SK14812000A3

SK14812000A3 - Chimérny reťazec protilátky, chimérna protilátka, v oblasť, humanizovaný reťazec protilátky, humanizovaná protilátka, dna, expresný vektor, hostiteľ, spôsob prípravy a liečivo

Info

Publication number: SK14812000A3
Application number: SK1481-2000A
Authority: SK
Inventors: Koh Sato; Hideki Adachi; Naohiro Yabuta
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2001-08-06
Also published as: EP1069185A1; US7494647B2; EP1069185A4; JP2008161198A; AU752730B2; AU3055699A; TR200002885T2; HUP0101160A2; US20040044187A1; JP3998419B2; WO1999051743A1; BR9909382A; US6677436B1; IL138801A0; PL343322A1; NO20004946L; ES2364266T3; PT1069185E; ATE512225T1; EP2363484A3

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka chimérnych protilátok človek/myš, ktoré obsahujú variabilnú oblasť (V oblasť) z myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF) a konštantnú oblasť (C oblasť) z ludskej protilátky; zošľachtenej protilátky, v ktorej oblasti určujúce komplementaritu (CDRs) V oblasti ľahkého reťazca (L reťazec) a V oblasti ťažkého reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF boli prenesené do ludskej protilátky; L reťazca a H reťazca uvedenej protilátky; a fragmentu V oblasti, vytvárajúceho L reťazec alebo H reťazec uvedenej protilátky. Predložený vynález sa týka aj spôsobu prípravy zošľachtenej protilátky proti ludskému TF.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej vyššie uvedenú protilátku, špecificky jej V fragmentu a DNA kódujúcej L reťazec alebo H reťazec, ktorý obsahuje V oblasť. Predložený vynález sa týka aj rekombinantného vektora, ktorý obsahuje vyššie uvedenú DNA a hostiteľa transformovaného uvedeným vektorom.

v

Predložený vynález sa týka aj sposobu prípravy chimérnej protilátky a zošľachtenej protilátky proti ludskému TF. Predložený vynález sa týka aj farmaceutického prostriedku a liečebného činidla pre syndróm roztrúsenej vnútrožilovej zrážavosti (DIC), ktoré obsahuje ako aktívnu zložku zošlachtenú protilátku proti ľudskému TF.

·· • t • · · · · · · ··· • · t··· ·· _ ·········· · · · ······ ·· ···· ·· ·· ·· ·

Doterajší stav techniky

Tkanivový faktor (TF), receptor pre koagulačný faktor VII exprimovaný na povrchu buniek, hraje nezastupitelnú rolu v aktivácii koagulačných faktorov IX a X tým, že vytvorí komplex s koagulačným faktorom VII, a je definovaný ako iniciačný faktor reakcií krvného zrážania.

tkanivovom faktore je známe, že je exprimovaný vo fibroblastoch, bunkách hladkého svalstva atď., ktoré tvoria krvné cievy a že má hemostatickú funkciu v tom, že aktivuje systém zrážania krvi v okamihu poškodenia cievy.

DIC je choroba, pri ktorej aktivácia systému krvného zrážania v krvnej cieve vedie k systematickému mnohonásobnému výskytu krvných zrazenín, hlavne v drobných cievach. Nie je nebvyklým, že zníženie počtu krvných doštičiek a koagulačných faktorov spôsobené ich spotrebovaním, vedie ku krvácaniu, ktoré je opačným javom ako krvné zrážanie. Mnohotvárne mikrozrazeniny môžu spôsobiť nedostatočnú mikrocirkuláciu krvi vo významných orgánoch, ktorá pokial raz vznikne, vedie k nenávratnej funkčnej nedostatočnosti a k zlej prognóze DIC a v tomto zmysle je DIC považovaná za závažné ochorenie.

Výskyt chorôb, ktoré sa za ňou skrývajú, stanovený z výskumných správ vypracovaných v rokoch 1990 až 1992 štúdijnou skupinou pre výskum špecifických chorôb spôsobených poruchami krvnej zrážavosti z ministerstva zdravotníctva a sociálnej starostlivosti, je: hematologické malignity asi 30 %, tuhé nádory asi 20 %, infekcie asi 15 %, choroby z oblasti pôrodníctva asi 10 %, ochorenia pečene asi 6 %, šoky asi 5 % a kardiovaskulárne choroby asi 3 %. Výskyt DIC je asi 15 % pri leukémii, asi 6 až 7 % pri malígnych lymfómoch a asi 3 % pri tuhých nádoroch.

Vývin DIC je sprevádzaný rôznymi vyššie uvedenými chorobami, ktorých príčina je ale tá istá, ide o TF.

Predpokladá sa teda, že mechanizmus vzniku DIC je tento:

·· ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ··· · · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· ··· abnormálne vysoká tvorba a/alebo expresia TF v rakovinových bunkách pri akútnej leukémii, malignom lymfóme a v tuhých nádoroch; zvýšená tvorba a/alebo expresia TF v monocytoch a/alebo bunkách bunkovej výstelky ciev pri infekciách (najmä pri sepse spôsobenej gram-negatívnymi bacilmi); príliv TF do krvi z nekrotického pečeňového tkaniva pri prudkom zápale pečene; expresia TF v svetlosti krvnej cievy pri vydutí srdcovnice, srdcovom vydutí a obrovských hemangiómoch; a tiež príliv TF do krvi pri ochoreniach z oblasti pôrodníctva (enbólia amniotickej tekutiny a predčasné oddelenie placenty), operačných zákrokoch, poraneniach a popáleninách.

Liečenie pôvodných ochorení (ktoré sa za DIC skrývajú) je hlavným cielom, ktorý však nie je lahko uskutočniteľný.

Ako bežná metóda liečby DIC sa používa protizrážavá terapia a substitučná terapia. Pri terapii proti zrážavosti sú používané hlavne heparínové prípravky (frakcionovaný heparín, heparín s nízkou molekulárnou hmotnosťou). Používajú sa aj syntetické inhibítory proteázy (gabexate mesilate nafamost mesilate) a koncentrovaná plazma (anti-thrombin III, prípravky s aktivovaným proteínom C) . Na substitučnú terapiu sú používané koncentráty krvných doštičiek, čerstvo zmrazenej plazmy (náhrada fibrinogénu), premyté červené krvinky a podobne.

Avšak terajšie liečebné činidlá nie sú uspokojivé z hladiska účinnosti, vedľajších účinkov a vo väčšine prípadov sa úplne zbaviť DIC nedá. Preto je nutné používať lieky, ktoré majú vysoké liečebné účinky a malé vedľajšie účinky.

Na druhej strane možno uviesť ako nové pokusy v liečbe DIC trombomodulínové prípravky, hirudín, anti-PAF činidlá, tkanivový faktor inhibície biochemickej dráhy (TFPI). Pozornosť vzbudzujú selektívne inhibítory FXa, ako orálne podávané protikoagulačné a/alebo protitrombotické činidlá. Ako činidlo, ktoré neutralizuje aktivitu TF je v WO ·· ···· • · ·· ·· » · · «

I · · ·· ····

K · « ·· ·· variabilnú kompletnej

88/07543 opísaná myšia monoklonálna protilátka proti ľudskému TF a v WO 96/40921 je opísaná zošľachtená protilátka proti ľudskému TF.

Od myších monoklonálnych protilátok proti ľudskému TF sa očakáva, že budú tvoriť bezpečné a účinné liečebné činidlo tým, že nebudú vykazovať príznaky krvácania, ktoré je spojené s hlavným účinkom na DIC. Avšak myšie monoklonálne protilátky sú vysoko imunogénne (niekedy označované ako antigénne) a tým je liečebná hodnota myších protilátok pre ľudí obmedzená. Napríklad polčas myších protilátok v ľudskom tele je relatívne krátky a preto nemôžu naplno prejaviť svoje predpokladané účinky. Ďalej ľudská protimyšia protilátka (HAMA), ktorá sa vyvinie ako odpoveď na podanú myšiu protilátku, spôsobuje imunologické reakcie, ktoré sú nežiaduce a pre pacienta nebezpečné. Teda myšie monoklonálne protilátky nemôžu byť ľuďom podávané opakovane.

Aby sa vyriešili tieto problémy, boli vyvinuté metódy, ktorých cieľom je znížiť imunogenitu protilátok odvodených z iných živočíchov než je človek, ako sú (z ktorých pochádzajú monoklonálne protilátky) napríklad myši. Jednou z nich je metóda prípravy chimérnej protilátky, v ktorej variabilná oblasť (V oblasť) protilátky pochádza z myšej monoklonálnej protilátky a jej konštantná oblasť (C oblasť) pochádza z vhodnej ľudskej protilátky.

Pretože takto získaná chimérna protilátka obsahuje oblasť pôvodnej myšej forme, predpokladá sa, k antigénu s totožnou afinitou, s akou sa viaže pôvodná myšia protilátka. Ďalej je v chimérnej protilátke podstatne znížený pomer aminokyselinových sekvencií pochádzajúcich z iného živočícha než je človek a teda sa predpokladá, že v porovnaní s pôvodnou myšou protilátkou bude mať zníženú imunogenitu. Je však stále možné, že vznikne imunologická protilátky v jej že sa bude viazať ·· ···· • · ·· ··

• · ·· ···· • · · · · · • · · · · • · ·· ·· · odpoveď na myšiu variabilnú oblasť (LoBuglio, A.F. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86: 4220-4224, 1989).

Od druhej metódy zníženia imunogenity myšej protilátky sa, hoci je oveľa komplikovanejšia, očakáva, že drasticky zníži potenciálnu imunogenitu myšej protilátky. V tejto metóde je samotná oblasť určujúca komplementaritu (CDRcomplementarity determining región) z myšej protilátky prenesená do ľudskej variabilnej oblasti a je tak vytvorená pozmenená ludská variabilná oblasť. Pokiaľ je to žiaduce, niektoré aminokyselinové sekvencie podporných oblastí (FRsframework regions), ktoré spevňujú CDRs, môžu byť prenesené z variabilnej oblasti myšej protilátky do ľudskej variabilnej oblasti, aby sa dosiahlo čo najtesnejšie možné priblíženie k pôvodnej štruktúre myšej protilátky. Potom je zošlachtená prestavaná ludská variabilná oblasť ligovaná k ľudskej konštantnej oblasti. V konečnej podobe prestavanej zošľachtenej protilátky sú len CDRs a malá časť FRs odvodené z aminokyselinových sekvencií iných živočíchov ako je človek. CDRs obsahujú hypervariabilné aminokyselinové sekvencie a nevykazujú druhovo špecifické sekvencie.

Informácie o zošlachtených protilátkach pozri Riechman, L. a kol., Náture, 332: 323-327, 1988; Verhoeye, M. a kol., Science, 239: 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. a kol., Proteín Engng., 4: 773-783, 1991; Maeda, H. a kol., Human Antibodies and Hybridoma, 2: 124-134, 1991; Gorman, S.D. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 41814185, 1991; Tempest, P.R. a kol., Bio/Technoiogy, 9: 266271, 1991; Co, M.S. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2869-2873, 1991; Cater, P. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289, 1992; Co, M.S. a kol., J. Immunol., 148: 1149-1154, 1992 a Seto, K. a kol., Cancer Res., 53: 851-856, 1993.

Pri bežnej technológii zošľachťovania protilátok časť podpornej oblasti (FR) obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá bola prenesená z variabilnej oblasti myšej protilátky ·· ·· ···· ·· ···· • · · 4 • · · 4 • · · · 4 • · · 4 » ·· ·· do ludskej variabilnej oblasti. Keď je potom podaná ako liečebné činidlo ľuďom, existuje riziko, že sa vytvoria protilátky miestu, ktoré má aminokyselinovú sekvenciu, ktorú ľudia nemajú, hoci by išlo len o jednu až niekoľko aminokyselín. Aby sa predišlo riziku, bol vynájdený tretí druh zošľachťovacej technológie. Pre štyri FRs (FR1 až FR4), vyžadované na podporu trojrozmernej štruktúry troch CDRs, táto metóda obsahuje substitúciu FR ľudskej protilátky, ktorá má vysokú homológiu s FR myšej protilátky prítomnej v databáze, pomocou jednej FR ako jednotky. V takom prípade je z ľudských protilátok, prítomných v databáze, vybraných niekoľko FRs, ktoré presúvané, až je pripravená zošlachtená vysokou aktivitou.

spôsobom možno konštruovať v ktorých všetky FRs, s výnimkou CDRs vo oblasti, majú aminokyselinové sekvencie ľudskej protilátky. Potom by zošlachtená protilátka nesúca myšiu CDR nemala mať vyššiu imunogenitu, ako má ľudská protilátka obsahujúca ľudskú CDR.

Hoci, ako bolo vyššie uvedené, sa očakáva, že zošlachtená protilátka bude vhodná na liečebné účely, nie je známy žiaden ustálený postup, ktorý by bol univerzálne použitelný pre akúkoľvek protilátku na prípravu zošľachtenej protilátky a teda sú pre konštrukciu zošľachtených protilátok, ktoré vykazujú dostatočnú väzobnú aktivitu a neutralizačnú aktivitu k špecifickému antigénu, vyžadované rôzne dômyselné postupy (pozri napr. Sato, K. a kol., Cancer Res., 53: 851-856, 1993).

sú postupne protilátka s zošlachtené

Týmto protilátky, variabilnej odvodené z

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť chimérnu protilátku človek/myš obsahujúcu variabilnú oblasť (V oblasť) z myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · • · • · • · ·· • t • · · · • · · • · · · • · · ·· ·· · tkanivovému faktoru (TF) a konštantnú oblasť (C oblasť) z ľudskej protilátky, zošlachtené protilátky, v ktorých oblasti určujúce komplementaritu (CDRs) ľahkého reťazca (L reťazec) V oblasti myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF boli pripojené k ľudskej protilátke, L reťazec a H reťazec uvedenej protilátky a fragment V oblasti, tvoriaci L reťazec alebo H reťazec uvedenej protilátky. Ďalej predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť postup prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF.

Ďalej je predmetom predloženého vynálezu poskytnutie DNA kódujúcej vyššie uvedenú protilátku, špecificky fragment jej V oblasti a DNA kódujúcej L reťazec alebo H reťazec, ktorý obsahuje V oblasť. Ďalej je predmetom predloženého vynálezu poskytnúť rekombinantný DNA vektor, obsahujúci uvedenú DNA a hostiteľa transformovaného uvedeným vektorom, ďalej je predmetom predloženého vynálezu poskytnúť farmaceutický prostriedok a liečebné činidlo pre syndróm roztrúsenej vnútrožilovej zrážavosti (DIC), obsahujúce ako aktívnu zložku zošlachtenú protilátku proti ludskému TF.

Po intenzívnom študovaní, ako riešiť uvedené problémy, autori predloženého vynálezu úspešne získali myšiu monoklonálnu protilátku proti ludskému TF, ktorá má imunogenitu pre ľudí redukovanú, a tiež vyvinuli postup prípravy novej zošľachtenej protilátky, čím je predložený vynález kompletne zavŕšený.

Predložený vynález sa teda týka chimérneho H reťazca, ktorý obsahuje C oblasť H reťazca ľudskej protilátky a fragment V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF. Ako príklad V oblasti H reťazca môže byť uvedená tá, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 9 (sekvencia č. 9) a ako príklad C oblasti môže byť uvedená tá, ktorá je odvodená z oblasti Cy4.

·· ·· ····

Ďalej sa predložený vynález týka chimérneho L reťazca, obsahujúceho C oblasť L reťazca ludskej protilátky a fragment V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF. Ako príklad V oblasti L reťazca môže byť uvedená tá, ktorá uvedenú v SEQ ID NO až 4 z V oblasti H a oblasti určujúce obsahuje aminokyselinovú sekvenciu 15 a ako príklad C oblasti L reťazca môže byť uvedená tá, ktorá je odvodená z oblasti C_K.

Ďalej sa predložený vynález týka chimérnej monoklonálnej protilátky človek /myš proti ľudskému TF, pričom uvedená protilátka obsahuje vyššie uvedený chimérny H reťazec a chimérny L reťazec.

Predložený vynález sa týka aj fragmentu V oblasti H reťazca zošlachtenej protilátky, pričom uvedený fragment obsahuje podporné oblasti (FRs reťazca ludskej protilátky komplementaritu (CDRs) 1 až 3 V oblasti H reťazca z myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF. Ako príklad CDR 1 až 3 môžu byť uvedené tie, ktoré obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 133 až 135. Ako príklad FR1 V oblasti H reťazca ľudskej protilátky môže byť uvedená FR1 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR1 V oblasti H reťazca myšej protilátky; ako príklad FR2 môže byť uvedená FR2 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR2 V oblasti H reťazca myšej protilátky; ako príklad FR3 môže byť uvedená FR3 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR3 V oblasti H reťazca myšej protilátky; a ako príklad FR4 môže byť uvedená FR4 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR4 V oblasti H reťazca myšej protilátky.

