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TW201402611A - 具有改變之ｆｃ效應子功能之腸促胰島素受體配體多肽ｆｃ區融合多肽及結合物 - Google Patents

具有改變之ｆｃ效應子功能之腸促胰島素受體配體多肽ｆｃ區融合多肽及結合物 Download PDF

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TW201402611A
TW201402611A TW102121604A TW102121604A TW201402611A TW 201402611 A TW201402611 A TW 201402611A TW 102121604 A TW102121604 A TW 102121604A TW 102121604 A TW102121604 A TW 102121604A TW 201402611 A TW201402611 A TW 201402611A
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fusion polypeptide
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TW102121604A
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Eike Hoffmann
Erhard Kopetzki
Matthias Rueth
Georg Tiefenthaler
Richard D Dimarchi
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Univ Indiana Res & Tech Corp
Hoffmann La Roche
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Abstract

本發明揭示一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含1至4個腸促胰島素受體配體多肽及變體人類Fc區，該變體人類Fc區在329位置處具有胺基酸殘基之突變及至少一個選自包含在228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及331位置處之胺基酸殘基之群的胺基酸至不同殘基之至少一個其他突變，其中該Fc區中之該等殘基係根據Kabat之EU索引編號；及其作為藥劑之用途。

Description

具有改變之FC效應子功能之腸促胰島素受體配體多肽FC區融合多肽及結合物 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2012年6月21日申請之美國臨時專利申請案第61/662,576號之優先權；該申請案之內容以全文引用方式併入本申請案中。
以電子方式呈送之材料之引用併入
以全文引用方式併入者係與本文同時呈送且標識如下之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列列表：2013年5月22日創建之名稱為「31050_SL.txt」之75千位元組ACII(文本)檔案。
本文報告腸促胰島素受體配體多肽與抗體Fc區之融合物及結合物，藉此該Fc區與天然存在Fc區相比具有改變之效應子功能，該改變之效應子功能受該Fc區中之一或多個胺基酸取代影響。
單株抗體具有巨大治療潛力且在當前醫療業中發揮重要作用。過去十年來，醫藥產業之重大趨勢係研發單株抗體(mAb)及抗體Fc區融合多肽作為治療諸如癌症、氣喘、關節炎、多發性硬化等多種疾病 之治療劑。
抗體之Fc區(即抗體中包含CH3結構域、CH2結構域及一部分鉸鏈區之一對重鏈之羧基端區)具有有限可變性且其參與抗體或包含Fc區之融合多肽或結合物之至少一部分生理效應。歸因於抗體之Fc區的效應子功能隨抗體之種類及子類而變化且包括(例如)抗體經由其Fc區與細胞上觸發各種生物學反應之特異性Fc受體(FcR)的結合。
舉例而言，所形成Fc區/Fcγ受體(Fc/FcγR)複合物將效應子細胞募集至結合抗原之位點，從而通常導致細胞內之信號傳導事件及重要的後續免疫反應，例如發炎介質之釋放、B細胞活化、胞吞作用、吞噬作用或細胞毒性攻擊。將表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別靶標細胞上之結合抗體且隨後引起靶標細胞溶解的細胞調介反應稱為抗體依賴性細胞調介細胞毒性(ADCC)(Ravetch等人，Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。將表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別靶標細胞上之結合抗體且隨後引起靶標細胞之吞噬作用的細胞調介反應稱為抗體依賴性細胞調介吞噬作用(ADCP)。另外，分子之Fc區上的重疊位點亦控制由補體調介之細胞獨立性細胞毒性功能的活化，此另外稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)。
對於Ab之IgG種類而言，ADCC及ADCP係由Fc區與稱為Fcγ受體(FcγR)之受體家族的咬合來管控。在人類中，此蛋白家族包含FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)，包括亞型FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIC；及FcγRIII(CD16)，包括亞型FcγRIIIA及FcγRIIIB(Raghavan及Bjorkman，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.12(1996)181-220；Abes等人，Expert Reviews(2009)735-747)。FcγR表現於多種免疫細胞上，且所形成Fc/FcγR複合物將該等細胞募集至結合抗原之位點，從而通常導致信號傳導及後續免疫反應，例如發炎介質之釋放、B細胞活化、胞吞作用、吞噬作用及細胞毒性攻擊。此外，FcγRI、FcγRIIA/C 及FcγRIIIA係特徵在於基於細胞內免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)的活化受體，而FcγRIIB具有抑制基序(ITIM)且因此具有抑制性。此外，de Reys等人(Blood 81(1993)1792-1800)推斷，由單株抗體(例如CD9)誘導之血小板活化及凝集始於抗原識別，隨後為涉及FcγRII-受體之Fc區依賴性步驟(亦參見：Taylor等人，Blood 96(2000)4254-4260)。儘管FcγRI以高親和力結合單體IgG，但FcγRIII及FcγRII係與複合或凝集之IgG相互作用的低親和力受體。
補體發炎性級聯係先天免疫反應之一部分且對於個體避開感染之能力至關重要。另一重要Fc區配體係補體蛋白C1q。Fc區與C1q之結合調介稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)之過程。C1q能夠結合6種抗體，但與兩種IgG之結合足以活化補體級聯。C1q與C1r及C1s絲胺酸蛋白酶形成複合物以形成補體路徑之C1複合物。
在許多情況下，由免疫球蛋白之Fc區調介之結合及對效應子功能之刺激極為有益，例如對於CD20抗體而言，然而，在某些情形下，可更有利地降低或甚至消除效應子功能。此對於彼等經設計以將藥物(例如毒素或同位素)遞送至靶標細胞之抗體而言尤其如此，其中Fc/FcγR調介之效應子功能將健康免疫細胞引入有效負荷之附近，從而導致正常淋巴組織以及靶標細胞之消耗(Hutchins等人，PNAS USA 92(1995)11980-11984；White等人，Annu.Rev.Med.52(2001)125-145)。在該等情形下，使用較差地募集補體或效應子細胞之抗體會具有巨大益處(亦參見Wu等人，細胞Immunol 200(2000)16-26；Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；US 6,194,551；US 5,885,573及PCT公開案WO 04/029207)。
在其他情況下，例如，倘若目標係阻斷廣泛表現之受體與其同源配體之相互作用，則可有利地降低或消除所有抗體效應子功能以減小不期望之毒性。同樣，在治療抗體在諸多人類組織間展示混雜結合 之情況下，將效應子功能之靶向限定於多組組織以限制細胞毒性會較為明智。最後但並非最不重要，降低之抗體與尤其FcγRII受體之親和力將有利於抗體經由FcγRII受體結合誘導血小板活化及凝集，經由FcγRII受體結合誘導血小板活化及凝集係該等抗體之嚴重副作用。
儘管存在人類免疫球蛋白之缺乏特異性效應子功能之某些子類，但不存在完全缺乏所有效應子功能之已知天然存在免疫球蛋白。替代方法係改造或突變Fc區中負責效應子功能之關鍵殘基。例如，參見WO 2009/100309、WO 2006/076594、WO 1999/58572、US 2006/0134709、WO 2006/047350、WO 2006/053301、US 6,737,056、US 5,624,821及US 2010/0166740。
IgG與活化及抑制性Fcγ受體或補體之第一組份(C1q)之結合取決於位於鉸鏈區及CH2結構域中之殘基。CH2結構域之兩個區域對於FcγR及補體C1q結合至關重要，且具有不同序列。233至236位置處之人類IgG1及IgG2殘基及327、330及331位置處之IgG4殘基之取代大大降低ADCC及CDC(Armour等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624；Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。Idusogie等人(J.Immunol 166(2000)2571-2575)繪製治療抗體Rituxan(R)之C1q結合位點且證實Pro329Ala取代降低利妥昔單抗(Rituximab)結合C1q及活化補體之能力。已報導用Ala取代Pro329達成降低之與FcγRI、FcγRII及FcγRIIIA受體之結合(Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)，但亦已將此突變闡述為展示與FcγRI及FcγRII之野生型樣結合且與FcγRIIIA受體之結合僅有極少降低(EP 1 068 241中之表1及表2，Genentech)。
Oganesyan等人，Acta Cristallographica D64(2008)700-704將三重突變L234F/L235E/P331S引入下游鉸鏈及C2H結構域中且顯示與人類IgG1分子至人類C1q受體FcγRI、FcγRII及FcγRIIIA之結合活性之降 低。
促胰島素多肽具有促胰島素活性，即，能夠刺激激素胰島素之合成或表現或引起該刺激。促胰島素肽包括(但不限於)GLP-1、促胰島素分泌素-3、促胰島素分泌素-4及其前體、衍生物或片段。
發現升糖素原(Pro-glucagon)衍生之肽(包括升糖素及升糖素樣肽-1(GLP-1))以許多種代謝路徑參與不同的生理功能，例如胰島素分泌及攝食量之調控。
前升糖素原(Pre-pro-glucagon)係可處理成多種不同活性化合物之158個胺基酸多肽。例如，GLP-1對應於前升糖素原之胺基酸殘基72至108。除其他功能以外，GLP-1亦刺激胰島素合成及分泌並抑制攝食量。已顯示GLP-1降低糖尿病中之高血糖(升高之葡萄糖含量)。
葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)係在葡萄糖存在下刺激胰臟β細胞分泌胰島素之42個胺基酸胃腸調控肽。其係自133個胺基酸前體pre-pro-GIP藉由蛋白水解處理得到。
在WO 2010/011439中報導用於治療代謝病症及肥胖之基於GIP之混合促效劑。據報導，對天然升糖素序列之修飾產生可展示高效升糖素活性(等效於或優於天然升糖素之活性)、高效GIP活性(等效於或優於天然GIP之活性)及/或高效GLP-1活性(等效於或優於天然GLP-1之活性)之升糖素肽。據報導，所提供數據顯示，同時具有GIP活性及GLP-1活性之肽尤其有利於誘導體重減輕或預防體重增長以及治療高血糖(包括糖尿病)，藉此，GIP促效劑活性與GLP-1促效劑活性之組合對體重減輕產生比單獨GLP-1更大之影響。
促胰島素多肽與抗體或抗體片段之結合假設性地概述於(例如)WO 2010/011439、US 6,329,336及US 7,153,825中。
本發明所揭示之一態樣係包含1、2、3或4個天然存在或合成腸 促胰島素受體配體多肽之Fc區結合物，該等多肽各自以共價方式連接至Fc區，其中該結合物包含胺基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：73)，其中X視情況係酸性胺基酸，例如D或E。舉例而言，該胺基酸序列可為LPETG(SEQ ID NO：74)。
已發現，將抗體重鏈Fc區329位置處之脯胺酸殘基變成甘胺酸會抑制FcγRIIIA與FcγRIIA受體結合並抑制ADCC及CDC。已進一步發現，組合突變P329G及(例如)L234A與L235A(在本文中稱為「LALA」之雙點突變)對C1q、FcγRI、FcγRIIA及FcγRIIIA產生意外的強烈抑制。因此，已發現，與其他胺基酸取代(如丙胺酸)相比，329位置為甘胺酸殘基意外地有利。
本發明所揭示之一態樣係包含1至4個腸促胰島素受體配體多肽及(變體)人類Fc區之Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物(在本文中亦稱為「Fc區結合物」)，其中在Fc區中包含329位置處之天然存在胺基酸殘基之突變及至少一個選自包含228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及331位置處之胺基酸殘基之群之胺基酸至不同殘基之至少一個其他突變，其中該Fc區中之該等殘基係根據Kabat之EU索引編號。與未經修飾(野生型)Fc區相比，改變胺基酸殘基會改變Fc區之效應子功能。
在一實施例中，與包含野生型IgG Fc區之融合多肽或結合物相比，該融合物或結合物之(變體)人類Fc區具有降低之與人類FcγRIIIA及/或FcγRIIA及/或FcγRI之親和力。
在一實施例中，與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC相比，由包含(變體)人類Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC降低至少20%。
在一實施例中，人類Fc區係人類IgG1同種型或人類IgG4同種型之人類Fc區。
在本文所述包含LPXTG(SEQ ID NO：75)或LPETG(SEQ ID NO：74)之融合多肽或結合物之一實施例中，融合多肽或結合物中之人類Fc區中329位置處之胺基酸殘基經甘胺酸或精胺酸、或大至足以破壞Fc區內脯胺酸三明治結構之胺基酸殘基取代。
在一實施例中，Fc區中之至少一個胺基酸之至少一個其他突變係S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D及/或P331S。在一實施例中，Fc區中之至少一個其他突變係L234A與L235A，若Fc區屬於人類IgG1同種型；或S228P與L235E，若Fc區屬於人類IgG4同種型。S228P與L235E之雙點突變在本文中稱為「SPLE」。
在一實施例中，與包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物相比，該融合多肽或結合物具有降低之與包含人類FcγI受體、人類FcγIIA受體及C1q之群中之至少一種其他受體之親和力。
在一實施例中，由該融合多肽或結合物誘導之血栓細胞凝集與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之血栓細胞凝集相比降低。
在一實施例中，與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之CDC相比，該融合多肽或結合物具有降低之CDC。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物之Fc區包含SEQ ID NO：42至56中之任一者之胺基酸序列。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物之腸促胰島素受體配體多肽包含SEQ ID NO：1至39、76及77中之任一者之胺基酸序列。
在例示性態樣中，該腸促胰島素受體配體多肽係經由連接體連接至Fc區且該連接體包含SEQ ID NO：57至69及82至94中之任一者之胺基酸序列。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：95)，其中X係AIB。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：96)，其中X係AIB。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：97)，其中X係AIB。
在例示性態樣中，Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：98)，其中X係AIB。
在例示性態樣中，將Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物與一或多種醫藥上可接受之載劑組合。因此，本文提供包含如本文所述Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物及一或多種醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物之用途，其用作藥劑。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物用於治療疾病之用途，其中有利的是該融合多肽或結合物之效應子功能與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之效應子功能相比降低。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物用於製造用於治療疾病之藥劑之用途，其中有利的是該融合多肽或結合物之效應子功能與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之效應子功能相比降低。
本發明所揭示之一態樣係治療患有疾病之個體之方法，該方法包含向個體投與有效量之本發明所揭示之融合多肽或結合物，其中有 利的是該融合多肽或結合物之效應子功能與由包含野生型人類Fc區之融合多肽或結合物誘導之效應子功能相比降低。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物之用途，其用於將ADCC下調至少20%(與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC相比)及/或用於下調ADCP，其中野生型人類IgG Fc區中之Pro329經甘胺酸取代，其中該等殘基係根據Kabat之EU索引編號，且其中該融合多肽或結合物展示降低之與人類FcγRIIIA及FcγRIIA之親和力。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物之用途，其用於將ADCC下調至少20%(與由包含野生型人類IgG Fc區之多肽誘導之ADCC相比)及/或用於下調ADCP，其中該Fc區屬於人類IgG種類且至少包含胺基酸取代P329G及L234A與L235A(若為人類IgG1 Fc區)或S228P與L235E(若為人類IgG4 Fc區)，其中該等殘基係根據Kabat之EU索引編號，其中該融合多肽或結合物具有降低之與人類FcγRIIIA及FcγRIIA之親和力。
本發明所揭示之一態樣係治療患有疾病之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明所揭示之包含胺基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：75)或LPETG(SEQ ID NO：74)之融合多肽或結合物，其中人類IgG Fc區之Pro329經甘胺酸取代，其中該等殘基係根據Kabat之EU索引編號，其中該融合多肽或結合物之特徵在於與包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物相比降低之與FcγRIIIA及/或FcγRIIA之結合。在例示性實施例中，該融合多肽或結合物之人類IgG Fc區係至少具有胺基酸取代P329G及L234A與L235A之人類IgG1 Fc區之變體，其中該等殘基係根據Kabat之EU索引編號。在例示性實施例中，該融合多肽或結合物之人類IgG Fc區係具有至少胺基酸取代P329G及S228P與L235E之人類IgG4 Fc區之變體，其中該等殘基係根 據Kabat之EU索引編號。
在例示性態樣中，該疾病係本文在標題為「THERPEUTIC METHODS AND COMPOSITIONS」之部分中所述者。
在一實施例中，該疾病係2型糖尿病或胰島素抗性。
在一實施例中，該疾病係肥胖。
在一實施例中，該疾病係1型糖尿病。
在一實施例中，該疾病係骨質疏鬆症。
在一實施例中，該疾病係脂肪性肝炎或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一實施例中，該疾病係代謝症候群。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物係與另一2型糖尿病藥物組合投與。在一實施例中，該另一2型糖尿病藥物係胰島素。
在一實施例中，本發明所揭示之包含胺基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：75)或LPETG(SEQ ID NO：74)之融合多肽或結合物包含至少兩個其他胺基酸取代L234A與L235A(根據Kabat之EU索引編號)(若為人類IgG1 Fc區)或S228P與L235E(根據Kabat之EU索引編號)(若為人類IgG4 Fc區)。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物包含一個腸促胰島素受體配體多肽。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物包含兩個腸促胰島素受體配體多肽。
在一實施例中，將一個腸促胰島素受體配體多肽融合或結合至Fc區多肽鏈之N端。
在一實施例中，將腸促胰島素受體配體多肽中之每一者融合或結合至一個Fc區多肽鏈之N端。藉此將每一Fc區多肽鏈僅融合或結合 至一個腸促胰島素受體配體多肽。
在一實施例中，將一個腸促胰島素受體配體多肽融合或結合至一個Fc區多肽鏈之C端。
在一實施例中，將腸促胰島素受體配體多肽中之每一者融合或結合至一個Fc區多肽鏈之C端，藉此將每一Fc區多肽鏈僅融合或結合至一個腸促胰島素受體配體多肽。
在一實施例中，將一個腸促胰島素受體配體多肽融合或結合至Fc區多肽鏈之N端並將一個腸促胰島素受體配體多肽融合或結合至相同或不同Fc區多肽鏈之C端。
在一實施例中，使兩個腸促胰島素受體配體多肽與相同Fc區多肽鏈融合。
