TW201441369A - 多向分化壓力耐受（ｍｕｓｅ）細胞分離及擴增 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種新穎的分離及擴增多功能幹細胞的方法，包括多向分化壓力耐受(multi-lineage stress enduring，MUSE)細胞。

Description

多向分化壓力耐受(MUSE)細胞分離及擴增 【交互參照】

本申請案主張於2012年12月21日所申請之美國臨時申請案第61/740,835號之優先權。該臨時申請案的內容係以全文參考方式併入本文。

本發明涉及一種新穎的分離及擴增多功能幹細胞的方法，例如，多向分化壓力耐受(multi-lineage stress enduring，MUSE)細胞。

多向分化壓力耐受(MUSE)細胞為多功能、非致癌性的幹細胞，其原來係於成人的間葉細胞群中被鑑定出來(Kuroda等人，2010年，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America第107卷：第8639-43頁)。這些細胞係具有壓力耐受性與自我更新能力，且能於懸浮細胞培養中形成特徵細胞叢。其表現一組與分化多能性有關的基因，且可自纖維母細胞、骨髓，或脂肪組織中被分離。其對應於經培養的間葉幹細胞之1至數個百分比以及骨髓單核細胞之約0.03%。MUSE細胞係為具吸引力的用於再生醫學的自體細胞的來源，因為其不需遺傳操作，且具有低致癌性(Wakao等人，2011年，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America第108卷：第9875-80 頁)。然而，MUSE細胞在組織與培養細胞中數量不多，且來自骨髓、纖維母細胞，或脂肪組織的組織與培養細胞的數量與生長都很有限。因此，需要有高產量產生多向分化壓力耐受(MUSE)細胞的方法。

本發明涉及一種富集多功能幹細胞的方法，例如，多向分化壓力耐受(MUSE)細胞，以及相關細胞區份。於一方面，本發明提供一種富集多功能幹細胞的方法，例如，MUSE細胞。該方法包含(i)提供動物的複數個起始間葉細胞；(ii)將該複數個起始間葉細胞塗覆於基質上；(iii)將該塗覆於該基質的複數個起始間葉細胞於第一培養基中培養第一段時間；以及(iv)獲得附著於該基質的細胞，以產生附著的間葉細胞群。大約有1%或更多(如3、4、5、6或7%)的該附著間葉細胞群為MUSE細胞。

在該方法中，該動物可為哺乳類動物，例如人類。該起始細胞可自該動物的活體組織(例如中胚層組織、間葉組織，或一活體的類似組織)中獲得，包括但不限於臍帶血、骨髓、羊水、脂肪組織、胎盤，以及周邊血。於一具體實施例中，該組織為臍帶血。較佳地，該起始細胞為單核細胞。該起始間葉細胞可藉由一包含滲透壓梯度離心的方法而自該動物中獲得。

在上述方法中，該基質可包含明膠、膠原蛋白與聚-L-離胺酸，以使細胞貼附於其上。未貼附的細胞可在該起始間葉細胞被塗覆於該基質上之後12-36小時內(如18-30小時或24小時)被移除。該第一培養基可含有血清。該第一段時間可為約3-10天(如3-5天或4天)。為了獲得附著於該基質的細胞，上述方法可包含使該附著於該基質的細胞自該基質脫離(如 經由非胰蛋白酶方式)，以獲得複數個懸浮細胞。

為了進一步純化或富集多向分化壓力耐受(MUSE)細胞，於第二培養基(如生長培養基)中，該懸浮細胞可暴露於或與胰蛋白酶接觸達第二段時間(例如約4-12小時，如6-10小時或8小時)，以獲得複數個暴露於胰蛋白酶的細胞。該複數個暴露於胰蛋白酶的細胞可被進一步培養於懸浮液中達第三段時間，例如，約3-10天(如4-6天或5天)。在該培養於懸浮液中的步驟之後，該暴露於胰蛋白酶的細胞可被培養於附著培養物中達第四段時間，例如，約3-10天(如4-6天或5天)，以獲得擴增細胞群。大約有30%或更多(如35、40、50、60或66%)的該擴增的細胞群為MUSE細胞。為了進一步增加產量(MUSE細胞的數目或百分比)，該以胰蛋白酶處理-懸浮液培養-附著培養步驟可以被重複一或多次。

本發明亦提供一種根據上述方法生產的本質上純的MUSE細胞部分/族群或富集的MUSE細胞部分/族群。本發明進一步提供細胞區分或具有多功能幹細胞，如MUSE細胞，的富集的細胞部分，其可根據上述方法而被生產。亦被提供的是實質如本文所示與描述的生產或富集MUSE細胞的方法，以及實質如本文所示與描述的生產或富集MUSE細胞群的方法。

本發明的一或多個具體實施例的細節於以下描述中被提出。本發明的其他特徵、目的，以及優點將自該描述與自該申請專利範圍中變得明顯。

圖1為顯示直接自解凍的臍帶血(umbilical cord blood，UCB)單核細胞分離、純化，以及擴增MUSE細胞之例示性程序的圖式。

本發明是基於，至少部份基於，未預期的發現MUSE細胞，其係在許多組織中佔小部分，可以直接自某些組織(如臍帶血)中分離出高出許多的產率，以及MUSE細胞可以在體外被擴增，使得大量的MUSE細胞可以有效地被生產而不需遺傳操作或由外源基因或蛋白來誘導。

MUSE細胞

MUSE細胞為分化多能、非致癌性的幹細胞。這些細胞起初於成人的間葉細胞群中被發現，且於2010年被來自在日本仙台的東北帝國大學的Mari Dezawa實驗室的Kuroda等人報告。見Kuroda等人，2010年，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America第107卷：第8639-43頁，其係以全文參考之方式被併入本文。這些細胞為壓力耐受、自我更新、於懸浮細胞培養中形成特徵細胞叢、表現一組與分化多能性有關的基因，以及可自纖維母細胞、骨髓，或脂肪組織中被分離。被稱為MUSE(多向分化壓力耐受)細胞，這些細胞表現兩種明確的標記：CD105與SSEA-3。前者為間葉細胞標記，且後者為由人類胚胎幹細胞所表現的分化多能性標記。該細胞可自單一細胞形成具有三個胚層的細胞、具有有限生長潛能直到海佛烈克極限(Hayflick limit)，以及當被移植到免疫缺失動物時不會形成畸胎瘤。