Výhodnejšie môže byť ako príklad FRl V oblasti H reťazca ludskej protilátky uvedená FRl ľudskej protilátky, ktorá má 50 % alebo vyššiu homológiu s FRl V oblasti H reťazca myšej protilátky; ako FR2 môže byť uvedená FR2 ludskej protilátky, ktorá má 70 % alebo vyššiu homológiu s ·· · · ···· · · · ···

Q · · · e · · · ^w · · ·· ···· · · ·· · ·

FR2 V oblasti H reťazca myšej protilátky; ako príklad FR3 môže byť uvedená FR3 ľudskej protilátky, ktorá má 65 % alebo vyššiu homológiu s FR3 V oblasti H reťazca myšej protilátky; ako príklad FR4 môže byť uvedená FR4 ľudskej protilátky, ktorá má 80 % alebo vyššiu homológiu s FR4 V oblasti H reťazca myšej protilátky. Ako špecifické príklady môže byť ako FR1 V oblasti H reťazca ľudskej protilátky uvedená ľudská protilátka L39130; ako FR2 môže byť uvedená ľudská protilátka L39130, ľudská protilátka P01742 a ľudská

protilátka	Z80844;	ako FR3 môže byť	uvedená	ludská
protilátka	L39130,	ludská	protilátka	Z34963,	ludská
protilátka	P01825,	ludská	protilátka	M62723,	ludská
protilátka	Z80844,	ludská	protilátka	L04345,	ľudská
protilátka	S78322,	ludská	protilátka	Z26827,	ľudská
protilátka	U95239 a	ludská	protilátka L03147; a	ako FR4

môže byť uvedená ľudská protilátka L39139.

Ako výhodný príklad FR1 V oblasti H reťazca ľudskej protilátky môže byť uvedená ľudská protilátka L39130; ako FR2 môže byť uvedená ľudská protilátka L39130 a ľudská

Z80844;

Z34963, protilátka protilátka protilátka U95239; protilátka L39139. oblasti H ako FR3 môže byť uvedená ľudská ľudská protilátka M62723 a ľudská a ako FR4 môže byť uvedená ľudská Ako ešte výhodnejší príklad FR1 V reťazca ľudskej protilátky môže byť uvedená ľudská protilátka L39130; ako FR2 môže byť uvedená ľudská protilátka L39130; ako FR3 môže byť uvedená ľudská protilátka Z34963 a ludská protilátka LJ95239; a ako FR4 môže byť uvedená ludská protilátka L39139.

Tu používané čísla v podporných oblastiach sú založené na definíciách Kabata (Kabat, E.A. a kol., US Dept. Health and Services, US Government Printing Offices, 1991).

Predložený vynález sa týka aj fragmentu V oblasti H reťazca zošlachtenej protilátky, pričom uvedený fragment obsahuje ktorúkoľvek z aminokyselinových sekvencií, ·· ···· ·· uvedených v SEQ ID NO: 30, 40, 42, 50, 52, 58, 60, 64, 70, 72, 76, 78, 82 a 84.

Predložený vynález sa týka aj fragmentu V oblasti L reťazca zošľachtenej protilátky, pričom uvedený fragment obsahuje FRs 1 až 4 z V oblasti L reťazca ludskej protilátky a CDRs 1 až 3 z V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF. Ako príklad CDR 1 až 3 môžu byť uvedené tie, ktoré obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 136 až 138. Ako FR1 V oblasti L reťazca ludskej protilátky môže byť uvedená ľudská protilátka, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR1 V oblasti L reťazca myšej protilátky; ako FR2 môže byť uvedená FR2 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR2 V oblasti L reťazca myšej protilátky; ako FR3 môže byť uvedená FR3 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR3 V oblasti L reťazca myšej protilátky; a ako príklad FR4 môže byť uvedená FR4 ludskej protilátky, ktorá má 40 % alebo vyššiu homológiu s FR4 V oblasti L reťazca myšej protilátky.

Výhodnejšie môže byť ako príklad FR1 V oblasti L reťazca ludskej protilátky uvedená FR1 ludskej protilátky, ktorá má 7 5 % alebo vyššiu homológiu s FR1 V oblasti L reťazca myšej protilátky; ako FR2 môže byť uvedená FR2 ludskej protilátky, ktorá má 80 % alebo vyššiu homológiu s FR2 V oblasti L reťazca myšej protilátky; ako príklad FR3 môže byť uvedená FR3 ludskej protilátky, ktorá má 70 % alebo vyššiu homológiu s FR3 V oblasti L reťazca myšej protilátky; a ako príklad FR4 môže byť uvedená FR4 ludskej protilátky, ktorá má 80 % alebo vyššiu homológiu s FR4 V oblasti L reťazca myšej protilátky. Ako špecifické príklady môže byť ako FR1 V oblasti L reťazca ludskej protilátky uvedená ludská protilátka Z37332; ako FR2 môže byť uvedená ľudská protilátka Z37332 a ludská protilátka X93625; ako FR3 môže byť uvedená ludská protilátka Z37332, ludská

II ·· ··

·· ···· ·· · protilátka S68699 a ľudská protilátka P01607; a ako FR4 môže byť uvedená ľudská protilátka Z37332.

Ako ešte výhodnejší príklad FR1 V oblasti L reťazca ludskej protilátky môže byť uvedená ľudská protilátka Z37332; ako FR2 môže byť uvedená ludská protilátka X93625; ako FR3 môže byť uvedená ludská protilátka S68699; a ako FR4 môže byť uvedená ludská protilátka Z37332.

Predložený vynález sa týka aj fragmentu V oblasti L reťazca zošlachtenej protilátky, pričom uvedený fragment obsahuje ktorúkoľvek z aminokyselinových sekvencií, uvedených v SEQ ID NO: 93, 99, 101, 107 a 109.

Predložený vynález sa týka aj H reťazca zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF, pričom uvedený reťazec obsahuje fragment V oblasti H reťazca vyššie uvedenej zošlachtenej protilátky a fragment C oblasti H reťazca ludskej protilátky. Ako C oblasť možno uviesť Cy4; ako FRs 1 až 4 odvodené z ludskej protilátky môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z ludskej protilátky L39130 (FR1), ludskej protilátky L39130 (FR2), ludskej protilátky Z34963 (FR3) alebo ludskej protilátky U95239 (FR3), ludskej protilátky L39130 (FR4); a ako CDRs 1 až 3 môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z aminokyselinových sekvencií, uvedených v SEQ ID NO: 133 až 135.

Predložený vynález sa týka aj L reťazca zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF, pričom uvedený reťazec obsahuje fragment V oblasti H reťazca vyššie uvedenej zošlachtenej protilátky a fragment C oblasti H reťazca ludskej protilátky. Ako C oblasť možno uviesť Cy4; ako FRs 1 až 4 odvodené z ludskej protilátky môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z ludskej protilátky L39130 (FRl), ludskej protilátky L39130 (FR2), ludskej protilátky Z34963 ·· ·· • · · · ·· · · • · · · · · · · • · ···· · · · · (FR3) alebo ľudskej protilátky U95239 (FR3), Iudskej protilátky L39130 (FR4); a ako CDRs 1 až 3 môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z aminokyselinových sekvencií, uvedených v SEQ ID NO: 133 až 135.

Predložený vynález sa týka aj L reťazca zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF, pričom uvedený reťazec obsahuje fragment L oblasti H reťazca vyššie uvedenej zošlachtenej protilátky a fragment C oblasti L reťazca Iudskej protilátky. Ako C oblasť možno uviesť Ck; ako FRs 1 až 4 odvodené z ľudskej protilátky môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z Iudskej protilátky Z37332 (FRl), ľudskej protilátky X93625 (FR2), Iudskej protilátky S68699 (FR3) a ľudskej protilátky Z37332 (FR4); a ako CDRs 1 až 3 môžu byť uvedené tie, ktoré sú odvodené z aminokyselinových sekvencií, uvedených v SEQ ID NO: 136 až 138.

Predložený vynález sa týka aj L reťazca zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF, pričom uvedená protilátka obsahuje L reťazec a H reťazec vyššie uvedenej zošlachtenej protilátky.

Predložený vynález sa týka aj procesu prípravy zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF. Proces zošľachťovania sa týka metód výberu FRs, ktoré spevňujú štruktúru CDRs 1 až 3, ktoré sú rozpoznávacími miestami na antigéne pre H reťazec a L reťazec. Predložený vynález sa teda týka metódy výberu niektorej FRs z ľudskej protilátky, ktorá má vysokú homológiu s FR myšej protilátky s každou FR ako jednotkou, a vytvorenia zošlachtenej protilátky, ktorá má požadovanú aktivitu, postupným presunutím FR.

Presnejšie povedané, jedným príkladom procesu prípravy prirodzenej zošlachtenej protilátky, ktorá má oblasť určujúcu komplementaritu (CDR) odvodenú zo živočícha iného ako je človek a podpornú oblasť (FR) odvodenú z prirodzenej ľudskej protilátky a ktorá má zníženú imunogenitu, je uvedná metóda, ktorá obsahuje kroky:

·· ··

9 9 9 ·· ····

9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 (1) príprava monoklonálnej protilátky živočícha iného ako je človek, ktorá reaguje s požadovaným antigénom;

(2) príprava niekolkých ľudských protilátok, ktoré majú vysokú homológiu s aminokyselinovou sekvenciou FR v monoklonálnej protilátke, uvedenej v bode (1);

(3) zámena štyroch FRs jednej z ľudských protilátok uvedených v bode (2) za odpovedajúce FRs z monoklonálnej protilátky živočícha iného ako je človek, uvedenej v bode (1) a vytvorenie tak prvej zošlachtenej protilátky;

(4) zistenie schopnosti zošlachtenej protilátky vytvorenej v bode (3) viazať sa na antigén alebo neutralizovať biologickú aktivitu antigénu;

(5) zámena jednej až troch FRs zošlachtenej protilátky vytvorenej v bode (3) za odpovedajúce FRs z ludskej protilátky, ktorá je odlišná od tej, ktorá bola použitá v bode (3), u ľudských protilátok pripravených v bode (2) a vytvorenie tak druhej zošlachtenej protilátky;

(6) porovnanie schopnosti druhej zošlachtenej protilátky vytvorenej v bode (5) a prvej zošlachtenej protilátky vytvorenej v bode (3) viazať sa k antigénu alebo neutralizovať biologickú aktivitu antigénu a podľa toho výber zošlachtenej protilátky s výhodnou aktivitou;

(7) uskutočnenie vyššie uvedených krokov (3) až (6) u zošlachtenej protilátky vybranej v bode (6); a (8) opakovanie vyššie uvedených krokov (3) až (6) dokiaľ sa nezíska zošľachtená protilátka, ktorá má aktivitu odpovedajúcu monoklonálnej protilátke živočícha iného ako je človek, uvedenej v bode (D · ·· ··· e· ·· • · · · • · · • · • · · ·· ···· • ι · • · · • · · · ·· ··

Len čo sa získa zošlachtená protilátka, ktorá má určitý stupeň aktivity neutralizácie ľudského TF, je uskutočnený ďalší prieskum homológie špecifických FR v H reťazci a L reťazci V oblasti a týmto spôsobom môže byť vybraná ľudská protilátka s vysokou homológiou. Pridaním takto získanej ľudskej protilátky ku skupine niekoľkých ľudských protilátok vo vyššie uvedenom kroku (2) a ďalším opakovaním krokov (3) až (6) môže byť získaná zošlachtená protilátka s požadovanou aktivitou.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej fragment

V oblasti H reťazca alebo fragment V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti TF. Ako príklad aminokyselinovej sekvencie a kódujúcej DNA fragmentu

V oblasti H reťazca alebo fragmentu V oblasti L reťazca možno uviesť tú, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 9 resp. 15.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej chimérny H reťazec alebo chimérny L reťazec. Ako DNA kódujúca uvedený H reťazec môže byť uvedená tá, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 9, a ako DNA kódujúca uvedený L reťazec môže byť uvedená tá, ktorá obsahuje nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 15.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej fragment

V oblasti H reťazca alebo fragment V oblasti L reťazca vyššie uvedenej zošlachtenej protilátky. Ako DNA kódujúcu fragment V oblasti H reťazca možno uviesť tú, ktorá obsahuje ktorúkoľvek z nukleotidových sekvencií uvedených v SEQ ID NO: 29, 39, 41, 49, 51, 57, 59, 63, 69, 71, 75, 77, 81 alebo 83, a ako DNA kódujúcu fragment V oblasti L reťazca možno uviesť tú, ktorá obsahuje ktorúkoľvek z nukleotidových sekvencií uvedených v SEQ ID NO: 92, 98,

100, 106 alebo 108.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej H reťazec zošlachtenej protilátky.

·· ···· • · • · · • · ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ····

Predložený vynález sa týka aj DNA H reťazca zošlachtenej protilátky, pričom uvedená DNA obsahuje DNA kódujúcu aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 30, 40, 42, 50, 52, 58, 60, 64, 70, 72, 76, 78, 82 alebo 84. Ako príklad uvedenej DNA možno uviesť tú, ktorá obsahuje ktorúkoľvek z nukleotidových sekvencii uvedených v SEQ ID NO: 29, 39, 41, 49, 51, 57, 59, 63, 69, 71, 75, 77, 81 alebo 83.

Predložený vynález sa týka aj DNA kódujúcej L reťazec zošlachtenej protilátky.

Predložený vynález sa týka aj DNA L reťazca zošlachtenej protilátky, pričom uvedená DNA obsahuje DNA kódujúcu aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 93, 99, 101, 107 alebo 109. Ako príklad uvedenej DNA možno uviesť tú, ktorá obsahuje ktorúkoľvek z nukleotidových sekvencii uvedených v SEQ ID NO: 92, 98, 100, 106 alebo 108.

Predložený vynález sa týka aj rekombinantného DNA vektora, ktorý obsahuje ktorúkoľvek vyššie opísanú DNA.

Predložený uskutočňovaných vektorom.

Predložený vynález vyššie vynález sa týka aj transformácií opísaným rekombinantným DNA sa týka aj spôsobu prípravy chimérnej protilátky alebo zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF, pričom uvedená metóda obsahuje kultiváciu vyššie uvedených transformantov a získanie chimérnej protilátky alebo zošlachtenej protilátky proti ľudskému TF z vypestovanej kultúry.

Predložený vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov a liečebných činidiel pre DIC, ktoré ako účinnú zložku obsahujú vyššie uvedenú zošľachtenú protilátku.

Najlepší spôsob uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález bude teraz vysvetlený s ďalšími podrobnosťami.

·· ···· ·· ·· • · · · · · • · · · · · ·· • · · • · ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

1. Príprava myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému

TF

Myšia monoklonálna protilátka proti ľudskému môže byť pripravená tak, že pomocou fúzie buniek produkujúcich protilátky, ktoré sú získané zo živočíchov imunizovaných daným antigénom, s myelómovými bunkami je vytvorený hybridom, potom je zo získaného hybridómu selektovaný kloň, ktorý produkuje protilátku, ktorá špecificky inhibuje aktivitu TF.

Slezinové bunky myši imunizovanej TF ako antigénom, ktorý bol čistený z ľudskej placenty, boli fúzované s myelómovými bunkami a tak bol pripravený hybridom. S cieľom hromadne prehľadávať hybridómy bola pomocou bunkového ELISA testu, ktorý využíva bunkovú líniu J82 veľmi produkujúcu TF, určovaná väzobná schopnosť protilátky k TF a jej schopnosť neutralizovať TF bola určená testovacím systémom, ktorý používa ako mieru aktivity inhibovania aktiváciu koagulačného faktora X (faktor X: FX) . Výsledkom bolo, že boli úspešne založené hybridómy, ktoré produkujú 6 protilátok, ktoré veľmi inhibujú aktiváciu FX komplexu TF/VIIa.

(1) Príprava antigénu

Ako TF na imunizáciu zvierat môže byť uvedený peptid, ktorý je časťou aminokyselinovéj sekvencie TF, vytvoreného rekombinačnou DNA technológiou alebo chemickou syntézou, alebo TF získaného z ľudskej placenty. Napríklad ako antigén možno použiť TF purifikovaný z ľudskej placenty podľa metódy Ita a kol. (Ito T. a kol., J. Biochem. 114: 691-696, 1993).

Získaný TF je zmiešaný s adjuvans a takto získaná zmes je použitá ako antigén. Ako adjuvans možno uviesť Freudovo kompletné adjuvans alebo Freudovo nekompletné adjuvans. Ktorékoľvek môže byť v zmesi použité.

(2) Imunizácia a odoberanie buniek produkujúch protilátky ·· ···· ·· · • · · · · · • · · · · · ·· • · • · ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

Antigén získaný vyššie uvedeným spôsobom môže byť podávaný civacom, okrem človeka, napríklad cicavcom ako sú myši, krysy, kone, opice, králiky, kozy, ovce a podobne. Imunizácia môže byť uskutočnená pomocou akejkoľvek existujúcej metódy a to hlavne intravenóznymi, subkutánnymi a intraperitoneálnymi injekciami a podobne. Obdobie imunizácie je napr. v intervale od niekoľkých dní do niekoľko týždňov, výhodne v intervale 4 až 21 dní.

Bunky produkujúce protilátku môžu byť odoberané 2 až 3 dni po poslednom dni imunizácie. Ako bunky produkujúce protilátku možno uviesť slezinové bunky, lymfatické bunky a bunky periférnej krvi; obyčajne sa používajú slezinové bunky. Množstvo antigénu, ktoré by malo byť použité pre každú imunizáciu je 0,1 až 100 pg na myš.

(3) Určovanie titra protilátky

Aby bola potvrdená úroveň imunitnej odpovede imunizovaného zvieraťa a vybraný požadovaný hybridom z buniek po uskutočnenej bunkovej fúzii, je určovaný titer protilátky v krvi imunizovaného zvieraťa prípadne v supernatente kultúry buniek, ktoré produkujú protilátku.

Ako metódy detekcie protilátky možno uviesť známe metódy, ako je enzýmimunologický test (EIA), rádioimunologický test (RIA), imunosorbčný test s viazaným enzýmom (ELISA) a podobne.

