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TW201815823A - 抗－pd－1抗體 - Google Patents

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TW201815823A
TW201815823A TW106131824A TW106131824A TW201815823A TW 201815823 A TW201815823 A TW 201815823A TW 106131824 A TW106131824 A TW 106131824A TW 106131824 A TW106131824 A TW 106131824A TW 201815823 A TW201815823 A TW 201815823A
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偉東 姜
林佩樺
曾琪鈴
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美商漢霖股份有限公司
漢霖生技股份有限公司
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Abstract

本發明提供抗-PD-1抗體及其抗原結合片段。本發明亦提供編碼抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之經分離核酸分子、相關表現載體及宿主細胞。本發明提供製造抗-PD-1抗體及其抗原結合片段之方法。本發明亦提供相關醫藥組合物及其等用以治療個體之方法。

Description

抗－PD－1抗體
本發明大體上係關於抗-PD-1抗體及其於人類癌症之治療中之使用方法。
程序化死亡-1 (PD-1)係由活化T及B細胞表現之關鍵免疫檢查點受體及介導免疫抑制。PD-1係受體之CD28家族之一員，其包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及BTLA。已識別PD-1之兩種細胞表面醣蛋白配體(程序化死亡配體-1 (PD-L1)及程序化死亡配體-2 (PD-L2))，其等表現於抗原提呈細胞及許多人類癌症上及已顯示一經結合至PD-1即下調T細胞活化及細胞介素分泌(Freeman等人，2000；Latchman等人，2001)。不同於CTLA-4，PD-1主要在其中活化T細胞可遭遇由腫瘤及/或基質細胞表現之免疫抑制PD-L1 (B7-H1)及PD-L2 (B7-DC)配體之周圍組織中發揮作用(Flies等人，2011；Topalian等人，2012a)。PD-1/PD-L1相互作用之抑制在臨床前模型中介導有效抗腫瘤活性(美國專利案第8,008,449及7,943,743號)，及PD-1/PD-L1相互作用之Ab抑制劑於治療癌症之用途已進入臨床試驗(Brahmer等人，2010；Flies等人，2011；Topalian等人，2012b；Brahmer等人，2012)。 存在研發針對PD-1之抗癌治療劑之需求。本發明滿足此需求及其他需求。
本發明提供抗-PD-1抗體及/或其抗原結合片段。在某些實施例中，本發明之抗-PD-1抗體係嵌合抗-PD-1抗體c1G4及/或人類化抗-PD-1 h1G4，其包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14)之CDR-H3。 本發明進一步提供針對人類化h1G4抗-PD-1抗體之親和力成熟抗體。在某些實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，33B)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASLRHT (SEQ ID NO:16)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20)之CDR-H3。 在其他實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，66E)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23)之CDR-H3。 在某些實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，711D)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25)之CDR-H3。 本文指示之CDR之序列係提供於下表1中。 表1 在一些實施例中，抗-PD-1抗體包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含選自由SEQ ID No: 9、21及24組成之群之胺基酸序列之CDR-L1；(2)包含SEQ ID No: 10或16之胺基酸序列之CDR-L2；(3)包含選自由SEQ ID No: 11、17、22組成之群之胺基酸序列之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含SEQ ID No: 12或18之胺基酸序列之CDR-H1；(2)包含 SEQ ID No: 13或19之胺基酸序列之CDR-H2；及(3)包含選自由SEQ ID No: 14、20、23及25組成之群之胺基酸序列之CDR-H3。 本發明亦提供抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變域序列，該重鏈可變域序列包含(SEQ ID NO:4)中所述之胺基酸序列，及輕鏈可變域序列，該輕鏈可變域序列包含SEQ ID NO:2)中所述之胺基酸序列。 本發明亦提供人類化抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含(SEQ ID NO:8)中所述之胺基酸序列及包含SEQ ID NO:6)中所述之胺基酸序列之輕鏈可變域序列。 在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗體包含人類IgG之Fc序列。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv (scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗體係多特異性抗體。 在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗-PD-1抗體或其抗原結合片段係經結合至治療劑。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗-PD-1抗體或其抗原結合片段係經結合至標記。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該標記係選自由以下組成之群：放射性同位素、螢光染料及酶。 本發明提供編碼根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之經分離核酸分子。本發明亦提供編碼根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之核酸分子之表現載體。本發明亦提供包含根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之表現載體之細胞。本發明亦提供產生抗體之方法，其包括培養根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之細胞及自細胞培養物回收抗體或其抗原結合片段。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該細胞係哺乳動物細胞。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該哺乳動物細胞係CHO細胞。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該細胞係穩定之哺乳動物細胞系。在根據(或如應用至)穩定之哺乳動物細胞系中之任何一者之一些實施例中，該穩定之哺乳動物細胞系係CHO細胞系。 本發明提供包含根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑之組合物。 本發明提供偵測來自病患之樣本中之PD-1蛋白之方法，其藉由使根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段接觸該樣本及偵測結合至PD-1蛋白之抗-PD-1抗體。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該抗-PD-1抗體或其抗原結合片段係用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析中。 本發明亦提供治療個體之癌症之方法，其包括向該個體投與有效量之根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之組合物。本發明亦提供包含根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之組合物，該組合物係用於治療癌症。本發明提供根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段在製造用於治療癌症之藥劑中之用途。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，該癌症係選自：黑色素瘤、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma) (cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌及非小細胞肺癌(NSCLC))、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及唾液腺癌。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，向該個體進一步投與選自由以下組成之群之治療劑：抗腫瘤藥劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，向該個體進一步投與放射治療。在根據(或如應用至)上文實施例中之任何一者之一些實施例中，向該個體進一步投與抗VEGF、VEGFR2或EGFR之治療抗體。
本發明提供新穎抗-PD-1抗體及/或其抗原結合片段。本發明者們已驚人地發現抗-PD-1抗體(例如，本文描述之嵌合c1G4及人類化h1G4抗體及其等親和力成熟抗體，例如33B、66E及711D)增強由T細胞分泌IL-2及IFNγ及CD4+及CD8+ T細胞之增殖。相較於OPDIVO® (尼魯單抗)(其為經FDA批准用以治療癌症之人類化IgG4抗-PD-1單株抗體)，本文描述之抗-PD-1抗體亦顯示增強之效用及/或抗腫瘤活性。 本發明亦提供免疫結合物、編碼本文描述之新穎抗-PD-1抗體之核酸、及組合物(諸如醫藥組合物)。本發明亦提供使用新穎抗-PD-1抗體以偵測樣本(諸如活體內或活體外樣本)中之PD-1之方法，包含此等抗體以用於治療癌症之組合物，及此等抗體在治療癌症之藥劑之製造中之用途。 定義 如本文使用，「治療(treatment或treating)」係用於獲得有利或所需結果(包括臨床結果)之途徑。出於本發明之目的，有利或所需臨床結果包括(但不限於)以下中之一或更多者：減輕疾病引起之一或更多種症狀；減弱疾病之程度；使疾病穩定(例如，預防或延遲疾病之惡化)；預防或延遲疾病之擴散(例如，轉移)；預防或延遲疾病之復現；延遲或減緩疾病之進展；改善疾病情況；提供疾病之緩解(部分或完全)；減少治療疾病所需之一或更多種其他藥物之劑量；延遲疾病之進展；增加或改善生活品質；增加體重增長及/或延長存活。「治療」亦包括癌症之病理結果(諸如，例如，腫瘤體積)之減小。本文提供之方法預期治療之此等態樣中之任何一或更多者。 術語「復現」、「復發」或「復發性」係指疾病消失之臨床評估後，癌症或疾病之重現。遠處轉移或局部復現之診斷可視為復發。 術語「難治」或「頑固」係指癌症或疾病對治療無反應。 術語「輔助治療」係指在基本治療(primary therapy)(通常，外科手術)後給定之治療。用於癌症或疾病之輔助治療可包括免疫治療、 化學治療、放射治療或激素治療。 術語「維持治療」係指給定以幫助維持先前治療效果之預定再治療。維持治療係通常給定以幫助保持癌症緩解，或不管疾病進展，延長癌症對特定治療之反應。 術語「浸潤性癌症」係指已超過其中開始之組織層傳播進入正常周圍組織內之癌症。浸潤性癌症可或可不為轉移性的。 術語「非浸潤性癌症」係指極早期癌症或未擴散超過起源組織之癌症。 腫瘤學中術語「無進展存活期」係指在治療期間及治療後癌症不生長之時間長度。無進展存活期包括病患已經歷完全反應或部分反應之時間量，及病患已經歷穩定疾病之時間量。 腫瘤學中術語「進行性疾病」可係指自治療開始大於20%之腫瘤生長–由於腫瘤之質量增加或腫瘤傳播。 「失調症」係將獲益自該抗體治療之任何病症。例如，忍受或需要抗異常PD-1活性之預防之哺乳動物。此包括慢性及急性失調症或疾病，其等包括彼等使哺乳動物易患所述失調症之病理狀態。本文待治療之失調症之非限制性實例包括癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。 如本文使用，「腫瘤」係指所有腫瘤細胞生長及增殖，無論惡性或良性，及所有癌前及癌細胞及組織。 術語「抗體」係以最廣泛意義使用及具體言之涵蓋(例如)單一單株抗體(包括促效劑、拮抗劑及中和抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多株抗體、單鏈抗-抗體及抗體之片段(參見下文)，只要其等特異性結合天然多肽及/或顯示本發明之生物活性或免疫活性。根據一項實施例，該抗體結合至靶蛋白之寡聚形式，例如，三聚形式。根據另一實施例，該抗體特異性結合至蛋白質，該結合可藉由本發明之單株抗體(例如，本發明之沈積抗體等)抑制。片語抗體之「功能片段或類似物」係具有與其參考之抗體相同之定性生物活性之化合物。例如，本發明之抗體之功能片段或類似物可為可特異性結合至PD-1者。在一項實施例中，該抗體可防止或大體上減小PD-1誘發細胞增殖之能力。 「經分離抗體」係已經識別及分離及/或回收自其自然環境之組分者。其自然環境之污染物組分係將干擾抗體之診斷或治療用途之材料，及可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，如藉由洛瑞(Lowry)方法測定，該抗體將經純化(1)至大於95重量%之抗體及最佳地大於99重量%，(2)藉助於轉杯式定序儀純化至足夠獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯(Coomassie)藍(或較佳地，銀染色)純化至均質化。由於抗體之自然環境之至少一種組分將不存在，因此經分離抗體包括於重組細胞內原位之抗體。通常，然而，經分離抗體將由至少一個純化步驟製成。 基本4鏈抗體單元係由兩個相同之輕(L)鏈及兩個相同之重(H)鏈組成之異四聚醣蛋白(IgM抗體由5個基本異四聚體單元及稱為J鏈之額外多肽組成，及因此含有10個抗原結合位點，而分泌之IgA抗體可聚合以形成包含2至5個基本4鏈單元及J鏈之多價聚集體)。在IgG之情況下，該4鏈單元係通常約150,000道爾頓。各L鏈係藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而該等兩個H鏈視H鏈同型物而定係藉由一或更多個二硫鍵彼此連接。各H及L鏈亦已具有規律間隔的鏈內二硫橋。各H鏈於N端具有可變域(VH)，接著各α及γ鏈的三個恆定域(CH)及µ及ε同型物的四個CH域。各L鏈於N端具有可變域(VL)，接著在其另一端具有恆定域(CL)。該VL係與VH對齊及該CL係與重鏈之第一恆定域(CH1)對齊。特定胺基酸殘基被認為在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH及VL配對在一起形成單一抗原結合位點。就不同類別抗體之結構及性質而言，參見，例如，Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P. Stites, Abba I. Terr及Tristram G. Parslow (編), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994，第71頁及第6章。 來自任何脊椎動物物種之L鏈基於其等恆定域之胺基酸序列可歸屬於兩種明顯不同之類型(稱為κ及λ)中之任何一者。視免疫球蛋白之重鏈之恆定域(CH)之胺基酸序列而定，其等可歸屬於不同之類別或同型物。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其等分別具有名為α、δ、γ、ε及µ之重鏈。γ及α類別基於CH序列及功能中相對較小之差異可進一步分為子類，例如，人類表現下列子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。 術語「可變」係指在抗體之間，可變域之某些區段之序列顯著不同之事實。V域介導抗原結合及界定特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性跨可變域之110個胺基酸範圍非均勻分佈。相反地，該等V區由相對不變之延伸組成，該等延伸稱為具有15至30個胺基酸之框架區(FR)，其等由具有極端可變性之較短區(稱為「高度可變區」)分隔，該等高度可變區係各9至12個胺基酸長度。具有天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個FR，其主要採取β折疊構形且由三個高度可變區連接，該等高度可變區形成環，該等環連接β折疊結構及在一些情況下形成β折疊結構之一部分。各鏈中之高度可變區係由FR緊挨著結合在一起，而與其他鏈之高度可變區有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恆定域不直接涉及抗體對抗原之結合，但顯示各種效應子功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中之參與。 如本文使用，術語「CDR」或「互補決定區」係意欲意謂於重鏈及輕鏈多肽兩者之可變區內發現之非連續抗原結合位點。此等特定區已由Kabat等人，J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；由Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)描述，其中定義包括在彼此進行比較時，胺基酸殘基之重疊或子集。然而，涉及抗體或經移植抗體或其變體之CDR之定義之應用係意欲在如本文定義及使用之術語之範圍內。包含如由如上文引用之參考文獻中之各者定義之CDR之胺基酸殘基係作為比較所述於下表2中。 表2 如本文使用之術語「單株抗體」係指獲得自大體上均質之抗體之群體之抗體，即組成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然生成之突變外相同。單株抗體係高度特異性的，係指針對單一抗原位點。此外，相較於包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除單株抗體之特異性外，單株抗體的有利之處在於其等可經合成而不被其他抗體污染。修飾語「單株」不應視為需藉由特定方法產生抗體。例如，用於本發明之單株抗體可由最先由Kohler等人，Nature. 256:495 (1975)描述之融合瘤方法製成或可使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中製得(參見，例如，美國專利案第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用Clackson等人，Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)及例如下文實例中描述之技術自噬菌體抗體庫分離。 本文之單株抗體包括「嵌合」抗體(其中重鏈及/或輕鏈之一部分係與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源，而該(等)鏈之剩餘部分係與衍生自其他物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源)及此等抗體之片段，只要其等顯示本發明之生物活性(參見美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本文受關注之嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其等包含衍生自非人類靈長類動物(例如，舊世界猴、猿類等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。 「完整」抗體係包含抗原結合位點及CL及至少重鏈恆定域(CH1、CH2及CH3)的抗體。該等恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變體。較佳地，該完整抗體具有一或更多種效應子功能。 「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳地完整抗體之抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利案第5,641,870號，實例2；Zapata等人，Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成之多特異性抗體。