TW201906624A - 黃耆萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途 - Google Patents

Abstract

在一方面，本發明提供一種黃耆多醣水溶性萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途，其中該黃耆水溶性萃取物具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。另一方面，本發明提供一種美白或淡斑面膜，其包含如上述的黃耆水溶性萃取物。

Description

黃耆萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途

發明係關於一種黃耆萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途，其中該黃耆萃取物為黃耆多醣水溶性萃取物。

黑色素表現的程度和分佈是頭髮及皮膚顏色的主要調節劑。另一方面黑色素對於太陽光中紫外線輻射的致癌作用及有害影響中扮演重要的防護作用角色。在歐洲，異常的色素沉積過度像是黑斑病和老人斑都可能導致各種皮膚病。而在亞洲，人們則是希望皮膚能更白一點。

過去的研究注重在從植物中篩選出天然化合物來做為抗黑色素生成劑（Jang, J.Y.等人， Exp Dermatol 2009, 18, 232-237; 及Lee, H.D.等人，Exp Dermatol 2011, 20, 761-763）。已經知道許多植物可以生產應用於化妝品上的化合物，其中有些化合物具有免疫調節活性並且抑制黑色素生成的作用（Liu, W.S.等人， Mar Drugs 2013, 11, 1899-1908）。

另外，CN 101134009 B揭示黄耆的水不溶部分（黃耆皂苷化合物）用於製造護膚組合物的用途。

在一方面，本發明提供一種黃耆多醣水溶性萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物為具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的莫耳比例為約1.5：1至約3：1，且包含莫耳百分比約5%至約25%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約10%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約15%的半乳糖、及莫耳百分比約50%至約95%的葡萄糖。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物包含莫耳百分比約5%至約15%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約1.5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約4%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約7%的半乳糖、及莫耳百分比約70%至約90%的葡萄糖。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物藉由包含以下步驟的方法製備： (a) 由黃耆萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖組合物之水溶性萃取物；(b) 在該水溶性萃取物中添加足夠量之低碳數烷醇，以將阿拉伯糖半乳聚糖組合物沉澱出來，並分離沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物；(c) 將該沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物溶於水中，以獲得一第一水溶液；(d) 以離子交換色層層析管柱來純化該第一水溶液，獲得一第二水溶液；及(e) 自該第二水溶液中分離出該黃耆多醣水溶性萃取物。

根據本發明之較佳具體實施例，所述用於抑制黑色素生成的組合物為一種化妝品組合物，例如，用於美白或淡斑的組合物。

另一方面，本發明提供一種美白或淡斑面膜，其包含黃耆多醣水溶性萃取物，該黃耆多醣水溶性萃取物具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的莫耳比例為約1.5：1至約3：1，且包含莫耳百分比約5%至約25%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約10%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約15%的半乳糖、及莫耳百分比約50%至約95%的葡萄糖。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物包含莫耳百分比約5%至約15%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約1.5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約4%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約7%的半乳糖、及莫耳百分比約70%至約90%的葡萄糖。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物藉由包含以下步驟的方法製備： (a) 由黃耆萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖組合物之水溶性萃取物；(b) 在該水溶性萃取物中添加足夠量之低碳數烷醇，以將阿拉伯糖半乳聚糖組合物沉澱出來，並分離沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物；(c) 將該沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物溶於水中，以獲得一第一水溶液；(d) 以離子交換色層層析管柱來純化該第一水溶液，獲得一第二水溶液；及(e) 自該第二水溶液中分離出該黃耆多醣水溶性萃取物。

本發明之其他目的及優點一部分記載於下述說明中，或者可透過本發明的實施例而理解。應了解前文之發明內容及下文之實施方式僅為例示性及闡釋性之說明，而非如申請專利範圍般限定本發明。