(4) Bunková fúzia

Ako myelómové bunky fúzujúce s bunkami produkujúcimi protilátku sú používané bunkové línie odvodené z myší, krýs, ľudí atď., ktoré sú bežne dostupné skúseným odborníkom v tomto odbore. Ako používané bunkové línie možno uviesť tie, ktoré majú vlastnosti ako je rezistencia proti liekom, neschopnosť v nefúzovanom stave prežiť v selekčnom médiu (napríklad médium HAT) a schopnosť prežiť len vo fúzovanom stave. Obyčajne sa používajú kmene rezistentné proti 8-azaguanínu; týmto bunkovým líniám chýba ·· ·· · ···· ·· ···· ·· · ··· ·· · · · · · · ··· ···· · e · ·· ···· ·· ·· ·· ··· hypoxantín-guanidín-fosforybosyltransferáza a preto nemôžu prežiť v médiu, ktoré obsahuje hypoxantín, aminopterín a tymidín (médium HAT).

Ako myelómové bunky sa prevažne používajú rôzne známe bunkové línie, ako sú P3 (P3X63Ag8.653) (J. Immunol. 123: 1548-1550, 1979), P3X63Ag8.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., J. Immunol. 6: 511-519, 1976), MPC-11 (Margulies, D.H., Celí 8: 405-415, 1976), SP2/0 (Shulman,

S.F. a kol., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21, 1980),

S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. 148: 313-323, 1978),

R210 (Galfre, G. akol., Náture 277: 131-133, 1979) a podobne.

Bunky produkujúce protilátky možno získať zo slezinových buniek, lymfatických buniek a podobne. Teda z vyššie uvedených živočíchov sú odoberané alebo zbierané sleziny, lymfatické uzliny atď. a tieto tkanivá sú dispergované. Dispergované bunky sú pri príprave požadovaných buniek produkujúcich protilátky resuspendované v médiu alebo v pufre, ako sú PBS, DMEM a RPMI1640, prefiltrované cez nerezové sitko a centrifugované.

Vyššie uvedené myelómové bunky a bunky produkujúce protilátky sú podrobené bunkovej fúzii.

Bunková fúzia sa môže uskutočniť tak, že myelómové bunky a bunky produkujúce protilátky sa privedú do kontaktu pri teplote 30 až 37 °C počas 1 až 15 minút, za prítomnosti urýchľovača fúzie, vo vzájomnom pomere 1:1 až 1:10, v kultivačnom médiu pre živočíšne bunky, ako sú MEM, DMEM,

RPMI1640 a podobne. Aby sa bunková fúzia urýchlila, môžu byť použité urýchľovače bunkovej fúzie alebo fúzujúce vírusy, ako sú polyetylénglykol (PEG) s molekulovou hmotnosťou 1 000 až 6 000, polyvinylalkohol alebo Sendai vírus (HVJ). Ďalej možno na fúzovanie buniek produkujúcich protilátky s myelómovými bunkami použiť komerčne dostupné ·· ···· ·· ·· • · · · • · · ·· ···· » · · » · e ·· ···· » · · I ·· ·· prístroje na bunkovú fúziu (napr. elektroporácia), ktoré využívajú elektrickú stimuláciu.

(5) Selekcia a klonovanie hybridómov

Z fúzovaných buniek môže byť vybraný požadovaný hybridom. Ako príklad môžu byť uvedené metódy, ktoré používajú selektívny rast buniek v selekčnom médiu. Bunková suspenzia je po zriedení vhodným médiom vysiata na mikrotitračné platničky a pridá sa selekčné médium (ako je HAT) . Výsledkom môžu byť rastúce bunky získané vo forme hybridómu.

Testovanie hybridómov sa robí metódou konečného riedenia, pomocou triedenia fluorescenčné aktivovaných buniek a podobne a nakoniec sa môže byť získaný hybridom produkujúci protilátku.

Výber hybridómu produkujúceho protilátku môže byť uskutočnený použitím kombinácie systémov. Napríklad môže byť rozpoznávací antigén, ako je bunkový ELISA test, systém merajúci TF-neutralizačnú aktivitu, ktorý používa ako meradlo aktivitu faktora Xa a systém testovania neutralizačnej aktivity, ako je systém merania schopnosti inhibovania koagulácie plazmy, a tak je získaný hybridom monoklonálnu protilátku s požadovanou Týmto spôsobom môžu byť získané hybridómy produkujúce monoklonálnu protilátku, ako sú ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5, ATR-7 a ATR-8.

(6) Odoberanie monoklonálnych protilátok

Ako metódy odberu monoklonálnych protilátok zo získaných hybridómov možno uviesť bežné metódy pestovania bunkových kultúr, metódu vytvárania ascitu a podobne.

Pri použití metódy pestovania bunkových kultúr je hybridom kultivovaný v kultivačnom médiu pre živočíšne bunkové kultúry, ako je RPMI1640 doplnené 10 až 20 % fetálneho teľacieho séra, médium DMEM, médium bez séra alebo pod., v kultivačných podmienkach (napr. 37 °C, rôznych testovacích kombinovaný systém produkujúci aktivitou.

··	·· • · •	··	···· • •	• •	·· • •	• ·
• •	• •	• •	• •
•	•	•	•	•	• ·	•	•
	··	····	··		··		··	··

koncentrácia 5 % CO₂) počas 2 až 14 dní. Protilátka je potom získaná zo supernatantu bunkovej kultúry.

Pri použití metódy vytvárania ascitov je hybridom podaný intraperitoneálne živočíšnemu druhu, ktorý je podobný tomu druhu cicavca, z ktorého sú odvodené myelómové bunky a hybridom vyrastie do veľkých rozmerov. Po 1 až 4 týždňoch je odobraný ascites alebo sérum.

Ak je požadovaná purifikácia protilátky vo vyššie uvedenej metóde získania protilátky, purifikácia sa uskutočňuje po výbere vhodnej známej metódy, ako je frakcionácia síranom amónnym, chromatografia na ionomeničoch a afinitná chromatografia, alebo pomocou ich kombinácie.

2. Klonovanie DNA kódujúcej V oblasť monoklonálnej protilátky proti TF (i) Príprava mRNA

Aby bolo možné klonovať DNA kódujúcu V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF, je izolovaná pomocou známej metódy, ako je napr. metóda pomocou guanidínu a ultracentrifugácie, celková RNA zo získaného hybridómu (Chirgwin, J.M. a kol., Biochemistry, 18: 5294-5299, 1979) a potom je mRNA purifikovaná pomocou stĺpca oligo (dT)-celulózy, ktorý je súčasťou súpravy na purifikáciu mRNA (mRNA Purification Kit-Pharmacia Biotech) a podobne. mRNA môže byť purifikovaná aj bez toho, že by bola izolovaná celková RNA a to pomocou QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech).

(ii) Príprava a amplifikácia DNA

Z RNA získanej v kroku (i) je pomocou reverznej transkriptázy syntetizovaná V oblasť L reťazca, prípadne

V oblasť H reťazca. Syntéza cDNA môže byť uskutočnená pomocou Oligo-dT priméru alebo iného vhodného priméru (napríklad primér na syntézu cDNA, ktorý je súčasťou ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ···· • · · · ·· ·· ·· súpravy), ktorý hybridizuje s C oblasťou L reťazca alebo s C oblasťou H reťazca.

Amplifikácia cDNA môže byť uskutočnená pomocou PCR, založenej na metóde 5'-RAČE (Frohman, M.A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,8998-9002, 1988; Belyavsky, A. a kol., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932, 1989), ktorá používa súpravu 5'-Ample FINDER RAČE kit (CLONOTECH) spolu s L reťazcom a H reťazcom. Ku koncom dvojvláknovej cDNA, syntetizovanej vyššie opísaným spôsobom, je pripojený cDNA adaptér a potom je uskutočnená polymerázová reťazová reakcia (PCR) pre DNA kódujúcu V oblasť H reťazca V oblasť L reťazca (výraz DNA kódujúca fragment V oblasti L reťazca je tu skrátene označovaný ako DNA V oblasti L reťazca alebo DNA kódujúca V oblasť L reťazca; to isté platí pre V oblasť H reťazca atď.).

Pri amplifikácii DNA V oblasti H reťazca môže byť ako 5'-koncový primér použitý Adaptér primér 1, primér MHC-G1 (SEQ ID NO: 1) pre konštantnú oblasť H reťazca myšej protilátky (ATR-2, ATR-3, ATR-4 a ATR-5)(oblasť cyl) alebo primér MHC-G2a (SEQ ID NO: 2) (ATR-7 a ATR-8) (oblasť cy2a) (S.T. Jones a kol., Biotechnology, 9: 88, 1991). Napríklad ako 5'-koncový primér môže byť použitý Adaptér primér 1, ktorý je súčasťou súpravy a ako 3'-koncový primér možno použiť primér pre konštantnú oblasť L reťazca κ reťazca (oblasť Ck) myšej protilátky (ako je primér MKC, ktorý má takú nukleotidovú sekvenciu, aká je uvedená v SEQ ID NO: 3.

(iii) Purifikácia DNA a určovanie nukleotidovej sekvencie

U produktov PCR je známym postupom uskutočnená agarózová ekektroforéza. Po vyrezaní požadovaného DNA fragmentu bola DNA znovu extrahovaná a purifikovaná. Potom bola ligovaná do vektorovej DNA.

DNA môže byť purifikovaná buď extrakciou pomocou fenolu a chloroformu (J. Sambrook a kol., Molecular ·· ···· ·· ·· ·· ···· ·· · ··· ··· ······ ·· ···· ·· ·· ·· ·

Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) alebo pomocou komerčne dostupnej súpravy (napríklad GENECLEAN II;

BIO101). Vektorovou DNA použitou na pripojenie fragmentov

DNA môže byť ktorákoľvek zo známych vektorových DNA (napríklad pUC19 a Bluescript atď.).

Vyššie uvedená DNA a vektorová DNA sú ligované pomocou známej ligačnej súpravy (vyrábanej v Takara Shuzo) a tak je získaný rekombinantný vektor. Po vnesení výsledného rekombinantného DNA vektora do kompetentných buniek Escherichia coli JM109 (Nippongene) atď. sú selektované kolónie rezistentné proti ampicilínu a potom je vektorová DNA pripravená známou metódou (J. Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Po štiepení vyššie uvedeného vektora pomocou reštrikčného enzýmu, nukleotidové sekvencia DNA, o ktorú ide, môže byť určená známou metódou (napríklad dideoxymetódou) (J. Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). V zhode s predloženým vynálezom môže byť použitý automatický prístroj na určovanie nukleotidovéj sekvencie (DNA Sequencer 373A, Perkin-Elmer).

(iv) V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca tvoria miesto, ktoré viaže antigén a všeobecná štruktúra je navzájom podobná. Teda každé 4 podporné oblasti (FRs) sú spojené troma hypervariabilnými oblasťami, t.j. oblasťami určujúcimi komplementaritu (CDRs). Aminokyselinové sekvencie FRs sú dosť konzervatívne, zatial čo aminokyselinové sekvencie CDRs sú velmi vysoko variabilné (Kabat, E.A. a kol., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Mnoho oblastí vyššie uvedených štyroch FRs má štruktúru β-listu, čo má za následok, že CDR vytvára slučku. Niekedy CDR môže byť časťou štruktúry β-listu. Tri

CDR sú teda udržiavané v priestore vo vzájomnej tesnej ·· ·· ·· ···· ·· ···· · · · ··· • · · · · · ·· ··· ···· ··· ·· ···· ·· ·· ·· ··· blízkosti a FRs vytvára spolu s tromi CDRs miesto, ktoré viaže antigén.

Na základe týchto skutočností môže byť upravením aminokyselinovej sekvencie myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF podľa databázy aminokyselinových sekvencií protilátok vytvorených Rabatom (Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983) testovaná jej homológia a možno teda nájsť CDRs.

Sekvencie CDRs pozmenené inzerciou, substitúciou alebo deleciou môžu byť do predloženého vynálezu zahrnuté, pokiaľ si udržia aktivitu väzby na ľudský TF alebo schopnosť neutralizovať ľudský TF, keď je pomocou nich vytvorená zošľachtená protilátka. Napríklad možno uviesť také, ktoré majú homológiu 90 až 100 % s každou CDRs pre SEQ ID NO: 133 až 138 alebo s každou CDRs v oblasti V so SEQ ID NO: 139 až 141, 143 až 144, 145 až 147 a 149 až 150.

Ako výhodné možno uviesť tie sekvencie, ktoré majú homológiu 95 až 100 %. Ako ešte výhodnejšie možno uviesť tie sekvencie, ktoré majú homológiu 98 až 100 %.

3. Príprava expresného vektora chimérnej protilátky

Len čo boli DNA fragmenty kódujúce myší L reťazec (L reťazec alebo H reťazec protilátky môže tu byť označený ako myší L reťazec pre myšiu protilátku a ludský H reťazec pre H reťazec ludskej protilátky) a myšiu V oblasť H reťazca raz klonované, DNA kódujúca myšiu V oblasť bola ligovaná do DNA kódujúcej konštantnú oblasť ludskej protilátky a exprimovaná, aby bola získaná chimérna protilátka proti ludskému TF.

Základné metódy prípravy chimérnej protilátky zahŕňajú pripojenie myšej leader sekvencie a sekvencie V oblasti v klonovanej cDNA k sekvencií kódujúcej konštantnú oblasť ludskej protilátky, už v expresnom vektore pre cicavčie bunky. Alternatívnou možnosťou je väzba myšej leader sekvencie a sekvencie V oblasti v klonovanej cDNA ·· ···· • · ·· · ·· ·· • · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· k sekvencii kódujúcej C oblasť ludskej protilátky a potom jej pripojenie do expresného vektora pre cicavčie bunky.

Fragmentmi C oblasti ludskej protilátky môžu byť fragment z C oblasti H reťazca a C oblasti L reťazca ktorejkoľvek ludskej protilátky. Napríklad možno uviesť cyl, cy2, cy3 alebo cy4, pochádzajúce z C oblasti H reťazca alebo ck pochádzajúce z L oblasti H reťazca.

Na prípravu chimérnej protilátky je pripravený expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu V oblasť myšieho H reťazca a C oblast H reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilňovač transkripcia/promótor a jednoduchý expresný vektor (pozri napr. WO 94/11523) obsahujúci DNA kódujúcu V oblasť myšieho L reťazca a C oblasť L reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilňovač transkripcia/promótor. Následne je expresný vektor použitý na kotransformáciu hostiteľskej bunky, ako je cicavčia bunka, a transformované bunky sú kultivované in vitro alebo in vivo pre produkciu chimérnej protilátky (pozri napríklad WO 91/16928). Ako jednoduché vektory možno použiť expresný vektor N5KG1(V) pre protilátku typu IgGlK a expresný vektor N5KG4P pre protilátku typu IgG4K.

(i) Konštrukcia H reťazca chimérnej protilátky

Expresný vektor pre H reťazec chimérnej protilátky možno získať vnesením cDNA kódujúcej V oblasť myšieho H reťazca do vhodného expresného vektora, ktorý obsahuje DNA kódujúcu C oblasť H reťazca ľudskej protilátky. Ako C oblasť H reťazca možno napríklad uviesť oblasti Cyl, Cy2, Cy3 alebo 0γ4.

Ako je to uskutočňované tu, aby došlo k vneseniu cDNA kódujúcej V oblasť myšieho H reťazca do expresného vektora, môže byť do uvedenej cDNA vnesená pomocou PCR metódy vhodná nukleotidová sekvencia. Napríklad takáto vhodná nukleotidová sekvencia môže byť vnesená do expresného ·· ···· ··

·· ·· • · · · • · · • · · vektora tak, že je uskutočnená PCR pomocou PCR primérov navrhnutých tak, aby sme mali rozpoznávaciu sekvenciu vhodného reštrikčného enzýmu na 5'-konci uvedenej cDNA a pre zvýšenie účinnosti transkripcie, bezprostredne pred iniciačným miestom uvedenej cDNA, Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-950,

1987) a PCR primérov navrhnutých tak, aby sme mali rozpoznávaciu sekvenciu vhodného reštrikčného enzýmu na 3'konci uvedenej cDNA.

Po opracovaní takto konštruovanej cDNA, kódujúcej V oblasť myšieho H reťazca, je táto vložená do vyššie uvedeného a potom je skonštruovaný expresný vektor pre chimérny H reťazec, ktorý obsahuje DNA kódujúcu C oblasť (Cyl alebo Cy4) H reťazca.

(ii) Konštrukcia expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu κ reťazec L reťazca chimérnej protilátky Expresný vektor pre L reťazec chimérnej protilátky možno získať vnesením cDNA kódujúcej V oblasť myšieho L reťazca do vhodného expresného vektora, ktorý obsahuje DNA kódujúcu C oblasť L reťazca Iudskej protilátky. Ako C oblasť L reťazca možno napríklad uviesť oblasti Ck a CX.

Ako je to uskutočňované tu, aby bol skonštruovaný expresný vektor obsahujúci cDNA kódujúcu V oblasť myšieho L reťazca, môže byť do uvedenej cDNA vnesená pomocou PCR metódy vhodná nukleotidová sekvencia. Napríklad takáto vhodná nukleotidová sekvencia môže byť vnesená do uvedenej cDNA ta!., že je uskutočnená PCR pomocou PCR . primérov navrnnutých tak, aby sme mali rozpoznávaciu sekvenciu vhodného reštrikčného enzýmu na 5'-konci uvedenej cDNA a pre zvýšenie účinnosti transkripcie Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu; a PCR primérov navrhnutých tak, aby sme mali rozpoznávaciu sekvenciu vhodného reštrikčného enzýmu na 3'konci uvedenej cDNA.

·· ···· • e ·· ···· ·· · · • · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · · · ······ ·Λ ΛΛΛΛ ΛΛ ΛΛ ΛΛ

Po opracovaní takto konštruovanej cDNA, kódujúcej

V oblasť myšieho L reťazca, je táto vložená do vyššie uvedeného a potom je skonštruovaný expresný vektor pre chimérny L reťazec, ktorý obsahuje DNA kódujúcu C oblasť (Ck) L reťazca.