表述「線性抗體」通常係指Zapata等人，Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)中描述之抗體。簡而言之，此等抗體包含一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或單特異性。 抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同之抗原結合片段(稱為「Fab」片段)及殘餘之「Fc」片段(反映容易結晶之能力之名稱)。該Fab片段由整個L鏈及H鏈之可變區域(VH)及一個重鏈之第一恆定域(CH1)組成。各Fab片段關於抗原結合係單價的，即其具有單一抗原結合位點。抗體之胃蛋白酶處理產生單一大F(ab’)2片段，其大致對應於具有二價抗原結合活性之兩個經二硫鍵連接之Fab片段且仍可交聯抗原。Fab’片段與Fab片段的不同在於在CH1域之羧基端具有額外之極少殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或更多個半胱胺酸。Fab'-SH係本文針對其中恆定域之該(等)半胱胺酸殘基具有游離之硫醇基之Fab'指定之名稱。F(ab’)2抗體片段最初產生係其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合物。 Fc片段包含由二硫鍵結合在一起之兩個H鏈之羧基端部分。抗體之效應子功能係由Fc區中之序列決定，該區亦係由某些類型之細胞上發現之Fc受體(FcR)識別之部分。 「變體Fc區」包含藉助於如本文定義之至少一種「胺基酸修飾」不同於天然序列Fc區之胺基酸序列之胺基酸序列。較佳地，相較於天然序列Fc區或相較於親代多肽之Fc區，該變體Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如，在天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中自約一個至約十個胺基酸取代，及較佳地自約一個至約五個胺基酸取代。在一項實施例中，本文之變體Fc區將具有與天然序列Fc區之至少約80%同源性、至少約85%同源性、至少約90%同源性、至少約95%同源性或至少約99%同源性。根據另一實施例，本文之變體Fc區將具有與親代多肽之Fc區之至少約80%同源性、至少約85%同源性、至少約90%同源性、至少約95%同源性或至少約99%同源性。 術語「包含Fc區之多肽」係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或免疫黏附素(參見本文於別處之定義)。Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可(例如)在多肽之純化期間或藉由重組改造編碼該多肽之核酸來移除。因此，包含具有根據本發明之Fc區之多肽(包括抗體) 之組合物可包含所有K447殘基已移除之多肽群體、K447殘基未移除之多肽群體、或具有K447殘基之多肽及無K447殘基之多肽之混合物之多肽群體。 抗體「效應子功能」係指歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)及隨抗體同型物變化之彼等生物活性。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體之下調；及B細胞活化。「天然序列Fc區」包含與自然中發現之Fc區之胺基酸序列相同之胺基酸序列。Fc序列之實例係描述(例如，但不限於)於Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))中。 「Fv」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由具有一個重鏈及一個輕鏈可變區域以緊密非共價結合之二聚體組成。自此等兩個域之折疊產生有助於胺基酸殘基之抗原結合並對抗體賦予抗原結合特異性之六個高度可變環(H及L鏈各產生3個環)。 然而，甚至單一可變域(或半個Fv，其僅包含三個對抗原具特異性之CDR)具有識別並結合抗原之能力，但親和力低於整個結合位點。 亦縮寫成「sFv」或「scFv」之「單鏈Fv」係包含連接成單一多肽鏈之VH及VL抗體域之抗體片段。較佳地，該sFv多肽進一步在VH與VL域之間包含多肽連接子，其能夠使sFv形成用於抗原結合之所需結構。為回顧sFv，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag, New York，第269至315頁(1994); Borrebaeck 1995，同下。 術語「雙功能抗體」係指藉由以下方式所製成之小抗體片段：用短連接子(約5至10個殘基)在VH與VL域之間構築sFv片段(參見前段)使得達成V域之鏈間而非鏈內配對，從而產生二價片段(即具有兩個抗原結合位點之片段)。雙特異性雙功能抗體係具有兩個「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩個抗體之VH及VL域係存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體係更充分描述(例如)於EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993)中。 非人類(例如，嚙齒類動物)抗體之「人類化」形式係含有衍生自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。就大部分而言，人類化抗體係其中來自受體之高度可變區之殘基被來自非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之具有所需抗體特異性、親和力及能力之高度可變區之殘基置換之人類免疫球蛋白(受體抗體)。在一些實例中，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基係由相應之非人類殘基置換。 此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。作出此等修飾以進一步改善抗體性能。通常，人類化抗體將包含大體上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或大體上所有該等高度可變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等及所有或大體上所有該等FR中係人類免疫球蛋白系列之彼等。人類化抗體視需要亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常包含人類免疫球蛋白之至少一部分。為進一步詳細說明，參見Jones等人，Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)。 關於本文定義之多肽及抗體序列之「百分率(%)胺基酸序列一致性」或「同源性」係定義為在比對序列並引入間隔(若有必要)後得到最大百分率序列一致性，及未考慮任何保守取代為序列一致性之一部分時，候選序列中胺基酸殘基與參考多肽中之胺基酸殘基相同之百分率。出於測定百分率胺基酸序列一致性之目的之比對可以熟悉此項技術者已知的各種方式達成，例如，使用公開可用之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體)。熟習此項技術者可決定用於比對序列之適當參數，其等包括在比較中之序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。出於本文之目的，然而，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生%胺基酸序列一致性值。該ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.授權，且源代碼已與用戶文檔一起於U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559提出申請，其中其以U.S. Copyright Registration No. TXU510087註冊。該ALIGN-2程式係公開獲得自Genentech, Inc., South San Francisco, California。該ALIGN-2程式應經編譯以於UNIX操作系統(較佳數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且請勿變更。 術語「Fc受體」或「FcR」係用以描述結合至抗體之Fc區之受體。在一項實施例中，本發明之FcR係結合IgG抗體(γ受體)之受體且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類，其包括此等受體之等位基因變體及或者拼接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其等具有主要其細胞質域不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA於其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB於其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM) (參見回顧M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。該術語包括同種異型，諸如FcγRIIIA同種異型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。FcR係於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中回顧。其他FcR(包括彼等在未來待識別者)係由本文之術語「FcR」包含。該術語亦包括新生兒受體(FcRn)，其負責將母系IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol . 24:249 (1994))。 術語「FcRn」係指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn係結構上類似於主要組織相容性複合體(MHC)及由非共價結合至β2-微球蛋白之α鏈組成。新生兒Fc受體FcRn之多種功能係回顧於Ghetie及Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766中。FcRn在將免疫球蛋白IgG自母親被動遞送至幼崽及血清IgG濃度之調節中發揮作用。FcRn可充當救援受體，在細胞內及跨細胞以完整形式結合及輸送胞飲化IgG，及自默認降解途徑援救其等。 人類IgG Fc區之「CH1域」(亦稱為「H1」域之「C1」)通常自約胺基酸118延伸至約胺基酸215 (EU編號系統)。 「鉸鏈區」係通常定義為自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985))。其他IgG同型物之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一及最後半胱胺酸殘基放置於相同位置中與IgG1序列對齊。 Fc區之「較低鉸鏈區」係通常定義為殘基立即自C端至鉸鏈區之延伸，即Fc區之殘基233至239。在先前報告中，FcR結合係通常歸因於IgG Fc區之較低鉸鏈區中之胺基酸殘基。 人類IgG Fc區之「CH2域」(亦稱為「H2」域之「C2」)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。該CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。而是，兩個N連接之分支醣鏈係間插於完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。已推斷醣可取代域-域配對及幫助穩定CH2域。Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。 「CH3域」 (亦稱為「C2」或「H3」域)包含Fc區中殘基C端至CH2域之延伸(即，自約胺基酸殘基341至自抗體序列之C端(通常於IgG之胺基酸殘基446或447處))。 「功能Fc區」具有天然序列Fc區之「效應子功能」。示例性「效應子功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。例如，此等效應子功能通常要求Fc區與結合域(例如，抗體可變域)組合及可使用如本文揭示之各種分析評估。 「C1q」係包括用於免疫球蛋白之Fc區之結合位點之多肽。C1q與兩個絲胺酸蛋白酶(C1r及C1s)一起形成複合體C1，其係補體依賴性細胞毒性(CDC)途徑之第一組分。人類C1q可購買自(例如)Quidel, San Diego, CA。 術語「結合域」係指多肽之結合至另一分子之區。在FcR之情況下，該結合域可包含其多肽鏈(例如，其α鏈)之一部分，其係負責結合Fc區。一個有用之結合域係FcR α鏈之細胞外域。 含具有「經改變之」FcR結合親和力或ADCC活性之變體IgG Fc之抗體係相較於親代多肽或包含天然序列Fc區之多肽具有增強或減弱之FcR結合活性(例如，FcγR或FcRn)及/或ADCC活性之抗體。對FcR「顯示增強之結合」之變體Fc以比親代多肽或天然序列IgG Fc更高之親和力(例如，較低之視Kd或IC50值)結合至少一個FcR。根據一些實施例，相較於親代多肽之結合改善係約3倍，較佳約5、10、25、50、60、100、150、200、高達500倍或約25%至1000%之結合改善。對FcR「顯示減小之結合」之多肽變體以比親代多肽更低之親和力(例如，較高之視Kd或較高之IC50值)結合至少一個FcR。相較於親代多肽之結合減小可為約40%或更大之結合減小。 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如，自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)之經分泌Ig能夠使此等細胞毒性效應子細胞特異性結合至攜抗原之靶細胞及接著用細胞毒素殺滅靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞及係此殺滅所絕對需要的。用於介導ADCC之原發性細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血幹細胞上之FcR表現係總結於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)之第464頁上之表3中。為評估受關注之分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，諸如描述於美國專利案第5,500,362或5,821,337號或下文實例中之分析。適用於此等分析之效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，受關注之分子之ADCC活性可例如在諸如Clynes等人，PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中揭示之動物模型中進行活體內評估。 當分析中具有變體Fc區之多肽及具有野生型Fc區之多肽(或親代多肽)之量係基本上相同時，在人類效應子細胞之存在下比具有野生型IgG Fc之多肽或親代多肽更有效地「顯示增加之ADCC」或介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之包含變體Fc區之多肽係活體外或活體內大體上更有效介導ADCC之多肽。通常，此等變體將使用此項技術中已知的任何活體外ADCC分析(諸如用於(例如)在動物模型中測定ADCC活性之分析或方法等)進行識別。在一項實施例中，較佳之變體比野生型Fc (或親代多肽)在介導ADCC時更有效約5倍至於100倍，例如，自約25至約50倍。 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體之存在下溶解。經典補體途徑之活化係由補體系統(C1q)之第一組分結合至與其等同源抗原結合之(適當子類之)抗體開始。為評估補體活化，可進行CDC分析，例如，如描述於Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中之分析。具有經改變之Fc區胺基酸序列及增加或減小之C1q結合能力之多肽變體係描述於美國專利案第6,194,551B1號及WO99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用之方式特定地併入本文內。亦參見Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。 如本文揭示之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「有效量」係足以進行明確規定之目的之量。「有效量」可經驗地及由關於規定目的之已知方法進行測定。術語「治療有效量」係指如本文揭示之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物有效「治療」哺乳動物(亦稱病患)之疾病或失調症之量。在癌症之情況下，如本文揭示之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之治療有效量可減少癌細胞之數量；減小腫瘤尺寸或重量；抑制(即，減緩至一定程度及較佳停止)癌細胞浸潤至外周器官內；抑制(即，減緩至一定程度及較佳停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與癌症相關聯之症狀中之一或更多者。在某種程度上，如本文揭示之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物可預防生長及/或殺滅現存之癌細胞，其可為細胞抑制及/或細胞毒性的。在一項實施例中，該治療有效量係生長抑制量。在另一實施例中，該治療有效量係延長病患存活期之量。在另一實施例中，該治療有效量係改善病患之無進展存活期之量。 本發明之如本文揭示之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「生長抑制量」係可活體外或活體內抑制細胞(尤其腫瘤，例如，癌細胞)生長之量。用於抑制腫瘤細胞生長之目的之本發明之多肽、抗體、拮抗劑或組合物之「生長抑制量」可經驗地及由本文提供之已知方法或實例進行測定。 本發明之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「細胞毒性量」係可活體外或活體內引起細胞(尤其腫瘤，例如，癌細胞)之破壞之量。用於抑制腫瘤細胞生長之目的之本發明之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「細胞毒性量」可經驗地及由此項技術中已知的方法進行測定。 本發明之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「生長抑制量」係可活體外或活體內抑制細胞(尤其腫瘤，例如，癌細胞)之生長之量。用於抑制腫瘤細胞生長之目的之本發明之抗-PD-1抗體(或其片段)或組合物之「生長抑制量」可經驗地及由本文提供之已知方法或實例進行測定。 如本文使用，「醫藥上可接受」或「醫藥上可相容」係意謂材料並非在生物學上或其他方面不適宜，例如，該材料可併入向病患投與之醫藥組合物內而不引起任何顯著之不適宜生物效應或不以有毒之形式與含該材料之組合物之其他組分中之任何一者相互作用。醫藥上可接受之載劑或賦形劑已較佳地滿足毒理學及製造測試之所需標準及/或包括於由美國食品及藥品監督管理局(U.S. Food and Drug administration)制訂之非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)上。 術語「偵測」意欲包括判定物質之存在或缺乏或定量物質(諸如PD-1)之量。因此該術語係指本發明之材料、組合物及方法用於定性及定量測定之用途。通常，用於偵測之特定技術就本發明之實務而言係非決定性的。 例如，根據本發明之「偵測」可包括：觀察PD-1基因產品、mRNA分子或PD-1多肽之存在或缺乏；PD-1多肽之濃度變化或結合至標靶之量之變化；PD-1多肽之生物功能/活性之變化。在一些實施例中，「偵測」可包括偵測野生型PD-1濃度(例如， mRNA或多肽濃度)。偵測可包括定量當相較於對照時，在10%與90%之間的任何值或在30%與60%之間的任何值或大於100%之變化(增加或減小)。偵測可包括定量在2倍至10倍(包括性)或更大(例如)100倍之間的任何值之變化。 字詞「標記」當本文使用時係指直接或間接結合至抗體之可偵測化合物或組合物。該標記自身可由自身偵測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶促標記之情況下，可催化可偵測之基質化合物或組合物之化學改變。 本文提及「約」某一值或參數係指個別值之為熟習此項技術者容易知道的之常見誤差範圍。本文提及「約」某一值或參數包括(及描述)針對該值或參數本身之態樣。例如，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。 應瞭解本文描述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由態樣及實施例組成」及「基本上由態樣及實施例組成」。 本文引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)係以全文引用之方式併入本文中。 抗-PD-1抗體 本發明係基於對結合PD-1受體(PD-1)之新穎抗體之識別。該等抗-PD-1抗體可用於各種治療及診斷方法中。