在一實施例中，使兩個腸促胰島素受體配體多肽與不同Fc區多肽鏈融合。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係選自GIP、GLP-1、促胰島素分泌素-3、促胰島素分泌素-4、雙重GIP-GLP-1促效劑、三重GIP-GLP-1-升糖素受體促效劑、嵌合GIP/GLP促效劑及其前體、衍生物或功能片段。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含GLP-1(7-37)(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG,SEQ ID NO：01)、或具有腸促胰島素受體配體活性之其前體、衍生物或片段。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含GLP-1(7-36)(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR,SEQ ID NO：02)、或具有腸促胰島素受體配體活性之其前體、衍生物或片段。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含促胰島素分泌素-3(HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS,SEQ ID NO：03)、或具有腸促胰島素受體配體活性之其前體、衍生物 或片段。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含促胰島素分泌素-4(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS,SEQ ID NO：04)、或具有腸促胰島素受體配體活性之其前體、衍生物或片段。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係SEQ ID NO：01至04中之任一者之衍生物且展示腸促胰島素受體配體活性。在例示性態樣中，該衍生物包含相對於SEQ ID NO：01至04具有1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)胺基酸修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：01至04。在例示性態樣中，該衍生物包含與SEQ ID NO：01至04中之一者具有至少65%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，該衍生物可包含與SEQ ID NO：01至04中之一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少97.5%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列促胰島素分泌素-4(1-31)desGlu(17)Tyr(32)(HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY,SEQ ID NO：05)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列促胰島素分泌素-4(1-30)Tyr(31)(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY,SEQ ID NO：06)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列促胰島素分泌素-4(9-39)(DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS,SEQ ID NO：07)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：08)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：09)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：10)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：11)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：12)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：13)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：14)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：15)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：16)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：17)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：18)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：19)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR(SEQ ID NO：20)，其中X=K或R。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS(SEQ ID NO：21)(雜交GLP-1/促胰島素分泌素多肽)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(SEQ ID NO：22)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(SEQ ID NO：23)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：24)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：25)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY(SEQ ID NO：26)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序 列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY(SEQ ID NO：27)。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS(SEQ ID NO：28)。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係天然升糖素(SEQ ID NO：76)之衍生物且展示升糖素受體配體活性、GLP-1受體配體活性及/或GIP受體配體活性。在例示性態樣中，該衍生物包含相對於SEQ ID NO：76具有1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)胺基酸修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：76。在例示性態樣中，該衍生物包含與SEQ ID NO：76具有至少65%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，該衍生物可包含與SEQ ID NO：76具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少97.5%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係GLP-1(SEQ ID NO：1或2)之衍生物且展示GLP-1受體配體活性。在例示性態樣中，該衍生物包含分別相對於SEQ ID NO：1或2具有1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)胺基酸修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：1或2。在例示性態樣中，該衍生物包含與SEQ ID NO：1或2具有至少65%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，該衍生物可包含與SEQ ID NO：1或2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少97.5%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係GIP(SEQ ID NO：77)之衍生物且展示GIP受體配體活性。在例示性態樣中，該衍生物包含相對於SEQ ID NO：77具有1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)胺基酸修飾之胺基 酸序列SEQ ID NO：77。在例示性態樣中，該衍生物包含與SEQ ID NO：77具有至少65%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，該衍生物可包含與SEQ ID NO：77具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少97.5%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係促胰島素分泌素-3或-4(分別為SEQ ID NO：3或4)之衍生物且展示促胰島素分泌素配體活性。在例示性態樣中，該衍生物包含分別相對於SEQ ID NO：3或4具有1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)胺基酸修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：3或4。在例示性態樣中，該衍生物包含與SEQ ID NO：3或4具有至少65%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，該衍生物可包含與SEQ ID NO：3或4具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少97.5%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
根據本發明之一些實施例，腸促胰島素受體配體多肽係具有GIP促效劑活性之升糖素(SEQ ID NO：76)之類似物，其中該類似物包含相對於SEQ ID NO：76具有以下之SEQ ID NO：76：(a)賦予GIP促效劑活性之1位置處之胺基酸修飾、(b)穩定該類似物之C端部分(胺基酸12至29)之α螺旋結構之修飾及(c)視情況1至10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)其他胺基酸修飾。在一些實施例中，該類似物在GIP受體下展示為天然GIP至少約1%之活性或WO2010/011439中所述在GIP受體下之任一其他活性程度。在例示性態樣中，該類似物在GIP受體下之EC50與其在GLP-1受體下之EC50相差小於約50倍。
在某些實施例中，穩定α螺旋結構之修飾係提供或引入分子內橋 (包括(例如)共價分子內橋，例如WO2010/011439中所述彼等中之任一者)之修飾。在一些實施例中，共價分子內橋係內醯胺橋。該等實施例之類似物之內醯胺橋可為如本文所述之內醯胺橋。例如，參見WO2010/011439中「Stabilization of the Alpha Helix Structure」部分下之內醯胺橋之教示內容。舉例而言，內醯胺橋可為位於i位置與i+4位置處之胺基酸之側鏈之間或位於j位置與j+3位置處之胺基酸之側鏈之間者，其中i係12、13、16、17、20或24，且其中j係17。在某些實施例中，內醯胺橋可位於16位置與20位置處之胺基酸之間，其中16位置與20位置處之胺基酸中之一者經Glu取代且16位置與20位置處之胺基酸中之另一者經Lys取代。
在替代實施例中，穩定α螺旋結構之修飾係在該類似物16、20、21及24位置處引入1個、2個、3個或4個α,α-二取代之胺基酸。在一些實施例中，α,α-二取代之胺基酸係AIB。在某些態樣中，α,α-二取代之胺基酸(例如，AIB)係位於20位置處且16位置處之胺基酸經本文所述帶正電荷之胺基酸(例如，式IV之胺基酸)取代。式IV之胺基酸可為高Lys、Lys、Orn或2,4-二胺基丁酸(Dab)。
在本發明之特定態樣中，1位置處之胺基酸修飾係用不含咪唑側鏈之胺基酸(例如較大芳族胺基酸(例如，Tyr))取代His。
在某些態樣中，升糖素之類似物包含27、28位置及29位置中之一者、兩者或全部該等位置處之胺基酸修飾。舉例而言，27位置處之Met可經較大脂肪族胺基酸、視情況Leu取代，28位置處之Asn可經較小脂肪族胺基酸、視情況Ala取代，29位置處之Thr可經較小脂肪族胺基酸、視情況Gly取代，或前述兩者或三者之組合。在特定實施例中，升糖素之類似物包含27位置處之Leu、28位置處之Ala及29位置處之Gly或Thr。
在本發明之某些實施例中，升糖素之類似物包含C端1至21個胺 基酸至29位置處之胺基酸之延伸部分。該延伸部分可包含(例如)胺基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：78)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：79)。另外或另一選擇為，升糖素之類似物可包含延伸部分之1至6個胺基酸係帶正電荷之胺基酸的延伸部分。帶正電荷之胺基酸可為式IV之胺基酸， 其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6，R1及R2中之每一者獨立地選自由下列組成之群：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)環烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5雜環)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7及(C1-C4烷基)(C3-C9雜芳基)，其中R7係H或OH，且式IV之胺基酸之側鏈包含游離胺基。在例示性態樣中，式IV之胺基酸係Lys、高Lys、Orn或Dab。
此外，在一些實施例中，升糖素(SEQ ID NO：76)之類似物相對於SEQ ID NO：76包含以下修飾中之任一者或組合：(a)2位置處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val或α-胺基-N-丁酸取代；(b)10位置處之Tyr經Trp、Orn、Glu、Phe或Val取代；(c)12位置處之Lys經Arg或Ile取代；(d)16位置處之Ser經Glu、Gln、高麩胺酸、高氧化半胱胺酸、Thr、Gly或AIB取代；(e)17位置處之Arg經Gln取代； (f)18位置處之Arg經Ala、Ser、Thr或Gly取代；(g)20位置處之Gln經Ser、Thr、Ala、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn或AIB取代；(h)21位置處之Asp經Glu、高麩胺酸、高氧化半胱胺酸取代；(i)23位置處之Val經Ile取代；(j)24位置處之Gln經Asn、Ser、Thr、Ala或AIB取代；(k)及2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、24、27、28及29位置中任一者處之保守取代。
在例示性實施例中，具有GIP促效劑活性之升糖素(SEQ ID NO：76)之類似物包含以下修飾：(a)賦予GIP促效劑活性之1位置處之胺基酸修飾，(b)位於i位置與i+4位置處之胺基酸之側鏈之間或位於j位置與j+3位置處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、20或24，且其中j係17，(c)27、28及29位置中之一者、兩者或全部該等位置處之胺基酸修飾，例如，27及/或28位置處之胺基酸修飾，及(d)相對於SEQ ID NO：76之1至9個或1至6個其他胺基酸修飾，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個其他胺基酸修飾，且該類似物關於GIP受體活化之EC50為約10nM或更小。在例示性態樣中，該類似物在GIP受體下之EC50與其在GLP-1受體下之EC50相差小於約50倍。
該等實施例之類似物之內醯胺橋可為如本文所述之內醯胺橋。例如，參見WO2010/011439中在「Stabilization of the Alpha Helix Structure」部分下之內醯胺橋之教示內容，舉例而言，該內醯胺橋可位於16位置與20位置處之胺基酸之間，其中16位置與20位置處之胺基 酸中之一者經Glu取代且16位置與20位置處之胺基酸中之另一者經Lys取代。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係具有GIP促效劑活性及以下修飾之升糖素之類似物：(a)賦予GIP促效劑活性之1位置處之胺基酸修飾，(b)該類似物16、20、21及24位置處之胺基酸中之一者、兩者、三者或全部該等位置經α,α-二取代之胺基酸取代，(c)27、28及29位置中之一者、兩者或全部該等位置處之胺基酸修飾，及(d)相對於天然升糖素(SEQ ID NO：76)之1至9個或1至6個其他胺基酸修飾，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個其他胺基酸修飾，其中該類似物關於GIP受體活化之EC50為約10nM或更小。在例示性態樣中，該類似物在GIP受體下之EC50與其在GLP-1受體下之EC50相差小於約50倍。
該等實施例之類似物之α,α-二取代之胺基酸可為任一α,α-二取代之胺基酸，包括(但不限於)胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基及正丁基之相同或不同基團或經環辛烷或環庚烷二取代之胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-甲酸)。在一實施例中，α,α-二取代之胺基酸係胺基異丁酸(aib)。
在又一些例示性實施例中，具有GIP促效劑活性之升糖素(SEQ ID NO：76)之類似物包含以下修飾：(a)賦予GIP促效劑活性之1位置處之胺基酸修飾，(b)16位置處之Ser經式IV之胺基酸之胺基酸取代： 其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6，R1及R2中之每一者獨立地選自由下列組成之群：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)環烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5雜環)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7及(C1-C4烷基)(C3-C9雜芳基)，其中R7係H或OH，且式IV之胺基酸之側鏈包含游離胺基，(c)20位置處之Gln經α,α-二取代之胺基酸之胺基酸取代，(d)27、28及29位置中之一者、兩者或全部該等位置處之胺基酸修飾，例如，27及/或28位置處之胺基酸修飾，及(e)1至9個或1至6個其他胺基酸修飾，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個其他胺基酸修飾，且該類似物關於GIP受體活化之EC50為約10nM或更小。在例示性態樣中，該類似物在GIP受體下之EC50與其在GLP-1受體下之EC50相差小於約50倍。
該等實施例之類似物之式IV之胺基酸可為任一胺基酸，例如，式IV之胺基酸，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在某些實施例中，n係2、3、4或5，在該情形下，該胺基酸分別係Dab、Orn、Lys或高Lys。
該等實施例之類似物之α,α-二取代之胺基酸可為任一α,α-二取代之胺基酸，包括(但不限於)胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基及正丁基之相同或不同基團或經環辛烷或環庚烷二取代之胺基酸 (例如，1-胺基環辛烷-1-甲酸)。在某些實施例中，α,α-二取代之胺基酸係AIB。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：29)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：30)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：31)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG(SEQ ID NO：32)，其中X=aib。本發明所揭示之一態樣係包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG(SEQ ID NO：32)之腸促胰島素受體配體多肽，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGG(SEQ ID NO：33)，其中X=aib。本發明所揭示之一態樣係包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGG(SEQ ID NO：33)之腸促胰島素受體配體多肽，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC(SEQ ID NO：34)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC(SEQ ID NO：35)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：36)，其中X=aib。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC(SEQ ID NO：37)，其中X=aib且在殘基16與殘基20之間具有內醯胺環。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC(SEQ ID NO：38)，其中X=aib且在殘基16與殘基20之間具有內醯胺環。
在一實施例中，該腸促胰島素受體配體多肽係或包含胺基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG(SEQ ID NO：39)，其中X=aib且在殘基16與殘基20之間具有內醯胺環。
圖1
藉由表面電漿共振(SPR)使用BIAcore T100儀器(GE Healthcare)在25℃下量測不同FcγR對免疫球蛋白之結合親和力。
a)具有不同變體Fc區(IgG1-P329G、IgG4-SPLE及IgG1-LALA)之抗-CD20抗體及具有不同變體Fc區(IgG1-P329G、IgG1-LALA及IgG4-SPLE)之抗-P-選擇素抗體以及包含野生型Fc區之該等抗體之FcγRI結合親和力。
b)具有不同Fc區(IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、IgG4-SPLE/P329G)之抗-CD9抗體之FcγRI結合親和力。
c)具有不同Fc區(IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、SPLE/P329G)之抗-CD9抗體之 FcγRIIA結合親和力；顯示正規化反應隨受體濃度之變化。
d)具有不同Fc區(IgG1-野生型、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-LALA、IgG1-LALA/P329G)之抗-CD9抗體及具有不同Fc區(IgG4-野生型、IgG4-SPLE)之抗-P-選擇素抗體之FcγRIIB結合親和力。
e)具有不同Fc區(IgG1-野生型、IgG4-SPLE、IgG1-LALA、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-P329G、IgG1-LALA/P329G)之抗-CD9抗體之FcγRIIIAV158結合親和力；顯示正規化反應隨受體濃度之變化。
圖2
具有不同Fc區(IgG1野生型、P329G、IgG4-SPLE)之抗-P-選擇素抗體及具有不同Fc區(IgG1-野生型、P329G及IgG4-SPLE)之抗-CD20抗體之C1q結合。
圖3
募集免疫效應子細胞之效力：將Fc區變體塗佈於ELISA板上並添加經人類FcγRIIIA轉染之人類效應子細胞。使用酯酶分析來量測經活化NK細胞之細胞溶解活性之誘導。