除非另行定義，所有在本文中所使用的技術及科學術語具有如同本發明所屬技術領域中之技藝人士一般所瞭解的意義。

本文中所使用的「一」乙詞，如未特別指明，係指至少一個（一個或一個以上）之數量。

除非另有說明，在說明書及申請專利範圍中用以表示成分、反應條件的數量等的所有數字，應理解為加上「約」。因此，除非特別指明，說明書及申請專利範圍中所述的數值為近似值。一般而言，本文中所使用的術語「約」，係指一測量值，例如，溫度、時間以及劑量等，涵蓋：相對於所指定的量，在一實例中，±15%或±10%的變動，在另一實例中，±5%的變動，在另一個實例中，±1%的變動，在又一實例中，±0.1%的變動，只要上述之變動對實施所揭露的方法而言是適當的。

「阿拉伯糖半乳聚糖蛋白質」或「AGP」通常可以用β-葡萄糖基亞里夫（Yariv）試劑來沉澱得到，屬高度醣化之蛋白質，其碳水化合物約佔分子量之至少50%，且主要之碳水化合物組成為阿拉伯糖及半乳糖，且該阿拉伯糖殘基多半位於末端。其可與AGPs之單株抗體MAC207進行專一性的反應。

本文中所使用的術語「阿拉伯糖半乳聚糖組合物」係指一種組合物，其至少包含，以重量百分百計，至少70%，特別是至少80%，尤其是至少90%的阿拉伯糖半乳聚糖蛋白質，及相關之阿拉伯糖半乳聚糖及其他多醣。

本文所述的「黃耆多醣水溶性萃取物」係指一種經純化的阿拉伯糖半乳聚糖組合物。

在一方面，本發明提供一種黃耆多醣水溶性萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。

根據本發明之較佳具體實施例，所述用於抑制黑色素生成的組合物為一種化妝品組合物，例如，用於美白或淡斑的組合物。

當製備為化妝品組合物，本發明之用於抑制黑色素生成可進一步包含一生理上可接受之載劑。所述化妝品組合物可為下列的形式之一：乳液、乳霜、凝膠、液劑、軟膏或噴霧，其中該液劑可為注射劑。所述化妝品組合物可經由局部外用、注射或其他合適的方式而投予有需要的個體。

另一方面，本發明提供一種美白或淡斑面膜，其包含如上述之黃耆多醣水溶性萃取物。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物中的阿拉伯糖（Ara）∶半乳糖（Gal）的比例為約1.5：1至約3：1，且包含莫耳百分比約5%至約25%的阿拉伯糖（Ara）、莫耳百分比小於約5%的鼠李糖（Rha）、莫耳百分比小於約10%的半乳糖醛酸（GalA）、莫耳百分比約3%至約15%的半乳糖（Gal）、及莫耳百分比約50%至約95%的葡萄糖（Glc）。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物包含莫耳百分比約5%至約15%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約1.5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約4%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約7%的半乳糖、及莫耳百分比約70%至約90%的葡萄糖。

在本發明之部分具體實施例中，該黃耆多醣水溶性萃取物藉由包含以下步驟的方法製備： (a) 由黃耆萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖組合物之水溶性萃取物；(b) 在該水溶性萃取物中添加足夠量之低碳數烷醇，以將阿拉伯糖半乳聚糖組合物沉澱出來，並分離沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物；(c) 將該沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物溶於水中，以獲得一第一水溶液；(d) 以離子交換色層層析管柱來純化該第一水溶液，獲得一第二水溶液；及(e)自該第二水溶液中分離出該黃耆多醣水溶性萃取物。

本發明中的黃耆多醣水溶性萃取物的定義如上所述，其自黄耆(Astragalus membranaceus)（特别是根部）中分離，較佳是從蒙古黃耆或膜莢黃耆(Astragalus membranaceus Bge. Var. mongholicus (Bge) Hsiao或A.membranaceus (Fisch) Bge.)的根部分離；較佳是生長在中國內蒙古或山西省的黃耆植物的根部，特別是前者；而且較佳的植物根部是選自生長兩年的黃耆。

典型地，本發明中的黃耆多醣水溶性萃取物中阿拉伯糖∶半乳糖的莫耳比例不低於1.5∶1；特別是不低於1.75∶1；尤其是不低於3∶1。典型地，本發明中的黃耆多醣水溶性萃取物的重量平均分子量介於20至60千道耳頓之間，特別是介於25至40 千道耳頓之間，尤其是介於27至35 千道耳頓之間。