Dezawa研究團隊於2011年指出MUSE細胞很可能是誘導性多功能細胞(induced pluripotent cells，iPS)的來源，當Yamanaka基因(Oct3/4、Sox2、Klf4與c-Myc)被轉染至小鼠或人類纖維母細胞時，iPS可以被產生。見Wakao等人，2011年，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America第108卷：第9875-80頁，其係以全文參考之方式被併入本文。更特定而言，已發現若CD105⁺/SSEA3⁺細胞自纖維母細胞中被移除，該Yamanaka基因不會產生任何iPS細胞，也不會在接受Yamanaka基因後提升分化多能性基因。相較之下，自帶有該Yamanaka基因的纖維母細胞中轉染CD105⁺/SSEA3⁺細胞則導致許多形成畸胎瘤的iPS細胞。相較於iPS，MUSE細胞是更具吸引力的用於再生醫學的自體細胞的來源，因為MUSE細胞不需遺傳操作，且具有低或無致癌性。

如本文所用，MUSE細胞乙詞係指上述Kuroda等人2010年發表的文獻與Wakao等人2011年發表的文獻，以及美國專利申請公開號第20120244129號與第20110070647號所描述的多功能幹細胞，其係以全文參考之方式被併入本文。更特定而言，MUSE細胞係指一種特定類型的動物(如人類)間葉多功能幹細胞，其可自單一細胞產生帶有三個胚層的特徵的細胞。MUSE細胞係為壓力耐受的；與在附著培養(類似纖維母細胞)中的一般間葉細胞在形態上並無差異；能在分化多能性標記與鹼性磷酸酶染色呈陽性的懸浮培養中形成M團簇；能自我更新；其增殖活性不高且在免疫缺乏小鼠試驗中顯示不會形成畸胎瘤；在體內與在體外皆能分化為內胚層、外胚層與中胚層細胞；且對CD105與SSEA-3皆呈現陽性。

MUSE細胞可能也表現分化多能性標記，如Nanog、Oct3/4以及Sox2，且以流式細胞儀分析或RT-PCR分析顯示對NG2(血管周圍細胞的一種標記)、CD34(內皮原生細胞與脂肪幹細胞的一種標記)、von Willebrand因子(內皮原生細胞的一種標記)、CD31(內皮原生細胞的一種標記)、CD117(c-kit，黑色素母細胞的一種標記)、CD146(血管周圍細 胞與脂肪幹細胞的一種標記)、CD271(神經脊幹細胞的一種標記)、Sox10(神經脊幹細胞的一種標記)、Snai1(皮膚源性前體的一種標記)、Slug(皮膚源性前體的一種標記)、Tyrp1(黑色素母細胞的一種標記)，以及Dct(黑色素母細胞的一種標記)呈現陰性。

如本文所用，詞彙「對」標記或抗原「呈現陰性」係指當進行如下所述的FACS(螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting))分析時，細胞不被分類為陽性細胞，或是當以RT-PCR檢測表現時，其沒有表現被確認的情形。亦即，既使這樣的標記或抗原表現至無法被這樣的技術所偵測的程度，在本發明中細胞被指定為陰性。或者，詞彙「對」標記或抗原「呈現陰性」係指該標記或抗原的測定係與已知對該標記或抗原呈現陽性的陽性對照細胞或是已知對該標記或抗原呈現陰性的陰性對照細胞一起進行的情形。當幾乎沒有表現被偵測到時，或是該表現的程度顯著地相較低於這樣的陽性對照細胞，或是該表現的程度在統計上無異於這樣的陰性對照細胞，細胞可能被指定為陰性。

來自骨髓、纖維母細胞或脂肪組織的MUSE細胞的數目與生長能力有限。該細胞在骨髓抽出物中並不多且約只有1：3,000的骨髓單核細胞為MUSE細胞。在培養的間葉細胞中，MUSE細胞僅占纖維母細胞與骨髓基質細胞的數個百分比。一旦在懸浮液中分離與培養，MUSE細胞一般只生長數週，然後停止增殖，但在轉移到附著培養物後，其開始增殖。據此，僅自骨髓單核細胞分離CD105⁺SSEA3⁺細胞並且隨後常規培養這樣的分離的細胞可能無法在實際應用上提供足夠的MUSE細胞。

既便MUSE細胞在懸浮培養中的增殖有限，但其在附著培養 物中可持續生長至其海佛烈克極限。此一極限在人類胎兒細胞培養中為40-60個分裂。在較老的成人細胞培養中，則取決於該細胞的年齡，其海佛烈克極限應該較少。臍帶血細胞，係為細胞最年輕的產後來源，應該俱有較多的增殖能力。相似於其他的成體幹細胞與造血幹細胞，MUSE細胞藉由對稱細胞分裂而產生自身，但同時藉由不對稱細胞分裂隨機地產生非MUSE細胞。因此，初步純化的MUSE細胞培養在培養物中其濃度顯現出S形下降，到達數個百分比的平線區後，接著維持此一較低濃度。然而，如本文所述，本發明之方法可以在體外增加MUSE細胞的濃度。

臍帶血

臍帶血含有高比例的幹細胞與原生細胞。這些包含CD34⁺內皮前體細胞、CD133⁺多功能幹細胞，以及其他原生細胞。在本案發明人的經驗中，至多0.3%的以密度離心分離自冷凍的臍帶血單元的單核細胞為CD34⁺或CD133⁺。後者細胞為分化多能的。當CD34⁺細胞可以在培養物中生長，該生長必須以細胞激素刺激，包括Steel因子(Steel factor，SF)與介白素-6。Seligman等人(Stem Cells and Development 2009年，第18卷：第1263-71頁)描述了一種自血液中分離分化多能或多潛能幹細胞的方法。某些研究者描述了培養來自臍帶血間葉細胞的類神經元細胞的程序。這些細胞大多為CD133⁺細胞。其他描述了培養來自臍帶血的神經原生細胞、神經元與寡樹突神經膠質細胞，以及心肌細胞與造血幹細胞的方法。

在本申請案的有效申請日期前，無人報告在臍帶血中發現CD105⁺/SSEA3⁺細胞。如本文所揭露，進行分析以在分離自解凍的人類臍帶血單元的單核細胞中尋找這樣的細胞。使用美天旎(Miltenyi)流式細胞儀， 不可預期地發現平均0.8%的單核細胞為CD105與SSEA3皆呈陽性(CD105⁺與SSEA3⁺)。此一濃度比在骨髓、纖維母細胞或脂肪組織中的該種細胞高出約1000倍。MUSE細胞在臍帶血中的高發生率可能解釋為何許多研究者報告在臍帶血細胞中具有更高效率的iPS生成。

