TW201305548A - 用於細胞分析之系統及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種用於枚舉一樣品中之諸如細胞等物件之系統。該系統基於平面波導成像技術而使用一低成本匣及一讀取器儀器。可藉助加螢光標籤之抗體來對一血液樣品之細胞進行染色且將其裝載至其中可區分並量化經差別標示之細胞之匣上。
Description
本發明係關於一樣品中之一分析物或一物件之識別及枚舉。更特定而言，本發明係關於一種用於枚舉一人體血液樣品中之諸如CD4輔助性T淋巴細胞等特定細胞之系統及若干方法。
本申請案主張2010年10月11日提出申請且標題為「System for Fluorescence Microscopy with Autofocus」之美國臨時專利申請案第61/391,909號之優先權。本申請案亦主張2011年4月13日提出申請且標題為「System and Method for Enumerating Cells in a Sample」之美國臨時專利申請案第61/475,189號之優先權。本申請案亦主張2011年4月26日提出申請且標題為「System and Method for Cell Analysis」之美國臨時專利申請案第61/479,268號之優先權。所有前述申請案之全部內容皆出於所有目的而以引用方式併入至本申請案中。
本發明係在政府支援下根據美國國家標準技術研究院(「NIST」)先進技術計劃(「ATP」)、授予號70NANB7H7053及國家衛生研究院(「NIH」)授予號2R44AI070052而作出。政府對本發明具有一定的權利。
人體免疫缺陷病毒(「HIV」)係感染免疫系統之細胞之一逆轉錄病毒。在其得以進入至一個別宿主之後，HIV可損害或最終破壞經感染個體之正常免疫功能。由於免疫系統變得較弱，因此經感染個體變得更易受其他感染。HIV感染病之最晚期通常稱作獲得性免疫缺陷綜合徵(「AIDS」)。在最近大約三十年內，AIDS已蔓延全球且已變為世界諸多地區(尤其係資源有限背景)中之最大健康挑戰中之一者。
HIV介導之CD4細胞破壞係HIV感染病之中心免疫學特徵。因此，CD4計數係初始疾病分期中、監視抗逆轉錄病毒治療中及管理機會性感染之一級與二級預防中之一關鍵量測。事實上，在每微升0至1000個細胞之範圍內之定量輔助性T細胞計數係用於起始且最佳化抗逆轉錄病毒療法並防止病毒藥物耐受之一關鍵指示符。流式細胞計量係用於CD4細胞計數之當前照護標準。令人遺憾地，流式細胞計量係一基於實驗室之中心技術；樣品冷鏈要求以及運輸裝備及操作成本使該技術在其中HIV流行程度最高之資源有限背景中成本高得支付不起。一簡單的重點照護(「POC」)CD4計數工具將基本上改變HIV管理。
本手段藉由提供解決此領域中諸多問題之一簡單診斷系統來加快技術發展。在一項實施例中，該系統可包含一裝置及一讀取器儀器。該裝置之實例可包含但不限於一匣、一基板、一通道或能夠透射光且保持樣品之其他固體支撐件。在另一實施例中，該讀取器儀器可能夠捕獲裝置上之影像且處理該影像資料。
在一項實施例中，該裝置可含有一波導。在另一實施例中，該裝置可含有一第一基板及一第二基板。在另一實施例中，該第一基板或該第二基板可含有一平面波導。在另一實施例中，該平面波導可係一多模式平面波導。在另一實施例中，該平面波導可具有一整體形成之透鏡。在另一實施例中，該平面波導可含有至少一第一外表面及一第一內表面，而該第二基板可含有至少一第二外表面及一第二內表面。在另一實施例中，該第一內表面與該第二內表面彼此間隔開，其中該第一內表面及該第二內表面至少部分地界定可保持或侷限整個樣品或其一部分之一樣品室。在另一實施例中，該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段及該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之此區段及該第二內表面之此區段至少部分地界定用於保持或侷限該樣品或其至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開。在另一態樣中，該裝置可具有一入口埠及一出口埠，且該入口埠及該出口埠可兩者皆與該樣品室連接。
在一項實施例中，揭示用於分析一樣品之一系統及一方法，其中將該樣品或其一部分裝載至一裝置(諸如，一匣)上。該樣品可含有欲分析之至少一種物件(亦稱為「目標分析物」)。該方法可包含用一或多個易激發標籤(諸如，一螢光團)專一地標示目標分析物之一步驟。不同種類之目標分析物可標示有不同易激發標籤。在另一實施例中，該方法亦可包含允許樣品與第一內表面接觸之一步驟，其中將該至少一種物件固相化於第一內表面處。在另一實施例中，該至少一種物件可透過重力累積或沈澱於第一內表面處。所揭示之方法亦可包含使用一或多個光條件來照射固相化於第一基板處之物件以產生一或多個螢光影像之一步驟。該物件之一或多個影像可經捕獲及分析以識別及/或枚舉一樣品中之物件。
在另一實施例中，本文中所揭示之裝置可用以接納一樣品。在一實施例中，該樣品係人體血液或其衍生物。在一個態樣中，該樣品可在由該裝置接納之前預培養有一或多個標示分子。該樣品中之一或多種物件可在由該裝置接納時與一或多個標示分子結合。該樣品中之一或多種物件可由一或多個標示分子標示，該一或多個標示分子可然後由讀取器儀器識別。設計用於讀取器儀器之演算法以枚舉標示有不同標示分子之物件。
此處亦揭示用於分析具有一或多種分析物或物件之一樣品之一方法，該方法可包含以下步驟：(a)將該樣品或其一部分添加至一裝置，其中該樣品可含有至少一種物件。在一個態樣中，該裝置可含有一第一基板及一第二基板，其中該第一基板含有一平面波導與一折射體積。在另一態樣中，該平面波導可具有一第一外表面及一第一內表面，且該第二基板可具有一第二外表面及一第二內表面。該第一內表面與該第二內表面可彼此間隔開且至少部分地界定用於侷限該樣品之全部或一部分之一體積(亦稱為「樣品室」)。在步驟(b)中，可允許樣品與第一內表面及第二內表面中之至少一者接觸，其中將該至少一種物件結合至第一基板之第一內表面。在步驟(c)中，可偵測結合至第一內表面之至少一種物件。在另一態樣中，該方法可進一步包含自一光源提供光以照射該裝置之折射體積之一步驟(d)，其中經由該折射體積將光耦合至該平面波導。
注意，出於清晰起見，圖中之所有元件可並非按比例繪製。
本發明提供用於偵測及表徵一樣品中之一分析物或一物件之一系統及方法。更特定而言，本發明提供能夠遞送一小體積之血液樣品中之CD4輔助性T細胞之準確計數之一低成本的重點照護系統。除血漿、紅血球(亦即，紅細胞或「RBC」)及凝血細胞(亦即，血小板)之外，血液還含有各種不同之白血球(亦即，白細胞或「WBC」)。此等包含淋巴細胞(舉例而言，T細胞、B細胞及自然殺傷細胞)、單核細胞及粒細胞(舉例而言，嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞)。白血球特徵在於稱作CD標記之表面蛋白質，且不同CD標記通常跨越不同白血球類型共用。舉例而言，輔助性T淋巴細胞及單核細胞兩者皆攜帶CD4表面標記。輔助性T淋巴細胞亦攜帶CD3標記，而單核細胞不攜帶CD3標記。輔助性T淋巴細胞不攜帶CD14標記而單核細胞攜帶CD14標記。藉助對抗表面CD標記之抗體之差別免疫螢光染色可用以識別白血球亞型。
此處所闡述之方法可統稱為「靜態細胞計量」，其使用平面波導螢光照射之一發明性實施方案。術語「細胞計量」在技術上係指對細胞(特別係血細胞)之計數或枚舉。本發明中，術語「細胞計量」一般用以指對下文更詳細闡述之若干分析物(特別係粒子分析物)中之任一者之枚舉。術語「靜態」暗指所揭示之系統及方法不需要目標分析物(舉例而言，細胞或粒子)在識別及枚舉時移動或流動。此與「流式細胞計量」(其中在目標分析物(例如，細胞或粒子)移動經過一偵測器或成組之偵測器時識別及/或枚舉該等目標分析物之一技術方法)形成對比。舉例而言，靜態細胞計量之實例包含血細胞儀，諸如彼-豪二氏(Petroff-Hauser)計數室，其與一習用光顯微鏡一起用以枚舉一樣品中之細胞。細胞染色設備及螢光顯微術手段可用以執行基於螢光之靜態細胞計量。本發明提供用於對一樣品執行靜態細胞計量分析之經顯著簡化、穩健且低成本之方法、裝置及儀器。
此處所闡述之方法及系統通常與使用螢光信號來識別及/或枚舉存在於一樣品中之分析物之測定有關。在例示性應用中，特定而言，目標分析物標示有偶聯螢光團之分子，諸如，一(或多種)抗體(免疫螢光染色)。亦可使用其他分子辨識元件，包含但不限於適體、親合體、核酸分子辨識元件或仿生構造。亦可使用非特定螢光團，包含但不限於諸如碘化丙啶、膜特定螢光團及螢光核染色劑等染色劑。
在例示性實施例中，易激發標籤可用作測定方案中之偵測試劑。例示性標籤可包含但不限於螢光有機染料，諸如螢光素、若丹明及商業性衍生物(諸如Alexa染料(生命技術)及DyLight產品)；螢光蛋白質，諸如R-藻紅蛋白及商業性類似物(諸如SureLight P3)；發冷光鑭系螯合物；發冷光半導體奈米粒子(例如，量子點)；磷光性材料及併入有此等易激發標籤之微粒(例如，乳膠珠)。出於本發明之目的，術語「螢光團」一般用以闡述此處所列舉之所有易激發標籤。術語「標示螢光團」、「標示螢光」、「標示染料」、「偶聯染料」、「加標籤」及「加螢光性標籤」在本發明中可交換地使用。
本文中所闡述之實施例可適用於除基於螢光之信號轉導之外的測定。舉例而言，該等方法及系統亦可與基於發冷光、磷光及光散射之信號轉導相容。
在一項實施例中，基於平面波導照射及差別免疫螢光染色之兩種色彩螢光顯微術可用以識別及枚舉一樣品中之分析物。本發明提供用於執行此分析之一方便方法及系統。舉例而言，藉助抗CD4及抗CD14抗體之差別免疫螢光染色可用以識別血液中之CD4輔助性T淋巴細胞。作為另一實例，藉助抗CD4及抗CD3抗體之差別免疫螢光染色可用以識別血液中之CD4輔助性T淋巴細胞。視情況，差別免疫螢光染色可與亮視場顯微術及細胞形態學分析組合以更準確地識別血液中之CD4輔助性T淋巴細胞。作為另一替代方案，差別免疫螢光染色及亮視場顯微術可用以識別其他細胞類型。
術語「T細胞」及「T淋巴細胞」在本發明中可交換地使用。術語「輔助性T細胞」、「CD4輔助性T細胞」及「CD4 T細胞」在本發明中可交換地用以指表達其表面上之CD4之彼等輔助性T細胞。
出於本發明之目的，藉助實質親和性結合至一標示分子之一細胞針對彼特定標示分子可稱為「陽性」。相反地，不藉助實質親和性結合至一標示分子之一細胞針對彼特定標示分子可稱為「陰性」。例如，結合具有一螢光標籤之一抗CD4抗體且在被照射時作為一可偵測螢光點展示出來之一細胞可稱為「CD4陽性」。相反地，在相同或類似條件下在藉助具有一螢光標籤之一抗CD4抗體培養之後不作為一可偵測螢光點展示出來之一細胞可稱為「CD4陰性」。
除非本發明中另有說明，否則一名詞之複數或單數形式可交換地使用。
在另一實施例中，樣品可在裝載至匣上之前藉助含有一或多個標示分子之一溶液(或混合物)來培養。用於血液分析之標示分子之實例可包含但不限於一抗CD4抗體、一抗CD14抗體、一抗CD3抗體或一抗CD8抗體。在一個態樣中，不同標示分子可以一順序次序逐一與樣品培養。在另一態樣中，不同標示分子可同時與樣品培養。藉由舉例之方式，一抗CD4抗體、一抗CD14抗體可預混合為一抗體混合劑，將該樣品或其一部分添加至該抗體混合劑中。可在添加樣品之前將紅細胞(RBC)裂解緩衝劑與抗體混合劑預混合。在另一態樣中，標示分子可係用一可偵測分子(諸如，一易激發標籤)加標籤或與該可偵測分子融合之一或多種抗體。實例性易激發標籤包含但不限於螢光染料、螢光蛋白質、鑭系螯合物、量子點及光散射粒子。
在一項實施例中，樣品可係自一受試者獲得之一體液。適合於本系統之樣品之實例可包含但不限於全血樣品、血漿、血清、痰、支氣管肺泡灌洗樣品或吸出物、鼻咽拭子、鼻拭子、腦脊髓液(「CSF」)、唾液、淋巴液、羊水、腹水、尿或其一組合。在另一實施例中，樣品可包含但不限於培養細胞、細胞製備物、細胞提取物、培養基或其組合。在另一實施例中，樣品可係一環境樣品、廢水、工業廢棄物或其組合。
在一實施例中，樣品可含有目標分析物。目標分析物之實例包含具有介於自0.1至50微米之間的範圍內之尺寸(例如，直徑)之物件。目標分析物之實例可包含哺乳動物細胞。哺乳動物細胞之實例可包含白細胞。目標分析物之額外實例可包含病毒粒子、細菌、孢子、真菌、寄生蟲、脂質體、植物細胞及細胞亞組分。
對於某些應用，期望定量地枚舉一既定樣品體積中之一特定細胞類型之數目。舉例而言，感染HIV之個體中之CD4輔助性T細胞之量化通常報告每微升全血之絕對細胞數目。本發明提供用於定量細胞枚舉之方法。
在一項實施例中，控制體積轉移裝置用以將樣品轉移至具有一流體通道之一匣之入口埠，其中經裝載之樣品可與第一內表面及第二內表面中之一者或兩者接觸。控制體積轉移裝置可係來源於市場(例如，Poly-Pipets,Inc或Safe-Tec Micro-Safe管)或可係定製設計的。在另一實施例中，控制體積轉移裝置用以將樣品轉移至一樣品處置裝置。在針對血細胞應用之一實施例中，該樣品處置裝置可係一藥水瓶、微型管或試管，其含有用以製備供測定之樣品之一經預量測、隨時可用量之染色及/或裂解緩衝劑。舉例而言，該樣品處置裝置可含有一經預量測、隨時可用量之標示螢光團之抗CD4及抗CD14抗體。該樣品處置裝置亦可含有一經預量測、隨時可用量之RBC裂解緩衝劑。在另一實施例中，該樣品處置裝置可含有在測定時與樣品或其他液體再水化之凍乾或以其他方式乾燥之測定試劑。
在另一實施例中，使用一轉移裝置將所製備樣品自樣品處置裝置轉移至一匣之入口埠。例示性轉移裝置包含可拋分注器、可拋移液管、固定體積移液管及可調整移液管。在一項實施例中，所製備樣品自樣品處置裝置至匣之入口埠之轉移係一控制體積步驟。在另一實施例中，所製備樣品自樣品處置裝置至匣之入口埠之轉移不係一控制體積步驟。
在另一實施例中，藉由簡單傾倒將所製備樣品自樣品處置裝置轉移至一匣之入口埠。
在另一實施例中，樣品處置裝置經設計以與匣之入口埠配合，從而提供所製備樣品至匣之直接轉移。在一項實施例中，樣品處置裝置可包括一膜，該膜可在插入至其在匣上之配合受體中時刺穿。舉例而言，樣品處置裝置可係具有一箔黏性底座之一藥水瓶，該箔黏性底座在樣品製備期間保持液體但在配合至匣時被刺穿，從而排放所製備樣品。
在另一實施例中，匣裝置可經設計以使得流體通道之充滿相對於樣品中之物件之沈澱時間較迅速。藉由舉例之方式，流體通道幾何形狀可經設計以使得包括經免疫螢光染色之血液之一樣品在大約幾秒內充滿該通道，而目標白血球之沈澱會發生超過幾分鐘之一週期。在此實施例中，沈澱主要發生在使流動終止之後，且因此係相對於第一內表面指向，亦即，當將匣放置於一平坦表面上時沈澱垂直於第一內表面。在此實施例中，該指向沈澱在不使用任何流動計量或流體體積控制之情況下達成匣上體積校準。舉例而言，一已知匣通道高度及第一內表面上之一已知二維成像面積(偵測器視場)界定一已知體積。當沈澱垂直於第一內表面且允許去完成時，第一內表面上所計數之細胞表示經界定體積中之所有細胞且可計算一細胞濃度(每單位體積之細胞)。
本發明之一個優點係可使用僅一單個控制體積轉移步驟來產生一定量細胞濃度。在血細胞枚舉之實例中，僅控制體積步驟可係血液自一毛細管狀手指針刺或靜脈穿刺管之轉移。假定將已知血液樣品體積添加一經預量測、隨時可用試劑，則後續轉移及處理不需要控制體積。濃度計算係基於已知樣品稀釋度及上文所闡述之成像面積方法。在另一態樣中，對於定量測定，不需要匣上計量、泵送或體積量測。
在另一實施例中，第一內表面經修改以形成一附著表面，其中該修改增強該附著表面與分析物或物件(諸如，一哺乳動物細胞)之間的親和性。藉由舉例之方式，該附著表面可經處理而具有一聚陽離子(諸如，聚左旋賴胺酸(「PLL」))。另一選擇係，該附著表面可包括其他聚陽離子(諸如聚右旋懶胺酸)、特定抗體、黏性蛋白質(諸如纖連蛋白)、受體肽(諸如RGD)、具有正電荷黏性或分子辨識首基之自組裝單層、聚合物膜、分子辨識部分或表面活化化學品(諸如胺基矽烷)。
本發明之一個優點係獨立於讀取器儀器處理裝置(匣)，從而達成匣之成批模式處理。此提供優於其中在匣處理期間佔用儀器之競爭性技術之一顯著輸送量優點。在一項實施例中，讀取器儀器上之測定時間少於4分鐘，從而使得在讀取器上每小時處理多達15種樣品。
在一項實施例中，一匣架可用以簡化匣測定。舉例而言，具有經界定且標示之匣位置之一匣架可改良並行處理之多個匣之組織，從而減少誤差。在另一實施例中，該匣架可具有進一步簡化匣處理之作用特徵。舉例而言，將一匣插入至一架位置中可致動一計時器及針對使用者之可視提示，諸如，將一測定步驟在進行中或完成告知使用者之燈及計時器狀態。聲訊提示亦可用以提醒使用者注意匣狀態，諸如測定完成。在又一實施例中，匣架可具有實體致動匣上之處理之作用特徵。舉例而言，可在製造期間將一沖洗緩衝劑併入於匣上之一泡罩包裝中。在一項實施例中，將一匣插入至一架位置中可致動一計時器，且在一經界定時間之後該架可進一步起始將該沖洗緩衝劑泡罩包裝部署至匣中之一機械致動器(例如，一推桿或操縱桿)，從而在無任何使用者互動之情況下完成一計時測定步驟。本發明之一優點係此等簡單特徵可以一高度並行方式在獨立管理多個匣之一「作用架」上實施。簡單邏輯電路及致動器馬達可以低成本併入於該架中，從而使讀取器儀器可用於連續處理多個匣。