在所述黃耆多醣水溶性萃取物的萃取流程中，可在有或無鹼金屬鹽（特別是磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉）這類共萃物存在下，以熱水在一溫度下（溫度一般不低於80℃，特別是不低於90℃，特別是約100℃）萃取黃耆曬乾後的根部（一般是於無菌下將乾燥的根部切片和分割，修剪乾燥的根部，用超過濾水搓洗，再用諸如70%酒精的滅菌溶液沖洗後，將根部切成薄片，並於滅菌條件下風乾）一段時間，並視需要重複進行許多次萃取步驟，讓根部的阿拉伯半乳聚糖蛋白質及相關的多醣可儘量溶出（一般是在約100℃，萃取三次，每次3小時）。所有在製備根部碎片後進行的步驟都是使用無菌設備和試劑在無菌環境下操作。將熱水萃出物濃縮（於60-70℃下真空濃縮至約1公升/千克的乾燥根部），然後用低碳數烷醇（例如酒精，室溫下最終濃度是70%）沉澱。再用更低碳數的醇類來清洗這些低碳數烷醇的沉澱物（一般是用95%酒精清洗三次），並用適當濃度懸浮於水中等待進一步處理（一般是18-20%重量/體積）。然後將懸浮液中不溶於水的物質去除，例如由低碳數烷醇（約35%的乙醇）加入沉澱去除。然後，低碳數烷醇沉澱物（例如35%的酒精沉澱物）的上清液再用高濃度的低碳數烷醇作進一步沉澱，例如40-80%的酒精，特別是60-70%的酒精，將內含阿拉伯半乳聚糖蛋白質和結合多醣的阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物沉澱出來。將沉澱再溶於水中，並乾燥（避免過度加熱），得到分離出來的阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物。該組合物粗產物一般是淡黃色粉末，可溶於水。

可用離子交換色層層析法進一步純化阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物。將其溶於水，或是將沉澱溶解後的溶液調整至適當濃度（一般約2%），然後進行超過濾，去除掉低分子量部分，以減少溶液體積（例如，用可排除分子量在5千道耳頓下的超過濾系統（5K MWCO UF系統）進行過濾）。再將超過濾後的上清液流經陽離子交換管柱（例如，SP瓊脂糖凝膠陽離子交換管柱，用pH 5.20的20mM乙醯鈉(NaOAc)緩衝液平衡），再將洗脫液裝填至陰離子交換管柱中（例如，Q瓊脂糖凝膠陰離子交換管柱，用同樣的NaOAc緩衝液平衡）。從陰離子交換管柱中洗脫液可直接拿來製備如本文中所述的黃耆多醣水溶性萃取物，或可濃縮乾燥形成一種適合用來製備黃耆多醣水溶性萃取物組合物的中間產物。在製備如本文中所述的黃耆多醣水溶性萃取物時，可用能過濾細菌的微過濾膜（例如，0.1μm的濾膜）進行超過濾，去除鹽類並減少溶液體積（例如，使用8K MWCO UF系統）。將超過濾後的上清液濃縮（50-60℃下，20-26%），然後用低碳數烷醇（約80-90%的乙醇）進行沉澱。進一步清洗沉澱（例如，使用無水酒精清洗三次），並乾燥（60-70℃的真空烤箱），可獲得如本文中所述的黃耆多醣水溶性萃取物。

如本文中所述的黃耆多醣水溶性萃取物的製備方法在TW I240629、CN 1179979 C或TW I507201中亦有揭示，茲將前述文獻之全文併入本文中作為參考文獻。

現參照下列特別的非限定性實例更詳細地說明本發明。

材料與方法

1.細胞

小鼠B16F10黑色素瘤細胞使用Dulbecco改良的Eagle培養基包含有10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和50μg/ ml慶大霉素且在37℃及5% CO2的條件下來培養。

2. 細胞增殖測定

細胞(10⁵ /孔)用不同濃度的黃耆多醣水溶性萃取物在無血清培養基中處理24小時。根據製造商的指示，透過細胞計數套組-8（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）來評估細胞增殖狀況。