臍帶血因此是目前為止MUSE細胞最豐富的來源之一。全球許多臍帶血銀行儲存了成千上萬的臍帶血單元。與骨髓不同的是，儘管只有4：6的HLA配對，80%的臍帶血單元將被植入。來自臍帶血的MUSE細胞因此是用於再生醫學的多功能幹細胞的一種HLA配對來源。然而，若0.8%的臍帶血單核細胞為MUSE細胞，一含有1億個細胞的單一單元的臍帶血應該含有少於一百萬個MUSE細胞。即使有方法可以自臍帶血中收獲所有的MUSE細胞，但一百萬個MUSE細胞可能仍無法滿足治療之目的。

目前可用來自組織如臍帶血中分離MUSE細胞的方法使用負譜系篩選，然後以雷射分選該細胞。這些傳統方法不但沒有效率且昂貴。負譜系篩選然後以雷射分選該細胞需使用大量的抗體。此外，臍帶血具有許多其他的集落形成細胞。因此，要培養大量的純MUSE細胞是困難的，且在擴增該細胞的前後將需要多重篩選程序。本文所描述之新穎方法可以同時分離與擴增單一單元的臍帶血以獲得數百萬個MUSE細胞，而不使用抗體或其他昂貴的試劑。

分離與擴增MUSE細胞

如上所述，各種常規的方法已被用於分離MUSE細胞。例如，MUSE細胞可以藉由先負篩選表現標準譜系標記(使用CD5、CD45R、CD11b、抗-Gr-1、7-4與Ter-119抗體)的細胞，然後使用雷射分選，以篩選 同時表現CD105與SSEA3的Lin-細胞而被分離。另一種分離該細胞的方式是使用與表現CD105或SSEA3的細胞結合的磁性奈米珠，然後將該細胞通過磁化管柱。然而，這些常規方法由於使用各種抗體而昂貴，且不具有高產率。

本發明提供一種直接自臍帶血與其他組織分離與擴增分化多能MUSE細胞的方法。該方法不需以抗體篩選細胞，且可在體外擴增MUSE細胞以獲得大量的MUSE細胞。

圖1顯示直接自解凍的臍帶血單核細胞分離、純化，以及擴增MUSE細胞的例示性程序的圖式。在此例示性的程序中，血漿耗盡的或紅血球減少的冷凍單元被解凍。單核細胞係藉由在聚蔗糖(Ficoll)梯度中離心細胞、將細胞塗覆在明膠塗布的培養皿上、在24小時時清洗以移除非附著的細胞，以及接著培養4天而予以分離。該細胞係以非胰蛋白酶細胞脫離溶液使其脫離，且置於懸浮培養基中。該細胞的樣本接著被移出，以進行流式細胞儀分析，剩下的細胞則暴露於0.05%胰蛋白酶溶液中8小時。該細胞接著培養於懸浮培養基中5天，然後培養於附著培養物5天，然後以流式細胞儀再分析。該方法的一個實例包含以下步驟：

1. 臍帶血單核細胞的分離

使用新鮮或解凍的臍帶血，單核細胞係以滲透壓梯度(Ficoll)分離以自血漿耗盡的或紅血球減少的臍帶血單元獲得該血沉棕黃層。自血漿耗盡的臍帶血單元中分離細胞的程序是本領域已知的，且一般產生約每毫升1百萬個單核細胞，每單位的臍帶血可達1億個單核細胞。

2. 附著間葉細胞的分離

該單核細胞被塗覆於明膠塗布的平板上且培養於最低必需 培養基(Minimum Essential Medium，MEM)阿法修飾液中，其含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)或人類臍帶血清，以及0.8% MC4100。未貼附的細胞則在24小時後伴隨培養基更換而清洗掉，接著培養細胞3-5天。在第5天結束時，將近100%的該附著細胞應該為CD105⁺。

3. MUSE細胞的純化

該附著的細胞以非胰蛋白細胞分離溶液分離、懸浮並以流式細胞儀分析。此時，約6-7%的細胞應該同時為CD105⁺與SSEA3⁺。該懸浮細胞暴露於胰蛋白酶(0.05%)8小時、清洗、再懸浮於生長培養基中。胰蛋白酶應該會殺死大部分非MUSE間葉細胞，而MUSE細胞則應該在懸浮培養中增殖。暴露於胰蛋白酶的期間可以變化且重複，如3小時的0.05%胰蛋白酶培養基接著為2小時的非胰蛋白酶培養基，再接著為3小時的0.05%胰蛋白酶培養基。

4. MUSE細胞的擴增

該暴露於胰蛋白酶的細胞被培養於懸浮液中5天，然後於附著培養物中培養另外5天。在這10天的培養階段結束時，超過60%的細胞應該同時為CD105⁺與SSEA3⁺。始於約4千萬臍帶血單核細胞，結束時約9百萬細胞的66%為CD105⁺與SSEA3⁺。該細胞亦可在暴露於胰蛋白酶之後直接在附著培養物中培養，而跳過在懸浮培養中的步驟。來自非血液組織的MUSE細胞也可不培養於懸浮培養中。

此一程序係基於MUSE細胞的三個特點。第一，MUSE細胞為貼附及生長於附著培養物的間葉細胞。藉由將該細胞最初培養於明膠塗布的培養板上，並洗掉所有非貼附的細胞，該程序迅速地且有效地消除大 部分非間葉細胞。本文所揭露的數據顯示此一程序消除了幾乎所有未表現CD105的細胞，CD105為間葉細胞的一種標記。此一步驟未預期地造成MUSE細胞增加八倍，自約0.8%至約6-7%。第二，MUSE細胞為壓力耐受的。例如，該細胞可以存活於長時間的胰蛋白酶處理下。第三，MUSE細胞在懸浮培養中增殖。纖維母細胞與其他分化細胞不會在懸浮液中增殖。這進一步地增加並純化該MUSE細胞。本文所揭露的數據推測，暴露於0.05%胰蛋白酶下8小時，接著培養於懸浮液以及之後的附著培養物中，結果造成MUSE細胞增加十倍，自約6-7%至超過60%。注意該程序的第三與第四步驟可以被重複以進一步增加MUSE細胞的數目及比例。

在上述的程序中，胰蛋白酶的濃度與胰蛋白酶暴露時間的期間為例示性的且不受限於此。例如，在附著細胞的一般培養中，所用的胰蛋白酶濃度可為自0.1%至1%的範圍內，例如0.1%至0.5%，以配合不同的時間期間以移除附著於培養容器的附著細胞。在此，細胞同樣的也可暴露於具有較高濃度的胰蛋白酶溶液中一段較短的時間期間，或暴露於具有較低濃度的胰蛋白酶溶液中一段較長的時間期間。胰蛋白酶培養的時間可為自約3至24小時的範圍。有鑒於本文所揭露者，本領域技術人員可以決定適當的胰蛋白酶濃度與時間期間。