a)具有不同Fc區(野生型、LALA、P329G、P329G/LALA)之抗-CD20抗體；b)具有不同Fc區(P329R、P329G)之抗-CD9抗體。
圖4
募集免疫效應子細胞之效力：使用經人類FγcRIIIA轉染之人類效應子細胞作為效應子並使用CD20陽性Raji細胞作為靶標細胞。
a)具有不同Fc區(P329G、LALA及P329G/LALA)之非糖改造之抗-CD20抗體；b)具有不同Fc區(P329G、P329A及LALA)之糖改造之抗-CD20抗體；對照：非糖改造之抗-CD20抗體。
圖5
補體依賴性細胞毒性(CDC)分析：分析具有不同Fc區之不同抗體之效率以調介SUDH-L4靶標細胞上之CDC。
a)具有不同Fc區(P329G、LALA及P329G/LALA)之非糖改造之抗-CD20抗體；b)具有不同Fc區(P329G、P329A及LALA)之糖改造之抗-CD20抗體。
圖6
a)人類IgG1變體之Fc-相關聚糖之碳水化合物譜。對含有LALA、P329G、P329A或P329G/LALA突變之hIgG1之Fc-相關寡糖的半乳糖基化百分比與野生型抗體的半乳糖基化百分比僅有極小差異。
b)相對半乳糖基化：引入IgG1 P329G/LALA突變的4種不同IgG。比較4種不同V-結構域在Hek293 EBNA細胞中表現時之半乳糖基化之量。
圖7
全血分析中抗體誘導之血小板凝集。鼠類IgG1誘導血小板凝集，如針對兩種供體所測定，該等供體之差異在於其對抗體濃度依賴性之反應。
a)供體A，b)供體B。
圖8
分選酶(sortase)調介之轉肽反應之SDS-PAGE分析。
圖9
在雄性DIO小鼠中單次投與化合物肽-長-G3Fc及肽-短-G3Fc(20nmol/kg,s.c.)後體重增長過程(部分a))及5天累積攝食量(部分b))。媒劑：三角形/1；人類IgG1Fc區對照：圓形/2；肽-短-G3Fc：倒三角形/3；肽-長-G3Fc：正方形/4。
圖10
在投與雄性db/db小鼠化合物肽-長-G3Fc及肽-短-G3Fc(20nmol/kg,s.c.)後反應腹膜內葡萄糖激發之葡萄糖波動過程(10a：ipGTT；10b：AUC ipGTT)。對於圖10a而言，媒劑：三角形；人類IgG1Fc區對照：圓形；肽-短-G3Fc：倒三角形；肽-長-G3Fc：正方形。對於圖10b而言，媒劑：1；人類IgG1Fc區對照：2；肽-短-G3Fc：3；肽-長-G3Fc：4。
圖11
在投與雄性db/db小鼠化合物肽-長-G3Fc及肽-短-G3Fc(20nmol/kg,s.c.)後反應腹膜內葡萄糖激發之劑量依賴性葡萄糖波動過程(11a：ipGTT；11b：AUC ipGTT)。對於圖11a而言，人類IgG1Fc區對照：圓形；1nmol/kg肽-長-G3Fc：倒三角形；3nmol/kg肽-長-G3Fc：三角形；10nmol/kg肽-長-G3Fc：正方形。對於圖11b而言，人類IgG1Fc區對照：1；1nmol/kg肽-長-G3Fc：2；3nmol/kg肽-長-G3Fc：3；10nmol/kg肽-長-G3Fc：4。
I.定義
在本說明書及申請專利範圍中，免疫球蛋白重鏈Fc區中殘基之編號係Kabat之EU索引之編號(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH出版社，91-3242，其明確地以引用方式併入本文中)。術語「Kabat之EU索引」表示人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「親和力」表示分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原或Fc受體)間之非共價相互作用的總強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和力」係指反映結合對成員(例如，抗體 /Fc受體或抗體及抗原)間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由業內已知之常用方法(包括本文所述之彼等)來量測。
術語「改變」表示可獲得變體抗體或融合多肽之(例如)至少包含Fc區之FcRn結合部分之抗體或融合多肽之親代胺基酸序列中一或多個胺基酸殘基之突變、添加或缺失。
術語「胺基酸突變」表示親代胺基酸序列之胺基酸序列修飾。例示性修飾包括胺基酸取代、插入及/或缺失。在一實施例中，胺基酸突變係取代。術語「...處之胺基酸突變」表示指定殘基之取代或缺失、或毗鄰指定殘基之至少一個胺基酸殘基之插入。術語「毗鄰指定殘基插入」表示在其1至2個殘基內插入。插入可係至指定殘基之N末端或C端。
術語「胺基酸取代」表示用不同「代替」胺基酸殘基代替預定親代胺基酸序列中之至少一個胺基酸殘基。代替殘基可係「天然存在胺基酸殘基」(即由遺傳密碼編碼)且係選自由以下組成之群：丙胺酸(Ala)；精胺酸(Arg)；天冬醯胺酸(Asn)；天冬胺酸(Asp)；半胱胺酸(Cys)；麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)；甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)；異白胺酸(Ile)；白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)；甲硫胺酸(Met)；苯丙胺酸(Phe)；脯胺酸(Pro)；絲胺酸(Ser)；蘇胺酸(Thr)；色胺酸(Trp)；酪胺酸(Tyr)；及纈胺酸(Val)。在一實施例中，代替殘基不為半胱胺酸。本文中胺基酸取代之定義亦涵蓋用一或多個非天然存在胺基酸殘基取代。「非天然存在胺基酸殘基」表示除彼等上文所列示天然存在胺基酸殘基外之殘基，其能夠以共價方式結合多肽鏈中之毗鄰胺基酸殘基。非天然存在胺基酸殘基之實例包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸、aib及其他胺基酸殘基類似物，例如彼等於Ellman等人，Meth.Enzym.202(1991)301-336中所闡述者。為生成該等非天 然存在胺基酸殘基，可使用Noren等人(Science 244(1989)182)及/或Ellman等人(見上文)之程序。簡言之，該等程序涉及用非天然存在胺基酸殘基以化學方式活化抑制劑tRNA，隨後進行RNA之活體外轉錄及轉譯。非天然存在胺基酸亦可經由化學肽合成及該等肽與重組產生之多肽(例如抗體或抗體片段)之後續融合納入肽中。
術語「胺基酸插入」表示將至少一個額外胺基酸殘基納入預定親代胺基酸序列中。儘管插入通常將由一或兩個胺基酸殘基之插入組成，但本申請案涵蓋較大「肽插入」，例如約3個至約5個或甚至至多約10個胺基酸殘基之插入。經插入殘基可係如上文所定義之天然存在或非天然存在殘基。
術語「胺基酸缺失」表示去除胺基酸序列中預定位置處之至少一個胺基酸殘基。
術語「抗體變體」表示野生型抗體之變體，其特徵在於在抗體變體胺基酸序列中存在胺基酸序列相對於野生型胺基酸序列之至少一個改變，例如由野生型抗體中一或多個胺基酸殘基之突變引入。
在本申請案內，每當提及胺基酸改變時，其均係特意胺基酸改變而非隨意胺基酸修飾。
術語「抗體依賴性細胞調介細胞毒性」(簡稱「ADCC」)表示表現FcR之非抗原特異性細胞毒性細胞(例如天然殺手細胞(NK細胞)、嗜中性球及巨噬細胞)藉由結合至免疫球蛋白Fc區識別靶標細胞且隨後引起靶標細胞溶解的細胞調介反應。用於調介ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁表3中。
術語「抗體依賴性細胞吞噬作用」(簡稱「ADCP」)表示塗佈抗體之細胞由結合免疫球蛋白Fc區之吞噬性免疫細胞(例如巨噬細胞、 嗜中性球及樹突細胞)整個地或部分地內在化的過程。
術語「結合至Fc受體」表示在(例如)BIAcore(R)分析(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)中Fc區與Fc受體之結合。
在BIAcore(R)分析中，使Fc受體與表面結合並藉由表面電漿共振(SPR)來量測分析物(例如包含Fc區之融合多肽或抗體)之結合。結合之親和力定義為以下各項：ka(締合常數：Fc區融合多肽或結合物締合以形成Fc區/Fc受體複合物之速率常數)、kd(解離常數；Fc區融合多肽或結合物自Fc區/Fc受體複合物解離之速率常數)及KD(kd/ka)。另一選擇為，可在共振信號高度及解離性質方面直接比較SPR感測圖之結合信號與參考之反應信號。
術語「C1q」表示包括免疫球蛋白之Fc區之結合位點的多肽。C1q連同兩種絲胺酸蛋白酶C1r及C1s一起形成補體依賴性細胞毒性(CDC)路徑之第一組份C1複合物。人類C1q可購自(例如)Quidel,San Diego,Calif。
術語「腸促胰島素受體配體多肽」表示結合至升糖素受體或/及升糖素樣肽-I(GLP-1)受體、或/及葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)受體之天然存在或合成多肽，即對該等受體中之至少一者具有促效劑活性之分子。
在一實施例中，腸促胰島素受體配體多肽結合至葡萄糖依賴性促胰島素肽受體。在一實施例中，腸促胰島素受體配體多肽結合至葡萄糖依賴性促胰島素肽受體及升糖素樣肽-I受體。在一實施例中，腸促胰島素受體配體多肽結合至葡萄糖依賴性促胰島素肽受體及升糖素樣肽-I受體及升糖素受體。
當血糖開始降低時，升糖素(由胰臟產生之激素)向肝臟發信號以分解糖原並釋放葡萄糖，以使血糖含量朝正常含量升高。GLP-I具有與升糖素不同的生物活性。其作用包括刺激胰島素合成及分泌、抑制 升糖素分泌及抑制攝食量。已顯示GLP-I降低糖尿病中之高血糖(葡萄糖含量升高)。促胰島素分泌素-4(與GLP-I具有約50%胺基酸序列一致性之來自蜥蜴毒液之肽)活化GLP-I受體且同樣已顯示降低糖尿病中之高血糖。葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)係在葡萄糖存在下刺激胰臟β細胞分泌胰島素之42個胺基酸胃腸調控肽。其係自133個胺基酸前體preproGIP藉由蛋白水解處理得到。
本發明所揭示之融合多肽或結合物包含具有對天然升糖素序列之修飾且展示高效升糖素活性(等效於或優於天然升糖素之活性)、高效GIP活性(等效於或優於天然GIP之活性)及/或高效GLP-I活性(等效於或優於天然GLP-I之活性)的腸促胰島素受體配體。
本發明所揭示之融合多肽或結合物之影響包括葡萄糖恆定、胰島素分泌、胃排空、腸生長、攝食量調控。同時具有GIP活性及GLP-I活性之肽尤其有利於誘導體重減輕或預防體重增長、以及治療高血糖(包括糖尿病)。
腸促胰島素受體配體多肽包括(但不限於)GLP-1、促胰島素分泌素-3、促胰島素分泌素-4及其前體、衍生物或片段。例示性腸促胰島素受體配體多肽係報告於US 5,574,008、US 5,424,286、US 6,514,500、US 6,821,949、US 6,887,849、US 6,849,714、US 6,329,336、US 6,924,264、WO 2003/103572、US 6,593,295、WO 2011/109784、WO 2010/011439、US 6,329,336及US 7,153,825中。
術語「CH2結構域」表示抗體重鏈多肽自EU 231位置大致延伸至EU 340位置(Kabat之EU編號系統)之部分。在一實施例中，CH2結構域具有胺基酸序列APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：40)。該CH2結構域之獨特之處在 於其不與另一結構域緊密地配對。而是，將兩條N-連接之具支鏈碳水化合物鏈插入完整天然Fc區之兩個CH2結構域之間。已推測該碳水化合物可取代結構域-結構域配對且有助於穩定CH2結構域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
術語「CH3結構域」表示抗體重鏈多肽自EU 341位置大致延伸至EU 446位置之部分。在一實施例中，CH3結構域具有胺基酸序列GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：41)。
抗體之「種類」表示其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。在人類中存在5種主要抗體種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干可進一步分成子類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
術語「補體依賴性細胞毒性」(簡稱「CDC」)表示誘導細胞死亡之機制，其中靶標結合Fc區融合多肽或結合物之Fc區活化以在靶標細胞膜中形成孔洞終結之一系列酶促反應。通常，抗原-抗體複合物(諸如彼等塗佈抗體之靶標細胞上者)結合並活化補體組份C1q，其進而活化補體級聯，從而導致靶標細胞死亡。補體活化亦可導致補體組份沈積於靶標細胞表面上，該等補體組份藉由結合白血球上之補體受體(例如，CR3)來促進ADCC或ADCP。
「效應子功能」表示可歸因於抗體Fc區之彼等生物活性，其會隨抗體同種型而變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調介細胞毒性(ADCC)；吞噬作用(ADCP)；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。此功能可藉由(例如)Fc區與具有吞噬或溶解活性之免 疫細胞上之Fc受體的結合或Fc區與補體系統之組份的結合來實現。
術語「降低之效應子功能」表示與分子相關之特定效應子功能(例如ADCC或CDC)與對照分子(例如具有野生型Fc區之多肽)相比降低至少20%。術語「顯著降低之效應子功能」表示與分子相關之特定效應子功能(例如ADCC或CDC)與對照分子相比降低至少50%。
術語藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」表示在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc區」表示免疫球蛋白之C端區。Fc區係包含二硫鍵連接之抗體重鏈片段(Fc區多肽鏈)且視情況包含1個、2個、3個或更多個二硫鍵之二聚分子。Fc區可藉由木瓜酶消化或IdeS消化、或胰蛋白酶消化完整(全長)抗體來生成或以重組方式產生。
自全長抗體或免疫球蛋白獲得之Fc區包含殘基226(Cys)至全長重鏈之C端，且因此包含鉸鏈區之一部分及2個或3個恆定結構域(即CH2結構域、CH3結構域及視情況CH4結構域)。自US 5,648,260及US 5,624,821獲知，Fc區中經界定胺基酸殘基的改變會產生表型效應。
包含兩個相同或不同抗體重鏈片段之二聚Fc區之形成係由所包含CH3結構域之非共價二聚調介(對於所涉及胺基酸殘基，例如，參見Dall’Acqua,Biochem.37(1998)9266-9273)。藉由在鉸鏈區中形成二硫鍵來以共價方式穩定Fc區(例如，參見Huber等人，Nature 264(1976)415-420；Thies等人，J.Mol.Biol.293(1999)67-79)。為破壞CH3-CH3結構域之二聚相互作用而在CH3結構域內引入胺基酸殘基變化不會不利地影響新生Fc受體(FcRn)結合，因為參與CH3-CH3-結構域二聚之殘基之位置係位於CH3結構域之內界面上，而參與Fc區-FcRn相互作用之殘基係位於CH2-CH3結構域之外部。
與Fc區之效應子功能相關之殘基係位於鉸鏈區、CH2及/或CH3結構域中，如對全長抗體分子所測定。Fc區相關/調介之功能係： (i)抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)，(ii)補體(C1q)結合、活化及補體依賴性細胞毒性(CDC)，(iii)抗原-抗體複合物之吞噬作用/清除率，(iv)一些情況下細胞介素釋放在，及(v)抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。
Fc區相關效應子功能係由Fc區與效應子功能特定分子或受體之相互作用引起的。IgG1同種型之大多數抗體會影響受體活化，而IgG2及IgG4同種型之抗體不具有效應子功能或具有有限的效應子功能。
誘發效應子功能之受體係Fc受體類型(及子類)FcγRI、FcγRII及FcγRIII。可藉由在下游鉸鏈區中引入特異性胺基酸變化(例如L234A及/或L235A，其參與FcγR與C1q之結合)來降低與IgG1同種型相關之效應子功能。此外，尤其位於CH2及/或CH3結構域中之某些胺基酸殘基與抗體分子或Fc區融合多肽在血流中之循環半衰期相關。循環半衰期取決於Fc區與新生Fc受體(FcRn)之結合。
存於Fc區糖結構上之唾液酸基(sialyl)殘基參與Fc區之抗炎調介活性(例如，參見Anthony,R.M.等人Science 320(2008)373-376)。
抗體恆定區中之胺基酸殘基係根據Kabat之EU索引編號(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIH Publication 91 3242)。
術語「人類來源Fc區」表示含有鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域之至少一部分之人類來源免疫球蛋白重鏈之C端區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自約Cys226或自約Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，可存在或可不存在Fc區之C端離胺酸(Lys447)。
術語「變體Fc區」表示因至少一個「胺基酸改變/突變」而不同於「天然」或「野生型」Fc區胺基酸序列之胺基酸序列。在一實施 例中，變體Fc區與天然Fc區相比或與親代多肽之Fc區相比在天然Fc區或親代多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸突變，例如約1至約10個胺基酸突變，且在一實施例中約1至約5個胺基酸突變。在一實施例中，(變體)Fc區與野生型Fc區及/或與親代多肽之Fc區具有至少約80%同源性，且在一實施例中，變體Fc區具有至少約90%同源性，在一實施例中，變體Fc區具有至少約95%同源性。
本發明所揭示之變體Fc區定義為所包含之胺基酸改變。因此，舉例而言，術語P329G表示相對於親代(野生型)Fc區在胺基酸位置329處具有脯胺酸至甘胺酸突變之變體Fc區。可未指定野生型胺基酸之身份，在此情形下，將上述變體稱為329G。對於本發明中所論述之所有位置，均係根據EU索引編號。EU索引或如Kabat或EU編號方案中之EU索引係指EU抗體之編號(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85，其以全文引用方式併入本文中)。改變可係添加、缺失或突變。術語「突變」表示天然存在胺基酸之變化以及非天然存在胺基酸之變化，例如，參見US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.及Schultz,P.G.，ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等人，PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；及Wang,L.及Schultz，P.G.,Chem.(2002)1-10(全部以全文引用方式併入本文中)。
IgG1同種型之野生型人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：42)。
具有突變L234A、L235A之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：43)。
具有孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：44)。
具有隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：45)。
具有L234A、L235A及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：46)。
具有L234A、L235A及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：47)。
具有P329G突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：48)。
具有L234A、L235A及P329G突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：49)。
具有P329G及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：50)。
具有P329G及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：51)。
具有L234A、L235A、P329G及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：52)。
具有L234A、L235A、P329G及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：53)。
IgG4同種型之野生型人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：54)。
具有S228P與L235E突變之IgG4同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：55)。
具有S228P、L235E及P329G突變之IgG4同種型之變體人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：56)。
術語「Fc受體」(簡稱「FcR」)表示結合至Fc區之受體。在一實施例中，FcR係天然序列人類FcR。此外，在一實施例中，FcR係結合IgG抗體(Fcγ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體的FcR，包括該等受體之對偶基因變體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包括具有類似胺基酸序列之FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，該等胺基酸序列主要在其細胞質結構域上不同。活化受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)(例如，參見Daëron,M.,Annu.Rev.Immunol.15(1997)203-234)。FcR綜述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492；Capel等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括彼等在將來鑑別者。該術語亦包括負責將母體IgG轉移至胎中之新生受體FcRn(例如，參見Guyer等人，J.Immunol.117(1976)587；Kim等人，J.Immunol.24(1994)249)。
術語「IgG Fc配體」表示來自任一有機體之結合至IgG抗體之Fc區以形成Fc區/Fc配體複合物之分子，在一實施例中表示來自任一有 機體之結合至IgG抗體之Fc區以形成Fc區/Fc配體複合物之多肽。Fc配體包括(但不限於)FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白G及病毒FcγR。Fc配體亦包括Fc受體同源物(FcRH)，其係與FcγR同源之Fc受體家族(例如，參見Davis等人，Immunological Reviews 190(2002)123-136，其以全文引用方式併入本文中)。Fc配體可包括未發現之結合Fc之分子。在一實施例中，IgG Fc配體係FcRn及Fc γ受體。