例如，該等抗-PD-1抗體可單獨使用或與其他藥劑組合以治療特徵為異常PD-1表現或異常PD-1活性之疾病(包括，例如，黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)。本文提供之抗體亦可用於偵測病患或病患樣本中之PD-1蛋白，方式為藉由向病患投與抗-PD-1抗體及偵測結合至病患(例如，活體內或活體外)之樣本中之PD-1蛋白之抗-PD-1抗體或藉由使該等抗-PD-1抗體與來自病患之樣本接觸及定性或定量地偵測結合至該PD-1蛋白之抗-PD-1抗體。 程序化細胞死亡蛋白1 (亦稱為PD-1及CD279 (分化279之團簇))係在人類中由PDCD1基因編碼之蛋白質。PD-1係屬於免疫球蛋白超家族且表現於T細胞及增殖B細胞上之細胞表面受體。PD-1結合兩種配體(PD-L1及PD-L2)。作為免疫檢查點發揮作用之PD-1藉由防止T細胞之活化而在下調免疫系統中發揮重要作用，其進一步降低自體免疫及促進自體耐受。PD-1之抑制效應係通過促進淋巴結中之抗原抗原特異性T細胞之細胞凋亡(程序化細胞死亡)而同時減少調節T細胞(抑制T細胞)之細胞凋亡之雙重機制完成。 抗-PD-1抗體係以足夠之親和力及特異性結合至PD-1之抗體。較佳地，本文提供之抗-PD-1抗體(或其抗原結合片段)可用作治療劑以靶向及干擾其中涉及PD-1活性之疾病或病症。抗-PD-1抗體通常將不結合至其他免疫球蛋白超家族。較佳地，該抗-PD-1抗體係重組人類化抗-PD-1單株抗體。 根據一項實施例，抗-PD-1抗體包含CDR，本文揭示之抗體中之任何一者之可變重鏈區及/或可變輕鏈區。 在某些實施例中，本發明之抗-PD-1抗體係嵌合抗-PD-1抗體c1G4及/或人類化抗-PD-1 h1G4，其包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14)之CDR-H3。在一些實施例中，變體在SEQ ID No. 9至14之一或更多者中包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10個胺基酸取代。 具有c1G4及h1G4之輕鏈及重鏈之全長胺基酸及核苷酸序列及其等CDR序列係提供於下文序列表中。 本發明亦提供抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變域序列，該重鏈可變域序列包含(SEQ ID NO:4)中所述之胺基酸序列，及輕鏈可變域序列，該輕鏈可變域序列包含SEQ ID NO:2)中所述之胺基酸序列。 本發明亦提供人類化抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含(SEQ ID NO:8)中所述之胺基酸序列及包含SEQ ID NO:6)中所述之胺基酸序列之輕鏈可變域序列。 本發明進一步提供針對人類化h1G4抗-PD-1抗體之親和力成熟抗體。在某些實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，33B)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASLRHT (SEQ ID NO:16)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20)之CDR-H3。 在其他實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，66E)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23)之CDR-H3。 在某些實施例中，本發明之成熟抗-PD-1抗體(例如，抗-PD-1抗體，711D)包含輕鏈(LC)可變域序列，該輕鏈(LC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈(HC)可變域序列，該重鏈(HC)可變域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25)之CDR-H3。 重鏈及輕鏈可變域及CDR係以所有可能之成對組合進行組合以產生大量抗-PD-1抗體。 在某些實施例中，胺基酸取代係保守胺基酸取代。在某些實施例中，該等胺基酸取代不實質性減小抗體結合抗原之能力。例如，可作出不實質性減小PD-1結合親和力之保守改變(例如，如本文提供之保守取代)。抗-PD-1抗體變體之結合親和力可使用下文實例中描述之方法進行評估。 保守取代係以「保守取代」之標題顯示於表3中。更實質性之變化係以「示例性取代」之標題提供於表3中及關於胺基酸側鏈類別如下文進一步描述。可將胺基酸取代引入受關注之抗體內及針對所需活性(例如，經保留/改善之PD-1結合、經減小之免疫原性或經改善之ADCC或CDC)篩選產品。 表3：保守取代 非保守取代將涉及此等類別中之一者之成員與另一類別之成員交換。示例性取代變體係親和力成熟抗體，其可(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如彼等本文描述者)便利地產生。簡而言之，一或更多個CDR殘基係經突變及變體抗體展示於噬菌體上及針對特定生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。可在HVR中作出改變(例如，取代)以(例如)改善抗體親和力。可於HVR 「熱點」(即，由在體細胞成熟過程(參見例如，Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))期間由經歷高頻率突變之密碼子編碼之殘基)及/或SDR (a-CDR)中作出此等改變，及測試所得變體VH或Vl之結合親和力。藉由自第二庫構築及再選擇之親和力成熟已描述於(例如)Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編，Human Press, Totowa, NJ, (2001)中。 在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法中之任何一者(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變)將多樣性併入針對成熟選擇之可變基因內。然後產生第二庫。然後篩選該庫以識別具有所需親和力之任何抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中數個HVR殘基(例如，每次4至6個殘基)係經隨機化。涉及抗原結合之HVR殘基可(例如)使用丙胺酸掃描突變或建模明確識別。特定言之，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。 在一些實施例中，抗-PD-1抗體包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含選自由SEQ ID No: 9、21及24組成之群之胺基酸序列之CDR-L1；(2)包含SEQ ID No: 10或16之胺基酸序列之CDR-L2；(3)包含選自由SEQ ID No: 11、17、22組成之群之胺基酸序列之CDR-L3，及重鏈可變域序列(VH )，該重鏈可變域序列(VH )包含(1)包含SEQ ID No: 12或18之胺基酸序列之CDR-H1；(2)包含 SEQ ID No: 13或19之胺基酸序列之CDR-H2；及(3)包含選自由SEQ ID No: 14、20、23及25組成之群之胺基酸序列之CDR-H3。 重鏈及輕鏈可變域及CDR係以所有可能之成對組合進行組合以產生大量抗-PD-1抗體。 在某些實施例中，抗-PD-1抗體可在重鏈或輕鏈可變區中缺乏N-醣化基序，此可於一批抗體中引起差異，從而導致經改變之功能、免疫原性或穩定性。分析抗體醣化之方法包括(但不限於)例如，層析術(諸如陽離子交換層析術(CEX)或液相層析術)、質譜法(諸如電噴霧電離質譜法)及毛細管電泳-十二基硫酸鈉。此等方法係描述(例如)於Jung等人，(2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67；Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD等人編，Essentials of Glycobiology.，第2版，Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.，第45章；Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD等人編，Essentials of Glycobiology.，第2版，Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.，第47章；Leymarie等人，(2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048；Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review.，第106至110頁；及Raju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180中。 在某些實施例中，抗-PD-1抗體對PD-1具有比其對該PD-1之同源物更強之結合親和力。通常，該抗-PD-1抗體「特異性結合」至PD-1 (即，具有不大於約1 x 10-7 M，較佳地不大於約1 x 10-8 及最佳地不大於約1 x 10-9 M之結合親和力(Kd)值)但對PD-1家族之成員具有比其對PD-1之結合親和力弱至少約50倍或至少約500倍或至少約1000倍之結合親和力。特異性結合至PD-1之抗-PD-1抗體可為如上文定義之抗體之各種類型中之任何一者，但較佳係人類化或人類抗體。 在一些實施例中，如藉由此項技術中已知的方法(諸如ELISA、螢光活化之細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱法(RIA))測定，抗-PD-1抗體結合至非靶蛋白之程度係小於約該抗體對PD-1之結合之10%。特異性結合可(例如)藉由相較於對照分子(通常為具有類似結構但不具有結合活性之分子)之結合，測定分子之結合而進行量測。例如，特異性結合可藉由與類似於標靶(例如，過量之未經標記之標靶)之對照分子競爭而進行測定。在此情況下，若未經標記之標靶對探針之結合係由過量未經標記之標靶競爭抑制，則指示特異性結合。術語「特異性結合」或「特異性結合至」如本文使用之特定多肽標靶上之特定多肽或抗原決定基或「對(如本文使用之特定多肽標靶上之特定多肽或抗原決定基)具特異性」可(例如)藉由分子對該標靶具有至少約10-4 M，或者至少約10-5 M，或者至少約10-6 M，或者至少約10-7 M，或者至少約10-8 M，或者至少約10-9 M，或者至少約10-10 M，或者至少約10-11 M，或者至少約10-12 M或更大之Kd來顯示。在一項實施例中，術語「特異性結合」係指其中分子結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而不實質性結合至任何其他多肽或多肽抗原決定基之結合。 抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)係治療抗體針對腫瘤細胞之作用機制。ADCC係細胞介導之免疫防禦，藉此免疫系統之效應子細胞主動溶解靶細胞(例如，癌細胞)，其等膜表面抗原已由特異性抗體(例如，諸如本文描述之抗-PD-1抗體)結合。在一些實施例中，如由(例如)實例中描述之分析證實，該抗-PD-1抗體顯示與OPDIVO®或尼魯單抗類似之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應子功能。 例如，在某些實施例中，本文描述之抗-PD-1抗體之ADCC效應子功能活性係OPDIVO® (尼魯單抗)之ADCC效應子功能活性之至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%或大於100% (例如，約105%、約106%、約107%、約108%、約109%、約110%、約111%、約112%、約113%、約114%、約115%、約116%、約117%、約118%、約119%、約120%、約121%、約122%、約123%、約124%、約125%或約130%)，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，該抗-PD-1抗體顯示與OPDIVO®類似之針對PD-1之結合親和力。在某些實施例中，如實例中描述，對PD-1之結合係由ELISA證實。例如，抗-PD-1對PD-1之結合親和力係比OPDIVO® (尼魯單抗)對PD-1之結合親和力高約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%或大於100% (例如，約105%、約106%、約107%、約108%、約109%、約110%、約111%、約112%、約113%、約114%、約115%、約116%、約117%、約118%、約119%、約120%、約121%、約122%、約123%、約124%、約125%或大於約125%)。 在某些實施例中，該抗-PD-1抗體以在約0.1 pM至200 pM (0.2 nM)之間的Kd結合人類PD-1，例如，約0.1 pM、約0.25 pM、約0.5 pM、約0.75 pM、約1 pM、約 5 pM、約10p M、約20 pM、約30 pM、約40 pM、約50 pM、約60 pM、約70 pM、約80 pM、約90 pM、約100 pM、約110 pM、約120 pM、約130 pM、約140 pM、約150 pM、約160 pM、約170 pM、約180 pM、約190 pM或大於約190 pM，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體對PD-1之結合親和力係比OPDIVO® (尼魯單抗)對PD-1之結合親和力高約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%或大於約100% (例如，約105%、約110%、約120%或約130%)。在某些實施例中，該抗-PD-1對PD-1之結合親和力係比OPDIVO® (尼魯單抗)對PD-1之結合親和力高約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.25倍、約2.5倍、約2.75倍、約3倍、約3.25倍、約3.5倍、約3.75倍、約4倍、約4.25倍、約4.5倍、約4.75倍或大於約4.75倍，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體具有相較於OPDIVO®經延長之活體內半衰期。在某些實施例中，本文描述之抗-PD-1抗體之活體內半衰期係不短於OPDIVO® 之活體內半衰期。 在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體顯示類似於OPDIVO® (尼魯單抗)或其生物類似物之藥物動力學性質。在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體顯示係OPDIVO® (尼魯單抗)或其生物類似物之血清濃度-時間曲線之約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或大於95% (諸如約96%、約97%、約98%、約99%，或大於約99%)之AUC (曲線下面積)，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，該抗體包含人類IgG(例如，人類IgG1或人類IgG4)之Fc序列。在某些實施例中，該Fc序列已經改變或以其他方式變化使其缺乏抗體依賴性細胞毒性(ADCC)效應子功能，通常係關於其等對Fc受體(FcR)之結合。存在可改變效應子功能之Fc序列變化或突變之許多實例。例如，WO 00/42072及Shields等人，J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)描述具有改善或減弱之FcR結合之抗體變體。將彼等公開案之內容以引用之方式明確地併入本文內。該抗體可呈Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv (scFv)、Fv片段；雙功能抗體及線性抗體之形式。同樣地，該抗體可為結合至PD-1，但亦結合一或更多個其他標靶及抑制其等功能之多特異性抗體。該抗體可結合至治療劑(例如，細胞毒性劑、放射性同位素及化學治療劑)或標記以藉由成像(例如，放射性同位素、螢光染料及酶)偵測病患樣本中或活體內的PD-1。其他修飾包括毒素對本文提供之抗-PD-1抗體之結合。 亦預期編碼抗-PD-1抗體之核酸分子、包含編碼本文描述之CDR及/或重鏈可變域及/或輕鏈可變域之核酸分子之表現載體及包含該等核酸分子之細胞。此等抗體可用於本文描述之治療中及用以偵測病患樣本(例如，經由FACS、免疫組織化學法(IHC)、ELISA分析)或病患中之PD-1蛋白。 單株抗體 單株抗體可(例如)使用融合瘤方法(諸如彼等由Kohler及Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述者)製成或可由重組DNA方法(美國專利案第4,816,567號)製得或可由在下文實例中本文描述之方法產生。在融合瘤方法中，倉鼠、小鼠或其他適當之宿主動物係通常用免疫劑免疫以引起產生或可產生將特異性結合至該免疫劑之抗體之淋巴細胞。或者，該等淋巴細胞可經活體外免疫。 免疫劑將通常包括多肽或受關注之蛋白質之融合蛋白或包含該蛋白質之組合物。通常，若需要人類起源之細胞，則使用外周血淋巴細胞(「PBL」)，或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。該等淋巴細胞係然後使用合適之融合劑(諸如聚乙二醇)與永生化細胞系融合以形成融合瘤細胞(Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, New York: Academic Press, 1986，第59至103頁)。永生化細胞系通常係經轉形之哺乳動物細胞，特定言之嚙齒類動物、牛及人類起源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。該等融合瘤細胞可在較佳含有一或更多種抑制未經融合的永生化細胞之生長或存活之物質之合適培養基中培養。例如，若親代細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞之生長。 較佳之永生化細胞系係係彼等有效融合，藉由產生經選擇之抗體之細胞支持抗體之穩定高濃度表現及對培養基(諸如HAT培養基)敏感者。更佳之永生化細胞系係鼠科骨髓瘤系，其等可(例如)獲得自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia。人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞系亦已針對人類單株抗體之產生進行描述(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等人，MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987，第51至63頁)。 可然後分析其中培養融合瘤細胞之培養基中是否存在針對多肽之單株抗體。由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性可由免疫沈澱法或由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))判定。此項技術中已知此等技術及分析。單株抗體之結合親和力可(例如)由Munson及Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)之Scatchard分析測定。 在識別所需融合瘤細胞後，純系可藉由有限稀釋方法子選殖及藉由標準方法生長(Goding，同上)。適用於此目的之培養基包括(例如)杜貝卡式改良伊格培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)及RPMI- 1640培養基。或者，該等融合瘤細胞可作為腹水生長於活體哺乳動物中。 由子純系分泌之單株抗體可由諸如(例如)蛋白A-瓊脂糖、氫氧磷灰石層析術、凝膠電泳、透析或親和力層析術之習知免疫球蛋白純化程序自培養基或腹水液分離或純化。 單株抗體亦可由重組DNA方法製得，諸如彼等描述於美國專利案第4,816,567號中者。編碼本文提供之單株抗體之DNA可使用習知程序(例如，藉由使用可特異性結合至編碼鼠科抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離及定序。本文提供之融合瘤細胞充當此DNA之較佳來源。一經分離，可將該DNA放置於表現載體內，然後將該等表現載體轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白的宿主細胞(諸如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以獲得單株抗體在重組宿主細胞中之合成。該DNA亦可(例如)藉由用於人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源性鼠科序列(美國專利案第4,816,567號；Morrison等人，同上)或藉由使非免疫球蛋白多肽之編碼序列中之所有或部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列加以修飾。此非免疫球蛋白多肽可替代本文提供之抗體之恆定域，或可替代本文提供之抗體之一個抗原組合位點之可變域以產生嵌合二價抗體。 在某些實施例中，由本發明提供之抗-PD-1抗體係由穩定之哺乳動物細胞系表現。