。在圖10 B中，顯示T2 NuclightRed細胞隨時間推移之密度(至多42h)。在圖10中，細胞標記為空白組(Mock)者，代表未轉導的CD8+PBL。

實施例 7 ：測試以 wt TCR 及以攜帶 β 鏈突變 K4V 、 N5P 及 Y37K 之 TCR (SEQ ID NO 4 ，參見表 2) 轉導之 TCR-/- 細胞的 CD3 與 TCR 表現 Jurkat-76 TCR-/-以辨識PRAME抗原之野生型TCR (wt TCR)及以攜帶恆定區β鏈胺基酸突變K4V、N5P及Y37K (SEQ ID NO:4)且辨識PRAME之TCR進行轉導。空白對照組為未轉導之Jurkat-76 TCR-/-細胞。進行流式細胞術，並評估細胞的CD3與TCR表現。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。如圖13中可見，突變之TCR顯示無CD3與TCR表現，其顯示突變之TCR無法在細胞膜上表現。

實施例 8 ： β 鏈之突變 K4V 、 N5P 及 Y37K (SEQ ID NO 4 ， 表 2) 破壞 TCR 表現 ，其可由含於 α 鏈與 β 鏈恆定區 C 端之 雌性激素受體的二聚合作用解救 。 以恆定區α鏈與β鏈C端攜帶雌性激素受體之G11-3 TCR及以恆定區β鏈之胺基酸殘基K4V、N5P及Y37K (Seq ID 4，表2)轉導含有ieGFP報導子之Jurkat-76。細胞以1µM因多西芬誘導24h。隨後，將細胞培養於充填不相關之胜肽或相關之胜肽的LCL細胞。LCL:Jurkat-76在共同培養基中之比率為1:1。在共同培養後24h進行流式細胞術，並評估細胞的eGFP表現。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。圖14顯示ieGFP係表現以響應相關之胜肽。此顯示，攜帶β恆定鏈位置4、5及37突變之TCR，在因多西芬誘導之二聚合作用後仍具有功能。因此，恆定區β鏈之胺基酸位置4、5及37 (SEQ ID 4)可經突變，且在以因多西芬誘導二聚合作用後，不會破壞TCR-CD3複合體。

無

圖 1 顯示誘導型TCR的示意圖。點突變(「星號」)係導入一給定TCR的恆定區(「c」)α鏈(「α」)與β鏈(「β」)。由於突變所致，TCRα-CD3與TCRβ-CD3複合體無法在內質網中配對。二聚合化結構域(「DD」)或替代的雜二聚合化結構域(「HD」)係插入相同TCR之恆定區α鏈與β鏈的c端。當導入二聚合化或雜二聚合化試劑(「DA或HA」)時，可發生α鏈與β鏈的配對，且隨後形成含有CD3 (「CD3」)與TCR的功能團簇，包括CD3 ζ鏈 (「ζ鏈，ζ鏈」)，因此TCR可在細胞表面上表現。