4. Príprava zošľachtených protilátok (1) Vyhľadávanie homológie ľudských protilátok Aby bola vytvorená zošlachtená protilátka, v ktorej sú

CDRs z myšej monoklonálnej protilátky zabudované do ľudskej protilátky, je výhodná vysoká homológia medzi FRs myšej monoklonálnej protilátky a FRs ľudskej protilátky. Teda

V oblasti H reťazca a L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF sú porovnané s V oblasťou všetkých známych protilátok, ktorých štruktúra bola publikovaná pomocou databanky. Súčasne sú porovnávané s podskupinami ľudských protilátok (HSG: ľudská podskupina) (Kabat, E.A. a kol., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983), klasifikovanými Kabat a kol., na základe dĺžky FR a homológie aminokyselín.

Na základe HSG klasifikácie podľa Kabat a kol.,

V oblasti ľudského H reťazca môžu byť zoskupené do skupín HDGI až III; napríklad V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ludskému TF má homológiu 67,8 % s konsenzuálnou sekvenciou HSGI. Na druhej strane, V oblasti ludských κ foriem L reťazcov môžu byť zoskupené do skupín HSGI až IV; napríklad V oblasť ľudských κ formy L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ludskému TF má homológiu 72,3 % s konsenzuálnou sekvenciou HSGI.

Pokiaľ je myšia protilátka zošľachťovaná bežnou technológiou, aminokyselinové sekvencia niektorých FRs

V oblasti myšej protilátky, ktoré podporujú CDR, môžu byť, pokiaľ je to žiaduce, vnesené do FR v ľudskej V oblasti, takže štruktúra zošľachtenej V oblasti môže presnejšie ·· ·· • · · · • · · ·· ···· • · · ·· ···· • · ·· · napodobniť CDR štruktúru pôvodnej myšej protilátky. Avšak neexistujú pravidlá o tom, že ktoré aminokyseliny FR V oblasti myšej protilátky majú byť vnesené do FR v ľudskej protilátke. Preto je veľmi pracné určiť aminokyseliny, ktoré sú podstatné pre zachovanie štruktúry CDR.

Existuje aj riziko, že môže vzniknúť protilátka proti aminokyselinovej sekvencii vnesenej do ľudskej V oblasti z V oblasti myšej protilátky. Podľa predloženého vynálezu, aby boli v zošlachtenej protilátke zmenené všetky aminokyselinové sekvencie, okrem CDR na aminokyselinovej sekvencii odvodenej z ludskej protilátky, boli v ludskej protilátke vyhľadané také FRs, ktoré majú vysokú homológiu s FR myších protilátok prítomných v databáze, s jednou FR ako jednotkou, pre štyri FRs (FRl až 4), ktoré sú vyžadované pre zachovanie trojrozmernej štruktúry CDR. Nasleduje výsledok vyhľadávania homológie v databáze pre každú FR V oblasti H reťazca a V oblasti L reťazca monoklonálnej protilátky ATR-5.

·· ···· ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · · · · · ·· ·· ···· ·· ·· ··

Tabulka 1

Číslo FR	Prístupové číslo	Homológia s každou FR V oblasti H reťazca myšej protilátky /%/	SEQ ID NO:
H reťazec FR1	L39130	53,0	110
H reťazec FR2	L39130	92, 9	111
	P01742	71,4	112
	Z80844	78,6	113
H reťazec FR3	L39130	62,5	114
	Z34963	71,9	115
	P01825	53, 1	116
	M62723	68,8	117
	Z80844	68,8	118
	L04345	65, 6	119
	S78322	75,0	120
	Z26827	56,3	121
	U95239	65, 6	122
	L03147	65, 6	123
H reťazec FR4	L39130	90,9	124

Tabulka 2

Číslo FR	Prístupové číslo	Homológia s každou FR V oblasti L reťazca myšej protilátky /%/	SEQ ID NO:
H reťazec FRl	Z37332	78,3	125
H reťazec FR2	Z37332	80,0	126
	S65921	80,0	127
	X93625	80,0	128
H reťazec FR3	Z37332	71,9	129
	S68699	75,0	130
	P01607	71, 9	131
H reťazec FR4	Z37332	90,0	132

• · · · · · ·· · • · · · • · · • · · ·· ···· • · · · ·· ·· • · ·· · (2) Navrhovanie DNA kódujúcej V oblasť zošlachtenej protilátky

Prvýn krokom pri navrhovaní DNA kódujúcej V oblasť zošlachtenej protilátky je vybrať každú FR V oblasti ludskej protilátky, ktoré sú potom základom návrhu. Pre zámeny FR je treba pre každú FR vybrať velmi variabilnú FR V oblasti ľudskej protilátky.

Pre monoklonálnu protilátku ATR-3, ktorá je predmetom tohto vynálezu, boli vybrané na základe prieskumu homológie medzi V oblasťami H reťazca všetkých myších protilátok a každou FR H reťazca tri FRs V oblasti pre FR2 a desať pre FR3. Pre L reťazec môžu byť na základe prieskumu homológie medzi V oblasťami L reťazca myších protilátok a každou FR H reťazca tri FRs V oblasti ľudskej protilátky pre FR2 a tri pre FR3.

Pre obidve zošľachtené V oblasti H reťazca a L reťazca možno vybrať V oblasti L reťazca L39130 a Z37332, ktoré majú vysokú homológiu s V oblasťami H reťazca, resp. L reťazca myšej protilátky ATR-5. Aby bola umožnená ľahká zámena pri vytváraní zošľachtených protilátok, je možné navrhnúť vhodné rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy na vhodných miestach v každej CDR A fr. Pri tomto postupe môže byť ľahko zamenená len jedna z FRs.

Príkladom takých miest je napr. rozpoznávacie miesto reštrikčného enzýmu EcoT221 v zošľachtenom H reťazci CDR1, rozpoznávacie miesto reštrikčného enzýmu Balí v CDP2, reštrikčného enzýmu Ncol v CDR3 a reštrikčného enzýmu Xhol v FR3, rozpoznávacie miesto rozpoznávacie miesto rozpoznávacie rozpoznávacie napríklad rozpoznávacie miesto reštrikčného enzýmu AfIII v zošľachtenom L reťazci CDR1, reštrikčného enzýmu Spel v CDR2, reštrikčného enzýmu Pstl v CDR3 a reštrikčného enzýmu Acclll v FR3.

miesto miesto rozpoznávacie miesto ·· ·· ·· ···· ·· · ···· ·· · ···· ·· · · · · ··· ·· ···· · · · · · ··· ···· ·· · ·· ···· ·· ·· ·· ···

Na základe takto navrhnutej verzie môže byť uskutočnená zámena pre každú FR, aby bola získaná zošľachtená protilátka s požadovanou aktivitou.

(3) Príprava fragmentu V oblasti zošiachtenej protilátky

Zošľachtená protilátka, ktorá je predmetom tohto vynálezu, je taká, kde FRs C oblasti a V oblasti uvedenej protilátky sú odvodené z ludskej protilátky a CDR V oblasti je odvodená z myšej protilátky. Fragmenty V oblasti zošiachtenej protilátky, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môžu byť, pokial sú dostupné DNA fragmenty ľudskej protilátky, pripravené metódou nazývanou prenos CDR pomocou PCR metódy. Podľa toho ako sa používa tu, je prenos CDR metóda, v ktorej je vytvorený DNA fragment kódujúci CDR myšej protilátky, ktorý je zamenený za CDR ludskej protilátky, ako matricu.

Keď nie sú k dispozícii DNA fragmenty ludskej protilátky ako matrice, nukleotidové sekvencie zaznanenané v databáze môžu byť syntetizované pomocou DNA syntetizátora a V oblasť zošiachtenej protilátky môže byť vytvorená pomocou metódy PCR. Pokial je v databáze zaznamenaná len aminokysekinová sekvencia, úplná nukleotidová sekvencia môže byť dedukovaná na základe aminokyselinovej sekvencie a frekvencie kodónov použitých v protilátkach, ako je publikované v Kabat E.A. a kol. (US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991). Nukleotidová sekvencia môže byť syntetizovaná pomocou DNA symtetizátora a fragmenty V oblasti zošiachtenej protilátky môže byť vytvorená pomocou metódy PCR.

(i) Konštrukcia DNA a expresného vektora, kódujúceho

V oblasť zošlachteného H reťazca

Podlá predloženého vynálezu môže byť DNA kódujúca

V oblasť zošlachteného H reťazca konštruovaná tak, že je získaný gén kódujúci V oblasť H reťazca ludskej protilátky, ktorý bude použitý ako matrica, potom je syntetizovaná

Ή ·· ·« ·· ···· ·· ···· ·· · · · · • · · · · · · · ··· ······· ·· ···· ·· ·· ·· ··· úplná nukleotidová sekvencia DNA kódujúca V oblasť zošľachteného H reťazca pomocou DNA symtetizátora a nasleduje použitie metódy PCR. Napríklad protilátka L39130, ktorá má vysokú homológiu s V oblasťou H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ľudskému TF, môže byť vytvorená ako zošľachtená V oblasť H reťazca verzie a. Napríklad, aby bola vytvorená zošlachtená V oblasť H reťazca verzie a, je oddelene použitých 5 primárov, ktoré sú uvedené v SEQ ID NOs: 22 až 26 a dva vonkajšie priméry, ktoré sú uvedené v SEQ ID NOs: 27 a 26.

Priméry na prenos CDR hR5HvlS (SEQ ID NO: 22), hR5Hv2S (SEQ ID NO: 23) a hR5Hv4S (SEQ ID NO: 24) majú smer DNA sekvencie proti smeru prepisu a priméry na prenos CDR hR5Hv3A (SEQ ID NO: 25) a hR5Hv5A (SEQ ID NO: 26) majú smer DNA sekvencie v smere prepisu a každý z nich má 18 až 35 báz komplementárnej sekvencie na oboch koncoch priméru. Primér hR5HvlS je navrhnutý tak, aby mal Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a rozpoznávacie miesto pre Sali a hR5Hv5A je navrhnuté tak, aby mal rozpoznávacie miesto pre Nhel. Vonkajšie priméry hR5HvPrS (SEQ ID NO: 27) a hR5HvPrA (SEQ ID NO: 28) sú tiež homologické s primérmi na prenos CDR hR5Hvls a hR5Hv5A.

S použitím PCR metódy je 5 primérov zostavených tak, aby syntetizovali cDNA po celej dĺžke a po pridaní vonkajšieho priméru je táto DNA amplifikovaná. Tu použité zostavenie pomocou PCR metódy znamená, že hR5Hvls,. hR5Hv2s, hR5Hv4s, hR5Hv3A a hR5Hv5A sú tepelne hybridizované svojimi komplementárnymi sekvenciami a je syntetizovaná DNA V oblasti H reťazca po celej dĺžke.

C oblasťou H reťazca ľudskej protilátky môže byť akákoľvek C oblasť ludského H reťazca; ako príklad možno uviesť ľudské reťazce Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4.

·· ···· ·· ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

DNA V oblasti H reťazca zošlachtenej protilátky, konštruovaná ako je opísané vyššie, môže byť pripojená k DNA C oblasti H reťazca ktorejkoľvek ludskej protilátky, napríklad C oblastí ludského H reťazca Cyl alebo Cy4. Ako je opísané v konštrukcii H reťazca chimérnej protilátky, po opracovaní vhodným reštrikčným enzýmom je pripojená k DNA kódujúca C oblasť ľudského H reťazca, pod kontrolou expresne regulačnej oblasti, ako je systém zosilňovač transkripcia/promótor, čím je vytvorený expresný vektor obsahujúci DNA zošlachtenej V oblasti H reťazca a C oblasť ludského H reťazca.

(ii) Konštrukcia DNA a expresného vektora, kódujúceho

V oblasť zošlachteného L reťazca

Ako v prípade DNA kódujúcej V oblasť zošlachteného H reťazca, môže byť podlá predloženého vynálezu DNA kódujúca

V oblasť zošlachteného L reťazca konštruovaná tak, že je získaný gén L reťazca ludskej protilátky, ktorý bude použitý ako matrica, potom je syntetizovaná úplná nukleotidová sekvencia DNA kódujúca V oblasť zošlachteného L reťazca pomocou DNA symtetizátora a následne PCR metódou. Napríklad protilátka Z37332, ktorá má vysokú homológiu s V oblasťou L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ľudskému TF, môže byť vytvorená ako zošľachtená

V oblasť L reťazca verzie a.

Napríklad, aby bola vytvorená zošľachtená V oblasť L reťazca verzie a, priméry na prenos CDR h5LvlS (SEQ ID NO: 85) a hRLv4S (SEQ 1D NO: 86) majú smer DNA sekvencie proti smeru prepisu a priméry na prenos CDR h5Lv2A (SEQ ID NO: 87), h5Lv3A (SEQ ID NO: 88) a h5Lv5A (SEQ ID NO: 89) majú smer DNA sekvencie v smere prepisu a každý z nich má 18 až 35 báz komplementárnej sekvencie na oboch koncoch priméru. Primér h5LvlS je navrhnutý tak, aby mal Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a rozpoznávacie miesto pre reštrikčný ·· ·· ···· » · · « ·· ·· ľudského L enzýmom je enzým Bglll a h5Lv5A je tiež navrhnuté tak, aby mal rozpoznávacie miesto pre reštrikčný enzým Spil. Vonkajšie priméry h5LvS (SEQ ID NO: 90) a h5LvA (SEQ ID NO: 91) sú tiež homologické s primérmi na prenos CDR h5Lvls a h5Lv5A.

Ako u zošľachtenej V oblasti H reťazca je s použitím PCR metódy zostavených 5 primérov tak, aby syntetizovali cDNA po celej dĺžke a po pridaní vonkajšieho priméru môže byť táto DNA amplifikovaná.

C oblasťou L reťazca ludskej protilátky môže byť akákoľvek C oblasť ľudského L reťazca; ako príklad možno uviesť ludský reťazec CX a Ck.

DNA V oblasti L reťazca zošľachtenej protilátky, konštruovaná ako je opísané vyššie, môže byť pripojená k DNA C oblasti L reťazca ktorejkolvek ludskej protilátky, napríklad odvodenej z oblastí Ck alebo CX reťazca. Po opracovaní vhodným reštrikčným pripojená k DNA kódujúca C oblasť ľudského L reťazca, pod kontrolou expresne regulačnej oblasti, ako je systém zosilňovač transkripcia/promótor, čím je vytvorený expresný vektor obsahujúci DNA zošľachtenej V oblasti L reťazca a k reťazec C oblasti ľudského L reťazca.

Aj keď je fragment V oblasti zošľachtenej protilátky vytvorený tak, ako bolo vyššie opísané, nie je vždy jasné, či uvedený fragment V oblasti bude mať protilátkovú aktivitu (t.j. schopnosť viazať antigén, schopnosť neutralizovať antigén atď.). Je teda nevyhnutné skúmať prítomnosť aktivity tak, že je spojený so zošlachteným H reťazcom a exprímovaný v živočíšnych bunkách , ako sú bunky COS-7.

(iii) Zámena FR V oblasti H reťazca a L reťazca zošľachtenej protilátky

Autori predloženého vynálezu uskutočnili v živočíšnych bunkách, ako sú bunky COS-7, prechodnú expresiu zošľachtenej protilátky, ktorá obsahovala zošlachtenú V oblasť H • · ·· ·· ···· ·· · ···· ·· · · · ·· · · · · ··· • · · · · · · · · · · • · · ···· · · · • 0 ···· ·· ·· ·· ··· reťazca a L reťazca, aby preskúmali väzobnú a neutralizačnú schopnosť antigénu. Zistili, že antigén má väzobnú a neutralizačnú schopnosť, ale aktivita nie je dostatočná v porovnaní s chimérnou protilátkou.

Autori predloženého vynálezu môžu rozriešiť tento problém postupnou zámenou každej FR zošlachtenej V oblasti H reťazca a L reťazca. Protilátky použité pri zamieňaní FR môžu byť vybrané z existujúcich databáz. FR z vybranej ludskej protilátky môže byť syntetizovaná na základe nukleotidovej sekvencie uvedenej v databázach, pomocou DNA syntetizátora. Súčasne, ako je uvedené vyššie, môžu byť pomocou pridania navrhnutých rozpoznávacích sekvencií reštrikčných enzýmov k CDR alebo FR lahko zamenené za FR V oblasti H reťazca a L reťazca zošlachtenej protilátky, vytvorenej ako bolo opísané vyššie. Skúmaním aktivity takto vytvorenej zošlachtenej protilátky môže byť získaná zošlachtená protilátka, ktorá má väzobnú aktivitu pre antigén a neutralizačnú aktivitu.

Napríklad FR3 V oblasti H reťazca zošlachtenej protilátky môže byť zamenená za FR3 odvodenú z ludskej protilátky Z34963 (GenBank, Borrentzen M. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12917-12921, 1994).

FR zamieňajúce priméry F3RFFS (SEQ ID NO: 35) a F3RFBS (SEQ ID NO: 36) majú smer DNA sekvencie proti smeru prepisu a F3RFFA (SEQ ID NO: 37) a F3RFBA (SEQ ID NO: 38)majú smer DNA sekvencie v smere prepisu. FR zamieňajúce priméry F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA a F3RFBA môžu byť syntetizované v

pomocou DNA syntetizátora.