術語「Fc γ受體」(簡稱「FcγR」)表示結合IgG抗體Fc區且由FcγR基因編碼之蛋白家族之任一成員。在人類中，此家族包括(但不限於)FcγRI(CD64)，包括亞型FcγRIA、FcγRIB及FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括亞型FcγRIIA(包括同種異型H131及R131)、FcγRIIB(包括FcγRIIB-1及FcγRIIB-2)及FcγRIIC；及FcγRIII(CD16)，包括亞型FcγRIIIA(包括同種異型V158及F158)及FcγRIIIB(包括同種異型FcγRIIB-NAI及FcγRIIB-NA2)(例如，參見Jefferis等人，Immunol.Lett.82(2002)57-65，其以全文引用方式併入本文中)以及任何未發現之人類FcγR或FcγR亞型或同種異型。FcγR可來自任何有機體，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、兔及猴。小鼠FcγR包括(但不限於)FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未發現之小鼠FcγR或FcγR亞型或同種異型。參與Fc區-FcγR相互作用之胺基酸殘基係234至239(下游鉸鏈區)、265至269(B/C環)、297至299(D/E環)及327至332(F/G)環(Sondermann等人，Nature 406(2000)267-273)。達成降低之對FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及/或FcγRIIIA之結合/親和力之胺基酸突變包括N297A(伴有降低之免疫原性及延長之半衰期結合/親和力)(Routledge等人，Transplantation 60(1995)847；Friend等人，Transplantation 68(1999)1632；Shields等人，J.Biol.Chem.276(1995)6591-6604)、殘基233至236(Ward及 Ghetie，Ther.Immunol.2(1995)77；Armour等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。一些例示性胺基酸取代闡述於US 7,355,008及US 7,381,408中。
術語「新生Fc受體」(簡稱「FcRn」)表示結合IgG抗體Fc區且至少部分地由FcRn基因編碼之蛋白。FcRn可來自任何有機體，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、兔及猴。如業內已知，功能FcRn蛋白包含兩種多肽，通常稱為重鏈及輕鏈。輕鏈係β-2-微球蛋白且重鏈係由FcRn基因編碼。除非本文另有說明，否則FcRn或FcRn蛋白係指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白之複合物。Fc區與FcRn之相互作用胺基酸殘基處於CH2結構域與CH3結構域之接合處附近。Fc區-FcRn接觸殘基全部在單一IgG重鏈內。所涉及胺基酸殘基係248、250至257、272、285、288、290至291、308至311及314(全部在CH2結構域中)及胺基酸殘基385至387、428及433至436(全部在CH3結構域中)。達成增加之對FcRn之結合/親和力之胺基酸突變包括T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
術語「野生型多肽」或「親代多肽」表示未經修飾(野生型多肽)或已含有至少一個不同於該野生型(親代多肽)之改變且隨後經改變以生成變體之起始多肽。術語「野生型多肽」表示該多肽自身、包含該多肽之組合物或編碼其之核酸序列。因此，術語「野生型Fc區多肽或結合物」表示包含經改變以生成變體之天然存在Fc區之Fc區融合多肽或結合物。
術語「全長抗體」表示具有與天然抗體結構實質上相同之結構及胺基酸序列以及包含本發明所揭示之Fc區之多肽的抗體。
術語「鉸鏈區」表示抗體重鏈多肽連結CH1結構域與CH2結構域之部分，例如約216位置至約230位置(根據Kabat之EU編號系統)。其他IgG同種型之鉸鏈區可與該IgG1同種型序列之鉸鏈區半胱胺酸殘基 比對來確定。
鉸鏈區一般係由兩個具有相同胺基酸序列之多肽組成的二聚分子。鉸鏈區通常包含約25個胺基酸殘基且具有允許抗原結合區獨立地移動之撓性。鉸鏈區可細分為三個結構域：上游鉸鏈結構域、中游鉸鏈結構域及下游鉸鏈結構域(例如，參見Roux等人，J.Immunol.161(1998)4083)。
術語Fc區之「下游鉸鏈區」表示緊接C端之胺基酸殘基至鉸鏈區之伸展，即Fc區之殘基233至239(根據Kabat之EU編號)。
術語「野生型Fc區」表示與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列相同的胺基酸序列。野生型人類Fc區包括天然人類IgG1 Fc區(非A及A同種異型)、天然人類IgG2 Fc區、天然人類IgG3 Fc區及天然人類IgG4 Fc區以及其天然存在變體。
「相對於參考多肽序列之胺基酸序列一致性百分比(%)定義為在比對序列並引入間隔(視需要)以達到最大序列一致性百分比後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比，且任何保守取代皆不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成比對，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，胺基酸序列一致性%之值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼已與用戶文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其係以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始碼進行編譯。 ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆係藉由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2比較胺基酸序列之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to、with或against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(另一選擇為，其可表述為具有或包含相對於給定胺基酸序列B之一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下來計算：100乘以分數X/Y
其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2在該程式對A與B之比對中評定為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%之值皆係如前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈容許所含活性成份之生物活性有效之形式且不含對投與該調配物之受試者具有不可接受之毒性之其他組份之製劑。
「醫藥上可接受之載劑」係指除活性成份以外醫藥調配物中對受試者無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「位置」表示胺基酸殘基在多肽之胺基酸序列中之定位。可依序或根據確定格式(例如用於抗體編號之Kabat之EU索引)來對位置編號。
術語「治療」(及其語法變形，例如「treat」或「treating」)表示嘗試改變所治療個體之自然過程的臨床幹預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、 預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態以及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「變體」表示胺基酸序列不同於親代多肽之胺基酸序列之多肽。通常，該等分子具有一或多個改變、插入或缺失。在一實施例中，變體胺基酸序列與親代胺基酸序列具有小於100%序列一致性。在一實施例中，變體胺基酸序列之胺基酸序列與親代多肽之胺基酸序列具有約75%至小於100%胺基酸序列一致性。在一實施例中，變體胺基酸序列與親代多肽之胺基酸序列具有約80%至小於100%、在一實施例中約85%至小於100%、在一實施例中約90%至小於100%且在一實施例中約95%至小於100%胺基酸序列一致性。
術語「改變」FcR結合親和力或ADCC活性表示多肽之FcR結合活性及/或ADCC活性與親代多肽(例如包含野生型Fc區之多肽)相比增強或減弱。對FcR「具有增加之結合」之變體多肽以低於親代或野生型多肽之解離常數(即更佳/更高之親和力)結合至少一個FcR。對FcR「具有降低之結合」之多肽變體以高於親代或野生型多肽之解離常數(即更差/更低之親和力)結合至少一個FcR。與野生型或親代IgG Fc區相比，該等展示降低之與FcR之結合之變體可具有極低或不具有可感知之與FcR之結合，例如，0-20%之與FcR之結合，例如如本文所述實例中所確定。
以與親代或野生型多肽相比「降低之親和力」結合FcR之多肽係當結合分析中之多肽變體及親代多肽之量(基本上)大致相同時，以與親代多肽相比(實質上)降低之結合親和力結合上文所鑑別FcR中任一者或多者之多肽。舉例而言，具有降低之FcR結合親和力之多肽變體與親代多肽相比可展示FcR結合親和力降低至20/23至約1/100，例如約5/6至約1/50，其中FcR結合親和力係如(例如)本文所揭示實例中所 揭示來確定。
比親代多肽「在人類效應子細胞存在下以更低之有效性調介抗體依賴性細胞調介細胞毒性(ADCC)的包含Fc區之多肽」係當用於分析中之變體多肽與親代多肽之量(基本上)大致相同時，在活體外或活體內以(實質上)更低之有效性調介ADCC者。通常，該等變體將使用如本文所揭示活體外ADCC分析來鑑別，但涵蓋確定(例如)動物模型等中之ADCC活性的其他分析或方法。在一實施例中，變體係在(例如)本文所揭示之活體外分析中以為親代之約2/3至約1/100(例如約1/2至約1/50)之有效性調介ADCC。
術語「受體」表示能夠結合至少一種配體之多肽。在一實施例中，受體係具有細胞外配體結合結構域及視情況其他結構域(例如跨膜結構域、細胞內結構域及/或膜錨著點)之細胞表面受體。欲在本文所述分析中評價之受體可係完整受體或其片段或衍生物(例如包含融合至一或多種異源多肽之受體之結合結構域的融合蛋白)。此外，欲評價結合性質之受體可存在於細胞中或經分離且視情況塗佈於分析板或一些其他固相上。
術語「受體結合結構域」表示受體之任一天然配體(包括細胞黏附分子)或該天然配體之保留對應天然配體之至少一種定性受體結合能力的任一區域或衍生物。此定義尤其明確包括上述受體之配體之結合序列。
II. FC區融合多肽或結合物
在本文中報告包含變體Fc區之Fc區融合多肽或結合物。然而，親代多肽可為任一包含Fc區之多肽。
本發明係部分地基於以下發現：包含Fc區之融合多肽或結合物之Fc區中所定義位置處之兩個突變之組合達成Fc區相關效應子功能之徹底降低。
誘發效應子功能之Fc區之選擇取決於該Fc區融合多肽或結合物之預期用途。
若期望用途係可溶性靶標之功能性中和，則應選擇不誘發效應子功能之同種型或變體。
若期望用途係去除靶標，則應選擇誘發效應子功能之同種型或變體。
若期望用途係細胞結合靶標之拮抗，則應選擇不誘發效應子功能之同種型或變體。
若期望用途係去除靶標呈現細胞(target presenting cell)，則應選擇誘發效應子功能之同種型或變體。
調節Fc區-FcRn相互作用會影響Fc區融合多肽或結合物之循環半衰期。此可藉由改變Fc區中之特異性胺基酸殘基來達成(Dall’Acqua,W.F.等人，J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524；Petkova,S.B.等人，Internat.Immunol.18(2006)1759-1769；Vaccaro,C.等人Proc.Natl.Acad.Sci.103(2007)18709-18714)。
抗體依賴性細胞調介之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)之最小化或甚至去除可藉由所謂的鉸鏈區胺基酸變化/取代來達成。所選用於取代之胺基酸殘基係彼等預計參與Fc區與人類Fc受體(但不為FcRn)之結合者。與包含野生型IgG Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，此/該等胺基酸殘基變化達成改良之安全特徵。
經典補體級聯始於藉助抗原/IgG免疫複合物之C1q之結合及活化。此活化產生炎性及/或免疫調控反應。經典補體級聯之活化之最小化或甚至去除可藉由所謂的鉸鏈區胺基酸變化/取代來達成。所選用於取代之胺基酸殘基係彼等預計參與Fc區與組份C1q之結合者。具有降低或甚至消除之C1q結合之一種例示性Fc區變體係包含突變L234A與L235A(LALA)之Fc區變體。
Fc區融合多肽或結合物與新生受體(FcRn)之結合導致該多肽穿過胎盤輸送且影響該Fc區融合多肽或結合物之循環半衰期。Fc區融合多肽或結合物之循環半衰期之增加達成改良之功效、降低之劑量或投與頻率、或改良之對靶標之定位。Fc區融合多肽或結合物之循環半衰期之降低導致降低之全身暴露或提高之靶標結合對非靶標結合之比率。
FcRn結合所需之物種間保守的胺基酸殘基係Fc區中310及435位置處之組胺酸殘基。該等殘基負責Fc區FcRn相互作用之pH依賴性(例如，參見Victor,G.等人，Nature Biotechnol.15(1997)637-640)；Dall’Acqua,W.F.等人，J.Immunol.169(2002)5171-5180)。減弱與FcRn相互作用之Fc區突變會減小抗體半衰期。
通常，親代Fc區融合多肽或結合物之Fc區包含野生型Fc區或改變之Fc區。在一實施例中，Fc區係人類來源之Fc區。然而，親代Fc區融合多肽或結合物之Fc區與野生型Fc區相比可能已具有一或多個胺基酸序列改變。舉例而言，親代Fc區之C1q或FcγR結合活性可能已經改變(下文將更詳細地闡述其他類型之Fc區修飾)。在一實施例中，親代Fc區係「概念上的」，且當其實際上不存在時，抗體改造可取決於所用變體Fc區。
在一實施例中，改變編碼親代Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物之多個部分之核酸以生成編碼變體Fc區融合多肽或Fc區結合物之部分之變體核酸序列。
編碼變體Fc區融合多肽或Fc區結合物之一部分之胺基酸序列之核酸可藉由多種業內已知方法來製備。該等方法包括(但不限於)藉由對先前製備之編碼Fc區融合多肽之DNA實施定點(或寡核苷酸介導之)誘變、PCR誘變及盒式誘變來製備，或可藉由DNA合成以化學方式生成。
定點誘變係製備取代變體之適宜方法。此技術為業內熟知(例 如，參見Carter等人，Nucl.Acids Res.13(1985)4431-4443；Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)488)。簡言之，在實施DNA之定點誘變時，藉由首先使編碼期望突變之寡核苷酸與此起始DNA之單鏈雜交來改變起始DNA。在雜交後，使用DNA聚合酶來合成整個第二鏈，其中使用雜交寡核苷酸作為引物且使用起始DNA之單鏈作為模板。因此，將編碼期望突變之寡核苷酸納入所得雙鏈DNA中。
PCR誘變亦適於製備起始多肽之胺基酸序列變體(例如，參見Higuchi，PCR Protocols,Academic Press(1990)，第177頁至第183頁，Vallette等人，Nucl.Acids Res.17(1989)723-733)。簡言之，當使用少量模板DNA作為PCR中之起始材料時，可使用在序列上與模板DNA中之對應區域略有不同之引物來生成相對大量之特異性DNA片段，該片段僅在引物與模板不同之位置處與模板序列不同。
製備變體之另一方法盒式誘變係基於由Wells等人，Gene 34(1985)315-323闡述之技術。
本發明所揭示之一態樣係包含抗體Fc區(在一實施例中人類抗體Fc區)之Fc區融合多肽或結合物，其中已藉由添加、突變或缺失改變至少一個胺基酸殘基，從而達成降低或除去之Fc區融合多肽或結合物對至少一種Fc受體之親和力，此係與包含親代或野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物比較而言。
Fc區與許多受體或配體相互作用，包括(但不限於)Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、補體蛋白CIq及其他分子(例如蛋白A及G)。該等相互作用對於多種效應子功能及下游信號傳導事件至關重要，包括(但不限於)抗體依賴性細胞調介細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在一實施例中，與包含親代或野生型Fc區之Fc區融合多肽或結 合物相比，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物包含具有降低或除去之對Fc受體之親和力且可誘發效應子功能之Fc區，其中Fc區融合多肽或結合物之胺基酸序列與親代Fc區融合多肽或結合物之胺基酸序列之不同之處在於至少一個胺基酸殘基之至少一個添加、突變或缺失。
在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物具有以下性質中之至少一者或多者：降低或除去之效應子功能(ADCC及/或CDC及/或ADCP)、降低或除去之與Fc受體之結合、降低或除去之與C1q之結合或降低或除去之毒性。
在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物包含至少具有329位置處(根據Kabat之EU索引)之脯胺酸胺基酸殘基之突變或缺失之Fc區。
若胺基酸序列缺失一個胺基酸殘基，儘管其餘胺基酸殘基保持其EU索引編號，但在胺基酸序列中之實際位置發生變化以允許精確鑑別多突變Fc區中之特異性胺基酸殘基。
在一實施例中，Fc區融合多肽或結合物包含具有329位置(根據Kabat之EU索引)處之胺基酸突變之野生型人類Fc區。在一實施例中，Fc區包含至少一個其他胺基酸突變。
在一實施例中，Fc區融合多肽或結合物包含具有胺基酸取代、缺失或添加之野生型人類Fc區，該胺基酸取代、缺失或添加降低或減弱Fc區中之脯胺酸三明治結構之功能。
在一實施例中，將Fc區中胺基酸位置329處之脯胺酸殘基突變為小於或大於脯胺酸之胺基酸殘基。在一實施例中，將該胺基酸殘基突變為甘胺酸、丙胺酸或精胺酸。在一實施例中，將Fc區中329位置處之胺基酸殘基脯胺酸(根據Kabat之EU索引)突變為甘胺酸。
在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物包含具有至少兩個胺基酸突變、添加或缺失之野生型Fc區。
在一實施例中，與包含野生型人類Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物具有降低之與人類Fc受體(FcγR)及/或人類補體受體之親和力。
在一實施例中，與包含野生型人類Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物包含具有降低之與人類Fc受體(FcγR)及/或人類補體受體之親和力之Fc區。
在一實施例中，融合多肽或結合物中之Fc區與FcγRI、FcγRII及/或FcγRIIIA中之至少一者之親和力降低。在一實施例中，與FcγRI及FcγRIIIA之親和力降低。在一實施例中，與FcγRI、FcγRII及FcγRIIIA之親和力降低。
在一實施例中，與FcγRI、FcγRIIIA及C1q之親和力降低。
在一實施例中，與FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA及C1q之親和力降低。
在一實施例中，由本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物誘導之ADCC與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比降低。在一實施例中，與由包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物誘導之ADCC相比，該ADCC降低至少20%。
在一實施例中，由包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物誘導之ADCC及CDC降低或除去。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物具有降低之ADCC、CDC及ADCP。
在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物在Fc區中包含至少一個選自包含S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D及P331S之群之胺基酸取代。
在一實施例中，野生型Fc區係人類IgG1 Fc區或人類IgG4 Fc區。
在一實施例中，除329位置處之胺基酸殘基脯胺酸突變以外，該Fc區融合多肽或結合物在Fc區中亦包含至少一個其他與增加之該融合多肽或結合物之穩定性相關之胺基酸殘基之添加、突變或缺失。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物與FcR之親和力係包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物之親和力的最多10%至20%。
在一實施例中，若Fc區屬於IgG4同種型，則本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物中之胺基酸殘基之該其他添加、突變或缺失係在Fc區228及/或235位置處。在一實施例中，228位置處之胺基酸殘基絲胺酸及/或235位置處之胺基酸殘基白胺酸經另一胺基酸取代。在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含228位置處之脯胺酸殘基(絲胺酸殘基至脯胺酸殘基之突變)。在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含235位置處之麩胺酸殘基(白胺酸殘基至麩胺酸殘基之突變)。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含三個胺基酸突變。在一實施例中，該三個胺基酸突變係P329G、S228P及L235E突變(P329G/SPLE)。
在一實施例中，若Fc區屬於IgG1同種型，則本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物中之胺基酸殘基之該其他添加、突變或缺失係在Fc區234及/或235位置處。在一實施例中，將234位置處之胺基酸殘基白胺酸及/或235位置處之胺基酸殘基白胺酸突變為另一胺基酸。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含包含234位置處之胺基酸突變之Fc區，其中將白胺酸胺基酸殘基突變為丙胺酸胺基酸殘基。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含包含235位置處之胺基酸突變之Fc區，其中將白胺酸胺基酸殘基突變為絲胺酸胺基酸殘基。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含包含329位置處之胺基酸突變(其中將脯胺酸胺基酸殘基突變為甘胺酸胺基酸殘基)、234位置處之胺基酸突變(其中將白胺酸胺基酸殘基突變為丙胺酸胺基酸殘基)及235位置處之胺基酸突變(其中將白胺酸胺基酸殘基突變為丙胺酸胺基酸殘基)之Fc區。
儘管在一實施例中與FcγR之結合發生改變，但具有改變之對新生受體(FcRn)之結合親和力之Fc區融合多肽或結合物亦係本發明所揭示之態樣之實施例。
具有增加之對FcRn之親和力之Fc區變體具有較長血清半衰期，且該等分子將在期望所投與Fc區融合多肽或結合物之長半衰期之治療哺乳動物之方法中具有有用應用，例如，以治療慢性疾病或病症。
具有降低之FcRn結合親和力之Fc區融合多肽或結合物具有較短血清半衰期，且該等分子將在期望所投與Fc區融合多肽或結合物之較短半衰期之治療哺乳動物之方法中具有用於應用，例如，以避免有毒副作用或用於活體內診斷性成像應用。具有降低之FcRn結合親和力之Fc區融合多肽或結合物不太可能穿過胎盤，且因此可用於治療懷孕女性之疾病或病症。