圖 2 顯示TCR^- Jurkat-76 (Jurkat 76細胞為CD8陰性人類T細胞淋巴瘤Jurkat的TCRα−與β−衍生株，其由M. Heemskerk友情提供)細胞以誘導型TCR G11-3 (iTCR-G11-3，MHC-II限制型TCR)轉導，並以流式細胞術測試CD3-TCR複合體在以10 µM 4-羥基太莫西芬(4-羥基太莫西芬，4-(1-[4-(二甲基胺基乙氧基)苯基]-2-苯基-1-丁烯基)酚，Sigma-Aldrich，儲液為5 mM且溶於DMSO)誘導6h後的細胞膜表現。4-羥基太莫西芬在含有細胞(中間圖示)或不添加4-羥基太莫西芬(「無太莫西芬」，最左邊圖示與最右邊圖示)的細胞培養基中稀釋至10 µM。以未轉導的Jurkat-76細胞作為TCR表現的陰性對照組，並以轉導wt G11-3的Jurkat-76 (Milosevic S. et al., J Virol 2006 Nov 80(21):10357-64)作為G11-3 TCR表現的陽性對照組。細胞以抗CD3-PECy7抗體與抗panTCR-PE抗體染色。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 3a 顯示TCR^- Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3轉導，並以流式細胞術評估CD3-TCR複合體在以10 µM 4-羥基太莫西芬或無太莫西芬誘導的細胞膜表現。以未轉導的TCR^- Jurkat-76細胞作為TCR表現的陰性對照組。細胞以抗CD3-PECy7抗體與抗panTCR-PE抗體染色，並在處理4-羥基太莫西芬0.5h、1h、4h、6h及24h後進行流式細胞術分析。圖 3b 顯示以5 µM或10 µM 4-羥基太莫西芬隨時間(0.5h、1h、4h、6h及24h)誘導iTCR-G11-3的動力學。細胞以抗CD3-PECy7抗體與抗panTCR-PE抗體染色，並在處理4-羥基太莫西芬0.5h、1h、4h、6h及24h後進行流式細胞術分析。利用graphPad Prism 7繪圖。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 4 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3與誘導型NFAT反應型GFP報導子(ieGFP)轉導，並以5 µM 4-羥基太莫西芬誘導6h。將充填相關之TDAWRFAMNYPRNPT (「TDA」)胜肽或不相關之PEVWILSPLLRHG (「PEV」)胜肽的LCL加入培養基中。共培養基中之LCL:Jurkat-76比率為1:1。以wt (野生型) G11-3轉導的Jurkat-76作為陽性對照組。在共培養24h後進行流式細胞術分析，並評估細胞的CD3、TCR及GFP表現。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 5a 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3與ieGFP轉導，並以1 µM 4-羥基太莫西芬誘導隔夜或不處理(無)。將充填不相關之PEV胜肽的LCL加入培養基中，接著利用Incucyte Zoom裝置(IncuCyte Zoom HD/2CLR System，Essen Bioscience)隨時間(所示者為1h、1.5 h及3.5h)誘導GFP。圖 5b 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3與ieGFP轉導，並以1 µM 4-羥基太莫西芬誘導隔夜或不處理(無)。將充填相關之TDA胜肽的LCL加入培養基中，接著利用Incucyte Zoom裝置隨時間(所示者為1h、1.5 h及3.5h)誘導GFP。圖 5c 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3與ieGFP轉導，並以0.1 µM、1 µM或5 µM 4-羥基太莫西芬誘導隔夜。將充填相關之TDA胜肽的LCL加入培養基中，接著利用Incucyte Zoom裝置誘導GFP歷時13h。以wt-G11-3轉導的Jurkat-76細胞作為陽性對照組。所示者為首先14小時的動力學。利用Excel繪圖。GFP螢光強度於y軸說明，即綠色校正單位(green calibration units；GCU) x mm² 。

圖 6 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-G11-3與ieGFP轉導，並以0.05 µM或0.1 µM 4-羥基太莫西芬誘導隔夜。將樣本清洗，並在清洗1h、2h及4h後，加入充填相關之TDA胜肽的LCL，接著利用Incucyte Zoom裝置誘導GFP。在陽性對照組(最左欄圖片)方面，將充填相關之TDA胜肽的LCL加入培養基中，且不進行清洗。

