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TW201534618A - 複合物 - Google Patents

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TW201534618A
TW201534618A TW103114526A TW103114526A TW201534618A TW 201534618 A TW201534618 A TW 201534618A TW 103114526 A TW103114526 A TW 103114526A TW 103114526 A TW103114526 A TW 103114526A TW 201534618 A TW201534618 A TW 201534618A
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TW
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fviii
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TW103114526A
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Inventor
Thomas Weimer
Hubert Metzner
Stefan Schulte
Original Assignee
Csl Behring Gmbh
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Abstract

本發明關於血管性血友病因子(von Willebrand Factor)(VWF)與第八因子(Factor Ⅷ)之共價複合物，其中該複合物係經過修改，使其具有活體內延長之半衰期。本發明進一步關於製造該複合物之方法及該複合物於治療或預防出血事件之治療或預防用途。

Description

複合物
本發明關於血管性血友病因子(von Willebrand Factor)(VWF)或其變體與第八因子(Factor Ⅷ)或其變體之共價複合物，其中該複合物係經過修改，使其具有活體內延長之半衰期。本發明進一步關於製造該複合物之方法及該複合物於治療或預防出血事件之治療或預防用途。
凝血因子的缺陷會引起各種出血性疾病。最常見的疾病為分別由凝血因子Ⅷ及IX之缺陷造成的A型血友病及B。另一種已知之出血性疾病為血管性血友病。
血漿中第八因子(FⅧ)主要係以與血管性血友病因子之非共價複合物形式存在。如第1圖中所示，成熟之FⅧ(在前肽裂解後具有高達2332個胺基酸的多肽)係由數個結構域所組成。FⅧ在凝血中的功能為加速因子IXa依賴性之因子X轉化成Xa因子的作用。由於FⅧ與血管性血友病因子形成複合物，FⅧ及血管性血友病因子有很長一段時間被認為是相同分子之兩種功能。直至七十年代才清 楚FⅧ及血管性血友病因子為在生理條件下形成複合物的獨立分子。八十年代時才測得FⅧ和血管性血友病因子之解離常數為約0.2奈莫耳/升(Leyte等人，Biochem J 1989，257：679-683)及兩種分子之DNA序列。
經典型血友病或A型血友病為遺傳性出血性疾病。其係由X染色體性聯遺傳之凝血因子FⅧ缺乏造成，且影響到的幾乎全為男性，發病率為每10,000人中介於一至兩人。X染色體二缺陷係由本身並非血友病患者之女性帶原者遺傳。A型血友病之臨床表現為出血傾向增加。在引入以FⅧ濃縮物進行治療前，患有嚴重血友病之患者的平均壽命不到20年。使用來自血漿之FⅧ濃縮物顯著改善A型血友病患者之情況，普遍增加平均壽命，使大多數之患者可能過幾乎正常的生活。然而，該源自血漿之濃縮物及彼等之使用一直有些問題，其中最嚴重的為傳染病毒(諸如引起B型肝炎、非A非B型肝炎及HIV之病毒)。然而，最近已研發出不同病毒之滅活方法及新的高度純化之FⅧ濃縮物，這為源自血漿之FⅧ建立了非常高的安全標準。
由於FⅧ之血漿半衰期短至約12小時，接受預防性FⅧ治療之嚴重的A型血友病患者必須每週經由靜脈內途徑(iv)投藥約3次。每次的靜脈內投藥都很麻煩，伴隨著疼痛且帶來感染的風險，尤其是這大多由被確診為A型血友病之患者本身或孩子的父母在家裡完成。
因此，創建具有增加之功能性半衰期的FⅧ，以允許 製造含有FⅧ，但投藥頻率必須降低之醫藥組成物將是具有高度吸引力的。
現已有一些延長FⅧ之功能性半衰期的嘗試，這些嘗試係經由下列方式進行：降低FⅧ與細胞受體之交互作用(WO 03/093313A2、WO 02/060951A2)、或將聚合物與FⅧ共價連接(WO 94/15625、WO 97/11957及US 4970300)、將FⅧ封裝(WO 99/55306)、引入新穎之金屬結合位點(WO 97/03193)、藉由肽連接(WO 97/40145及WO 03/087355)或二硫化物連接(WO 02/103024A2)來將A2結構域與A3結構域共價連接或引入防止A1和A2結構域之間的凝血酶裂解之突變，從而在凝血酶活化之後保持A1結構域與A2結構域共價連接(WO2006/108590)。
另一種用於增加FⅧ或血管性血友病因子之功能性半衰期的方法為將FⅧ聚乙二醇化(WO 2007/126808、WO 2006/053299、WO 2004/075923)或將血管性血友病因子聚乙二醇化(WO 2006/071801)，其構思為經聚乙二醇化之血管性血友病因子藉由半衰期增加亦將間接增加存在於血漿中之FⅧ的半衰期。此外，現已有關於FⅧ與半衰期增加之多肽(如白蛋白或免疫球蛋白之恆定區Fc)的融合蛋白之描述(WO 2004/101740、WO 2008/077616及WO 2009/156137)。
血管性血友病因子(此因子在不同形式之血管性血友病(VWD)中缺失、功能上有缺陷或僅取得減少的量)為存在於哺乳動物血漿中之多聚體型黏性糖蛋白，其具有多種 生理功能。在初期止血期間，血管性血友病因子係作為血小板表面上之特定受體與胞外基質組分(諸如膠原蛋蛋白)之間的傳介子。再者，血管性血友病因子作為前凝血因子FⅧ之載體及穩定蛋白質。血管性血友病因子係在內皮細胞及巨核細胞中合成，為具有2813個胺基酸之前體分子。野生型VWF之胺基酸序列及cDNA序列揭示於Collins等人之1987，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：4393-4397中。該前體多肽，前血管性血友病因子原係由具有22個殘基之信號肽、具有741個殘基之前肽及在成熟之血漿血管性血友病因子中找到之具有2050個殘基的多肽所組成(Fischer等人，FEBS Lett.351：345-348,1994)，亦參見第2圖之前血管性血友病因子及成熟血管性血友病因子單體單元。當信號肽在內質網中裂解後，血管性血友病因子之兩個單體之間形成C端二硫橋。在進一步透過分泌途徑轉運後，加入12個N-連接及10個O-連接之碳水化合物側鏈。更重要的是，血管性血友病因子二聚體係經由N端二硫橋多聚體化，而741個胺基酸長之前肽被晚期高基氏體中被PACE酶/弗林蛋白酶(furin)裂解。血管性血友病因子之前肽及高分子量多聚體(VWF-HMWM)係儲存在內皮細胞之Weibel-Pallade體中或血小板之α-顆粒中。
一旦分泌入血漿中，蛋白酶ADAMTS13將在血管性血友病因子之A2結構域中的超大血管性血友病因子多聚體裂解。血漿血管性血友病因子係由範圍在約500kDa之 單一二聚體至分子量超過10,000kDa的多聚體(由多達20個，甚至更多個二聚體所組成)的全部範圍內之多聚體所組成。VWF-HMWM具有最強之止血活性，此可藉由瑞斯托菌素輔因子活性分析(ristocetin cofactor activity assay)(VWF：RCo)測量。VWF：RCo/血管性血友病因子抗原的比例愈高，高分子量多聚體之相對量愈高。
血管性血友病因子的缺陷為血管性血友病(VWD)的原因，其特徵為有點明顯之出血表型。第3型VWD為最嚴重的形式，其中血管性血友病因子基本上完全缺失，第1型VWD與血管性血友病因子量減少有關且其表型可能非常溫和。第2型VWD與血管性血友病因子之品質缺陷有關且可能與第3型VWD一樣嚴重。第2型VWD具有許多亞型，其中一些與高分子量多聚體損失或減少有關。第2A型VWD之特徵為中間及大型多聚體均喪失，因此，其特徵為VWF具有品質缺陷且VWF結合血小板糖蛋白1受體之能力下降。第2B型VWD之特徵為損失最高分子量之多聚體。具有品質缺陷之VWF結合血小板膜上之糖蛋白1受體的能力被異常增強，導致其自發性結合血小板，接著經結合之血小板及大血管性血友病因子多聚體被清除。第2M型VWD亦為血管性血友病因子具有品質缺陷，其特徵在於其結合血小板膜上之糖蛋白1受體的能力下降，但多聚體分佈及血管性血友病因子抗原量正常。第2N型VWD(Normandy)為血管性血友病因子具有品質缺陷，其中缺乏血管性血友病因子與凝血因子FⅧ之結合。 雖然血管性血友病因子及血管性血友病因子多聚體之量正常，患者表現出FⅧ數量減少，導致與A型血友病類似之表型。
VWD為人類最常見之遺傳性出血性疾病且可根據VWD之類型，以1-去胺基-8-D-精胺酸-垂體後葉素(Vasopressin)(DDAVP)療法治療，以從細胞內儲存池釋出血管性血友病因子或可以含有血漿或重組來源之血管性血友病因子的濃縮物進行替代療法。血管性血友病因子可依，例如EP 0503991中之描述從人血漿中製備。EP 0784632中描述用於分離重組血管性血友病因子的方法。
血漿中之FⅧ以高親和力與血管性血友病因子結合，血管性血友病因子保護FⅧ免於過早的分解代謝，因此，除了其在初期止血之作用外，VWF在調節FⅧ之血漿數量上具有至關重要的作用。因此，血管性血友病因子在第二期止血的控制中亦為核心因素。血漿中，與血管性血友病因子結合之非活化的FⅧ之半衰期為約12小時。在沒有或幾乎沒有血管性血友病因子存在的第3型VWD中，FⅧ之半衰期僅約2小時，由於FⅧ的濃度減少，因而導致此類患者具有輕微至中度之A型血友病症狀。
血管性血友病因子對FⅧ之穩定效果亦已用於協助重組FⅧ在CHO細胞中之表現出(Kaufman等人，1989,Mol Cell Biol)。其他最近進行之使用血管性血友病因子來穩定FⅧ的嘗試已揭示於最近幾個專利申請案(WO2011060242、WO2013083858、WO2013106787、 WO2014011819)中。
目前對於進一步，更好之增加FⅧ半衰期的方法仍有需要。本申請案之發明者已發現將FⅧ分子與半衰期延長之血管性血友病因子分子共價連接將使FⅧ部分之半衰期延長，從而使其半衰期將類似於未融合之半衰期延長的血管性血友病因子分子。藉由此方法，在大鼠PK模型中可觀察到游離FⅧ之半衰期延長約3倍。本發明提供血管性血友病因子或其變體(VWF)與第八因子的共價複合物，尤其是，使用方法來增加複合物中之VWF組分的半衰期，如此可提供具有延長之半衰期的穩定複合物，這對於治療及預防出血性疾病是有利的。
於第一態樣中，本發明關於包含血管性血友病因子(VWF)或其變體及第八因子(FⅧ)或其變體之血管性血友病因子共價複合物，其中該複合物係經過修改，使其具有活體內延長之半衰期。較佳地，其係經過修改以包含半衰期延長部分。VWF與第八因子形成共價複合物；一半衰期延長部分連接到此複合物之任何部分(較佳為連接至VWF部分)。較佳地，VWF和第八因子係藉由直接共價鍵連接，例如經由為VWF之一部分的半胱胺酸和為第八因子之一部分的半胱胺酸之間的二硫橋連接，或經由將VWF與第八因子融合(可選擇地，經由肽連接子)來連接，惟該共價複合物不為Fc融合蛋白，其中該Fc鏈之一與VWF 融合，而另一Fc鏈係與FⅧ或其變體融合。較佳地，該共價連接並非由該半衰期延長部分提供。
於第一種實施態樣中，第八因子係經修改使其與VWF形成二硫橋(惟該二硫橋並非介於分別與VWF和第八因子融合之Fc分子的兩條鏈之間)。較佳地，第八因子係經由以半胱胺酸殘基取代天然存在之胺基酸，或經由插入半胱胺酸殘基以與VWF中之半胱胺酸殘基形成二硫鍵來修改。較佳地，第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係選白在a3結構域中之胺基酸，或係在a3結構域(SEQ ID NO：6之殘基1649至1689)中插入一個半胱胺酸殘基。更佳地，該天然存在之胺基酸為酸性殘基，較佳為經保留之酸性殘基、或涉及血友病表型之殘基、或可在FⅧ a3結構域中被硫酸化之Tyr殘基。更佳地，該在第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係位在第八因子a3結構域之胺基酸1653至1660之內、或在胺基酸1667至1674之內、或在胺基酸1675至1688之內，或在第八因子a3結構域之胺基酸1653至1660、或胺基酸1667至1674、或胺基酸1675至1688之序列中引入半胱胺酸。再更佳地，該在第八因子a3結構域中被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：6中之T1653、L1655、D1658、E1660、S1669、V1670、N1672、K1673、K1674、E1675、D1676及/或N1685，或經遺傳工程處理形式之第八因子中的等同位置。最佳地，該在第八因子a3結構域中被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係選自 SEQ ID NO：6中之T1654、Q1656、F1677、D1678、11679、Y1680、D1681、E1682、D1683、E1684、Q1686、S1687及/或P1688，或係在經遺傳工程處理形式之第八因子中的等同位置。
於另一實施態樣中係在C端結構域中插入半胱胺酸殘基，或者該被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係在第八因子之C端結構域中，較佳地，該殘基係選自SEQ ID NO：6中之I2098、S2119、N2129、R2150、P2153、W2229、Q2246，或經遺傳工程處理形式之第八因子中的等同位置。
於本發明之第一態樣的進一步，較佳之實施態樣中，亦經由以半胱胺酸殘基取代天然存在之胺基酸，或插入半胱胺酸殘基，以與被引入第八因子中之半胱胺酸殘基形成二硫橋來修改VWF。較佳地，半胱胺酸殘基係插入D'或D3結構域(參見第2圖)中，或VWF中該被半胱胺酸殘基取代之天然存在的胺基酸為在D'或D3結構域中之殘基、或在D'或D3結構域中之鹼性或被高度保留之殘基、或涉及N-VWD型之殘基、或暴露在VWF分子表面上之胺基酸。於本發明之較佳的實施態樣中，半胱胺酸殘基係插入TIL'結構域、E'結構域、VWD3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域或E-3結構域中，或該在VWF中被半胱胺酸殘基取代之天然存在的胺基酸為在TIL'結構域、E'結構域、VWD3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域或E-3結構域中之殘基(其均如Zhou等人(2012)Blood 120(2)，449- 458中所定義者)。例如，該在VWF中之天然存在的胺基酸係選自K773、G785、E787、A/T789、K790、T791、Q793、N794、M800、R820、R826、F830、H831、K834、E835、P838、K843、R852、R854、K855、W856、H861、H874、K882、L884、R906、K912、H916、K920、K923、R924、K940、R945、K948、H952、R960、K968、R976、H977、K985、K991、K1026、R1035、K1036、K1052、Q1053、K1073或H1074。較佳地，該在VWF中之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：2中之Y795、R816、H817、P828、D853、D879、K922、D951、E1078、E1161及/或R1204，或係在經遺傳工程處理形式之VWF中的等同位置。更佳地，該在VWF中被半胱胺酸殘基取代之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：2中之R768、R782、H817、D853、E933、L984、E1015、D1076、E1078、P1079、K1116及/或N1134，或例如，在經遺傳工程處理形式之VWF中的等同位置。
更佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合：A/T789C：D1658C、M800C：D1658C、P828C：D1658C、F830C：D1658C、P838C：D1658C、D853C：D1658C、R924C：D1658C、E1078C：D1658C、F830C：D1663C、P838C：D1663C、D853C：D1663C、E1078C：D1663C、E1078C：Y1664C、P838C：D1665C、R816C： D1666C、F830C：D1666C、E835C：D1666C、T791C：E1671C、F830C：E1671C、E835C：E1671C、D879C：E1671C、A/T789C：E1675C、T791C：E1675C、N794C：E1675C、P828C：E1675C、F830C：E1675C、E835C：E1675C、P838C：E1675C、D879C：E1675C、R924C：E1675C、E1078C：E1675C、A/T789C：D1676C、T791C：D1676C、N794C：D1676C、F830C：D1676C、E835C：D1676C、A/T789C：D1678C、F830C：D1678C、E835C：D1678C、A/T789C：I1679C、M800C：I1679C、F830C：I1679C、E835C：I1679C、R854C：I1679C、D879C：I1679C、A/T 789C：Y1680C、T791C：Y1680C、Y795C：Y1680C、M800C：Y1680C、R816C：Y1680C、F830C：Y1680C、E835C：Y1680C、R854C：Y1680C、D879C：Y1680C、A/T789C：E1682C、Y795C：E1682C、R816C：E1682C、P828C：E1682C、E835C：E1682C、P838C：E1682C、R854C：E1682C、D879C：E1682C、Q1053C：E1682C。