在一實施例中，具有改變之對FcRn之結合親和力之Fc區融合多肽或結合物包含彼等包含在以下一或多個胺基酸位置處具有胺基酸改變之Fc區者：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439及/或447。
在一實施例中，具有降低之與FcRn之結合之Fc區融合多肽或結合物包含在胺基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439及/或447處具有一或多個胺基酸改變 之Fc區。
在一實施例中，展示增加之與FcRn之結合之Fc區融合多肽或結合物包含在以下胺基酸位置處具有一或多個胺基酸改變之Fc區：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及/或434。
該Fc區融合多肽或結合物可包含任一種類(例如(但不限於)IgG、IgM及IgE)之Fc區。在一實施例中，Fc區融合多肽或結合物包含IgG種類之Fc區。在一實施例中，Fc區融合多肽或結合物包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類之Fc區。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含IgG1子類之Fc區且在該Fc區中包含胺基酸突變P329G及/或L234A與L235A。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含IgG4子類之Fc區。在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物包含IgG4子類之Fc區且在該Fc區中包含胺基酸突變P329G及/或S228P與L235E。
在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物係藉由將生物活性多肽與包含一或多個本發明所揭示之胺基酸突變之Fc區重組融合或結合來產生。在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物係藉由引入一或多個本發明所揭示之胺基酸突變修飾親代Fc區融合多肽或結合物來產生。
使用分選酶A之酶促結合
可藉由使用酶分選酶A來獲得包含Fc區及一或多個腸促胰島素受體配體多肽之結合物。
分選酶A(SrtA)係使蛋白以共價方式附接至細菌細胞壁之膜結合酶。SrtA受質上之特異性識別基序係LPXTG(SEQ ID NO：75)，該酶憑藉該基序在殘基蘇胺酸與甘胺酸之間進行切割。肽聚醣上之識別基序係五甘胺酸基序。已顯示，N端上之三甘胺酸且甚至二甘胺酸基序 足以支撐SrtA反應(Clancy,K.W.等人，Peptide science 94(2010)385-396)。該反應藉助硫酯醯基-酶中間體進行，該中間體受到來自寡甘胺酸之胺親核劑攻擊而解體，進而使肽聚醣以共價方式連接至蛋白受質並重新生成SrtA。SrtA可用於使化學合成肽以共價方式結合至重組表現蛋白。
對於腸促胰島素受體配體多肽(例如具有GIP受體及GLP-1受體雙重促效活性)與子類IgG1之人類Fc區之酶促結合而言，可使用可溶性SrtA(60至206個胺基酸殘基之金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)SrtA)。該酶可在大腸桿菌(E.coli)中產生。每條重鏈皆具有N端三重G基序之Fc區可表現於真核細胞(例如HEK293細胞、CHO細胞)中。將SrtA識別基序引入腸促胰島素受體配體多肽之C端。
本發明所揭示之一態樣係藉由使用酶分選酶A使腸促胰島素受體配體多肽與Fc區結合而獲得之Fc區腸促胰島素受體配體多肽結合物，其中分選酶識別序列係位於腸促胰島素受體配體多肽之C端及/或一個或兩個Fc區重鏈片段之C端，且其中三重甘胺酸基序係位於腸促胰島素受體配體多肽之N端及/或一個或兩個Fc區重鏈片段之N端。
因此，本發明提供包含腸促胰島素受體配體多肽之胺基酸序列及分選酶識別序列之胺基酸序列之多肽。在例示性態樣中，本發明提供包含腸促胰島素受體配體多肽之胺基酸序列及LPXTG(SEQ ID NO：75)之多肽，其中X係任一胺基酸。在例示性態樣中，X係酸性胺基酸，例如，Asp、Glu。在例示性態樣中，X係Glu。在例示性態樣中，該多肽包含以N端至LPXTG(SEQ ID NO：75)之一或多個Gly殘基，其中X係任一胺基酸。在替代或其他實施例中，該多肽包含以C端至LPXTG(SEQ ID NO：73)之Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：79)、Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：80)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：81)。在例示性態樣中， 該多肽包含(GGS)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：82至84)；或Gn，其中n=2至6(SEQ ID NO：85至87)；(GGGS)n，其中n=1至6(SEQ ID NO：57至60、88及89)；(GGGGS)m，其中m=1至6(SEQ ID NO：61至64、90及91；或(GGGGGS)o，其中o=1至6(SEQ ID NO：65至67及92至94)。
在一實施例中，Fc區重鏈片段中之一者或兩者包含位於三重G基序之C端與Fc區重鏈之N端之間的連接體多肽。
在一實施例中，腸促胰島素受體配體多肽包含位於SrtA識別序列之N端與腸促胰島素受體配體多肽之C端之間的連接體多肽。
在一實施例中，連接體多肽具有9至25個胺基酸殘基之長度。在一實施例中，連接體多肽係選自(GGGS)3(SEQ ID NO：57)、(GGGS)4(SEQ ID NO：58)、(GGGS)5(SEQ ID NO：59)、(GGGS)6(SEQ ID NO：60)、(GGGGS)2(SEQ ID NO：61)、(GGGGS)3(SEQ ID NO：62)、(GGGGS)4(SEQ ID NO：63)、(GGGGS)5(SEQ ID NO：64)、(GGGGGS)2(SEQ ID NO：65)、(GGGGGS)3(SEQ ID NO：66)及(GGGGGS)4(SEQ ID NO：67)。
在例示性態樣中，本發明提供包含腸促胰島素受體配體多肽之胺基酸序列及連接體(例如包含SEQ ID NO：57至67中之任一者之胺基酸序列之連接體)之多肽。
在一實施例中，該融合多肽或結合物包含一個腸促胰島素受體配體多肽。在此實施例中，腸促胰島素受體配體多肽係結合至Fc區之單一N端或C端。此外，在此實施例中，Fc區係兩個抗體重鏈Fc區片段中僅一者包含腸促胰島素受體配體多肽或寡甘胺酸基序之異源二聚體。
包含結合至兩個腸促胰島素受體配體多肽之人類IgG1 Fc區之結合物(其因活化GIP受體及GLP-1受體而具有雙重促效性質)可用於控制 血糖含量及達成強效脂肪質量損失。
已顯示，此結合物已使得在患糖尿病db/db小鼠中在腹膜內葡萄糖激發後降低血糖波動。另外，在飲食誘導之肥胖(DIO)小鼠中，已觀察到，投與此腸促胰島素受體配體多肽Fc區結合物能夠誘導降低之食物吸收且在單次投用後達成強效體重減輕。
腸促胰島素受體(例如GLP-1受體及GIP受體)之活化達成葡萄糖依賴性胰島素分泌、增殖及保護胰臟β細胞免於脂毒性、及預防由PKA及/或EPAC活化之下游路徑調介之凋亡(Dzhura,I.等人，Islets 3(2011)121-128；Ehses,J.A.等人，Endocrin.144(2003)4433-4445；Kang,G.等人，J.Biol.Chem.278(2003)8279-8285；Miura,Y.及Matsui,H.,Tox.Appl.Pharmacol.216(2006)363-372；Mukai,E.等人，Diabetes 60(2011)218-226；Natalicchio,A.等人，Endocrin.151(2010)2019-2029；Quoyer,J.等人，J.Biol.Chem.285(2010)1989-2002；Uhles,S.等人，Diabetes Obes.Metabol.13(2010)326-336)。
此外，已在分泌升糖素之胰臟α-細胞中檢測到腸促胰島素受體(例如GLP-1及GIP受體)。
據報導，腸促胰島素受體(例如GLP-1受體)存在於迷走神經中並且廣泛分佈於CNS中。據報導，門脈GLP-1受體之活化在葡萄糖恆定中發揮關鍵作用(Burcelin,R.等人，Diabetes 50(2001)1720-1728；Vahl,T.P.等人，Endocrin.148(2007)4965-4973)。另外，表現於弓狀核中之GLP-1受體參與調控葡萄糖含量(Sandoval,D.A.等人，Diabetes 57(2008)2046-2054)。
後腦及下視丘中GLP-1受體之活化在限制攝食量及預防肥胖中發揮重要作用(Hayes,M.R.等人，Endocrinol.150(2009)2654-2659；McMahon,L.R.及Wellman,P.J.,Am.J.Physiol.274(1998)R23-29； Turton,M.D.等人，Nature 379(1996)69-72)。
GIP受體及GIP受體係存於CNS中。認為CNS中之GIP在神經生成及記憶中發揮作用(Figueiredo,C.P.等人，Behav.Pharmacol.21(2010)394-408；Nyberg,J.等人，J.Neurosci.25(2005)1816-1825)。
腸促胰島素受體(例如GIP受體)係存於脂肪細胞上且誘導脂肪酸之脂肪分解及再酯化(Getty-Kushik,L.等人，Obesity 14(2006)1124-1131)。另外，GIP受體活化會增加人類脂肪細胞上之LPL表現(Kim,S.J.等人，J.Biol.Chem.282(2007)8557-8567；Kim,S.J.等人，J.Lipid Res.51(2010)3145-3157)。
降低之與Fc配體之結合
熟習此項技術者應理解，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物具有經改變(相對於未經修飾之Fc區融合多肽或結合物)FcγR及/或C1q結合性質(結合性質之實例包括(但不限於)結合特異性、平衡解離常數(KD)、解離及締合速率(分別為koff及kon)、結合親和力及/或結合性)且或多或少地期望某些變化。業內已知，平衡解離常數(KD)定義為kd/ka。熟習此項技術者可確定對於給定應用最重要之動力學參數。舉例而言，降低與一或多種正性調控物(例如，FcγRIIIA)之結合及/或增強與抑制性Fc受體(例如，FcγRIIB)之結合的修飾將適於降低ADCC活性。因此，結合親和力之比率(例如，平衡解離常數(KD))可指示ADCC活性增強抑或降低。另外，降低與C1q之結合的修飾將適於降低或消除CDC活性。
其配體之Fc區之親和力及結合性質可藉由業內已知測定Fc區/FcR相互作用(即，Fc區與FcγR之特異性結合)之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫學之分析)來測定，包括(但不限於)平衡方法(例如，酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如，BIACORE®分析)及其他方法，例如間接結合分析、競爭抑制分 析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及化學層析(例如，凝膠過濾)。該等及其他方法可在所檢查組份之一或多者上利用標記及/或採用多種檢測方法，包括(但不限於)發色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細說明可參見Paul,W.E.(編輯)，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)。
在一實施例中，與包含親代Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之包含變體Fc區(其中胺基酸位置329處之胺基酸殘基脯胺酸發生突變且其中至少一個其他胺基酸殘基發生突變)之Fc區融合多肽或結合物展示降低之與人類Fc受體(FcR)及/或人類補體之親和力。在一實施例中，本發明所揭示之Fc區融合多肽或結合物對Fc受體之親和力係包含野生型人類Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對一或多種Fc受體(包括(但不限於)FcγRI(CD64)，包括亞型FcγRIA；FcγRII及FcγRIII(CD 16，包括亞型FcγRIIIA))之結合親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對FcγRI(CD64)FcγRIIA及FcγRIIIA之結合親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對FcγRIIA及FcγRIIIA之結合親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相 比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對FcγRI(CD64)及FcγRIIIA之結合親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對Fc受體中之至少一者之結合親和力及降低之與C1q之親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物不具有增加之與FcγRIIB受體之結合。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有增加之與人類受體FcγRIIIA及與包含人類受體FcγIIA、FcγRIIIB及C1q之群中之至少一種其他受體之親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之與人類受體FcγRIIIA及與包含人類受體FcγIIA、FcγRIIIB及C1q之群中之至少兩種其他受體之親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之與人類FcγRIA、FcγRIIIA、FcγIIA、FcγRIIIB及C1q之親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之與人類受體FcγRIA、FcγRIIIA、FcγIIA、FcγRIIIB及C1q之親和力。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之與FcγRI或FcγRIIA之親和力。在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物對FcγRI或FcγRIIA之親和力係包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多 1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物對FcγRI或FcγRIIA之親和力比包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物小至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對FcγRIIIA之親和力。在一實施例中，對FcγRIIIA之親和力係包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物對FcγRIIIA之親和力比包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物小至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%。
業內應理解，FcγRIIIA之F1-58V對偶基因變體具有改變之與Fc區之結合特性。在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之與FcγRIIIA(F1-58V)受體之親和力。在一實施例中，對FcγRIIIA(F1 58V)之親和力係包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有降低之對C1q之親和力。在一態樣 中，對C1q之親和力係包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物對C1q之親和力比包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物小至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物對人類FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1 58V)或C1q之親和力比包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物小至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物與FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1-58V)及/或C1q之親和力分別為介於約10nM至100nM、10nM至1μM、100nM至約100μM、或約100nM至約10μM、或約100nM至約1μM、或約1nM至約100μM、或約10nM至約100μM、或約1μM至約100μM、或約10μM至約100μM之間。在一實施例中，對FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1-58V)或C1qare之親和力大於100nM、500nM、1μM、大於5μM、大於10μM、大於25μM、大於50μM或大於100μM。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該Fc區融合多肽或結合物具有增加之對FcγRIIB之親和力。在一實施例中，對FcγRIIB之親和力未變化或增加到包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50 倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。在一實施例中，與包含野生型Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，對FcγRIIB受體之親和力增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。
在一實施例中，該Fc區融合多肽或結合物與FcγRI、FcγRIIAFcγRIIIA或FcγRIIIA(F1-58V)、或C1q之親和力小於100μM、小於50μM、小於10μM、小於5μM、小於2.5μM、小於1μM、或小於100nM或小於10nM。
降低之效應子功能
在本發明之某些態樣中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物調節效應子功能。
在一實施例中，該調節係ADCC及/或ADCP及/或CDC之調節。
在一實施例中，該調節係效應之下調或降低。
在一實施例中，該調節ADCC之調節。在一實施例中，該調節係ADCC及/或ADCP之下調。
在一實施例中，該調節係ADCC及CDC之下調。在一實施例中，該調節僅係ADCC之下調。在一實施例中，該調節係ADCC及CDC及/或ADCP之下調。在一實施例中，該調節係ADCC、CDC及ADCP之下調或降低。
在一實施例中，ADCC及/或CDC及/或ADCP之降低或下調分別係降低至針對由包含野生型Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC及/或CDC及/或ADCP所觀察到之值的0%、2.5%、5%、10%、20%、50%或75%。
在一實施例中，ADCC之調節係使得該融合多肽或結合物之EC50值與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比降低至多約9/10的效力 降低。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物在人類效應子細胞存在下實質上全無ADCC及/或CDC及/或ADCP。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物之效應子功能降低(例如降低至少20%)或顯著降低(例如降低至少50%)，其可為ADCC、CDC及/或ADCP之下調或降低。
降低之ADCC活性
可使用活體外及/或活體內細胞毒性分析來確定CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可使用Fc受體(FcR)結合分析以確保融合多肽或結合物缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於調介ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於下列中：US 5,500,362；Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；US 5,821,337或Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361。亦可使用非放射性活性分析方法。舉例而言，可使用用於流式細胞儀之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性活性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。用於該等分析之有用效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。另一選擇為，或另外，可在活體內評估該融合多肽或結合物之ADCC活性，例如，在動物動物模型(例如Clynes等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所報導者)中。亦可實施C1q結合分析以證實該融合多肽或結合物不結合C1q且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中所報導之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Meth.202(1996)163；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
本發明涵蓋藉由活體外功能分析來表徵本發明所揭示之融合多肽或結合物以確定一或多種FcγR調介之效應子細胞功能。
在某些實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物在活體內模型(例如彼等本文中所闡述及揭示者)中具有與彼等基於活體外之分析中之結合性質及效應子細胞功能類似的結合性質及效應子細胞功能。然而，不排除本發明所揭示之融合多肽或結合物在基於活體外之分析中不展示期望表現型，但在活體內展示期望表現型。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低之ADCC活性。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物之ADCC活性係包含野生型Fc區之融合多肽或結合物的至多1/2或至多1/3、或至多1/5、或至多1/10、或至多1/50、或至多1/100。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物之ADCC活性相對於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物降低至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物降低或下調 之ADCC活性係分別針對由包含野生型Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC或CDC或ADCP所觀察到之值的0%、2.5%、5%、10%、20%、50%或75%。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物不具有可檢測到之ADCC活性。