圖 7a 顯示TCR^- Jurkat-76細胞以誘導型TCR iTCR-NY-ESO (iTCR-NY-ESO、MHC-I限制型TCR，上圖)或以wt-NY-ESO TCR (下圖)轉導，並以流式細胞術測試CD3-TCR複合體的細胞膜表現。轉導的細胞亦表現BFP (藍色螢光蛋白，編碼iTCR之載體亦含有藍色螢光蛋白(mTag-BFP)，以作為報導子基因，其係分開表現，因此僅有轉導之細胞為BFP陽性)(左圖)。右圖顯示BFP+細胞的CD3與TCR染色。細胞以抗CD3-PECy7抗體與抗panTCR-PE抗體染色。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。圖 7b 顯示TCR^- Jurkat-76細胞以誘導型TCR NY-ESO (iTCR-NY-ESO，MHC-I限制型TCR，上圖)或以wt-NY-ESO TCR (下圖)轉導，並以1 µM 4-羥基太莫西芬(儲液為5 mM且溶於DMSO)誘導。在含有細胞的細胞培養基中，將4-羥基太莫西芬稀釋成1 µM。轉導的細胞亦表現BFP (左圖)。右圖顯示BFP+細胞的CD3與TCR染色。細胞以抗CD3-PECy7抗體與抗panTCR-PE抗體染色。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 8a 顯示將iTCR-NY-ESO-mTag-BFP (MHC-I限制型TCR)及ieGFP轉導的Jurkat-76細胞培養於以不相關之VLDGLDVLL胜肽或以相關之胜肽SLLMWITQC填充的T2細胞。在共培養基中，T2:Jurkat-76的比率為1:1。在以CD19共培養染色24h後，進行流式細胞術，並測定藍色螢光、APC與FITC通道的螢光。閘控策略為閘控CD19^- (陰性)(因此排除T2-標靶細胞，其為CD19⁺ (陽性))與BFP⁺ 細胞，並在FACS中測定FITC通道的ieGFP螢光。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。圖 8b 顯示Jurkat-76細胞以iTCR-NY-ESO (MHC-I限制型TCR)及以ieGFP轉導，並以1 µM因多西芬((E/Z)-因多西芬鹽酸鹽水合物，Sigma-Aldrich))誘導隔夜，接著培養於充填不相關之VLDGLDVLL (「T2-irr. Pept.」)胜肽或相關之胜肽SLLMWITQC (「T2-rel. pept.」)的T2細胞。在共培養基中，T2:Jurkat-76的比率為1:1。在共培養24h後進行流式細胞術，並評估細胞的BFP (轉導體)、CD3、TCR、及GFP表現。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 9 顯示以iTCR-NY-ESO (MHC-I限制型TCR)轉導的CD8⁺ PBL或表現wt-NY-ESO的CD8⁺ PBL，並以1、5、10或20 µM因多西芬誘導隔夜或不誘導(無因多西芬)。在誘導24h後，將充填相關之胜肽SLLMWITQC或不相關之胜肽VLDGLDVLL的T2細胞加入培養基。利用標準IFN-γ ELISA，檢測IFN-γ分泌，其係於T2標靶刺激24h後以培養基上清液進行。在誘導48h後，進行流式細胞術，並評估細胞的BFP (轉導體)、CD3及BV6-5。所示之示例圖為iTCR-NY-ESO轉導之CD8⁺ PBL不誘導或以20 µM因多西芬誘導。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。利用graphPad Prism 7繪圖。

圖 10 顯示以i-NY-ESO (MHC-I限制型TCR)轉導的CD8⁺ PBL或表現wt-NY-ESO的CD8⁺ PBL，並以10 µM因多西芬誘導20h (+誘導)或未處理(無誘導)。隨後，將細胞培養於表現NuclightRed且充填相關之胜肽(+pept)的T2細胞或充填不相關之對照組胜肽(+ctrl)的T2 NuclightRed細胞。利用Incucyte Zoom裝置，觀察到隨時間殺死T2細胞。A) T細胞與標靶細胞在培養42h後的顯示圖。在上面部分，T細胞不以因多西芬誘導。下面部分顯示T細胞以因多西芬誘導。T2 NuclightRed細胞出現在中間，且為深灰色。效應子細胞為淺灰色。B) T2 NuclightRed細胞隨時間(最多42h)之密度圖。空白組(mock)為未轉導的CD8+PBL。