在一項實施例中，可使用不同波長來照射波導及所附著之分析物或物件。可拍攝附著表面上之不同視場之一或多個影像。讀取器儀器可含有一平移機構以使裝置相對於透鏡及影像捕獲裝置移動以使得可獲得不同視場之影像。
在另一實施例中，針對每一視場連同每一螢光通道捕獲一亮視場顯微術影像。該亮視場影像可用以經由形態學分析來解析目標物件。
所揭示方法及系統之有利特徵中之一者係對於每一測定而言需要樣品之一相對較小量。在基於血液之測定之上下文中，期望系統與靜脈全血及毛細管(手指針刺)全血兩者相容。在一實施例中，樣品具有介於1至50微升之間或較佳地介於1至20微升之間或更佳地介於1至10微升之間的範圍內之一特定體積。在一項實施例中，獲得一樣品中之輔助性T細胞之一準確計數需要10微升血液樣品。
在一項實施例中，可藉助一或多個標示分子(諸如，標示螢光之抗CD4及抗CD14抗體)培養一樣品，且可在裝載至匣上且經受讀取器儀器中之照射之後枚舉細胞。
在另一實施例中，本文中所揭示之試劑可提供於一盒套組中。在一個態樣中，該盒套組可尤其含有至少兩種抗體。該等抗體之實例可包含抗CD4抗體、一抗CD14抗體、抗CD3抗體或抗CD8抗體。在另一態樣中，該盒套組可含有一抗CD4抗體及一抗CD14抗體。該盒套組可含有已用一易激發標籤(諸如，一螢光團)加標籤或與該易激發標籤融合之抗體。該盒套組亦可含有辨識一級抗體(諸如，舉例而言抗CD4抗體或抗CD14抗體)之一加標籤之二級抗體。該盒套組亦可以工作濃度或以儲備濃度包含RBC裂解緩衝劑。在另一態樣中，該盒套組可進一步含有本文中所揭示之裝置(諸如，舉例而言匣)。
圖1及2展示根據一實施例之包含具有一匣110之一讀取器儀器100之一細胞計數系統。匣110經組態以用於在其中接納一樣品(未展示)，諸如血液、血清、環境樣品以及相關聯之處理試劑及類似物。讀取器儀器100可包含各種各樣之特徵，諸如但不限於，具有一門125之一開口120及一手柄130。可打開門125以將匣110插入至讀取器儀器100中以用於影像捕獲及分析。另外，如圖2中所展示，讀取器儀器100可進一步配備一托盤140以用於將匣110定位且插入至讀取器儀器100中。讀取器儀器100可具有一機載電腦及使用者介面構件(諸如，一觸控螢幕或小鍵盤)(未展示)。另一選擇係，儀器100可操作為來自一標準個人電腦(諸如，一膝上型電腦)之一USB週邊裝置。
圖3係根據一實施例圖解說明用於血細胞計數之一例示性方法之一流程圖。如圖3所展示，一方法200以其中製備欲分析之樣品之一步驟210開始。舉例而言，製備步驟210可包含藉由靜脈刺穿或其他方法之樣品收集、適當試劑之添加及對樣品之機械操縱(諸如，磁珠處理、離心作用或渦旋)。然後，在一步驟212中，將所製備樣品裝載至一匣(諸如，圖1之匣110)中。視情況，可執行該匣處之額外處理(諸如，試劑之引入)。舉例而言，可將原始樣品添加至匣，隨後添加免疫螢光染色試劑及沖洗緩衝劑。然後將匣插入至一讀取器儀器(諸如，圖1之讀取器儀器100)中以用於影像之捕獲及分析。然後，該讀取器儀器在一步驟216中產生一細胞計數數目。下文闡述方法200之步驟中之每一者之其他細節。
對於某些應用，可期望定量地枚舉一既定樣品體積中之一特定細胞類型之數目。舉例而言，感染HIV之個體中之CD4輔助性T細胞之量化通常報告每微升全血之一絕對細胞數目。本發明提供此定量細胞枚舉之實例。
將期望使製備步驟210需要極小使用者互動而不需要外部裝備(諸如，渦漩混合器、震盪器或磁體)。例如，在一例示性方法中，可經由一控制體積轉移裝置將一全血樣品轉移至一樣品處置裝置，諸如一微型管、藥水瓶或試管，其含有經預量測、隨時可用測定試劑(諸如，染色劑及緩衝劑)。在經由管倒置或吸氣之簡單手動混合之後，在步驟212中將所製備樣品裝載至匣中。此例示性方法之一優點係全血樣品轉移係整個過程中之唯一控制體積步驟。當將一已知血液體積添加至一已知體積之測定試劑時，定量維持不變且可計算一絕對細胞計數。
圖4係僅出於圖解說明目的之具有匣之細胞計數系統之一示意性表示。並未展示系統之所有組件。展示一細胞計數系統300具有插入於其中之一匣302。匣302包含一第一基板304及一第二基板306，此兩者協作界定一流體通道307。第一基板304可係一平面波導，諸如2009年11月12日提出申請且標題為「Waveguide with Integrated Lens」之前述美國專利申請案第12/617,535號中所闡述。第一基板304及第二基板306經組態以用於在其間含有一流體樣品。
如圖4中所展示，細胞計數系統300可包含用於將來自匣302之螢光或其他光信號成像於一影像感測器310處之成像光學器件308，諸如但不限於濾波器、折射元件、反射元件及全息元件。例如，影像感測器310可係一電荷耦合裝置(「CCD」)或一互補金屬氧化物半導體(「CMOS」)感測器。可使用由一發光二極體(「LED」)312提供之光(其由光學器件314引導至匣302)來產生用於匣302中物件之亮視場顯微術之光。諸如提供雷射光316及318(由箭頭指示)之雷射1及2等其他光源可用以自本質發螢光或已標示有螢光團之物件誘發螢光。在不同照射條件下捕獲之影像可用以分析以提供一細胞計數數目，如下文將更詳細地闡述。可將電腦整合至偵測系統儀器中(例如，機載電腦)。另一選擇係，該電腦可係一外部裝置。
藉助一抗體336將含有各種細胞330及332之一樣品染色。注意，可使用一個以上類型之抗體。具有不同色彩之易激發標籤340及344可用以標示抗體。抗體336僅結合至細胞330而不結合至細胞332。此外，抗體336僅用標籤340而不藉由標籤344標示。第一基板304之一內表面已經處理以形成能夠結合細胞330及332之一附著表面350。
例如，樣品可係自一受試者獲得之一體液。適合於本系統之樣品之實例可包含但不限於全血樣品、血漿、血清、痰、支氣管肺泡灌洗樣品或吸出物、鼻咽拭子、鼻拭子、腦脊髓液(「CSF」)、唾液、淋巴液、羊水、腹水、尿或其一組合。另一選擇係，樣品可係培養細胞、細胞製備物、細胞提取物、培養基及其組合。此外，樣品可係一環境樣品、廢水、工業廢棄物、食物、細菌樣品或其組合。
在一實施例中，樣品可含有目標分析物。目標分析物之實例包含但不限於具有介於自0.1至50微米之間的範圍內之尺寸(例如，直徑)之物件。目標分析物之實例可包含哺乳動物細胞。實例性哺乳動物細胞可包含白細胞。目標分析物之額外實例可包含病毒粒子、細菌、孢子、真菌、寄生蟲、脂質體、植物細胞及細胞亞組分。
該匣可經設計以使得流體通道之充滿相對於樣品中之分析物之沈澱時間較迅速。藉由舉例之方式，流體通道幾何形狀可經設計以使得包含經免疫螢光染色之血液之一樣品在大約幾秒內充滿該通道，而目標白血球之沈澱會發生超過幾分鐘之一週期。在此實施例中，沈澱主要發生在使流過流體通道終止之後，且因此，當將匣放置於一平坦表面上時沈澱實質上垂直於第一基板之第一內表面。換言之，指向沈澱在不使用任何流動計量或流體體積控制之情況下達成匣上體積校準。
圖5係根據一實施例之一例示性匣(諸如部分地展示於圖4中之匣)之一部分360之一示意性表示。如圖5中所展示，將一樣品流體362自一入口埠364引入至流體通道307中。樣品流體362流過流體通道307，如由箭頭366及368所指示，然後任何溢流自一出口埠370排出。流體通道307之幾何形狀可經設計以使得樣品流體362相對於樣品流體362中之分析物(由具有向下箭頭之點指示)之重力沈澱時間迅速充滿流體通道307。舉例而言，可藉由組態入口埠364之幾何形狀以確立一進口壓力、藉由控制流體通道307之剖面幾何形狀且藉由控制通道壁之表面能(例如，潤濕性)來策劃一流體通道之充滿速率。藉由舉例之方式，流體通道307之幾何形狀可經設計以使得包含經免疫螢光染色之血液之一樣品流體在大約幾秒內充滿流體通道307，而目標白血球(亦即，分析物375)之沈澱會發生超過幾分鐘之一週期。用於控制或策劃通道壁之表面能(例如，潤濕性)之方法可包含電漿處理(例如，氧電漿)或薄膜化學品之沈積。
當流體通道之充滿速率相對於沈澱較迅速時，沈澱主要發生在使流動終止之後。因此，沈澱因此係相對於第一內表面指向，亦即，當將匣放置於一平坦表面上時沈澱垂直於第一內表面。指向沈澱在不使用任何流動計量裝置或流體體積控制之情況下達成匣上體積校準。
在一實施例中，一已知流體通道高度及影像感測器之經校準視場可協作界定一已知三維樣品體積以便達成該樣品體積內之細胞計數之定量。舉例而言，一旦將一經免疫螢光染色之血液樣品引入至匣，該樣品內之細胞即重力地下沈(亦即，沈澱)至第一基板之其中將其成像之內表面。假定一既定視場中之所有細胞皆係自該視場正上方之液體體積指向下沈之結果，則二維影像中之細胞計數可用以計算如由該視場及通道高度所界定之液體體積中之細胞濃度。注意，沈澱期間之一定程度的橫向流體運動係可接受的，只要細胞以相同速率進入及排出該取樣體積即可。在一特定實例中，流體通道307之高度係0.14 mm且成像系統之視場係2 mm×2 mm，從而產生0.56微升之一「取樣」體積。因此，細胞計數可表達為每單位體積之細胞。在上文所闡述之血細胞計數實例中，血液至一預量測染色劑之一體積轉移導致一已知稀釋因數。在將所製備樣品轉移至匣之後，基於影像之枚舉產生每單位體積之一計數。藉助該已知稀釋因數之倒退計算允許確立最初血液樣品中之細胞濃度。
流體通道307之第一內表面可經修改以形成一附著表面，其中該修改增強該附著表面與分析物或物件(諸如，一哺乳動物細胞)之間的親和性。藉由舉例之方式，該附著表面可經處理而具有一聚陽離子(諸如，聚左旋賴胺酸(「PLL」))。另一選擇係，該附著表面可包括其他聚陽離子(諸如聚右旋懶胺酸)、特定抗體、黏性蛋白質(諸如纖連蛋白)、受體肽(諸如RGD)、具有正電荷黏性或分子辨識首基之自組裝單層、聚合物膜、分子辨識部分或表面活化化學品(諸如胺基矽烷)。
在一種方法中，樣品可在裝載至匣上之前藉助含有一或多個標示分子之一溶液(或混合物)來培養。用於血液分析之標示分子之實例可包含但不限於一抗CD4抗體、一抗CD14抗體、一抗CD3抗體或一抗CD8抗體。在一個態樣中，不同標示分子可以一順序次序逐一與樣品培養。在另一態樣中，不同標示分子可同時與樣品培養。藉由舉例之方式，一抗CD4抗體、一抗CD14抗體可預混合為一抗體混合劑，將該樣品或其一部分添加至該抗體混合劑中。可在添加樣品之前將RBC裂解緩衝劑與抗體混合劑預混合。舉例而言，RBC裂解緩衝劑可係氯化銨、溶血素蛋白質及其重組體、表面活性劑及鹽類。在另一態樣中，標示分子可係用一可偵測分子(諸如，一易激發標籤)加標籤或與該可偵測分子融合之一或多種抗體。實例性易激發標籤包含但不限於螢光染料、螢光蛋白質、鑭系螯合物、量子點及光散射粒子。
本文中所揭示之試劑可提供於一盒套組中，該盒套組可尤其含有至少兩種抗體。該等抗體之實例可包含抗CD4抗體、一抗CD14抗體、抗CD3抗體或抗CD8抗體。在另一態樣中，該盒套組可含有一抗CD4抗體及一抗CD14抗體。該盒套組可含有已用一易激發標籤(諸如，一螢光團)加標籤或與該易激發標籤融合之抗體。該盒套組亦可含有辨識一級抗體(諸如，舉例而言抗CD4抗體或抗CD14抗體)之一加標籤之二級抗體。該盒套組亦可以工作濃度或以儲備濃度包含RBC裂解緩衝劑。在另一態樣中，該盒套組可進一步含有本文中所揭示之裝置(諸如，舉例而言匣)。
所揭示裝置之有利特徵中之一者係對於每一測定而言需要樣品之一相對較小量。例如，獲得一樣品中之輔助性T細胞之一準確計數需要僅約10微升血液樣品。
在一實例中，一個二色雷射螢光成像系統用以判定一人體全血樣品中之輔助性T細胞濃度。圖6圖解說明圖3之「製備樣品」步驟210中所涉及之步驟之細節。如圖6中所展示，在一步驟410中，藉助與不同螢光染料偶聯之兩種不同抗體將一全血樣品中之目標細胞染色。在一步驟412中，使樣品中之紅細胞裂解。在於一步驟414中添加沖洗緩衝劑以移除未附著之細胞及抗體之後，在圖3之步驟214中，匣準備好用於插入至讀取器儀器中以用於影像捕獲及分析。
圖7中展示圖3之「製備樣品」步驟210之一較簡單替代方案。圖7展示一替代「製備樣品」步驟210'之細節，該步驟涉及至匣之僅兩次流體添加。如圖7中所展示，在一步驟510中，將一全血樣品與一組合染色及裂解緩衝劑混合。然後，在於一步驟512中添加一沖洗緩衝劑之後，可在圖3之步驟214中將匣插入至讀取器儀器中。在下文所論述之實例中闡述該製備樣品步驟之替代方案之其他細節。
本發明之一個優點係獨立於讀取器儀器處理裝置(匣)，從而達成匣之成批模式處理。此提供優於其中在匣處理期間佔用儀器之競爭性技術之一顯著輸送量優點。
讀取器儀器可使用不同波長來照射波導及所附著之分析物或物件以便達成差別染色分析。可拍攝附著表面上之不同視場之一或多個影像。讀取器儀器可含有一平移機構以使裝置相對於透鏡及影像捕獲裝置移動以使得可獲得不同視場之影像。此外，可針對每一視場連同每一螢光通道捕獲一亮視場影像。該亮視場影像可用以經由形態學分析來解析目標物件。
細胞計數系統可用以確立一全血樣品中之絕對CD4輔助性T細胞計數(以每微升之細胞為單位)。例如，標示有兩個不同螢光標籤之抗CD4及抗CD14抗體可用以將一血液樣品差別地染色。藉助抗CD4及抗CD14染色劑兩者染色之細胞係單核細胞。藉助抗CD4染色之細胞係CD4輔助性T細胞或單核細胞。藉由自總CD4計數減去單核細胞計數，可產生一CD4輔助性T細胞計數。另一選擇係，可使用其他差別染色方案(諸如，一抗CD4及抗CD3方法)來產生一CD4輔助性T細胞計數。
另外，亮視場顯微術可用以改良由該系統產生之細胞計數之準確性。在任何血液製備物中，諸如細胞殘骸、聚集染料、不溶解之粒子、棉絨等矯作物可危及僅基於螢光影像之計數。亮視場顯微術可用以基於諸如直徑、面積、形狀及光學密度等形態學特徵鑑別物件。舉例而言，包括細胞殘骸及染色劑之螢光粒子聚集體可作為一亮物件顯現於一螢光影像中，但可在亮視場中具有極小結構或不具有結構且因此將不符合為識別一細胞所確立之準則。
在一實例中，在「製備樣品」步驟之後，可然後將匣成像於含有兩個或兩個以上不同照射源之一讀取器儀器中，諸如，(舉例而言)以下各項之一組合：1)一紅色雷射(635 nm)；2)一綠色雷射(532 nm)；及3)一廣譜發光二極體(「LED」)。由於如圖4中所展示在第一基板304之附著表面350處捕獲所關注之細胞，因此然後必需將成像光學器件308及影像感測器310組態為聚焦於附著表面350處。用以將不同視場成像於感測器處之成像光學器件308可包含(舉例而言)一或多個折射元件(諸如，透鏡及物鏡)以及相修改元件、濾波器及反射元件。一旦達成聚焦，即捕獲對應於三個不同照射源之三個影像，且處理所捕獲之影像以在圖3之步驟216中提取細胞計數數目。
在本實例中，讀取器儀器經設計以針對一既定視場產生三個經空間配準數位影像。術語「經空間配準」意指一既定影像中之每一物件在其他經配準影像中大約具有相同實體位置。可使用熟習此項技術者所熟悉之數位影像處理演算法來校正自完美影像配準之偏離。對於每一成像模式，在軟體中為一經識別物件給出一空間位置索引。因此，每一獨特物件具有與每一成像模式相關聯之一狀態。在亮視場顯微術模式中，一物件具有一實體位置及諸如直徑、面積或形狀之形態學特徵。下文更詳細地闡述對亮視場影像之數位影像處理。在螢光模式中之每一者中，一特定實體位置處之一既定物件端視該物件之螢光標示而可或可不顯現於影像中。在軟體中，產生一既定視場中之每一物件之特性之一表格。下文更詳細地且在實例中闡述此過程。
本發明之一優點係可在不具有讀取器儀器中之零件之機械運動之情況下產生每一視場之三個經空間配準影像。舉例而言，成像光學器件308可包含一雙帶通螢光發射濾波器，其使來自所使用之兩個螢光標籤之螢光通過但阻擋兩個雷射激發波長。亮視場LED之波長可經選擇以使得LED發射穿過該雙帶通濾波器以便另外達成亮視場影像產生。就此光學系統組態而言，僅藉由接通及關斷三個光源(LED、雷射1、雷射2)同時在相同影像感測器處捕獲所得影像來產生三個影像。以此方式，藉由消除對移動光學組件(諸如，可移動反射鏡及濾波器輪)之需要，本組態可既快速又穩健。
雖然可在不移動零件之情況下產生每一視場之經空間配準影像，但可實施讀取器儀器內部之機械平移以使匣移動經過多個視場以增加總細胞計數及統計準確性。通常，分析5至20個視場，且可根據特定需要調整用以捕獲及分析之視場之數目。一例示性儀器利用九個成像視場來研究提供具有在有臨床價值範圍之低限處之統計顯著性之絕對計數(例如，在200個細胞/微升下，統計誤差係+/-20個細胞或10%)之一複合樣品體積。儀器光學設計及匣平坦性之組合可使得在一單個初始自動聚焦操作之後所有視場皆在焦點上且被成像，從而改良讀取速度。