在一實施例中，ADCC活性之降低及/或除去係因本發明所揭示之融合多肽或結合物與Fc配體及/或受體之親和力降低所致。
在一實施例中，ADCC之下調係使得本發明所揭示之融合多肽或結合物之EC50值與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比降低約10倍的效力降低。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物可調節ADCC及/或CDC及/或ADCP。在一實施例中，該融合多肽或結合物具有降低之CDC及ADCC及/或ADCP活性。
降低之CDC活性
補體活化路徑始於補體系統(C1q)之第一組份與與同源抗原複合之分子(例如包含Fc區之分子)的結合。為評估補體活化，可實施CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202(1996)163中所述。
可藉由ELISA三明治結構型免疫分析來分析本發明所揭示之不同融合多肽或結合物與C1q之結合性質。最大反應一半時的融合多肽或結合物濃度係用以判定EC50值。此讀出值報告為在相同培養板上所量測之相對於參考標準物之差異連同樣品與參考物之變異係數。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物相對於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物對於C1q具有降低之親和力。在一實施例中，該融合多肽或結合物對C1q之親和力係低於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物之親和力的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、 或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物對C1q之親和力比包含野生型Fc區之融合多肽或結合物小至少90%或至少80%、或至少70%、或至少60%、或至少50%、或至少40%、或至少30%、或至少20%、或至少10%、或至少5%。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物對C1q之親和力係介於約100nM至約100μM、或約100nM至約10μM、或約100nM至約1μM、或約1nM至約100μM、或約10nM至約100μM、或約1μM至約100μM、或約10μM至約100μM之間。在一實施例中，該融合多肽或結合物對C1q之親和力為1μM或更大、或5μM或更大、或10μM或更大、或25μM或更大、或50μM或更大、或100μM或更大。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低之CDC活性。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物之CDC活性係包含野生型Fc區之融合多肽或結合物的至多1/2或至多1/3、或至多1/5、或至多1/10、或至多1/50、或至多1/100。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物之CDC活性相對於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物降低至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物不具有可檢測到之CDC活性。
在一實施例中，CDC活性之降低及/或除去歸因於降低之該融合多肽或結合物對Fc配體及/或受體之親和力。
降低之抗體相關毒性
業內應理解，生物學療法可具有與引導免疫系統識別並攻擊不期望之細胞及/或靶標之複雜性質相關的不良毒性問題。當不發生攻擊用識別及/或靶向時，倘視需要治療，則可出現諸如不良毒性等結果。舉例而言，非靶向組織之抗體染色可指示潛在毒性問題。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低之抗體相關毒性。在一實施例中，該融合多肽或結合物之毒性係包含野生型Fc區之融合多肽的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。在一實施例中，該融合多肽或結合物之毒性相對於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物降低至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。
血栓細胞凝集
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低之血小板活化及/或血小板凝集之誘導。在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低或甚至除去之血栓細胞活化及/或凝集之誘導。
業內應理解，生物學療法可具有血栓細胞凝集之不良效應。可使用活體外及活體內分析來量測血栓細胞凝集。假設活體外分析反映活體內情況。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物在活體外分析中具有降低之血栓細胞凝集之誘導。
在一實施例中，該融合多肽或結合物在活體外分析中之血栓細胞凝集之誘導係包含野生型Fc區之融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物在活體外分析中之血栓細胞凝集之誘導相對於包含野生型Fc區之融合多肽或結合物降低至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。
在一實施例中，與包含野生型Fc區之融合多肽相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物具有降低之血栓細胞凝集之活體內誘導。在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物在活體內分析中降低之血栓細胞凝集之誘導係包含野生型Fc區之融合多肽或結合物的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。
在一實施例中，本發明所揭示之融合多肽或結合物在活體內分析中降低之血栓細胞凝集之誘導相對於包含野生型Fc區之融合多肽降低至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。
III. 重組方法
Fc-融合多肽或Fc區結合物之多個部分可使用重組方法及組合物來產生，例如，參見US 4,816,567。
在一態樣中，提供編碼本發明所揭示之融合多肽或本發明所揭示之結合物之一部分之經分離核酸。
在一態樣中，提供一或多個包含該核酸之載體(例如，表現載 體)。
在一態樣中，提供包含該核酸之宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞包含(例如，經轉化具有)：(1)包含核酸之載體，該核酸編碼包含該融合多肽之第一重鏈Fc區或該結合物之第一重鏈Fc區之全部或一部分之胺基酸序列及包含該融合多肽之第二重鏈Fc區或該結合物之第二重鏈Fc區之全部或一部分之胺基酸序列；或(2)包含核酸之第一載體，該核酸編碼包含該融合多肽之第一重鏈Fc區或該結合物之第一重鏈Fc區之全部或一部分之胺基酸序列；及包含核酸之第二載體，該核酸編碼包含該融合多肽之第二重鏈Fc區或該結合物之第二重鏈Fc區之全部或一部分之胺基酸序列。
在一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如人類胚腎(HEK)細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。
在一態樣中提供製備本發明所揭示之融合多肽之方法，其中該方法包含在適於該融合多肽或結合物表現之條件下培養如上文所提供之包含編碼該融合多肽或結合物之核酸之宿主細胞、及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該融合多肽或結合物。
在一態樣中提供製備本發明所揭示之多肽結合物之方法，其中該方法包含在適於該多肽結合物之一部分表現之條件下培養如上文所提供之包含編碼該多肽結合物之該部分之核酸之宿主細胞、及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該多肽結合物之該部分、及將該多肽結合物重組產生之部分與該多肽結合物之各個其他部分以化學方式或酶促方式結合。該多肽結合物之各個其他部分可重組產生且隨後經修飾，或可完全以合成方式產生。
對於融合多肽或該多肽結合物之一部分之重組產生而言，將如(例如)上文所述編碼該融合多肽或該多肽結合物之一部分之核酸分離 並插入一或多個載體中用以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習用程序容易地分離及/或產生。
用於選殖或表現編碼多肽之載體的適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，多肽可在細菌中產生，尤其在無需糖化及Fc效應子功能時(例如，參見US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523；Charlton,Methods in Molecular Biology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo(編輯)，Humana Press,Totowa,NJ)，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現後，可自存於可溶性部分中之細菌細胞糊狀物分離多肽且可進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦係用於編碼多肽之載體之適宜選殖或表現宿主，其包括糖化路徑經「人類化」以產生具有部分地或完全人類糖化型式之多肽的真菌及酵母菌株(例如，參見Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用於表現糖基化多肽之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主(例如，參見US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(闡述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術))。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(293或腎細胞(BHK))；小鼠塞氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述)；猴腎細胞(CV1)； 非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR陰性CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216)；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生多肽之某些哺乳動物宿主細胞系的綜述(例如)參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology 248(2003)255-268(B.K.C.Lo，(編輯)，Humana Press,Totowa,NJ)。
IV. 醫藥調配物
本發明所揭示之融合多肽或結合物之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之該融合多肽或結合物與一或多種可選醫藥上可接受之載劑混合(Osol,A.(編輯)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，(1980))以凍乾調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚(乙烯基吡咯啶酮)；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離 子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International公司)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種額外醣胺多醣酶(例如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物闡述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括彼等於US 6,171,586及WO 2006/044908中所闡述者，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療具體適應症之活性成份，尤其彼等具有相互間不會產生不利影響之互補活性者。該等活性成份適宜地以有效用於預期目的之量以組合形式存在。
活性成份亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或界面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或巨乳液中。該等技術揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編輯)，(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常無菌。無菌性可藉由(例如)經由無菌濾膜過濾來容易地實現。
V. 治療方法及組合物
任一本發明所揭示之融合多肽或結合物皆可用於治療方法。
在本發明之一態樣中，本發明所揭示之融合多肽或結合物用於治療疾病。在一實施例中，該疾病係使得有利的是，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，該融合多肽或結合物之效應子功能顯著降低(至少50%)。
在一態樣中，本發明所揭示之融合多肽或結合物用於製造用於治療疾病之藥劑，其中有利的是，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，該融合多肽或結合物之效應子功能顯著降低。
在一態樣中，本發明所揭示之融合多肽或結合物用於製造藥劑，該藥劑用於治療益於以下情況之疾病：該融合多肽或結合物之效應子功能與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比降低至少20%。
本發明所揭示之一態樣係治療患有疾病之個體之方法，，該方法包含向該個體投與有效量之本發明所揭示之融合多肽或結合物其中有利的是，與包含野生型Fc區之融合多肽或結合物相比，本發明所揭示之融合多肽或結合物之效應子功能顯著降低。
效應子功能之顯著降低係效應子功能降低由包含野生型Fc區之融合多肽或結合物誘導之效應子功能的至少50%。
該等疾病係(例如)所有靶向細胞不會受到(例如)ADCC、ADCP或CDC破壞之疾病。
可用該多肽變體治療之病況有許多且包括代謝病症。
本發明所揭示之融合多肽或結合物係藉由任一適宜方式投與，包括經腸(經口或經直腸)、經胃腸、舌下、唇下、非經腸、皮下、靜脈內、真皮內、腹膜內、肺內及鼻內。在一實施例中，藉由錠劑、膠囊或微滴進行投用。
對於疾病之預防或治療而言，該融合多肽或結合物之合適劑量將取決於欲治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及進程、投與該融合多肽或結合物係出於預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床史及對 該融合多肽或結合物之反應、以及主治醫師之決定。該融合多肽或結合物適於一次性地或經一系列治療投與患者。
端視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至20mg/kg)融合多肽或結合物係投與患者之初始候選劑量，不論(例如)藉由一或多次單獨投與抑或藉由連續輸注。端視上述因素而定，典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg之間或更高之範圍內。對經數天或更長時間重複投與而言，端視病況而定，治療持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習用技術及分析容易地監測。
超過5×107個美國人感染代謝症候群(亦稱為代謝症候群X、胰島素抗性症候群或雷文氏症候群(Reaven’s syndrome))病症。代謝症候群之特徵通常在於以下風險因素中之至少三者或更多者之群集：(1)腹部肥胖(腹部中及周圍脂肪組織過量)、(2)致動脈粥樣化血脂異常(增強斑塊在動脈壁中累積之血脂病症，包括高甘油三酸酯、低HDL膽固醇及高LDL膽固醇)、(3)血壓升高、(4)胰島素抗性或葡萄糖不耐性、(5)易血栓狀態(prothrombotic state)(例如血液中之纖維蛋白原或纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-1高)及(6)易發炎狀態(pro-inflammatory state)(例如血液中C-反應蛋白升高)。其他風險因素可包括衰老、激素失衡及遺傳預先傾向性。
代謝症候群與增加之冠心病及其他與血管斑塊累積相關之病症(例如中風及周邊血管疾病)(稱為動脈粥樣硬化性心血管疾病，ASCVD))之風險相關。患有代謝症候群之患者可能自早期之胰島素抵抗狀態發展成ASCVD風險進一步增加之完全型II型糖尿病。不欲受任一具體理論限制，胰島素抗性、代謝症候群及血管疾病間之關係可涉及包括受損胰島素刺激性血管舒張、因增強之氧化性應激導致的胰島素抗性相關之NO可用度降低及脂肪細胞衍生之激素(例如脂聯素)異常 在內之一或多個並行致病機制(Lteif及Mather，Can.J.Cardiol.20(增刊B)：66B-76B(2004))。
根據2001年美國國家膽固醇教育計劃成人治療小組(National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel)(ATP III)，在同一個體中存在以下特性中之任三者滿足代謝症候群準則：(a)腹部肥胖(男性腰圍超過102cm且女性腰圍超過88cm)；(b)血清甘油三酸酯(150mg/dl或更高)；(c)HDL膽固醇(男性為40mg/dl或更低且女性為50mg/dl或更低)；(d)血壓(130/85或更大)；及(e)空腹血糖(110mg/dl或更高)。根據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)，具有高胰島素含量(僅空腹血糖升高或餐後葡萄糖升高)且具有以下準則中之至少兩者之個體滿足代謝症候群準則：(a)腹部肥胖(腰臀比大於0.9，身體質量指數為至少30kg/m2，或腰圍量測值超過37英吋)；(b)顯示甘油三酸酯含量為至少150mg/dl或HDL膽固醇低於35mg/dl之膽固醇小組；(c)血壓為140/90或更大或正在進行高血壓治療)。(Mathur,Ruchi,「Metabolic Syndrome」，Shiel,Jr.,William C.編輯，MedicineNet.com，2009年5月11日)。
出於本文目的，若個體滿足2001年美國國家膽固醇教育計劃成人治療小組或WHO所陳述準則中之任一者或兩者之準則，則認為該個體患有代謝症候群。
不欲受任一具體理論限制，本文所述Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物可用於治療代謝症候群。因此，本發明提供在受試者中預防或治療代謝症候群或降低1個、2個、3個或更多個其風險因素之方法，其包含向該受試者投與有效預防或治療代謝症候群或其風險因素之量之本文所述Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物，其用於治療患有糖尿病或肥胖之個體之方法，該方法包含向該個體投 與有效量之本發明所揭示之融合多肽或結合物。在一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑。
在一態樣中，提供本發明所揭示之融合多肽或結合物，其用於在個體中刺激胰島素合成及/或分泌、抑制升糖素分泌、抑制攝食量或/及降低高血糖，其包含向該個體投與有效劑量之本發明所揭示之融合多肽或結合物以在個體中刺激胰島素合成及/或分泌、抑制升糖素分泌、抑制攝食量或/及降低高血糖。在一實施例中，該個體係人類。
在一態樣中，本文提供用於誘導體重減輕或預防體重增長之方法，其包括向有需要的患者投與有效量之在GIP受體及GLP-I受體二者下均展示活性且視情況亦在升糖素受體下展示活性之本發明所揭示之融合多肽或結合物。該等化合物包括本文所述之GIP/GLP-1共促效劑及升糖素/GIP/GLP-1三元促效劑。
本發明所揭示之一態樣係本發明所揭示之融合多肽或結合物之用途，其用於製造或製備藥劑。在一實施例中，該藥劑係用於治療糖尿病或肥胖。在又一實施例中，該藥劑係用於治療糖尿病或肥胖之方法，其包含向患有糖尿病或肥胖之個體投與有效量之該藥劑。在一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑。在又一實施例中，該藥劑係用於刺激胰島素合成及/或分泌、抑制升糖素分泌、抑制攝食量或/及降低高血糖。
在又一實施例中，該藥劑係用於在個體中刺激胰島素合成及/或分泌、抑制升糖素分泌、抑制攝食量或/及降低高血糖之方法，該方法包含向該個體投與有效量之該藥劑以刺激胰島素合成及/或分泌、抑制升糖素分泌、抑制攝食量或/及降低高血糖。上文任一實施例之「個體」可係人類。
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)係指單純性脂肪肝(脂肪變性)至非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)、至肝硬化(肝之不可逆晚期結痂)範圍內之廣譜肝疾病。NAFLD之所有階段之共同之處在於脂肪在肝細胞(liver cell,hepatocyte)中累積(脂肪浸潤)。單純性脂肪肝係某一類型脂肪(甘油三酸酯)在肝細胞中異常累積而無發炎或結痂。在NASH中，脂肪累積與肝之發炎(肝炎)及結痂(纖維化)之變化程度相關。炎性細胞會破壞肝細胞(肝細胞壞死)。在術語「脂肪性肝炎」及「脂肪性壞死」中，脂肪性係指脂肪浸潤，肝炎係指肝發炎，且壞死係指受破壞肝細胞。NASH最終會導致肝結痂(纖維化)且然後導致不可逆晚期結痂(肝硬化)。由NASH引起之肝硬化係NAFLD譜之最後且最嚴重之階段。(Mendler,Michel,「Fatty Liver：Nonalcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD)and Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH)」，Schoenfield,Leslie J.編輯，MedicineNet.com，2005年8月29日)。
酒精性肝疾病或酒精誘導之肝疾病涵蓋三種在病理上不同之與過度飲酒相關或由其引起之肝疾病：脂肪肝(脂肪變性)、慢性或急性肝炎及肝硬化。酒精性肝炎可在唯一疾病適應症係異常實驗室測試之輕度肝炎至伴發諸如以下併發症之嚴重肝功能失常範圍內：黃疸(由膽紅素滯留引起之皮膚變黃)、肝性腦病(由肝衰竭引起之神經功能失常)、腹水(在腹部中之流體累積)、出血性食道靜脈曲張(在食道中之靜脈曲張)、異常血液凝結及昏迷。在組織學上，酒精性肝炎具有肝細胞之細胞腫脹變性(ballooning degeneration)特徵外觀、嗜中性球發炎且有時馬洛裏氏小體(Mallory bodies)(細胞中間絲蛋白之異常凝集)。肝硬化在解剖學上之特徵在於廣泛分佈於肝中之結節與纖維化之組合。(Worman,Howard J.,「Alcoholic Liver Disease」,Columbia University Medical Center website)。