關於要用來培養來自中胚層組織、間葉組織、或活體的類似物的細胞的培養基與培養條件，可使用一般用於培養動物細胞的任何培養基與培養條件。此外，也可使用供培養幹細胞的已知培養基。培養基可適當地補充血清如胎牛血清、人類臍帶血清，抗生素如青黴素與鏈黴素，以及各種生物活性物質。

相較於一般傳統以抗體為基礎的分選以增加MUSE細胞濃度的方法，本文所揭露的程序效率較高。而且這也是一種便宜的分離及擴增大量MUSE細胞的方法。其他方法不但不能獲得百萬個細胞，亦需要昂貴的試劑(如抗體)與儀器(如FACS分選儀)。本文所揭露的程序不需要抗體來做陽性或陰性篩選、雷射分選，或其他昂貴的試劑或儀器。

本方法可直接自臍帶血或任何MUSE細胞的來源來分離、純化、並擴增MUSE細胞。臍帶血為一種具有吸引力的MUSE細胞來源，其原因如下。第一，HLA配對的臍帶血是一種豐富且免疫相容的MUSE細胞來源。許多臍帶血銀行已儲存成千上萬的臍帶血單元，其可為HLA-配對以提供用於移植目的的免疫相容的MUSE幹細胞。第二，臍帶血細胞比獲自骨髓、皮膚或脂肪的成人間葉幹細胞的其他來源具有較大的擴增潛能。第三，臍帶血在骨髓更換的安全使用歷史悠久，且伴隨低致癌風險。

本文所揭露的方法可應用於自臍帶血以外的其他組織分離與擴增MUSE細胞。如上所述，MUSE細胞是分離自間葉幹細胞的多功能幹細胞的一種特殊的亞群。因此，任何適合分離間葉幹細胞的來源都可以用來實施本文所揭露的發明。實例包括臍帶血、臍帶、臍帶基質細胞(花頓氏膠，Wharton’s jelly)、羊膜、胎盤、臍帶襯裡，以及甚至是經血。其他實例包括骨髓、皮膚、脂肪組織，以及甚至是周邊血。然而，如上所指出，這些來源中沒有一個具有與臍帶血細胞一樣多的MUSE細胞，且較臍帶血細胞具有較小的生長潛能。

由於間葉幹細胞含有MUSE細胞，許多有益的影響與分化多能性或間葉幹細胞的神經傾向可能是由於間葉細胞之中的MUSE細胞而 來。雖然已有許多方法描述自這些來源培養間葉幹細胞，但是沒有任何一個特定針對自這些來源，具體而言是並非自臍帶血，分離與擴增MUSE細胞。

在本發明中所揭露的方法可直接自各種組織(包括臍帶血)分離、增加、擴增或獲得多功能幹細胞，如MUSE細胞。本發明進一步提供細胞區份或具有多功能幹細胞，如MUSE細胞，的富集的細胞區份，其可根據上述方法而被生產。

如本文所用，可「直接」自組織分離、增加、擴增或獲得多功能幹細胞，此一詞彙意指，細胞可以自組織中分離而無任何人工誘導/遺傳再編程操作，如外來的/外源的基因或蛋白質的導入，或以化合物(如一化合物的施用)處理。這樣的外來基因可為，但不限於，能重新編程體細胞的細胞核的基因。這樣的外來基因的實例包括Oct家族基因(如Oct3/4基因)、K1f家族基因(如K1f基因)、Myc家族基因(如c-Myc基因)，以及Sox家族基因(如Sox2基因)。此外，外來蛋白質的實例包括由這些基因與細胞激素編碼的蛋白質。再者，化合物的實例包括能誘導上述能重新編程體細胞的細胞核的基因表現的低分子量化合物、DMSO、能作為還原劑的化合物，以及DNA甲基化試劑。

此外，在本發明中，常規的細胞培養與繼代(如使用胰蛋白酶)、使用細胞表面標記作為指標以進行細胞或細胞區份的分離、將細胞暴露於細胞壓力下，以及對細胞提供物理衝擊都不是上述的人工誘導操作。據此，本發明之多功能幹細胞的特徵亦在於其可在不需重新編程或誘導去分化之情況下獲得。

此外，本發明所揭露的方法可直接自各種組織分離、富集、 擴增、或獲得多功能幹細胞，如MUSE細胞，而不使用對細胞標記專一的抗體，其係用於正篩選(如一或多個SSEA-3或CD105抗體)或用於負篩選(如一或多個CD5、CD45R、CD11b、抗-Gr-1、7-4與Ter-119抗體)。據此，於一具體實施例中，本發明亦提供一種可直接自各種組織分離、增加、擴增、或獲得多功能幹細胞之方法，如MUSE細胞，其不使用對細胞標記專一的抗體。

本發明之多功能幹細胞係存在於中胚層組織或間葉組織，或活體的類似組織中。在本發明中，存在於這些種類的組織的細胞或細胞部分被分離。本文所用之「多功能幹細胞」意指具有可自單一細胞產生三個胚胎胚層的細胞種類(即內胚層、中胚層與外胚層細胞)之能力的細胞，其亦具有自我更新能力。於一較佳具體實施例中，本發明之多功能幹細胞具有以下特性。該多功能幹細胞表現分化多能性標記，如Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4與Sox2。該多功能幹細胞展現單株性(clonality)，借此其自單一細胞擴增且保持產生其本身的複製。該多功能幹細胞展現自我更新的能力。該多功能幹細胞可在活體外與活體內分化為三種胚層(即內胚層細胞譜系、中胚層細胞譜系，以及外胚層細胞譜系)。當被移植至小鼠的睪丸或皮下組織時，該多功能幹細胞分化為三種胚層。該多功能幹細胞被發現透過鹼性磷酸酶染色呈現陽性。

本發明之多功能幹細胞明確地與成人幹細胞及組織幹細胞有所區分，因為本發明之多功能幹細胞是分化多能的，並具有較高的分化潛能。此外，本發明之多功能幹細胞明確地與細胞部分如骨髓基質細胞(MSC)有所區分，因為本發明之多功能幹細胞係以單一細胞或複數個具 有分化多能性的細胞的形式分離。本發明之多功能幹細胞明確地與iPS細胞(誘導性多功能細胞)以及ES細胞有所區分，因為本發明之多功能幹細胞可以直接自活體或組織獲得。