在某些實施例中，由本發明提供之抗-PD-1抗體係以約2.0公克/公升、約2.5公克/公升、約3.0公克/公升、約3.5公克/公升、約4.0公克/公升、約4.5公克/公升、約5.0公克/公升、約5.5公克/公升、約6公克/公升、約6.5公克/公升、約7.0公克/公升或大於約7.0公克/公升，包括在此等值之間的任何範圍之滴定量自穩定之哺乳動物細胞系表現。在某些實施例中，其中表現由本發明提供之抗-PD-1抗體之穩定之哺乳動物細胞系係CHO細胞系。 在某些實施例中，該等抗體係單價抗體。此項技術中已知用於製備單價抗體之方法。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈之重組表現。該重鏈係通常於Fc區中的任何一處經截斷，以便於防止重鏈交聯。或者，相關半胱胺酸殘基係經另一胺基酸殘基取代或經刪除以便於防止交聯。 活體外方法係亦適用於製備單價抗體。可使用(但不限於)此項技術中已知的技術完成抗體消化，以產生其片段(特定言之，Fab片段)。 人類及人類化抗體 該等抗體可為人類化抗體或人類抗體。非人類(例如，鼠科)抗體之人類化形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其他抗原結合子序列)，其等通常含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之CDR之殘基係經來自非人類物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠或兔)之具有所需特異性、親和力及能力之CDR之殘基置換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架殘基係經相應之非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含於受體抗體及輸入性CDR或框架序列均未見之殘基。通常，人類化抗體可包含大體上所有至少一個及通常兩個可變域，其中該等CDR區中之所有或大體上所有對應於彼等非人類免疫球蛋白之CDR區，及FR區中之所有或大體上所有係彼等人類免疫球蛋白共有序列中之FR區。人類化抗體較佳亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之一部分。Jones等人，Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332: 323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。 通常，人類化抗體具有來自非人類之來源之一或更多個胺基酸殘基引入於其中。此等非人類胺基酸殘基係通常稱為「輸入性」殘基，其等通常取自「輸入性」可變域。根據一項實施例，人類化可基本上遵循Winter及同事之方法 (Jones等人，Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332: 323-327 (1988)；Verhoeyen等人，Science, 239: 1534-1536 (1988))，藉由以嚙齒類動物CDR或CDR序列替代人類抗體之相應序列進行。因此，此等「人類化」抗體係其中大體上小於完整人類可變域已被來自非人類物種之相應序列替代之抗體(美國專利案第4,816,567號)。在實務中，人類化抗體通常係其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基係由來自嚙齒類動物抗體中的類似位點之殘基替代之人類抗體。 作為人類化的另一種選擇，可產生人類抗體。例如，如今可產生轉基因動物(例如，小鼠)，其在免疫後能夠在缺乏內源性免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體之完整庫。例如，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因之純合子刪除導致內源性抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變小鼠內將導致一經抗原激發即產生人類抗體。參見，例如，Jakobovits等人，PNAS USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等人，Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol., 7:33 (1993)；美國專利案第5,545,806、5,569,825、5,591,669、5,545,807號及WO 97/17852。 或者，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全失活之轉基因動物(例如，小鼠)內製得。一經激發，就會觀察到人類抗體產生，此在所有方面(包括基因重排、重組及抗體庫)與人類中所見皆極為相似。此方法係(例如)描述於美國專利案第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425與5,661,016號及Marks等人，Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；Lonberg及Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)中。 或者，可使用噬菌體展示技術(McCafferty等人，Nature 348:552-553, 1990)以自來自未免疫化供體之免疫球蛋白可變(V)域基因庫活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術之一項實施例，抗體V域序列係以順讀一致(in frame)方式選殖至絲狀噬菌體之主要或次要外殼蛋白基因(諸如M13或fd)內，並以功能抗體片段顯示在噬菌體顆粒之表面上。噬菌體展示可以各種形式進行，例如，如下文描述於實例部分中或回顧(例如)於Johnson, Kevin S.及Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)中。V-基因區段之數種來源可用於噬菌體展示。Clackson等人，Nature, 352:624-628 (1991)自衍生自免疫化小鼠之脾臟之V基因之小隨機組合庫分離各種抗-噁唑酮抗體。來自未免疫化人類供體之V基因庫可經構築及針對各種抗原(包括自身抗原)之抗體可遵循由Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或Griffith等人，EMBO J. 12:725-734 (1993)描述之技術而基本上分離。亦參見美國專利案第5,565,332及5,573,905號。 如上文討論，人類抗體亦可由經活體外活化之B細胞產生(參見美國專利案5,567,610及5,229,275)。 人類抗體亦可使用此項技術中已知的各種技術(包括噬菌體展示庫)產生。Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)。Cole等人及Boerner等人之技術亦適用於人類單株抗體之製備。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。 多特異性抗體 多特異性抗體係對兩種或更多種不同之抗原具有結合特異性之單株(較佳人類或人類化)抗體(例如，對至少兩種抗原具有結合特異性之雙特異性抗體)。例如，結合特異性中之一者可針對a5~1蛋白，另一者可針對任何其他抗原。根據一項較佳之實施例，另一種抗原係細胞表面蛋白或受體或受體子單元。例如，細胞表面蛋白可為自然殺手(NK)細胞受體。因此，根據一項實施例，本發明之雙特異性抗體可結合PD-1及(例如)第二細胞表面受體。 此項技術中熟知適用於製造雙特異性抗體之方法。例如，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中該等兩條重鏈具有不同之特異性。Milstein及Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)。因為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，此等融合瘤(細胞雜交瘤)產生具有十種不同抗體分子之可能混合物，其中僅一種具有正確之雙特異性結構。正確分子之純化係通常由親和層析步驟完成。類似過程係揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO, 10: 3655-3659 (1991)中。 具有所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原組合位點)可融合至免疫球蛋白恆定域序列。該融合較佳係與免疫球蛋白重鏈恆定域(包含鉸鏈、CH2及CH3區中之至少一部分)發生。含有輕鏈結合所需之位點之第一重鏈恆定區(CH1)較佳存在於該等融合物之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物(及視需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入各別表現載體內，並共轉染至合適之宿主生物體內。就產生雙特異性抗體之詳細說明而言，參見，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)。 亦已描述用於直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體片段之各種技術。例如，雙特異性抗體已使用白胺酸拉鏈產生。Kostelny等人，J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽係藉由基因融合連接至兩個不同抗體之Fab'部分。抗體同源二聚體係在鉸鏈區減少以形成單體及然後經再氧化以形成抗體異二聚體。此方法亦可用於產生抗體同源二聚體。由Hollinger等人，PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)描述之「雙功能抗體」技術已為製造雙特異性抗體片段提供替代機制。片段包含由連接子連接至VL之VH，該連接子太短而無法容許相同鏈上的兩個域之間配對。因此，一個片段之VH及VL域被迫與另一片段之互補VL及VH域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉助於單鏈Fv (sFv)二聚體以製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J. Immunol., 152:5368 (1994)。 預期具有超過兩個價數之抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)。 異質結合抗體 異質結合抗體係由兩個共價連接之抗體組成。此等抗體已(例如)經建議使免疫系統細胞靶向非所需之細胞(美國專利案第4,676,980號)及用於治療HIV感染。WO 91/00360、WO 92/200373、EP 03089。設想該等抗體可使用合成蛋白化學中已知的方法(包括彼等涉及交聯劑者)活體外製備。例如，免疫毒素可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵進行構築。適用於此目的之試劑之實例包括亞胺酸硫醇鹽及甲基-4-巰基丁基亞胺酸鹽(mercaptobutyrimidate)及彼等揭示(例如)於美國專利案第4,676,980號中者。 效應子功能改造 可能需要相對於效應子功能修飾本文提供之抗體，以便於增強(例如)抗體於治療癌症中之效用。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區內，藉此容許在此區內形成鏈間二硫鍵。因此產生之同源二聚性抗體可具有改善之內化能力及/或增強之補體介導之細胞殺滅及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見，Caron等人，J. Exp. Med., 176: 1191- 1195 (1992)及Shapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)。具有增強之抗腫瘤活性之同源二聚性抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)中描述之異型雙官能交聯劑製備。或者，抗體可經改造以具有雙重Fc區及可藉此具有增強之補體溶解及ADCC能力。參見，Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)。 可在Fc區序列中作出突變或改變以改善FcR結合(例如，FcγR、FcRn)。根據一項實施例，本發明之抗體具有選自由以下組成之群之至少一種經改變之效應子功能：ADCC、CDC及相較於天然IgG或親代抗體經改善之FcRn結合。數種有用之特異性突變之實例係描述(例如)於Shields, RL等人，(2001) JBC 276(6)6591-6604；Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490及WO 00/42072中。 根據一項實施例，Fc受體突變係在選自由以下組成之群之至少一個位置處之取代：Fc區之238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區中殘基之編號係根據EU編號系統。在一些實施例中，該Fc受體突變係D265A取代。在一些實施例中，該Fc受體突變係N297 A取代。額外合適之突變係所述於美國專利案第7,332,581號中。 免疫結合物 本發明亦關於包含結合至細胞毒性劑(諸如化學治療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物起源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性結合物))之抗體之免疫結合物。 可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思子素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii )蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、米托潔林(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯(tricothecene)。各種放射性核素可用於產生經放射結合之抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。適用於產生此等免疫結合物之示例性化學治療劑包括彼等本文於別處描述者。 在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體係結合至美登素(maytansine)、美登醇(maytansinoid)或卡奇黴素(calicheamicin)。在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體係結合至美登醇DM1。 抗體及細胞毒性劑之結合物係使用各種雙功能蛋白偶聯劑製成，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫醇基)丙酸鹽(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(諸如己二亞醯胺二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science, 238: 1098 (1987)中描述製備。經碳-14-標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於使放射性核苷酸結合至抗體之示例性螯合劑。參見WO94/11026。 在另一實施例中，該抗體可結合至「受體」 (諸如鏈黴親和素)以用於腫瘤預靶向中，其中將該抗體-受體結合物投與病患，接著使用清潔劑自循環移除未經結合之結合物及然後投與結合至細胞毒性劑(例如，放射性核苷酸)之「配體」 (例如，抗生物素蛋白)。 共價修飾 抗-PD-1抗體及其片段之共價修飾係包括於本發明之範圍內。共價修飾之一種類型包括使多肽之靶向胺基酸殘基與可與多肽之經選擇之側鏈或N端或C端殘基反應之有機衍生劑反應。與雙功能劑之衍生係(例如)適用於將該多肽交聯至不溶於水之支持基質或表面以用於純化抗體之方法中，及反之亦然。常用交聯劑包括(例如)1,1-雙(重氮基乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯(例如，具有4-疊氮基水楊酸之酯)、同雙功能亞胺酸酯(包括二琥珀醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫雙(琥珀醯亞胺基-丙酸酯))、雙功能馬來醯亞胺(諸如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷)及試劑(諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)-二硫]丙醯異丙亞胺)。 其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別變為相應之麩胺醯基及天冬胺醯基殘基之脫醯胺作用；脯胺酸及離胺酸之羥化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco，第79至86頁(1983))；N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。 多肽之共價修飾之另一類型包括以美國專利案第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述之方式將該多肽連接至各種非蛋白聚合物中之一者，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧伸烷基。 嵌合分子 本發明之抗-PD-1抗體及/或其片段亦可(若有利)以形成包含融合至另一異源性多肽或胺基酸序列(例如，免疫黏附素或肽抗體)之多肽之嵌合分子之方式而經修飾。 在一項實施例中，此嵌合分子包含多肽與蛋白轉導域之融合，該蛋白轉導域靶向該多肽以遞送至各種組織及更特定言之跨腦血屏障遞送，使用(例如)人類免疫缺陷病毒TAT蛋白之蛋白轉導域(Schwarze等人，1999, Science 285: 1569-72)。 在另一實施例中，此嵌合分子包含多肽與標籤多肽之融合，該標籤提供抗-標籤抗體可選擇性結合之抗原決定基。該抗原決定基標籤係通常放置於該多肽之胺基端或羧基端。該多肽之此等抗原決定基標記之形式之存在可使用針對標籤多肽之抗體偵測。同樣地，抗原決定基標籤的提供能夠使用抗-標籤抗體或結合至該抗原決定基標籤之另一類型之親和基質藉由親和純化易於純化該多肽。此項技術中已知各種標籤多肽及其等個別抗體。實例包括聚-組胺酸(聚-His)或聚-組胺酸-甘胺酸(聚-His-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5 (Field等人，Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]；c-myc標籤及結合至其之8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體(Evan等人，Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及單純皰疹病毒醣蛋白D (gD)標籤及其抗體(Paborsky等人，Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]。其他標籤多肽包括標誌-肽(Flag-peptide)(Hopp等人，BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；KT3抗原決定基肽(Martin等人，Science, 255:192-194 (1992)]；α-微管蛋白抗原決定基肽(Skinner等人，J. Biol. Chem., 266:15163- 15166 (1991)]；及T7基因10蛋白肽標籤(Lutz-Freyermuth等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))。 在替代實施例中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區之融合。就嵌合分子(例如，「免疫黏附素」)之二價形式而言，此融合可至IgG分子之Fc區。本發明之Ig融合包括多肽，該等多肽包含取代Ig分子內之至少一個可變區之人類之約或僅殘基94至243、殘基33至53或殘基33至52。在特別較佳之實施例中，該免疫球蛋白融合包括鉸鏈、CH2及CH3或IgG1分子之鉸鏈、CH1、CH2及CH3區。就免疫球蛋白融合之產生而言，亦參見1995年6月27日發證之美國專利案第5,428,130號。 免疫脂質體 本文揭示之抗體亦可調配為免疫脂質體。包含抗體之脂質體係由此項技術中已知的方法製備，諸如描述於Epstein等人，PNAS USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人，PNAS USA, 77: 4030 (1980)；及美國專利案第4,485,045及4,544,545號中之方法。具有增加之循環時間之脂質體係揭示於美國專利案第5,013,556號中。 特別有用之脂質體可藉由逆相蒸發方法用包含卵磷脂、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。