再更佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合：F1677C：R768C、I1679C：R768C、Y1680C：R768C、N1685C：R768C、T1654C：R782C、E1675C：R782C、N1685C：R782C、Q1686C：Y795C、S1687C：Y795C、P1688C：Y795C、P1688C：Y795C、E1675C：H816C、D1676C：R816C、Y1680C：R816C、E1682C：R816C、P1688C：R816C、 Y1680C：H817C、N1685C：H817C、Q1686C：H817C、S1687C：H817C、I1679C：P828C、Y1680C：D853C、N1685C：D853C、T1654C：D879C、P1688C：E933C、P1688C：T951C、T1653C：L984C、T1654C：L984C、L1655C：L984C、S1669C：L984C、K1673C：L984C、D1683C：L984C、T1653C：E1015C、L1655C：E1015C、S1669C：E1015C、V1670C：E1015C、N1672C：E1015C、K1673C：E1015C、D1678C：E1015C、I1679C：E1015C、E1684C：E1015C、S1687C：E1015C、F1677C：V1027C、I1679C：V1027C、P1688C：V1027C、S1657C：D1076C、K1673C：D1076C、D1676C：D1076C、F1677C：D1076C、I1679C：D1076C、E1682C：D1076C、D1683C：D1076C、Q1686C：D1076C、D1676C：E1078C、I1679C：E1078C、Y1680C：E1078C、T1653C：P1079C、L1655C：P1079C、S1657C：P1079C、D1658C：P1079C、E1682C：P1079C、V1670C：K1116C、K1673C：K1116C、D1676C：K1116C、D1678C：K1116C、D1681C：K1116C、Q1686C：K1116C、P1688C：K1116C、T1653C：N1134C、L1655C：N1134C、E1660C：N1134C、D1678C：N1134C、D1683C：N1134C、E1684C：N1134C、Q1686C：N1134C、T1653C：E1161C、L1655C：E1161C、K1674C：E1161C、D1676C：E1161C、E1684C： E1161C、S1687C：E1161C、P1688C：R1204C。
最佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合：T1654：P1079、T1654：N1134、Q1656：D1076、F1677：K1116、D1678：R782、I1679：K1116、Y1680：H817、Y1680：D853、Y1680：E1078、D1681：R768、E1682：R768、D1683：R768、E1684：R768、Q1686：R768、Q1686：E1015、S1687：R768、S1687：N1134、P1688：R768、P1688：H817、P1688：E933、P1688：L984、P1688：E1015、P1688：D1076及P1688：N1134。
較佳地，插入VWF和第八因子中之一或多種半胱胺酸殘基之組合所在的天然存在之胺基酸係藉由共價鍵結之第八因子對VWF的相對比率高於0.5(如實施例6中所顯示之實驗評估的結果)及第八因子之活性(如實施例9中所顯示之實驗評估的結果)來選擇。最佳地，插入VWF和第八因子中之一或多種半胱胺酸殘基之組合所在的天然存在之胺基酸係藉由高於1.0之該比率選擇。
較佳地，在本發明複合物中之第八因子為經遺傳工程處理之第八因子。該經遺傳工程處理之第八因子的B-結構域可被部分删除或完全删除，其可為包含一或多個胺基酸取代、插入、删除或彼等之組合的經突變之第八因子，或者其可為具有半衰期延長部分之融合多肽或為經化學改質之第八因子，例如經由連接半衰期延長部分(諸如聚乙二醇(聚乙二醇化)、糖基化之聚乙二醇、羥乙基澱粉(羥乙 基澱粉化)、聚唾液酸、彈力蛋白樣多肽、肝素前體(heparosan)聚合物或透明質酸)來修改。
於一較佳之實施態樣中，本發明複合物中之VWF為半衰期延長型之VWF，較佳為經遺傳工程處理形式之VWF。更佳地，該經遺傳工程處理VWF為VWF與半衰期延長部分之融合蛋白。較佳地，該半衰期延長部分為半衰期延長多肽(HLEP)，更佳地，HLEP係選自白蛋白或其片段、免疫球蛋白恆定區及其部分，例如Fc片段、具有大流體動力學體積之溶劑化無規鏈(例如XTEN(Schellenberger等人，2009)、高胺基酸重複序列(HAP)或脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列(PAS))、艾芙米(afamin)、α-胎兒蛋白、維生素D結合蛋白、轉鐵蛋白或其變體、人絨毛膜促性腺激素-β次單位之羧基端肽(CTP)、能夠在生理條件下結合白蛋白或免疫球蛋白恆定區之多肽或脂質。於另一較佳之實施態樣中，該複合物之VWF係以二聚體之形式表現。於進一步之較佳實施態樣中，該複合物之VWF形成多聚體。
於本發明之另一實施態樣中，本發明之複合物的半衰期係藉由化學改質延長，例如經由連接半衰期延長部分(諸如聚乙二醇(PEG化)、糖基化之聚乙二醇、羥乙基澱粉(HES化)、聚唾液酸、彈力蛋白樣多肽、肝素前體聚合物或透明質酸)來修改。
本發明之第二實施態樣為包含VWF及第八因子之共價複合物，其中該複合物係經修改，使其具有活體內延長 之半衰期，且其中第八因子係經修改以包含一或多個VWF結構域。較佳地，該複合物之延長的半衰期係經由在複合物中使用半衰期延長型VWF來取得。
較佳地，第八因子係與VWF之一或多個C端結構域融合(參見第4圖)，較佳地，該一或多個VWF之C端結構域係與第八因子之C端融合。這類VWF之C端結構域包含VWF之C端胱胺酸結(CK)結構域，且除了C或CK結構域外，還另外包含一或多個VWF之其他結構域，例如A或D結構域。更佳地，FⅧ包含(較佳地，在其C端)SEQ ID NO：2之殘基2723-2813、2724-2813、2722-2813、2578-2813、2580-2813、2497-2813、2429-2813、2400-2813、2334-2813、2255-2813、1873-2813、1683-2813、1277-2813、1264-2813或764-2813或其變體，惟半胱胺酸殘基2773(或其等同體)被保留。
較佳地，VWF之C端CK結構域(可選擇地包含如上文所揭示之其他VWF結構域)係經由可裂解之連接子連接至FⅧ。更佳地，該可裂解之連接子包含可被與血液凝固相關之蛋白酶裂解之裂解位點，再更佳地，該可裂解之連接子包含凝血酶裂解位點，較佳為FⅧ之凝血酶裂解位點之一。較佳地，該連接子序列亦包含額外之胺基酸殘基，較佳地，該額外之胺基酸殘基係插入VWF之C端結構域與該連接子之可裂解部分之間。較佳地，該額外之胺基酸殘基提供足夠長之肽以容許FⅧ和VWF分別經由FⅧ之a3區及VWF之D'D3區交互作用。該額外之胺基酸殘基 可超過10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120或150個胺基酸。較佳地，該額外之胺基酸殘基形成具有彈性之“非結構性”肽，更佳地，包含或甚至係由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、高胺基酸重複序列或FⅧ B-結構域之序列所組成。
於另一實施態樣中，第八因子係在N端與VWF之一或多個C端結構域融合。這類C端結構域可源自VWF之C端胱胺酸結(CK)結構域，且可額外包含一或多個其他VWF結構域。更佳地，第八因子包含(較佳地，在其N端)SEQ ID NO：2之殘基2723-2813、2724-2813、2722-2813、2580-2813、2578-2813、2497-2813、2429-2813、2400-2813、2334-2813、2255-2813、1873-2813、1683-2813、1277-2813、1264-2813或764-2813或其變體，惟半胱胺酸殘基2773(或其等同體)被保留。在這些實施態樣方面，該表現產物從N至C端將包含信號肽、VWF之CK結構域，可選擇地具有額外之VWF結構域，較佳為可裂解(可選擇地，彈性的)之連接子及第八因子。
本發明之另一實施態樣為包含VWF及第八因子之共價複合物，其中VWF為半衰期延長型VWF且其中第八因子係經修改以包含VWF之D'D3或D1D2D'D3區或VWF之保留至少10%野生型血管性血友病因子之FⅧ結合活性的片段。較佳地，第八因子係經修改，而使其部分或全部B結構域被VWF D'D3區或其片段替換(見第5圖)。更佳地，第八因子包含SEQ ID NO：2之殘基764至1241、 764至1242、764至1247、764至1270、或分別介於764至1241至1270間的任何序列、或其變體或片段，較佳地，替代彼之B結構域或B結構域之一部分。
於一較佳之實施態樣中，VWF之D'D3結構域係連接第八因子，當該分子分泌入細胞培養基時會產生二-鏈分子，且該D'D3結構域係位於第八因子輕鏈之N端。此可經由在第八因子a2結構域或B結構域之其餘部分與VWF D'D3結構域之間引入包含，例如用於PACE/弗林蛋白酶之裂解位點的可裂解連接子來取得(第5d和e圖)。較佳地，該連接子在VWF之D'D3結構域和第八因子a3結構域之間包含額外之殘基，該額外之殘基包含足夠長之肽以容許第八因子和VWF分別經由a3和D'D3結構域進行分子內交互作用(第5e圖)。較佳地，該額外殘基析包含之胺基酸少於200個，更佳為少於100個胺基酸，再更佳為少於90、80、70、60、50個胺基酸、少於40個胺基酸、少於30個胺基酸、少於20個胺基酸，最佳為少於10個胺基酸。較佳地，該額外殘基包含具有彈性之“非結構性”肽。更佳地，其包含或甚至係由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列或高胺基酸重複序列所組成。欲表現，以取得如所描述之成熟型的蛋白質可構建成在N端包含額外之序列，例如信號序列。
或者，第八因子之N端係連接VWFD'D3結構域或其片段之C端，較佳地，其N端係經由VWF之另外結構域(例如D1和D2結構域)延長；此將協助表現及細胞內形 成與半衰期延長之VWF間的共價鍵。更佳地，第八因子N端包含SEQ ID NO：2之殘基1至1241或殘基764至1241(在前肽裂解之後)或其變體或片段。
較佳地，VWF之D'D3或D1D2D'D3結構域分別藉由可裂解之連接子連接至第八因子之N端。更佳地，該可裂解之連接子包含可被與血液凝固相關之蛋白酶裂解之裂解位點，再更佳地，該可裂解之連接子包含凝血酶裂解位點，較佳為FⅧ之凝血酶裂解位點之一。較佳地，該連接子在VWF之D'D3或D1D2D'D3結構域和第八因子分子之間包含額外殘基，該額外殘基包含足夠長之肽以容許第八因子和VWF分別經由a3區及D'D3區交互作用(第5e圖)。較佳地，添加超過20、30、50、100、或150個額外之胺基酸。較佳地，該額外之胺基酸包含具有彈性之“非結構性”肽，更佳地，其包含或甚至係由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、高胺基酸重複序列，或FⅧ B-結構域之序列所組成。
此外，若該構造體中要進一步納入與VWF相關的功能性，該如上述之經由連接子融合至FⅧ之N端的VWF之D'D3或D1D2D'D3結構域可藉由源自VWF之額外VWF結構域在D3及所描述之連接子之間延長。
本發明之第二態樣為製造如上述之第八因子與VWF的共價複合物之方法，其包含在真核細胞株中共同表現第八因子和VWF分子。較佳地，該真核細胞株係經修改以表現PACE/弗林蛋白酶，以確保有效之處理。或者，該蛋 白質(第八因子和VWF)可被分別製造，然後在體外(例如在適度氧化之環境中)組合以形成二硫橋，但使第八因子和VWF的功能性完整。
於本發明此態樣之另一實施態樣中，該(經修改)之第八因子及(經修改)之VWF係藉由化學交聯共價連接(見第7圖)。
本發明之第三態樣為如上述之用於醫療的共價複合物，較佳地，用於治療或預防出血性疾病。較佳地，該出血性疾病為A型血友病或血管性血友病。
本發明之第四態樣為包含上述之共價複合物的醫藥組成物。
本發明之另一態樣為經由投予有此需要之個體有效量之如上述的複合物來治療或預防出血疾病之方法。
本發明之詳細描述
如上述，具有用於長期治療血友病(尤其是A型血友病)患者之半衰期長的FⅧ將是非常有利的。本發明者現在意外地發現可製造血管性血友病因子(VWF)與FⅧ之共價複合物，此共價複合物提供FⅧ較長之半衰期。尤其是，當該複合物被修改以延長其活體內半衰期時(例如當使用半衰期延長型VWF或FⅧ時)，FⅧ之半衰期被顯著增加，而使得此方法成為具有吸引力之用於改善預防和治療患者之出血性疾病，如A型血友病的方法。較佳地，亦可藉由此方法增加活體內之回收。
因此，本發明之第一態樣係關於包含血管性血友病因子或其變體(VWF)和第八因子或其變體(第八因子)之共價複合物，其中該複合物係經修改，使其具有活體內延長之半衰期。例如，VWF可為半衰期延長型VWF；或者(或此外)，第八因子可為半衰期延長型FⅧ，或者半衰期延長部分可經由連接子連接至共價複合物。較佳地，該複合物中之VWF包含半衰期延長部分。較佳地，該共價複合物並非雜二聚體Fc融合物(其中一個Fc單體連接VWF，而另一Fc單體連接第八因子)。更佳地，該共價連接並非由半衰期延長部分提供。
本文所使用之術語“血管性血友病因子”或“VWF”係指具有野生型VWF，包括其變體(諸如具有一或多個胺基酸取代、插入、少量或大量删除，例如删除一或多個結構域之VWF)之生物活性的任何多肽，或VWF與另一肽或蛋白質部分(例如半衰期增加多肽)或非蛋白質部分之融合蛋白，只要至少有一部分血管性血友病因子之活性被保留。VWF活性可為膠原蛋白結合活性、及/或血小板結合活性、及/或FⅧ結合活性。測定FⅧ對VWF之結合活性時並不將FⅧ經由VWF上之結合位點與VWF共價結合。測量VWF活性之分析已完善建立，例如膠原結合分析、瑞斯托黴素(Ristocetin)輔因子活性分析、或FⅧ結合分析。在本發明之意義中，若該具有刪除及/或其他修改之VWF保留至少10%，較佳為15%、20%、25%或30%，更佳為至少40%或50%，再更佳為至少60%、70%或75%之野生 型VWF所測得的任何活性，則該生物活性被保留。術語“第八因子結合結構域”係指保留至少10%，較佳為15%、20%、25%或30%，更佳為至少40%或50%，再更佳為至少60%、70%或75%之野生型血管性血友病因子的第八因子結合活性的VWF片段或部分。第八因子結合結構域係位於成熟VWF之N端，例如在D'D3結構域或其片段中。
該編碼野生型血管性血友病因子之基因被轉錄成9kb mRNA，此9kb mRNA被轉譯成具有2813個胺基酸，估計之分子量為310,000道耳吞的前多肽原。前多肽原含有22個胺基酸長之信號肽，741個胺基酸之前多肽及成熟次單位。從N端將741個胺基酸長之前多肽裂解會產生由2050個胺基酸所組成之成熟VWF。VWF前多肽原之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：2中，且已有數種變種發表，例如NCBI參考序列NP_000543.2。除非另外指明，本申請案中之VWF殘基的胺基酸編號係指SEQ ID NO：2，即使VWF分子不需要包含SEQ ID NO：2之所有殘基。成熟野生型VWF之胺基酸序列對應於SEQ ID NO：2之殘基764至2813。本文所使用之術語“VWF”係指顯示至少一部分任一上述VWF功能之VWF活性的任何形式之VWF或其變體。
野生型VWF之前多肽原包含多個以下列順序排列之結構域(根據Schneppenheim及Budde(2011)J Thrombosis Haemostasis 9(增刊1)209-215之前VWF結構域D1至 D4的結構域構造，根據Zhou等人(2012)Blood 120,449-458之C-結構域的結構域構造及命名)：D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