再者，本發明之多功能幹細胞具有以下特性。(i)生長速度相對緩慢且分裂週期需要1天或更久，如1.2-1.5天。然而，該多功能幹細胞不表現出以類似於ES細胞或iPS細胞的方法無限增殖。(ii)當被移植到免疫缺乏的小鼠體內時，該多功能幹細胞分化為內胚層細胞譜系、中胚層細胞譜系，以及外胚層細胞譜系。該多功能幹細胞未被觀察到變成致癌細胞，而不像ES細胞或iPS細胞，其通常在短時間內，如8週，形成畸胎瘤。(iii)該多功能幹細胞形成ES細胞衍生的胚狀體樣細胞叢，其係懸浮培養的結果。(iv)該多功能幹細胞形成胚狀體樣細胞叢，其係懸浮培養的結果，且在約10-14天內停止生長。隨後，當該細胞叢被轉移至附著培養，開始恢復生長。(v)非對稱分裂與生長有關。(vi)該細胞的核型均正常。(vii)該多功能幹細胞沒有或具有低度的端粒酶活性。(viii)關於甲基化狀態，在自本發明之多功能幹細胞，如MUSE細胞，所誘導的iPS細胞中，其於Nanog與Oct3/4啟動子區域的甲基化程度低。(ix)該多功能幹細胞表現出高吞噬能力。(x)該多功能幹細胞沒有表現出致癌性增殖。

本文所用之詞彙「沒有或具有低度的端粒酶活性」意指當使用例如TRAPEZE XL端粒酶偵測套組(Millipore公司)來偵測這樣的活性時，偵測到無或低度的端粒酶活性。「低端粒酶活性」乙詞意指細胞具有與人類纖維母細胞相同程度的端粒酶活性，或是具有Hela細胞1/5或更少且較佳為1/10或更少的端粒酶活性的情形。

本文所用之表述「細胞沒有表現出致癌性增殖」意指當進行懸浮培養時，該細胞在當其細胞叢達到預定的大小時停止其生長且不經歷無限生長的情形。再者，這樣的表現意指當這樣的細胞被移植到免疫缺乏小鼠的睪丸內時，沒有畸胎瘤形成的情形。此外，上述(i)至(iv)點及其類似者亦涉及該相關細胞(細胞叢)不經歷致癌性增殖的事實。

本發明之多功能幹細胞(如MUSE細胞)能透過在體外的附著培養物分化為三種胚層。特定而言，該多功能幹細胞可以透過在體外的誘導培養物分化為該三個胚層的細胞代表，包括皮膚、肝臟、神經、肌肉、骨骼、脂肪及其類似物。此外，當在體內被移植時，該多功能幹細胞能分化為具有該三個胚層特徵的細胞；當經由靜脈注射至活體內而被移植到受損的器官中，該多功能幹細胞能存活且分化為器官(如皮膚、脊髓、肝臟與肌肉)。

據此，一旦上述多功能幹細胞，如MUSE細胞，被分離或增加後，接著該細胞可以標準技術進行測試，使用一或多種譜系特異性的標記，以確認該細胞的分化潛能。亦即，在合適的培養條件下，可以測試該細胞是否可以被誘導以分化且產生表現這三個胚層的標記的細胞。外胚層細胞的例示性標記包括巢蛋白、NeuroD、Musashi、神經絲蛋白、MAP-2以及黑色素細胞標記(如酪胺酸酶、MITF、gf100、TRP-1以及DCT)；中胚層細胞的例示性標記包括鼠短尾突變體表型(brachyury)、Nkx2-5、平滑肌肌動蛋白、骨鈣化素、油紅-(+)-脂滴，以及結蛋白；內胚層細胞的例示性標記包括GATA-6、α-胎蛋白、細胞角質蛋白-7，以及白蛋白。

例如，分離/增加細胞可以藉由本領域已知的方法被誘導以 形成神經膠質細胞、骨細胞，以及脂肪細胞。簡言之，該細胞可以被繼代並且培養至長到全滿後，移至成骨培養基中或生成脂肪的培養基中，且培養一段適當的時間(如3週)。成骨的分化潛能可以藉由鈣累積的礦化作用來評估，其可透過von Kossa染色而被顯現。為了檢視脂肪生成的分化，細胞內脂滴可以藉由油紅O染色，且在顯微鏡下觀察。對於神經分化，該細胞可以在神經性培養基中培養一段適當的期間(如7天)，然後經過血清耗盡與β-巰基乙醇的培養。在分化後，細胞表現出折射細胞體的形態伴隨著編排成一網狀的延伸的軸突狀結構。可以進一步進行特定標記譜系的免疫細胞化學染色以確認神經分化。該標記的實例包括神經元特異性第III類β-微管蛋白(Tuj-1)、神經絲，以及GFAP。

一旦多功能幹細胞，如MUSE細胞，被分離且其分化潛能被確認後，藉由上述方法製備的該細胞或細胞群可以多種方式使用。由於其分化多能性與非致癌性，該細胞或細胞群可以用來治療各種退化性或遺傳疾病，而同時避免人類胚胎操作的道德考量以及與其他幹細胞如ES細胞與iPS細胞有關的致癌風險。此外，因為本發明之方法可獲得大量的多功能幹細胞，如MUSE細胞，因此亦可避免與其他類型的幹細胞有關的後勤障礙。

於一實例中，可以使用該細胞以治療各種症狀，包括脊髓損傷、脫髓鞘症狀、創傷性腦損傷與中風，以及抑制不需要的免疫反應(如發炎)與治療心臟、肺、腸、肝臟、胰腺、肌肉、骨髓以及皮膚的異常。為此，可以先在活體外，然後在活體內測試該細胞的分化多能性，然後在未受傷的免疫缺乏動物中測試，最後在脊髓損傷動物與中樞神經系統及其他組織損傷的其他模式中測試。

如本文所用，「細胞區份」乙詞意指含有至少一給定量的所欲細胞(如MUSE細胞)的細胞群。「多功能幹細胞部分」乙詞意指含有一對應於1%、2%、3%、6%或更多的，10%或更多的，30%或更多的，50%或更多的，70%或更多的，90%或更多的，或95%或更多的量的多功能幹細胞之細胞群。其實例包括經由多功能幹細胞的培養所獲得的細胞叢以及經由多功能幹細胞的增加所獲得的細胞群。此外，該細胞部分也可被稱為一個本質上均勻的細胞部分。