將脂質體擠壓通過具有指定孔徑之過濾器以產生具有所需直徑之脂質體。本發明之抗體之Fab’片段可經由二硫鍵交換反應結合至如Martinet等人，J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)中描述之脂質體。抗腫瘤藥劑、生長抑制劑或化學治療劑(諸如阿黴素)亦視需要包括於該脂質體內。參見，Gabizon等人，J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)。 使用抗-PD-1抗體治療 可將本文提供之抗-PD-1抗體及/或其片段及/或組合物投與至個體(例如，哺乳動物，諸如人類)以治療涉及異常PD-1活性之疾病及失調症，其等包括(例如)癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。在某些實施例中，本發明提供本文描述之抗-PD-1抗體(或其片段)以用於製造治療癌症之藥劑，該癌症為個體中之癌症(諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma) (cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)。在某些實施例中，本發明提供本文描述之抗-PD-1抗體或其片段)以用於治療個體中之癌症(諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)。 在某些實施例中，本發明提供包含本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)之醫藥組合物，其用於治療個體中之癌症(黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)。在某些實施例中，待治療之個體係哺乳動物(例如，人類、非人類靈長類動物、大鼠、小鼠、奶牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等)。在某些實施例中，該個體係人類。在某些實施例中，該個體係臨床病患、臨床試驗志願者、實驗動物等。在某些實施例中，該個體疑似患有或存在風險患有癌症(諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)或經診斷患有癌症或患有異常PD-1表現或活性之任何其他疾病。 此項技術中已知許多診斷方法，該等診斷方法用於癌症(諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)或顯示異常PD-1活性之任何其他疾病，及彼等疾病之臨床描述。此等方法包括(但不限於)例如，免疫組織化學、PCR、螢光原位雜交(FISH)。關於用於異常PD-1活性或表現之診斷方法之額外詳細說明係描述(例如)於Gupta等人，(2009)Mod Pathol . 22(1): 128-133；Lopez-Rios等人，(2013)J Clin Pathol . 66(5): 381-385；Ellison等人，(2013)J Clin Pathol 66(2): 79-89；及Guha等人，(2013)PLoS ONE 8(6): e67782中。 投與可為藉由任何合適之途徑，包括(例如)靜脈內、肌內或皮下投與。在一些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)及/或組合物係與第二、第三或第四試劑(包括，例如，抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑)組合投與以治療涉及異常PD-1活性之疾病或失調症。此等藥劑包括(例如)多西他賽(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI (伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)及甲醯四氫葉酸(leucovorin))、伊立替康(irinotecan)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、貝伐單抗(bevacizumab) (抗-VEGF抗體)、FOLFOX-4、滴注氟尿嘧啶(infusional fluorouracil)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)及奧沙利鉑(oxaliplatin)、阿法替尼(afatinib)、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、魯索利替尼(tivantinib)、依維莫司(everolimus)、CpG-ODN、雷帕黴素(rapamycin)、來那度胺(lenalidomide)、維羅非尼(vemurafenib)、內皮抑素(endostatin)、拉帕替尼(lapatinib)、PX-866、Imprime PGG及埃羅替尼(irlotinibm)。在一些實施例中，抗-PD-1抗體(或其片段)係結合至額外之藥劑。 在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)及/或組合物係與一或更多種額外之治療組合投與，諸如放射治療、外科手術、化學治療及/或靶向治療。在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)及/或組合物係與放射治療組合投與。在某些實施例中，本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)及/或組合物與放射治療之組合係用於治療選自由以下組成之群之癌症：黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌及甲狀腺癌。 取決於待治療之病症及與熟知該領域之醫師所熟悉之給藥相關之因素，本文提供之抗-PD-1抗體或其片段將以有效治療該病症同時最小化毒性及副作用之劑量投與。就癌症(諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌)之治療而言，典型劑量可為(例如)在0.001至1000 μg之範圍內；然而，低於或高於此示例性範圍之劑量係在本發明之範圍內。每日劑量可為總體重之約0.1 μg /kg至約100 mg/kg (例如，約5 μg/kg、約10 μg/kg、約100 μg/kg、約500 μg/kg、約1 mg/kg、約50 mg/kg或由前述值中之任何兩者定義之範圍)，較佳自總體重之約0.3 μg/kg至約10 mg/kg (例如，約0.5 μg/kg、約1 μg/kg、約50 μg/kg、約150 μg/kg、約300 μg/kg、約750 μg/kg、約1.5 mg/kg、約5 mg/kg或由前述值中之任何兩者定義之範圍)，更佳自總體重之約1 μg/kg至1 mg/kg (例如，約3 μg/kg、約15 μg/kg、約75 μg/kg、約300 μg/kg、約900 μg/kg或由前述值中之任何兩者定義之範圍)，及甚至更佳自每日體重之約0.5至10 mg/kg (例如，約2 mg/kg、約4mg/kg、約7 mg/kg、約9 mg/kg或由前述值中之任何兩者定義之範圍，包括前述值之間的任何範圍)。如上文指示，治療或預防效用可由已治療病患之定期評估進行監測。就經數日或更久之重複投與而言，取決於病症，重複治療直至發生疾病症狀之所需抑制。然而，其他劑量方案可為有用的及係在本發明之範圍內。所需劑量可由組合物之單一劑量投與；組合物之多次劑量投與或組合物之連續輸液投與進行遞送。 包含抗-PD-1抗體或其片段之醫藥組合物可每日投與一、二、三或四次。該等組合物亦可頻率較低地每日投與，例如，一週六次、一週五次、一週四次、一週三次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、一月一次、每兩個月一次、每三個月一次、或每六個月一次。該等組合物亦可以緩釋調配物(諸如在一定時間週期內使用時逐漸釋放該組合物之植入物)投與，及容許該組合物以較低之頻率投與，諸如一月一次、每2至6個月一次、每年一次或甚至單一投與。緩釋裝置(諸如丸劑、奈米顆粒、微粒、奈米球、微球及類似物)可由注射投與。 抗體(或其片段)可以單一每日劑量投與，或總每日劑量可以每日二、三或四次之分開劑量投與。組合物亦可以低於每日之頻率投與，例如，一週六次、一週五次、一週四次、一週三次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次。該抗體(或其片段)亦可以緩釋調配物(諸如在一定時間週期內使用時逐漸釋放該組合物之植入物)投與，及容許該組合物以較低之頻率投與，諸如一月一次、每2至6個月一次、每年一次或甚至單一投與。緩釋裝置(諸如丸劑、奈米顆粒、微粒、奈米球、微球及類似物)可由注射投與或以外科手術植入各種位置中。 癌症治療可由(例如，但不限於)腫瘤消退、腫瘤體重或體積縮小、進展之時間、存活之持續時間、無進展存活期、整體反應速率、反應之持續時間、生活之品質、蛋白質表現及/或活性進行評估。可採用判定治療效用之方法，其等包括(例如)通過放射成像量測反應。 在一些實施例中，治療效用係作為百分率腫瘤生長抑制(% TGI)進行量測，其使用等式100-(T/C x 100)計算，其中T係經治療腫瘤之平均相對腫瘤體積，及C係未經治療腫瘤之平均相對腫瘤體積。在某些實施例中，該%TGI係約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%或大於95%。在某些實施例中，抗-PD-1之% TGI係於OPDIVO®之% TGI相同或大於OPDIVO®之% TGI，諸如約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.1倍、約2.2倍、約2.3倍、約2.4倍、約2.5倍、約2.6倍、約2.7倍，包括在此等值之間的任何範圍，或比OPDIVO®之% TGI大大於約2.7倍。 醫藥調配物 抗-PD-1抗體(或其片段)可與合適之載劑或賦形劑調配使得其等適用於投與。抗體之合適調配物係藉由將具有所需純度之抗體(或其片段)與視需要之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合成凍乾調配物或水溶液形式獲得(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編，(1980))。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對受體係無毒的，及包括緩衝劑(諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸)；抗氧化劑(包括抗壞血酸及甲硫胺酸)；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、六甲氯銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、酚醇、丁醇或苄醇、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲苯酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸)；單醣、二醣及其他醣類(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑(諸如EDTA)；糖類(諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)；成鹽對離子(諸如鈉)；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子型表面活性劑(諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG))。示例性抗體調配物係描述於W098/56418中，以引用之方式將其明確併入本文內。適用於皮下投與之凍乾調配物係描述於W097/04801中。此等凍乾調配物可用合適之稀釋劑復水至高蛋白質濃度及經復水之調配物可皮下投與至本文中待治療之哺乳動物。 本文之調配物亦可含有不止一種如治療中之特定病症所需之活性化合物，較佳彼等具有互補活性而不彼此不利影響者。例如，可視需要進一步提供抗腫瘤藥劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑。此等分子係以有效用於預期目的之量適當地存在於組合物中。此等其他藥劑之有效量取決於存在於該調配物中之抗體之量、疾病或失調症或治療之類型及上文討論之其他因素。此等藥劑通常以如本文描述之相同之劑量及投與途徑使用或以迄今所用劑量之約自1至99%使用。亦可將活性成分包埋於(例如)由凝聚技術或由界面聚合製備之微膠囊(例如，分別為羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗乳液內。此等技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編，(1980)中。可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質係以成形物件之形式(例如，薄膜或微膠囊)。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利案第3,773,919號)、L-麩胺酸及乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解乙烯-乙烯基、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT™) (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。 脂質體(Lipofectin或liposome)可用以將本發明之多肽及抗體(或其片段)或組合物遞送至細胞內。在使用抗體片段之情況下，特異性結合至靶蛋白之結合域之最小抑制片段較佳。例如，基於抗體之可變區序列，肽分子可經設計以保留結合靶蛋白序列之能力。此等肽可化學合成及/或由重組DNA技術產生。參見，例如， Marasco等人，PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993)。 亦可將活性成分包埋於(例如)由凝聚技術或由界面聚合製備之微膠囊(例如，分別為羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗乳液內。此等技術係揭示於Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES中，同上。 可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有抗體(或其片段)之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質係以成形物件之形式(例如，薄膜或微膠囊)。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利案第3,773,919號)、L-麩胺酸及乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT TM) (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物可釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白釋放更短之時間週期。當囊封抗體在體內保留較長時間時，其等可因在37℃下曝露於水分而變性或聚集，導致生物活性之損失及免疫原性之可能變化。取決於涉及之機制，可針對穩定設計合理策略。例如，若發現聚集機制係通過硫醇基-二硫鍵互換之分子間S-S鍵形成，則穩定可由以下達成：修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當之添加劑及顯影特異性聚合物基質組合物。 在某些實施例中，該調配物包含具有以下濃度之本文描述之抗-PD-1抗體：大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約2 mg/ml、大於約3 mg/ml、大於約4 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約6 mg/ml、大於約7 mg/ml、大於約8 mg/ml、大於約9 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約11 mg/ml、大於約12 mg/ml、大於約13 mg/ml、大於約14 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約16 mg/ml、大於約17 mg/ml、大於約18 mg/ml、大於約19 mg/ml、大於約20 mg/ml、大於約21 mg/ml、大於約22 mg/ml、大於約23 mg/ml、大於約24 mg/ml、大於約25 mg/ml、大於約26 mg/ml、大於約27 mg/ml、大於約28 mg/ml、大於約29 mg/ml或大於約30 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，抗-PD-1抗體係(例如，以大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg.ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)調配於包含檸檬酸鹽、NaCl、乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘胺酸、聚山梨醇酯80 (吐溫80)或前述之任何組合之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係(例如，以大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)調配於包含約100 mM至約150 mM甘胺酸之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係調配於包含約50 mM至約100 mM NaCl之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係(例如，以大於約mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)調配於包含約10 mM至約50 mM乙酸鹽之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係調配於包含約10 mM至約50 mM琥珀酸鹽之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係(例如，以大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)調配於包含約0.005%至約0.02%聚山梨醇酯80之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係調配於具有在約5.1與5.6之間的pH之緩衝劑中。在某些實施例中，該抗-PD-1抗體係調配於包含10 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝劑中，其中該調配物係pH=5.5。 在某些實施例中，包含本文描述之PD-1抗體(例如，以大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)之調配物(諸如包含包含10 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝劑之調配物，其中該調配物係pH=5.5)係在室溫下穩定(諸如在約20至25℃下穩定約0.5週、1.0週、1.5週、2.0週、2.5週、3.5週、4.0週、4.5週或5.0週，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，包含本文描述之PD-1抗體(例如，以大於約0.5 mg/ml、大於約1 mg/ml、大於約5 mg/ml、大於約10 mg/ml、大於約15 mg/ml、大於約20 mg/ml或大於約25 mg/ml，包括在此等值之間的任何範圍之濃度)之調配物(諸如包含包含10 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝劑之調配物，其中該調配物係pH=5.5)係在加速條件下穩定(諸如在約37℃下儲存)穩定約0.5週、1.0週、1.5週、2.0週、2.5週、3.5週、4.0週、4.5週、或5.0週，包括在此等值之間的任何範圍。 粒徑排阻層析術(SEC)係蛋白質穩定性研究中用於偵測可能之片段化及聚集(對應於物理及化學不穩定性)之熟知且廣泛使用之方法。