3. 黑色素含量測定

在實驗最後收集細胞並在冷裂解緩衝液（20mM磷酸鈉pH 6.8、1%Triton X-100、1mM PMSF和1mM EDTA）中裂解。將黑色素顆粒在100℃下溶解在Soluene-350（Perkin-Elmer, Waltham, MA,USA）中15分鐘，並以15,000g離心15分鐘。測量500nm處的吸光度。

4. 統計學分析

所有數據均以平均值±標準偏差表示。使用變異數分析來測定組間的差異。p值小於0.05表示具有統計上的顯著性。

實例 1 ：黃耆多醣水溶性萃取物的製備

步驟A. 「浸製切片」

將300千克曬乾的黃耆（Astragalus membranaceus）根部經過除汙，滅菌清洗並用超過濾水搓洗，然後浸泡在70%酒精中過夜，切成厚約3-5毫米的薄片，在60-70℃的滅菌烘箱中烘乾，製成「浸製切片」。這些烘乾後的「浸製切片」因乾燥減重約＜15%。

步驟B. 阿拉伯半乳聚糖組合物的粗萃

將200千克步驟A中製備的「浸製切片」，用UF水（以10 K MWCO UF系統進行超過濾的去離子水）在100℃下萃取3次，每次3小時。在60-70℃下，將混合萃取液減壓濃縮至約200公升。在濃縮液中加入95%的酒精，使酒精最終濃度達70%，室溫下攪拌15分鐘，沉澱多醣。輕輕倒出上清液，用95%酒精清洗沉澱3次。將沉澱懸浮在UF水中，濃度約18-20%（由折射計測定），再加入95%酒精，使酒精最終濃度是35%。將酒精懸浮液離心，丟棄沉澱部分，並在上清液中加入95%酒精，並攪拌使酒精濃度達70%。收集沉澱部分，再用UF水溶解，乾燥可得阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物。

阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物是質地輕的黃色粉末，水中溶解度是200毫克/毫升，烘烤減重約＜15%。

步驟C. 阿拉伯半乳聚糖組合物的純化

將3.5千克，步驟B中製備的阿拉伯半乳聚糖組合物的粗產物，用UF水溶解得到濃度2%的溶液(（體積175公升）。用5K MWCO UF系統將溶液過濾至終體積35-40公升。添加pH5.2的1.0M乙醯鈉（NaOAc）緩衝液將濃縮液配製成pH5.2的20mM NaOAc緩衝液。將溶液裝填到SP瓊脂糖凝膠陽離子樹脂交換柱（體積20升，床層高30釐米）中，並用20mM NaOAc洗脫，收集2.5-3.0倍床體積的洗脫液。將收集的洗脫液裝填到Q瓊脂糖凝膠陰離子樹脂交換柱（與SP柱體積和床層高度相同）中，並用20mM NaOAc洗脫，收集3-3.5倍床體積的洗脫液。從Q瓊脂糖凝膠陰離子樹脂交換柱收集的洗脫液用0.1μm濾器過濾後，再用8K MWCO UF系統進行超過濾。將殘留液體用濃縮系統在50-60℃下濃縮至20-26%，再添加無水酒精進行沉澱，酒精最終濃度是80-90%。用無水酒精清洗沉澱3次，然後在60-70℃下烘乾，可得純化的阿拉伯半乳聚糖組合物（即本文中所述的一種黃耆多醣水溶性萃取物）。

純化的阿拉伯半乳聚糖組合物是一種白色粉末，溶於水、生理食鹽水、及5%的葡萄糖水，濃度是20毫克/毫升，而且含水量≤6.0%。組合物的含糖量≦85%（以葡萄糖為標準物，由甲酚-硫酸法來測定），組合物Ara∶Gal比例≥1.5∶1（採用GLC分析所述組合物三甲基矽甲基糖苷衍生物來測定）。