本文所用之「活體」乙詞意指活的動物(如哺乳類動物)體，且其特定地指經歷發展到一定程度的動物體。在本發明中，這樣的活體的實例不包括在囊胚期之前的發育階段的受精卵或胚胎，但包括在囊胚期與之後的發育階段的胚胎，如胎兒和囊胚。哺乳類動物的實例包括，但不限於，靈長類動物如人與猴、囓齒類動物如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、貓、狗、羊、豬、牛、馬、驢、山羊，以及雪貂。本發明之多功能幹細胞，如MUSE細胞，與來自胚胎幹細胞(ES細胞)或胚胎生殖幹細胞(EG細胞)有所區別，因為這些細胞來自活體組織。

「中胚層組織」乙詞意指出現在動物的初始發育過程中的中胚層來源的組織。中胚層組織的實例包括肌肉系統的組織、結締組織、循環系統的組織、排泄系統的組織和生殖系統的組織。例如，本發明之多功能幹細胞可自骨髓抽出物或皮膚組織如真皮結締組織中獲得。「間葉組織」乙詞意指組織如骨、軟骨、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韌帶、肌腱、牙髓和臍帶。例如，本發明之多功能幹細胞可自臍帶、骨髓或皮膚中獲得。

中胚層組織和活體的間葉組織的實例包括，但不限於，骨髓單核細胞、纖維母細胞部分如皮膚細胞、髓組織、眼球組織，以及髮根組織。作為細胞，培養細胞與自組織收集的細胞皆可被使用。在這些細胞中，較佳為臍帶細胞、骨髓細胞和皮膚細胞。這樣的細胞的實例包括人類骨髓基質細胞(MSC)部分以及人類真皮纖維母細胞部分。骨骼MSC部分可藉由培養骨髓抽出物2至3週而獲得。

如本文所揭露，提供了一個數值的範圍。應當理解的是，每個中間值，到其下限的單位的十分之一，除非上下文另有明確地說明，否則該範圍的上限和下限之間也被特定地揭露。每個介於任何所述的數值的較小範圍或在所述的範圍內的中間值以及在該所述範圍內的任何其他所述或中間值係包含在本發明之內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地被包括或被排除在該範圍內，且每一範圍中任一、皆不或皆為的限制都包括在該較小範圍內，也包含在本發明內，在所述範圍內受限於任何特定排除的限制。當所述範圍包括一或兩者限制，排除任一或皆為那些包括的限制的範圍也包括在本發明中。

術語「大約」一般是指加上或減去指定數量的10%。例如，「約10%」可能表示9%至11%的範圍，「大約1」可能意指自0.9至1.1，以及「大約4」可能意指自3.6至4.4。「約」的其他含義可從上下文中顯明，如四捨五入，因此，例如，「約1」也可指自0.5至1.4。

實施例

在以下的實施例中，進行如圖1所示的方法以直接分離與擴增MUSE細胞。該方法不需細胞的抗體篩選，且被應用於獲自Stemcyte公司 的臍帶血的紅血球細胞減少(red cell reduced，RCR)單元。

實施例1

此一實施例描述用於以下實施例2及3的方法。

單核細胞的分離

單核細胞係經由在聚蔗糖(Ficoll)梯度中離心而自臍帶血中分離而來，得到含有該單核細胞的血沉棕黃層。當細胞自血漿耗盡(plasma depleted，PD)冷凍單元中分離出時，滲透壓震擾係用來減少紅血球細胞與DNA酶的數量，以防止該細胞在聚蔗糖梯度中彼此粘黏。血漿耗盡(PD)通常產生每毫升的解凍臍帶血中約一百萬個細胞，而解凍RCR單元為25毫升且含有2至2.5億個單核細胞。約4千萬個單核細胞被使用。

培養

將細胞接種於明膠塗布或其他培養皿中24小時，至其中的間葉細胞貼附且非附著細胞以磷酸鹽緩衝溶液沖洗掉。然後將該細胞塗覆於附著培養物中，於Eagle最低必需培養基(Minimal Essential Medium Eagle，MEM)阿法修飾液中，10% FBS以及0.8% MC4100。MEM α修飾為修飾的合成培養基以具有較高的胺基酸濃度、Earle氏的平衡鹽類、非必需胺基酸、丙酮酸鈉，以及維生素(見www.safcglobal.com/etc/medialib/docs/Sigma/Formulation/m0894for.Par.0001.File.tmp/m0894for.pdf)。

在第四天結束時，該細胞係以非胰蛋白酶細胞分離溶液分離，即Accutase細胞分離溶液，其含有蛋白分解酵素與膠原蛋白酶酵素。該溶液不含胰蛋白酶或EDTA。取出一樣本以進行流式細胞儀分析。其餘的，重新懸浮的細胞在0.05%胰蛋白酶中培養8小時，並使其在懸浮液中增殖5 天，再塗覆到明膠塗布的平板上，使其生長5天，然後以流式細胞儀分析。

流式細胞儀

使用美天旎MACSQuant分析儀流式細胞儀以進行這項研究。對於所有的流式細胞儀的讀值，活細胞係在碘化丙啶(propidium iodide，PI)/PE-CY5,5-A與PE-A的散點圖上被鑑定。碘化丙啶是一種螢光染料，其可嵌入到雙股核酸中。其通常被排除於活細胞之外，但會滲入到死細胞的細胞膜而染色細胞。當使用488nm雷射激發，PI發射可以在紅色螢光通道中被偵測到。

死細胞在45度「尾巴」中表現出PI的逐漸增加，且被排除於以下的分析。為了鑑定在細胞上的單一或雙重標記，該細胞係與對CD105、SSEA3、CD34和CD45具有專一性的初級抗體培養。然後加入標記帶有別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC-A)或螢光異硫氰酸鹽(fluorescen isothyocynate，FITC)的二級螢光抗體。別藻藍蛋白具有650nm的激發波長、660nm的發射波長(紅色)，以及104K的分子量；螢光異硫氰酸鹽具有495nm的激發波長、519nm的發射波長(綠)，以及389的分子量。接著，藉由使用一非特異性的同型抗體將非特異性螢光標準化，設定下邊界以偵測陽性細胞。當使用二個通道的螢光時，螢光補償係用來排除光譜重疊。

實施例2

單核細胞係經由聚蔗糖梯度離心而自紅血球細胞減少的臍帶血單元的解凍單元分離而來。然後該細胞被塗覆在明膠塗布的細胞培養皿上，於24小時後以磷酸鹽緩衝溶液清洗以移除非附著細胞，然後再培養4天。貼附培養在明膠塗布的培養皿5天後，使用細胞分離溶液將該臍帶血單 核細胞分離，並且以流式細胞儀分析該細胞。在附著培養的5天後，發現幾乎所有的單核細胞表現CD105，其為間葉細胞的標記。