圖8概述根據一實施例之適合於在圖3之步驟214中使用之影像捕獲及分析之一例示性過程。在一開始步驟602處起始該例示性過程，且在一步驟604處起動讀取器儀器之各種組件。「起動儀器」步驟可包含(例如)連接一感測器(亦即，任一適合影像捕獲裝置)與步進器馬達(或其他適當運動控制機構)，及其校準。亦可在步驟604中讀取如儲存於一外部檔案中之任何感測器校準資料。在儀器起動之後，作出判定裝載於一匣中之一樣品是否準備好用於在成像系統內量測之一決策620。若決策620之答案係「否」，則樣品未準備好，然後該過程繼續進行以在一步驟622中退出該程式，且在一結束步驟624中結束該過程。
繼續參考圖8，若決策620之答案係「是」，則樣品準備好，且然後該過程繼續進行以在一步驟630中將感測器移動至匣中所關注之一第一視場。在一步驟632中執行一自動聚焦常式，在一步驟634中設定感測器之曝光時間，在一步驟636中啟用三個光源中之一者，且然後在一步驟638中獲取所關注之第一視場之一影像圖框。然後在一步驟640中停用在步驟636中啟用之光源，且在一步驟642中保存如此捕獲之影像圖框。然後在一決策650中，判定是否已將所有光源用於影像捕獲中。
若決策650之答案係「否」，則尚未使用所有光源，然後該過程返回至步驟634。若決策650之答案係「是」，則已使用所有光源，然後該過程繼續進行至判定是否已捕獲所有視場之一決策660。若決策660之答案係「否」，則尚未捕獲所有視場，然後該過程繼續進行至將感測器移動至下一視場之一步驟662，且重複步驟632至650。若決策660之答案係「是」，則已捕獲所有視場，然後在一步驟670中執行對所捕獲影像之分析，且在一步驟672中保存分析結果。然後該過程返回至決策620之前。若已將另一樣品裝載至成像系統中，則決策620之答案再次係「是」，且該過程再次自步驟630繼續進行。若尚未將其他樣品裝載至成像系統中，則決策620係「否」且結束該過程。
已演示兩種不同自動聚焦方法。稱為基於微球體之自動聚焦之一種方法使用正如所關注之細胞一樣下沈至底部表面之螢光微球體。稱為基於條紋之自動聚焦之另一方法在底部表面上利用一螢光塗層以產生可用於自動聚焦過程中之條紋。下文詳細地闡述兩種自動聚焦方法。可利用其他自動聚焦方法。舉例而言，可出於自動聚焦目的而偵測且使用模製、浮凸或印刷至匣中之基準特徵。在一實施例中，諸如在數位照相術中使用之彼等方法等光學方法亦可併入至細胞計數系統中。
在此方法中，匣含有細胞及螢光微球體兩者。該等微球體已經挑選以使得其正如細胞一樣下沈至流體通道之底部，且發出的螢光顯著亮於紅色通道中之細胞(已使用來自Bangs Laboratories之6 μm「Flash Red」聚苯乙烯微球體)。因此，可調諧成像系統以僅看到紅色通道中之微球體，此允許基於使用圖9中所圖解說明之自動聚焦常式之微球體之顯現而自動聚焦。
圖9圖解說明適合於用作圖8之步驟632中之自動聚焦常式之一過程之一實例。在一開始步驟702處起始該例示性過程，且在一步驟710中將成像光學器件移動至一第一焦點位置。在一步驟712中啟用用於自動聚焦之特定光源。在一步驟714中獲取第一焦點位置處之視場之一影像，且在一步驟716中將該影像儲存於記憶體中。在一決策720中，是否已在成像光學器件之所有相關位置處捕獲一影像之一判定。
若決策720之答案係「否」，則尚未在所有相關成像光學器件位置處獲取影像，然後該過程繼續進行以在一步驟722將成像光學器件移動至下一位置，且重複步驟714至716及決策720。因此，使成像光學器件移動經過一預定系列之焦點位置。一旦已將所有焦點位置取樣，決策720之答案即係「是」且然後該過程繼續進行至其中停用光源之一步驟730。然後，在一步驟732中對所捕獲影像執行一小波轉變分析以尋找影像中之高頻空間內容。最佳焦點位置與其中最大化所獲取影像之高頻空間內容之成像光學器件位置有關。
基於步驟732中之小波變換分析之結果，作出判定是否已找到成像光學器件之一理想位置之一決策740。若決策740之答案係「否」，則尚未找到一理想位置，然後該過程返回至步驟710，且重複步驟710至722。若決策740之答案係「是」，則已找到一理想位置，然後在一步驟750中將成像光學器件移動至該理想位置且在一結束步驟760中結束該過程。
在自動聚焦程序完成之後，最佳化該成像系統以用於細胞成像且記錄對應於以下三個不同光源之三個影像：1)紅色螢光；2)綠色螢光；及3)亮視場(參見圖8)。識別三個經配準影像中之每一者中之情形且可使該等情形相關以用於區別樣品中之細胞類型。最小化用於細胞成像之視場中之微球體之數目係有益的。在細胞計數簡單性與自動聚焦可靠性之間存在一折衷。當一視場中之微球體之數目下降至一定位準以下時，自動聚焦常式可失敗。若底部表面係充分平坦，則可在無需重新聚焦之情況下在某些視場之間移動。然後，可將微球體濃度降低至其中僅在經成像視場中之某些視場中自動聚焦係充足之點。若該常式在所考量之視場中失敗，則移動至相鄰視場且以彼方式保持下去直至找到具有足夠微球體之一視場為止。當找到此視場時，執行自動聚焦，移動回至首先考量之視場且執行細胞成像。
在此方法中，不將任何事物添加至樣品以幫助自動聚焦。替代地，該方法在附著表面(亦即，其中捕獲所關注之細胞之表面)上利用一螢光塗層。已演示紅色螢光團之非特定結合提供充足信號。亦已演示可將一薄表面塗層中之螢光材料沈積至基板上且以彼方式達成一充足信號。雷射束之固有特性在該薄表面塗層中產生清晰條紋。當偏離最佳焦點時迅速降低條紋對比度，從而提供用於自動聚焦於底部表面上之一方法。記錄成像系統之不同焦點設定處之一系列影像，此可(舉例而言)藉由變化物鏡至匣距離來實施。
另一選擇係，條紋自動聚焦可係基於附著表面上之一或多個經沈積之「聚焦點」。聚焦點沈積方法之優點係條紋信號係明亮且可再現，從而改良自動聚焦常式之穩健性。根據圖10及11中概述之程序分析影像。
圖10圖解說明適合於用作圖8之步驟632中之用於基於條紋之自動聚焦之自動聚焦常式之一過程之一實例。一過程632'與圖9中所詳述之過程632相同，只是已用一條紋分析步驟832替換小波變換分析步驟以外。
圖11圖解說明圖10之條紋分析步驟832之其他細節。在一步驟910中，自在自動聚焦過程中所捕獲之影像提取一所關注區。然後，在一步驟912中形成一譜線輪廓(例如，沿影像像素之行之總和)。在一步驟914中計算若干(「n」個，其足夠大於相鄰條紋峰值之間的像素數目)元素之一實施框平均值。在一步驟916中自該譜線輪廓減去框平均值以移除在步驟912中所形成之譜線輪廓之慢變化。在一步驟918中修整前「n」個元素。在一步驟920中對經截短之線譜輪廓執行一快速傅立葉(Fourier)變換(「FFT」)。在一步驟922中計算FFT結果之平方量值，然後在一步驟924中應用二項式平滑化。在一步驟926中對所得經平滑化FFT之前45%執行一高斯(Gaussian)擬合，且在一步驟928中將高斯振幅用作最佳焦點之一量度。換言之，成像光學器件之其中最大化高斯振幅峰值之位置被認為係成像光學器件之理想位置。
兩個不同自動聚焦常式之分析階段可偶爾未能找到成像光學器件之一理想位置。舉例而言，高斯擬合步驟926可不能夠將一高斯輪廓擬合至該等資料點。作為另一實例，可在高斯擬合之後找到一個以上峰值，藉此導致關於哪個峰值係成像光學器件之理想位置之適當指示符之混亂。若發生此一失敗，則重複自動聚焦過程，如圖9中所展示。
圖12展示根據一實施例之具有用於與自動聚焦常式一起使用之一印刷點之一平面波導之一剖視圖。印刷之自動聚焦點之一例示性材料係一螢光染料，諸如DyLight649(賽默飛世爾科技(Thermo))。如圖12中所展示，一平面波導1005可包含一整合透鏡1010。舉例而言，可藉由使用一非接觸印刷機(諸如，由BioDot,Inc.生產之彼等印刷機)或類似裝備在距整合透鏡1010之一特定距離L處沈積一點1015。在一項實例中，L=31.75 mm，其對應於跨越細胞附著表面之九個視場中之第五視場之一中心。當細胞附著表面係一多胺聚合物(諸如，聚左旋賴胺酸)時，可期望印刷一胺反應性試劑作為自動聚焦點。一例示性材料係一琥珀醯亞胺脂修改之有機染料，諸如NHS-DyLight649。
圖13係根據一實施例圖解說明圖8之「執行影像分析」步驟670之細節之一流程圖。如圖13中所展示，該例示性過程假定已針對每一視場捕獲且儲存不同照射條件下之三個影像。在所圖解說明之實例中：影像1)使用藉助LED 312及光學成像器件314之照射之亮視場影像；影像2)使用藉助雷射1之照射所獲得之螢光影像；及影像3)使用藉助雷射2之照射所獲得之螢光影像。在一特定實例中，LED 312可係一紅色LED，其已經選擇而以經設計用於自AlexaFluor 649激發發射之頻帶中之可透射穿過一發射濾波器之一波長產生光。雷射1可係以與AlexaFluor 649之激發相容之一紅色波長發射之一個二極體雷射，且雷射2可係以與R-藻紅蛋白之激發相容之一綠色波長發射之一個二極體雷射。此實例中之影像分析常式可適合於一人體血液樣品中之CD4輔助性T細胞之枚舉。
繼續參考圖13，例示性影像分析過程以識別亮視場影像及螢光影像中之白細胞(「WBC」)之一步驟1110開始。步驟1110實質上將一物件辨識演算法強加於所捕獲之影像以識別歸屬於一已知參數範圍內之物件，如將在圖14中更詳細地闡述。
如圖14中所展示，步驟1110包含一亮視場影像物件辨識常式。一小波變換步驟1210提供初始雜訊減少預處理。在一步驟1212中將一變異數濾波器應用於此經預處理影像之一大面積上方，且在一步驟1214中確立一臨限值以在一步驟1216中產生一臨限遮罩。同時，在一步驟1220中藉助一小面積變異數濾波器(隨後在一步驟1222中藉助一均值濾波器且在一步驟1224中藉助一模糊常式)處理來自步驟1210之經預處理影像。此時，在一步驟1226中將來自大面積變異數濾波器之臨限遮罩應用於來自步驟1224之所得影像。然後在一步驟1228中使經處理影像經受一去聚叢選路。然後可應用形態學濾波器(諸如，大小濾波器及圓形度濾波器)以在一步驟1230中識別且計數所關注之粒子。形態學濾波器消除殘骸、亞細胞組分及倖免於裂解過程之任何紅細胞。結果係資料1240，其包含全部假定為白細胞(「WBC」)之物件位置之一表格。
一旦已在亮視場影像中識別WBC位置，即藉助兩個雷射通道產生經配準之螢光影像。亦將類似於圖14中所展示之濾波演算法之一濾波演算法應用於兩個螢光影像(亦即，影像2及影像3)以產生彼等影像中之螢光物件之位置。返回參考圖13，分別在步驟1112及步驟1114中使影像2及影像3與亮視場影像中之影像相關。在一實例中，螢光影像2展示藉助抗CD14抗體染色之細胞，表示所有單核細胞，且影像3表示藉助抗CD4抗體染色之所有細胞，因此表示單核細胞及CD4輔助性T細胞兩者。在圖13中，步驟1112導致資料1116，表示視場中之單核細胞(例如，CD14+細胞)之實體位置及數目。步驟1114導致資料1118，表示相同視場中之所有輔助性T細胞及單核細胞(亦即，CD4+細胞)之實體位置及數目。在一步驟1120中自影像3(資料1118)細胞減去影像2(資料1116)細胞以產生資料1122，從而識別影像中之CD4+輔助性T細胞。就已知視場樣品體積(影像視場面積乘室高度，如上文所闡述，)而言，可在裝置中將CD4+輔助性T細胞計數轉換成每微升之細胞。就在將所製備樣品添加至裝置之前所執行之已知體積稀釋而言，可計算最初血液樣品中之CD4+輔助性T細胞濃度(每微升之細胞)(資料1122)。
在一項實施例中，本發明之一重要應用係重點照護下之全血樣品中之CD4輔助性T細胞之迅速、廉價識別及枚舉，其中經最簡單培訓之人員操作儀器。對於此應用，毛細管(手指針刺)全血係所期望之樣品矩陣。手指針刺樣本由於需要對小血液體積(例如，<50微升)之準確體積轉移而呈現挑戰。在一項實施例中，藉助乾燥抗凝劑(EDTA)來製備微型管及10微升可拋移液管。可期望10微升或更少血液體積，此乃因較大手指針刺體積(例如，20至50微升)較難以獲得，從而需要較大刺血針及較廣延之手指操縱。在另一態樣中，「擠」手指以增加該體積可導致樣本中之相當大量之間質液液。藉助間質液之稀釋形成一定量CD4量測之計數誤差。處置10微升或更少樣品體積之裝置可幫助改良測定之準確度，且此處用作演示。
在另一實施例中，在匣中或在樣品處置裝置中將測定試劑(染色及裂解試劑)弄乾 乾燥機載試劑相對於液體試劑提供經改良之環境穩定性。乾燥試劑之製備可係藉由直接凍乾至匣、樣品處置裝置或體積轉移裝置組件中，或者作為片劑添加至匣、樣品處置裝置或體積轉移裝置。
在另一實施例中，乾燥測定試劑之再水化係藉助樣品達成。在另一實施例中，乾燥測定試劑之再水化係藉助在測定時添加之水或緩衝劑達成。在另一實施例中，再水化緩衝劑或液體測定試劑儲存於匣上，舉例而言，儲存於一泡罩包裝中。在一實施例中，一手動動作(諸如，關閉一帽或擠壓匣之一區段)釋放再水化緩衝劑或液體測定試劑。
在另一實施例中，可實施匣上儲存之液體試劑(例如，泡罩包裝)與具有作用特徵之一架之一組合。在一實施例中，匣「開口」可包含(舉例而言)一個10微升毛細管以將手指針刺或靜脈刺穿樣本抽取至裝置中。如上文所闡述，可將乾燥染色劑及EDTA以及可能裂解鹽類塗佈於管壁上。在添加樣本之後，操作者可關閉毛細管上方之一蓋，從而致使一塞子或柱塞與毛細管介接且將10微升樣品推至匣之一內部通道中。匣可放置於架上，在該架處一機械致動器可在一預界定培養週期之後按壓匣上泡罩包裝。該泡罩包裝可含有再水化緩衝劑以再水化機載乾燥試劑。或該泡罩包裝可含有液體測定試劑。在另一實施例中，可手動地或經由架致動器部署匣上沖洗緩衝劑。
在一實施例中，執行無稀釋或RBC裂解之純全血之直接成像。此實施例提供消除液體試劑之添加之優點。在一項實施例中，減少通道高度以形成成像視場中之一較薄細胞層。選擇通道高度以最小化RBC背景之干涉。
在另一實施例中，亮視場影像不用於分析中。在另一實施例中，藉由凝集(例如，類似於一庫姆氏(Coomb)測試)移除RBC。
在一實施例中，提供對匣之一表面之印刷控制。舉例而言，相關印刷控制可包含細胞標記(CD4及CD14)之印刷點，其將充當針對流體流動之程序控制以及抗CD4及抗CD14抗體染色劑之功能。藉由諸如在美國專利6，008，052中找到之彼等方法等方法乾燥之印刷週邊血液單核細胞(PBMC)製備物亦可充當程序控制。另外，印刷抗血紅蛋白抗體點將用以驗證RBC裂解及血液之添加。所捕獲之血紅蛋白將藉由包含於具有CD4及CD14染色劑之乾燥蛋白質混合物中或沖洗溶液中之一標示螢光之抗血紅蛋白抗體來偵測。為避免由血液中之少量本質血紅蛋白造成之假陽性，印刷抗體之量及所標示抗血紅蛋白抗體之濃度可經調整以圍繞經裂解RBC之適當範圍按比例縮放。
可調整之移液管自一FDA/CLIA角度來看被認為「複雜」且通常不可用於資源有限背景中。因此，根據一實施例，可拋轉移裝置特徵在於用於一測定盒套組中。裝置係自Poly-Pipets Inc.(新澤西州，恩格爾伍德克利夫斯(Englewood Cliffs,NJ))及SafeTec Clinical Products(賓夕法尼亞州，艾維蘭(Ivyland,PA))獲得。來自SafeTec之Microsafe管在臨床上用於諸如Hemosense INRatio產品等經批准測試中。準確性及再現性實驗間接表明Microsafe產品具有可接受之準確性。
此外，不管一特定測試之臨床實驗室改良修正案(「CLIA」)放棄狀態，持有證明書之臨床實驗室規則地(通常按日)藉助陰性及陽性控制溶液執行QC檢查。在一實施例中，諸如在其表面上具有或不具有CD4及CD14標記之乳膠珠(0.3至10微米直徑)等微粒可充當參考控制。
在一實施例中，可使用如用於裂解溶液之不持續體積之校準器之螢光珠。可在測定開始時將固定數目個螢光珠添加至乾燥試劑混合物，從而導致該等珠與細胞一起成像。可比較所量測之珠計數與所預期之珠計數，且差將反映所添加裂解溶液之實際量。用於計數校準之螢光珠之使用在流式細胞計量中係常見的，其中CountBright(Invitrogen)及CytoCount(Dako)珠係實例。所添加之珠將未必干涉目標CD4或輔助性T細胞計數，此乃因珠螢光將匹配抗CD14標示(亦即，紅色通道)之發射，且因此將在標準影像演算法中減去珠計數。可調整校準珠之密度以提供準確但並非壓倒性之經成像珠計數。
圖19至21圖解說明形成適合於與本文中所闡述之實施例一起使用之一平面波導之一替代方式。圖19展示如由一箭頭1720所指示拼湊在一起之一折射體積1700及一平面波導1710之一透視圖。圖20展示折射體積1700及平面波導1710之一側視圖。圖21展示一平面波導配置1750，其中折射體積1700與平面波導1710組合為一單個組件。
如圖19至21中所展示，折射體積1700可與平面波導1710單獨形成，然後將兩者拼湊在一起(如由箭頭1720所指示)以形成平面波導配置1750。平面波導配置1750可用以替換(舉例而言)圖12之平面波導1005。自一製造角度來看，折射體積1700及平面波導1710之單獨製作可係有利的。舉例而言，一折射率匹配液或環氧樹脂可用以將折射體積1700與平面波導1710接合在一起以便模擬一整體形成之平面波導(諸如，圖12之平面波導1005)之效能。