F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA a F3RFBA boli tepelne hybridizované a vzniknuté produkty boli štiepené Balí a Xhol, resp. Ncol a Xhol. Potom boli vnesené do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Xhol) pripraveného štiepením pomocou Balí a Xhol a potvrdením jeho nukleotidovej sekvencie bol získaný plazmid, ktorý má správnu sekvenciu. Takto získaný plazmid obsahujúci H reťazec zošlachtenej protilátky bol ·· ···· ·· ·· ···· ·· · · ·· β · · · ·· ··· · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· · označený ako hATRSHvb/CVIDEC obsiahnutý v plazmide bol Nukleotidová sekvencia a zošľachtený H reťazec označený ako verzia b.

a odpovedajúca aminokyselinová sekvencia sú uvedené v SEQ ID NO: 39 a aminokyselinová sekvencia verzie b je uvedená v SEQ ID NO: 40.

Podobným spôsobom môže byť vymenená aj FR odvodená z V oblasti H reťazca a L reťazca inej ludskej protilátky vybranej z databázy za FR V oblasti H reťazca a L reťazca zošlachtenej ludskej protilátky.

Aby bola vybraná výhodnejšia ludská protilátka pre výmenu FR z V oblasti H reťazca a L reťazca zošlachtenej ludskej protilátky, je možné uskutočniť nasledovné. Kombinácia verzie b H reťazca zošlachtenej protilátky a L reťazca chimérnej protilátky má neutralizačnú aktivitu, ktorá sa rovná neutralizačnej aktivite chimérnej protilátky alebo myšej protilátky. Avšak kombinácia verzie b H reťazca zošlachtenej protilátky a verzie a L reťazca zošľachtenej protilátky má neutralizačnú aktivitu nižšiu, ako neutralizačná aktivita chimérnej protilátky alebo myšej protilátky.

Pri výbere ludskej protilátky, ktorá by mohla byť kandidátom pre výmenu FR, môže byť uskutočnený prieskum homológie, napríklad pre FR3 (prístupové číslo Z34963: SEQ ID NO: 115) verzie b H reťazca zošlachtenej protilátky a môže byť získaná ludská protilátka, ktorá má vysokú homológiu s touto sekvenciou. Ako príklad V oblasti H reťazca FR3 takto vybranej ludskej protilátky možno uviesť v

J95239 (SEQ ID NO: 122) a L03147 (SEQ ID NO: 123).

Aminokyselinové sekvencie takto pripravenej V oblasti H reťazca zošlachtenej protilátky sú uvedené v tabuľke 3 a 4, a aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca zošlachtenej protilátky je uvedená v tabuľke 5.

·· ····

CM

OC

O

O ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ··

Aminokyselinové sekvencie V oblasti H reťazca

CM or:

ÍX.

ctx o

o

C£ (X

LO

CO

CM

ĽO

CO J 1 1 | 1 | ι ι ι i i

cy

1

»

l

1

CO

cx.

1

I

CM

1

l

|

O.

1

i

uZj

1

|

cn

<*

1

t

l

oo

s

1

|

c^

to

1

|

to

□c

1

ĽO

to

1

J

ΖΣ.

J

1

CO

c

1

I

<

cu

1

CM

C2>

1

—l

ZôZ

1

CO

to

1

cra

to

1

|

J

oo

*—

1

s

c—

5=

1

I

to

Ct3

1

i

1

lO

1

•sa-

to

1

I

co

cy

1

CM

to

1

|

I-—<

O-

1

O

os

1

«<

OT

cy

I

1

l

I

i

CO

1

Q£

C2C

l*—

1

|

to

5=

1

ιο

CC

1

^r

ZSE

1

CO

>-

1

CM

>-

1

|

to

1

O

1

|

OT

—M

1

l

1

CO

Z

1

|

c*-—

Cx.

1

to

1

l

LO

CO

1

<c

1

I

1

|

CO

1

CM

o

1

I

l

1

CO

1

l

I

t

O

*—

1

l

|

cn

í

1

l

I

CO

>

1

c—

CO

1

I

to

E—

1

l

|

LO

to

1

I

|

Q-

1

I

|

CO

Cč

1

l

t

|

CM

<c

1

l

|

f—«

mJ

1

|

1

O

o=~

1

|

1

OT

<c

1

l

|

(

OO

to

1

r

1

t>—

CO

1

|

1

I

to

OJ

1

|

1

I

LO

m3

1

I

mJ

1

|

I

co

cy

1

I

|

CM

>-

1

I

*^— ^e

cy

1

I

Z-S

z-*\

z·'»

o

- z>

z\ ·

z^.

z**S

Z*S

r - 4

σ3

JO

o

x>

CD

u_

CU}

x=

JO

Ό

</

uz

S—Z

K—z

O

CO

in

CO

LO

CM

t*

03

O

CM

CO

to

oo

CM

^r

CM

CO

M*

--4

CT>

co

h-

oo

co

CO

CM

o-

CD

M*

o

CM

o

x’

CO

to

IO

co

CO

oo

o

l>

CM

03

o

O

-J

CM

s

CM

m3

CO

CM

=3

J

o_

D-

l ca

Z80844Cb3) ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · · · ·· ····

Aminokyselinové sekvencie V oblasti H reťazca (pokračovanie)

	co	co 1 1 1
		CM	CO	1		1
		r—í	>	!		1
	—1	O	č—			1
		cn	>	1		1
az		co	X	1		1
Cx.		Ľ—	F*			1
		CD	CO			)
		Lf3	cy			1
			CO			1
		co				1
	CM	>-	\|		1
			CQ			J
CO	O	o	:s	1		1
az	—H	03	<c	1		1
Q		oo	>-			1
CD		r*-	CO	1		1
		co	CO			\|
	UD	za			1
			az			I
		CO	<c			\|
		CM	o			1
		»—1	>-			Ci,
	CO	o				1
		03	>	*—		1
		oo	<			1
		o	CO	e-	F*	1
		CO	CQ			1
		uo	Cz3		<C	1
			z	cn		CO
		co	E—·	az		QC
		o	—3			\|
		CQ	CO			1
CO			cn			1
az		CM	Cx.	_3	X	—3
Cs-			CxJ		oc	1
	oo	o	X	ZS		ZS
		03	>-		CO	1
		CO			Cx.	1
		ŕ-	.—.	e-	CV	e—
		co	cn	z	’Z.	1
		in	c	E—	3iC	Ε-
			CO			ι
		CO	E—		1	Cx3
		CM	<c	CQ	CQ	CQ
		t-H	<c		0>	1
	Ľ—	o	É-		—3	1
		03	-J	·—	S	^4
		CO		E—¹	E—·	E—
		12-				>-
	CO	az		t	1

I

I I < I i I

I I i i

I I < I

I t

I I i I

I

I t i t I

I i

I I

I 1

I I

I t

I I

Cx. i ( I ι ει |

I

CO cn

QC OZ

I I

/'N	s~\		o	Z->	z~\
od	ja	O	TO	03	U-i	bo
<-/	o	o	z	M-Z	V-Z	\_Z
o	CO	ĽO	CO	TT	LÍO	CM
co	CO	co	CM			CM
»—1	03	CO	r-	OO	co	CO
03	-tr	O	CM	o		co
CO	CO	co	CO	CO	o	L-·
X	OM	2	s	03	—3	CO

r*

CM

CO

CM c^3

Z**\	z-\		·—
· —	—Ί	X	X3
s_z		M-z
03	S-	CM	CM
CO		XT
CM	•—H	Ľ—	Γ—
LO	co	•—4	> j
03	o	o	O
ZQ	—3	o	CL-

CO X s—z oo o

oo

I t

i

I t

I

I t

I

I l

CX.

I

I (

I

Z8O844(d3) -VTI--DE-T-T--M-L---RS38 ·· ···· ·· ·· ·· ···· ·· · ··· ·· · · · · · · • · · · · · ···· • · · ···· ··

Tabulka 5

Aminokyselinové sekvencie V oblasti L reťazca

FR1 CDR1 FR2 CDR2

2 3 4 5

12345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456 Z37332(a) DIQMTQSPSSLSASVCDRVT1TC KASQDIKSFLS WYQQKPGKAPKLL1Y YATSLAD

S68699(b) -------------------------------------------------------P01607(c) -------------------------------------------------------S65921(bl) -----------------------------------F------S--T---------X93625(b2) —-------------------------------------E—-S...........

FR3

CDR3 FR4

Z37332(a) S68699(b) P01607(c) S65921(bl) X93625(b2)

7 8

78901234567890123456789012345678

GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS S LQ P E D FATYYC

--------------Y------------------------------Y-----------|------------------Y------------------------------Y----------------9 10

901234567 8901234567

LQHGESPYT FGGGTKVEIK ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ··· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·

Každá verzia V oblasti H reťazca a L reťazca takto konštruovanej zošlachtenej protilátky môže byť pripojená k DNA ktorejkoľvek C oblasti ľudského H reťazca alebo C oblasti L reťazca, napríklad k oblasti Cy4 ľudského H reťazca alebo oblasti Ck ľudského L reťazca. Po opracovaní vhodným reštrikčným enzýmom je pripojená k DNA kódujúcej Cy4 oblasť ľudského H reťazca a Ck oblasť ľudského L reťazca pod kontrolu expresne regulačnej oblasti, ako je systém zosilňovač transkripcie/promótor, čím je vytvorený expresný vektor kódujúci obidve verzie DNA zošlachtenej V oblasti H reťazca a L reťazca a DNA kódujúca oblasť Cy4 ľudského H reťazca a oblasť Ck ľudského L reťazca.

DNA kódujúca V oblasť H reťazca zošlachtenej protilátky a C oblasť ľudského H reťazca, konštruovaná vyššie uvedeným spôsobom, a DNA kódujúca zošľachtenú V oblasť L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca sú vnesené do jedného vektora (pozri príklad WO/11523) a uvedený vektor je následne použitý na transformáciu hostiteľských buniek. Potom môžu byť transformované bunky kultivované in vivo alebo in vitro, aby produkovali požadovanú protilátku. 5. Produkcia chimérnej protilátky a zošlachtenej protilátky

Aby bola produkovaná chimérna protilátka alebo zošľachtená protilátka, môže byť DNA kódujúca V oblasť H reťazca a C oblasť H reťazca a DNA kódujúca V oblasť L reťazca a C oblasť L reťazca pripojené do jedného vektora, ki_orý je transformovaný do vhodných hostiteľských buniek, ktoré potom protilátku produkujú. Teda pre expresiu chimérnej protilátky je DNA kódujúca myšiu leader sekvenciu v klonovanej cDNA a V oblasť myšieho H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca a DNA kódujúca myšiu leader sekvenciu a V oblasť myšieho L reťazca a C oblasť ľudského H reťazca vnesená do jedného vektora (pozri napríklad WO/11523) pod ·· ···· ·· ·· • · · · • e · • · · e· ···· • · · · ·· ··

9 ·

kontrolu expresne regulačnej oblasti, ako je napr. systém zosilňovač transkripcie/promótor.

Pre expresiu zošľachtenej protilátky sú DNA kódujúca V oblasť zošľachteného H reťazca a C oblasť ludského H reťazca a DNA kódujúca V oblasť zošľachteného L reťazca a C oblasť ludského H reťazca vnesené do jedného expresného vektora (pozri napríklad WO/11523) pod kontrolu expresne regulačnej oblasti, ako je napr. systém zosilňovač transkripcie/promótor. Tieto vektory sú použité na transformáciu hostiteľských buniek. potom môžu byť transformované bunky kultivované in vivo alebo in vitro, a týmto spôsobom môže byť produkovaná chimérna alebo zošľachtená protilátka.

Môžu byť vytvorené aj dva expresné vektory, pričom každý obsahuje V oblasť H reťazca V oblasť L reťazca. Teda pre chimérnu protilátku sú vytvorené expresné vektory, kedy jeden obsahuje DNA kódujúcu V oblasť myšieho H reťazca a C oblasť ludského H reťazca pod kontrolou systému zosilňovač transkripcie/promótor a druhý expresný vektor obsahuje DNA kódujúcu V oblasť myšieho L reťazca a C oblasť ludského L reťazca pod kontrolou systému zosilňovač transkripcie /promótor, a pre zošlachtenú protilátku sú vytvorené dva expresné vektory, kedy jeden obsahuje DNA kódujúcu V oblasť zošľachteného H reťazca a C oblasť ludského H reťazca pod kontrolou systému zosilňovač transkripcie/promótor a druhý expresný vektor obsahuje DNA kódujúcu V oblasť zošľachteného L reťazca a C oblasť ludského L reťazca pod kontrolou systému zosilňovač transkripcie/promótor.

Inou možnosťou pre chimérnu protilátku je vytvoriť expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu V oblasť myšieho H reťazca a C oblasť ludského H reťazca a DNA kódujúcu V oblasť myšieho L reťazca a C oblasť ludského L reťazca pod kontrolou expresne regulačnej oblasti, ako je napr.systém zosilňovač transkripcie/promótor, a pre zošlachtenú protilátku je inou možnosťou vytvoriť expresný ·· ·· ·· ···· ·· ···· · · · ··· ·· ··· ·· ··· ···· · ·· ···· ·· «· ·· · vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu V oblasť zošlachteného H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca a DNA kódujúcu V oblasť zošlachteného L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca pod kontrolou expresne regulačnej oblasti, ako je napr.systém zosilňovač transkripcie/promótor.

Tieto expresné vektory sú potom použité na kotransformáciu hostiteľských buniek, ako sú cicavčie bunky, a transformované bunky sú kultivované in vitro alebo in vivo pre produkciu chimérnej alebo zošľachtenej protilátky (pozri napríklad WO 91/16928).

Ako je uvedené vyššie, transformant transformovaný genómom kódujúcim požadovanú chimérnu protilátku alebo zošľachtenú protilátku je kultivovaný a produkovaná chimérna protilátka alebo zošľachtená protilátka môže byť oddelená zvnútra buniek alebo z vonkajšieho prostredia okolo buniek a purifikovaná do homogénneho stavu.

Izolácia alebo purifikácia chimérnej protilátky alebo zošľachtenej protilátky, alebo požadovaného proteínu, ktorý je predmetom tohto vynálezu, môže byť uskutočnená pomocou stĺpca Sepharosy s proteínom A. Inými metódami sú okrem iného separačné alebo purifikačné metódy používané pre bežné proteíny. Napríklad chimérna protilátka alebo zošľachtená protilátka môže byť izolovaná alebo purifikovaná vhodným spojením rôznych chromatografických metód, ultracentrifugácie, vysolenia, dialýzy a podobne.

Na produkciu chimérnej protilátky alebo zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môže byť použitý ktorýkoľvek expresný systém. Keď sú napríklad používané eukaryotické bunky, môžu to byť bunky živočíšne (napríklad udržiavané línie cicavčích buniek), bunky húb alebo bunky kvasiniek; keď sú používané prokaryotické bunky, môžu to byť bunky bakteriálne (ako sú bunky Escherichia coli). Výhodne je chimérna protilátka alebo zošľachtená protilátka, ktorá je predmetom tohto ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· · vynáleu, exprimovaná v cicavčích bunkách, ako sú bunky COS alebo bunky CHO.

V týchto prípadoch môžu byť na expresiu v cicavčích bunkách použité vhodné bežné promótory. Výhodne je napríklad používaný bezprostredne časný promótor ľudského cytomegalovírusu (HCMV). Príklady expresných vírusov, ktoré obsahujú HCMV promótor, zahŕňajú HCMV-VH-HCyl, HCMV-VL-HCk a podobne, a ďalej tie, ktoré sú odvodené od pSV2neo (WO 92/19759).

Iné promótory na expresiu génov v cicavčích bunkách, ktoré môžu byť použité v predloženom vynáleze, zahŕňajú vírusové promótory, ako sú promótory retrovírusu, polyomavírusu, adenovírusu a opičieho vírusu 40 (SV40) a promótory odvodené od cicavčích buniek, ako je ľudský faktor la na predlžovanie polypeptidového reťazca (HEFla). Expresiu možno ľahko dosiahnuť napríklad metódou Mulligan a kol., (Náture /1979/ 227: 108), kde je použitý promótor SV40, alebo metódou Mizushima a kol., (Nucleic Acids Res.

/1990/ 18: 5322), kde je použitý promótor HEFla.

Ako začiatky replikácie môžu byť použité tie, ktoré sú odvodené od SV40, polyomavírusu, adenovírusu, hovädzieho papilomavírusu (BPV) a podobne. Naviac pre zmnoženie počtu génových kópií v systéme hostiteľskej bunky môžu expresné vektory obsahovať selektovatelné markery, ako je gén pre fosforybosyltransferázu ΑΡΗ (3') II alebo I (neo), gén pre tymidínkinázu (TK), gén pre xantínguanínfosforybos^1transferázu (Ecogpt), Escherichia coli, gén pre- dihydrofolátreduktázu (dhfr) a podobne.

6. Hodnotenie väzobnej aktivity k antigénu a neutralizačnej aktivity chimérnej protilátky a zošlachtenej protilátky (1) Meranie koncentrácie protilátky pomocou testu

ELISA ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · • · · · · • · · · · · • * · · · · ·· ···· ·· ·· ·

Koncentrácia získanej purifikovanéj protilátky môže byť meraná pomocou testu ELISA.

ELISA platničky na meranie koncentrácie protilátky môžu byť pripravené nasledovným spôsobom: v každej jamke 96-jamkovej platničky (napríklad Maxisorp, NUNC) je imobilizovaných 100 μΐ kozej protilátky proti ľudskému IgGy (BioSource), pripravenej s koncentráciou 1 μς/πιΐ.