由此產生的流式細胞儀散點圖顯示各種細胞從非常低到非常高的側向散射與前向散射。將碘化丙啶(PI)與藻紅素標記PE-CY5,5-A應用到該細胞顯示出在PI/PE對PE的散點圖上細胞的線性45度的「尾巴」。由於PI只有進入死亡或瀕臨死亡的細胞，結果在這條對應於PE的增加的PI的尾巴上的細胞可能已死亡，因此被排除於進一步的分析之外。

將近所有剩餘的細胞(99.2%)表現CD105。因此獲得流式細胞儀的散點圖。該指示對兩組細胞的流式細胞儀數據的圖係自相同的來源而得。

在一組散點圖中，三個散點圖係為與不結合CD105的對照同型初級抗體共同培養的細胞之分析；另三個散點圖係為與CD105抗體及二級螢光抗體共同培養的細胞之分析。其中，二圖為側向散射(SSC-A Y軸)與前向散射(FSC-A X軸)的散點圖。這些細胞可以被視為在該同型-對照與CD105標記的細胞中具有相似的散射。該散點圖包括PI/PE-Cy5,5A(Y軸)與PE-A的比值的其他兩個散點圖。PI係指進入死細胞並插入DNA之間的碘化丙啶。在這兩個散點圖上的每一個散點圖，細胞的尾部傾斜45度到右上方。死細胞係位於此一尾巴內，這表明碘化丙啶的增加。最後兩個圖顯示與同型(ISO)或與CD105抗體結合的APC-A訊號的散點圖。該散點圖之一顯示所有位於左下角(低側向散射與低APC-A訊號)的細胞。設定排除線以排除在該同型對照的範圍內表達APC-A訊號的所有細胞。其他的散點圖顯示該細胞的位置在該圖的右下側。該數據顯示99.2%的該標定細胞是 CD105⁺。

比較標記該同型對照的細胞與標記該CD105-APC-A抗體的細胞的分布。該二族群之間很少重疊，如信號強度直方圖所示。結果獲得側向散射(SSC-A)的散點圖以及與該同型對照抗體(ISO-APC-A)共同培養的細胞和與該CD105抗體(CD105-APC-A)共同培養的細胞的散點圖。還獲得顯示在每個訊號強度種類的細胞分布的相關直方圖。該二族群的細胞之間幾乎沒有重疊。

在附著培養的5天後在該單核細胞中CD90的表現也受到檢視，且獲得一組顯示CD90表現的圖。獲得的圖形之二顯示分別與對照同型(ISOCD90-PE-A)及與CD90抗體(CD90-PE-A)共同培養的細胞的散點圖。另一圖顯示相同結果的直方圖，顯示該二族群有一些重疊。分析指出96.59%的該細胞表現CD90。

這些結果指出，幾乎所有(96.59%)的培養的附著細胞也表現CD90。CD-90為Thy-1，一種GPI連接的表面糖蛋白，其係為免疫球蛋白超級家族的一成員，且由能在培養物中長期生長的CD34⁺造血幹細胞的子群表現。骨髓基質與纖維母細胞株，活化內皮細胞，以及神經元與淋巴來源的腫瘤細胞株表現CD-90。該分子在細胞附著與遷移作用中具有作用。最近顯示這些細胞具有纖維母細胞形態，具有24.15±0.49小時的倍增時間，表現Nanog、Oct-4以及CD105，且具有高擴增潛能(即30天內10¹⁰個細胞)。

在附著培養的5天後在細胞內的CD34的表現也受到檢視，且獲得一組圖。結果發現，附著培養為CD34陰性。該散點圖之二分別顯示與對照同型抗體共同培養的細胞的分布以及與該CD34抗體(CD34-FITC-H) 共同培養的細胞的分布。結果發現很少或沒有(0.0%與0.22%)細胞表現CD34。

這些結果指示以上獲得的附著間葉細胞不表現CD34，因為標記該同型對照與該CD34抗體的細胞的螢光並無差異。內皮原生細胞的一標記，CD34⁺是最常用於在臍帶血中的造血幹細胞的替代標記。有些造血幹細胞表現CD34。上述數據清楚地顯示，培養在明膠塗布的培養皿上的CD105陽性細胞不表現CD34，且少於0.22%的藉由附著生長在明膠塗布平板上分離的該細胞表現CD34。

接著進行分析以檢視在附著培養的5天後CD45的表現。獲得在附著培養的5天後顯現CD45表現的散點圖。結果發現，某些附著間葉細胞表現CD45。在兩個實驗中，10.37%與27.26%的附著間葉細胞被發現表現CD45。糖蛋白的CD45家族屬於一蛋白酪胺酸磷酸酶受體C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，PTPRC)的家族。現有所有的分化的造血細胞中，除了紅血球與血漿細胞之外，CD45是由初始淋巴細胞、淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病，以及急性非淋巴細胞性白血病細胞所表現。CD45常用被用來從惡性腫瘤中區分出淋巴瘤。

在該細胞的附著培養5天後還進行分析以檢視CD105與SSEA3。簡言之，該細胞係與針對CD105以及SSEA3的抗體或二個對照抗體(針對CD105與SSEA3)共同培養。結果發現，針對該二個對照抗體的螢光信號都很低。相較之下，與針對CD105及SSEA3的兩種抗體共同培養的細胞的散點圖顯示，只有6.93%的活細胞是CD105⁺及SSEA3⁺，而且一小部分的細胞(1.17%)不表現SSEA3或CD105。該對照同型抗體與SSEA3抗體之間 有大量的重疊。

這些結果指出，大約6-7%的表現CD105的附著細胞也表現SSEA3，其為Dezawa等人所鑑定的人類胚胎幹細胞標記。雖然該對照同型抗體與該SSEA3抗體之間有些重疊，但是該數據推測約6-7%的CD105⁺細胞表現SSEA3。一小部分(1.17%)的細胞對CD105與SSEA3皆呈現陰性。在先前的研究中，結果顯示約0.8%自冷凍臍帶血單元中分離的單核細胞同時表現CD105與SSEA3。因此，這表明在明膠塗布的培養皿中培養該細胞的第一步令人驚訝地增加了培養物近十倍，自約0.8%至約6-7%。

實施例3

將以在上述實施例2中所述的方式所獲得的附著間葉細胞接著暴露於0.05%胰蛋白酶中8小時，在懸浮培養物中培養5天，然後在附著培養物中培養5天。在10天的培養結束時，該細胞以非胰蛋白酶分離溶液分離。然後，進行上述分析以檢測各種標記。