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml, 10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%高分子量物質，在37℃下1週後的高分子量物質(HMWS)增加小於約1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%高分子量物質，在37℃下2週後的高分子量物質增加小於約2.0%、1.8%、1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-EFGR抗體之調配物顯示相對於初始%高分子量物質，在37℃下4週後的高分子量物質增加小於約3.3%、3.2%、3.1%、3.0%、2.9%、2.8%、2.7%、2.6%、2.5%、2.4%、2.2%、2.0%、1.8%、1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%低分子量物質，在37℃下1週後的低分子量物質(LMWS)增加小於約1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%低分子量物質，在37℃下2週後的低分子量物質增加小於約2.0%、1.8% 1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%低分子量物質，在37℃下4週後的低分子量物質增加小於約2.4%、2.2%、2.0%、1.8% 1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%單體，在37℃下1週後的單體減少不大於約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%或3.5%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物顯示相對於初始%單體，在37℃下2週後的單體減少不大於約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%或3.5%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用SEC量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-EFGR抗體之調配物顯示相對於初始%單體，在37℃下2週後的單體減少不大於約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%或3.5%，包括在此等值之間的任何範圍。 陽離子交換層析術(CEX)係用於偵測蛋白質降解事件諸如脫醯胺作用或氧化(Moorhouse等人，(1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593–603)的熟知且廣泛使用之工具。降解產物通常係稱作酸性或鹼性物質。酸性物質係比來自CEX之主峰更早溶析之變體，而鹼性物質係比來自CEX之主峰更晚溶析之變體。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之酸性峰值部分在37℃下1週後係不大於總蛋白質之約7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之酸性峰值部分在37℃下2週後係不大於總蛋白質之約8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%或18%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之酸性峰值部分在37℃下2週後係不大於總蛋白質之約8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%或27%，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之鹼性峰值部分在37℃下1週後係不大於總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之鹼性峰值部分在37℃下2週後係不大於總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之鹼性峰值部分在37℃下4週後係不大於總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。 在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之主峰部分在37℃下1週後係不小於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之鹼性峰值部分在37℃下2週後係不小於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，如使用CEX量測，包含5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml或25 mg/ml本文描述之抗-PD-1抗體之調配物之鹼性峰值部分在37℃下4週後係不小於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%，包括在此等值之間的任何範圍。 待用於活體內投與之調配物必須係無菌的。此容易由(例如)通過無菌過濾膜過濾完成。 使用抗-PD-1抗體之診斷及成像之方法 經標記之抗-PD-1抗體、其片段及其衍生物及類似物(其等特異性結合至PD-1多肽)可出於診斷目的用於偵測、診斷或監測與PD-1之表現、異常表現及/或活性相關之疾病及/或失調症。例如，本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)可用於原位、活體內、活體外及活體外診斷分析或成像分析中。用於偵測PD-1多肽之表現之方法包括(a)使用一或更多種本發明之抗體分析個體之細胞(例如，組織)或體液中多肽之分析，及(b)比較基因表現程度及標準基因表現程度，藉此經分析之基因表現程度相較於標準表現程度之增加或減小指示異常表現。 本文提供之額外實施例包括診斷動物(例如，哺乳動物，諸如人類)中與PD-1之表現或異常表現相關之疾病或失調症之方法。該等方法包括偵測哺乳動物中之PD-1分子。在某些實施例中，診斷包括：(a)向哺乳動物投與有效量之經標記之抗-PD-1抗體(或其片段)，(b)在投與後等待一定時間間隔，以容許經標記之抗-PD-1抗體(或其片段)在個體之其中表現PD-1分子之位點處優先濃縮(及容許未經結合之經標記之分子清除至背景水平)；(c)測定背景水平；及(d)偵測個體中經標記之分子，使得經標記之分子之高於背景水平之偵測指示該個體患有與PD-1之表現或異常表現相關之特定疾病或失調症。背景水平可由各種方法測定，該等方法包括將經偵測後之標記分子之量及先前針對特定系統測定之標準值進行比較。 本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)可用以使用熟習此項技術中已知的經典免疫組織化學方法分析生物樣本中之蛋白質濃度(例如，參見Jalkanen,等人，J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)；Jalkanen,等人，J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987))。適用於偵測蛋白質基因表現之其他基於抗體之方法包括免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。合適之抗體分析標記係此項技術中已知且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115m In、113m In、112 In、111 In)及鍀(99 Tc、99m Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru；魯米諾(luminol)；及螢光標記，諸如螢光素及羅丹明(rhodamine)及生物素。 此項技術中已知的技術可應用至本文提供之經標記之抗體(或其片段)。此等技術包括(但不限於)使用雙官能偶聯劑(參見例如，美國專利案第5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；及5,808,003號)。 或者或另外，吾人可量測細胞中編碼PD-1多肽之核酸或mRNA之濃度，例如，經由使用對應於編碼PD-1之核酸或其補體之基於核酸之探針進行之螢光原位雜交；(FISH；參見1998年10月公開之W098/454 79)、南方印漬術、北方印漬術或聚合酶鏈反應(PCR)技術，諸如實時定量PCR (RT-PCR)。吾人亦可藉由量測生物流體(諸如血清)中之脫落抗原(shed antigen)，例如，使用基於抗體之分析(亦參見，例如，1990年6月12日發證之美國專利案第4,933,294號；1991年4月18日公開之W091/05264；1995年3月28日發證之美國專利案第5,401,638號；及Sias等人，J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990))研究PD-1過表現。除上文分析外，熟習執業醫師可獲得各種活體內及活體外分析。例如，吾人可使哺乳動物體內之細胞曝露於視需要經可偵測標記(例如，放射性同位素)標記之抗體，該抗體與該細胞之結合可(例如)藉由針對放射性進行外部掃描或藉由分析取自先前曝露於抗體之哺乳動物之樣本(例如，活組織切片或其他生物樣本)以進行評估。 製造物件及套組 本文提供之另一實施例係含有適用於治療癌症之材料之製造物件，該癌症諸如黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三陰性乳癌，TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及唾液腺癌。製造物件可包含容器及於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。該等容器可形成自各種材料，諸如玻璃或塑膠。通常，該容器容納有效治療病症之組合物及可具有無菌出入口(例如，該容器可為靜脈輸液袋或具有可由皮下注射針刺破之塞子之小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑係本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)。該標籤或包裝插頁指示該組合物適用於治療特定之病症。該標籤或包裝插頁將進一步包含用於向病患投與該抗體組合物之說明書。亦預期包含本文描述之組合治療之製造物件及套組。 包裝插頁係指通常包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其包含有關使用此等治療產品之適應症、用途、劑量、投與、禁忌症及/或警告之資訊。在一項實施例中，該包裝插頁指示該組合物適用於治療癌症(諸如頭頸癌、肺癌或結腸直腸癌)。 另外，製造物件可進一步包含第二容器，其包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、格氏溶液及葡萄糖溶液。其可進一步包括在商業及使用者立場上所需之其他材料，其等包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 亦提供適用於各種目的(例如，適用於分離或偵測病患中之PD-1)之套組，該等套組視需要與製造物件組合。就PD-1之分離及純化而言，該套組可含有結合至珠(例如，SEPHAROSETM 珠)之本文提供之抗-PD-1抗體(或其片段)。可提供含有用於偵測及定量活體外(例如，在ELISA或西方墨點轉漬法中)PD-1之抗體(或其片段)之套組。與製造物件一樣，該套組包含容器及於該容器上或與該容器相關之標籤或包裝插頁。例如，該容器容納包含至少一種本文提供之抗-PD-1抗體之組合物。可包括含有(例如)稀釋劑及緩衝劑、對照抗體之額外容器。該標籤或包裝插頁可提供該組合物之描述及針對預期活體外或診斷用途之說明書。 實例 實例1 抗-PD1抗體之研發 抗-PD-1抗體之研究係如下總結。藉由篩選自構築自經PD-1 (經純化之重組6xHis標記之PD-1_ECD抗原) (如SEQ ID NO: 26揭示之「6xHis」)免疫之小鼠之融合瘤所產生之Fab噬菌體庫識別陽性抗-PD-1抗體純系。進行下文中進一步詳細描述之活體外功能分析以表徵該等純系。 簡而言之，將融合瘤純系之連續稀釋液用塗覆PD1-His蛋白之盤在室溫下培養1小時，及在450 nm下監測PD1結合活性。該等盤係用於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之5%牛奶在室溫下阻斷1小時及用PBS-吐溫20 (PBST)清洗，接著添加融合瘤稀釋液。在用融合瘤純系培養後，該等盤用PBST清洗，用1:4000抗-小鼠IGG-HRP在室溫下培養1小時，用PBST清洗，用四甲基聯苯胺(TMB)顯影，及最後使用H2 SO4 以停止該反應，及量測在450 nm下之吸光度。 流動式細胞測量術顯示純系ID編號11、12、14、16、18、20、24、27及28可結合PD-1。用於評估PD-1結合之流動式細胞測量術條件包括以下之步驟：1) 用PBS (2% FBS)清洗4E+05個表現PD-1之CHO-S細胞兩次；2)添加融合瘤上清液，在4℃下培養30 min；3)在500 x g下將細胞離心5 min；4)用PBS (2% FBS)清洗兩次；5)添加經1:150稀釋之山羊抗-人類IgG-FITC，在4o C下培養30 min；6)用PBS (2% FBS)清洗細胞兩次；及7)將細胞懸浮於50 μl 1x PBS中，藉由流動式細胞測量術分析。 流動式細胞測量術係用以評估融合瘤上清液阻斷PD-L1與PD1之間的結合之能力。結果顯示經純系#11阻斷之結合相當於參考抗-PD-1抗體(例如，尼魯單抗)。進行之流動式細胞測量術結合分析包括以下之步驟：1) 用PBS (2% FBS)清洗每個樣本4E+05個細胞兩次；2)混合8 μg/mL生物素-PDL1及融合瘤上清液，體積比率為1:1；3)向細胞添加60 μL來自步驟2之混合物及在4℃下培養30 min；4)細胞用PBS (2% FBS)清洗兩次；5)用抗生物素蛋白-FITC (1:65稀釋液)在4℃下將細胞培養30 min；及6)細胞用PBS (2% FBS)清洗兩次。 於SS320感受態細胞中識別一個陽性PD-1群落(c1G4)。下文提供c1G4純系之特徵及序列。 實例2 產生人類化抗-PD-1抗體1G4 (h1G4) 人類化抗-PD-1抗體1G4 (h1G4)係使用人類生殖系輕鏈可變區IGKV1-39*01及人類生殖系重鏈可變區IGHV3-11*04產生。簡而言之，人類化係藉由將來自嵌合c1G4之輕鏈及重鏈之CDR殘基移植至人類免疫球蛋白之類似輕鏈及重鏈框架完成。移植CDR之人類化抗體之庫可經產生以用於進一步基於活體外噬菌體展示之親和力成熟以增強對其抗原之親和力。 針對c1G4及h1G4之序列比對係顯示於圖8A及8B中。圖8A顯示嵌合c1G4、人類化h1G4、人類生殖系輕鏈可變區IGKV1-39*01及尼魯單抗(NIV)之輕鏈之胺基酸序列比對。圖8B顯示嵌合c1G4、人類化h1G4、人類生殖系重鏈可變區IGHV3-11*04及尼魯單抗(NIV)之重鏈之胺基酸序列比對。自c1G4移植以用於人類化之CDR (互補決定區)係用粗體加下劃線文本標識。 實例3 c1G4及h1G4之平衡解離常數(KD)之測定 結合親和力及動力學係使用表面電漿子共振(SPR)量測。將抗-人類IgG Fc首先固定於感測器晶片上及然後以Rmax ~ 150 RU捕獲參考抗-PD-1抗體、c1G4及h1G4。實驗係在25℃下進行，及量測係用PD-1-His之自58.8 nM至7.35 nM之連續稀釋液穿過用0.1% (w/v) BSA補充之HBS-P+緩衝劑中之經捕獲抗體來進行。所有資料係用評估軟體分析及曲線係用1:1朗繆爾(Langmuir)結合模型擬合。 結合及解離動力學及算得的親和力(KD)係由表面電漿子共振(SPR)量測。相比於抗-PD-1參考之對c1G4及h1G4之親和力之改善亦顯示於下表4中。資料係代表一式兩份進行之兩個獨立實驗。 表4 實例4 嵌合c1G4及人類化h1G4抗體之結合特徵 c1G4對PD-1重組蛋白之結合 進行ELISA分析以評估嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體對PD-1之結合。嵌合c1G4及參考抗-PD-1之連續稀釋液係用PD-1-His於微量滴定盤之孔中捕獲。各孔中經捕獲之抗體之量係使用抗-人類IgG Fc-HRP-結合之二級抗體定量。向該等孔添加HRP-結合之二級抗體，及在培養後，沖走過量之二級抗體。向該等孔添加TMB，及在培養後，停止該反應，及藉由監測在450 nm下之吸光度之增加量測HRP活性。進行以比較抗-PD-1抗體嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體對PD-1-His之結合之ELISA之結果係顯示於圖1A中。 圖1B顯示進行以比較抗-PD-1抗體嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體對PD-1-AP之結合之第二組ELISA之結果。嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體之連續稀釋液係用抗-人類IgG Fc抗體於微量滴定盤之孔中捕獲。各孔中經捕獲之抗體之量係使用AP-結合之PD-1定量。在培養後，沖走過量之PD-1-AP。向該等孔添加鹼性磷酸鹽受質，及在培養後，停止該反應及藉由監測在405 nm下之吸光度之增加量測AP活性。 結果指示嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體可結合至PD-1-His及PD-1-AP。 c1G4對PD-1配體之結合之阻斷及競爭 嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體之連續稀釋液係用PD-L1-AP在室溫下培養2小時。將各抗體:抗原混合物添加至微量滴定盤之塗覆PD-1-His之孔。在培養及清洗後，向該等孔添加pNPP及培養1小時以偵測經結合之PD-L1-AP。藉由監測在405 nm下之吸光度之增加量測AP活性。圖2A顯示進行以比較抗-PD-1抗體嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體阻斷PD-L1及PD-1之結合之能力之ELISA的結果。發現嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體兩者均阻斷PD-L1對PD-1之結合。 圖2B顯示進行以測定抗-PD-1抗體嵌合c1G4與參考抗-PD-1抗體競爭結合至PD-1-His之能力之ELISA之結果。將嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體之連續稀釋液與固定濃度之PD-1-His (0.1 μg/ml)在室溫下預混合2小時及然後結合至塗覆固定濃度之參考抗-PD-1 (4 μg/ml)之盤。使用抗-His-HRP-結合之二級抗體定量各孔中經結合之PD-1-His之量。在培養後，沖走過量二級抗體。向該等孔添加TMB，及在培養後，停止該反應，及藉由監測在450 nm下之吸光度之增加量測HRP活性。將固定濃度之PD-1-His (0.1 μg/ml)添加至塗覆固定濃度之NIV (4 μg/ml)之盤及在室溫下培養1小時，及然後向該等孔添加嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體之連續稀釋液。在培養及清洗後，使用抗-His-HRP-結合之二級抗體定量各孔中經結合之PD-1-His之量。 此等資料指示嵌合c1G4及參考抗-PD-1抗體兩者均可阻斷PD-L1對PD-1之結合，及嵌合c1G4可與抗-PD-1參考競爭結合至PD-1-His。 c1G4及h1G4對表現PD-1之CHO-S細胞之結合 在細胞表面表現重組人類PD-1之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系係經研究及用以藉由流動式細胞測量術測定PD-1人類單株抗體之特異性。用含有編碼PD-1之跨膜形式之全長cDNA之表現質體轉染CHO細胞。藉由用連續稀釋於FACS緩衝劑(具有1% FBS之PBS)中之抗-PD-1單株抗體培養該等經轉染之細胞評估c1G4及h1G4抗-PD-1單株抗體之結合。該等細胞係用流動緩衝劑清洗及結合係用經生物素標記之兔抗-人類IgG Fcγ Ab及鏈黴親和素-PE偵測。流動式細胞分析係使用Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.)進行。 圖3A及3B提供藉由流動式細胞測量術測定之c1G4抗體對CHO-S細胞(圖3A)及經PD-1轉染之CHO-S細胞(圖3B)之結合。參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。結果指示該c1G4結合至經PD-1轉染之CHO細胞，但不結合至未經人類PD-1轉染之CHO細胞。 人類化h1G4及原始c1G4抗體對細胞表面上之PD-1之結合特徵係顯示於圖9中。 由經選擇之c1G4及h1G4抗體阻斷配體結合至PD-1 使用流動式細胞測量術分析測試抗-PD-1 c1G4及h1G4的阻斷配體PD-L1結合至表現PD-1之CHO-S細胞之能力。抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。將表現PD-1之CHO-S細胞懸浮於FACS緩衝劑(具有1% FBS之PBS)中。將各種濃度之c1G4及h1G4抗-PD-1抗體、參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體添加至細胞懸浮液及在4℃下培養30分鐘。洗除未經結合之抗體及添加經生物素標記之PD-L1-Fc融合蛋白及在4℃下培養30分鐘。清洗該等細胞及然後用鏈黴親和素-PE在4℃下染色30分鐘。流動式細胞分析物係使用Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.)進行。 如由染色之平均螢光強度(MFI)量測，抗-PD-1單株抗體c1G4阻斷PD-L1結合至經PD-1轉染之CHO-S細胞。如由染色之平均螢光強度(MFI)量測(圖4及10)，此等資料證實c1G4及h1G4兩者均阻斷PD-L1結合至經PD-1轉染之CHO-S 細胞。 人類化抗-PD-1抗體對活化人類T細胞之結合 人類T細胞係使用MagniSortTM 人類T細胞富集套組(eBioscience)分離自PBMC。