D1及D2結構域代表被裂解出以產生成熟VWF之多肽。該D'結構域包含SEQ ID NO：2之胺基酸764至865；該D'D3結構域包含SEQ ID NO：2之胺基酸764至1241、764至1242、764至1247、或764至1270、或分別介於764和1241至1270之間的任何序列。該羧基端90個殘基包含與蛋白質之“胱胺酸結”超家族同源的“CK”結構域。這些家族成員具有透過二硫鍵二聚化之傾向。如Zhou等人定義之C端結構域C1-C6對應於SEQ ID NO：2中之殘基2255至2333(C1)、2334至約2402(C2)、2429至2496(C3)、2497至2577(C4)、2578至2646(C5)及2647至2722(C6)。
野生型血管性血友病因子包含如SEQ ID NO：2，殘基764至2813所示之成熟血管性血友病因子。亦包含VWF之加入、插入、N端、C端或內部删除，只要VWF之生物活性被保留。在本發明之意義中，若該具有删除及/或其他修改之VWF保留至少10%，較佳為15%、20%、25%或30%，更佳為至少40%或50%，再更佳為至少60%、70%或75%之野生型VWF所測得的任何活性，則該生物活性被保留。野生型VWF之生物活性可由熟習本技藝之人士例如，使用測量瑞斯托黴素輔因子活性(Federici AB，等人，2004.Haematologica 89：77-85)、 VWF對血小板糖蛋白複合物Ib-V-IX之GPIbα的結合作用(Sucker等人，2006.Clin Appl Thromb Hemost.12：305-310)、或膠原蛋白結合分析(Kallas & Talpsep.2001.Annals of Hematology 80：466-471)或測量膠原蛋白結合作用(例如藉由表面等離子共振)的方法測定。可使用之測定VWF之生物活性的其他方法包含測定FⅧ結合能力(Veyradier等人，Haemophilia 2011)。
本文中，術語“凝血因子Ⅷ”、“第八因子”及“FⅧ”可互換使用。“凝血因子Ⅷ”或“第八因子”包括野生型凝血因子FⅧ及野生型凝血因子FⅧ之衍生物或變體，其中該野生型凝血因子FⅧ之促凝血活性至少被部分保留。與野生型FⅧ之胺基酸序列相比較，衍生物可具有删除，如B結構域或部分B結構域被删除、插入及/或加入。術語第八因子包括經蛋白水解處理型之FⅧ，例如包含重鏈和輕鏈之活化前的二鏈形式，及未裂解之單鏈第八因子。
術語“第八因子”包括保留至少10%，較佳為至少15%、20%或25%，更佳為至少30%、40%或50%，最佳為至少60%、70%或甚至是75%之野生型FⅧ的生物活性之任何FⅧ變體或突變體。
合成之FⅧ為分子量約280kDa之單一多肽鏈形式。該胺基端信號肽係在FⅧ轉位入內質網時被除去，然後該成熟(即，信號肽被裂解後)之天然FⅧ分子在其其分泌的過程中在B和a3結構域之間或B結構域內經蛋白水解式裂解。這導致雜二聚體釋出，該雜二聚體係由約80kDa之 C端輕鏈及約90-200kDa之N端重鏈片段所組成，二者以金屬離子依賴方式聯結(亦參見Kaufman,Transfusion Med.Revs.6：235(1992)所做之審閱)。
該雜二聚體透過凝血酶將蛋白質鏈進行蛋白水解式裂解而生理上活化。凝血酶將重鏈裂解成90kDa蛋白質，然後再裂解成54kDa和44kDa之片段。凝血酶亦將80kDa輕鏈裂解成72kDa之蛋白質。後項蛋白質及該兩個重鏈片段(上述之54kDa及44kDa)藉由鈣離子結合在一起而構成活性FⅧ。當44kDa之A2重鏈片段從分子解離，或當72kDa及54kDa蛋白被凝血酶、活化之蛋白C或FXa進一步裂解時會發生去活化。在血漿中，FⅧ係經由與50倍莫耳過量之血管性血友病因子蛋白(“VWF”)結合被穩定，這似乎能抑制如上述之FⅧ的蛋白質降解。
FⅧ之胺基酸序列被組織成三個結構域：各具330個胺基酸之三重A結構域、具980個胺基酸之單一B結構域及各具150個胺基酸之雙重C結構域。B結構域與其他蛋白質不具同源性且提供此蛋白質之25個潛在天門冬醯胺(N)-連接之糖基化位點中的18個。顯然地，B結構域在凝血作用中不具功能且可以被刪除，B-結構域被刪除之FⅧ分子仍具有促凝血活性。
可作為非限制性實例的為，本文所使用之第八因子，包括提供減少或防止APC裂解之FⅧ突變體(Amano 1998.Thromb.Haemost.79：557-563)、具有被進一步穩定之A2結構域的FⅧ突變體(WO 97/40145)、導致表現增加之FⅧ 突變體(Swaroop等人，1997.JBC 272：24121-24124)、致免疫性降低之FⅧ突變體(Lollar 1999.Thromb.Haemost.82：505-508)、從獨立表現之重鏈和輕鏈重構成之FⅧ(Oh等人，1999.Exp.Mol.Med.31：95-100)、對受體之結合力降低，導致FⅧ樣HSPG(硫酸肝素蛋白聚醣)及/或LRP(低密度脂蛋白受體相關之蛋白)分解代謝之FⅧ突變體(Ananyeva等人，2001.TCM,11：251-257)、二硫鍵穩定化之FⅧ突變體(Gale等人，2006.J.Thromb.Hemost.4：1315-1322)、具有改善之分泌性質的FⅧ突變體(Miao等人，2004.Blood 103：3412-3419)、具有增加之輔因子特異活性的FⅧ突變體(Wakabayashi等人，2005.Biochemistry 44：10298-304)、具有改善之生物合成及分泌、降低之ER伴侶蛋白交互作用、改善之ER-高基氏體轉運、增加之活化或對去活化之抗性及改善之半衰期的FⅧ突變體(由Pipe 2004.Sem.Thromb.Hemost.30：227-237綜述)及不能被弗林蛋白酶裂解之單鏈FⅧ突變體。所有這些FⅧ突變體及變異體均以引用方式全部納入本文。
較佳地，第八因子包含如SEQ ID NO：6中所示之全長FⅧ序列，更佳地，第八因子為B-結構域被部分或完全删除之FⅧ的變體。亦包括在FⅧ中加入、插入、取代、N端、C端或內部删除之變體，只要FⅧ之生物活性至少有部分被保留。在本發明之意義中，若經修改之FⅧ保留至少10%，較佳為至少15%、20%或25%，更佳為至少30%、40%或50%，最佳為至少60%、70%，或甚至更佳 為75%之野生型FⅧ的生物活性，則該生物活性被保留。第八因子之生物活性可由熟習本技藝之人士依下述測定。
用於測定第八因子之生物活性的合適試驗為，例如單步驟凝血分析法(Rizza等人，1982.Coagulation assay of F Ⅷ：C and FIXa，在Bloom編輯之The Hemophilias.NY Churchchill Livingston 1992中)或產色(兩步驟)受質FⅧ活性分析法(S.Rosen,1984.Scand J Haematol 33：139-145，增刊)。這些參考文獻之內容以引用方式納入本文。
人成熟野生型凝血因子FⅧ的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：6中。所提及之特定序列的胺基酸位置意指在FⅧ野生型蛋白中之該胺基酸的位置且不排除在所提及之序列中的其他位置存在突變，例如删除、插入及/或取代。例如，涉及SEQ ID NO：6之殘基2004的突變並不排除在該經修改之同源物中，SEQ ID NO：6之位置1至2332處有一或多個胺基酸遺失。
上述定義中之“第八因子”及/或“VWF”亦包括可能存在且從一個個體再傳遞至另一個體的天然等位基因變異及來自其他哺乳動物物種之FⅧ，例如豬FⅧ。上述定義中之“第八因子”及/或“VWF”進一步包括FⅧ及/或VWF之變體。這類變體與野生型序列有一或多個胺基酸殘基不同。這類差異之實例可包括保留型胺基酸取代，即，具有類似特徵之胺基酸群組內的取代，例如(1)小胺基酸、(2)酸性胺基酸、(3)極性胺基酸、(4)鹼性胺基酸、(5)疏水性胺基酸及(6)芳香族胺基酸。這類保留型取代之實例顯示於下 列表1中。
FⅧ或VWF中之術語“保留之殘基”係關於演化保留之殘基，即，在至少兩個，較佳為至少3個哺乳動物序列中之各自位置上發現同一殘基或保留型取代。
術語FⅧ、VWF或其結構域之“變體”係指與SEQ ID NO：6或2中所示之序列或該序列之相關部分分別具有至少50%之序列同一性，較佳為至少55%、60%、65%、70%、75%或80%之序列同一性，更佳為至少82%、84%、85%、86%或88%之序列同一性，再更佳為至少90%、92%、94%、95%之序列同一性的蛋白質或結構域，惟該變體分別保留該蛋白質或其結構域之至少10%，較佳為15%、20%、25%或30%，更佳為至少40%或50%，再更佳為至少60%、70%或75%之生物學活性。一般公認，某些位置可能較其他位置更適合變化。例如，VWF之CK結構域的變體將需要保留位置2773之半胱胺酸(或其等同體)，此半胱胺酸(或其等同體)似乎對形成二聚體是必 不可少的。VWF及FⅧ之CK結構域(Zhou等人(2012)Blood 120,449-458)和其他結構域中之其他半胱胺酸殘基亦可能是必要的。
為了測定%序列同一性，使用合適之序列比對程式來比對該序列，諸如使用默認參數之GCG套組的GAP程式(Devereux等人(1984)Nucl Acids Res 12,387)。其他可用於比對序列之程式包括FASTA(Lipman & Pearson(1985)Science 227,1436-1441)、BLAST(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215,403-410)及ClustalW(Thompson等人(1994)Nucl Acids Res 22,4673-4680)。
於本發明之一實施態樣中，該共價連接係藉由FⅧ中之半胱胺酸殘基(其係藉由遺傳工程被引入FⅧ中)及VWF中之半胱胺酸殘基(其可為在野生型VWF序列中發現之半胱胺酸或亦可為藉由遺傳工程被引入VWF序列中之適當位置的半胱胺酸)之間的二硫橋取得。
本發明之一種較佳實施態樣係關於包含半衰期延長之VWF及第八因子的共價複合物，其中第八因子係經由以半胱胺酸殘基取代至少一個天然存在之胺基酸或在FⅧ中之適當位置中插入至少一個半胱胺酸殘基以與VWF中之半胱胺酸殘基形成二硫橋來修改(圖3)。
因此，根據本發明，該複合物之第八因子組分的胺基酸序列與SEQ ID NO：6中顯示之野生型FⅧ的胺基酸序列不同。經修改之第八因子具有至少一種突變，例如以半胱胺酸取代天然存在之胺基酸或在適當的位置，例如a3 結構域或C端結構域中插入一個半胱胺酸殘基。因此，在本發明之複合物的第八因子中可有一或多個，例如兩個、三個、四個、五個或更多個額外之半胱胺酸殘基；更佳地，僅引入一或兩個額外之半胱胺酸殘基，最佳地引入一個額外之半胱胺酸殘基。
更佳地，第八因子中被取代之天然存在的胺基酸為a3結構域中之胺基酸。更佳地，第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係位於FⅧ a3結構域中之胺基酸1653至1660之內、或胺基酸1667至1674之內、或胺基酸1675至1688之內。更佳地，該a3結構域中之天然存在的胺基酸為酸性殘基，較佳為保留型酸性殘基，或涉及血友病表型之殘基，或可在FⅧ a3結構域中被硫酸化之Tyr殘基。再更佳地，該a3結構域中被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：6中之E1649、D1658、E1660、D1663、Y1664、D1665、D1666、E1671、E1675、D1676、D1678、I1679、Y1680、E1682、D1683、E1684，再更佳地，選自T1653、L1655、D1658、E1660、S1669、V1670、N1672、K1673、K1674、E1675、D1676及/或N1685，或例如在經遺傳工程處理形式之第八因子的同等位置中。最佳地，該a3結構域中被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：6中之T1654，Q1656，F1677，D1678，I1679，Y1680，D1681，E1682，D1683，E1684，Q1686，S1687及/或P1688，或同等位置，例如在經遺傳工程處理形式之 FⅧ中。
較佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係藉由高於0.5之共價鍵結的第八因子對VWF的相對比率(如實施例6中所顯示之實驗評估的結果)及第八因子之活性(如實施例9中所顯示之實驗評估的結果)來選擇。最佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係藉由高於1.0之該比率選擇。
於本發明之第一態樣的另一較佳實施態樣中，該被半胱胺酸取代之天然存在的胺基酸係在FⅧ之C端結構域中，較佳為FⅧ區中介於胺基酸2051和2270之間的胺基酸，更佳地，該殘基係選自SEQ ID NO：6中之I2098、S2119、N2129、R2150、P2153、W2229、Q2246，或例如在經遺傳工程處理形式之FⅧ的同等位置中。
於本發明之第一態樣的進一步較佳實施態樣中，VWF亦經由以下方式修改：以半胱胺酸殘基取代天然存在之胺基酸，或插入半胱胺酸殘基，以與被引入第八因子中之半胱胺酸殘基形成二硫橋。VWF中之天然存在的胺基酸為D'或D3區內之殘基，較佳為D'或D3區內之鹼性殘基、或D'或D3區內之高度保留型殘基、或涉及N-VWD型之殘基、或暴露在VWF分子之表面上的胺基酸。於本發明之較佳實施態樣中係將半胱胺酸殘基插入TIL'結構域、E'結構域、VWD3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域、或E-3結構域中，或者VWF中被半胱胺酸殘基取代之天然存在的胺基酸為TIL'結構域、E'結構域、VWD3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域或E-3結構域中之殘基(結構 域如Zhou等人(2012)Blood 120(2)449-458所定義)。例如，VWF中之天然存在的胺基酸係選自R768、R782、R816、R820、R826、R852、R854、R906、R924、R945、R960、R976、R1035、H817、H831、H861、H874、H916、H952、H977、H1047、K773、K790、K834、K843、K855、K882、K912、K920、K922、K923、K940、K948、K968、K985、K991、K1026、K1036、K1052、K1073、G785、M800、D879、Q1053、E1078、E787、A789、T789、T791、Q793、N794、Y795、P828、F830、E835、P838、D853、W856、L884。較佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：2中之T795、R816、D879、D951、E1161及/或R1204，或例如在經遺傳工程處理形式之VWF的同等位置中。更佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係選自SEQ ID NO：2中之R768、R782、H817、D853、E933、L984、E1015、D1076、E1078、P1079、K1116及/或N1134，或例如在經遺傳工程處理形式之VWF的同等位置中。
較佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係藉由高於0.5之共價鍵結的第八因子對VWF的相對比率(如實施例6中所顯示之實驗評估的結果)及第八因子之活性(如實施例9中所顯示之實驗評估的結果)來選擇。最佳地，VWF中之天然存在的胺基酸係藉由高於1.0之該比率選擇。
較佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合： A/T789C：D1658C、M800C：D1658C、P828C：D1658C、F830C：D1658C、P838C：D1658C、D853C：D1658C、R924C：D1658C、E1078C：D1658C、F830C：D1663C、P838C：D1663C、D853C：D1663C、E1078C：D1663C、E1078C：Y1664C、P838C：D1665C、R816C：D1666C、F830C：D1666C、E835C：D1666C、T791C：E1671C、F830C：E1671C、E835C：E1671C、D879C：E1671C、A/T789C：E1675C、T791C：E1675C、N794C：E1675C、P828C：E1675C、F830C：E1675C、E835C：E1675C、P838C：E1675C、D879C：E1675C、R924C：E1675C、E1078C：E1675C、A/T789C：D1676C、T791C：D1676C、N794C：D1676C、F830C：D1676C、E835C：D1676C、A/T789C：D1678C、F830C：D1678C、E835C：D1678C、A/T789C：I1679C、M800C：I1679C、F830C：I1679C、E835C：I1679C、R854C：I1679C、D879C：I1679C、A/T789C：Y1680C、T791C：Y1680C、Y795C：Y1680C、M800C：Y1680C、R816C：Y1680C、F830C：Y1680C、E835C：Y1680C、R854C：Y1680C、D879C：Y1680C、A/T789C：E1682C、Y795C：E1682C、R816C：E1682C、P828C：E1682C、E835C：E1682C、P838C：E1682C、R854C：E1682C、D879C：E1682C、Q1053C：E1682C。更佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合：F1677C：R768C、I1679C：R768C、Y1680C：R768C、N1685C： R768C、T1654C：R782C、E1675C：R782C、N1685C：R782C、Q1686C：Y795C、S1687C：Y795C、P1688C：Y795C、P1688C：Y795C、E1675C：H816C、D1676C：R816C、Y1680C：R816C、E1682C：R816C、P1688C：R816C、Y1680C：H817C、N1685C：H817C、Q1686C：H817C、S1687C：H817C、I1679C：P828C、Y1680C：D853C、N1685C：D853C、T1654C：D879C、P1688C：E933C、P1688：T951C、T1653C：L984C、T1654C：L984C、L1655C：L984C、S1669C：L984C、K1673C：L984C、D1683C：L984C、T1653C：E1015C、L1655C：E1015C、S1669C：E1015C、V1670C：E1015C、N1672C：E1015C、K1673C：E1015C、D1678C：E1015C、I1679C：E1015C、E1684C：E1015C、S1687C：E1015C、F1677C：V1027C、I1679C：V1027C、P1688C：V1027C、S1657C：D1076C、K1673C：D1076C、D1676C：D1076C、F1677C：D1076C、I1679C：D1076C、E1682C：D1076C、D1683C：D1076C、Q1686C：D1076C、D1676C：E1078C、I1679C：E1078C、Y1680C：E1078C、T1653C：P1079C、L1655C：P1079C、S1657C：P1079C、D1658C：P1079C、E1682C：P1079C、V1670C：K1116C、K1673C：K1116C、D1676C：K1116C、D1678C：K1116C、D1681C：K1116C、Q1686C：K1116C、P1688C：K1116C、T1653C：N1134C、L1655C： N1134C、E1660C：N1134C、D1678C：N1134C、D1683C：N1134C、E1684C：N1134C、Q1686C：N1134C、T1653C：E1161C、L1655C：E1161C、K1674C：E1161C、D1676C：E1161C、E1684C：E1161C、S1687C：E1161C、P1688C：R1204C。
最佳地，引入下列一或多種取代VWF和FⅧ中之天然存在的胺基酸殘基之組合：T1654：P1079、T1654：N1134、Q1656：D1076、F1677：K1116、D1678：R782、I1679：K1116、Y1680：H817、Y1680：D853、Y1680：E1078、D1681：R768、E1682：R768、D1683：R768、E1684：R768、Q1686：R768、Q1686：E1015、S1687：R768、S1687：N1134、P1688：R768、P1688：H817、P1688：E933、P1688：L984、P1688：E1015、P1688：D1076及P1688：N1134。
較佳地，插入VWF和第八因子中之一或多種之半胱胺酸殘基之組合所在的天然存在之胺基酸係藉由共價鍵結之第八因子對VWF的相對比率高於0.5(如實施例6中所顯示之實驗評估的結果)及第八因子之活性(如實施例9中所顯示之實驗評估的結果)來選擇。最佳地，插入VWF和第八因子中之一或多種半胱胺酸殘基之組合所在的天然存在之胺基酸係藉由高於1.0之該比率選擇。
較佳地，在本發明複合物中之第八因子為經遺傳工程處理之第八因子。該經遺傳工程處理之第八因子的B-結構域可部分删除或完全删除，其可為包含一或多個胺基酸 取代、插入、删除或彼等之組合的經突變之第八因子、其可為單鏈版之第八因子，或者其可為具有半衰期延長部分(例如半衰期延長多肽(HLEP))之融合多肽。其亦可為經化學改質之第八因子，例如經由連接半衰期延長部分(諸如聚乙二醇(PEG化)、糖基化之聚乙二醇、羥乙基澱粉(HES化)、聚唾液酸、彈力蛋白樣多肽、肝素前體聚合物或透明質酸)來修改。其亦可為來自另一物種，例如另一種哺乳動物物種之第八因子，例如豬第八因子。
較佳地，本發明之複合物中的VWF為半衰期延長型VWF。
如本文所使用之術語“半衰期”係指各別蛋白質之功能性半衰期，即，在體內(即，在血液中)喪失一半活性所花費的時間。
於一較佳之實施態樣中，本發明之複合物中的半衰期延長型VWF為經遺傳工程處理型VWF。更佳地，該經遺傳工程處理型VWF為具有半衰期延長部分(諸如半衰期延長多肽(HLEP))之VWF的融合蛋白。
本文所使用之“半衰期增加多肽”或“半衰期延長多肽”(HLEP)為與所欲蛋白質，尤其是VWF融合，以延長彼之半衰期的部分。較佳地，HLEP係選自由下列所組成之群組：白蛋白、白蛋白族的成員、免疫球蛋白G及其片段的恆定區、在生理條件下能與白蛋白結合、與白蛋白族之成員結合及與免疫球蛋白恆定區部分結合之多肽或脂質。其可為本文所描述之完整長度的半衰期增強蛋白質 (例如白蛋白、白蛋白族之成員或免疫球蛋白G之恆定區)或彼等之一或多個能夠穩定或延長該凝血因子之治療活性或生物活性的結構域或片段。這類片段可由長度為10個或更多個胺基酸所組成，或可包含至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約50、至少約100、或更多個來自HLEP序列之連續胺基酸，或可包含各別HLEP之一部分或全部特定結構域，只要與野生型VWF或第八因子比較時，該HLEP片段能延長至少25%之功能性半衰期。
該HLEP可為HLEP之變體。術語“變體”包括插入、删除及取代(保留型或非保留型)，其中這類變化容許該HLEP之半衰期延長性質被至少部分保留。
尤其是，本發明所提出之VWF HLEP融合構造體可包括HLEP及HLEP片段之天然存在的多形型變體。該HLEP可源自任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物，例如人、猴、牛、羊或豬。非哺乳動物HLEP包括，但不限於母雞和鮭魚。
較佳地，該半衰期延長部分係選自白蛋白或其變體或片段、免疫球蛋白恆定區或其變體及部分，例如Fc片段、具有大流體動力學體積之溶劑化無規鏈(例如XTEN、高胺基酸重複序列(HAP)、或脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列(PAS))、艾芙米(afamin)或其變體、α-胎兒蛋白或其變體、維生素D結合蛋白或其變體、轉鐵蛋白或其變體、人絨毛膜促性腺素-β次單位之羧基端肽(CTP)、 在生理條件下能與白蛋白或免疫球蛋白恆定區結合之多肽或脂質。最佳地，該HLEP為人血清白蛋白。
本申請案中二術語“人血清白蛋白”(HSA)及“人白蛋白”(HA)可互換使用。術語“白蛋白”及“血清白蛋白”較廣義，且包含人血清白蛋白(及其片段和變體)以及源自其他物種之白蛋白(及彼等之片段和變體)。
如本文所使用之“白蛋白”通指具有一或多種白蛋白之功能活性(例如生物活性，諸如與Ca2+、Na2+、K+、Zn2+離子、脂肪酸、激素、膽紅素結合或與FcRn結合)之白蛋白多肽或胺基酸序列、或白蛋白片段或變體。尤其是，“白蛋白”係指人白蛋白或其片段，尤其是如本文中SEQ ID NO：7中所示之成熟形式的人白蛋白、或來自其他脊椎動物之白蛋白或其片段、或這些分子或其片段之類似物或變體。
尤其是，本發明所提出之VWF融合構造體可包含人白蛋白及人白蛋白之片段的天然存在乏多形性變體。一般而言，白蛋白片段或變體的長雙將為至少30個，最佳為超過70個胺基酸。較佳地，該白蛋白變體可由至少一個白蛋白之全結構域或該結構域之片段所組成，或包含彼等，例如結構域1(SEQ ID NO：7之胺基酸1-194)、結構域2(SEQ ID NO：7之胺基酸195-387)、結構域3(SEQ ID NO：7之胺基酸388-585)、結構域1+2(SEQ ID NO：7之胺基酸1-387)、結構域2+3(SEQ ID NO：7之胺基酸195-585)或結構域1+3(SEQ ID NO：3之胺基酸1- 194+SEQ ID NO：7之胺基酸388-585)。各結構域本身係由兩個同源子結構域組成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491及512-585，其具彈性之子結構域內連接子區包含殘基Lys106至Glu119、Glu292至VaI315及Glu492至Ala511。
本發明之複合物中的VWF融合構造體的白蛋白部分可包含至少一個HA之子結構域或結構域，或其保留型修改。
於一較佳之實施態樣中，白蛋白之N端係融合至該經修改之VWF的胺基酸序列之C端。亦即，本發明之複合物可包含以下結構：mVWF-L-A
其中mVWF為如上述之經修改的VWF，L為可選擇之肽連接子序列且A為如上述定義之白蛋白。
本發明之經修改的VWF或FⅧ與經修改之VWF的複合物可包含超過一個HLEP序列，例如二或三個HLEP序列。此數個HLEP序列可以縱排方式(例如為連續之重複序列)融合至VWF之C端部分。
HLEP亦可經由肽連接子偶聯至VWF。該連接子應為非致免疫性的，且可為不可裂解或可裂解之連接子。不可裂解之連接子可包含，例如WO2007/090584中所示例之交替的甘胺酸和絲胺酸殘基。
VWF部分和HLEP部分之間可能的肽連接子亦可由作為人蛋白質中之天然結構域間之連接子的肽序列所組 成。較佳地，這類肽序列在其天然環境中係位於接近蛋白質之表面且容易被免疫系統接近，因此們可假設針對此序列之天然耐受性。WO2007/090584中提出實例。較佳地，該連接子區包含VWF之序列，這導致該表現出之融合蛋白產生新抗原性質之風險降低。
可裂解之連接子應具足夠彈性以容許被蛋白酶裂解。較佳地，該連接子肽可被凝血系統之蛋白酶(例如FⅡa、FIXa、FXa、FXIa、FXⅡa及/或FVⅡa)裂解。
HLEP亦可為可非共價式地結合半衰期延長部分，諸如人血漿中之天然存在之蛋白質(例如白蛋白、免疫球蛋白)的肽。在此情況中，VWF之修改方式將為使其攜帶(較佳地，在D'D3結構域之C端或N端)與該半衰期延長部分結合之肽。
於本發明之另一實施態樣中，VWF之半衰期係藉由化學改質延長，例如連接半衰期延長部分，諸如聚乙二醇(PEG化)、糖基化之PEG、羥乙基澱粉(HES化)、聚唾液酸、彈性蛋白樣多肽、肝素前體聚合物或透明質酸。
本發明之另一實施態樣為第八因子與半衰期延長之VWF的共價複合物，其中第八因子係經由加至第八因子之額外的肽或多肽序列連接到VWF。較佳地，該添加之序列包含一或多個VWF結構域。
如上文中所提及者，在內質網之生物合成過程中，VWF前肽單體經由C端胱胺酸結結構域(CK)之間形成的C端二硫橋組裝成二聚體。令人驚訝地，本發明者現已發 現此CK結構域，當與第八因子融合時，導致介於被引入第八因子之CK結構域與天然存在於VWF中之CK結構域之間的共價二硫鍵。因此，這呈現另一種取得本發明之第八因子與VWF之共價複合物的新穎方式。若與第八因子融合之VWF的一部分包含額外之C結構域則可增強形成該共價鍵之效率。這些可為，例如Zhou等人(2012，Blood 120，449-458)定義之C5至C6結構域、C3至C6結構域或C1至C6結構域，其可選擇地藉由額外之VWF結構域延長。
因此，本發明之另一實施態樣為包含VWF及第八因子之共價複合物，其中VWF為半衰期延長型VWF，其中第八因子係經修改以包含VWF之C端結構域CK，且可選擇地，包含額外之VWF結構域。較佳地，第八因子係在其C端被修改。更佳地，第八因子包含(較佳地，在其C端)SEQ ID NO：2之殘基2723至2813、2722至2813、2724至2813、2580至2813、2578至2813、2497至2813、2429至2813、2400至2813、2334至2813、2255至2813、1873至2813、1683至2813、1277至2813、1264至2813或764-2813或其變體，惟半胱胺酸殘基2773(或其等同體)被保留。較佳地，除了該CK結構域外，該經修改之第八因子包含如Zhou等人(2012，Blood 120，449-458)定義之VWF的C6、C5至C6、C4至C6、C3到C6、C2至C6、或C1至C6結構域或其變體。可選擇地，該CK和C結構域可藉由VWF之額外結構域延 長。
於本發明之另一實施態樣中，第八因子係N端與一或多個VWF之C端結構域融合(參見第6圖)。這類C端結構域可源自VWF之C端胱胺酸結(CK)結構域且可額外包含一或多個VWF之C-結構域、D-結構域、或A-結構域，至多為包含整個VWF序列(參見第2圖中之VWF的結構)。更佳地，第八因子包含(較佳地，在其N端)SEQ ID NO：2之殘基2723至2813、2722至2813、2724至2813、2580至2813、2578至2813、2497至2813、2429至2813、2400至2813、2334至2813、2255至2813、1873至2813、1683至2813、1277至2813、1264至2813、或764-2813或其變體，惟半胱胺酸殘基2773(或其等同體)被保留。在此實施態樣中係在VWF結構域之N端加入一個信號肽，且VWF結構域係直接或經由多肽連接子融合至成熟之第八因子的N端(無信號肽)。
較佳地，VWF之C端CK結構域(其可選擇地藉由額外的結構域延長)係藉由可裂解之連接子連接至第八因子。連接子序列可由一或多個胺基酸，例如1至200、1至150、1至100、1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、或1至3(例如1、2或3)個胺基酸所組成且其可彼此相等或不同。通常，該連接子序列並不存在於野生型凝血因子之對應位置處。較佳地，該連接子為可裂解之連接子，即，其包含蛋白酶作用之裂解位點，較佳地，其包含可被與凝血相關之蛋白酶裂解的裂解位點，更 佳地，該可裂解之連接子包含凝血酶裂解位點，再更佳地，其包含FⅧ之凝血酶裂解位點之一。可裂解之連接子的實例有EDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRN(SEQ ID NO：6(FVIII))之aa1675-1720)或NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHRSTRQKQFNATTIPEN(SEQ ID NO：6之aa714-764)VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLV(SEQ ID NO：6之aa357-399)或VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYA(SEQ ID NO：6之aa357-396)或VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWD(SEQ ID NO：6之aa357-394)
包括彼等之删除、插入及/或取代(假定該可裂解性被保留)。
可選擇地，該連接子包含額外之胺基酸殘基，較佳地，其係被引入源自VWF之結構域與連接子之可裂解部分之間。較佳地，該額外之殘基提供足夠長之肽，以允許第八因子和VWF之交互作用，尤其是分別經由a3和D'D3區。該額外之胺基酸殘基可超過10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120或150個胺基酸。較佳地，該額外之胺基酸殘基形成有彈性的，“非結構性”肽，更佳地，包含或甚至由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、高胺基酸重複序列、或FⅧ B結構域之序列所組成。
本發明之另一實施態樣為包含VWF及第八因子之共價複合物，其中VWF為半衰期延長型VWF，且其中第八 因子係經修改以包含VWF之D'D3區域，及可選擇地，VWF之另外的結構域(第5圖)。較佳地，第八因子係經修改以使其部分或全部B結構域被VWF D'D3區或其片段所取代(第5d和e圖)。更佳地，第八因子包含(較佳地，代替其(或其部分)B結構域)SEQ ID NO：2之殘基764至1241、764至1242、764至1247、或764至1270、或分別介於764和1241至1270之間的任何序列，或其變體或片段。
較佳地，VWF之D'D3結構域係連接第八因子，以在分子分泌入細胞培養基時產生二-鏈分子，而該D'D3結構域係位於第八因子輕鏈之N端。此可經由在第八因子a2結構域和VWF D'D3結構域之間引入包含，例如PACE/弗林蛋白酶作用之裂解位點的可裂解之連接子來取得(第5d和e圖)。可選擇地，該連接子在VWF之D'D3結構域和第八因子a3結構域之間包含額外之殘基(第5e圖)，該額外之殘基包含足夠長之肽以容許第八因子和VWF分別經由a3和D'D3區進行分子內交互作用。較佳地，該額外之殘基係少於300、250、200、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15或10個胺基酸。該額外之胺基酸殘基可包含具有彈性之“非結構性”肽，較佳地，其包含或甚至由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、或高胺基酸重複序列、或源自FⅧ B結構域之序列所組成。