圖 11 顯示依據人類α恆定區之IMGT，TCRα恆定區的胺基酸編號命名：http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/index.php?species=Homo%20sapiens&group=TRAC&gene=TRAC1。

圖 12 顯示依據人類β恆定區等位基因C1之IMGT，TCRβ恆定區的胺基酸編號命名： http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/index.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBC&gene=TRBC1。

圖 13 顯示TCR^- Jurkat-76細胞以辨識PRAME抗原之wt TCR (wt TCR)及以辨識PRAME抗原(其中恆定區β鏈(SEQ ID 4)的胺基酸殘基4、5及37分別突變成V、P及K)之TCR轉導。空白對照組為Jurkat-76 TCR-/-未轉導細胞。利用流式細胞術，評估細胞的CD3與TCR表現。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

圖 14 顯示以恆定區α鏈與β鏈兩者之C端攜帶雌性激素受體的G11-3 TCR及以恆定區β鏈(SEQ ID 4)胺基酸殘基4、5、及37分別突變成V、P及K轉導之含有ieGFP報導子的TCR^- Jurkat-76細胞。細胞以1 µM因多西芬誘導24h。隨後，細胞以充填相關之TDAWRFAMNYPRNPT胜肽(相關)或不相關之PEVWILSPLLRHG胜肽(不相關)的LCL細胞培養。在共培養基中，LCL:Jurkat-76的比率為1:1。在共培養24h後，進行誘導之eGFP的流式細胞術評估。利用分析軟體FlowJo V10繪圖。

下列實例旨在說明本發明，然而，不可視為侷限本發明之範疇及申請專利範圍。

無

Claims (15)