經分離T細胞係由5 μg/ml植物凝集素(PHA)活化3天以刺激PD-1表現。收集活化T細胞及在具有人類Fc阻斷劑(eBioscience)之FACS緩衝劑(具有2% FBS之PBS)中在4℃下培養20分鐘。 抗-PD-1單株抗體之結合係藉由用連續稀釋於FACS緩衝劑中之抗-PD-1單株抗體培養活化T細胞進行評估。該等細胞係用流動緩衝劑清洗及結合係用經FITC標記之兔抗-人類IgG Fcγ Ab偵測。流動式細胞分析物係使用Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.)進行。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。 人類化抗-PD-1抗體h1G4結合至活化人類T細胞之結果係顯示於圖12中。 實例5 在混合白血球反應(MLR)中抗-PD-1 c1G4及h1G4對細胞介素產生之影響 使用混合白血球反應以證實阻斷PD-1途徑對淋巴細胞效應子細胞之影響。測試該分析中之T細胞在存在或缺乏抗-PD-1抗體之情況下之增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。 使用Lympho-kwik T (One Lamda, Inc.)自PBMC純化人類T細胞。將經分離T細胞懸浮於PBS中及用1 μM之CFSE在室溫下標記10分鐘。在用完全培養基(具有10% FBS之RPMI-1640)清洗細胞後，將經CFSE標記之T細胞以1E6/細胞之濃度懸浮於完全培養基中。 自PBMC產生同種異體樹突細胞。經分離PBMC係用200 U/ml重組人類IL-3 (eBioscience)培養整夜以容許單核球/巨噬細胞群體附接至盤。移除非黏附細胞及該等盤用完全培養基清洗兩次。然後將該等盤上之該等細胞在含有200 U/ml人類IL-4 (eBioscience)及200U/ml人類GM-CSF (eBioscience)之完全培養基中培養6天。單核球衍生之樹突細胞係藉由在第6天向該培養物添加TNF-α (100 U/ml)成熟及培養整夜。成熟DC係經胰蛋白酶化、獲取及以1E5/細胞之濃度懸浮於完全培養基中。 各反應含有200 μl總體積的105 個經CFSE標記之T細胞及104 個同種異體樹突細胞。在不同抗體濃度下將抗-PD-1單株抗體c1G4或h1G4添加至各培養物。無抗體或抗-VEGF抗體(阿瓦斯汀)係用作陰性對照。參考抗-PD-1抗體係用作陽性對照。在37℃下將該等細胞培養5天。5天後，自各培養物取出100 μl培養基以供細胞介素量測。細胞介素之濃度係使用人類IFN-γ或IL-2 ELISA MAX™ Deluxe套組(BioLegend)量測。收集該等細胞及藉由流動式細胞測量術分析T細胞增殖。 圖5A闡述由針對人類PD-1之單株抗體c1G4促進之濃度依賴性IL-2分泌，及圖5B闡述由針對人類PD-1之單株抗體c1G4產生之濃度依賴性IFN-γ分泌。 圖13A闡述由針對人類PD-1之單株抗體h1G4促進之濃度依賴性IL-2分泌，及圖13B闡述由針對人類PD-1之單株抗體h1G4產生之濃度依賴性IFN-γ分泌。 針對人類PD-1之單株抗體c1G4在混合白血球反應分析中促進CD4+ 及CD8+ T細胞增殖。圖6A闡述在各種濃度之c1G4抗體下之CD4+ T細胞增殖，及圖6B闡述在各種濃度之c1G4抗體下之CD8+ T細胞增殖。圖14A闡述在各種濃度之h1G4抗體下之CD4+ T細胞增殖，及圖14B闡述在各種濃度之h1G4抗體下之CD8+ T細胞增殖。 總之，此等結果指示抗-PD-1單株抗體c1G4及h1G4促進T細胞增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。相比之下，含有陰性對照抗體之培養物不顯示T細胞增殖、IFN-γ或IL-2分泌之增加。 實例6 c1G4及h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性 抗-人類PD-1抗體之活體內活性係在異種移植小鼠模型中使用免疫功能不全之NOD/SCID (非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷)小鼠進行研究。癌細胞及經分離人類PBMC係在皮下投與前以指定效應子-比-標靶(E:T)比率立即混合。各小鼠係經癌細胞及人類PBMC之混合物雙側接種。將四隻小鼠分配至各實驗組。在移植癌症/效應子細胞之1天後腹腔內投與測試物件之第一劑量。該等小鼠一週兩次接受測試物件之劑量，歷時3至4週。觀察各動物中之腫瘤之形成，一週兩次。腫瘤係由測徑器量測及腫瘤體積(V)係使用下式計算： V(mm3 ) = 0.5×(長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)/2)。 在HT29/PBMC異體移植模型中以c1G4或h1G4抗體進行之腫瘤生長曲線係分別顯示於圖7A及15A中。在第28天以c1G4進行或在第21天以h1G4進行之HT29/PBMC異體移植模型之個別腫瘤體積係分別呈現於圖7B及15B中。此外，在NCI-H292/PBMC中以h1G4抗體進行之腫瘤生長曲線係顯示於圖16A中。在第25天下以h1G4抗體進行之個別腫瘤體積係呈現於圖16B中。所有資料點係平均值± SEM。 此外，亦研究HT29/PBMC異體移植模型中抗-PD-1及抗-VEGF單株抗體之組合治療。指示以抗-PD-1及抗-VEGF之組合增強腫瘤抑制之資料係呈現於圖21中。 實例7 h1G4之物種交叉反應性 重組人類、大鼠、小鼠及食蟹猴PD-1融合蛋白係購買自Sino Biological Inc。藉由在4℃下培養整夜將PD-1/Fc (每孔9 ng)固定於96孔分析盤上。非特異性結合位點係使用於PBS中之5%脫脂牛奶在室溫下阻斷1小時。在用PBST將盤清洗三次後，指定濃度之h1G4、參考抗-PD-1 (陽性對照)及HLX01 (陰性對照)係用固定化蛋白質在室溫下培養1小時。用PBST將該等盤清洗三次及然後用經1/10,000稀釋於PBS中之經過氧化物酶標記之山羊抗-人類IgG F(ab)’2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)在室溫下培養1小時。在清洗後，用TMB (eBioscience)使盤顯影。藉由Vmax酶標儀(Molecular Devices)讀取在450 nm波長長度下之吸光度。 圖11A至11D顯示h1G4對人類(圖11A)、食蟹猴(圖11B)、小鼠(圖11C)及大鼠(圖11D) PD-1蛋白之物種交叉反應性。 實例8 h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性 h1G4抗體於hPD1 KI小鼠中之腫瘤生長抑制活性 抗-人類PD-1抗體之活體內活性係在人類PD-1敲入C57BL/6小鼠(hPD1 KI小鼠)中進行研究。對該等小鼠皮下接種經人類PD-L1轉染之小鼠結腸癌細胞(每隻小鼠1E6個細胞)。當腫瘤體積達成約75 mm3 (第9天)時，開始抗體治療。在治療前，將四隻動物分配至各實驗組。該等動物一週兩次接受抗-PD-1抗體之劑量，歷時3至4週。觀察各動物中之腫瘤之形成，一週兩次。腫瘤係由測徑器量測及腫瘤體積(V)係使用下式計算：V(mm3 ) = 0.5×(長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)/2)。hPD1 KI小鼠中h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性係顯示於圖17中。 h1G4於人類化NSG小鼠之三陰性乳癌(TNBC)細胞系異體移植模型中之效用研究 對人類化NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ)皮下接種MDA-MB-231 (人類三陰性乳癌細胞系)。當腫瘤體積達成~ 60-150 mm3 時，基於根據表之腫瘤體積將小鼠隨機分配至3組(n=9隻/組)內。在研究第0、7、14、21及28天，每7天一次向小鼠腹腔內給藥h1G4。在研究第0、5、10、15及20天，每5天一次腹腔內注射派姆單抗(Keytruda) (抗-PD-1)。每3至4天觀察各動物中之腫瘤之形成。腫瘤係由測徑器量測及腫瘤體積(V)係使用下式計算：V(mm3 ) = 0.5×(長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)/2)。圖18闡述h1G4於人類化NSG小鼠之三陰性乳癌(TNBC)細胞系異體移植模型中之效用研究。 實例9 親和力成熟抗-PD-1抗體33B、66E及711D之平衡解離常數(KD)之測定 人類化抗-PD-1抗體h1G4係用於基於活體外噬菌體展示之親和力成熟實驗中以產生具有經改善之結合性能之純系。h1G4之CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3 (聚集於3個CDR上)及CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 (聚集於6個CDR上)核酸庫係經由PCR產生，選殖至噬菌體展示載體內及轉化為大腸桿菌TG1或SS320細胞以產生噬菌體之庫。在針對兩個庫進行用偶合至塗覆鏈黴親和素之磁性Dynabeads® M-280 (Thermo Fisher Scientific #11205D)之生物素化PD-1-His分選三輪後，經由ELISA篩選出三個Fab純系(即，33B、66E及711D)。其他動力學特徵係由表面電漿子共振(SPR) (參見與如上文針對圖9描述之方法相同之SPR方法)使用33B、66E及711D之全長IgG量測及發現具有等於或優於參考抗-PD-1抗體之結合性能。 表5顯示相較於h1G4篩選自基於噬菌體庫之親和力成熟之33B、66E及711D之CDR之胺基酸序列。 表5 表6顯示由表面電漿子共振(SPR)量測之33B、66E及711D之結合及解離動力學以及計算親和力(KD)。抗-PD-1抗體之相較於參考抗-PD-1抗體之親和力改善亦顯示於表6中。資料代表一式兩份進行之兩個獨立實驗。 表6 實例10 親和力成熟抗體之功能 在混合白血球反應(MLR)中人類抗-PD-1抗體(33B、66E、711D)對細胞介素產生之影響 遵循與上文描述相同之方法，此研究顯示針對人類PD-1之人類單株抗體(諸如66E及711D)在混合白血球反應分析中促進IFN-γ分泌及IL-2分泌。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖19A闡述由親和力成熟抗體產生之濃度依賴性IL-2分泌，及圖19B闡述由親和力成熟抗體產生之濃度依賴性IFN-γ分泌。 人類抗-PD-1抗體於HT29/PBMC異體移植模型中之腫瘤生長抑制活性 遵循與上文描述相同之方法，對小鼠(n=4隻/組)皮下注入人類結腸癌細胞系HT29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1抗體注入小鼠的腹腔內。每週兩次量測腫瘤體積。人類親和力成熟抗-PD-1抗體於HT29/PBMC異體移植模型中之腫瘤生長抑制活性係顯示於圖20中。所有資料點係平均值± SEM。 實例11 PD-1組合治療 具有抗-PD-1及其他治療抗體之組合治療之活體內活性係在異種移植小鼠模型中使用免疫功能不全之NOD/SCID (非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷)小鼠進行研究。在皮下投與前以指定效應子-比-標靶(E:T)比率立即混合癌細胞及經分離人類PBMC。各小鼠係經癌細胞及人類PBMC之混合物雙側接種。將四或五隻動物分配至各實驗組。在移植癌症/效應子細胞之1天後腹腔內投與測試物件之第一劑量。該等動物一週兩次接受測試物件之劑量，歷時3至4週。觀察各動物中之腫瘤之形成，一週兩次。腫瘤係由測徑器量測及腫瘤體積(V)係使用下式計算： V(mm3 )=0.5×(長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)/2) 抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb於NSCLC異種移植小鼠模型中之腫瘤生長抑制活性 在此等研究中，對小鼠(n=4隻/組)皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1 (h1G4)及抗-VEGF (HLX04)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖22A中。第21天之個別腫瘤體積係呈現於圖22B中。所有資料點係平均值± SEM。此等資料闡述與抗-VEGF mAb (HLX04)組合之抗-PD-1 mAb (h1G4)比單獨使用任何一種藥劑更有效抑制NCI-H292異種移植之腫瘤生長。 在其他研究中，對小鼠(n=4/組)皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1 (h1G4)及抗-VEGFR2 (HLX06)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖23A中。第21天之個別腫瘤體積係呈現於圖23B中。所有資料點係平均值± SEM。此等資料闡述與抗-VEGFR2 mAb (HLX06)組合之抗-PD-1 mAb (h1G4)比單獨使用任何一種藥劑更有效抑制NCI-H292異種移植之腫瘤生長。 抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb於NSCLC異種移植小鼠模型中之腫瘤生長抑制活性 遵循與上文描述相同之方法，對小鼠(n=4/組)皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC=3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1 (HLX10)及抗-EGFR (HLX07)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖24A中。第21天之個別腫瘤體積係呈現於圖24B中。所有資料點係平均值± SEM。此等資料指示與抗-EGFR mAb (HLX07)組合之抗-PD-1 mAb (HLX10 (h1G4))比單獨使用任何一種藥劑更有效抑制NCI-H292異種移植之腫瘤生長。 另外，對小鼠(n=5/組)皮下注入人類結腸癌細胞HT-29及新鮮經分離人類PBMC (癌細胞：PBMC = 3:1)之混合物。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1 (HLX10)及抗-EGFR (HLX07)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖25A中。第21天之個別腫瘤體積係呈現於圖25B中。所有資料點係平均值± SEM。 此等資料指示與抗-EGFR mAb (HLX07)組合之抗-PD-1 mAb (HLX10 (h1G4))比單獨使用HLX10更有效抑制BRAF突變體HT-29異種移植之腫瘤生長。HLX10加HLX07治療比單獨HLX07治療針對腫瘤生長產生稍微更大之抑制。HLX10加HLX07治療及單獨HLX07治療之平均腫瘤生長抑制速率分別係47%及28%。 前述實例僅提供出於闡述目的，及無意以任何方式限制本發明之範圍。熟習此項技術者自前述描述將知曉除彼等本文顯示及描述者之外之本發明之各種修改及其等落於隨附申請專利範圍之範圍內。 實施例之列表 由本發明提供之實施例包括(但不限於)： 1. 一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14)之CDR-H3。 2. 一種成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASLRHT (SEQ ID NO:16)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20)之CDR-H3。 3. 一種成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22)之CDR-L3，及重鏈可變(VH )域序列，該重鏈可變(VH )域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23)之CDR-H3。 4. 一種成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25)之CDR-H3。 5. 如實施例1至4中任一項之抗-PD-1抗體之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv (scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。 6. 如實施例1至5中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係多特異性抗體。 7. 如實施例1至6中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其結合至治療劑。 8. 如實施例1至7中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其結合至標記。 9. 如實施例8之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該標記係選自由以下組成之群：放射性同位素、螢光染料及酶。 10. 一種經分離核酸分子，其編碼如實施例1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。 11. 一種表現載體，其編碼如實施例10之核酸分子。 12. 一種細胞，其包含如實施例11之表現載體。 13. 一種產生抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之方法，其包括培養如實施例12之細胞及自細胞培養物回收抗體。 14. 一種組合物，其包含如實施例1至9中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 15. 一種偵測來自病患之樣本中之PD-1蛋白之方法，其藉由使如實施例1至9中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段接觸該樣本及偵測結合至該PD-1蛋白之該抗-PD-1抗體。 16. 如實施例15之方法，其中該抗-PD-1抗體或其抗原結合片段係用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析中。 17. 一種治療個體之癌症之方法，其包括向該個體投與有效量之如實施例14之組合物。 18. 如實施例17之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、三陰性乳癌(TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及唾液腺癌。 19. 如實施例18之方法，其中向該個體進一步投與選自由以下組成之群之治療劑：抗腫瘤藥劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。 20. 如實施例19之方法，其中向該個體進一步投與放射治療。 21. 如實施例18之方法，其中向該個體進一步投與抗VEGF、VEGFR2或EGFR之治療抗體。 