上述之實施態樣為成熟形式；熟習本技藝之人士將能 構建欲表現之蛋白質，以取得成熟形式，例如經由在N端包含額外之序列，例如之信號序列來取得。
或者，第八因子之N端係連接VWFD'D3結構域或其片段之C端，可選擇地含有VWF之其他結構域(例如D1和D2結構域)，較佳地，其N端係藉由信號肽延長。此將有助於表現及細胞內形成與半衰期延長之VWF間的共價鍵。更佳地，VWF部分N端包含SEQ ID NO：2之殘基1至1241或殘基764至1241(在前肽裂解之後)或彼等之變體或片段。
較佳地，VWF之D'D3或D1D2D'D3結構域分別藉由可裂解之連接子連接至第八因子之N端。更佳地，該可裂解之連接子包含蛋白酶裂解位點，更佳地，供凝血系統之蛋白酶之一作用的裂解位點，再更佳地，包含凝血酶裂解位點，較佳為FⅧ之凝血酶裂解位點之一。可選擇地，該連接子在VWF之D'D3或D1D2D'D3結構域和第八因子分子之間包含額外之殘基，該額外之殘基包含足夠長之肽以容許第八因子及VWF分別經由a3區及D'D3區進行分子內交互作用。較佳地，添加超過20、30、40、50、70、100或150個額外之胺基酸。較佳地，該額外之胺基酸包含具有彈性之“非結構性”肽，更佳地，其包含或甚至係由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、高胺基酸重複序列，或FⅧ B-結構域之序列所組成。
進一步之替代方案中，第八因子之C端係連接VWF D'D3結構域或其片段之N端。此將有助於表現及細胞內形成與共同表現之半衰期延長之VWF間的共價鍵。更佳地，VWF包含SEQ ID NO：2之胺基酸764至1241、764至1242、764至1247、或764至1270、或分別介於764和1241至1270之間的任何序列、或彼等之變體或片段。
較佳地，VWF之D'D3結構域(或D1D2D'D3結構域)係藉由可裂解之連接子連接至第八因子之N端；VWF結構域之N端包含信號肽將導致該蛋白質在哺乳動物細胞中表現時分泌出。更佳地，該可裂解之連接子包含凝血酶裂解位點，較佳地，FⅧ之凝血酶裂解位點之一(這些凝血酶裂解位點包含含有分別在SEQ ID NO：6之胺基酸位置372、740及/或1689處的凝血酶裂解位點之序列)。
可選擇地，在VWF之D'D3結構域和第八因子分子之間的連接子包含額外殘基，該額外殘基包含足夠長之肽，以容許第八因子和VWF分別經由a3和D'D 3區交互作用。較佳地，加入超過20、30、40、50、70、100、120、或150個胺基酸。較佳地，該額外之胺基酸包含具有彈性之非結構性肽，更佳地，彼等包含或甚至係由甘胺酸-絲胺酸重複序列、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸重複序列、高胺基酸重複序列、或由FⅧ B-結構域之序列所組成。
這類具有各種不同連接子之融合蛋白的實例顯示於SEQ ID NO：144-177中；所顯示之各序列，即，DNA和其轉譯產物(融合蛋白)，以及憑藉遺傳密碼之冗餘性編碼同一轉譯產物之DNA序列(例如那些DNA序列之密碼子 優化的版本)為本發明之特定實施態樣。然而，熟習本技藝之人士將能夠設計更多這類亦在本發明範圍內之融合蛋白的實例。
較佳地，本發明之複合物的VWF部分會如同其在天然情況下般形成多聚體。為了特定原因，該複合物之VWF部分形成多聚體時不超過二聚體是較有利的。此可經由將VWF之前肽序列刪除並將VWF信號肽直接融合至D'之N端以容許前肽被刪除之VWF分子表現出來達成。由於缺乏前肽，經由D'D3結構域之多聚體化作用將被阻斷。為了其他特定原因，該複合物之VWF部分形成多聚體時不超過單體是較有利的。此可經由將VWF之前肽序列刪除，並將VWF信號肽直接融合至D'之N端以容許前肽被刪除之VWF分子表現出，另外再將Cys2773之突變引入另一合適之胺基酸(例如丙胺酸)中來達成。
本發明之另一實施態樣為上述形成第八因子/VWF複合物之實施態樣的任何組合，其中第八因子和VWF結合位點之間直接存在一或多個共價鍵(較佳為二硫鍵)，且其中該分子之第八因子和VWF部分之間存有另一共價鍵，且其中有一或多個HLEP連接第八因子、連接VWF、或連接該兩者(第12圖)。這類第八因子/VWF複合物可能是有利的，因為其可產製之產量高於那些在第八因子和VWF部分之間僅具有二硫鍵之複合物。
本發明之第二態樣為製造如上述之第八因子與VWF的共價複合物之方法，其包含在真核細胞株中共同表現第 八因子和VWF。因此，本發明亦關於編碼形成本發明之複合物的蛋白質之多核苷酸。
術語“多核苷酸”一般指任何可為未經修改之RNA或DNA或經修改之RNA或DNA的多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸。該多核苷酸可為單股或雙股DNA、單股或雙股RNA。如本文所使用之術語“多核苷酸”亦包括含有一或多個經修改之鹼基及/或稀有鹼基(諸如肌苷)之DNA或RNA。可理解的是，DNA和RNA可做各種修改以用於熟習本技藝之人士已知之許多有用的用途中。當用於本發明中時，術語“多核苷酸”包含化學、酶、或代謝上經修改之多核苷酸形式，以及具病毒和細胞(包括，例如單純及複雜細胞)之DNA和RNA特性的化學形式。
熟習本技藝之人士將會理解由於遺傳密碼之簡併性，指定之多肽可由不同的多核苷酸編碼。這些“變體”包含在本發明中。
較佳地，本發明之多核苷酸為分離出之多核苷酸。術語“分離出”之多核苷酸係指實質上不含其他核酸序列之多核苷酸，諸如，但不限於其他染色體及染色體外DNA和RNA。分離出之多核苷酸可從宿主細胞純化取得。熟習本技藝之人士所已知之常規核酸純化方法可用來取得被分離出之多核苷酸。該術語亦包括重組多核苷酸及化學合成之多核苷酸。
本發明進一步關於一群多核苷酸，其同時編碼本發明之經修改的VWF及/或經修改之第八因子，或包含經修改 之VWF及/或經修改之第八因子的本發明多肽。例如，該組中之第一多核苷酸可編碼經修改之第八因子的重鏈，而第二多核苷酸可編碼經修改之第八因子的輕鏈，且第三多核苷酸可編碼經修改之VWF。
而本發明之另一態樣為包含根據本發明之多核苷酸的質粒或載體。較佳地，該質粒或載體為表現載體。於一特殊之實施態樣中，該載體為用於人基因療法之轉運載體。
本發明亦關於一群包含上述之多核苷酸群的質粒或載體。第一質粒或載體可含有該第一多核苷酸，而第二質粒或載體可含該第二多核苷酸。或者，將二或多個編碼序列選殖入表現載體中，此可使用分開之啟動子序列，或一個啟動子及內部核糖體進入位點(IRES)元件以指導一個以上之蛋白質(其為本發明之複合物的一部分)表現。
本發明還有另一態樣為包含本發明之多核苷酸、質粒或載體，或如本文所描述之多核苷酸群、或質粒或載體群之宿主細胞。
本發明之宿主細胞可用於製造本發明之共價複合物的方法中。該方法包含：(a)在能表現所需之蛋白質複合物的條件下培養本發明之宿主細胞；及(b)可選擇地，從該宿主細胞或從培養基中回收所需之蛋白複合物。
在合適之宿主細胞中以高產量製造之重組突變蛋白需要將上述之經修改的cDNA與合適之調控元件在重組表現 載體中一起組合在有效的轉錄單元中，而該重組表現載體可根據熟習本技藝之人士已知之方法在各種表現系統中增殖。有效之轉錄調控元件可源自以動物細胞作為其天然宿主的病毒或源自動物細胞之染色體DNA。較佳地，可使用源自猿猴病毒40(Simian Virus 40)、腺病毒、BK多瘤病毒(BK polyoma virus)、人巨細胞病毒(cytomegavirus)之啟動子-增強子組合，或勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒之長末端重複序列，或包括動物細胞中之強結構性轉錄基因(像β-肌動蛋白或GRP78)的啟動子-增強子組合。為了取得穩定高產量之從cDNA轉錄的mRNA，該轉錄單元之3'-近端部分應包含編碼轉錄終止-多聚腺苷酸化序列的DNA區域。較佳地，此序列係源自猿猴病毒40早期轉錄區、兔子β-球蛋白基因或人組織纖溶酶原(plasminogen)活化子基因。
然後，可將cDNA整合在用於表現經修改之第八因子及/或VWF蛋白的合適宿主細胞株之基因組中，經修改之第八因子及/或VWF蛋白再組合成本發明之共價複合物。或者，亦可使用保留在細胞中為穩定之染色體外元件形式的穩定游離型載體(episomal vector)。較佳地，此細胞株應為脊椎動物來源之動物細胞株，以確保進行正確折疊、形成二硫鍵、天門冬醯胺連接之糖基化和其他轉譯後修改，以及分泌入培養基中。其他轉譯後修改之實例為新生多肽鏈之酪胺酸O-硫酸化及蛋白酶解處理。可使用之細胞株的實例為猴子COS細胞、小鼠L細胞、小鼠C127細 胞、倉鼠BHK-21細胞、人HEK-293細胞及倉鼠CHO-細胞。
編碼對應之cDNA的重組表現載體可以多種不同的方式被引入動物或人細胞株中。例如，根據不同之動物病毒可從載體創建重組表現載體。這些實例為以桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒，及較佳地，牛乳頭狀瘤病毒為基礎之載體。
編碼對應之DNA的轉錄單元亦可與另一可作為這些細胞中之顯性選擇標記的重組基因一起被引入動物細胞中，以協助分離出其基因組中已具有整合之重組DNA的特定細胞選殖株。此類型之顯性選擇標記基因的實例有：賦予遺傳黴素(G418)抗性之Tn5胺基糖苷磷酸轉移酶、賦予潮黴素抗性之潮黴素磷酸轉移酶、賦予嘌呤黴素抗性之嘌呤黴素乙醯轉移酶。編碼這類選擇標記之重組表現載體可駐留在與編碼所需蛋白質之cDNA的載體相同之載體上，或可被編碼在分開之載體上，再被同時引入並整合到宿主細胞之基因組中，這經常導致不同轉錄單元之間緊密的物理聯結。
其他可與所需蛋白質之cDNA一起使用之選擇標記基因的類型係以編碼二氫葉酸還原酶(dhfr)之各種轉錄單元為基礎。將此類型之基因引入缺乏內源性dhfr活性之細胞(較佳為CHO細胞(DUKX-B11、DG-44))後，該基因將可使這些細胞在缺乏核苷之培養基中生長。這類培養基之一種實例為不含次黃嘌呤、胸苷和甘胺酸之Ham氏F12。 這些dhfr-基因可與cDNA轉錄單元一起被引入上述類型之CHO-細胞中(無論是連接在同一載體上，或在不同的載體上)，從而創建產製重組蛋白之dhfr陽性細胞株。
若上述細胞株係在細胞毒性dhfr-抑制劑胺甲喋呤之存在下生長，新細胞株將會出現對胺甲喋呤的抗性。由於連接之dhfr和所需之蛋白質轉錄單元的數目擴增，這些細胞株可加速產製重組蛋白。當將這些細胞株在增加濃度之胺甲喋呤(1-10000nM)中增殖時，可取得能以非常高之速率產製所需蛋白質的新細胞株。
上述之產製所需蛋白的細胞株可在懸浮培養中或在不同的固相支撐上大規模生長。這些支撐之實例為以葡聚醣或膠原蛋白基質為基礎的微載體，或為中空纖維型或各種陶瓷材料之固體載體。當在細胞懸浮培養中或在微載體上生長時，上述細胞株之培養可以分批培養進行或在延長之期間以連續製造之條件培養基進行輸注培養。因此，根據本發明，上述之細胞株非常適合用於發展用於產製所需之重組突變蛋白的工業過程。
較佳地，將本發明之複合物純化至≧80%純度，更佳為≧95%純度，特佳為純度大於99.9%(相對於來自細胞培養之污染的大分子，尤其是其他蛋白質及核酸)之醫藥上純態，且不含傳染劑和產膿劑。較佳地，本發明之分離或純化之經修改的共價複合物實質上不含其他，不相關之多肽。
積聚在上述類型之分泌細胞的培養基中之本發明的共 價複合物可藉由各種生化和色層分析法濃縮及純化，包括利用細胞培養基中之所需蛋白質與其他物質之間的大小、電荷、疏水性、溶解性、特定親和力，等差異的方法。
一種這類純化法之實例為將重組突變蛋白吸附在被固定在固體載體上之，例如針對HLEP(較佳為人白蛋白)或針對各別凝血因子之單株抗體上。將複合物吸附在支撐上後，清洗並解吸附，再藉由根據上述性質之各種色層分析技術進一步純化該蛋白質。純化步驟之順序係，例如根據該步驟之能力和選擇性、支撐之穩定性、或其他方面選擇。較佳地，純化步驟為，例如，但不限於離子交換色層分析步驟、免疫親和色層分析步驟、親和色層分析步驟、疏水交互作用色層分析步驟、染料色層分析步驟、羥基磷灰石色層分析步驟、多峰色層分析步驟及尺寸排阻色層分析步驟。
為了盡量減少理論上之病毒污染風險，可在此過程中包含額外的步驟，以有效地將病毒去活化及/或排除。這類步驟有，例如在液態或固態中熱處理、以溶劑及/或清潔劑處理、在可見光或紫外光譜中照射、γ-照射或奈米過濾。
本發明之經修改的多核苷酸(例如DNA)亦可被整合入用於人基因療法的轉移載體中。
於本發明此態樣之另一實施態樣中，(經修改)之第八因子及(經修改)之VWF係藉由化學交聯共價連接。
本發明之各種產物可用來作為藥物。因此，本發明之 第三態樣為如上述用於醫學中之共價複合物，較佳為用於治療或預防出血性疾病。較佳地，該出血性疾病為A型血友病或血管性血友病。
本發明之第四態樣為包含上述共價複合物之醫藥組成物。如本發明中所描述之共價複合物可被配製成用於治療用途之醫藥製劑。純化之蛋白質可溶解在常規之生理上相容的緩衝水溶液中，其中可選擇地加入醫藥賦形劑以提供醫藥製劑。
這類醫藥載體和賦形劑，以及合適之醫藥配製劑為本技藝所熟知(參見，例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)或“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第3版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。標準醫藥配製技術為熟習本技藝之人士所熟知(參見，例如2005Physicians' Desk Reference®,Thomson Healthcare：Montvale,NJ,2004；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro等人編輯，Lippincott Williams & Wilkins：Philadelphia,PA,2000)。尤其是，包含本發明之共價複合物的醫藥組成物可配製成凍乾或穩定之液體形式。多肽變體可藉由本技藝中已知之各種程序凍乾。凍乾之配製劑係在使用前經由加入一或多種醫藥上可接受之稀釋劑(請如注射用無菌水或無菌生理鹽水溶液)重構成。
該組成物之配製劑係藉由任何醫藥上合適之投服方式 投遞給個人。已知之遞送系統有各式各樣且可經由任何方便的途徑投服該組成物。較佳地，本發明之組成物係經系統性途徑投服。在系統性使用方面，本發明之複合物係配製成用於腸胃道外途徑(例如靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜內、腦內、肺內、鼻內或經皮)或腸內途徑(例如口服、陰道或直腸)途徑根據常規方法投遞。最佳之投服途徑為靜脈內及皮下投服。該配製劑可藉由輸注或藉彈丸注射連續投服。一些配製劑包含緩釋系統。
本發明之共價複合物係以治療上有效劑量投予患者，治療上有效劑量意指該劑量足以產生所需之效果，預防或減輕接受治療之病況或適應症的嚴重性或擴散，且未達到產生無法忍受之不良副作用的劑量。確切之劑量取決於許多因素，諸如，例如該適應症、配製劑、投服模式且必須在用於各別適應症之臨床前及臨床試驗中測定。
本發明之醫藥組成物可單獨投服或與其他治療劑一起投服。這些作用劑可納入同一醫藥製劑中作為該製劑之一部分。
本發明之另一態樣為經由投予有此需要之個體有效量之如上述的複合物來治療或預防出血疾病的方法。於另一實施態樣中，該方法包含投予該個體有效量之本發明的多核苷酸或本發明之質粒或載體。或者，該方法可包含投予該個體有效量之本文所描述的本發明之宿主細胞。
下列非限制性實施例中將進一步說明本發明。本發明之特定實施態樣的描述將結合附圖進行。
序列說明：
SEQ ID NO：1：人VWF之cDNA序列
SEQ ID NO：2：人VWF之蛋白質序列
SEQ ID NO：3：PCR引物VWF+
SEQ ID NO：4：PCR引物VWF-
SEQ ID NO：5：人FⅧ之cDNA序列
SEQ ID NO：6：成熟人FⅧ之蛋白質序列
SEQ ID NO：7：成熟人血清白蛋白之蛋白質序列
SEQ ID NO：8-143：用於引起如實施例中列出之突變的各種不同引物和寡核苷酸。
SEQ ID NO：144-177：人單鏈FⅧ與各種包含VWF-CK之序列的融合蛋白序列(DNA和蛋白質)(透過各種連接子連接)。
第1圖：a)成熟FⅧ蛋白之結構域構造；b)刪除B-結構域之成熟FⅧ蛋白的結構域構造；c)刪除B-結構域之單鏈成熟FⅧ蛋白的結構域構造。箭頭顯示PACE/弗林蛋白酶裂解位點，三角形顯示用於活化之凝血酶裂解位點。
第2圖：根據Zhou等人，2012之前VWF(A)及成熟VWF(B)的結構域構造。圖中未顯示VWF-二聚體化及多聚體化。
第3圖：其中第八因子和VWF係經由二硫橋連接之共價複合物的實例。VWF結構域以灰色顯示，第八因子以白色顯示。
第4圖：以包含VWF CK結構域之VWF結構域修改之FⅧ的實例。FⅧ結構域以白色顯示，VWF結構域以灰色顯示。黑色三角形顯示凝血酶裂解位點，空心三角形顯示被引入連接子中之蛋白酶裂解位點。
第5圖：以包含D'D3結構域之VWF結構域修改之FⅧ的實例。箭頭顯示PACE/弗林蛋白酶裂解位點，黑色三角形顯示凝血酶裂解位點，空心三角形顯示被引入連接子中之蛋白酶裂解位點。
第6圖：以額外之VWF結構域修改的FⅧ。符號之解釋同上。
第7圖：經由化學交聯連接之共價複合物的實例。
第8圖：共價連接之FⅧ-SC/VWF-FP分子的西方印 跡分析。M，分子大小標記。A，抗FⅧ，B，抗VWF抗體印跡。
第9圖：在純化(泳道1)及隨後之凝血酶裂解(泳道2)後在還原SDS-PAGE上分離共價連接之FⅧ-SC/VWF-FP分子。