實例 2 ：黃耆多醣水溶性萃取物抗黑色素生成活性試驗

使用小鼠B16F10黑色素瘤細胞系統評估黃耆萃取物的抗黑色素生成活性。如圖一所示，使用黃耆多醣水溶性萃取物處理後測定B16F10細胞的存活和黑色素含量。結果可觀察於黃耆多醣水溶性萃取物處理的細胞中（1-100 奈克/毫升）沒有觀察到顯著的細胞毒性（圖1A）。經由α黑色素細胞激素處理後的細胞中黑色素含量有顯著上升。黃耆多醣水溶性萃取物處理後，即使經由α黑色素細胞激素刺激的B16F10細胞的黑色素含量亦會顯著降低（圖1B）。使用黃耆多醣水溶性萃取物處理會導致B16F10細胞的黑色素含量顯著降低且具有劑量依賴性（圖1C）。這些結果顯示黃耆多醣水溶性萃取物具有抑制黑色素生成的能力且對細胞沒有傷害。

無

圖1A顯示透過細胞增殖測定法測定細胞活性。圖1B顯示黃耆多醣水溶性萃取物對細胞黑色素含量的影響（平均值 ± 標準差；樣品數 = 6）。圖1C為小鼠黑色素瘤細胞沉澱的照片。細胞與或不與黃耆多醣水溶性萃取物共同培養48小時 (0-100 奈克/毫升)。 *，p ＜0.05； **，p ＜0.01。

無

Claims (10)

1. 一種黃耆多醣水溶性萃取物在製備用於抑制黑色素生成的組合物的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。
2. 如請求項1所述的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的莫耳比例為約1.5：1至約3：1，且包含莫耳百分比約5%至約25%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約10%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約15%的半乳糖、及莫耳百分比約50%至約95%的葡萄糖。
3. 如請求項2所述的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物包含莫耳百分比約5%至約15%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約1.5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約4%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約7%的半乳糖、及莫耳百分比約70%至約90%的葡萄糖。
4. 如請求項1所述的用途，其中該黃耆多醣水溶性萃取物藉由包含以下步驟的方法製備： (a) 由黃耆萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖組合物之水溶性萃取物；(b) 在該水溶性萃取物中添加足夠量之低碳數烷醇，以將阿拉伯糖半乳聚糖組合物沉澱出來，並分離沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物；(c) 將該沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物溶於水中，以獲得一第一水溶液；(d) 以離子交換色層層析管柱來純化該第一水溶液，獲得一第二水溶液；及(e)自該第二水溶液中分離出該黃耆多醣水溶性萃取物。
5. 如請求項1-4中任一項所述的用途，其中該用於抑制黑色素生成的組合物為用於美白或淡斑的組合物。
6. 如請求項5所述的用途，其中該用於美白或淡斑的組合物可為下列的形式之一：乳液、乳霜、凝膠、液劑、軟膏或噴霧。
7. 一種美白或淡斑面膜，其包含黃耆多醣水溶性萃取物，其中該黃耆多醣水溶性萃取物具有約20 千道耳頓至約60 千道耳頓之平均分子量。
8. 如請求項7所述的美白或淡斑面膜，其中該黃耆多醣水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的莫耳比例為約1.5：1至約3：1，且包含莫耳百分比約5%至約25%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約10%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約15%的半乳糖、及莫耳百分比約50%至約95%的葡萄糖。
9. 如請求項7所述的美白或淡斑面膜，其中該黃耆多醣水溶性萃取物包含莫耳百分比約5%至約15%的阿拉伯糖、莫耳百分比小於約1.5%的鼠李糖、莫耳百分比小於約4%的半乳糖醛酸、莫耳百分比約3%至約7%的半乳糖、及莫耳百分比約70%至約90%的葡萄糖。
10. 如請求項7所述的美白或淡斑面膜，其中該黃耆多醣水溶性萃取物藉由包含以下步驟的方法製備： (a) 由黃耆萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖組合物之水溶性萃取物；(b) 在該水溶性萃取物中添加足夠量之低碳數烷醇，以將阿拉伯糖半乳聚糖組合物沉澱出來，並分離沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物；(c) 將該沉澱的阿拉伯糖半乳聚糖組合物溶於水中，以獲得一第一水溶液；(d) 以離子交換色層層析管柱來純化該第一水溶液，獲得一第二水溶液；及(e)自該第二水溶液中分離出該黃耆多醣水溶性萃取物。