1. 一種含有一或多個核酸分子的組合組合，該一或多個核酸分子包含： (a) 核酸序列A，其包含： (i) 編碼與SEQ ID NO: 2至少90%相同胺基酸序列之核酸序列，相較於SEQ ID NO: 2，任意地包含位置44及/或47的胺基酸取代，及 (ii) 編碼誘導型二聚合作用結構域之核酸序列，其下游鍵聯至該編碼與SEQ ID NO: 2至少90%相同胺基酸序列之核酸序列；以及 (b) 核酸序列B，其包含： (i) 編碼與SEQ ID NO: 4至少90%相同胺基酸序列之核酸序列，相較於SEQ ID NO: 4，包含位置4、5、37、63、77及/或79的胺基酸取代，及 (ii) 編碼誘導型二聚合作用結構域之核酸序列，其下游鍵聯至該編碼與SEQ ID NO: 4至少90%相同胺基酸序列之核酸序列，類似於與該編碼與(a)(i)之SEQ ID NO: 2至少90%相同胺基酸序列之核酸序列鍵聯之二聚合作用結構域之位置，該二聚合作用結構域相應於鍵聯該編碼與(a)(i)之SEQ ID NO: 2至少90%相同胺基酸序列之核酸序列的二聚合作用結構域， 其中相較於SEQ ID NO: 2，該與(a)(i)之SEQ ID NO: 2至少90%相同之胺基酸序列包含至少一個，較佳為至少二個胺基酸取代，及/或 相較於SEQ ID NO: 4，該與(b)(i)之SEQ ID NO: 4至少90%相同之胺基酸序列包含至少一個，較佳為至少二個，更佳地至少三個胺基酸取代。
2. 如請求項1之組合，其中該核酸序列A與該核酸序列B係由單獨的核酸分子組成或含於一核酸分子中。
3. 如請求項1或2之組合，其中： (a) 相較於SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該(a)(i)之核酸序列編碼包含至少一個胺基酸取代之胺基酸序列，該取代選自於由： T44A與T47A組成之群組；及/或 (b) 相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸序列編碼包含至少一個胺基酸取代之胺基酸序列，該取代選自於由： K4V、N5P、Y37K、L63A、S77A、及R79A組成之群組，其中較佳為 (c) 相較於SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該(a)(i)之核酸序列編碼包含二個胺基酸取代之胺基酸序列，該二取代為T44A與T47A；以及 (d) 相較於SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，該(b)(i)之核酸序列編碼包含三個胺基酸取代之胺基酸序列，該三取代為K4V、N5P與Y37K或L63A、S77A、及R79A。
4. 如請求項1至3之組合，其中該二聚合作用結構域為同二聚合作用結構域或異二聚合作用結構域，較佳為選自於由mTOR之ERT2、FKBP、鈣調神經磷酸酶A (CNA)、CyP-Fas、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag、HaloTag、eDHFR及FRB結構域組成之群組。
5. 一種包含如請求項1至4中任一項定義之核酸序列A與核酸序列B的表現片匣，或至少二個表現片匣，其中至少一個表現片匣包含如請求項1至4中任一項定義之核酸序列A且至少一個表現片匣包含如請求項1至4中任一項定義之核酸序列B。
6. 一種包含一或多個如請求項5定義之表現片匣的載體，其中該載體較佳為反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
7. 一種包含如請求項1至4中任一項之組合、如請求項6之表現片匣或如請求項6之載體、及如請求項1至5中任一項定義之相應於鍵聯編碼與SEQ ID NO: 2至少90%相同胺基酸序列之核酸序列之二聚合作用結構域與鍵聯編碼與SEQ ID NO: 4至少90%相同胺基酸序列之核酸序列之二聚合作用結構域的二聚合作用試劑的套組，該二聚合作用試劑係能誘導該二聚合作用結構域之二聚合作用，其中該二聚合作用試劑係較佳為選自於由4-羥基太莫西芬、因多西芬、4-(1-[4-(二甲基胺基乙氧基)苯基]-2-苯基-1-丁烯基)酚、AP21967、及23,27-環氧基-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧雜氮雜環三十一烷、FK1012、FK506、FKCsA、雷帕黴素、香豆黴素、赤黴素、HaXS、及TMP-Htag組成之群組。
8. 一種包含如請求項1至4中任一項定義之核酸序列A與核酸序列B、如請求項5定義之表現片匣、或如請求項6定義之載體的宿主細胞，其中該宿主細胞較佳為T淋巴細胞，更佳地為人類T淋巴細胞，且該宿主細胞任意地包含如請求項7定義之二聚合作用試劑。
9. 一種由如請求項1至4中任一項定義之核酸序列A與核酸序列B編碼的蛋白質。
10. 一種以如請求項7定義之二聚合作用試劑用於二聚合化如請求項1至4中任一項定義之由核酸序列A編碼之蛋白質與由核酸序列B編碼之蛋白質的用途，其中該二聚合作用試劑較佳為因多西芬。
11. 一種用於二聚合化如請求項1至4中任一項定義之由核酸序列A編碼之蛋白質與由核酸序列B編碼之蛋白質的方法，其包含將如請求項7定義之二聚合作用試劑添加至該蛋白質的步驟。
12. 一種用於製備誘導型T細胞受體的方法，包含將如請求項1至4中任一項定義之核酸序列A與核酸序列B、如請求項5定義之表現片匣、或如請求項6定義之載體體外加入宿主細胞中，在該條件下容許核酸序列A與核酸序列B的表現之步驟。
13. 如請求項1至4中任一項定義之組合、如請求項5定義之表現片匣、如請求項6定義之載體、如請求項8定義之宿主細胞、或如請求項9定義之蛋白質，用於T細胞療法，較佳為用於治療癌症。
14. 如請求項13之組合、表現片匣、載體、宿主細胞、或蛋白質，其中該癌症為實體癌或血癌。
15. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至4中任一項定義之組合、如請求項5定義之表現片匣、如請求項6定義之載體、如請求項8定義之宿主細胞、或如請求項9定義之蛋白質。

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