第10圖：藉由抗VWF(A)及抗FⅧ(B)抗體進行共價連接之FⅧ-SC/VWF-FP多聚體分子的多聚體凝膠分析。 泳道1，源自血漿之VWF；泳道2和3，表現共價連接之FⅧ-SC/VWF-FP多聚體的二種選殖株之上清液；泳道4，rVWF-FP。
第11圖：大鼠中之共價連接的FⅧ-SC/VWF-FP多聚體(圓圈)的藥代動力學分析。A，FⅧ之數據，B，VWF之數據。
第12圖：同時具有二硫鍵及VWF與第八因子融合(可選擇地經由肽連接子)的構造體之實例。
實施例1：產生D'D3區中具半胱胺酸殘基之VWF突變體
預先產生在其多選殖位點中含有全長VWF cDNA序列(pVWF-2448)的表現質粒(pIRESpuro3；BD Biosciences公司，美國紐澤西州富蘭克林湖)。包含在此載體中之VWF cDNA序列為SEQ ID NO：1所顯示者，其對應之蛋白質序列如SEQ ID NO：2所顯示者。
為了產生這類表現載體，可在熟習本技藝之人士已知之標準條件下(例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel FM等人(編輯)John Wiley & Sons,Inc.；http：//www.currentprotocols.com/WileyCDA/中所描述者)，使用引物組VWF+及VWF-(SEQ ID NO：3和4)，藉由聚合酶鏈反應(PCR)從含有VWF cDNA(如市售者，例如來自ATCC編號67122之pMT2-VWF)之質粒擴增VWF cDNA。藉由限制內切酶EcoR I分解所得之PCR片段，並連接入已藉由EcoRI線性化之表現載體pIRESpuro3中。所產生之已篩選插入物之正確方向的表現質粒將含有在CMV啟動因子下游之適合用於表現VWF 的野生型VWF之cDNA。
為了將突變引入VWF序列中，根據下列套組製造商建議之方案，在質粒pVWF-2448上應用定點致突變(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit，Agilent科技，美國加州La Jolla)。在每一致突變反應中，將5微升之10x反應緩衝液、1微升之質粒DNA pVWF-2448(50奈克)、各1微升(10皮莫耳/微升)之二種致突變寡核苷酸、1微升之dNTP混合物、3微升之Quick溶液、1微升之Turbo聚合酶(2.5U/微升)及37微升水混合，並依下述進行聚合酶鏈反應：在95℃下，進行2分鐘之初始變性，進行以下週期18次：a)在95℃下變性50秒，b)在60℃下黏合50秒，及c)在68℃下延長14分鐘，再在68℃下進行單一端延長階段7分鐘。接著，加入1微升來自該套組之Dpn1酶，並將該反應物再在37℃下培育60分鐘。然後，將3微升之致突變反應物轉形入大腸桿菌勝任細胞(competent cell)(例如XL10 GOLD，Agilent科技公司)中。將選殖株分離出，萃取質粒DNA並藉由DNA定序來驗證VWF序列中之突變。
下表中列出用於引起VWF cDNA序列突變之寡核苷酸及引入之各別突變。
使用上述方案和質粒，經由應用熟習本技藝之人士已知之分子生物學技術(如上文Current Protocols in Molecular Biology中所描述者)，技術人員可製造其他用於引起SEQ ID NO：2中之任何胺基酸殘基突變的構造體。
依照這些實施例中之半衰期延長原理選擇VWF與白蛋白之融合物。此係以後綴-FP表示。
為了產生白蛋白與VWF及VWF突變體之融合物，以類似於WO 2009/156137中所描述之實施例插入連接子及白蛋白cDNA序列。
為了產生含有VWF突變體，且不含有前肽序列之表現匣，使用具有SEQ ID 54和55之引物進行致突變作用。
這將產生其中該信號肽(SEQ ID NO：2之胺基酸1至22)直接融合至D'區(SEQ ID NO：2之胺基酸764)的VWF序列。
下表列出以分散的方式與VWF D'D3結構域中之半胱胺酸互換的殘基：
實施例2：產生a3結構域中具半胱胺酸殘基之FⅧ突變體
任何被選殖在表現質粒中之FⅧ cDNA序列均可用來將Cys突變引入a3結構域中。較佳地，使用部分B結構域被删除的單鏈FⅧ構造體(參見WO 2004/067566中之實例)。
為了產生FⅧ表現載體，可在熟習本技藝之人士已知之標準條件下(例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel FM等人(編輯)John Wiley & Sons, Inc.；http：//www.currentprotocols.com/WileyCDA/中所描述者)，使用引物組SEQ ID NO：56和57，藉由聚合酶鏈反應(PCR)從含有FⅧ cDNA之質粒擴增FⅧ cDNA。藉由限制內切酶NheI和NotI分解所產生之PCR片段，並將其連接入已藉由NheI和NotI線性化之表現載體pIRESpuro3(BD Biosciences公司，美國紐澤西州富蘭克林湖)中。所產生之表現質粒將含有CMV啟動因子之FⅧ下游的cDNA，且適合用於在動物細胞培養中表現FⅧ。
為了將突變引入FⅧ中，根據套組製造商之建議，在FⅧ表現質粒上應用定點致突變(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit，Agilent科技，美國加州La Jolla)。
下表中列出用於引起FⅧ cDNA序列突變之寡核苷酸及引入之各別突變。
使用上文及WO 2004/067566中所描述之方案和質粒，應用熟習本技藝之人士已知之分子生物學技術(如上文Current Protocols in Molecular Biology中所描述者)，技術人員可製造任何其他用於在FⅧ之a3結構域中引起任何其他胺基酸殘基突變的構造體。
下表列出與第八因子a3、C1及C2結構域中之半胱胺酸互換的殘基。
實施例3：產生具有源自VWF之C端延伸體的FⅧ分子之表現載體
藉由熟習本技藝之人士已知之分子生物學方法產生其羧基端具有添加之VWF結構域或片段的FⅧ分子。將這些分子與VWF-FP共同轉染以產生含有經修改之FⅧ和VWF-FP的雜二聚體，該經修改之FⅧ和VWF-FP係經由在此兩種蛋白質之C端的CK結構域共價連接。
為此，藉由以下引物擴增FⅧ cDNA
將所產生之PCR片段已插入藉由NheI和NotI打開之合適的表現載體，例如pIRESpuro3(同上)中。分別使用下列引物對 和 藉由PCR將源自VWF C端結構域C3-C4-C5-C6-CK(VWF胺基酸2400至2813)、C5-C6-CK(VWF胺基酸2544至2813)或單獨之CK結構域(VWF胺基酸2724至2813)的編碼序列擴增，並透過所產生之Age1和NotI位點插入。此可產生含有FⅧ cDNA，且C端分別藉由VWF C端結構 域C3-C4-C5-C6-CK、C5-C6-CK或CK延伸之表現載體。
在Age1限制酶切位點中引入可在FⅧ活化期間從VWF-FP釋出FⅧ的可裂解連接子序列。該連接子序列係選自圍繞FⅧ之凝血酶裂解位點之一的序列，但亦可使用任何其他凝血酶裂解位點(例如WO 03/035861中所描述者)。例如：凝血酶裂解位點372和1689係由下列cDNA序列表示：CS372(SEQ ID NO：87)：5’ACCGGTGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGACCGGT3’ CS1689(SEQ ID NO：88)：5’ACCGGTGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGACCGGT3’
這些序列可藉由其末端含有Age1限制位點的合適PCR引物擴增。然後，藉由Age1將PCR片段裂解，再插入如上述之由Age1打開的表現載體中。
技術人員可使用類似的方法構建含有FⅧ cDNA分子之表現質粒，該FⅧ cDNA分子之B結構域或其一些部分已被VWF D'D3區替換，或者其中該VWF D'D3區係直接或經由連接子連接至FⅧ之N端或C端。
實施例4：轉染質粒以在CHO細胞中穩定表現VWF突變體
在XL10 Gold(Agilent科技公司)中生長以pIRESneo3為基礎之表現質粒並使用標準方案(Qiagen公司，德國Hilden)純化。
使用標準方法，例如核轉染或脂質轉染法來轉染CHO細胞，較佳為CHO-K1，並選出表現所需之VWF-FP突變體的單一選殖株。
為了適當地裂解VWF前肽，將編碼弗林蛋白酶(NM002569.2)之表現質粒與VWF質粒以1：4之莫耳比(弗林蛋白酶：VWF突變體)共同轉染。
實施例5：轉染表現VWF-FP突變體之CHO細胞及瞬時表現FⅧ突變體
依上述純化FⅧ突變體表現質粒。根據標準方法，將該FⅧ突變體表現質粒瞬時轉染入穩定之VWF-FP突變體CHO選殖株(實施例4)中。
藉由離心將細胞與上清液分開以收穫瞬時轉染物。產生上清液之等分試樣並決定該重組產物之特徵。
下表描述將FⅧ突變體表現質粒(第1列)瞬時轉染入穩定表現VWFFP突變株(第2列)之CHO細胞後所得到之代表性結果。選出其共價連接之FⅧ抗原對總FⅧ活性的比率(第7列)，或共價連接之FⅧ抗原對總FⅧ抗原的比率(第8列)等於或大於1.0者，數值1.0為吾人選擇最佳之突變體組合的標準。
共價連接之FⅧ抗原的量係藉由實施例6中描述之分析測定，FⅧ和VWF活性及抗原係藉由實施例9和10中描述之分析測定。
實施例6：藉由Elisa偵測共價連接至VWF突變體之FⅧ突變體
以Amicon Ultracell-30K(Millipore UFC903024；離心力3000g)將來自瞬時轉染之細胞培養上清液樣本(10毫升)濃縮。藉由標準ELISA測定培養上清液(濃縮液)中與VWF-FP共價連接之FⅧ。簡單地說，在微量盤之每一孔中加入100微升之捕捉抗體(兔子抗人VWF-IgG抗體，Dako A0082[Dako公司，德國漢堡]，在緩衝液A[Sigma C3041，Sigma-Aldrich公司，德國慕尼黑]中稀釋1：2000 並在周圍溫度下培育一整夜。以緩衝液B(Sigma T9039)清洗盤三次後，在每一孔中加入200微升之緩衝液C(Sigma T6789)並在周圍溫度下培育1.5小時(阻斷)。以緩衝液B進行3次清洗步驟後，將測試樣本在緩衝液B中之連續稀釋液及共價連接之FⅧ-VWF-FP的對照製劑之連續稀釋液(在緩衝液B中，2.0-0.03任意單位/毫升(我們稱這些為“任意單位”，因為他們與使用標準人血漿測定之標準FⅧ單位可能不相當)；每孔之體積：100微升)在室溫下培育1.5小時。以緩衝液B進行3次清洗步驟後，在每個孔中加入200微升之350mM氯化鈣，並在周圍溫度下培育1小時。去除氯化鈣(不清洗)，並在每個孔中加入額外之200微升，再進一步培育1小時。以緩衝液B進行3次清洗步驟後，在每個孔中添加100微升在緩衝液B中以1：2稀釋之偵測抗體(用於FⅧ：C，經過氧化物酶標記之偵測抗體，Cedarlane CL20035K-D)並在周圍溫度下培育1小時。以緩衝液B進行3次清洗步驟後，在每個孔中添加100微升之受質溶液(OUVF，西門子醫療診斷公司)並在黑暗中，周圍溫度下培育15分鐘。加入100微升之未稀釋的終止稀釋液(OSFA，西門子醫療診斷)，製備樣本以在合適之微量盤讀取儀中，在450nm波長處讀取數值。然後，使用以對照製劑製作之標準曲線計算測試樣本之濃度。
實施例7：藉由西方印跡法及考馬斯(Coomassie)染色偵測 與VWF突變體共價連接之FⅧ突變體
或者，藉由染色或西方印跡法偵測共價複合物。在還原或非還原條件下先以變性SDS-PAGE，接著以西方印跡法檢查樣本。為了偵測FⅧ，先使用內部之小鼠抗-FⅧ單株抗體混合物，再使用鹼性磷酸酶偶聯之二級抗小鼠抗體(Invitrogen)進行偵測，在偵測VWF方面，使用經HRP標記之多株兔子抗人VWF(fa.Dako P0226)抗體。
第8圖顯示藉由如上述之兩種原理，來自非還原SDS-PAGE之rVWF-FP二聚體與FⅧ(FⅧ-單鏈)的共價連接複合物之西方印跡分析。A係使用抗FⅧ抗體偵測，B係使用抗VWF抗體偵測。
泳道1代表其中FⅧ部分係藉由源自VWF之C3-C4-C5-C6-CK序列連接至VWF-FP二聚體的物質，該C3-C4-C5-C6-CK序列係加至FⅧ之C端，且FⅧ和C3-C4-C5-C6-CK序列之間有一個額外之凝血酶裂解位點。藉由實施例8中所描述之特異性Elisa法測得共價FⅧ對總FⅧ活性之比率為5.78，FⅧ對總FⅧ抗原之比率為7.47。藉由抗FⅧ及抗VWF抗體兩者將大於460kDa之高分子量條帶可視化並證明共價連接之FⅧ-VWF-FP複合物的存在。M表示分子量標記。泳道2及3分別代表FⅧ-SC和VWF-FP之對照製劑。
泳道4及5代表透過FⅧ a3和VWF-FP D3結構域之間的二硫鍵，藉由各別之半胱胺酸突變連接之共價複合物。泳道4代表VWF-FP E1078C突變種上之FⅧ-SC I1679C突變種。泳道5代表VWF-FP E1078C突變種上之FⅧ-SC I1675C突變種。泳道6為僅含有VWF-FP突變種E1078C之對照製劑。該印跡證明除了游離FⅧ分子外，存有彼此共價連接之高分子量FⅧ-VWF-FP複合物。
第9圖顯示以Gelcode藍染色試劑染色之還原的SDS-PAGE。泳道1含有與rVWF-FP二聚體共價連接之純化的FⅧ(FⅧ-單鏈)，泳道2顯示以凝血酶分解後，釋出該連接子序列中之共價連接的FⅧ部分，並同時活化FⅧ的同一製劑。泳道1中之條帶代表共價複合物及FⅧ二聚體，泳道2中之介於268和460kDa標記之間的突出條帶代表VWF-FP部分，而在71KDa範圍下之條帶代表FⅧ片段。
實施例8：FⅧ與VWF之化學交聯
在恆定溫度(較佳為介於4℃與37℃之間)下，在含有較佳為生理氯化鈉及氯化鈣濃度的緩衝水溶液中將FⅧ與分子量介於500Da與100kDa之間的雙特異性雙琥珀醯亞胺酯(PEG)n反應，其中FⅧ和交聯劑之莫耳比為2：1至1：1000(較佳為約1：1)。較佳地，該FⅧ之濃度低，以將FⅧ與FⅧ本身之交聯減至最少。經過1分鐘至60分鐘的一段時間後，將2：1至200：1(以VWF之單體構造單位為基礎)之莫耳過量的半衰期延長VWF加入FⅧ溶液中。在上述指定之溫度下培育1至300分鐘的期間後，使用(較佳地)含有一級胺基團之低分子量化合物將殘 餘試劑淬火，並藉由本領域之專家已知的方法純化FⅧ與VWF之共價複合物，除去未反應之FⅧ或FⅧ的寡聚物，及未反應之VWF。藉由本領域之專家已知的方法將用於不同培育步驟之反應時間和溫度優化，例如使用抗FⅧ或抗VWF抗體，藉由SDS-PAGE/西方印跡分析進行，目標為將所需之共價複合物的含量最大化，並將副產物之含量最少化。
經修改之FⅧ與VWF分子的化學交聯可使用不同的試劑進行。這是根據FⅧ和VWF之不同反應基團的交聯來進行：
a)胺對胺交聯劑(例如雙-亞胺基酯(PEG)n或雙琥珀醯亞胺酯(PEG)n)
b)羧基對羧基交聯劑
c)氫硫基對氫硫基交聯劑(如雙馬來醯亞胺(PEG)n)
d)碳水化合物對碳水化合物交聯劑
e)胺對氫硫基交聯劑
f)氫硫基對碳水化合物交聯劑
g)氫硫基對羥基交聯劑
h)羧基對胺交聯劑
實施例9：分析第八因子活性及抗原
為了在體外測定FⅧ：C之活性，使用凝血分析(例如由德國Dade Behring交付之Pathromtin SL試劑和FⅧ缺乏血漿)或產色分析(例如由Haemochrom交付之Coamatic FⅧ：C分析)。根據製造商之說明進行分析。
藉由標準ELISA測定FⅧ抗原(FⅧ：Ag)。簡單地說，在微量盤之每一孔中加入100微升捕捉抗體(羊抗-人FⅧ IgG，Cedarlane CL20035K-C，在緩衝液A中稀釋1：200[Sigma C3041])，在周圍溫度下培育2小時。以緩衝液B(Sigma P3563)清洗盤三次後，將在樣本稀釋緩衝液(Cedarlane公司)中之測試樣本的連續稀釋液及在樣本稀釋緩衝液中之FⅧ製劑(CSL Behring；200-2mU/毫升)的連續稀釋液(每孔體積：100微升)在周圍溫度下培育2小時。以緩衝液B行三次清洗盤之步驟後，將100微升在緩衝液B中之偵測抗體(羊抗-人FⅧ IgG，Cedarlane CL20035K-D，經過氧化物酶標記)的1：2稀釋液加入各個孔中並在周圍溫度下再培育1小時。以緩衝液B進行三次清洗盤之步驟後，每一孔中加入100微升之受質溶液(1：10(體積/體積)之TMB OUVF：TMB緩衝液OUVG，Dade Behring)，並在黑暗中，周圍溫度下培育30分鐘。加入100微升之終止溶液(Dade Behring，OSFA)以製備用於在合適之微量盤讀數儀中，在450nm波長處讀數的樣本。然後，使用以FⅧ製劑作為參考之標準曲線計算測試樣本之濃度。
實施例10：分析VWF活性及抗原
依製造商之描述，藉由免疫比濁法測定VWF：Ag(OPABO3，Siemens Healthcare Diagnostics公司，德國 Marburg)及膠原蛋白結合(Technozym VWF：CBA ELISA，參考編號5450301，使用校準組5450310及對照組5450312，Technoclone公司，奧地利維也納)來分析樣本。根據製造商之說明，使用德國Marburg Siemens Healthcare Diagnostics公司之BC VWF試劑進行VWF：RCo測試。使用國際濃度標準作為一級標準製劑以校準供日常使用之內部標準製劑。