以下實例係僅出於圖解說明實施例之目的而提供且並不意欲具有限定性。試劑、化學品及其他材料係作為例示性組件或試劑呈現，且鑒於上述論述，可在本發明之範疇內作出各種修改。除非本發明中另有說明，否則用於如在實例中闡述之系統及測定中之組件、試劑、方案或其他方法僅係出於圖解說明之目的。已研究大量抗體之各種同型以及用於CD4、CD14、CD3、CD8及CD45之染色劑。此等實驗成功地演示查看多種標記之能力。下文之實例演示使用CD4及CD14對絕對細胞計數之量測，但在本發明之上下文內可使用其他標記組合來提供絕對細胞計數。
生物試劑 。出於本發明之目的，使用市場上可購得且通常使用之抗體。然而，應認識到，亦可使用其他商業及經定製之抗體。亦應理解，對於任一既定抗體，可使用對抗相同抗原之抗體之一單批或一混合物。此等抗體可係自不同源獲得但全部係反應性對抗相同抗原。
測定試劑 。測定試劑中之某些實際包含牛血清白蛋白(「BSA」，密蘇裏州聖路易斯之西格瑪生命科學公司(Sigma Life Science,St. Louis,MO))、磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」，依利諾斯州羅克福德之飛世爾科技(Fisher Scientific,Rockford,IL))。
血液樣品 。由於本系統及方法之重要用途中之一者將係在重點照護背景下，因此評估該系統對全血樣品之效能較為重要。全血係根據一IRB批准方案來源於Constance Benson博士領導之下的加利福尼亞大學聖地亞哥分校抗病毒研究中心(University of California San Diego Antiviral Research Center)(「AVRC」)之HIV陽性捐獻者。將靜脈刺穿樣品收集於乙二胺四乙酸(「EDTA」)血液收集管(Lavender Cap BD Vacutainer)中且連夜運送至在接納樣品之兩個小時內(亦即，在抽取之24小時內)實施測定之地點。
測定匣及儀器 。此處實例中所闡述之系統將單次用可拋測定匣與一讀取器儀器組合。使用一多模式平面波導技術來照射螢光免疫測定且使其成像。幾十年來，已將各種類型之平面波導用於生物感測器及免疫測定應用中，且該等平面波導經受著數種技術評論。簡言之，將一光源(通常係一雷射)引導至一波導基板中。本系統使用如(舉例而言)2009年11月12日提出申請、標題為「Waveguide with Integrated Lens」之序列號為12/617,535的美國專利申請案及2010年11月9日提出申請、標題為「Planar Optical Waveguide with Core of Low-Index-of-Refraction Interrogation Medium」之序列號為12/942,234的美國專利申請案中所揭示之一平面波導系統，該等申請案之全部內容皆以引用方式併入本文中。
讀取器儀器設計併入有兩個雷射二極體(540及635 nm)及具有簡單成像光學器件之一亮視場LED。在一例示性實施例中，此等照射源可係低成本儲備雷射及LED，其中在三模式照射系統中無移動零件。成像光學器件包含用於將匣之附著表面處之光信號成像至一低成本CMOS偵測器上之收集光學器件。
一簡單機械平移模組已併入至讀取器儀器中，因此允許跨越樣品體積之九個毗鄰視場(「FOV」)之成像。增加之FOV數目改良技術統計，特別係對於低CD4計數樣品。就九個FOV而言，相對於一單個視場之30%，已將200個細胞/微升下之所得統計計數誤差(%CV)減少至九個FOV之大約10%。在圖9至11中所闡述之自動聚焦機構亦已實施於本實例中。舉例而言，自動聚焦機構可係基於一步進器馬達模組，且亦可涵蓋其他實施方案。注意，自動聚焦之主要目的係精細焦點調整。在一例示性實施例中，波導及匣之平面性與讀取器組件之機械公差組合導致在匣成像器件僅需要較小焦點調整。
用於實例中之匣係基於具有用以促進光插入其中之一整合透鏡(例如，圖12之整合透鏡1010)之一注入模製之塑膠平面波導(例如，圖3之第一基板304)之一簡單單通道總成。一雙側黏性襯墊用以界定用於含納經處理樣品之一流體通道。該襯墊亦將平面波導結合至一注入模製之上部組件(例如，圖3之第二基板306)。該上部組件提供流體輸入及輸出埠，如2011年3月31日提出申請且標題為「Cartridge for Use with a Reader」之序列號為61/469,954的美國臨時專利申請案中所論述，該案之全部內容皆以引用方式併入本文中。上部組件上之輸出埠上方之一吸附墊可藉助一扣入塑膠罩包封，從而使得自含納有匣流體，藉此最小化生物危害。雷射焊接可進一步提供襯墊黏合之一較低成本、可能更迅速替代方案。
在組裝至匣中之前，藉助一陽離子聚合物層活化平面波導之內表面以提供「普遍」白細胞黏合(亦即，如先前所論述之一附著表面)。舉例而言，該附著表面可經處理而具有聚左旋賴胺酸(「PLL」)或任何其他適合之表面修改以使得該修改增強該附著表面與分析物或物件(諸如，一哺乳動物細胞)之間的親和性。當樣品流過第一內表面與第二內表面之間的窄體積時，樣品中之分析物或物件中之一或多者可下沈及/或附著至附著表面。
樣品可在裝載至臺上型匣上之前及之後在環境溫度(在此項研究中其係大約20至25℃)下處理。由於可獨立於讀取器儀器執行測定程序，因此可成批處理樣品匣，其中最多並行實施30個，舉例而言。用於匣之樣品體積係約10微升全血，從而使匣與手指針刺毛細管樣品相容。
如先前所論述，對在讀取器儀器處捕獲之影像執行影像處理以用於點查找、計數、點內部螢光信號強度量測及正規化、減去單核細胞信號及減去殘骸染色。在已收集所期望資料之後，可將匣自讀取器儀器移除並作為生物危害廢棄物安置，且可將下一經處理匣插入至讀取器儀器中。
執行如圖6中所圖解說明之測定方案以產生針對此實例設定之資料。在血液抽取之24小時內接納並處理血液樣品。簡言之，藉助標示染料之抗CD4及抗CD14抗體(分別為R藻紅蛋白(「R-PE」)及Alexa649)將一10微升新鮮全血樣品染色達5分鐘。在此步驟中使用6微升染色試劑。然後，將樣品染色劑混合物添加至100微升氯化銨RBC裂解緩衝劑。此時，樣品稀釋度係已知的且可用以倒退計算最初血液樣品中之計數。在5分鐘之裂解之後，將大約40微升轉移至匣之入口埠，且匣通道藉由毛細管動作迅速充滿。充滿時間通常少於5秒，此時流動停止。注意，在此轉移步驟時不需要一準確體積。至聚合物附著表面之WBC之重力沈澱在至匣之樣品添加之大約5分鐘內完成。最後，添加一沖洗溶液以透過通道清洗過量螢光染色劑。然後將匣插入至讀取器儀器中，在該讀取器儀器處在大約3分鐘內完成影像捕獲及資料處理。可並行處理8至20個匣且可順序地將該等匣成像，從而導致每小時多達20個匣之一輸送量。
在讀取器儀器中，將雷射光耦合至光學波導中以照射經染色之細胞，且使用圖8、10、11、13及14中所闡述之方法來分析所捕獲之螢光影像以區分不同細胞類型且清點不同細胞類型之數目。執行影像分析以比較螢光影像與亮視場影像兩者以解析殘骸、未標示之細胞及具有任一染色劑或兩種染色劑之細胞。如上文詳細論述，藉由標示染料之抗CD4抗體將CD4 T細胞及單核細胞兩者染色。相比之下，藉由標示染料之抗CD14抗體僅將單核細胞染色。因此，CD4 T細胞之總數目通常等於抗CD4染色細胞之數目減去抗CD14染色細胞之數目，其中自亮視場結果有所調整。
特定而言，分析影像以藉由使每一視場中之三個重疊影像相關來特定地計數輔助性T細胞。如先前所闡述，亮視場影像用以自實際細胞鑑別非細胞殘骸。在本實例中，635 nm雷射(紅色)影像中之螢光物件係藉助抗CD14抗體染色且係單核細胞(亦即，圖13中之影像2)。540 nm雷射(綠色)影像中之螢光物件係藉助抗CD4抗體染色且可係輔助性T細胞或單核細胞(亦即，圖13之之影像3)。藉由自經配準影像堆疊中之綠色物件減去紅色物件，產生一絕對輔助性T細胞計數(稱為CD4計數)。可利用多個差別染色方法(例如，CD4/CD8、CD4/CD3)代替本實例中論述之CD4/CD14組合。
已使用本系統及方法處理超過135種臨床樣本，且比較該等結果與使用流式細胞計量獲得之結果。已測試各種濃度及混合物下之多種市場上可購得之染色劑抗體以最佳化效能。
圖15展示分別自如由當前所揭示系統且藉由標準FACS方法量測之全血樣品及CD4耗盡之血液樣品獲得之結果之一比較研究。同一天在兩個設施處分裂及處理未經識別之全血樣品，一個設施在科羅拉多大學丹佛市分校健康科學中心(University of Colorado Denver Health Science Center)使用一BD FACSCaliburTM(雙平臺)。另一設施係使用本文中所揭示之系統及方法來執行。標繪圖中之每一圓圈表示實施於兩個系統上之一個全血樣品。完美一致將產生沿對角「身份」線之一直線。Passing-Bablok回歸(虛線)展示在95%置信度下小於+/- 5%之一斜率偏差及在95%置信度下小於15之一截距偏差。如圖15中所展示，自「黃金標準」FACS獲得之CD4 T細胞計數與使用當前所揭示系統及方法獲得之彼等計數相當。
雖然各種各樣之抗體、緩衝劑溶液濃度及培養時間可適合於在本文中所闡述之實施例中使用，但可能抗體組合之一項實例係OKT4(Biolegend)、SK3(BD)及13B8.2(Beckman Coulter)(如抗CD4抗體)以及HCD14(Biolegend)及TUK4(AbD Serotec)抗CD14抗體。儘管認識到OKT4對在大約8%的非洲人口中存在之一特定基因變體無效，但OKT4與SK3或13B8.2之混合劑混合物可幫助避免此潛在誤差且亦已被觀察到可能由於在不同表位處結合而提供更強烈之染色。
將200微升10x RBC裂解緩衝劑(Biolegend目錄第420301號)與1.8 ml去離子水混合以製備1x RBC裂解緩衝劑。允許1x RBC裂解緩衝劑加溫至室溫。將匣自封裝移除且放置於一水平表面上。藉由混合以下三種抗體來製備一抗體混合劑：(a)鼠抗人CD4藻紅蛋白，克隆OKT4(Biolegend目錄第317410號)；(b)鼠抗人CD4藻紅蛋白，克隆13B8.2(Coulter目錄第IM0449U號)；及(c)鼠抗人CD14 AlexaFluor 647，克隆HCD14(Biolegend目錄第32561號)。舉例而言，可依據體積(如1微升OKT4、2微升13B8.2及1微升HCD14)混合該等抗體；可根據測定效能最佳化確切混合物。在藉由渦旋強力地混合該混合劑之後移除4微升抗體混合劑。將該4微升抗體混合劑添加至一樣品管中之100微升1x RBC裂解緩衝劑且使其完全混合。
執行如圖5中所傳輸之2步驟樣品處理方案以產生此實例中設定之資料。緊接將10微升血液樣品移除且添加至含有約104微升抗體混合劑/裂解緩衝劑混合物之樣品管之前，藉由重複管倒置使一中之血液樣品完全混合，如緊接前一段落中所闡述。
將血液樣品與樣品管中之抗體及RBC裂解緩衝劑平緩混合。已藉助數種方法(包含一低速渦旋混合器、管倒置或藉助一移液管緩慢吸出並分注)成功地執行「平緩混合」。然後將35微升混合物裝載至一匣之入口埠。匣之流體通道藉由毛細管動作而充滿，且在將200微升之一沖洗劑添加至入口埠中以固定細胞且將任何未附著之染料/螢光染色劑沖洗掉之前，允許經裝載之匣置於一水平表面處達約20分鐘。注意，流體通道之窄高度及至溶液之細胞之高表面曝露去除對在培養期間旋轉或混合細胞之需要。
圖16展示比較在實例2及一雙平臺流式細胞計量系統中獲得之CD4細胞計數、藉由展示相對於一Passing-Bablok擬合之計數分佈而量化該比較之一比較性研究之結果。
圖17展示量化使用實例2之方案獲得之CD4細胞計數之變化之一再現性研究之結果。在10個連續匣上實施來自一單個血液樣品之等分部分。針對10個匣中之每一者獨立實施染色方案。
對於一重點照護裝置，將期望提供不需要特別控制溫度儲存之盒套組組件。此處簡單闡述乾燥盒套組試劑研發。當前闡述之方案中之最易變試劑可係染色劑溶液，尤其當在室溫下儲存於可具有不持續溫度控制之設施中時。已將樣品收集管中之抗體染色劑成功地弄乾且已重複地演示具有等於液體染色劑之直接添加及流式細胞計量量測之效能之測定。此外，將EDTA併入至乾燥抗體點中，從而導致10微升血液樣品之直接抗凝劑添加及染色。實驗指示僅5至10分鐘之培養下之高效能。此等乾燥實驗係基於一適當基於糖之溶液及連夜真空乾燥之選擇。較高抗體活性可藉助凍乾而達成。圖18展示跨越流式細胞計量(FACSCaliber)及在當前所闡述之細胞計數系統之情況下藉助乾燥或液體抗體之細胞計數比較。使用當前所闡述之細胞計數系統之量測係依據如由實例1或2所指示之個別匣。誤差棒係基於跨越每一匣中之多個視場所計數之細胞數目。流式細胞計量量測中之誤差係未知的。
迄今，使用一典型氯化銨裂解緩衝劑(標準配方包含氯化銨(150 mM NH4Cl)、碳酸氫鉀(KHCO3)及EDTA.)進行實例1及2以及各實驗。含有NH4Cl裂解緩衝劑之一盒套組之一潛在缺點係一1x溶液之不穩定性。內部研究表明2周內裂解活性損失50%。為將組合之染色/裂解步驟整合至測定中且避免一1x溶液之不穩定性，可將抗凝劑、染色劑及裂解鹽類組合成一單個乾燥片劑中。血液樣品之添加將提供用以溶解試劑之初始液體。類似地，亦可藉由將一所製備之溶液弄乾或將氯化銨及碳酸氫鉀之乾燥化學品混合來達成NH4Cl及KHCO3之一乾燥裂解封裝。為防止至NH4Cl溶液之抗體之濃縮與擴展曝露，可製備染色及裂解緩衝劑之單獨片劑且將其放置於同一樣品管種，且若需要，則可將染色及裂解溶液之片劑進一步分離成箔「小袋」。
一(或多個)乾燥裂解/染色片劑可不完全消除對添加液體以用於稀釋之需要。舉例而言，RBC(甚至RBC殘骸)過量密度可使細胞影像模糊不清且可需要添加諸如去離子水之一稀釋劑以達成適當稀釋。
沖洗緩衝劑用以移除總體溶液中之非結合染色劑之背景螢光，從而導致更清晰地解析之螢光細胞。沖洗緩衝劑可係一等滲漂洗溶液或一定影溶液(如，多聚甲醛)。儘管沖洗確實改良對細胞之解析且類似於用於流式細胞計量中之離心作用步驟，但可期望消除此沖洗步驟。亦即，在沒有沖洗步驟且假定乾燥染色及裂解試劑之合理預期之情況下，測定方案可變得如全血、乾燥試劑與一預量測「藥水瓶」之分注至匣中之去離子水之一初始混合一樣簡單。例如，在10至30分鐘之一培養時間之後，可立即將匣(或一組匣)插入至讀取器儀器中。
已執行對沒有沖洗步驟之影像經染色及裂解樣品製備之一初步實驗。在此實驗性設定中，染色濃度及時間係變化的，且如所預期，較低染色濃度具有較低背景且需要較長時間來達成等效染色強度。此等結果之最突出且相關特徵係沒有一沖洗步驟之影像確實允許解析經染色細胞超過螢光背景。
儘管實例2中所闡述之程序將染色及紅細胞(RBC)裂解組合成一個步驟，但需要一操作者在將染色-裂解混合物與血液樣品混合之前將染色溶液與裂解緩衝劑短暫(通常在幾小時內)混合。此額外試劑製備步驟可係操作者之一額外負擔且可增加過程之複雜性，此又可造成測定中之更有可能之誤差。
此處揭示一經組合之試劑，其在一個穩定配方中含有染色試劑及RBC裂解試劑兩者。該穩定配方提供一單一儲備試劑以用於由操作者在沒有額外試劑製備步驟之情況下測試。此改良可簡化偵測全血中之特定淋巴細胞之過程且可使所揭示之測定與CLIA放棄之程序更相容且更適合於一展開式全球市場。在一項實施例中，細胞染色及紅細胞(RBC)裂解之步驟可組合成藉助一單一液體試劑之一個步驟。在將血液/染色/裂解混合物添加至匣之前，將全血樣本添加至染色及裂解溶液。
在另一實施例中，可使用草酸銨(11.45 mg/mL)代替氯化銨，此乃因草酸銨已經演示以具有擴展之室溫穩定性。在另一實施例中，可將抗體染色劑與草酸銨溶液混合且儲存起來作為一經預量測、隨時可用之試劑。可將濃度為自0至25 mg/mL之牛血清白蛋白(BSA)添加至經組合之染色及裂解溶液，且可使用ProClin及疊氮化鈉作為抗菌劑。此經組合之裂解及染色溶液已展示在室溫下具有至少2個月之穩定性。
在此實例中，自一操作者工作流程角度來看，測定方案得到顯著改良。給使用者供應隨時可用之染色/裂解溶液微型管(樣品處置裝置)。給使用者供應預充滿草酸銨/染色溶液管。使用一控制體積移液管(例如，Micro-)將一10微升血液樣品直接轉移至該管。將樣品/試劑溶液平緩混合且然後轉移至匣以用於計數測定。隨著染色及裂解溶液之體積按比例改變，亦已成功地使用較小體積之全血：3微升及5微升。
以下實例闡述可用於本文中所揭示之裝置及系統中之一平面波導。螢光標示之探針提供表徵生物樣品之內容之一方便方法。藉由調製一螢光探針之結合化學基團，可達成用於偵測諸如RNA、DNA、蛋白質及細胞結構等複雜分子之高特定性。由於螢光團通常吸收且重新發射史托克(Stokes)移位之輻射而不管係結合還是非結合至欲偵測之一物種，因此需要分離結合螢光團與非結合螢光團。
一種用以分離結合螢光團與非結合螢光團之常見方法依賴於螢光標示之物種之空間定位。舉例而言，在‘三明治免疫測定’中，一表面經化學處理以使欲偵測之一物種結合至彼表面。螢光探針然後附著至結合至該表面之物種。然後可以一沖洗步驟自該系統移除非結合螢光團。