檢視CD105的表現並獲得相關的散點圖。所得之散點圖包括顯示藉由側向散射(SSC-A)與前向散射(FSC-A)的細胞分布的散點圖，以及PI/PE-Cy5,5A對PE-A分布的圖，其顯示約13%的死細胞的45度「尾巴」，其被排除於進一步的分析之外。所得之散點圖包括顯示同型對照的圖以及顯示表現CD105的細胞的圖。結果發現，從該分析中去除死細胞(即高PI/PE比率)之後，幾乎所有的細胞(99.41%)表現CD105。

然而，不同於上述實施例2中較早的樣本只有經歷在附著培養物中培養5天而無胰蛋白酶的處理，在懸浮液中生長後再於附著培養物中培養10天的胰蛋白酶處理的附著間葉細胞具有較少或無細胞表現CD45。事 實上，來自兩個單獨的實驗的相關散點圖與直方圖顯示只有一點點細胞表現CD45(0.08-1.83%)。

接著，檢視SSEA3的表現且以上述方式獲得相關的散點圖。針對SSEA3標示該細胞顯示，66.23%的附著間葉細胞表現SSEA3。因為幾乎所有的細胞都是CD105⁺，這一發現表示，該程序的第二部分(即以胰蛋白酶處理，並於懸浮液中培養，然後附著培養)增加了在培養物中的MUSE細胞大約另一個十倍(即自約6-7%至66%)。

也獲得了針對標記有對照同型(ISO-FITC-A)與SSEA3抗體(SSEA3-FITC-A)的細胞的相關散點圖和直方圖。結果表示，該對照同型與SSEA3抗體之間有些重疊，但超過三分之二(66%)的細胞清楚地表現SSEA3(SSEA3陽性)。

然後，以上述方式檢視CD105、CD73，以及CD90的表現。相關的散點圖顯示幾乎所有的細胞(99.48%)為CD105⁺。結果也發現，只有12.63%的細胞表現CD73，但96.59%的細胞表現CD90。

檢視在本實施例中得到的細胞的形態，並使用相位差顯微攝影在63倍下拍攝活細胞培養物的照片。結果發現，該細胞類似於那些纖維母細胞。該附著間葉細胞呈現典型的梭形、雙極細胞。這些發現與其他研究者(Zhang等人，(2012年)，Cell Biochemistry And Function，第30卷，第8期，第643-649頁)的發現一致，其描述纖維母細胞樣的細胞的克隆，可以藉由一單一酵素消化而易於分離，且描述CD73、CD90，以及CD105的表現，但並非CD34、CD45或HLA-DR的表現。當被培養於分化培養基中，可見到各種不同的細胞。這些細胞包括脂肪細胞、骨細胞，以及軟骨細胞。另一 方面，這些是清楚的間葉幹細胞，而在本實施例中所獲得的細胞為CD105⁺與SSEA3⁺的MUSE細胞。

總結，分離自人體臍帶血中的單核細胞可藉由附著培養在明膠塗布的平板上而被增加以獲得本質上純的間葉細胞。在此一步驟中，MUSE(CD105⁺與SSEA3⁺)細胞的百分比自約0.8%增加至約6-7%。接著以胰蛋白酶處理細胞8小時，懸浮培養5天，然後附著培養5天導致大約66%的細胞對CD105與SSEA3 MUSE細胞呈現陽性。

前述實施例與較佳具體實施例的描述應被視為說明性的，而非作為限制本發明的申請專利範圍所限定者。如將容易理解的是，上述的特徵的許多變化和組合可以在不脫離如申請專利範圍中闡述之本發明的範圍內加以利用。這樣的變化不被視為脫離本發明的範圍，且所有這樣的變化旨在被包括在以下申請專利範圍的範圍之內。本文所引用的所有參考文獻在此以全文的方式引入本文。

Claims (22)

1. 一種富集多向分化壓力耐受(MUSE)細胞的方法，包含：提供動物的複數個起始間葉細胞；將該複數個起始間葉細胞塗覆於基質上；將該塗覆於該基質的複數個起始間葉細胞於第一培養基中培養第一段時間，其中該第一段時間係約3-10天；以及獲得附著於該基質的細胞，以產生附著間葉細胞群，3%或更多的該附著間葉細胞群為多向分化壓力耐受(MUSE)細胞。
2. 如請求項1之方法，其中該方法進一步包含使該附著於該基質的細胞自該基質脫離，以獲得複數個懸浮細胞。
3. 如請求項2之方法，其中該方法進一步包含於第二培養基中將該複數個懸浮細胞暴露於胰蛋白酶達第二段時間，以獲得複數個暴露於胰蛋白酶的細胞。
4. 如請求項3之方法，其中該方法進一步包含於懸浮液中培養該複數個暴露於胰蛋白酶的細胞達第三段時間。
5. 如請求項4之方法，其中該方法進一步包含，在該於懸浮液中培養的步驟之後，於附著培養物中培養該複數個暴露於胰蛋白酶的細胞達第四段時間，以獲得擴增細胞群，30%或更多的該擴增細胞群為多向分化壓力耐受(MUSE)細胞。
6. 如請求項1-5中任一項之方法，其中該動物係哺乳類動物。
7. 如請求項6之方法，其中該哺乳類動物係人類。
8. 如請求項1-7中任一項之方法，其中該複數個起始細胞係自該動物的組 織中所獲得。
9. 如請求項8之方法，其中該組織係臍帶血、骨髓、羊水、脂肪組織、胎盤，或周邊血。
10. 如請求項9之方法，其中該組織係臍帶血。
11. 如請求項1-10中任一項之方法，其中該起始間葉細胞係單核細胞。
12. 如請求項1-11中任一項之方法，其中該起始間葉細胞係藉由一包含滲透壓梯度離心的方法而自該動物中所獲得。
13. 如請求項1-12中任一項之方法，其中該基質包含明膠。
14. 如請求項1-13中任一項之方法，其中該第一培養基包含血清。
15. 如請求項1-14中任一項之方法，其中該第一段時間係約3-5天或約4天。
16. 如請求項1-15中任一項之方法，進一步包含於該起始間葉細胞被塗覆於該基質上之後12-36小時內、18-30小時內或24小時內，將未貼附於該基質的細胞移除。
17. 如請求項2之方法，其中該細胞經由非胰蛋白酶的方式而脫離。
18. 如請求項3之方法，其中該第二時間係約4-12小時、6-10小時，或8小時。
19. 如請求項3之方法，其中該第二培養基係生長培養基。
20. 如請求項4之方法，其中該第三段時間係約3-10天、4-6天，或5天。
21. 如請求項5之方法，其中該第四段時間係約3-10天、4-6天，或5天。
22. 一種根據請求項1-21中任一項之方法所生產的多向分化壓力耐受(MUSE)細胞群。