在藥物動力學分析方面，藉由標準ELISA來測定VWF抗原。簡單地說，在微量盤之每一孔中加入100微升捕捉抗體(兔子抗-人VWF-IgG，Dako A0082[Dako公司，德國漢堡]，在緩衝液A[Sigma C3041，Sigma-Aldrich公司，德國慕尼黑]中稀釋1：2000)，在周圍溫度下培育一整夜。以緩衝液B(Sigma P3563)清洗盤三次後，在每一孔中加入200微升緩衝液C(Sigma P3688)，將盤在周圍溫度下培育1.5小時(阻斷)。以緩衝液B再進行三次清洗步驟後，將在緩衝液B中之測試樣本的連續稀釋液及在緩衝液B中之標準人血漿(ORKL21；20-0.2mU/毫升；德國Marburg Siemens Healthcare Diagnostics公司)的連續稀釋液(每孔體積：100微升)在周圍溫度下培育1.5小時。以緩衝液B再進行三次清洗步驟後，在每一孔中加入100微升在緩衝液B中稀釋1：16000的偵測抗體(兔子抗人vWF-IgG抗體，Dako P0226，經過氧化物酶標記)，並在周圍溫度下培育1小時。以緩衝液B進行三次清洗步驟後，在每一孔中加入 100微升之受質溶液(OUVF，Siemens Healthcare Diagnostics公司)並在黑暗中，周圍溫度下培育30分鐘。加入100微升之未稀釋的終止溶液(OSFA，Siemens Healthcare Diagnostics公司)以製備用於在合適之微量盤讀數儀中，在450nm波長處讀數的樣本。然後，使用以標準人血漿作為參考之標準曲線計算測試樣本之濃度。
實施例11：VWF多聚體分析
依最近之描述(Tatewaki等人，Thromb.Res.52：23-32(1988)，及Metzner等人，Haemophilia 4(增刊3)：25-32(1998))，但做一些小修改，藉由SDS瓊脂糖凝膠電泳法分析VWF多聚體。簡單地說，在運行緩衝液中平衡後，使用現成之1%瓊脂糖迷你凝膠(BioRad公司)以盡可能將方法標準化。將相當數量之VWF抗原在SDS-瓊脂糖凝膠上進行電泳。進行西方印跡分析後，先使用抗VWF、抗FⅧ或抗白蛋白抗體，再使用鹼性磷酸酶標記之抗IgG抗體(SIGMA，產品編號1305)偵測蛋白質條帶，並藉由光密度分析法定量顯色反應。
藉由多聚體凝膠分析來分析兩種共價FⅧ-SC/VWF-FP多聚體複合物之製劑。第10圖中之泳道2和3代表其中該FⅧ部分藉由源自VWF之C3-C4-C5-C6-CK序列連接到VWF-FP多聚體的物質，該C3-C4-C5-C6-CK序列係加至FⅧ之C端，且FⅧ和C3-C4-C5-C6-CK序列之間具有一個額外之凝血酶裂解位點(實施例3)。泳道1代表源自血 漿之VWF，泳道4代表VWF-FP。結果證明共價FⅧ/VWF-FP複合物以類似於VWF-FP或天然VWF之程度多聚體化。額外之條帶代表添加一或多種共價FⅧ分子。由抗VWF抗體(A)偵測到之大部分多聚體條帶亦可被抗FⅧ(B)染色，證明其為共價FⅧ/VWF-FP多聚體。
實施例12：純化共價連接之FⅧ/VWF-FP複合物
將含有共價連接之FⅧ/VWF-FP二聚體複合物的細胞培養上清液通過0.2微米過濾器進行無菌過濾並以30kDa UF單位(CentramateTM，Pall)濃縮高達20倍。將含有共價連接之FⅧ/VWF-FP多聚體複合物的細胞培養上清液通過0.2微米過濾器進行無菌過濾並以CadenceTM單次使用內聯濃縮器(Single-Use Inline Concentrator)(30kDa截斷，Pall)濃縮。然後，將此物質施放在以平衡緩衝液(EB，20mM Tris pH 7.0)平衡過之人白蛋白捕捉選擇柱(Human Albumin Capture Select Column)(BAC)上。以EB清洗該柱並以在EB中之2M氯化鎂洗提FⅧ/VWF-FP複合物。將該洗提峰匯集並對含有50mM HEPES、400mM氯化鈣、50mM氯化鈉，pH 7之SEC HiPrep Sephacryl S-500 High Resolution(GE Healthcare公司)的運行緩衝液進行透析(依McCue等人，2009；J.Chrom.A,1216(45)：7824-30中之描述，做一些小修改)。將此物質施放在預先平衡之SEC HiPrep Sephacryl S-500 High Resolution(GE Healthcare公司)上，並藉由尺寸分離法分 離，只匯集含有共價連接之FⅧ/VWF-FP的餾分並進行SEC HiPrep Sephacryl S-500 High Resolution(GE Healthcare公司)。將此匯集物對1.7mM氯化鈣、10mM L-His、308mM氯化鈉、8.76mM蔗糖、0.01%吐溫80，pH值7進行透析。最後，將該物質分成等份樣本冷凍。
或者，在某些構造體方面，Ⅷ Select柱(GE Healthcare公司)可提供較人白蛋白捕捉選擇柱為佳之純化效果。在此種情況下，將該細胞培養上清液之濃縮物施放在預先平衡之Ⅷ選擇柱(GE Healthcare公司)上，以平衡緩衝液(10mM HEPES、5mM氯化鈣、150mM氯化鈉、0.03%吐溫80，pH7)清洗後，使用具有高鹽濃度(1M氯化鈉)之平衡緩衝液，再使用平衡緩衝液清洗。以20mM L-His、5mM氯化鈣、150mM氯化鈉、60%乙二醇、0.03%吐溫80，pH 7洗提FⅧ/VWF-FP複合物。匯集該洗提峰，隨後對含有50mM HEPES、400mM氯化鈣、50mM氯化鈉，pH 7之SEC柱的運行緩衝液進行透析。然後，將此物質施放在預先平衡之SEC HiPrep Sephacryl S-500 High Resolution(GE Healthcare公司)柱上。匯集含有共價連接之FⅧ/VWF-FP餾分。將該匯集液對1.7mM氯化鈣、10mM L-His、308mM氯化鈉、8.76mM蔗糖、0.01%吐溫80，pH 7進行透析。最後將該物質分成等份樣本冷凍。
實施例13：在FⅧ經删除之小鼠及大鼠中進行共價連接之 FⅧ/VWF複合物的藥代動力學分析。
將FⅧ/VWF複合物以100IU(FⅧ：Ag)/公斤體重之劑量經靜脈內途徑投予FⅧ經删除之小鼠(每一物質12隻小鼠)。採用交替採樣策略，在適當間隔下抽取血液樣本，產生來自3隻動物之樣本/時間點(在1號子集方面，t=0分鐘及16小時，2號子集方面，t=5分鐘及24小時，3號子集方面，t=2小時及4小時，4號子集方面，t=8小時及32小時)。此策略之設計係為了將採血對欲定量之血漿濃度可能產生的影響減至最少。處理血液以取得血漿並將其儲存在低溫冷凍下，直到進行分析。接著，藉由特異性Elisa分析來定量FⅧ及VWF抗原之含量(見實施例7、9及10)。5分鐘後，採用治療組之平均值來計算體內回收。根據式t1/2=In2/k，採用排除β相的時間點計算半衰期，其中k為回歸線之斜率。在藥代動力學研究中通常採用抗原作為一種測量值。預期抗原與功能活性將相關聯。
將FⅧ/VWF複合物以100IU(FⅧ：Ag)/公斤體重之劑量經靜脈內途徑投予被麻醉之CD/Lewis大鼠(每一物質6隻大鼠)。在施用測試物質5分鐘後開始，採用交替採樣策略，在適當間隔下抽取血液樣本，產生來自3隻動物之樣本/時間點(在1號子集方面，t=0、5、30、90分鐘、4小時、1天，2號子集方面，t=0及15分鐘、1、2、8小時及2天)。此策略之設計係為了將採血對欲定量之血漿濃度可能產生的影響減至最少。處理血液以取得血 漿並將其儲存在低溫冷凍下，直到進行分析。接著，藉由特異性Elisa分析來定量FⅧ及VWF抗原之含量(見上文)。5分鐘後，採用治療組之平均值來計算體內回收。根據式t1/2=In2/k，採用排除β相的時間點計算半衰期，而k為回歸線之斜率。在正常動物之藥代動力學研究中通常採用抗原作為一種測量值，以將動物之內因性FⅧ活性的背景從測量排除。預期抗原與功能活性將相關聯。
在大鼠PK模型中測試由單鏈FⅧ序列及與白蛋白融合之VWF所組成之共價FⅧ/VWF-FP製劑的半衰期，該單鏈FⅧ序列具有經由可裂解之連接子連接至其羧基端的VWF C3至C6及CK結構域(如實施例3中之描述)。第11圖顯示出共價複合物(圓圈，在圖形圖標中之命名為FⅧ-CK+VWF-FP)與重組FⅧ(Advate，A中之正方形)、VWF-FP(B中之正方形)及源自血漿之FⅧ-VWF複合物(Haemate，三角形)相比較之排除動力學。A顯示出FⅧ數據(該共價複合物係依實施例6中之描述藉由特異性Elisa測量；所有其他化合物係藉由FⅧ Elisa測定)，B顯示出VWF之Elisa數據。當測量FⅧ及VWF抗原時(當預期這兩個部分共價連接時)，該共價結構物之排除動力學相似。計算出之FⅧ抗原的終末半衰期為7.9小時，VWF之終末半衰期為7.8小時。令人驚訝地，計算出之VWF-FP對照組(VWF抗原)的終末半衰期非常相似，為8.1小時。共價複合物之清除率為9.8IU/毫升/小時，亦與VWF-FP之清除率10.1IU/毫升/小時相似。計算出rFⅧ(Advate) 之半衰期為2.5小時，這將導致共價複合物之半衰期延長超過游離FⅧ的半衰期約3倍。
這些結果指出FⅧ序列與半衰期延長之VWF分子共價連接確實可顯著延長FⅧ分子之半衰期，其程度類似於該未融合之半衰期延長的VWF分子之半衰期。
<110> CSL貝林公司(CSL Behring GmbH)
<120> 複合物
<140> TW 103114526
<141> 2014-04-22
<150> EP2013164728
<151> 2013-04-22
<160> 177
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 36
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 37
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 38
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 39
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Oligonucleotide for Mutaagenesis
<400> 40
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 41
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 42
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 43
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 44
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 45
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 46
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 47
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 48
<210> 49
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 50
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 52
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 53
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 54
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 55
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 56
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 57
<210> 58
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 58
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 59
<210> 60
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 60
<210> 61
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 61
<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 63
<210> 64
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 64
<210> 65
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 67
<210> 68
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 68
<210> 69
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 69
<210> 70
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 70
<210> 71
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 71
<210> 72
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 72
<210> 73
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 73
<210> 74
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Oligonucleotide for Mutaagenesis
<400> 74
<210> 75
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 75
<210> 76
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 76
<210> 77
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 77
<210> 78
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 78
<210> 79
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 79
<210> 80
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 80
<210> 81
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 82
<210> 83
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 83
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 84
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 85
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 86
<210> 87
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cDNA序列(凝血酶裂解位點)
<400> 87
<210> 88
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cDNA序列(凝血酶裂解位點)
<400> 88
<210> 89
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 90
<210> 91
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 91
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 92
<210> 93
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 93
<210> 94
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 94
<210> 95
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 95
<210> 96
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 96
<210> 97
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 97
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 98
<210> 99
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 99
<210> 100
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 100
<210> 101