Po blokovaní s 200 μΐ riedeného pufra (tu označovaný ako DB; 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovädzí sérumalbumín (BSA), pH 7,2), sú do každej jamky pridané supernatanty z bunkových kultúr COS-7 alebo buniek CHO, v ktorých bola exprimovaná chimérna protilátka alebo zošlachtená protilátka, alebo je purifikovaná chimérna protilátka alebo zošlachtená protilátka sériovo riedená a potom pridaná do každej jamky. Potom sa pridá 100 μΐ kozej protilátky proti ľudskému IgG, konjugovanej s alkalickou fosfatázou, ďalej sa pridá 100 μΐ roztoku substrátu s koncentráciou 1 mg/ml (Sigma 104, pnitrofenylfosfát, SIGMA) a nakoniec sa odpočítacím zariadením pre mikrodoštičky Microplate Reader (Bio Rad) meria absorbancia 405/655 nm. Ako štandard pre meranie koncentrácie bol použitý ludský IgG4K (The Binding Site).

(2) Meranie väzobnej aktivity k antigénu

Platničky bunkového ELISA testu na meranie väzobnej aktivity k antigénu sú pripravené nasledovným spôsobom: bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (ATCC HTB-1) sa naočkujú do 60 jamôk 96-jamkc-vej platničky na pestovanie bunkových kultúr s koncentráciou 1 x 10⁵ buniek. Toto je kultivované (médium RPMI 1640 obsahujúce 10 % fetálneho hovädzieho séra (Gibco)) jeden deň v CO₂ inkubátore, aby bunkám bolo umožnené sa uchytiť. Po odstránení kultivačného média je každá jamka dvakrát premytá 300 μΐ PBS. Potom sa do každej jamky pridá 100 μΐ PBS, ktorý obsahuje 4% ·· ···· ·· · · • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • ·

9· · paraformaldehyd (tento pufer je tu označený PFA/PBS) a na 10 minút sa to umiestni na lad, aby došlo k imobilizácii buniek.

PFA/PBS je odstránený a každá jamka je dvakrát premytá 300 μΐ PBS a potom blokovaná 250 μΐ DB. 100 μΐ supernatantov z kultúr, obsahujúcich chimérnu protilátku alebo zošlachtenú protilátku alebo purifikovanú chimérnu protilátku alebo sériovo riedené zošlachtené protilátky, je pridaných do každej jamky a 2 hodiny sa to inkubuje pri izbovej teplote. Po premytí oplachovacím pufrom (tu označovaný ako RB PBS obsahujúci 0,05 % Tweenu 20) je pridaných 100 μΐ kozej protilátky proti ľudskému IgGy, konjugovanej s alkalickou fosfatázou (BioSource), ktorá je lOOOx zriedená v DB. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premytí RB je pridaný roztok substrátu a potom je meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek (Bio Rad).

(3) Meranie neutralizačnej aktivity

Neutralizačná aktivita myšej protilátky, chimérnej protilátky a zošlachtenej protilátky môže byť meraná použitím indexu inhibičnej aktivity produkcie faktora Xa tromboplastínom odvodeným z ludskej placenty, Thromborel S (Boehringer AG) . Teda 60 μΐ pufra (TBS obsahujúci 5 mM CaCl2 a 0,1% BSA) je pridaných k 10 μΐ 1,25 mg/ml Thromborelu S a 10 μΐ vhodne riedenej protilátky, potom je zmes 1 hodinu inkubovaná v 96-jamkovéj platničke pri izbovej teplote.

Ďalej bolo pridaných 10 μΐ ako ľudského faktora X (Celsus Laboratories) s koncentráciou 3.245 gg/ml, tak ľudského faktora Vila (Enzýme Research) s koncentráciou 82,5 ng/ml a inkubácia pokračovala pri izbovej teplote ďalšiu hodinu. Reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 0,5 M EDTA, pridalo sa 50 μΐ roztoku chromogénneho substrátu a ·· ··· · ·· • · určila sa absorbancia pri 405/655 nm. Po jednohodinovej reakcii pri izbovej teplote bola znovu meraná absorbancia pri 405/655 nm. Neutralizačná aktivita môže byt určená spočítaním zvyškovej aktivity (%) z každej zmeny v absorbancii, pričom zmena absorbancie pri nepridaní žiadnej protilátky je považovaná za 100 % aktivitu.

Roztok chromogénneho substrátu je pripravený rozpustením chromogénneho substrátu Testzyme S-2222 (Chromogenix) podľa priložených inštrukcií, dvojnásobným zriedením purifikovanou vodou a potom zmiešaním s roztokom polybrénu (0,6 mg/ml hexametylénbromidu, SIGMA) v pomere 1:1.

7. Analýza kinetiky interakcie zošiachtenej protilátky a rozpustného TF

Kinetické parametre, t.j. disociačné konštanty (KD), konštanty disociačnej rýchlosti (kdiss) a konštanty rýchlosti väzby (kass) protilátky proti TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môžu byť určené pomocou BIACORE.

Rekombinantný proteín G je imobilizovaný na senzorickom čipe, ku ktorému je protilátka naviazaná a purifikovaný rekombinantný TF (rozpustný TF 1 až 219, v ktorom bol označený FLAG peptid) (tu označované ako rozpustný TF) je použitý ako antigén, zatial čo rozpustné TF pripravené s rôznymi koncentráciami sú použité ako analytické činidlá. Zo získaného senzorogramu sú vypočítané kinetické parametre (konštanty disociačnej rýchlosti kdiss a konštanty rýchlosti väzby kass) a z nich môže byť vypočítaná disociačná konštanta. O kinetickej analýze pozri napríklad Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical systém (Karlsson, R. a kol., /1991/ J. Imunnol. Methods 145: 229240) .

Prednosť sa dáva takej protilátke proti TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, ktorá má menšie hodnoty disociačných konštánt (KD), pretože bude mať vyššiu ·· •β ···· ·· · • · · · • · · « · · · · ·· ···· ·· · neutralizačnú aktivitu. U protilátky proti TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, je výhodné ak hodnoty KD nie sú väčšie ako 2,30 x 10⁸ [1/M], výhodnejšie ak nie sú väčšie ako 2,30 x 10'⁹ [1/M] a najvýhodnejšie ak nie sú väčšie ako 1,17 x 10’⁹ [1/M].

Okrem toho sú hodnoty KD určované z dvoch parametrov, konštanty disociačnej rýchlosti (kdiss) a konštanty rýchlosti väzby (kass) (KD = kdiss/kass). Je teda zrejmé, že ak hodnota kdiss je malá a kass velká, získaná hodnota KD je malá.

Špecificky v prípade protilátky proti TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, kdiss nemusí byť väčšia ako 9,52 x 10³ [l/s]. Výhodnejšie je, ak kdiss nie je väčšia ako 9,52 x 10’⁴ [l/s] a najvýhodnejšie je, ak kdiss nie je väčšia ako 6,5 x 10’⁴ [l/s].

Na druhej strane hodnoty kass môžu byť väčšie ako 4,15 x 10⁴ [1/M«s]. Je výhodné, ak nie sú hodnoty kass menšie 4,15 x 10⁵ [1/M»s] a najvýhodnejšie je, ak nie sú hodnoty kass menšie ako 4,65 x 10⁵ [1/M*s].

Okrem toho výhodná protilátka proti TF nemá hodnotu kdiss väčšiu ako 9,52 x 10³ [l/s] a hodnotu kass menšiu ako 4,15 x 10⁵ [1/M«s].

Prísnejšie povedané, u protilátok, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, sú hodnoty KD v rozsahu od 1,09 x 1O~¹⁰ do 2,30 x 10’⁸ [1/M], výhodnejšie v rozsahu od 1,09 x 10’⁹ do

2,30 x 10’⁸ [1/M] a najvýhodnejšie	v rozsahu	od	1,-09 x	10’⁹
do 2,30 x 10’⁸ [1/M].
Okrem toho sú hodnoty kdiss	v rozsahu	od	5,06 x	10'⁴
do 9,52 x 10³ [l/s], výhodnejšie v	rozsahu od	5,'	06 x 10’	⁴ do
9,52 x 10⁴ [l/s] a najvýhodnejšie	v rozsahu	od	5,06 x	10’⁴
do 6,49 x 10^-4 [l/s].
Hodnoty kass sú v rozsahu od	4,15 x 10⁴	do	5,44 x	10⁵
[1/M-s], výhodnejšie v rozsahu od	4,15 x 10⁵	do	5,44 x	10⁵

·· ···· ·· ··

R · · 4 »· ···· [1/M«s] a najvýhodnejšie v rozsahu od 4,65 x 10⁵ do 5,44 x 10⁵ [1/M-s].

Hoci tieto hodnoty KD, hodnoty kdiss a hodnoty kass môžu byť získané popri BIACORE pomocou analýzy podľa Scatcharda a podobne, prednosť sa dáva použitiu BIACORE.

8. Meranie reaktivity zošlachtenej protilátky s ľudským

TF

Metódu hybridizácie typu dot-blot možno použiť na skúmanie reaktivity nedenaturovaného TF, TF denaturovaného v neredukujúcich podmienkach a TF denaturovaného v redukujúcich podmienkach.

Na skúmanie možno použiť TF, ktorý bol purifikovaný z ludského tkaniva alebo bol exprimovaný v cicavčích bunkách, ako sú bunky CHO a purifikovaný. Ako denaturačné činidlo môže byť namiesto močoviny použitý guanidínhydrochlorid alebo SDS atď. Ako redukčné činidlo môže byť namiesto DTT použité redukčné činidlo redukujúce SH

Na detekciu skupiny, napríklad 2-merkaptoetanol. zošlachtenej protilátky môže byť použitá protilátka proti ľudskému IgG, ktorá je značená rôznymi zlúčeninami. Tu používanými značkovacími činidlami môžu byť rádioizotopy, biotín, fluorogénne zlúčeniny, ako je FITC, enzýmy, ako sú peroxidáza a alkalická fosfatáza, a pod. Protilátka proti TF, ktorá je predmetom tohto vynálezu, reaguje s akýmkoľvek nedenaturovaným TF, TF denaturovaným v neredukujúcich podmienkach a TF denaturovaným v redukujúcich podmienkach.

9. Farmaceutické prostriedky a liečebné činidlá· pre DIC, obsahujúce ako aktívnu zložku zošlachtenú protilátku

Aby bol potvrdený liečebný účinok zošlachtenej protilátky na ľudský TF, zošľachtená protilátka proti živočíchovi, ktorý má silné merajú ukazovatele DIC, aby ľudskému TF je podávaná príznaky DIC a potom sa liečebné účinky boli potvrdené.

·· ····

• · • · • · • · ·

Tu používanou protilátkou je zošlachtená protilátka proti ľudskému TF. Protilátka neutralizuje aktivitu ludského TF tým, že sa na ludský TF viaže a prednostne tu môže byť uvedená zošlachtená protilátka ATR5. Metóda prípravy zošľachtenej protilátky ATR5 je opísaná v príkladoch.

Tu používaná protilátka môže byť purifikovaná do vysokej čistoty spojením bežných purifikačných postupov, ako je vysolenie, metóda gélovej filtrácie, ako je HPLC, afinitná chromatografia používajúca stĺpec s proteínom A a pod. U takto purifikovanej protilátky možno s veľkou presnosťou pomocou bežných imunologických postupov, ako je rádioimunologický test (RIA), enzymoimunologický test (EIA, ELISA) alebo metódou imunofluorescenčne značených protilátok (imunofluorescenčná analýza) a podobne potvrdiť, že rozpoznáva ludský TF.

Farmaceutické prostriedky a liečebné činidlá pre DIC, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, obsahujúce ako aktívnu zložku zošlachtenú protilátku proti ľudskému TF, môžu byť podávané buď systémovo alebo lokálne, nie však orálne. Metódu podávania možno napríklad vybrať z týchto: intravenózne injekcie, ako je kvapkacia infúzia, intramuskulárne injekcie, intraperitoneálne injekcie a podkožné injekcie a výber môže byť uskutočnený podľa veku a stavu pacienta. Účinná dávka je vybraná v rozsahu 0,01 až 1000 mg na kg telesnej hmotnosti pre jedno podanie. Inou možn'-scou je vybrať dávku 10 mg/pacienta, výhodne .1 až 1000 mg/pacienta.

Farmaceutické prostriedky a liečebné činidlá pre DIC, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, obsahujúce ako aktívnu zložku zošlachtenú protilátku proti ľudskému TF, môžu v závislosti od spôsobu podávania obsahovať farmaceutický prijateľné nosiče alebo prísady. Príkladmi takých nosičov alebo prísad sú voda, farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlá, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón,

• · •	•	·· • ·	·· • ·	···· •	·· •	•	• ·
•	•	• ·	• ·	• ·	•	•
• • ·	•	• ····	• · • ·	• · a ·	• • ·	•	• ·

karboxyvinylové polyméry, sodná sol karboxymetylcelulózy, sodná sol kyseliny polyakrylovéj, alginát sodný, vo vode rozpustný dextrán, sodná sol karboxymetylovaného škrobu, pektín, metylcelulóza, xantánová guma, arabská guma, kazeín, želatína, agar, diglycerín, glycerín, propylénglykol, polyetylénglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina stearová, ľudský sérumalbumín (HSA), manitol sorbitol, laktóza, farmaceutický prijatelné povrchovo aktívne látky a podobne. Prísady je možné vyberať podľa potreby, okrem iného z vyššie uvedených látok alebo ich kombinácií, v závislosti od dávkovej formy predloženého vynálezu.

Podľa predloženého vynálezu je poskytnutá chimérna protilátka a zošľachtená protilátka proti ľudskému TF a postup prípravy zošlachtenej protilátky. Tieto protilátky sú pre svoju nízku antigenecitu užitočné ako liečebné činidlá.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošľachtený H reťazec verzia a/chimérny L reťazec a protilátky chimérny H reťazec/zošľachtený L reťazec verzia a.

Obrázok 2 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošľachtený H reťazec verzia a/chimérny L reťazec a protilátky chimérny H reťazec/zošľachtený L reťazec verzia a.

Obrázok 3 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec a protilátky zošľachtený H reťazec verzia a/chimérny L reťazec verzia a.

»· ···· ·· ··

0 0 · · • · · · · · · ·

0 0 ·

0··· «

Obrázok 4 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať Xudský TF u myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti TF, protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia a/zošľachtený L reťazec verzia a.

Obrázok 5 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia a.

Obrázok 6 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia c/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia d/chimérny L reťazec.

Obrázok 7 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia c/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia d/chimérny L reťazec.

Obrázok 8 je graf, ktorý porovnáva schopnosť u protilátky chimérny H a protilátky zošlachtený H neutralizovať ľudský TF reťazec/chimérny L reťazec reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia a.

Obrázok 9 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia c.

Obrázok 10 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, reťazec/zošlachtený L reťazec protilátky verzia b chimérny H a protilátky chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia c.

·· ···· ·· ·· > · · <

protilátky zošlachtený L reťazec verzia b

Obrázok 11 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/ zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošľachtený L reťazec verzia c.

Obrázok 12 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, reťazec verzia b/zošľachtený protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený reťazec verzia c.

Obrázok 13 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/ zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia d/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 14 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, reťazec verzia b/zošlachtený protilátky zošlachtený H reťazec verzia d/zošlachtený reťazec verzia b.

ktorý porovnáva aktivitu väzby chimérny H reťazec/chimérny L verzia e/ protilátky zošlachtený L reťazec verzia b

Obrázok 15 je graf, k antigénu u protilátky reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia e/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 16 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia e/chimérny L reťazec.

Obrázok 17 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia g/zošlachtený L reťazec verzia b.

·· • · · ·

9 9

9999

9 9 • · • · ·· ·

Obrázok 18 je graf, neutralizovať ľudský TF reťazec/chimérny L reťazec ktorý porovnáva schopnosť u protilátky chimérny H a protilátky zošlachtený H reťazec verzia g/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 19 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby

H reťazec/chimérny L H reťazec verzia k antigénu u protilátky chimérny reťazec, protilátky zošlachtený b3/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia d3/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 20 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b3/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia d3/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 21 je graf, k antigénu u protilátky ktorý porovnáva aktivitu väzby chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/chimérny

L reťazec a protilátky j/chimérny L reťazec.

Obrázok 22 je graf, zošlachtený H reťazec verzia ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia j/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 23 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia j/chimérny L reťazec.

Obrázok 24 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ľudský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzip i/zošlachtený L reťazec verzia ·· φ· ·· ···· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· · protilátky verzia bl chimérny H a protilátky b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia j/zošlachtený L reťazec verzia b.

Obrázok 25 je graf, ktorý porovnáva aktivitu vázby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia bl a protilátky chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 26 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, reťazec/zošlachtený L reťazec chimérny H reťazec/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 27 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec a protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 28 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošľachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 29 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia bl a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 30 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošľachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia bl a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošľachtený L reťazec verzia b2.

·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · •9 ····

Obrázok 31 je graf, ktorý porovnáva aktivitu väzby k antigénu u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošľachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 32 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF (schopnosť inhibovať tvorbu faktora Xa spôsobenú TF) u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošľachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 33 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF (schopnosť inhibovať väzbu faktora X) u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Obrázok 34 je graf, ktorý porovnáva schopnosť neutralizovať ludský TF (schopnosť inhibovať koaguláciu plazmy spôsobenú TF) u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, reťazec verzia b/zošlachtený protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený reťazec verzia b2.

Obrázok 35 je graf, ktorý porovnáva reaktivitu s ľudským TF, opracovaným za rôznych podmienok, u protilátky chimérny H reťazec/chimérny L reťazec, protilátky zošlachtený H reťazec verzia b/zošlachtený L reťazec verzia b, protilátky zošlachtený H reťazec verzia protilátky zošlachtený L reťazec verzia b ·· ·· ·· • · · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ···· ·· ···· • · • · • · · • · · ·· ·· · i/zošlachtený L reťazec verzia b a protilátky zošlachtený H reťazec verzia i/zošlachtený L reťazec verzia b2.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Ďalšie podrobnosti predloženého vynálezu budú teraz vysvetlené uvedením nasledujúcich príkladov.