序列表 SEQ ID NO:1 (c1G4_LC核苷酸序列) CAGCTCGAGGATATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGACTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAACAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTACACTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO:2 (c1G4_LC胺基酸序列，下劃線：經Kabat定義之CDR，參見圖8A) QLEDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVTTAVA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRHT GVPDRFTGSGSGTDYTLTINSVQAEDLALYYC QQHYTIPWT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:3 (c1G4_HC核苷酸序列) GAAGTGATGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTAGTAACATCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGCGGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCCTGTATTACTGTGTATCGTATTACTATGGAATAGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO:4 (c1G4_ HC胺基酸序列，下劃線：經Kabat定義之CDR，參見圖8B) EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASG FTFSNYGMS WVRQTPEKSLEWVA TISGGGSNIY YPDSVKGRFTISRDNAKNNLFLQMSGLRSEDTALYYC VSYYYGIDF WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO:5 (h1G4_LC核苷酸序列) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGACTACTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTACACTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO:6 (h1G4_LC胺基酸序列，下劃線：經Kabat定義之CDR，參見圖8A) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVTTAVA WYQQKPGKAPKLLIY WASTRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYTIPWT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:7 (h1G4_HC核苷酸序列) CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCAACCATTAGTGGTGGTGGTAGTAACATCTACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTATCGTATTACTATGGAATAGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO:8 (h1G4_HC胺基酸序列，下劃線：經Kabat定義之CDR，參見圖8B) QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG FTFSNYGMS WIRQAPGKGLEWVS TISGGGSNIY YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC VSYYYGIDF WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO:9 (c1G4及h1G4 CDR-L1): KASQDVTTAVA SEQ ID NO:10 (c1G4及h1G4 CDR-L2): WASTRHT SEQ ID NO:11 (c1G4及h1G4 CDR-L3): QQHYTIPWT SEQ ID NO:12 (c1G4及h1G4 CDR-H1): FTFSNYGMS SEQ ID NO:13 (c1G4及h1G4 CDR-H2): TISGGGSNIY SEQ ID NO:14 (c1G4及h1G4 CDR-H3): VSYYYGIDF SEQ ID NO:15 (33B CDR-L1): KASTDVTTAVA SEQ ID NO: 16 (33B CDR-L2): WASLRHT: SEQ ID NO: 17 (33B CDR-L3): QQHYGIPWT SEQ ID NO: 18 (33B CDR-H1): FRFSNYGMS SEQ ID NO: 19 (33B CDR-H2): TISGGGSNAY SEQ ID NO: 20 (33B CDR-H3): TSYYYGIDF SEQ ID NO: 21 (66E CDR-L1): KAKQDVTTAVA SEQ ID NO: 22 (66E CDR-L3): QQHYWIPWT SEQ ID NO: 23 (66E CDR-H3): VSYYYGIDL SEQ ID NO: 24 (711D CDR-L1): KASQDVTNAVA SEQ ID NO: 25 (711D CDR-H3): SSYYYGIDL
圖1A至1B：c1G4對PD-1重組蛋白之結合。圖1A顯示為比較抗-PD-1抗體c1G4及參考抗-PD-1對PD-1-His之結合進行之ELISA之結果。圖1B顯示為比較抗-PD-1抗體c1G4及參考抗-PD-1對PD-1-AP之結合進行之第二組ELISA之結果。資料指示c1G4及參考抗-PD-1可結合至PD-1-His及PD-1-AP兩者。 圖2A至2B：c1G4結合至PD-1配體之阻斷及競爭。圖2A顯示為比較抗-PD-1抗體c1G4及參考抗-PD-1阻斷PD-L1及PD-1之結合之能力進行之ELISA之結果。c1G4及參考抗-PD-1兩者均被發現阻斷PD-L1對PD-1之結合。圖2B顯示為判定抗-PD-1抗體c1G4與參考抗-PD-1競爭結合至PD-1-His之能力進行之ELISA之結果。資料指示c1G4及參考抗-PD-1兩者均可阻斷PD-L1對PD-1之結合，及c1G4可與抗-PD-1參考競爭結合至PD-1-His。 圖3A至3B：c1G4對表現PD-1之CHO-S細胞之結合。c1G4抗體對CHO-S細胞(圖3A)及經PD-1轉染之CHO-S細胞(圖3B)之結合係藉由流動式細胞測量術測試。參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。資料指示c1G4結合至經人類PD-1轉染之CHO細胞但不結合至未經轉染之CHO細胞。 圖4：藉由所選c1G4抗體阻斷配體結合至PD-1。使用流動式細胞測量術測試抗-PD-1 c1G4阻斷配體PD-L1對表現PD-1之CHO-S細胞之結合之能力。參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。如藉由染色之平均螢光強度(MFI)量測，抗-PD-1單株抗體c1G4阻斷PD-L1結合至經PD-1轉染之CHO-S細胞。此等資料證實抗-PD-1 c1G4阻斷PD-L1配體結合至細胞表面PD-1。 圖5A至5B：混合白血球反應(MLR)中抗-PD-1 c1G4對細胞介素產生之影響。在混合白血球反應分析中，抗人類PD-1之單株抗體c1G4促進IFN-γ分泌及IL-2分泌。參考抗-PD-1及阿瓦斯汀(Avastin) (抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖5A闡述顯示濃度依賴性IL-2分泌之條形圖；圖5B闡述顯示濃度依賴性IFN-γ分泌之條形圖。 圖6：混合白血球反應(MLR)中抗-PD-1 c1G4對T細胞增殖之影響。在混合白血球反應分析中，抗人類PD-1之單株抗體c1G4促進CD4+ 及CD8+ T細胞增殖。參考抗-PD-1及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖6A闡述顯示在抗體之各種濃度下CD4+ T細胞增殖之條形圖；圖6B闡述顯示在抗體之各種濃度下CD8+ T細胞增殖之條形圖。 圖7：c1G4抗體之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下植入人類結腸癌細胞系HT29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 2:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1抗體注入小鼠之腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖7A中。第28天的個別腫瘤體積係呈現於圖7B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖8：針對c1G4及h1G4之序列比對。圖8A顯示c1G4、人類化h1G4、人類生殖系輕鏈可變區IGKV1-39*01及尼魯單抗(Nivolumab)(NIV)之輕鏈之胺基酸序列比對。(分別為SEQ ID NO 27至30，以出現之順序)。圖8B顯示c1G4、人類化h1G4、人類生殖系重鏈可變區IGHV3-11*04及尼魯單抗(NIV)之重鏈之胺基酸序列比對(分別為SEQ ID NO 31至34，以出現之順序)。自c1G4移植以用於人類化之CDR (互補決定區)係用粗體加下劃線文本標示。 圖9：人類化抗-PD-1抗體對表現PD-1之CHO-S細胞之結合。人類化h1G4及原始c1G4抗體對細胞表面上之PD-1之結合係藉由流動式細胞測量術測試。參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。 圖10：藉由人類化h1G4抗體阻斷配體結合至PD-1。使用流動式細胞測量術分析測試人類化抗-PD-1 h1G4阻斷配體PD-L1對表現PD-1之CHO-S細胞之結合之能力。參考抗-PD-1及抗-PD-L1抗體係分別用作陽性對照及陰性對照。如藉由染色之平均螢光強度(MFI)量測，c1G4及h1G4兩者阻斷PD-L1對經PD-1轉染之CHO-S細胞之結合。 圖11A至11D闡述h1G4對人類(圖11A)、食蟹猴(圖11B)、小鼠(圖11C)及大鼠(圖11D) PD-1蛋白之物種交叉反應性。所有資料點係三次重複試驗之平均值± SD。 圖12：人類化抗-PD-1抗體對活化人類T細胞之結合。人類化h1G4對人類T細胞之結合係藉由流動式細胞測量術測試。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。 圖13：混合白血球反應(MLR)中h1G4對細胞介素產生之影響。在混合白血球反應分析中，抗人類PD-1之人類化抗體h1G4促進IFN-分泌及IL-2分泌。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖13A闡述顯示濃度依賴性IL-2分泌之條形圖；圖14B闡述顯示濃度依賴性IFN-γ分泌之條形圖。 圖14：混合白血球反應(MLR)中h1G4對T細胞增殖之影響。在混合白血球反應分析中，抗人類PD-1之人類化抗體h1G4促進CD4+ 及CD8+ T細胞增殖。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖14A闡述顯示在抗體之各種濃度下CD4+ T細胞增殖之條形圖；圖14B闡述顯示在抗體之各種濃度下CD8+ T細胞增殖之條形圖。 圖15：HT29/PBMC異體移植模型中h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下植入人類結腸癌細胞系HT29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖15A中。第21天的個別腫瘤體積係呈現於圖15B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖16：NCI-H292/PBMC異體移植模型中h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下植入人類NSCLC細胞系NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次，將抗-PD-1抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖16A中。第25天的個別腫瘤體積係呈現於圖16B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖17：hPD1 KI小鼠中h1G4抗體之腫瘤生長抑制活性。人類PD-1敲入(hPD1 KI)小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入MC38-huPD-L1 (經人類PD-L1轉染之MC38)細胞。當腫瘤體積達成約75 mm3 時開始抗體處理。每週兩次將抗-PD-1抗體注入小鼠的腹腔內。所有資料點係平均值± SD。 圖18：人類化NSG小鼠之三陰性乳癌(TNBC)細胞系異體移植模型中h1G4之效用研究。人類化NSG小鼠(n=9隻/組)係經皮下接種MDA-MB-231細胞。當腫瘤體積達成約60至150 mm3 時開始抗體處理。給藥天數係由箭頭指示。所有資料點係平均值± SEM。 圖19：混合白血球反應(MLR)中人類抗-PD-1抗體對細胞介素產生之影響。在混合白血球反應分析中，抗人類PD-1之人類單株抗體促進IFN-γ分泌及IL-2分泌。參考抗-PD-1抗體及阿瓦斯汀(抗-VEGF)係分別用作陽性對照及陰性對照。圖19A闡述顯示濃度依賴性IL-2分泌之條形圖；圖19B闡述顯示濃度依賴性IFN-γ分泌之條形圖。 圖20：HT29/PBMC異體移植模型中人類抗-PD-1抗體之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入人類結腸癌細胞系HT29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1抗體注入小鼠的腹腔內。每週兩次量測腫瘤體積。所有資料點係平均值± SEM。 圖21：HT29/PBMC異體移植模型中抗-PD-1及抗-VEGF單株抗體之組合。小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入人類結腸癌細胞系HT29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。將抗-PD-1 mAb、抗-VEGF mAb (HLX04)或抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb注入小鼠的腹腔內。給藥天數係由箭頭指示。每週兩次量測腫瘤體積。所有資料點係平均值± SEM。 圖22：NSCLC異種移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1 (h1G4)及抗-VEGF (HLX04)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖22A中。第21天的個別腫瘤體積係呈現於圖22B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖23：NSCLC異種移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-VEGFR2 mAb之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC = 3:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1 (h1G4)及抗-VEGFR2 (HLX06)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖23A中。第21天的個別腫瘤體積係呈現於圖23B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖24：NSCLC異種移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=4隻/組)係經皮下注入人類NSCLC細胞NCI-H292及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC=3:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1 (HLX10)及抗-EGFR (HLX07)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖24A中。在第21天下個別腫瘤體積係呈現於圖24B中。所有資料點係平均值± SEM。 圖25：HT-29 (KRASWT , BRAFV600E )異種移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb之腫瘤生長抑制活性。小鼠(n=5隻/組)係經皮下注入人類結腸癌細胞HT-29及新鮮經分離人類PBMC之混合物(癌細胞：PBMC=3:1)。自第1天起，每週兩次將抗-PD-1 (HLX10)及抗-EGFR (HLX07)抗體注入小鼠的腹腔內。腫瘤生長曲線係顯示於圖25A中。第21天的個別腫瘤體積係呈現於圖25B中。所有資料點係平均值± SEM。

Claims (21)

  1. 一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14)之CDR-H3。
  2. 如請求項1之抗-PD-1抗體，其中該抗體係親和力成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASLRHT (SEQ ID NO:16)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20)之CDR-H3。
  3. 如請求項1之抗-PD-1抗體，其中該抗體係親和力成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22)之CDR-L3，及重鏈可變(VH )域序列，該重鏈可變(VH )域序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23)之CDR-H3。
  4. 如請求項1之抗-PD-1抗體，其中該抗體係親和力成熟抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域(VL )序列，該輕鏈可變域(VL )序列包含(1)包含胺基酸序列KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24)之CDR-L1；(2)包含胺基酸序列WASTRHT (SEQ ID NO:10)之CDR-L2；及(3)包含胺基酸序列QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11)之CDR-L3，及重鏈可變域(VH )序列，該重鏈可變域(VH )序列包含(1)包含胺基酸序列FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12)之CDR-H1；(2)包含胺基酸序列TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13)之CDR-H2；及(3)包含胺基酸序列SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25)之CDR-H3。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv (scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。
  6. 如請求項1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係多特異性抗體。
  7. 如請求項1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其結合至治療劑。
  8. 如請求項1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其結合至標記。
  9. 如請求項8之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該標記係選自由以下組成之群：放射性同位素、螢光染料及酶。
  10. 一種經分離核酸分子，其編碼如請求項1至4中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。
  11. 一種表現載體，其編碼如請求項10之核酸分子。
  12. 一種細胞，其包含如請求項11之表現載體。
  13. 一種產生抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之方法，其包括培養如請求項12之細胞及自細胞培養物回收抗體。
  14. 一種組合物，其包含如請求項1至9中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  15. 一種偵測來自病患之樣本中之PD-1蛋白之方法，其藉由使如請求項1至9中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段接觸該樣本及偵測結合至該PD-1蛋白之該抗-PD-1抗體。
  16. 如請求項15之方法，其中該抗-PD-1抗體或其抗原結合片段係用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析中。
  17. 一種如請求項14之組合物之用途，其用於製造用於治療個體之癌症之藥劑。
  18. 如請求項17之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、NSCLC、頭頸癌、尿路上皮癌、三陰性乳癌(TNBC)、胃癌、經典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma) (cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原發性縱隔B細胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、間皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌(NPC)、膽道癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及唾液腺癌。
  19. 如請求項18之用途，其中向該個體進一步投與選自由以下組成之群之治療劑：抗腫瘤藥劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。
  20. 如請求項19之用途，其中向該個體進一步投與放射治療。
  21. 如請求項18之用途，其中向該個體進一步投與抗VEGF、VEGFR2或EGFR之治療抗體。
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