若可將激發光侷限於該表面則可進一步減少背景螢光。全內反射螢光(「TIRF」)係一種減少背景螢光之方法。一般而言，當光自一個介質傳播至另一介質時，將在界面處反射光之一部分。然而，當光正傳播至具有一較低光學折射率至一材料中時，若光束入射於表面上之角度大於‘臨界角度’(相對於表面法線)則將反射全部光。在較低折射率材料中，光強度隨著距表面之距離而按指數衰退。此按指數衰退之視場(稱作一‘瞬逝場’)具有可見光之約為100奈米至1微米之一特性衰退長度。因此，瞬逝場之光將僅激發位於表面處之螢光團。
在一簡化實施方案中，藉助一雷射束自表面反射一次來執行TIRF。此係沿用已久之TIRF顯微術及其他生物感測技術之基礎。然而，藉由將雷射束侷限在一波導內部，可實現多個反射且可照射較大區域。數個波導幾何形狀係可能的，每一者具有一定的折衷。
單模式平面波導(亦稱作薄膜波導或整合式光學波導)將光侷限至具有小於傳播光之波長之薄尺寸之一小剖面區域中。單模式波導之優點係產生顯著較強之瞬逝場。單模式波導之一缺點係對於高效光耦合，其通常需要具有精確對準公差之一稜鏡或光柵。另外，單模式平面波導製造起來較貴，此乃因導引層通常係沈積於一基板上之具有嚴格厚度公差之一薄膜。相比而言，一多模式平面波導實質上比單模式平面波導更容易將一雷射束耦合至其且更易於構造。舉例而言，一標準的1毫米厚顯微鏡載片達成可透過載片之邊緣將光耦合至其中之一有效波導。另外，多模式波導之尺寸可與當前塑膠注入模製技術相容。
對於一基於螢光之測定系統，期望在偵測區中有一均勻瞬逝場。依據定義，瞬逝場之強度沿一單模式平面波導之光傳播方向係均勻的(忽略波導內部之散射損失及吸收)。然而，對於一可拋臨床裝置，成本、穩健性及使用之簡便性具有類似重要性。藉由調整至一多模式波導之輸入耦合，可最佳化瞬逝場之均勻性及場強度。
雖然一多模式波導中之每一個別模式沿傳播方向具有一均勻強度，但當耦合至一多模式波導時將激發一模式分佈；此模式分佈將在表面上相長地且相消地干涉且導致一空間變化場強度。當波導之厚度比光之波長大得多時，可忽略波導之該模式結構，且波導之強度可被視為自波導之兩個表面全內反射且干涉相鄰反射之一習用繞射束。
圖22圖解說明涉及多模式波導之現有耦合方案2205至2215之數個實例。使用一多模式波導2220之耦合方案2205涉及藉助一柱面透鏡2230將平行於一波導2220傳播之一雷射束2225聚焦至波導2220之邊緣中。然而，一全內反射(「TIR」)束之場強度對於以臨界角度入射之一束係最大化的且對於具有與表面法線成90°之一入射角度(亦即，切線入射)之一束係零。因此，平行於TIR表面之一入射束在藉助柱面透鏡2230以方案2205之組態耦合至波導2220時將具有小瞬逝場強度。
藉由耦合方案2210圖解說明耦合方案2205之一變化。在耦合方案2210中，藉由一柱面透鏡2240聚焦之一雷射束2235以一適當角度入射於一波導2245之邊緣上以使得波導內部之雷射束2235之一中心射線在接近TIR之臨界角度處撞擊於表面上以最大化瞬逝場強度。可藉由聚焦光學器件之挑選達成場強度與均勻性之間的折衷。若一幾乎準直束用以藉由接近TIR之臨界角度操作達成高場強度，則在表面強度變得充分均勻之前該束必須使諸多反射在波導內，因此需要一較長波導。然而，若使該束高度聚焦，則表面強度在極少反射中正規化，但在於臨界角度以外傳播之射線中含有相當大量之功率且其導致沿波導之長度向下減小之瞬逝場強度。
必須達成諸如透鏡2230及2240之一柱面透鏡相對於一波導(諸如，分別為波導2220及波導2245)之輸入面之精確對準以使一雷射束聚焦於輸入面上。藉由一耦合方案2215圖解說明此問題之一個經提議之解決方案。在耦合方案2215中，將一透鏡2250與一波導2255合併為一單個光學組件，舉例而言，藉由將透鏡元件接合至平面波導或藉由模製一單個光學組件而達成。雖然此允許使透鏡2250之焦點與波導2255之邊緣精確地隔開一定的距離，但必須仍達成一雷射束2260相對於波導2255之透鏡2250之仔細對準以將束2260耦合至波導2255。對於需要一波導組件相對於光源之重複放置之應用，高度期望光耦合對未對準相對不敏感。
在實務應用中，瞬逝場之穿透深度通常小於入射光之一波長。此態樣在某些應用中係一優點，此乃因瞬逝場可充當用以照射僅所關注之一體積(例如，接近於波導表面之較低折射率介質中之一薄層)之一機構。另一方面，當所關注之物件(諸如，一細胞或一溶液總體)實質上擴展超過瞬逝波之穿透深度時，瞬逝照射可不如泛光燈型照射更有效。
整合光流體之一子域係關於用於使用光學波導來照射經擴展之流體介質之方法之研發。大部分所研發之方法涉及一液體樣品由其他液體及/或固體材料含納，藉此有效形成用於照射該液體樣品之一波導。大部分基於TIR之設計涉及藉助其折射率低於液體樣品本身之折射率之介質環繞該液體樣品。然後，理論上可藉由高折射率液體與較低折射率環境之間的界面處之TIR在液體樣品中導引光。然而，實務上，在含有於另一材料中之一液體樣品中之波導由於常見液體具有低於常見固體之折射率之事實而較困難；舉例而言，水具有大約1.33之一折射率，而大部分固體材料具有1.4或更大之一折射率。因此，大多數TIR波導設計涉及使用高折射率(亦即，「高n」)液體或較奇特的低折射率(亦即，「低n」)固體。
在基於干涉之光流體波導中，藉由自周圍材料反射將光侷限至之一液體核心，該周圍材料包含經組合以導致周圍介質之一較低有效折射率之較高折射率材料之兩個或兩個以上層。某些基於干涉之光流體波導包含光子晶體，諸如不同折射率之多個交替材料層。
下文所揭示之實施例允許將光耦合至提供用於樣品照射之一強瞬逝場同時消除或大大減少因一使用者疏忽造成之未對準之一平面波導。各種實施例進一步允許對波導內部之內部傳播角度之輕易調諧，從而提供對瞬逝場強度之簡單調整。另一實施例亦提供用於執行涉及以對流體室之光學性質不敏感之一方式將一流體室放置於一平面波導上之測定之設備。
在一實施例中，揭示用於照射用於分析之一樣品之設備。該設備包含一光源、一平面波導及一折射體積。該光源沿一傳播向量提供光。該平面波導經定向以使得該傳播向量垂直於該平面波導之法向向量且沿平行於該平面波導之法向向量之一方向自該平面波導偏移。定位於接近於該平面波導處之折射體積將由光源提供之光光學地耦合至該平面波導。
另一實施例陳述用於執行樣品分析之一方法。沿一傳播向量自一光源提供光。藉助該光照射定位於接近於一平面波導處之一折射體積。該波導經定向以使得該傳播向量垂直於該平面波導之法向向量且沿平行於該平面波導之法向向量之一方向自該平面波導偏移。然後，經由該折射體積將光耦合至該平面波導。
在又一實施例中揭示用於執行生物測定之設備。該設備包含一光源、一平面波導、一折射體積及一偵測器。該光源沿一傳播向量提供光。該平面波導使複數種特定結合分子結合至其一面。該平面波導可進一步使兩種或兩種以上不同特定結合分子之一陣列結合至其面。另外，平面波導之光學軸經定向而平行於傳播向量且沿垂直於平面波導之一面之一方向自傳播向量偏移。折射體積將由光源提供之光光學地耦合至平面波導且定位於接近於平面波導處。折射體積包含一平凸柱面透鏡之至少一區段。該偵測器經定位以偵測自接近於平面波導之使複數種特定結合分子結合至其之面之一區發射之光。
在一實施例中，用於照射一樣品之一設備包含一平面波導。該平面波導包含：一第一基板，其具有一第一外表面及一第一內表面；及一第二基板，其具有一第二外表面及一第二內表面。分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面彼此間隔開且部分地界定用於將樣品侷限於其中之一體積。該設備進一步包含一光源以用於提供經引導朝向平面波導之光以使得該光光學地耦合至該等第一及第二基板之外表面之間的平面波導且含納於該平面波導內，同時照射含納於該體積內之樣品之至少一部分。
在另一實施例中，樣品含有至少一種物件，且平面波導及光源經組態以協作以均勻地照射該物件。在仍另一實施例中，該物件在直徑上大於一微米。
在又一實施例中，該設備進一步包含一襯墊以用於分離分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面，同時進一步界定用於將樣品侷限於其中之體積。在另一實施例中，至少部分地藉由全內反射將光含納於該等第一及第二基板之外表面之間。在仍另一實施例中，光源提供未準直光。
在另一實施例中，一樣品分析系統包含一平面波導。該平面波導又包含：一第一基板，其具有一第一外表面及一第一內表面；及一第二基板，其具有一第二外表面及一第二內表面。分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面彼此間隔開且部分地界定用於將一樣品侷限於其中之一體積。該樣品分析系統進一步包含一第一光源以用於提供經引導朝向該平面波導之一第一照射。該第一照射光學地耦合至該等第一及第二基板之外表面之間的平面波導且含納於該平面波導內同時照射侷限於該體積內之樣品之至少一部分。該樣品分析系統亦包含一偵測器以用於偵測作為第一照射與樣品之部分相互作用之一結果而自樣品發射之一第一光信號。
在另一實施例中，該樣品分析系統包含：一第二光源，其經組態以用於提供一第二照射，及城鄉光學器件，其用於將來自該第二光源之第二照射引導至樣品之至少另一部分且引導至該偵測器。該偵測器進一步經組態以用於偵測由於第二照射與樣品之至少另一部分相互作用所產生之一第二光信號。
本技術之實施例提供樣品照射，諸如使用包含具有一整合透鏡之一波導之設備基於瞬逝場之螢光偵測及測定中所涉及之樣品照射。該設備之整個組態可使得藉由自傳播於波導內之一光束穿透至毗鄰溶液中之一瞬逝場激發結合至一波導表面之發螢光分子，該所傳播束由一整體連接之透鏡引入。準直光束(諸如，一雷射束)可平行於波導表面傳播以使得系統對波導之平移不敏感。入射束亦可適當地自波導之光學軸偏移以使得光在透鏡表面處之折射以接近TIR之臨界角度之一角度將該束引導至波導中。另外，可將一第二整合柱面透鏡添加至波導之輸出端。該第二整合柱面透鏡之此添加可促進沿相反方向耦合一第二雷射(諸如)以供用於多色彩螢光測定中。
該設備亦可允許將一流體室結合至平面波導以使得與平面波導之室接觸在傳播光之光學路徑外部，從而消除對構成室之材料之光學性質之限制。在某些先前組態中，流體室已利用藉助機械夾緊與平面波導接觸之低折射率材料以限定波導/室接觸區域處之光學損失。藉由分離波導/室接觸與光學路徑，可使用諸如黏合劑或塑膠焊接等傳統接合方法來將室附接至波導。此外，流體室可包含一第二平面波導或部分地由該第二平面波導形成，其中流體室安置於兩個平面波導之間。在此一配置中，可將光耦合至平面波導以及由流體室形成之體積兩者。
圖23圖解說明闡述例示性實施例之一個一般組態2300。組態2300包含一光源2305、一折射體積2310及一平面波導2315。光源2305可包含沿一傳播向量2320提供光之一雷射或者準直或接近準直光之任一其他源。折射體積2310定位於接近於平面波導2315處。折射體積2310與平面波導2315可在其間缺少一折射率不連續性。舉例而言，折射體積2310可毗鄰於或鄰接於波導2315，其中一折射率匹配流體(未展示)佔用其間的任何間隙。另一選擇係，折射體積2210可與平面波導2315整合為一單個單元或物品。平面波導2315經定向以使得傳播向量2320垂直於平面波導2315之法向向量2325。此外，平面波導2315沿平行於平面波導2315之法向向量2325之一方向具有一偏移2330。
圖24圖解說明根據一項實施例之具有一整合透鏡2410之一波導2405之一例示性剖視圖2400。另外，視圖2400繪示一準直光束2415，諸如，具有適於激發一測定表面2420處之螢光探針之一波長之一雷射之光束。具有整合透鏡2410之平面波導2405經組態以使準直光束2415注入穿過平面波導2405之一底部表面。一流動池由一密封機構(諸如一襯墊2425、一入口埠2430、一輸出埠2435及一流體樣品室2440)形成，其中沈積於波導2405之測定表面2420上之化學化合物可將所期望之目標化合物結合至該表面。收集與濾波光學器件2445可自波導2405之測定表面2420捕獲螢光。然後，可將對應於如此捕獲之螢光之一信號引導至一成像裝置2450(諸如，一CCD或CMOS相機)。此外，該流動池之頂部、底部及/或壁可用作其上沈積有化合物之一表面。
值得注意的係，流體樣品室2440可包含一第二平面波導(類似於波導2405)或部分地由該第二平面波導形成以使得流體樣品室2440安置於兩個平面波導之間。在此一組態中，可將光耦合至波導2405及第二平面波導以及由流體樣品室2440形成體積兩者。本文中所闡述之原理類似地適用於具有多個平面波導之組態。
圖25提供具有整合透鏡2410之波導2405之一詳細剖視圖2500。對於進一步參考，圖26係圖解說明具有整合透鏡2410之波導2405之一斜等軸測投影視圖2600。返回參考圖25，準直光束2415沿平行於或接近平行於波導2405之光學軸之一方向傳播，但自該光學軸偏移以使得其碰撞整合透鏡2410之彎曲表面。對於其中波導結構係一可移除消耗物項之一臨床儀器，此幾何形狀可放寬將準直光束2415可再現地耦合至波導2405所需之位置公差。準直光束2415相對於整合透鏡2410之局部表面法線以一非零角度α撞擊於整合透鏡2410之彎曲表面上，如圖25中所圖解說明。
作為由司乃耳(Snell)定律闡釋之折射之一結果，準直光束2415折射以使得其相對於波導2405之光學軸以一角度β碰撞波導2405之頂部表面。將角度β界定為內部傳播角度。準直光束2415之中心與整合透鏡2410之頂點之間的垂直距離y經挑選以使得β小於允許發生全內反射之臨界角度之餘角。對於整合透鏡2410之彎曲表面之一既定半徑R及整合透鏡2410之折射率n，藉由以下方程式將距離y與角度β聯繫起來：
由於準直光束2415具有一空間限度，因此整合透鏡2410之彎曲表面將用以聚焦準直光束2415。整合透鏡2410之彎曲表面之半徑R經挑選以使得對於準直光束2415之一既定束直徑，入射於波導2405之頂部表面上之角度範圍適於在偵測區內提供一均勻瞬逝場強度同時保持在TIR之臨界角度之外。可期望將準直光束2415聚焦於波導2405之頂部表面上以允許最大未對準公差。可藉由以下方程式給出由波導2405及導致將一束聚焦於頂部表面上之整合透鏡2410所形成之結構之總厚度：
當使用一適當厚度t時，準直光束2415將聚焦於距界定整合透鏡2410之彎曲表面之圓形之中心有一水平距離L處。可藉由以下方程式將L與先前界定之量聯繫起來：
可以數個不同方式製造包含波導2405及整合透鏡2410之結構。一種方法係使整個總成藉由注入模製技術以塑膠構成。一替代方法係由類似反射率材料單獨製作平面波導及透鏡元件。然後，藉由透明光學膠合劑、光學接觸或暫時藉助反射率匹配流體/油類/凝膠持久地連結兩個元件。
諸如結合圖24闡述之彼等幾何形狀等幾何形狀容易允許透過入射雷射束之一平移而非一旋轉來調整內部傳播角度(β)。此允許用以將雷射耦合至波導之一較不複雜機械設計。另外，當期望改變入射角度時不需要一新注入模製波導，此乃因使用圖24及25之所揭示幾何形狀之透鏡之焦點對一雷射束相對於波導2405之光學軸平移不敏感。此外，在不改變讀出儀器之情況下達成入射角度之一所期望改變，從而允許匣功能隨儀器之實體改變而變化。可利用匣上之一條形碼來識別用以解譯來自一既定匣之信號之資訊。
為防止在自頂部表面之第一反射之後光自波導2405洩漏，將柱面透鏡2410截短以使得其不延伸超過焦點之位置。由連接整合透鏡2410之頂點與底部表面上之與焦點相對之點的線界定之區域(參見，例如，圖24中之光學死區2455)將永不使成功地耦合至波導之光在其中傳播。如此，指定為光學死區2455之區域中之透鏡之精確形狀可係使整合透鏡2410不延伸超過穿過焦點之垂直線之任一方便形狀。對於其中最小化材料成本較為重要之一單個注入模製裝置，可期望移除標示為光學死區2455之區域中之所有塑膠。若製作透過習用光學製造製程而製成之兩個單獨組件，則可容易製造已經切割以移除超過焦點之材料之整合透鏡2410。可期望具有低自發螢光性質之一材料最小化信號收集中之背景貢獻物。
由於以軸外幾何形狀使用整合透鏡2410，因此在彎曲表面係圓形之情況下可展現焦點處之小光學像差。雖然一圓形輪廓功能地工作，但一非球狀表面之使用可用以擴展入射束之其中該束將耦合至波導2405之垂直位置之範圍，從而允許對角度β之一較大調整範圍。可藉助熟習此項技術者所熟悉之光學射線追蹤程式而計算自一圓形輪廓之適當偏差。
波導2405之頂部表面在焦點之前的大區域可允許密封一樣品室。密封表面之襯墊2425可避開光學路徑。因此，僅需要評估其化學/生物相容性而不需要評估其光學性質之一較大範圍之襯墊材料可係可能的。舉例而言，一黏性背襯間隔件可用以形成不具有一複雜夾緊機構之一密封流動池。亦可藉由利用具有多個通道之一襯墊將多個流動池併入至一單個生物感測器中。