Príklad 1

Klonovanie DNA kódujúcej V oblasť myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF (1) Príprava mRNA mRNA bola pripravená z hybridómov ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5 (IgGlK), ATR-7 a ATR-8 (IgG2aK) pomocou purifikačnej súpravy QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech). Každý druh hybridómových buniek bol kompletne homogenizovaný v exrakčnom pufre podľa návodu pripojeného k súprave a potom bola mRNA purifikovaná pomocou stĺpca s oligo (dT)-celulózou, a nasledovalo zrážanie etanolom. Zrazenina mRNA bola rozpustená v elučnom pufre.

(2) Príprava a amplifikácia cDNA génu kódujúceho V oblasť myšej protilátky (i) Klonovanie cDNA V oblasti H reťazca

Klonovanie génu kódujúceho V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF bolo uskutočnené pomocou metódy 5'-RAČE (Frohman, M.A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavski, A. a kol., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932,1989). Pre metódu 5'-RACE bola použitá súprava Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH) a postup bol uskutočnený podľa návodu priloženého k súprave.

S použitím asi 1 pg mRNA, pripravenej ako bolo opísané vyššie, ako matrice boli pridané cDNA syntetizujúce priméry ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·· ·· priložené k súprave, potom bola uskutočnená reakcia s reverznou transkriptázou pri teplote 42 °C v trvaní 60 minút, aby sa uskutočnila reverzná transkriptáza na cDNA. Táto potom reagovala s DNA polymerázou I, DNA ligázou a Rnázou H pri teplote 16 °C počas 1,5 hodiny a s T4 DNA polymerázou pri teplote 16 °C počas 45 minút, aby došlo k syntéze dvojreťazcovej cDNA. Dvojreťazcová cDNA bola extrahovaná fenolom a chloroformom a vyzrážaná etanolom.

V reakcii s T4 DNA ligázou, uskutočnenou cez noc pri 16 °C, bol na obidva konce dvojreťazcovej cDNA pripojený adaptér. Reakčná zmes bola 50 x zriedená 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5), obsahujúcim 0,1 mM EDTA. S použitím tohto ako matrice bol pomocou PCR amplifikovaný gén kódujúci V oblasť H reťazca. Adaptérový primér 1 priložený k súprave bol použitý ako 5'-koncový primér a ako 3'-koncový primér bol použitý primér MHC-G1 (SEQ ID NO: 1) (ATR-2, ATR-3, ATR-4 a ATR-5) alebo primér MHC-G2a (SEQ ID NO: 2) (ATR-7 a ATR-8) (S.T. Jones a kol., Biotechnology, 9: 88-89, 1991).

PCR reakčné roztoky pre V oblasť H reťazca protilátok ATR-2, 3, 4 a 5 obsahovali v 100 μΐ: 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), 30-50 pmol adaptérového priméru 1, ako aj priméru MHC-G1 a 1-5 μΐ reakčnej zmesi cDNA, ku ktorej bol adaptér ligovaný.

Všetky PCR reakcie boli uskutočnené pomocou DNA termálneho cykléru 480 (Perkin-Elmer) a u PCR bolo uskutočnených tridsať cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 74 °C počas 1 minúty.

(ii) Klonovanie cDNA V oblasti L reťazca

Klonovanie génu kódujúceho V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF bolo uskutočnené pomocou metódy 5'-RAČE (Frohman, M.A. a kol., Proc. Natl.

• · · · • · · • · · • · · •· ···· ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·

Acad. Sci, USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavski, A. a kol., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932,1989). Pre metódu 5'-RAČE bola použitá súprava Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH) a postup bol uskutočnený podlá návodu priloženého k súprave.

S použitím asi 1 μς mRNA, pripravenej ako bolo opísané vyššie, ako matrice boli pridané cDNA syntetizujúce priméry priložené k súprave, potom bola uskutočnená reakcia s reverznou transkriptázou pri teplote 42 °C v trvaní 60 minút, aby sa uskutočnila reverzná transkriptáza na cDNA. Táto potom reagovala s DNA polymerázou I, DNA ligázou a Rnázou H pri teplote 16 °C počas 1,5 hodiny a s T4 DNA polymerázou pri teplote 16 °C počas 45 minút, aby došlo k syntéze dvojreťazcovej cDNA. Dvojreťazcová cDNA bola extrahovaná fenolom a chloroformom a vyzrážaná etanolom.

V reakcii s T4 DNA ligázou, uskutočnenou cez noc pri 16 °C, bol na obidva konce dvojreťazcovej cDNA pripojený adaptér. Reakčná zmes bola 50 x zriedená 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5), obsahujúcim 0,1 mM EDTA. S použitím tohto ako matrice bol pomocou PCR amplifikovaný gén kódujúci V oblasť H reťazca. Adaptérový primér 1 bol použitý ako 5'-koncový primér a ako 3'-koncový primér bol použitý primér MKC (SEQ ID NO: 3) (S.T. Jones a kol., Biotechnology, 9: 88-89, 1991).

PCR reakčné roztoky obsahovali v 100 μΐ: 120 mM TrisHCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfát-y (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), 30-50 pmol adaptérového priméru 1, ako aj priméru MKC a 1 μΐ reakčnej zmesi cDNA, ku ktorej bol adaptér ligovaný.

Všetky PCR reakcie boli uskutočnené pomocou DNA termálneho cykléru 480 (Perkin-Elmer) a u PCR bolo

9 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9 ·· ···· ·· ·· • · · · ·

9 9 9 • · 9 9 9

9 9 9

9999 uskutočnených tridsať cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 55 ’C počas 30 sekúnd a 74 °C počas 1 minúty.

(3) Purifikácia a fragmentácia PCR produktov

Vyššie uvedená PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a fragmenty amplifikovanej DNA boli získané etanolovou precipitáciou. Fragmenty DNA boli štiepené reštrikčným enzýmom Xmal (New England Biolabs) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes pre Xmal bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% až 3% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 500 bázových párov pre V oblasť H reťazca a a taktiež asi 500 bázových párov pre L oblasť H reťazca. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom a fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 10 μΐ 10 mM TrisHC1 (pH 8,0), ktorý obsahuje 1 μιη EDTA (tu je označovaný TE) .

Fragmenty DNA štiepené Xmal, pripravené ako bolo opísané vyššie, obsahujúce gény kódujúce V oblasť myšieho H reťazca a V oblasť myšieho L reťazca a plazmidový vektor pUC19 pripravený štiepením Xmal boli ligované pomocou súpravy DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C 1 hodinu, podía návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 3ú minút na ľade a 1 minútu pri 42 ’C,

Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu HiCompetence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LB médiu (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) , obsahujúcom 100 μς/ιηΐ ampicilínu (tu označované ako

Φ· ···· ·· ·· • · · ·

9 · • · · • · · •· ···· • · · • · · • · · · · • · · ·

99

9

9 9

9 agar v médiu LBA) a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby boli získané transformanty E. coli.

Transformanty boli cez noc inkubované v 3 alebo 4 ml média LB, obsahujúceho 50 gg/ml ampicilínu (tu označované ako LBA médium) pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) a potom bola určená nukleotidová sekvencia.

(4) Určenie nukleotidovej sekvencie génu kódujúceho

V oblasť myšej protilátky

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti vo vyššie uvedenom plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PerkinElmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 373A (PerkinElmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primér 4 (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 4) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 5) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch.

Takto získané plazmidy, ktoré obsahujú gén kódujúci V oblasť myšieho H reťazca, odvodený z hybridómov ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5, ATR-7 a ATR-8 boli označené ako ATRxHv/pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7 alebo 8) a získané plazmidy, ktoré obsahujú gén kódujúci V oblasť myšieho L reťazca, odvodený z hybridómov ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5, ATR-7 a ATR-8 boli označené ako ATR-xLv/pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7 alebo 8). Nukleotidové sekvencie génov kódujúcich V oblasť H reťazca každej myšej protilátky, obsiahnuté v. plazmide ATR-xHv/pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7 alebo 8) (vrátane odpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) sú uvedené v SEQ ID NO: 6 až 11, nukleotidové sekvencie génov kódujúcich V oblasť L reťazca každej myšej protilátky, obsiahnuté v plazmide ATR-xLv/pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7 alebo 8) (vrátane odpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) sú uvedené v SEQ ID NO: 12 až 17.

• 9 ·· • · · • · • · • · ·· · ·· ·· ···· ·· • · · ·· ·· • · ·· ·

Príklad 2

Konštrukcia chimérnej protilátky

Bola pripravená chimérna protilátka ATR-5, v ktorej

V oblasť myšej ATR-5 protilátky bola pripojená k C oblasti ľudskej protilátky. Expresný vektor tejto chimérnej protilátky bol skonštruovaný tak, že gén kódujúci V oblasť ATR-5 protilátky bol pripojený do expresného vektora kódujúceho C oblasť ľudskej protilátky.

(1) Konštrukcia V oblasti H reťazca chimérnej protilátky

V oblasť H reťazca protilátky ATR-5 bola pomocou PCR metódy modifikovaná, aby ju bolo možné zabudovať do expresného vektora kódujúceho C oblasť H reťazca ľudskej protilátky. 5'-koncový primér ch5HS (SEQ ID NO: 18) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 5'-koncom DNA kódujúcej

V oblasť a mal Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-970, 1987) a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Sali. 3'-koncový primér ch5HA (SEQ ID NO: 19) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 3'-koncom DNA kódujúcej J oblasť a mal rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Nhel.

PCR reakčné roztoky obsahovali v 100 μΐ: 120 mM TrisHCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), 50 pmol priméru ch5HS a priméru ch5HA a 1 μΐ plazmidu ATR5Hv/pUC19 ako matricovú DNA. Všetky PCR reakcie boli uskutočnené pomocou DNA termálneho cykléru 480 (Perkin-Elmer) a u PCR bolo uskutočnených tridsať cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 74 °C počas 1 minúty.

PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a fragmenty amplifikovanej DNA boli získané ·· ·· ·· ···· ·· ···· · · · ··· • · · ······· ·· ···· ·· ·· ·· ··· etanolovou precipitáciou. Fragmenty DNA boli štiepené reštrikčným enzýmom Nhel (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny a potom reštrikčným enzýmom Sali (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% až 3% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 450 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

Ako klonovací vektor bol použitý vektor s pozmeneným promótorom (tu označovaný ako CVIDEC), do ktorého boli vnesené rozpoznávacie sekvencie pre reštrikčné enzýmy Nhel, Sali a Spil, Bglll. Fragment génu pripravený vyššie opísaným spôsobom, kódujúci V oblasť myšieho H reťazca, a vektor CVIDEC, pripravený štiepením Nhel a Sali, boli ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C počas 1 hodiny, podía návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná do 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola ínkubovaná 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do tejto zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C 1 hodinu. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LB médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti vo vyššie uvedenom plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PerkinElmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 373A (PerkinElmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primer 4 • a • a a ·· · · • · · · ·· ···· a a • a aa a (Takara Shuzo) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch. Plazmid, ktorý obsahuje gén kódujúci V oblasť myšieho H reťazca ATR-5 protilátky, rozpoznávaciu sekvenciu pre Sali a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu na 5'-konci a rozpoznávaciu sekvenciu pre Nhel na 3'-konci, bol označený ako chATR5Hv/CVIDEC.

(2) Konštrukcia V oblasti L reťazca chimérnej protilátky

V oblasť L reťazca protilátky ATR-5 bola pomocou PCR metódy modifikovaná, aby ju bolo možné zabudovať do expresného vektora kódujúceho C oblasť L reťazca ľudskej protilátky. 5'-koncový primér ch5LS (SEQ ID NO: 20) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 5'-koncom DNA kódujúcej V oblasť a mal Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-970, 1987) a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Bglll. 3'-koncový primér ch5LA (SEQ ID NO: 21) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 3'-koncom DNA kódujúcej J oblasť a mal rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Spil.

PCR reakčné roztoky obsahovali v 100 μΐ: 120 mM TrisHC1 (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), 50 pmol priméru ch5LS a priméru ch5LA a 1 μΐ plazmidu ATR5Lv/pUC19 ako matricovú DNA. Všetky PCR reakcie boli uskutočnené pomocou DNA termálneho cykléru 480 (Perkin-Elmer) a u PCR bolo uskutočnených tridsať cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 74 °C počas 1 minúty.

PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a fragmenty amplifikovanej DNA boli získané etanolovou precipitáciou. Fragmenty DNA boli štiepené reštrikčným enzýmom Spil (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C ·· ···· · · · ······ ·· ···· ·· ·· ·· · počas 1 hodiny a potom reštrikčným enzýmom BglII (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 3% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 400 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

Fragment génu pripravený vyššie opísaným spôsobom, kódujúci V oblasť myšieho L reťazca a vektor CVIDEC, pripravený štiepením Spil a BglII, boli ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C počas 1 hodiny, podľa návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná do 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubované 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do tejto zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C 1 počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LB médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti vo vyššie uvedenom plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PerkinElmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 373A (PerkinElmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primér 4 (Takara Shuzo) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch. Plazmid, ktorý obsahuje gén kódujúci V oblasť myšieho H reťazca ATR-5 protilátky a ktorý má rozpoznávaciu sekvenciu pre BglII a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu na * · · • · β · ·· • · · · · · ·· ···· • · · ···· · »

9999 99 99 99 9

5'-konci a rozpoznávaciu sekvenciu pre Spil na 3'-konci, bol označený ako chATR5Lv/CVIDEC.

(3) Konštrukcia expresného vektora pre chimérnu protilátku

Expresný vektor pre chimérnu protilátku bol konštruovaný s použitím expresného vektora pre protilátku, zavedeného v IDEC Pharmaceutical. Ako vektory boli použité: expresný vektor H5KG1(V) pre protilátku typu IgGl a expresný vektor N5KG4P pre protilátku typu IgG4. Chimérny vektor pre protilátku ATR-5 bol vytvorený spojením génu kódujúceho V oblasť H reťazca ATR-5 s Sall-Nhell miestom umiestneným bezprostredne pred C oblasťou H reťazca ľudskej protilátky v expresnom vektore N5KG1(V) alebo N5KG4P a spojením génu kódujúceho V oblasť L reťazca ATR-5 s BglllSpll miestom umiestneným bezprostredne pred C oblasťou L reťazca ľudskej protilátky v expresnom vektore N5KG1(V) alebo N5KG4P.

(i) Vnesenie V oblasti H reťazca

Plazmid chATR5Hv/CVIDEC bol štiepený reštrikčným enzýmom Nhel (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín a potom reštrikčným enzýmom Sali (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 450 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

Expresné vektory N5KG1(V) a N5KG4P boli štiepené reštrikčným enzýmom Nhel (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín a potom reštrikčným enzýmom Sali (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 9000 • · · · · · ·· ·· ···· ·· » · • · · · · · · · • · ···· ···· bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

DNA fragment Sall-Nhel, pripravený tak ako bolo opísané vyššie, obsahujúci gén kódujúci V oblasť H reťazca a N5KG1(V) alebo N5KG4P štiepené Sali a Nhel, boli ligované pomocou súpravy DNA ligačnej súpravy ver.2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C 1 hodinu, podlá návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na 100 μ9/πι1 agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc v 3 ml média LBA pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Tieto plazmidy, ktoré obsahujú gény kódujúce H reťazec chimérnej protilátky ATR-5 boli označené ako chATR5Hv/N5KGl(V), resp. chATR5Hv/N5KG4P.

(ii) Vnesenie V oblasti L reťazca

Plazmid chATR5Lv/CVIDEC bol štiepený reštrikčnými enzýmami BglII (Takara Shuzo) a Spil (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1,5 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 400 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

Plazmidy chATR5Hv/N5KGl(V) a chATR5Hv/N5KG4P boli štiepené reštrikčnými enzýmami BglII (Takara Shuzo) a Spil ·· ···· • · · · • · · · · · · · · · ««· ····«· • · ···· ·· ·· ·· · (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1,5 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 9400 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom, fragmenty DNA boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v 20 μΐ TE.

DNA fragment Spll-Bglll, pripravený tak ako bolo opísané vyššie, obsahujúci gén kódujúci V oblasť L reťazca a chATR5Hv/N5KGl(V) alebo chATR5Hv/N5KG4P štiepený Spil a Bglll, boli ligované pomocou súpravy DNA ligačnej súpravy ver.2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C 1 hodinu, podlá návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na 100 pg/ml agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc v 3 ml média LBA pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný vil média 2xYT, obsahujúcom 50 μς/πιΐ ampicilínu, pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy Plasmid Maxi Kit (QIAGEN).

Tieto plazmidy, ktoré obsahujú gény kódujúce H reťazec chimérnej protilátky ATR-5 boli označené ako chATR5/N5KGl(V), resp. chATR5/N5KG4P.

(4) Transfekcia do buniek COS-7

Aby bolo možné zhodnotiť väzobnú aktivitu k antigénu a neutralizačnú aktivitu chimérnej protilátky, boli vyššie uvedené expresné plazmidy transfekované do buniek COS-7 a protilátky boli prechodne exprimované.

Plazmid chATR5/N5KGl(V) alebo chATR5/N5KG4P bol transdukovaný do buniek COS-7 elektroporáciou pomocou ·· ···· prístroja Gene Pulser (Bio Rad). 50 pg plazmidu bolo pridaných do 0,78 ml buniek COS-7, suspendovaných v PBS (-) podľa Dulbecca (tu označované ako PBS) na bunkovú koncentráciu 1 x 10⁷ buniek/ml a zmes bola podrobená pulzom 1500 V, pri kapacite 25 gF.