不欲受任一具體理論限制，本文所述Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物可用於治療酒精性肝疾病、NAFLD或其任一階段，包括(例如) 脂肪變性、脂肪性肝炎、肝炎、肝臟發炎、NASH、肝硬化或其併發症。因此，本發明提供預防或治療受試者酒精性肝疾病、NAFLD或其任一階段之方法，其包含向受試者投與有效預防或治療酒精性肝疾病、NAFLD或其該階段之量之本文所述Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物。該等治療方法包括以下中之一者、兩者、三者或更多者降低：肝脂肪含量、肝硬化之發病率或進展、肝細胞癌之發病率、發炎跡象(例如異常肝臟酶含量(例如，天冬胺酸轉胺酶AST及/或丙胺酸轉胺酶ALT或LDH)、升高之血清鐵蛋白、升高之血清膽紅素)及/或纖維化跡象(例如升高之TGF-β含量)。在較佳實施例中，該等Fc區融合多肽或Fc區多肽結合物用於治療已進展超出單純性脂肪肝(脂肪變性)且展示發炎跡象或肝炎之患者。該等方法可達成(例如)AST及/或ALT含量之降低。
在一態樣中，本文提供包含本發明所揭示之融合多肽或結合物中之任一者之醫藥調配物用於(例如)以上治療方法中之任一者。在一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供融合多肽或結合物中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供融合多肽或結合物中之任一者及至少一種其他治療劑。
本發明所揭示之融合多肽或結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明所揭示之融合多肽或結合物可與至少一種其他治療劑共投與。
上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與(在此情形下，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體)。
本發明所揭示之融合多肽或結合物應以與良好醫療實踐一致之方式調配、投用並投與。在此背景下，考慮因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑 遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從業者已知之其他因素。該融合多肽或結合物不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所論述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在該融合多肽或結合物之量、病症或治療之類型以及上文所論述之其他因素而定。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑，或本文所述劑量之約1%至99%，或以經驗/臨床上確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。
對於疾病之預防或治療，本發明所揭示之融合多肽或結合物之合適劑量(在單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、融合多肽或結合物之類型、疾病之嚴重性及病程、投與該融合多肽或結合物係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床史及對該融合多肽或結合物之反應以及主治醫師之判斷。該融合多肽或結合物適於一次性地或經一系列治療投與患者。該融合多肽或結合物之一個例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多個劑量(或其任一組合)。該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週一次(例如，以使患者接受約2個至約20個、或例如約6個劑量之該融合多肽或結合物)。可在開始時投與較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習用技術及分析容易地監測。
VI. 製品
在本發明另一態樣中，提供含有用於治療及/或預防上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標籤或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合時可有效治療及/或預防病況之組合物，且可具有無 菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性藥劑係本發明所揭示之融合多肽或結合物。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療所選病況。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明所揭示之融合多肽或結合物；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含又一治療劑。本發明之此實施例之製品可進一步包含包裝插頁，其指示組合物可用於治療具體病況。另一選擇為或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受之緩衝液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及用戶角度考慮需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
本文所引用所有專利及科學文獻之揭示內容皆係全文以引用方式明確併入本文中。
序列表說明：
SEQ ID NO：01至39 腸促胰島素受體配體多肽
SEQ ID NO：40 人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域
SEQ ID NO：42 人類免疫球蛋白重鏈CH3結構域
SEQ ID NO：43 IgG1同種型之人類Fc區
SEQ ID NO：44至53 IgG1同種型之變體人類Fc區
SEQ ID NO：54 IgG4同種型之人類Fc區
SEQ ID NO：55及56 IgG4同種型之變體人類Fc區
SEQ ID NO：57至67 連接體多肽
SEQ ID NO：68 不含連接體之例示性腸促胰島素受體配體多肽Fc區結合物
SEQ ID NO：69 包含連接體之例示性腸促胰島素受體配體多 肽Fc區結合物
SEQ ID NO：70 具有分選酶標誌之長腸促胰島素受體配體多肽
SEQ ID NO：71 具有分選酶標誌之短腸促胰島素受體配體多肽
SEQ ID NO：72 分選酶標誌
實例
以下實例係本發明方法及組合物之實例。應理解，慮及上文所提供之一般說明，可實踐多個其他實施例。
儘管上文出於清晰理解之目的已經由說明及實例在一定程度上詳細地闡述本發明，但該等說明及實例不應視為限制本發明之範圍。
實例1 抗體
對於下文所述實驗而言，使用針對CD9之抗體(參見PCT/EP2012/055393中SEQ ID 8至14)、P-選擇素(闡述於WO 2005/100402中之序列)及CD20(闡述於EP 1 692 182中之序列)。
本文所述所有變體，例如抗-P-選擇素抗體之P329G、P329A、P329R SPLE、LALA、P329G/LALA、P329G/SPLE變體；抗-CD9抗體；及抗-CD20抗體(根據Kabat之EU索引編號)係使用基於PCR之誘變來製備。使IgG分子在HEK-EBNA或HEK293(抗-CD9抗體)細胞中表現，並使用蛋白A及大小排除層析來純化。
實例2 不同Fcγ受體與免疫球蛋白之結合親和力之測定 藉由表面電漿共振(SPR)使用BIAcore T100儀器(GE Healthcare)在25℃下量測不同FcγR對免疫球蛋白之結合親和力。
公認BIAcore®系統用於研究分子相互作用。其允許連續即時監測配體/分析物結合且因此測定締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及平衡常數(KD)。折射率變化指示由固定配體與注入溶液中之分析物 之相互作用所引起表面上之質量變化。若分子結合表面上之固定配體，則質量會增加，若解離，則質量會減小。
對於1：1相互作用而言，若將結合分子注入表面上或固定至表面上，則將不會看到結果差異。因此，端視配體或對應分析物之溶解度及可用性使用不同環境(分別以Fcγ受體作為配體或分析物)。
對於FcγRI而言，藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組及CM5晶片在pH 4.5下固定識別聚組胺酸序列(pentaHis單株抗體，Qiagen Hilden，目錄編號34660)之10,000共振單位(RU)之捕獲系統。以5μg/ml之濃度藉助60sec之脈衝以5μl/min之流速捕獲FcγRI。使在0nM至100nM範圍內之不同濃度之抗體以30μl/min之流速通過流動細胞，且在298K下保持120sec以記錄締合期。將解離期監測至多240sec且藉由自樣品溶液轉換為運行緩衝液來觸發。藉由用甘胺酸溶液(pH 2)以30ml/min之流速實施2min洗滌使表面再生。對於所有實驗而言，選擇由GE Healthcare供應之HBS-P+緩衝液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.05%(v/v)表面活性劑P20)。藉由減去自無捕獲FcγRI之表面獲得之反應來校正本體折射率差。亦減去空白注射(=雙參考)。
藉由使用BIA評價軟體包分析利用若干不同濃度獲得之感測圖曲線來測定平衡解離常數(KD)(定義為ka/kd)。數據擬合依照適宜結合模型。
對於FcγRIIA及FcγRIIIAV158而言，藉由使用由GE供應之胺偶合套組(pH 4.5，以10μg/ml之濃度)將10,000共振單位(RU)之欲測試單株抗體固定至CM5晶片上。
使在0μM至12.8μM範圍內之不同濃度之FcγRIIA及IIIA以5μl/min之流速通過流動細胞，且在298K下保持120sec以記錄締合期。將解離期監測至多240sec.且藉由自樣品溶液轉換為運行緩衝液 來觸發。藉由用3mM NaOH/1M NaCl溶液以30ml/min之流速實施0.5min洗滌使表面再生。對於所有實驗而言，選擇由GE Healthcare供應之HBS-P+緩衝液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.05%(v/v)表面活性劑P20)。
藉由減去自無捕獲抗體之表面獲得之反應來校正本體折射率差。亦減去空白注射(=雙參考)。
藉由使用BIA評價軟體包分析利用若干不同濃度獲得之感測圖曲線來測定之平衡解離常數(KD)。數據擬合依照使用穩態擬合之適宜結合模型。
對於FcγRIIB而言，藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組及CM5晶片在pH 4.5下固定識別聚組胺酸序列(pentaHis單株抗體，Qiagen Hilden，目錄編號34660)之10,000共振單位(RU)之捕獲系統。以5μg/ml之濃度藉助120sec之脈衝以5μl/min之流速捕獲FcγRIIB。使不同抗體以1,340nM之濃度以5μl/min之流速通過流動細胞，且298K下保持60sec以記錄締合期。將解離期監測至多120sec且藉由自樣品溶液轉換為運行緩衝液來觸發。藉由用甘胺酸溶液(pH 2.5)以30ml/min之流速實施0.5min洗滌使表面再生。對於所有實驗而言，選擇由GE Healthcare供應之HBS-P+緩衝液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.05%(v/v)表面活性劑P20)。
藉由減去自無捕獲FcγRIIB之表面獲得之反應來校正本體折射率差。亦減去空白注射(=雙參考)。
由於FcγRIIB與野生型IgG1之固有親和力極低，因此無法計算親和力，而是評估定性結合。
下表匯總將突變引入Fc部分中對與FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIAV1-58(A)之結合之影響以及對ADCC(不使用(BLT)及使用靶標細胞(ADCC)進行量測)及對C1q結合(B)之影響。
-- 與wt相比顯著降低/無活性，- 與wt相比降低，+ 與wt相互作用相當， n.d. 未測定/無結果。
更詳細而言，獲得以下結果：
與FcγRI受體之親和力
已將P329G、P329A、SPLE及LALA突變引入P-選擇素、CD20及CD9抗體之Fc多肽中，且利用BIAcore系統量測與FcγRI之結合親和力。儘管具有P329G突變之抗體仍結合FcγR1(圖1a及1b)，但分別引入三重突變P329G/LALA及P329G/SPLE產生幾乎無法檢測到結合之抗體(圖1b)。LALA或SPLE突變使與受體之結合降低之程度大於單獨P329G，但小於與P329G之組合(圖1a及1b)。因此，P329G與LALA或SPLE突變之組合之有效性大於單獨P329G突變或雙重突變LALA或SPLE。CD20 IgG1野生型抗體之kd值係4.6nM且相同抗體之P329G突變體之kd值係5.7nM，但對於三重突變體P329G/LALA而言，因幾乎無法檢測到抗體與FcγRI受體之結合而無法測定kd值。不論測試CD9抑或CD20抑或P-選擇素，抗體本身均對結合親和力具有微小影響。
與FcγRIIA受體之親和力
已分別將P329G、SPLE及LALA突變引入CD9抗體之Fc多肽中且利用BIAcore系統來量測與FcγRIIA-R131受體之結合親和力。將結合程度正規化，例如經捕獲mAb代表100RU。因此對於1：1化學計量，預計不超過約20RU。圖1c顯示，藉由將LALA、SPLE/P329G、P329G及LALA/P329G突變引入Fc變體中，與FcγRIIA受體之結合顯著降低。與對FcγR1受體之結合不同，單獨引入P329G突變能夠或多或少以與三重突變P329G/LALA類似之程度極顯著地阻斷與該受體之結合(圖1c)。
與FcγRIIB受體之親和力
已分別將SPLE、LALA、SPLE/P329G及LALA/P329G突變引入CD9及P-選擇素抗體之Fc多肽中且利用BIAcore系統量測與FcγRIIB受 體之結合親和力。圖1d顯示，在LALA及三重突變體P329G/LALA、P329G/SPLE中，與FcγRIIB受體之結合顯著降低。
與FcγRIIIA受體之親和力
已將P329G、LALA、SPLE、P329G/LALA及SPLE/P329G突變引入CD9之Fc多肽中且利用BIAcore系統量測與FcγRIIIA-V158受體之結合親和力。P329G突變及三重突變P329G/LALA將與FcγRIIIA受體之結合最顯著地降低至幾乎不可檢測之程度。P329G/SPLE亦產生顯著降低之結合親和力，突變SPLE及LALA分別僅輕微地降低與FcγRIIIA受體之結合親和力(圖1e)。
實例3 C1Q ELISA
藉由ELISA三明治結構型免疫分析來分析包含Fc變體之不同多肽與C1q之結合性質。將每一變體以介於10μg/ml與0μg/ml之間之8種濃度偶合至疏水性Maxisorb 96孔板。此偶合刺激抗體複合物，此係C1q分子之高親和力結合之前提。洗滌後，培育樣品以允許C1q結合。進一步洗滌後，藉由多株兔抗hC1q抗體檢測結合之C1q分子。在下一洗滌步驟後，添加酶標記之抗兔-Fcγ特異性抗體。藉由添加由酶轉化成有色產物之受質使免疫學反應可見。以光度計量方式量測之所得吸光度與結合至欲研究抗體之C1q之量成比例。計算變體-C1q相互作用之EC50值。繪製自顯色反應獲得之吸收單位對抗體之濃度之圖形。半最大反應抗體濃度決定EC50值。將此讀出值報告為在相同板上量測之與參考標準物之相對差異連同樣品與參考物之變異係數。
引入P-選擇素或CD20抗體中之P329G突變顯著降低與C1q之結合，此與SPLE突變類似(圖2)。表3匯總所計算變體與C1q之結合之EC50值。C1q屬於補體活化蛋白且在經典補體路徑之活化中發揮主要作用，該活化會導致膜攻擊複合物之形成。C1q亦參與其他免疫學過 程，例如增強吞噬作用、清除凋亡細胞或中和病毒。因此，可預計，此處所示降低與C1q之結合之突變體(例如P329G及SPLE以及極可能亦包含上述單一突變之三重突變)顯著降低C1q之上述功能。
實例4 不使用靶標細胞之ADCC，BLT分析
在4℃下在適宜96孔平底板中將欲測試抗體(CD20及CD9)塗佈於PBS中過夜。在用PBS洗滌板後，在室溫下用PBS/1% BSA溶液將剩餘結合位點阻斷1h。同時，收穫效應子細胞(經轉染以表現低或高親和人類FcγRIII之NK細胞系)且在丟棄阻斷緩衝液後以200 000個活細胞/孔接種於存於孔中之100μl/孔AIM V培養基中。使用100μl/孔皂苷緩衝液(0.5%皂苷+1% BSA，存於PBS中)來測定效應子細胞之最大酯酶釋放。在培育箱中將細胞在37℃、5% CO2下培育3h。3h後，將20μl/孔上清液與180μl/孔BLT受質(0.2mM BLT+0.11mM DTNB，存於0.1M Tris-HCl中，pH 8.0)混合且在37℃下培育30min，然後在微量板計數器中在405nm下讀數。測定酯酶釋放百分比，將最大釋放(經皂苷治療之細胞)設定為100%且將未刺激細胞(未經抗體塗佈)設定為0%釋放。
野生型抗-CD20抗體顯示細胞溶解活性之顯著誘導。LALA變體顯示酯酶釋放之顯著降低，而P329G及P329G/LALA變體不顯示任何 ADCC活性(圖3a)。圖3b顯示不僅P329位置處之G之交換會導致顯著降低之細胞溶解活性，且將P329交換為R329(CD20抗體)同樣如此。因此，精胺酸似乎會破壞抗體中脯胺酸三明治結構之功能，此與甘胺酸類似。此處所觀察到P329G突變體之顯著降低之ADCC最有可能係因顯著降低之與FcγRIIA及FcγRIIIA受體之結合所致(參見圖1c及圖1e)。
實例5 使用靶標細胞之ADCC
使用人類周邊血單核細胞(PBMC)作為效應子細胞且係使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics公司，St.Louis,MO63178 USA)並基本上依照製造商說明書來製備。簡言之，利用肝素化注射器自志願者採集靜脈血液。用PBS(不含有Ca2+或Mg2+)以1：0.75至1：1.3稀釋血液且將其層鋪於Histopaque-1077上。在室溫(RT)下不間斷地將梯度以400 x g離心30min。收集含有PBMC之中間相且用PBS(50ml/來自兩個梯度之細胞)洗滌並藉由在室溫下以300 x g離心10分鐘來收穫。在用PBS使沈澱再懸浮後，對PBMC進行計數且藉由在室溫下以200 x g離心10分鐘再次洗滌。然後將細胞再懸浮於合適培養基中以用於後續程序。對於PBMC及NK細胞，用於ADCC分析之效應子：靶比率分別為25：1及10：1。在AIM-V培養基中製備合適濃度之效應子細胞以在圓底96孔板之每孔中添加50ml。靶標細胞係生長於含有10% FCS之DMEM中的人類B淋巴瘤細胞(例如，Raji細胞)。在PBS中洗滌靶標細胞，計數且以3×105個/ml再懸浮於AIM-V中以在每微孔之100ml中添加30000個細胞。將抗體稀釋於AIM-V中，向預先平鋪之靶標細胞中添加50ml且使其在室溫下經10分鐘結合至靶標。然後，添加效應子細胞且將板在37℃下在含有5% CO2之加濕氣氛中培育4小時。使用細胞毒性檢測套組(Roche Diagnostics,Rotkreuz,Switzerland)藉由量測自受損細胞釋放之乳酸去氫酶(LDH)來評價靶細胞之殺滅。在4小時培 育後，以800 x g對板實施離心。將來自各孔之100ml上清液轉移至新透明平底96孔板上。每孔添加來自套組之100ml顏色受質緩衝液。在ELISA讀數器中在490nm下經至少10min使用SOFTmax PRO軟體(Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089,USA)確定顏色反應之Vmax值。自僅含有靶及效應子細胞但不含抗體之孔量測自發LDH釋放。自僅含靶細胞及1% Triton X-100之孔測定最大釋放。如下計算抗體調介之特異性殺滅之百分比：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x係在特定抗體濃度下Vmax之平均值，SR係自發釋放之Vmax之平均值且MR係最大釋放之Vmax之平均值。
募集免疫效應子細胞之效力取決於Fc變體之類型，如藉由經典ADCC分析所量測。此處，使用經人類FcγRIIIA轉染之人類NK細胞系作為效應子且使用CD20陽性Raji細胞作為靶標細胞。如可在圖4a中所看到，甘胺酸代替脯胺酸之抗-CD20抗體Fc變體(P329G)之ADCC顯著降低，且同樣雙重突變體P329G/LALA之ADCC降低程度類似。相比之下，對於LALA突變而言，ADCC降低較不顯著。為更好地區別不同變體，亦以糖改造之形式產生變體以增強ADCC潛力。可觀察到，親代分子(抗-CD20抗體)顯示強ADCC，如所預計。LALA形式之ADCC潛力顯著受損。P329G突變體極顯著地降低ADCC；遠大於抗-CD20抗體之P329A變體(圖4b)。
實例6 補體活性
對靶標細胞計數，用PBS洗滌，以1×106個細胞/ml再懸浮於AIM-V(Invitrogen)中。將50ml細胞/孔平鋪於平底96孔板中。在AIM-V中製備抗體稀釋液且以50ml添加至細胞中。在室溫下使抗體經10分鐘結合至細胞。剛剛解凍人類血清補體(Quidel)，用AIM-V稀釋3倍並以50ml添加至孔中。如由製造商所述製備兔補體(Cedarlane Laboratories)，用AIM-V稀釋3倍並以50ml添加至孔中。作為對照，在56℃下將補體源加熱30min，然後添加以供分析。在37℃下將分析板培育2h。藉由量測LDH釋放來確定細胞殺傷。簡言之，將該等板以300 x g離心3min。將每孔50ml上清液轉移至新96孔板中並添加50ml來自細胞毒性套組(Roche)之分析試劑。利用ELISA讀數器進行之動力學量測來確定與上清液中之LDH濃度對應之Vmax。藉由在1% Triton X-100存在下培育細胞來確定最大釋放。
分析不同Fc變體以調介SUDH-L4靶標細胞上之CDC。非糖改造之抗-CD20抗體分子顯示CDC之明顯誘導。LALA變體僅在最高濃度下顯示活性，而P329G及P329G/LALA變體不顯示任何CDC活性(圖5a)。此外，糖改造之抗-CD20抗體分子之LALA變體以及P329G及P329A變體不顯示任何CDC活性(圖5b)。
實例7 人類IgG1之碳水化合物譜
藉由MALDI/TOF-MS以陽離子模式(中性寡糖)來分析在Fc內含有突變之人類IgG1抗體之碳水化合物譜，該等突變旨在消除與Fcγ受體之結合。
依照製造商說明書用唾液酸酶(QA-Bio)處理人類(h)IgG1變體以去除末端唾液酸。隨後藉由PNGase F(QA-Bio)消化釋放hIgG1之中性寡糖，如先前所述(Ferrara,C.等人，Biotech.Bioeng.93(2006)851-861)。藉由質譜(Autoflex,Bruker Daltonics GmbH)以陽離子模式分析碳水化合物譜，如先前所述(Ferrara,C.等人，Biotech.Bioeng.93(2006)851-861)。
人類IgG1之中性Fc-相關聚糖之碳水化合物譜的特徵在於三個主要m/z峰，可將其指定為具有0個(G0)、1個(G1)或2個(G2)末端半乳糖殘基之岩藻糖基化複合物寡糖。
分析在Fc內含有突變之hIgG1的碳水化合物譜且將其與針對野生型抗體所獲得者進行比較，該等突變旨在消除與Fc受體之結合。在Fc內含有突變中之一者的IgG變體(P329G、LALA、P329A、P329G/LALA)顯示與野生型抗體類似之碳水化合物譜，其中Fc-相關聚糖係岩藻糖基化複合物寡糖(數據未顯示)。Fc內之突變會影響末端半乳糖基化及末端唾液酸化之程度，如藉由用丙胺酸代替241、243、263、265或301位置處之胺基酸所觀察(Lund,J.等人，J.Immunol.157(1996)4963-4969)。
圖6a顯示本文所述不同hIgG1 Fc-變體之半乳糖基化的相對百分比。當使抗體在不同宿主中表現時，可觀察到微小變異，但不能觀察到末端半乳糖基化之顯著差異。
圖6b指示4種不同抗體之野生型及IgG1-P329G/LALA之半乳糖基化含量的可變性，其中比較4種不同V-結構域在Hek293 EBNA細胞中表現時之半乳糖基化量。
實例8 全血分析中抗體誘導之血小板凝集.