圖27係圖解說明具有多個通道之一例示性襯墊2705之一斜等軸測投影視圖。每一通道之寬度可經挑選以匹配入射束之未經聚焦之尺寸以使得最小化沿波導之長度耦合至襯墊之光。可包含用於使入射束在通道之間平移之一機構。另外，波導2405之在流動通道內之頂部表面可經適當處理以允許捕獲螢光標示之目標分子，諸如蛋白質、RNA、DNA或細胞結構。
附接至襯墊之一罩使流動池完整。流體樣品可透過罩中之節流孔引入且流過該等通道，從而允許流體與頂部波導表面相互作用。亦可包含流動通道外部之流體儲槽以允許將流體引入至流動通道中且包含流動通道之出口埠處之一溢流儲槽以用於含納在其穿過流動通道之後的流體。就塑膠組件而言，可視情況藉由將通道模製至該等塑膠組件中之一者中且藉助熟習此項技術者所熟知之方法(例如，雷射或超聲波焊接)直接連結兩個塑膠組件來消除襯墊。
由波導2405內之光形成之瞬逝場可激發已附著至波導2405之頂部表面之螢光團。當螢光團鬆弛且發射頻率移位之輻射時，可由一透鏡或一系列透鏡捕獲(例如，收集與濾波光學器件2445)所發射之光以將表面之一影像轉移至由諸如一CCD或CMOS感測器之一光捕獲裝置(例如，成像裝置2450)成像之一平面。亦可將一光學濾波器放置於波導表面與成像裝置之間以消除尚未藉由所捕獲螢光團而頻率移位之經散射入射光。
圖28係用於執行樣品分析之一例示性方法2800之一流程圖。可以變化之次序執行例示性方法2800之步驟。此外，可自例示性方法2800添加或減去若干步驟且該等步驟仍歸屬於本技術之範疇內。可執行圖28中所圖解說明之方法以用於基於瞬逝場之螢光偵測及測定。
在一步驟2805中，沿一傳播向量自一光源提供光。該光源可包含一雷射或準直或接近準直光之任一其他源。
在一步驟2810中，藉助光照射一折射體積。該折射體積定位於接近於一平面波導處且可與該平面波導整合在一起。在例示性實施例中，該折射體積可包含一平凸柱面透鏡之至少一區段，其中該折射體積之縱向軸經定向而垂直於平面波導之光學軸及法向向量。
在一步驟2815中，經由折射體積將光耦合至平面波導。該波導經定向以使得傳播向量垂直於平面波導之法向向量且沿平行於平面波導之法向向量之一方向自平面波導偏移。
在一可選步驟2820(由一虛線框指示)中，可藉由使光源沿平行於平面波導之法向向量之一方向平移來對由光源提供之光至平面波導之光學耦合進行調諧。
在一步驟2825中，在使光源平行於平面波導之光學軸平移之同時維持由光源提供之光至平面波導之持續光學耦合。
在一步驟2830中，將一生物樣品定位於至少部分地由平面波導之一面形成之一儲槽中。
在一步驟2835中，偵測自接近於平面波導之一面之一區發射之光。在某些實施例中，一偵測器經定位以偵測自接近於平面波導之使複數種捕獲分子結合至其之面之一區發射之光。
對於某些應用，如在上文所闡述之應用之上下文中，將液體層含納於一子波長限度內可係不能實行的。例如，若所關注之物件係直徑約為1至20微米之一生物細胞，則需要用以分析照射及光導引之一不同方法。
考量何時設計用於一實務應用之光學波導之另一重要態樣係波導之可製造性，尤其係在意欲使應用進入具有成本要求之批量生產之情況下。必須評估對製造公差之敏感性，此乃因其可大大影響可製造性且在最壞情形下使設計不能實行。同樣，應考量用於將光耦合至波導中之方法，此乃因光插入方法可影響波導可製造性及使波導與光源介接所需之策劃工作兩者。此問題在光源將不永久地附加至波導之情況下特別有意義。另外，介接複雜性往往隨波導尺寸減小而增加。
儘管已在(例如)電信裝備中實施光至微米級波導之耦合，但策劃工作及製造費用係針對除電信以外之成本敏感應用所考量之重要因素。例如，上文所闡述之各種類型之波導通常由於其複雜性而不適於大量生產。
將期望使用一光學波導來高效照射嵌入於此等介質中之低n介質及/或物件，其中該等介質或物件擴展超過產生於一高n對低n界面處之瞬逝場之穿透深度。一低n介質可係(舉例而言)具有低於習用固體材料之折射率之一折射率(例如，低於~1.5之一折射率)之一材料。本文中闡述能夠有效照射含有一低折射率介質之一核心之一光學波導。注意，術語「光」及「照射」在本文中可交換地使用。
在一實施例中，如圖29中所圖解說明，一平面波導2900包含一層堆疊，其由夾持一低n介質2910之一第一基板2902與一第二基板2904形成。該低n介質在本文中可交換地指示為詢問介質。第一基板2902及第二基板2904可係(例如)透光以便對具有介於一預定範圍內之一波長之光透明。在第一基板2902與第二基板2904之間引入低n介質2910以使得第一基板2902與第二基板2904協作以侷限其間的低n介質2910。第一基板2902及第二基板2904以及低n介質2910可具有各種各樣之厚度，只要與第一基板2902及第二基板2904相比，低n介質2910展現一較低折射率即可。本概念可與將光耦合至波導中之眾多方案以及在其中含有低n介質之不同方法相容。低n介質可係液體、氣體及/或固體。
可藉由透過基板與外部環境之間的界面處之TIR來提供對插入至波導中之光之一維光學侷限(亦即，沿由第一基板及第二基板之一表面法線2920(由一粗箭頭指示)所指示之方向)。在圖29中所展示之例示性實施例中，一光源2930以遠離基板法線且在基板之平面外之一角度將照射2935引導至平面波導2900中以使得由平面波導2900藉由兩個基板對周圍介質界面處之全內反射提供對照射2935之一維光學侷限。
圖30中展示平面波導2900之一剖視圖。應注意，該等圖並非按比例繪製。如圖30中所展示，第一基板2902具有一折射率ns1，第二基板2904具有一折射率ns2且低n介質2910具有一折射率nm。平面波導2900由具有一折射率na之空氣(或某一其他介質)環繞。該等折射率實現以下要求：
n a <n s 1,n s 2 [方程式4]及
n a <n m . [方程式5]
注意，藉由以下方程式給出自一第一材料(具有折射率折射率n1)朝向一第二材料(具有折射率n2，其中n2<n1)之光傳播之臨界角度(θ_1,2)_c：
如圖30中所展示，光2935進入平面波導2900以使得自第一基板2902(具有折射率ns1)至周圍介質(具有折射率na)之一入射角度θ_(s-a)大於如由ns1及ns2中之較低者所界定之臨界角度(θ_(s,a))_c，亦即，
θ s,a .>, [方程式7]
以使得藉由TIR將光2935含納於平面波導2900內。所有角度皆係相對於表面法線2920而量測。因此，該等基板及詢問介質形成一多部分波導，同時在一個維度中(亦即，沿平行於表面法線2920之一方向)提供光侷限。詢問介質可具有任何類型(例如，氣體、液體及嵌入於一液體中之生物物件)，只要滿足方程式4之折射率條件及方程式7之入射角度條件即可。
對於液體及氣體詢問介質，波導設計可經修改以用於含有詢問介質。舉例而言，在圖29及30中所展示之實施例中，低n介質藉由表面張力完全含納於第一基板2902與第二基板2904之間。圖31及32展示一平面波導3000之一替代組態，其中第一基板2902與第二基板2904藉由第一襯墊3006及第二襯墊3008間隔開。仍另一選擇係，第一襯墊3006及第二襯墊3008可經連接一形成一單個相連襯墊。注意，圖29至32中所展示之實施例慮及用於低n詢問介質之入口埠及出口埠(未展示)之添加。可使用另一材料塞住圖31及32中之開口端，藉此形成用於含納詢問介質之一完全密封體積。
該含納組態應可與用於將光耦合至波導中之方法相容。例如，系統可經組態以使得即使光不僅侷限於詢問介質內，亦在平面波導之平面中均勻地照射詢問介質。穿過基板之光2935之輸入耦合通常不受圖29至32中所展示之低n介質含納方案之影響。干涉效應或彎曲界面效應(例如，在光2935自周圍介質直接入射至低n介質2910上之情況下，其可包含由表面張力所造成之一界面曲率)可影響穿過平面波導2900或3000之光2935之後續傳播。
參考圖30，低n介質2910內部之照射強度取決於平面波導2900內部之光傳播之角度。由於空間壓縮，以接近臨界角度之角度傳播之光將導致比以遠離臨界角度之角度傳播之光更大之照射強度。相當近似地，平面波導2900內之平均照射強度與sin(θs,a)成反比(其中θ_s,a係基板-空氣界面處之傳播光之入射角度)，以使得將光含納於該波導內。
參考圖29及30，可根據既定應用挑選將光耦合至波導中之方式。舉例而言，可將入射光耦合至多部分平面波導之一單個層、任何層組合或所有層中。例如，若將光直接耦合至低n詢問介質中，則可以使得實現方程式7之任一角度將光插入至平面波導中。此角度範圍包含至波導端上之法向入射(亦即，以垂直於表面法線2920之一角度)。另一方面，若光經耦合穿過該等基板中之一者，則入射角度應在自第一基板2902或第二基板2904至低n介質2910中之界面處進一步滿足以下條件：
θ s 1, m < [方程式8]及
θ s 2, m < [方程式9]
其中下標c指示臨界角度。此等條件中之適當條件之實現確保最終將光自基板耦合至低n介質。
平面低n折射率波導之一簡單版本可由一單個類型之材料之兩個相同基板形成，如圖30中所展示。另一選擇係，兩個基板可係不同的且甚至由可能具有不同折射率之透光材料之數個異類層組成。
注意，若第一基板2902或第二基板2904由複數個異類層形成，則該複數個異類層之組合之有效折射率可表達為n_eff，藉由以下方程式將n_eff與周圍介質之折射率n_a聯繫起來：
n a <n eff . [方程式10]
此外，兩個基板可與不同介質接觸，諸如若將第一基板2902曝露於空氣而將第二基板2904附接至一第三基板(未展示)。在此情形下，多部分平面波導2900將仍像一波導一樣工作，只要對於基板及周圍介質兩者滿足方程式1及4以及以下額外條件即可：
n a <n m ,n eff [方程式11]
光傳播之角度應使得基板對詢問介質界面以及形成基板之若干層之間的所有界面之入射角度θ滿足以下條件：
θ<θ c [方程式12]
且，對於基板與周圍介質處之界面，自基板至周圍介質之入射角度θ應實現以下條件：
θ>θ c [方程式13]
圖29至32中所圖解說明之實施例不對詢問介質或兩個基板之厚度強加約束條件，只要滿足方程式1及4之折射率與入射角度要求即可。所揭示之實施例可特別適合於低成本、批量生產且可與相對低複雜性之光耦合機構組合在一起。雖然平面波導2900及3000將在詢問介質及基板之厚度之幾乎任何選項之情況下皆適當地起作用，但層厚度之實際選項可係基於若干因素，諸如材料、製造方法及成本之選項。
針對作為光輸入之一準直束(圖33及34)及一發散束(圖35及36)兩者，圖解說明穿過平面波導2900之厚版本及薄版本之光傳播。如圖33及34中所展示，一準直束3301將以高強度有差異地通過在整個波導中之低n介質。另一方面，對於一發散束3501，經反射光最終重疊，從而導致平面波導內之實質上均勻照射。因此，若僅一或多個適當放置之小區(僅延伸由一單個通過照射之部分)需要照射，則準直束3301可在小區內提供大於發散束3501之強度。若意欲可能以一均勻方式照射一較大區，則一發散束3501可係一較佳選項。亦應注意，成對之圖(亦即，圖33至34及圖35至36)可視為對同一平面波導之圖解說明但藉助不同束直徑之分別為準直束及發散束而照射。
在(例如)約為幾百奈米或更大之目視限度之一組合波導厚度之情況下易於達成光至波導中之高效耦合。例如，一經聚焦雷射束可容易耦合至此等尺寸之一平面波導中。用於適當地聚焦傳入光之機構可整合於波導中或構成為與波導分離之一系統。圖37至46中展示光耦合機構之實例。
圖37展示其中一光束3701以遠離表面法線2920之一角度入射至第二基板2904上之一實施例。圖38展示其中一光束3801以垂直於表面法線2920之一角度直接入射於低n介質2910上之一特殊情形。圖39展示其中光束3701同時入射於分別為第一薄基板3902及第二薄基板3904上且再次以遠離表面法線2920之一角度入射於低n介質3910上之一薄平面波導實施例。圖40再次展示由分別為第一薄基板3902及第二薄基板3904以及低n介質3910形成之薄平面波導，其中光束3801以垂直於表面法線2920之一角度插入至所有三個層中。
圖41及42展示其中一外部透鏡用以將入射光束聚焦至兩個基板中之一者上之實施例。圖41展示其中一透鏡4110用以聚焦光束3701以使得將自遠離表面法線2920之一非法向角度入射之一經聚焦束4112引導至第二基板2904中之一實施例。類似地，圖42展示其中以垂直於表面法線2920之一角度入射之一光束4201藉由一透鏡4210聚焦以在入射於第二基板2904上之前形成一經聚焦束4212之一實施例。
在另一方法中，可將光耦合至兩個基板中之具備用於適當地聚焦且引導傳入光之一整合透鏡總成之一者中。例如，圖43展示其中分別為第一基板4302及第二基板4304間隔開以在其間含有一低n介質4310之一實施例。第二基板4304包含一整合透鏡4320，其經組態以接收光束3701以便將光束3701耦合至第二基板4304及隨後多部分平面波導組態。圖44展示其中分別為第一基板4402及第二基板4404間隔開以在其間含有一低n介質4410之一類似實施例。在此實施例中，第二基板4404包含一整合透鏡4420，其此次經組態以接收以垂直於表面法線2920之一角度入射之光束3801。將在整合透鏡4420處接收之光束3801引導至第二基板4404及隨後作為一整體之多部分平面波導。圖45展示一替代實施例，其包含分別為第一基板4502及第二基板4504，該等基板藉由分別為第一襯墊4506及第二襯墊4508分離以便在其間含有一低n介質4510。第二基板4504包含一整合透鏡4520，其經組態以在第二基板4504之遠離第一襯墊4506之一部分處接收光束3701以使得光束3701在不被第一襯墊4506阻擋之情況下插入至多部分平面波導結構中。最後，圖46展示包含分別為第一基板4602及第二基板4604之一實施例。此次，替代包含一單獨襯墊，第一基板4602包含分別為第一支座4606及第二支座4608，其經組態以便可藉由(例如)雷射焊接、超聲波焊接或其他適合接合方法附接至第二基板4604。當接合在一起時，分別為第一基板4602及第二基板4604界定用於在其間含有一低n介質4610之一體積。第二基板4604包含一整合透鏡4620，其經組態以用於接收以垂直於表面法線2920之一角度入射之光束3801，以使得光束3801傳播至第二基板4604中且隨後傳播至作為一整體之多部分平面波導結構中。舉例而言，整合透鏡4620可係如序列號為12/617,535之前述美國專利申請案中所闡述之一整合透鏡，以使得光束3801至第二基板4604中之插入實質上對光束3801相對於整合透鏡4620之平移不敏感。
圖47展示一例示性波導結構之一側視圖，其在此處經展示以圖解說明穿過其之一光束之插入、傳播及含納。一平面波導4700包含分別為第一基板4702及第二基板4704，該等基板藉由分別為第一襯墊4706及第二襯墊4708間隔開以便在其間含有一低n介質4710。視情況，第二基板4704可包含諸如一整合透鏡4720(展示為虛線曲線)之一折射組件以用於促進一光束4730至平面波導4700中之插入。如圖47中所展示，分別為第一基板4702及第二基板4704、低n介質4710及入射角度θ實現上文在方程式1及4中所規定之折射率與入射角度條件，以使得在於基板-空氣界面處反沖幾個TIR之後，光束4730均勻地照射平面波導4700之厚度。
圖48至49中展示具有詢問介質含納裝置、入口埠及出口埠以及經設計用於使光在所含有區內部進入至波導中之光耦合構件之一匣系統之一例示性實施例。一波導匣4800包含分別為第一基板4802及第二基板4804，該等基板藉由一襯墊4806分離以便提供其間的一低n介質4810之含有。第二基板4804包含一整合透鏡4820以用於接收入射於其上之光4835且將光4835引導至波導匣4800，以使得在於其中反沖幾個TIR之後，光4835均勻地照射低n介質4810之至少一部分。波導匣4800進一步包含一入口埠4842及一出口埠4844，可透過該埠將一或多種樣品引入至波導匣4800中作為低n介質4810。
透光基板之使用可促進透過基板之詢問介質之光學傳遞。例如，透過基板之額外影像捕獲可用以偵測自詢問介質發射之光且藉此以(例如)顯微術及/或螢光應用提取關於詢問介質之資訊。另外，藉由使用一位置敏感偵測器，可獲得關於詢問介質之空間資訊。另一選擇係，若確立一適當路徑以用於允許在由波導侷限之角度範圍內發射之光退出波導(未展示)，則可在波導之平面中偵測此光。舉例而言，可以類似於用於光之輸入耦合之方式之一方式將用於光之輸出耦合之一機構併入至基板中。
作為一替代方案，一或多個基板-周圍介質界面可經組態而係至少部分地反射。另外，可在波導中利用一或多個反射表面。例如，基板對詢問介質界面中之一者或兩者可經組態而係部分地或完全地反射以較佳將經導引之光含納於詢問介質內。在其中透過兩個基板中之一者將光耦合至波導中之組態之情形下，兩個基板中之另一者可經組態以包含一反射表面(例如，在基板對詢問介質界面處)，藉此增加詢問介質內之照射強度。圖50中展示此組態之一實例，其中一波導匣5000進一步在第一基板4802與低n介質4810之間的界面處包含一反射層5010。如圖50中所展示之組態仍允許透過第二基板4804之光學傳遞(例如，用於對自詢問介質發射之光之偵測)，同時在不影響其內之光之輸入耦合之情況下改良波導匣5000內之光含納。此組態之另一優點係在導引一發散束時減小自光進入至均勻照射之一距離。圖44中展示仍另一實例，其中一波導匣4400在第一基板4802之外表面與周圍介質4415之間的界面處包含一反射層4410。以圖44之組態給予之優點類似於相對於圖50所論述之彼等優點。