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 101
<210> 102
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 102
<210> 103
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 103
<210> 104
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 104
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 105
<210> 106
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 106
<210> 107
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 107
<210> 108
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 108
<210> 109
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 109
<210> 110
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 110
<210> 111
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 111
<210> 112
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 112
<210> 113
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 113
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 114
<210> 115
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 115
<210> 116
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 116
<210> 117
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 117
<210> 118
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 118
<210> 119
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 119
<210> 120
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 120
<210> 121
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 121
<210> 122
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 122
<210> 123
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 123
<210> 124
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 124
<210> 125
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 125
<210> 126
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 126
<210> 127
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 127
<210> 128
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 128
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 129
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 130
<210> 131
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 131
<210> 132
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 132
<210> 133
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 133
<210> 134
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 134
<210> 135
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 135
<210> 136
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 136
<210> 137
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 137
<210> 138
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 138
<210> 139
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 139
<210> 140
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 140
<210> 141
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 141
<210> 142
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引起突變之寡核苷酸
<400> 142
<210> 143
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 143
<210> 144
<211> 5645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
<221> misc_特性
<222> (1)..(4389)
<400> 144
<210> 145
<211> 5213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(5211)
<400> 145
<210> 146
<211> 1735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構造體
<400> 146
<210> 147
<211> 4672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(4671)
<400> 147
<210> 148
<211> 1555
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構造體
<400> 148
<210> 149
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構造體
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 融合蛋白
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<213> 人工序列
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<223> 合成之構造體
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<223> 合成之構造體
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<223> 合成之構造體
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<223> 合成之構造體
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成之構造體
<400> 177

Claims (38)

  1. 一種經共價連接之複合物，其包含血管性血友病因子(von Willebrand Factor)(VWF)或其變體及第八因子(Factor Ⅷ)或其變體，該複合物包含延長半衰期之部分，惟該複合物並非具有一個連接VWF之Fc單體及另一連接第八因子之Fc單體的雜二聚體Fc融合蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項之經共價連接之複合物，其中該共價連接並非由該延長半衰期之部分提供。
  3. 如申請專利範圍第1項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經過修改，從而與VWF形成二硫橋。
  4. 如申請專利範圍第3項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經由以半胱胺酸殘基取代天然存在之胺基酸或經由插入半胱胺酸殘基以與VWF中之半胱胺酸殘基形成二硫橋來修改。
  5. 如申請專利範圍第4項之經共價連接之複合物，其中第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係選自第八因子a3結構域中之胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第5項之經共價連接之複合物，其中第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係位在第八因子a3結構域之胺基酸1653至1660內、或在胺基酸1667至1674內、或在胺基酸1675至1688內，或將半胱胺酸引入第八因子a3結構域之胺基酸1653至1660、或胺基酸1667至1674、或胺基酸1675至1688之序列內。
  7. 如申請專利範圍第3項之經共價連接之複合物， 其中第八因子中被取代之天然存在的胺基酸係在C端結構域內。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF係經由以半胱胺酸殘基取代天然存在之胺基酸或經由插入半胱胺酸殘基以與被引入第八因子中之半胱胺酸殘基形成二硫橋來修改。
  9. 如申請專利範圍第8項之經共價連接之複合物，其中VWF中之天然存在之胺基酸為在D'或D3結構域中之胺基酸，或其中將半胱胺酸殘基插入該D'或D3結構域中。
  10. 如申請專利範圍第9項之經共價連接之複合物，其中係將半胱胺酸殘基插入TIL'結構域、E'結構域、D3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域或E-3結構域中，或VWF中被半胱胺酸殘基取代之天然存在的胺基酸為在TIL'結構域、E'結構域、D3結構域、C8-3結構域、TIL-3結構域或E-3結構域中之殘基。
  11. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF包含第八因子結合結構域或係由第八因子結合結構域所組成。
  12. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經過修改以包含VWF之一或多個結構域。
  13. 如申請專利範圍第12項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經過修改以包含VWF之C端結構域 CK。
  14. 如申請專利範圍第13項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經過修改以亦包含VWF結構域C6、或C5及C6、C3至C6、或結構域C1至C6中之任一者或多者、或彼等之變體。
  15. 如申請專利範圍第13項之經共價連接之複合物，其中第八因子包含SEQ ID NO：2之殘基2724至2812或其變體，惟半胱胺酸殘基2773(或其等同體)被保留。
  16. 如申請專利範圍第13項之經共價連接之複合物，其中VWF C端結構域係藉由可裂解之連接子連接第八因子。
  17. 如申請專利範圍第16項之經共價連接之複合物，其中該可裂解之連接子包含第八因子之凝血酶裂解位點之一。
  18. 如申請專利範圍第16項之經共價連接之複合物，其中該連接子序列包含額外之胺基酸殘基，該額外之胺基酸殘基提供足夠長之肽以允許第八因子和VWF分別經由a3及D'D3結構域之分子內交互作用。
  19. 如申請專利範圍第12項之經共價連接之複合物，其中第八因子係在其C端或N端或第八因子的B結構域內被修改，或部分或完全取代第八因子之B結構域。
  20. 如申請專利範圍第12項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經過修改以包含VWF之D'D3結構域 或其片段。
  21. 如申請專利範圍第20項之經共價連接之複合物，其中第八因子係經由以VWF D'D3結構域或其片段或變體部分或完全取代彼之B結構域來修改。
  22. 如申請專利範圍第21項之經共價連接之複合物，其中第八因子所包含之SEQ ID NO：2的殘基746至1241或其變體或片段係在彼之B結構域內、或替代彼之B結構域內、或替代彼之B結構域的一部分。
  23. 如申請專利範圍第19項之經共價連接之複合物，其中第八因子係以雙鏈分子之形式表現，該雙鏈分子含有VWF D'D3結構域且該VWF D'D3結構域代表第八因子輕鏈之胺基端。
  24. 如申請專利範圍第19項之經共價連接之複合物，其中在VWF之D'D3區與第八因子輕鏈結構域之間引入額外之連接子序列。
  25. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中第八因子為經遺傳工程處理之第八因子。
  26. 如申請專利範圍第25項之經共價連接之複合物，其中B結構域全部或部分經刪除之該經遺傳工程處理之第八因子為經突變之第八因子，或為具有半衰期延長部分之融合多肽。
  27. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF為VWF之半衰期延長型。
  28. 如申請專利範圍第26項之經共價連接之複合物，其中該VWF之半衰期延長型為VWF與半衰期延長部分之經遺傳工程處理之融合蛋白。
  29. 如申請專利範圍第1項之經共價連接之複合物，其中該半衰期延長部分係選自白蛋白或其變體或片段、免疫球蛋白恆定區及其部分和變體，例如彼之Fc片段或變體、具有大流體動力學體積之溶劑化無規鏈(例如XTEN或PAS)、艾芙米(afamin)或其變體、α-胎蛋白或其變體、維生素D結合蛋白或其變體、轉鐵蛋白或其變體、人絨毛膜促性腺素-β次單位之羧基端肽(CTP)、在生理條件下能與白蛋白或免疫球蛋白恆定區結合之多肽或脂質。
  30. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF之血漿半衰期係藉由化學改質延長，該化學改質係例如連接聚乙二醇(PEG化)、糖基化之聚乙二醇、羥乙基澱粉(HES化)、聚唾液酸、肝素前體(heparosan)聚合物、彈性蛋白樣多肽或透明質酸。
  31. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF係以單體形式表現，或其中VWF係以二聚體形式表現。
  32. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中VWF形成多聚體。
  33. 如申請專利範圍第1項之經共價連接之複合物，其中該共價連接係經由使用一或多種經化學合成之交聯劑取得。
  34. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其中第八因子與VWF係經由超過一個共價二硫鍵或肽或蛋白質連接子連接。
  35. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之經共價連接之複合物，其係用於治療或預防出血性疾病。
  36. 如申請專利範圍第35項之經共價連接之複合物，其中該出血性疾病為A型血友病A(hemophilia A)或血管性血友病。
  37. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至34項中任一項之經共價連接之複合物。
  38. 一種製造如申請專利範圍第1至34項中任一項之經共價連接之複合物的方法，其包含在真核細胞株中共同表現第八因子及VWF。
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