使用來自Dynabyte之多板儀器進行全血血小板凝集分析。首先，自正常人類供體抽取20ml血液且將其轉移至水蛭素管(Dynabyte Medical，MP0601號)中。將微槽阻抗裝置(minicell impedance device)(Dynabead，MP0021號)插入多板儀器中用於分析。然後，將175μl 0.9% NaCl添加至微槽中。將抗體添加至微槽中以獲得最終測試濃度。隨後，添加175μl人類血液且將其在37℃下培育3min。在37℃下再自動開始6min.阻抗分析。藉由量化曲線下面積作為血小板凝集之量度來分析數據。
已顯示抗-CD9抗體誘導血小板活化及血小板凝集(Worthington等人，Br.J.Hematol.74(2)(1990)216-222)。先前已顯示由抗體與血 小板之結合誘導之血小板凝集涉及與FcãRIIA之結合(de Reys等人，Blood 81(1993)1792-1800)。如上文所顯示，引入抗-CD9抗體中之突變LALA、P329G、P329G/LALA及P329G/SPLE顯著降低之抗-CD9抗體與FcγRIIA受體之結合(圖1c)。
藉由將P329G及LALA三重突變引入抗體中以使得與野生型抗體相比FcγRIIA結合顯著降低來消除由抗-CD9抗體誘導之活化(藉由Ca流出量來量測，數據未顯示)以及血小板凝集(參見圖7a及7b)。鼠類IgG1在低抗體濃度(0.1μ/ml至1μ/ml)下誘導血小板凝集。在較高濃度(3μg/ml至30μg/ml)下，過度刺激血小板會導致凝集反應沉默。對於chim-hu-IgG4-SPLE而言，觀察到供體可變性。圖6a中顯示在較高抗體濃度下chim-hu-IgG4-SPLE反應者之數據，且圖6b中顯示chim-hu-IgG4-SPLE非反應者之數據。在抗體變體chim-hu-IgG1-LALA、chim-hu-IgG-WT-P329G、chim-hu-IgG1-LALA-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-P329G及chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q之情況下血液樣品均未顯示任何凝集反應。對照：未處理血液樣品之自發凝集(背景)；ADP誘導(ADP)及凝血酶類似物誘導(TRAP6)之血小板凝集。同種型對照：鼠類IgG1(鼠類同種型)及人類IgG4-SPLE(hu-IgG4-SPLE同種型)。
該等數據之一種可能理解係減弱之具有三重突變之抗-CD9抗體與FcγRIIA受體的結合係對該等種類之突變體抗體觀察到減少之血小板凝集之原因。因此，原則上可藉由將能夠降低與FcγRIIA受體之結合的上述突變引入抗體之Fc部分中來防止作為抗體治療之有毒副作用之血栓細胞凝集。
實例9 Fc區與腸促胰島素受體配體多肽之分選酶A結合
G3-Fc：GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV (SEQ ID NO：68)。
G4S3-Fc： (SEQ ID NO：69)。
長肽：Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-醯胺(SEQ ID NO：70)。
短肽：Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGGLPETGGSGS-醯胺(SEQ ID NO：71)。
對於分選酶調介之轉肽反應而言，使用N端截切之金黃色葡萄球菌分選酶A(△1-59)。該反應係在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl之pH 7.5緩衝液(分選酶緩衝液)中實施。在該反應中，將C端具有分選酶基序之化學合成肽(LPETGGSGS,SEQ ID NO：72)與N端具有寡甘胺酸基序之Fc區連接，從而產生連接序列肽-LPETGGG-重鏈Fc區。為實施該反應，所有試劑均係以溶液引入分選酶緩衝液中。在第一步驟中，將GGG-Fc與肽混合，並在添加分選酶A後開始反應。藉由移液或渦旋來混合組份並在37℃下培育1h及24 h，此視肽而定。隨後，在轉肽反應後直接純化接合產物(ligation product)，或藉由冷凍反應混合物來終止反應並儲存於-20℃下直至純化。
莫耳比肽：Fc：分選酶=10：8：1
結果
長合成肽及短合成肽二者經由分選酶調介之轉肽分別偶合至N端具有短三元甘胺酸基序或較長GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：62)序列之IgG-Fc片段。組合展示於表3中。
關於長肽-G3-Fc、短肽-G3-Fc、長肽G4S3-Fc及短肽G4S3-Fc之Fc區-腸促胰島素受體配體多肽結合物分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：95至98。
分選酶調介之轉肽之分析
藉由SDS-PAGE來分析轉肽反應之等份試樣。一實例展示於圖8中，圖8顯示長肽或短肽與G3-Fc結合之結果。自凝膠以密度方式評估接合效率。如表4中所示，約5% Fc未與肽結合，而約90% Fc與兩個肽部分結合。
不同結合物之生物活性顯示於表5中。
實例10 環AMP分析
使用以下材料：cAMP HunterTM CHO-K1 GLP-1或GIP細胞系(DiscoveRx公司)、Ham’s F-12(Gibco目錄編號21765)、10%經加熱去活化之FBS(Gibco目錄編號16000)、青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸(Gibco 目錄編號10378)及800μg/ml G418(遺傳黴素，Gibco目錄編號10131)。
將表現GLP-1或GIP受體之CHO-K1細胞以100,000個細胞/ml之細胞密度懸浮於10ml分析緩衝液(含有0.5mM IBMX(Sigma-Aldrich目錄編號17018)及0.1% BSA(Sigma-Aldrich目錄編號A-2153)之Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩衝液(Sigma-Aldrich目錄編號K4002))中。隨後將細胞懸浮液(25μl)轉移至半區板(Costar目錄編號3694)中並將藥物溶液(25μl)以合適濃度添加至孔中。在室溫下在板式震盪器上將細胞培育30min。依照製造商說明書使用Cisbio「cAMP動態套組」(Cisbio Bioassays,France)來測定cAMP含量。所有實驗均以一式兩份實施且對藥物測試至少2次(N2)。
實例11 急性DIO小鼠研究
將雄性C57B1/6小鼠(約7個月齡；Jackson laboratories(Bar Harbor,ME,USA))以12h光照：12h黑暗循環圈養於溫度及濕度受控之環境中。小鼠隨意獲取水及高脂肪飼料(HFD；飼料中58%(千卡)為脂肪與蔗糖，Research Diets D12331)並在8週齡開始飲水，並在整個研究中持續獲得。在治療期開始前按體重及攝食量對小鼠分類且每個籠子圈養4隻動物。在使用前使小鼠適應至少6天。在黑暗循環開始前對小鼠投用1次媒劑(s.c.)、對照(人類IgG1-Fc；s.c.)或化合物(20nmol/kg,s.c.，肽-長-G3Fc或肽-短-G3Fc)。隨後，每日監測體重及攝食量，共計5天(N=8隻小鼠/組)。
數據分析：
所顯示之所有數據均係平均值±標準誤差(s.e.m.)。使用單因子ANOVA、隨後使用鄧奈特檢定(Dunnett’s test)來實施數據之統計學評價以確定在媒劑組與藥物治療組之間是否存在統計學上顯著差異。在P<0.05時，認為差異在統計學上顯著。用GraphPad軟體(GraphPad Prism)實施數據分析。
結果：
在雄性DIO小鼠中單次投與化合物肽-長-G3Fc及肽-短-G3Fc(20nmol/kg,s.c.)誘導體重增長之顯著降低(與經媒劑治療之動物相比)及累積攝食量之降低(圖9)。
實例12 急性db/db小鼠研究
將10週齡雄性db/db小鼠(C57BLKS；BKS.Cg-m +/+ Lepr(000642)；Jackson Laboratories,USA)以12h光照：12h黑暗循環圈養於溫度及濕度受控之環境中，並使其任意獲取普通飼料及水(每千卡 飼料中5%為脂肪，Harlan 7912)。基於任意血糖含量將小鼠(約42g)隨機化成不同的治療組。在黑暗循環開始前對小鼠投與媒劑(s.c.)、對照(s.c.)或化合物(20nmol/kg,s.c.)。次日，在腹膜內葡萄糖激發測試前使小鼠禁食6h(N=8隻小鼠/組)。在6h禁食後，使用手持式FreeStyle Freedom Lite血糖儀(Abbott)自尾部截取物(tail clip)採集血液樣品用於基線值(t=0min.)之測定。然後經腹膜內推注向小鼠注射葡萄糖(1g/kg；25%右旋糖溶液)，並以規律間隔(t=15min.、30min.、60min.及120min.)採集其他血液樣品用於葡萄糖量測。為分析該等化合物對腹膜內葡萄糖耐量之影響，使用梯形法來測定關於血糖波動之曲線下面積(AUC0-120 min)。
數據分析：
所顯示之所有數據均係平均值±標準誤差(s.e.m.)。使用單因子ANOVA、隨後使用鄧奈特檢定來實施數據之統計學評價以確定在媒劑組與藥物治療組之間是否存在統計學上顯著差異。在P<0.05時，認為差異在統計學上顯著。用GraphPad軟體(GraphPad Prism)實施數據分析。
結果：
向雄性db/db小鼠快速投與化合物肽-長-G3Fc及肽-短-G3Fc(20mmol/kg,s.c.)顯著降低反應腹膜內葡萄糖激發之葡萄糖波動(ipGTT；AUC ipGTT)(圖10)。該影響具有劑量依賴性(圖11)。
<110> 瑞士商赫夫門羅氏藥廠股份有限公司 霍夫曼等人
<120> 具有改變之FC效應子功能之腸促胰島素受體配體多肽FC區融合多肽及結合物
<130> 31135/47511A
<150> US-61/662,576
<151> 2012-06-21
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<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20之間之內醯胺環
<400> 37
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 腸促胰島素受體配體多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20之間之內醯胺環
<400> 38
<210> 39
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 腸促胰島素受體配體多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20之間之內醯胺環
<400> 39
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
<210> 42
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突變L234A、L235A之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 43
<210> 44
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 44
<210> 45
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 45
<210> 46
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A、L235A及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 46
<210> 47
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A、L235A及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 47
<210> 48
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P329G突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 48
<210> 49
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A、L235A及P329G突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 49
<210> 50
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P329G及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 50
<210> 51
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P329G及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 51
<210> 52
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A、L235A、P329G及孔洞突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 52
<210> 53
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A、L235A、P329G及隆凸突變之IgG1同種型之變體人類Fc區
<400> 53
<210> 54
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P與L235E突變之IgG4同種型之變體人類Fc區
<400> 55
<210> 56
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P、L235E及P329G突變之IgG4同種型之變體人類Fc區
<400> 56
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 57
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 58
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 59
<210> 60
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 60
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 61
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 62
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 63
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 64
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 65
<210> 66
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 66
<210> 67
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體多肽
<400> 67
<210> 68
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G3-Fc
<400> 68
<210> 69
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S3-Fc
<400> 69
<210> 70
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有分選酶標誌之長腸促胰島素受體配體多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示aib
<220>
<221> MIsC_FEATRE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa表示aib
<400> 70
<210> 71
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有分選酶標誌之短腸促胰島素受體配體多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任一天然存在胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可為任一天然存在胺基酸
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分選酶基序
<400> 72
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa係酸性胺基酸(例如Asp或Glu)
<400> 73
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任一天然存在胺基酸
<400> 75
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
<210> 77
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為任一胺基酸
<400> 79
<210> 80
<400> 80
000
<210> 81
<400> 81
000
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
<210> 91
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
<210> 93
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
<210> 94
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
<210> 95
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係AIB
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa係AIB
<400> 95
<210> 96
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係AIB
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa係AIB
<400> 96
<210> 97
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係AIB
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa係AIB
<400> 97
<210> 98
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係AIB
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa係AIB
<400> 98

Claims (37)

  1. 一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含1個、2個、3個或4個天然存在或合成腸促胰島素受體配體多肽，每一多肽係以共價方式連接至Fc區，其中該融合多肽或結合物包含胺基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：75)、視情況LPETG(SEQ ID NO：74)。
  2. 如請求項1之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含介於該腸促胰島素受體配體多肽之胺基酸序列與該Fc區之胺基酸序列之間的胺基酸序列LPETG(SEQ ID NO：74)。
  3. 如請求項2之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含以C端至LPETG(SEQ ID NO：74)之Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：88)、Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：90)。
  4. 如請求項3之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含(GGGS)n，其中n=1至6(SEQ ID NO：57至60、88及89)；(GGGGS)m，其中m=1至6(SEQ ID NO：61至64、90及91)；或(GGGGGS)o，其中o=1至6(SEQ ID NO：65至67及92至94)。
  5. 如請求項4之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含SEQ ID NO：57至67中之任一者。
  6. 如請求項1至5中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含以N端至LPXTG(SEQ ID NO：75)之Gly或Gly-Gly。
  7. 如請求項1至6中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該Fc區係在329位置處具有胺基酸殘基之突變及至少一個選自包含在228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及331位置處之胺基酸殘基之群之胺基酸至不同殘基之至少一個其他突變的人類Fc區，其中該Fc區中之該等殘基係根據Kabat之EU索 引編號。
  8. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中與包含野生型IgG Fc區之Fc區融合多肽或結合物相比，該變體人類Fc區針對人類FcγRIIIA及/或FcγRIIA及/或FcγRI具有經降低之親和力。
  9. 如請求項7及8中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該Fc區中至少一個胺基酸之至少一個其他突變係S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。
  10. 如請求項9之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該Fc區中至少一個其他突變係L234A與L235A，若該Fc區係人類IgG1同種型；或S228P與L235E，若Fc區係人類IgG4同種型。
  11. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中由該Fc區融合多肽或結合物誘導之血栓細胞凝集與由包含野生型人類IgG Fc區之Fc區融合多肽或結合物誘導之血栓細胞凝集相比是降低的。
  12. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中包含1個或2個腸促胰島素受體配體多肽。
  13. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該等腸促胰島素受體配體多肽之每一者係融合或結合至一個Fc區多肽鏈之N端，藉此每一Fc區多肽鏈僅融合或結合至一個腸促胰島素受體配體多肽。
  14. 如請求項12及13中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該等腸促胰島素受體配體多肽之每一者係融合或結合至一個Fc區多肽鏈之C端，藉此每一Fc區多肽鏈僅融合或結合至一個腸促胰島素受體配體多肽。
  15. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該 等腸促胰島素受體配體多肽彼此獨立地選自GIP、GLP-1、促胰島素分泌素-3、促胰島素分泌素-4、雙重GIP-GLP-1促效劑、三重GIP-GLP-1-升糖素受體促效劑、嵌合GIP/GLP促效劑及其前體、衍生物或功能片段。
  16. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該Fc區包含選自由SEQ ID NO：42至56組成之群之胺基酸序列。
  17. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該腸促胰島素受體配體多肽包含選自由SEQ ID NO：1至39、76及77組成之群之胺基酸序列。
  18. 如前述請求項中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物，其中該Fc區融合多肽或Fc區結合物包含該Fc區與該腸促胰島素受體配體多肽之間之連接體，其中該連接體包含選自由57至69及82至94組成之群之胺基酸序列。
  19. 一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：95。
  20. 一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：96。
  21. 一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：97。
  22. 一種Fc區融合多肽或Fc區結合物，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：98。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物。
  24. 一種如請求項1至22中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物之用途，其用作藥劑。
  25. 一種如請求項1至22中任一項之Fc區融合多肽或Fc區結合物用於 製造藥劑之用途，該藥劑用於治療疾病，其中有利的是該包含野生型人類IgG Fc區之變體Fc區之融合多肽或結合物之效應子功能與由包含野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之效應子功能相比是降低的。
  26. 一種如請求項1至22中任一項之包含野生型人類IgG Fc區之變體Fc區之Fc區融合多肽或Fc區結合物在製造藥劑中之用途，該藥劑用於使ADCC下調由包含該野生型人類IgG Fc區之融合多肽或結合物誘導之ADCC至少20%及/或用於下調ADCP，其中該野生型人類IgG Fc區之Pro329經甘胺酸取代，其中該等殘基係根據Kabat之EU索引編號，其中該融合多肽或結合物針對人類FcγRIIIA及FcγRIIA展示出降低之親和力。
  27. 如請求項24至26中任一項之用途，其中該疾病係2型糖尿病或肥胖。
  28. 如請求項24至26中任一項之用途，其中該疾病係1型糖尿病。
  29. 一種多肽，其包含腸促胰島素受體配體多肽之胺基酸序列及LPXTG(SEQ ID NO：75)，其中X係任一胺基酸。
  30. 如請求項29之多肽，其中X係酸性胺基酸。
  31. 如請求項30之多肽，其中該酸性胺基酸係Glu。
  32. 如請求項29至31中任一項之多肽，其包含以C端至LPETG(SEQ ID NO：74)之Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：88)、Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：90)。
  33. 如請求項32之多肽，其包含(GGGS)n，其中n=1至6(SEQ ID NO：57至60、88及89)；(GGGGS)m，其中m=1至6(SEQ ID NO：61至64、90及91)；或(GGGGGS)o，其中o=1至6(SEQ ID NO：65至67及92至94)。
  34. 如請求項33之多肽，其包含SEQ ID NO：57至67中之任一者。
  35. 如請求項29至34中任一項之多肽，其包含以N端至LPXTG(SEQ ID NO：75)之Gly或Gly-Gly。
  36. 一種如請求項29至35中任一項之多肽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療疾病。
  37. 如請求項36之用途，其中該藥劑之製造包含分選酶A(sortase A)及人類Fc區之使用。
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