其中基板中之一者或兩者包含一或多個反射區之其他變化形式可擁有其他優點。例如，圖49中所繪示之組態可經修改以包含位於距光進入點有一定距離處之一反射區段，藉此減小在維持用於透過兩個基板之光學傳遞之構件之同時達成均勻照射所需之距離。另外，圖50及51中之至少部分地反射表面可用以引導由詢問介質發射之光(例如，螢光發射)朝向放置於波導100下方之一偵測器。
雖然所圖解說明實施例中之每一者展示進入波導之一單個光束，但該等實施例可經擴展以慮及進入波導之多個束。舉例而言，該波導可經構造以藉由透過一個埠(諸如，整合至基板中之一者中之一透鏡)及/或藉由併入有數個輸入耦合埠而輸入耦合數個光束來接受多個光束。該等束可沿彼此平行之方向、以同向或反向傳播組態或者以非平行組態傳播。
藉助可自Invitrogen公司購得之CD3 Alexa Fluor 647螢光染色劑標示人體週邊血液單核細胞(「PBMC」)。將直徑係6至12 μm之細胞保存於由具有1%牛血清白蛋白及0.06%疊氮化鈉之磷酸鹽緩衝鹽水組成之一緩衝劑中。將具有細胞之緩衝劑裝載至圖48及49中所展示之類型之一匣中。基板材料及緩衝劑導致基板對詢問介質界面處之一臨界角度θc=61°。透過下部基板之彎曲部分將635 nm雷射光耦合至系統中。曲率經設計以使得不同進入高度導致至基板對詢問介質界面上之不同入射角度。在本實例中使用兩個不同雷射高度從而導致至基板對詢問介質界面上之兩個不同入射角度：(a) 57°及(b) 66°。就在穿過下部基板之彎曲表面之後的3.5°之一雷射發散角度而言，情形(a)允許光穿過詢問介質且由整個匣導引，如圖49中所展示。另一方面，在情形(b)下，將雷射光侷限至下部基板且僅藉由瞬逝場照射詢問介質。635 nm雷射光激發Alexa Fluor 647螢光團且定位於匣下方之一成像系統將自詢問介質發射之螢光成像。
原始螢光影像(未展示)指示當直接照射詢問介質時強烈地增強螢光，亦即，情形(a)。表1中概括結果。在情形(a)下，偵測到590個螢光細胞，而在情形(b)下僅偵測到138個細胞。情形(a)之染色百分比(亦即，螢光細胞之數目除以總細胞數目)與在一流式細胞儀上獲得之結果一致。已依據一代表性細胞之峰值像素強度除以周圍背景像素強度之標準偏差而計算信雜比S/N。另一選擇係，可已依據一細胞之峰值強度除以背景位準而計算信雜比。然而，當涉及區分影像中之一細胞與背景之能力時，前一方法係較適當參數。如表1中所列舉，當直接照射詢問介質時，信雜比增加將近四倍。
以下各條款之列舉闡述本發明之各種實施例。
條款1.一種用於照射一樣品之設備，該設備包含：一波導，其包含一第一基板，其包含一第一外表面及一第一內表面，及一第二基板，其包含一第二外表面及一第二內表面，分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面彼此間隔開且部分地界定用於將該樣品侷限於其中之一體積；及一光源，其用於提供經引導朝向該波導之光以使得該光光學地耦合至該等第一及第二基板之該等外表面之間的該波導且含納於該波導內，同時照射侷限於該體積內之該樣品之至少一部分。
條款2.如條款1之設備，該樣品含有至少一種物件，其中該波導及該光源經組態以協作以均勻地照射該至少一種物件。
條款3.如條款2之設備，其中該至少一種物件在直徑上大於一微米。
條款4.如條款1之設備，其進一步包含一襯墊以用於分離分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面，同時進一步界定用於將該樣品侷限於其中之該體積。
條款5.如條款1之設備，其中該光係至少部分地藉由全內反射而含納於該等第一及第二基板之該等外表面之間。
條款6.如條款1之設備，其中該光源提供準直光。
條款7.如條款6之設備，其進一步包含一折射元件以用於使該準直光發散於該平面波導內。
條款8.如條款1之設備，其中該等第一及第二表面間隔開10微米以上之一距離。
條款9.如條款8之設備，其中該等第一及第二表面間隔開約為100微米之一距離。
條款10.如條款1之設備，其中該等第一及第二外表面以及第一及第二內表面中之至少一者經組態以用於至少部分地反射入射於其上之光。
條款11.如條款10之設備，其中該等第一及第二外表面以及第一及第二內表面中之該至少一者進一步經組態以用於反射入射於其上之一預定波長範圍之光。
條款12.如條款1之設備，其進一步包含一折射總成以用於將來自該光源之該光光學地耦合至該第二基板中。
條款13.如條款12之設備，其中該第二基板及該折射總成由一單個材料件整體形成。
條款14.如條款13之設備，其中該第二基板及該折射總成係藉由注入模製而形成。
條款15.如條款12之設備，其中該折射總成經組態以使得該光源在平行於該第二基板之該內表面之一平面中之一相對平移對來自該光源之該光至該波導之光學耦合無關緊要。
條款16.如條款12之設備，一表面法線界定為垂直於該第二基板之該外表面之一向量，其中該光以遠離該表面法線之一非90°角度入射於該折射體積上。
條款17.一種樣品分析系統，其包含：一波導，其包含一第一基板，其包含一第一外表面及一第一內表面，及一第二基板，其包含一第二外表面及一第二內表面，分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面彼此間隔開且部分地界定用於將一樣品侷限於其中之一體積；及一光源，其用於提供經引導朝向該波導之一第一照射以使得該第一照射光學地耦合至該等第一及第二基板之該等外表面之間的該波導且含納於該波導內，同時照射侷限於該體積內之該樣品之至少一部分；及一偵測器，其用於偵測作為該第一照射與該樣品之該部分相互作用之一結果而自該樣品發射之一第一光信號。
條款18.如條款17之系統，該樣品含有至少一種物件，其中該波導及該光源經組態以協作以均勻地照射該至少一種物件。
條款19.如條款18之系統，其中該至少一種物件在直徑上大於一微米。
條款20.如條款17之系統，其進一步包含：一第二光源，其經組態以用於提供一第二照射；及成像光學器件，其用於將來自該第二光源之該第二照射引導至該樣品之至少另一部分且引導至該偵測器，其中該偵測器進一步經組態以用於偵測由於該第二照射與該樣品之該至少另一部分相互作用所產生之一第二光信號。
條款21.如條款17之系統，其進一步包含一襯墊以用於分離分別為該等第一及第二基板之該等第一及第二內表面，同時進一步界定用於將該樣品侷限於其中之該體積。
條款22.如條款17之系統，其中該光係至少部分地藉由全內反射而含納於該等第一及第二基板之該等外表面之間。
條款23.如條款17之系統，其中該光源提供未準直光。
條款24.如條款17之系統，其中該等第一及第二外表面以及第一及第二內表面中之至少一者經組態以用於至少部分地反射入射於其上之光。
條款25.如條款24之系統，其中該等第一及第二外表面以及第一及第二內表面中之該至少一者進一步經組態以用於反射入射於其上之一預定波長範圍之光。
條款26.如條款17之系統，其進一步包含一折射總成以用於將來自該光源之該光光學地耦合至該第二基板中。
條款27.如條款26之系統，其中該第二基板及該折射總成由一單個材料件整體形成。
條款28.如條款27之系統，其中該第二基板及該折射總成係藉由注入模製而形成。
條款29.如條款26之系統，其中該折射總成經組態以使得該光源在平行於該第二基板之該內表面之一平面中之一相對平移對來自該光源之該光至該波導之光學耦合無關緊要。
條款30.如條款26之系統，一表面法線界定為垂直於該第二基板之該外表面之一向量，其中該光以遠離該表面法線之一角度入射於該折射體積上。
條款31.一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之系統，該系統包括一匣及一讀取器儀器，該匣包括一第一基板及一第二基板，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開；該讀取器儀器包括一接納機構，其用於將該匣定位於其中，及一成像偵測器，其用於偵測來自該平面波導之該第一內表面上或接近該第一內表面之一視場之光信號；該匣進一步包括一折射體積以用於將由一光源提供之一光束光學地耦合至該平面波導，其中該折射體積經組態以用於折射該光束以使得該光束以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該第一內表面上。
條款32.如條款31之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一模組以用於分析由該成像偵測器接收之該光信號。
條款33.如條款31之系統，其中該第一內表面與該第二內表面之間的該距離連同具有可量測尺寸之該視場一起界定一樣品體積。
條款34.如條款31之系統，其中該折射體積與該平面波導整體形成。
條款35.如條款31之系統，其中該第一內表面經修改以形成一附著表面，該修改增強該等目標分析物至該第一內表面上之固相化。
條款36.如條款35之系統，其中該修改藉由使用一陽離子聚合物而執行。
條款37.如條款36之系統，其中該修改藉由使用一聚賴胺酸而執行。
條款38.如條款35之系統，其中該修改藉由將黏性蛋白質固相化於該第一內表面上而執行。
條款39.如條款35之系統，其中該修改藉由將抗體固相化於該第一內表面上而執行。
條款40.如條款39之系統，其中該等抗體選自由抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD14、抗CD45及抗TCR-β抗體組成之群組。
條款41.如條款35之系統，其中該修改藉由沈積一有機矽烷薄膜而執行。
條款42.如條款31之系統，其中該有機矽烷係一種胺基矽烷。
條款43.如條款31之系統，其中該平面波導由塑膠製成。
條款44.如條款43之系統，其中該塑膠係一低自發螢光塑膠。
條款45.如條款43之系統，其中該塑膠係一種環烯烴。
條款46.如條款43之系統，其中該塑膠係一種環烯烴聚合物。
條款47.如條款31之系統，其中該折射體積係一透鏡。
條款48.如條款34之系統，其中該折射體積係一透鏡。
條款49.如條款34之系統，其中該折射體積及該平面波導由塑膠製成。
條款50.如條款34之系統，其中折射體積及該平面波導藉由塑膠注入模製而整體形成。
條款51.如條款31之系統，其中該等目標分析物標示有一或多個易激發標籤。
條款52.如條款31之系統，其中該等目標分析物標示有與螢光團偶聯之抗體。
條款53.如條款52之系統，其中藉由該模組之該分析包括藉由計數由該讀取器儀器之該成像偵測器捕獲之至少一個視場中之目標分析物之數目來枚舉該等目標分析物。
條款54.如條款53之系統，其中該至少一個視場中之目標分析物之該數目表示該樣品體積中之所有目標分析物之總數目，且該樣品中之該等目標分析物之濃度可藉由將條款53中所獲得之目標分析物之該總數目除以該樣品體積而計算。
條款55.如條款54之系統，其中該濃度對添加至該樣品室之該樣品之量不敏感。
條款56.如條款31之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一或多個光源以用於提供該光束。
條款57.如條款56之系統，其中該一或多個光源係雷射。
條款58.如條款31之系統，其中該光束內之該光之至少一小部分光學地耦合至該第一基板之該第一外表面及該第二基板之該第二外表面且含納於該兩者之間，其中該光之該小部分照射侷限於該樣品室內之該樣品之至少一部分。
條款59.如條款31之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一自動聚焦構件。
條款60.如條款31之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一光源及一聚光透鏡，該光源及該聚光透鏡聯合該成像偵測器能夠產生一亮視場顯微術影像。
條款61.如條款31之系統，其中該讀取器儀器包括一致動構件以用於產生多個視場。
條款62.如條款31之系統，其中該讀取器儀器包括一致動構件以用於藉由控制該匣及該成像偵測器之相對位置而產生多個視場。
條款63.如條款31之系統，其中該讀取器儀器包括一致動構件以用於藉由使該匣相對於該成像偵測器移動而產生多個視場。
條款64.如條款31之系統，其中該讀取器儀器包括一致動構件以用於藉由使該成像偵測器相對於該匣移動而產生多個視場。
條款65.一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之方法，該方法包括：
(a)使該樣品與一第一類型之一標示分子接觸
(b)將在步驟(a)中製備之該樣品引入至一匣中，該匣包括一第一基板、一第二基板及用於將光光學地耦合至平面波導之一折射體積，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，
(c)將該匣定位於一讀取器儀器中，其中該儀器將來自一光源之一光束引導至該折射體積中以使得該光束以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該第一內表面上，其中該光束激發結合至該平面波導之該第一內表面處之該一或多種目標分析物之一第一類型之該標示分子；
(d)在該平面波導之該第一內表面處產生具有可量測尺寸之一視場之一影像，該影像解析存在於該樣品中之目標分析物。
條款66.一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之方法，該方法包括：
(a)使該樣品與一第一類型之標示分子及一第二類型之標示分子接觸；
(b)將在步驟(a)中製備之該樣品引入至一匣中，該匣包括一第一基板、一第二基板及用於將光光學地耦合至平面波導之一折射體積，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，
(c)將該匣定位於一讀取器儀器中，其中該儀器將來自一第一光源之一第一光束引導至該折射體積中，其中該第一光束激發該第一類型之該等標示分子，且其中該儀器進一步將來自一第二光源之一第二光束引導至該折射體積中，其中該第二光束激發該第二類型之該等標示分子；
(d)在該平面波導之該第一內表面處產生具有可量測尺寸之一單個視場之一第一影像及一第二影像，其中該等影像係空間配準，及
(e)使用該等經空間配準影像來解析存在於該樣品中之目標分析物以產生差別標示資訊。
條款67.如條款66之方法，其中該第一光束及該第二光束係以該等光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該平面表面上。
條款68.如條款66之方法，其中一視場影像中之該等目標分析物表示藉由該第一內表面與該第二內表面之間的該已知距離及具有已知尺寸之該視場界定之該已知樣品體積中之所有目標分析物，藉此產生呈每單位體積之目標分析物之數目之形式之一濃度結果。
條款69.如條款66之方法，其中該等目標分析物包含CD4輔助性T細胞。
條款70.如條款66之方法，其中該分析進一步包括一演算法以用於比較該等經空間配準影像且用於使用該差別染色資訊來識別特定目標分析物。
條款71.如條款70之方法，其中該等目標分析物包含CD4輔助性T細胞，且其中該差別染色資訊包括一第一經空間配準影像中之抗CD4標示資訊及一第二經空間配準影像中之抗CD14標示資訊，該分析進一步包括識別存在於該抗CD4標示影像中但不存在於該抗CD14標示影像中之目標分析物，及進一步報告抗CD4陽性/抗CD14陰性目標分析物作為CD4輔助性T細胞。
條款72.如條款70之方法，其中該等目標分析物包含CD4輔助性T細胞，且其中該差別染色資訊包括一第一經空間配準影像中之抗CD4標示資訊及一第二經空間配準影像中之抗CD3標示資訊，該分析進一步包括識別存在於該抗CD4標示影像中且亦存在於該抗CD3標示影像中之目標分析物，及進一步報告抗該等CD4陽性/抗CD3陽性目標分析物作為CD4輔助性T細胞。
條款73.如條款66之方法，其進一步包括產生該視場之一第三經空間配準影像，其中該第三經空間配準影像係一亮視場顯微術影像。
條款74.如條款73之方法，其中該等目標分析物包含CD4輔助性T細胞，且其中使用該亮視場顯微術影像來鑑別該視場中之非目標分析物物件，其中該差別染色資訊包括一第一經空間配準影像中之抗CD4標示資訊及一第二經空間配準影像中之抗CD14標示資訊，該分析進一步包括識別存在於該抗CD4標示影像中但不存在於該抗CD14標示影像中之目標分析物，及進一步報告該等抗CD4陽性/抗CD14陰性目標分析物作為CD4輔助性T細胞。
條款75.如條款73之方法，其中該等目標分析物包含CD4輔助性T細胞，且其中使用該亮視場顯微術影像來鑑別該視場中之非目標分析物物件，其中該差別染色資訊包括一第一經空間配準影像中之抗CD4標示資訊及一第二經空間配準影像中之抗CD3標示資訊，該分析進一步包括識別存在於該抗CD4標示影像中且亦存在於該抗CD3標示影像中之目標分析物，及進一步報告該等抗CD4陽性/抗CD3陽性目標分析物作為CD4輔助性T細胞。
條款75.如條款66之方法，其進一步包括針對該樣品室內之多個視場重複步驟(c)至(e)。
條款76.一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之裝置，該裝置包括一第一基板及一第二基板，其中該第一基板包括具有一第一外表面及一第一內表面之一平面波導，且該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段及該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，該裝置進一步包括一折射體積以用於將由一或多個光源提供之一或多個光束光學地耦合至該平面波導。
條款77.如條款76之裝置，其中該折射體積經組態以用於折射該一或多個光束以使得該等光束中之至少一者以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該平面表面處。
條款78.如條款76之裝置，其中該第一內表面經修改以形成一附著表面，該修改增強該等目標分析物之固相化。
條款79.如條款76之裝置，其中該修改藉由使用一陽離子聚合物而執行。
可在以上方法及系統中作出改變而背離其範疇。因此，應注意，上文說明中所含有或附圖中所展示之內容皆應視為說明性的而不具有一限定意義。以下申請專利範圍意欲涵蓋本文中所闡述之一般及特定特徵，以及對本方法及系統之範疇之陳述，只是語言的問題，可認為本方法及系統歸屬於一般特徵與特定特徵之間。
雖然已在各組件具有特定各別定向之情況下圖解說明瞭前述實施例中之每一者，但應理解，如本發明中所闡述之系統可呈現其中各組件位於各種各樣之位置及相互定向中的各種各樣之特定組態且仍保持在本發明之精神及範疇內。舉例而言，應注意，本組態可適用於其中核心折射率大於基板之折射率之系統，諸如在使用一固體核心材料之情形下，只要周圍介質折射率小於基板之彼等折射率即可。另外，在上文所闡述之各圖中，可消除襯墊且藉助對第一及第二基板之直接雷射焊接來替換該襯墊。此外，可代替各種組件使用或除各種組件外亦使用適合等效物，熟習此項技術者應熟悉此等可行替代組件或額外組件之功能及使用且因此將此等替代組件或額外組件視為歸屬於本發明之範疇內。因此，應將本實例視為說明性而非限制性，且本發明並不限於本文中所給出之細節而可經修改以仍在隨附申請專利範圍之範疇內。
1．．．雷射
2．．．雷射
100．．．讀取器儀器
110．．．匣
120．．．開口
125．．．門
130．．．手柄
140．．．托盤
300．．．細胞計數系統
302．．．匣
304．．．第一基板
306．．．第二基板
307．．．流體通道
308．．．成像光學器件
310．．．影像感測器
312．．．發光二極體
314．．．光學器件
316．．．雷射光
318．．．雷射光
330．．．細胞
332．．．細胞
336．．．抗體
340．．．標籤
344．．．標籤
350．．．附著表面
360．．．匣之一部分
362．．．樣品流體
364．．．入口埠
370．．．出口埠
375．．．分析物
1005．．．平面波導
1010．．．整合透鏡
1015．．．點
1700．．．折射體積
1710．．．平面波導
1750．．．平面波導配置
2205．．．耦合方案
2210．．．耦合方案
2215．．．耦合方案
2220．．．多模式波導
2225．．．雷射束
2230．．．柱面透鏡
2235．．．雷射束
2240．．．柱面透鏡
2245．．．波導
2250．．．透鏡
2255．．．波導
2260．．．雷射束
2300．．．一般組態
2305．．．光源
2310．．．折射體積
2315．．．平面波導
2320．．．傳播向量
2325．．．法向向量
2330．．．偏移
2400．．．例示性剖視圖
2405．．．波導
2410．．．整合透鏡
2415．．．準直光束
2420．．．測定表面
2425．．．襯墊
2430．．．入口埠
2435．．．輸出埠
2440．．．流體樣品室
2445．．．收集與濾波光學器件
2450．．．成像裝置
2455．．．光學死區
2600．．．斜等軸測視圖
2705．．．襯墊
2900．．．平面波導
2902．．．第一基板
2904．．．第二基板
2910．．．低n介質
2920．．．表面法線
2930．．．光源
2935．．．照射
3000．．．平面波導
3006．．．第一襯墊
3008．．．第二襯墊
3301．．．準直束
3501．．．發散束
3701．．．光束
3801．．．光束
3902．．．第一薄基板
3904．．．第二薄基板
3910．．．低n介質
4110．．．透鏡
4112．．．經聚焦束
4201．．．光束
4210．．．透鏡
4212．．．經聚焦束
4302．．．第一基板
4304．．．第二基板
4310．．．低n介質
4320．．．整合透鏡
4402．．．第一基板
4404．．．第二基板
4410．．．低n介質
4420．．．整合透鏡
4502．．．第一基板
4504．．．第二基板
4506．．．第一襯墊
4508．．．第二襯墊
4510．．．低n介質
4520．．．整合透鏡
4602．．．第一基板
4604．．．第二基板
4606．．．第一支座
4608．．．第二支座
4620．．．整合透鏡
4700．．．平面波導
4702．．．第一基板
4704．．．第二基板
4706．．．第一襯墊
4708．．．第二襯墊
4710．．．低n介質
4720．．．整合透鏡
4730．．．光束
4800．．．波導匣
4802．．．第一基板
4804．．．第二基板
4806．．．襯墊
4810．．．低n介質
4820．．．整合透鏡
4835．．．光
4842．．．入口埠
4844．．．出口埠
5000．．．波導匣
5010．．．反射層
圖1及2展示根據一實施例之具有一匣之一細胞計數系統之透視圖。
圖3係根據一實施例圖解說明用於細胞計數之一方法之一流程圖。
圖4及5係根據一實施例之具有一匣之一細胞計數系統之額外示意性表示。
圖6係根據一實施例圖解說明適合於與用於細胞計數之方法一起使用之一樣品處理方法之一流程圖。
圖7係根據一實施例圖解說明適合於與用於細胞計數之方法一起使用之一替代樣品處理方法之一流程圖。
圖8展示根據一實施例圖解說明影像捕獲與分析過程之一流程圖。
圖9展示根據一實施例圖解說明當使用一基於微球體之自動聚焦方法時圖8中之「執行自動聚焦常式」步驟之細節之一流程圖。
圖10展示根據一實施例圖解說明當使用一基於條紋之自動聚焦方法時圖8中之「執行自動聚焦常式」步驟之細節之一流程圖。
圖11展示根據一實施例之圖10「執行條紋分析」步驟之細節。
圖12展示根據一實施例之具有用於與自動聚焦常式一起使用之一印刷點之一平面波導之一剖視圖。
圖13係根據一實施例圖解說明圖8中之「執行影像分析」步驟之細節之一流程圖。
圖14係根據一實施例圖解說明用於識別亮視場影像及螢光影像中之白細胞之位置之一過程之一流程圖。
圖15展示比較使用本系統及行業標準螢光活化細胞分類(「FACS」)分析所獲得之CD4細胞計數之一比較性研究之結果。
圖16展示比較使用本系統及一雙平臺流式細胞計量系統所獲得之CD4細胞計數、藉由展示相對於一Passing Bablok擬合之計數分佈而量化該比較之一比較性研究之結果。
圖17展示量化對相同血液樣品使用本系統所獲得之CD4細胞計數之變化之一再現性研究之結果。
圖18展示根據一實施例之比較如藉由流式細胞計量及在本細胞計數系統中藉助乾燥或液體抗體所量測之細胞計數之一比較研究之結果。
圖19至21圖解說明形成一平面波導(諸如，圖12中所展示之平面波導)之一替代方式。
圖22圖解說明涉及多模式波導之現有耦合方案之數個實例。
圖23圖解說明闡述例示性實施例之一個一般組態。
圖24圖解說明具有一整合透鏡之一例示性波導之一剖視圖。
圖25提供圖24中所繪示之具有整合透鏡之波導之一詳細剖視圖。
圖26係圖解說明具有整合透鏡之例示性波導之一斜等軸測投影視圖。
圖27係圖解說明具有多個通道之一例示性襯墊之一斜等軸測投影視圖。
圖28係用於執行樣品分析之一例示性方法之一流程圖。
圖29及30圖解說明一平面低n核心波導之一例示性實施例，其中藉由二維表面張力含納液體樣品。在本發明之上下文內，一平面低n核心波導係其中波導之核心展現低於環繞該核心之材料之一折射率之一平面波導。
圖31及32圖解說明另一平面低n核心波導之一例示性實施例，其中藉由用於四個側之一固體密封材料及用於兩個側之表面張力含納樣品。
圖33至36係一平面低n核心波導之一實施例中之光傳播之圖解。圖33及34展示穿過厚波導及薄波導之準直光傳播。圖35及36展示使光在厚波導及薄波導中發散。在所有圖中，出於清晰起見，省略了各種內部界面(舉例而言，基板對詢問介質界面)處之部分反射。
圖37至46展示適合於與平面低n核心波導一起使用之光耦合構件之變化形式之概略性圖解。
圖47展示其中詢問介質完全由固體材料含納且將光耦合至含納區內之波導本身中之一例示性實施例。虛線表示用於至波導中之適當光耦合之一例示性形狀。
圖48至49圖解說明包含光耦合構件、流體含納裝置以及流體入口埠及出口埠之具有一液體詢問介質之一低n核心波導之例示性實施例。兩個基板針對所關注之波長範圍可係透光的，如圖49中所展示。一襯墊可用以沿二維含納流體，如圖48至49中所展示。另一選擇係，上部組件可經整形以包含側壁或支座，該等側壁或支座可直接接合至波導基板。
圖50及51展示類似於圖49中所展示之實施例之實施例，其中上部基板進一步包含一反射器。
100．．．讀取器儀器
110．．．匣
120．．．開口
125．．．門
130．．．手柄
140．．．托盤
Claims (27)
- 一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之系統，該系統包括一匣及一讀取器儀器，該匣包括一第一基板及一第二基板，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開；該讀取器儀器包括一接納機構，其用於將該匣定位於其中，及一成像偵測器，其用於偵測來自該平面波導之該第一內表面上或接近該第一內表面之一視場之光信號；該匣進一步包括用於將由一光源提供之一光束光學耦合至該平面波導之一折射體積。
- 如請求項1之系統，其中該讀取器儀器進一步包括用於分析由該成像偵測器接收之該光信號之一模組。
- 如請求項2之系統，其中該第一內表面與該第二內表面之間的該距離連同具有可量測尺寸之該視場一起界定一樣品體積。
- 如請求項1之系統，其中該折射體積與該平面波導整體形成。
- 如請求項1之系統，其中該折射體積經組態以用於折射該光束以使得該光束係以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該第一內表面上。
- 如請求項1之系統，其中該第一內表面經修改以形成一附著表面，該修改增強該等目標分析物至該第一內表面上之固相化。
- 如請求項6之系統，其中該修改係藉由使用一陽離子聚合物來執行。
- 如請求項1之系統，其中該等目標分析物標示有一或多個易激發標籤。
- 如請求項1之系統，其中該等目標分析物標示有與一螢光團偶聯之抗體。
- 如請求項3之系統，其中藉由該模組進行之該分析包括藉由計數由該讀取器儀器之該成像偵測器捕獲之至少一個視場中之目標分析物之數目來枚舉該等目標分析物。
- 如請求項10之系統，其中該至少一個視場中之目標分析物之該數目表示該樣品體積中之所有目標分析物之總數目，且該樣品中之該等目標分析物之濃度可藉由將請求項10中所獲得之目標分析物之該總數目除以該樣品體積來計算。
- 如請求項11之系統，其中該濃度對添加至該樣品室之該樣品之量不敏感。
- 如請求項1之系統，其中該讀取器儀器進一步包括用於提供該光束之一或多個光源。
- 如請求項1之系統，其中該光束內之該光之至少一小部分光學耦合至該第一基板之該第一外表面及該第二基板之該第二外表面且含納在該第一外表面與該第二外表面之間，其中該光之該小部分照射侷限於該樣品室內之該樣品之至少一部分。
- 如請求項1之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一自動聚焦構件。
- 如請求項1之系統，其中該讀取器儀器進一步包括一光源及一聚光透鏡，該光源及該聚光透鏡聯合該成像偵測器能夠產生一亮視場顯微術影像。
- 如請求項1之系統，其中該讀取器儀器包括一致動構件以用於藉由控制該匣及該成像偵測器之相對位置而產生多個視場。
- 如請求項17之系統，其中該致動構件藉由使該匣相對於該成像偵測器移動來控制該匣與該成像偵測器之相對位置。
- 一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之裝置，該裝置包括一第一基板及一第二基板，其中該第一基板包括具有一第一外表面及一第一內表面之一平面波導，且其中該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段及該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，該裝置進一步包括用於將由一或多個光源提供之一或多個光束光學地耦合至該平面波導之一折射體積。
- 如請求項19之裝置，其中該折射體積經組態以用於折射該一或多個光束以使得該等光束中之至少一者係以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該平面表面處。
- 如請求項19之裝置，其中該第一內表面經修改以形成一附著表面，該修改增強該等目標分析物之固相化。
- 如請求項21之裝置，其中該修改係藉由使用一陽離子聚合物來執行。
- 一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之方法，該方法包括：(a)使該樣品與一第一類型之一標示分子接觸，(b)將在步驟(a)中製備之該樣品引入至一匣中，該匣包括一第一基板、一第二基板及一折射體積，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，且其中該折射體積將光光學耦合至該平面波導，(c)將該匣定位於一讀取器儀器中，其中該儀器將來自一光源之一光束引導至該折射體積中以使得該光束係以該光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該第一內表面上，其中該光束激發結合至該平面波導之該第一內表面處之該一或多種目標分析物之一第一類型之該標示分子；(d)在該平面波導之該第一內表面處產生具有可量測尺寸之一視場之一影像，該影像解析存在於該樣品中之目標分析物。
- 一種用於分析含有一或多種目標分析物之一樣品之方法，該方法包括：(a)使該樣品與一第一類型之標示分子及一第二類型之標示分子接觸；(b)將在步驟(a)中製備之該樣品引入至一匣中，該匣包括一第一基板、一第二基板及一折射體積，該第一基板包括一平面波導，該平面波導具有一第一外表面及一第一內表面，該第二基板包括一第二外表面及一第二內表面，其中該第一基板及該第二基板經定位以使得至少該第一內表面之一區段與該第二內表面之一區段以其中該第一內表面之該區段及該第二內表面之該區段至少部分地界定用於侷限該樣品之至少一部分之一樣品室之一距離彼此隔開，且其中該折射體積將光光學耦合至該平面波導；(c)將該匣定位於一讀取器儀器中，其中該儀器將來自一第一光源之一第一光束引導至該折射體積中，其中該第一光束激發該第一類型之該等標示分子，且其中該儀器進一步將來自一第二光源之一第二光束引導至該折射體積中，其中該第二光束激發該第二類型之該等標示分子；(d)在該平面波導之該第一內表面處產生具有可量測尺寸之一單個視場之一第一影像及一第二影像，其中將該等影像空間配準，及(e)使用該等經空間配準影像來解析存在於該樣品中之目標分析物以產生差別標示資訊。
- 如請求項24之方法，其中該第一光束及該第二光束係以該等光束內之全部光相對於該平面波導之該第一內表面之一非零內部傳播角度聚焦於該平面表面上。
- 如請求項24之方法，其中一視場影像中之該等目標分析物表示藉由該第一內表面與該第二內表面之間的該已知距離及具有已知尺寸之該視場界定之該已知樣品體積中之所有目標分析物，藉此產生呈每單位體積之目標分析物之數目之形式之一濃度結果。
- 如請求項23或請求項24之方法，其中該等目標分析物係CD4輔助性T細胞。
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