Po 10 minútach zotavenia pri izbovej teplote boli elektroporované bunky suspendované v médiu DMEM obsahujúcom 5% fetálne hovädzie sérum s ultranízkym obsahom IgG (GIBCO) a kultivované v 10 cm kultivačných miskách v 5% CO2 inkubátore. Po 24 hodinovej kultivácii bol supernatant odsatý a bolo pridané médium HBCHO bez séra (Irvine Scientific). Po ďalšej 72 hodinovej kultivácii bol supernatant odobraný a centrifugovaný, aby boli zvyšky buniek odstránené.

(5) Purifikácia protilátok

Zo supernatantov bunkových protilátky (Pharmacia

COS-7 boli rProtein A nasledovným kultúr pomocou

Biotech) purifikované chimérne Sepharose Fast Flow spôsobom.

Jeden ml rProtein A Sepharose Fast Flow bol naplnený do stĺpca a ten bol ekvilibrovaný 10 objem, jednotkami TBS. Supernatant z bunkovej kultúry COS-7 bol nanesený na ekvilibrovaný stĺpec, ktorý bol potom premytý 10 objem, jednotkami TBS.

Absorbovaná protilátková frakcia bola potom vymytá 13,5 ml 2,5 mM HCI (pH 3,0) a eluát bol bezprostredne potom neutralizovaný pridaním 1,5 ml IM Tris-HCl (pH 8,0).

Rozpúšťadlo bolo potom u purifikovanéj frakcie protilátok vymenené za 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), obsahujúcom 150 mM NaCl (tu označovaný ako TBS) tak, bola dvakrát urobená ultrafiltrácia pomocou prípravkov Centriprep 100 (Amicon) a na záver bola frakcia protilátok koncentrovaná na 1,5 ml.

(6) Založenie stabilne produkujúcej línie buniek CHO

B B B · · ·

BB BB • B · · B B · B B B • · s··· · B

B · B ···· · Λ • B BB B B B B B B «B B

Aby bola založená bunková línia, ktorá bude stabilne produkovať chimérnu protilátku, bol vyššie uvedený expresný plazmid vnesený do buniek CHO (DG44), ktoré sú prispôsovené rastu v médiu bez séra CHO-S-SFM11 (GIBCO).

Plazmid chATR5/N5KGl(V) alebo chATR5/N5KG4P bol štiepený reštrikčným enzýmom Sspl (Takara Shuzo), aby bola DNA linearizovaná a po extrakcii fenolom a chloroformom bola DNA získaná etanolovým zrážaním. Linearizovaný plazmid bol vnesený do buniek DG44 elektroporáciou pomocou prístroja Gene Pulser (Bio Rad). 10 pg plazmidu bolo pridaných do 0,78 ml buniek DG44, suspendovaných v PBS na bunkovú koncentráciu 1 x 10⁷ buniek/ml a zmes bola podrobená pulzom 1500 V, pri kapacite 25 pF.

Po 10 minútach zotavenia pri izbovej teplote boli elektroporované bunky suspendované v médiu CHO-S-SFM11 (GIBCO), obsahujúcom hypoxantín/tymidín (GIBCO) a kultivované na dvoch 96-jamkových platničkách (Falcon) v 5% CO2 inkubátore. Jeden deň po začatí kultivácie bolo médium vymenené za selekčné médium CHO-S-SFM11 (GIBCO) s obsahom hypoxantínu/tymidínu (GIBCO) a 500 pg/ml GENETICIN (G418 sulfát GIBCO), aby boli selektované bunky, do ktorých bol vnesený gén pre protilátku. Dva týždne po výmene selekčného média boli bunky prehliadané pod mikroskopom. Keď bol pozorovaný dobrý bunkový rast, bolo merané množstvo produkovanej protilátky pomocou ELISA testu, ktorého postup pre meranie koncentrácie je opísaný nižšie, a boli vybrané bunky s vysokou produkciou protilátky.

Príklad 3

Konštrukcia zošlachtenej protilátky (1) Konštrukcia H reťazca zošlachtenej protilátky (i) Konštrukcia verzie a zošlachteného H reťazca • · · · • · · · · · • · · · · « • · · · a a » aa aaaa aa aa

H reťazec zošlachtenej protilátky ATR-5 bol vytvorený prenosom CDR pomocou PCR metódy. Aby bola vytvorená verzia a H reťazca zošlachtenej protilátky, ktorá má FRs odvodené z ludskej protilátky L39130 (DDBJ, Gao L. a kol., nepublikované, 1995), bolo použitých 7 primérov. Priméry na prenos CDR hR5HvlS (SEQ ID NO: 22), hR5Hv2S (SEQ ID NO:23) a hR5Hv4S (SEQ ID NO: 24) majú DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a priméry na prenos CDR hR5Hv3A (SEQ ID NO: 25) a hR5Hv4A (SEQ ID NO: 26) majú DNA sekvenciu v smere prepisu DNA, pričom každý primér má 18 až 35 bázových párov komplementárnej sekvencie na oboch svojich koncoch.

Primér hR5HvlS bol navrhnutý tak, aby mal Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a rozpoznávacie miesto pre Sali a hR5Hv5A je navrhnuté tak, aby mal rozpoznávacie miesto pre Nhel. Vonkajší primér hR5HvPrS (SEQ ID NO: 27) má homológiu s primérom na prenos CDR hR5HvlS a hR5HvPrA (SEQ ID NO: 28) má homológiu s primérom na prenos CDR hR5Hv5A.

Priméry na prenos CDR hR5HvlS, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S a hR5Hv5A a vonkajšie priméry hR5HvPrS a hR5HvPrA boli syntetizované a purifikovaní v Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki) s použitím priloženého pufra za týchto podmienok: 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki) a 5 pmol každého z primérov na prenos hR5HvlS, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S a hR5Hv5A v objeme 98 μΐ, a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov hR5HvPrS a hR5HvPrA bola uskutočnená reakcia 25 cyklov v objeme 100 μΐ pri rovnakých teplotných cykloch. ch5HS a priméru ch5HA a 1 μΐ plazmidu ATR5Hv/pUC19 ako • · · · • · 9 · · β · ··· · · · ······ • » ···· «« ·· ·· · matricovou DNA. Fragmenty DNA amplifikované PCR reakciou boli rozdelené pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% NuSIEVE GTG (FMC BioProducts).

Boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 4 30 bázových párov, k nim sa pridali tri objemy (ml/g) pufra a potom prebehlo extrahovanie fenolom, fenolom s chloroformom a chloroformom, aby boli DNA fragmenty purifikované. Po precipitácii purifikovanej DNA etanolom bola tretina objemu rozpustená v 17 μΐ vody. Získaná PCR reakčná zmes bola štiepená Nhel a Sali a potom ligovaná do plazmidového vektora CVIDEC, pripraveného štiepením Nhel a Sali pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo) podlá návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA pri 37 °C a z bunkovej frakcie sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti v plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) . Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primer 4 (Takara Shuzo) a M13 Primer RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch.

Pretože boli pozorované mutácie alebo delécie pred alebo za rozpoznávacím miestom pre EcoT221, bol každý z fragmentov, ktorý mal správnu sekvenciu ligovaný a potom znova subklonovaný v CVIDEC pre určenie nukleotidovej ·· · • · · · · ·· ···· «·« · · · B ·· ·· β λ a» ·· β · ·· β sekvencie. Plazmid, ktorý mal správnu sekvenciu, bol označený ako hATR5Hva/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie a zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hva/CVIDEC, sú uvedené v SEQ ID NO: 29. Aminokyselinová sekvencia verzie a je ukázaná aj v SEQ ID NO: 30.

(ii) Konštrukcia verzií b a c zošlachteného H reťazca

Verzie b a c boli pripravené výmenou FR3 verzie a za FR3 odvodenú z inej ludskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii b za inú odvodenú z ludskej protilátky Z34963 (DDBJ, Borretzen M. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1291712921, 1994), boli použité 4 priméry kódujúce FR3. Priméry pre zámenu FR F3RFFS (SEQ ID NO: 31) a F3RFBS (SEQ ID NO: 32) majú DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a priméry F3RFFA (SEQ ID NO: 33) a F3RFBA (SEQ ID NO: 34) majú DNA sekvenciu v smere prepisu DNA. Priméry F3RFFS a F3RFFA majú navzájom komplementárne sekvencie a majú na oboch koncoch rozpoznávacie sekvencie pre Xhol a Ncol.

Aby bola vymenená verzia FR3 vo verzii c za inú odvodenú z ludskej protilátky P01825 (SWISS-PROT, Poljak R:J: akol., Biochemistry, 16: 3412-3420, 1977), boli použité 4 priméry kódujúce FR3. Priméry pre zámenu FR F3NMFS (SEQ ID NO: 35) a F3NMBS (SEQ ID NO: 36) majú DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a priméry F3NMFA (SEQ ID NO: 37) a F3NMBA (SEQ ID NO: 38) majú DNA sekvenciu v smere prepisu DNA.

Priméry F3NMFS a F3NMFA majú navzájom komplementárne sekvencie a majú na oboch koncoch rozpoznávacie sekvencie pre Balí a Xhol.

Priméry F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA, F3RFBA, F3NMFS,

F3NMBS, F3NMFA a F3NMBA boli syntetizované vo Pharmacia

Biotech. Priméry F3NMFA a F3NMBA, resp. F3RFBS a F3RFBA ·· ···· ·· • 9 9 9

99 • 999 ·

9 9 •9 9999

9 9 9 9 9

99 99 9 boli tepelne hybridizované a štiepené Balí a Xhol, resp. Ncol a Xhol. Boli vnesené do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol a bola určená jeho nukleotidové sekvencia. Plazmid, ktorý mal správnu sekvenciu, bol označený ako hATR5Hvb/CVIDEC. Nukleotidové sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie b zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvb/CVIDEC, sú uvedené v SEQ ID NO: 30. Aminokyselinová sekvencia verzie b je ukázaná aj v SEQ ID NO: 40.

Priméry F3NMFS a F3NMFA, resp. F3NMBS a F3NMBA boli tepelne hybridizované a štiepené Balí a Xhol, resp. Ncol a Xhol. Boli vnesené do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol a bola určená jeho nukleotidová sekvencia. Plazmid, ktorý mal správnu sekvenciu, bol označený ako hATR5HvC/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie C zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5HvC/CVIDEC, sú uvedené v SEQ ID NO: 41. Aminokyselinová sekvencia verzie C je ukázaná aj v SEQ ID NO: 42.

(iii) Konštrukcia verzií d a e zošlachteného H reťazca

Verzie d a e boli pripravené výmenou FR3 verzie a za FR3 odvodenú z inej ľudskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii d za inú odvodenú z ľudskej protilátky M62723 (DDBJ, Pascual V. a kol., J. Clin. Invest., 86: 1320-1328, 1990), boli použité 4 priméry kódujúce FR3. Primér pre zámenu FR F3EPS (SEQ ID NO: 43) má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3EPA (SEQ ID NO: 44) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov.

Vonkajšie priméry F3PrS (SEQ ID NO: 45) a F3PrA (SEQ ID NO: 46) majú homológiu s primérmi pre výmenu FR F3EPS a ·· • · I • · ·· ···· » · · · ·· ··

F3EPA a môžu byť použité pre zámenu iných FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii e za inú odvodenú z ludskej protilátky Z80844 (DDBJ, Thomsett A. R. a kol., nepublikované), boli vytvorené 2 priméry kódujúce FR3. Primér pre zámenu FR F3VHS (SEQ ID NO: 47) má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3VHA (SEQ ID NO: 48) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov. F3EPS, F3EPA, F3PrS, F3PrA, F3VHS a F3VHA boli syntetizované vo Pharmacia Biotech.

PCR	reakcia	bola	uskutočnená	pomocou	KOD	DNA
polymerázy	(Toyo Boseki)	s použitím	priloženého	pufra	za
podmienok,	keď obsahovala	5 μΐ 1 μΜ primérov pre	zámenu	FR
F3EPS a	F3EPA	alebo	F3VHS a	F3VHA,	0,2	mM

deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1 mM MgCl2 a 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy v objeme 100 μΐ, a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 74 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov F3PrS a F3PrA bola uskutočnená PCR reakcia 25 cyklov pri rovnakých teplotných cykloch.

Fragmenty DNA amplifikované PCR reakciou boli rozdelené pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% NuSIEVE GTG (FMC BioProducts). Boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 424 bázových párov, k nim boli pridané tri objemy (ml/g) pufra TE a potom prebehlo extrahovanie fenolom, fenolom s chloroformom a chloroformom, aby boli DNA fragmenty purifikované. Po precipitácii purifikovanej DNA etanolom bola tretina objemu rozpustená v 14 μΐ vody. Získaná PCR reakčná zmes bola štiepená Balí a Ncol a potom ligovaná do plazmidového vektora hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol, a bola určená nukleotidové sekvencia. Plazmidy, ktoré mali správnu sekvenciu, boli označené ako hATR5Hvd/CVIDEC a hATR5Hve/CVIDEC. Nukleotidové sekvencia a ·· ···· «· ·· • · · · • I · • · · ·· ···· • · » · · ·· ·· ·· · jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie d zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvd/CVIDEC, sú uvedené v SEQ ID NO: 49, a aminokyselinová sekvencia verzie d je tiež ukázaná v SEQ ID NO: 50. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie e zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hve/CVIDEC, sú uvedené v SEQ ID NO: 51, a aminokyselinová sekvencia verzie e je tiež ukázaná v SEQ ID NO: 52.

(iv) Konštrukcia verzií f a g zošlachteného H reťazca

Verzie f a g boli pripravené výmenou FR3 verzie a za FR3 odvodenú z inej ľudskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii f za inú odvodenú z ludskej protilátky L04345 (DDBJ, Hillson J.L. a kol., J. Exp. Med., 178: 331-336, 1993) a aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii g za inú odvodenú z ludskej protilátky S78322 (DDBJ, Bejcek BE. a kol., Cancer Res., 55: 2346-2351, 1995), boli syntetizované 2 priméry, každý kódujúci FR3. Primér pre zámenu FR F3SSS (SEQ ID NO: 53) verzie f má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3SSA (SEQ ID NO: 54) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov.

Primér F3CDS (SEQ ID NO: 55) verzie g má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3CDA (SEQ ID NO: 56) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov. F3SSS, F3SSA, F3CDS a F3CDA boli syntetizované a purifikovaní vo Pharmacia Biotech. PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki) s použitím priloženého pufra za podmienok, keď obsahovala: 5 μΐ 1 μΜ primérov pre zámenu FR F3SSS a F3SSA alebo F3CDS a F3CDA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1 ·· ·· ·· ···· • · * • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · B • · · · • B BB

B · · mM MgCl₂ a 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy v objeme 100 μΐ reakčnej zmesi, a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 74 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov F3PrS a F3PrA bola uskutočnená PCR reakcia 25 cyklov pri rovnakých teplotných cykloch.

Fragmenty DNA amplifikované PCR reakciou boli rozdelené pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% NuSIEVE GTG (FMC BioProducts). Agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 424 bázových párov boli vyrezané, k nim boli pridané tri objemy (ml/g) pufra TE a potom prebehlo extrahovanie fenolom, fenolom s chloroformom a chloroformom, aby boli DNA fragmenty purifikované. Po precipitácii purifikovanéj DNA etanolom bola tretina objemu rozpustená v 14 μΐ vody. Získaná PCR reakčná zmes bola štiepená Balí a Ncol a potom ligovaná do plazmidového vektora hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol, a bola určená nukleotidová sekvencia.

Plazmidy, ktoré mali správnu sekvenciu, boli označené ako hATR5Hvf/CVIDEC a hATR5Hvg/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie f zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvf/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie f sú uvedené v SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 58. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie g zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvg/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie g sú uvedené v SEQ ID NO: 59 a SEQ ID NO: 60.

(v) Konštrukcia verzie h zošlachteného H reťazca

Verzie h bola pripravená výmenou FR3 verzie a za FR3 odvodenú z inej ludskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii h za inú odvodenú z ludskej protilátky Z26827 (DDBJ, van Der ·· ···· ·· • I ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · • · • · • · · ·· ··

Stoep a kol., J. Exp. Med., 177: 99-107, 1993), boli syntetizované 2 priméry, každý kódujúci FR3. Primér pre zámenu FR F3ADS (SEQ ID NO: 61) verzie h má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3ADA (SEQ ID NO: 62) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov.

Priméry F3ADS a F3ADA boli syntetizované a purifikovaní vo Pharmacia Biotech. PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki) s použitím priloženého pufra za podmienok, keď obsahovala: 5 μΐ 1 μΜ primérov pre zámenu FR F3ADS a F3ADA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1 mM MgCl2 a 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy v objeme 100 μΐ reakčnej zmesi, a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 74 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov F3PrS a F3PrA bola uskutočnená PCR reakcia 25 cyklov pri rovnakých teplotných cykloch. Fragmenty DNA amplifikované PCR reakciou boli rozdelené pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% NuSIEVE GTG (FMC BioProducts).

Agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 424 bázových párov boli vyrezané, k nim boli pridané tri objemy (ml/g) pufra TE a potom prebehlo extrahovanie fenolom, fenolom s chloroformom a chloroformom, aby boli DNA fragmenty purifikované. Po precipitácii purifikovanéj

DNA etanolom bola tretina objemu rozpustená v 14 μΐ vody. Získaná PCR reakčná zmes bola štiepená Balí a Ncol a potom ligovaná do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol, a bola určená sekvencia. Nukleotidová sekvencia a jej nukleotidová odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie zošľachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvh/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie h sú ·· ···· ·· ··

···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· uvedené v SEQ ID NO: 63. Aminokyselinová sekvencia verzie h je uvedená v SEQ ID NO: 64.

(vi) Konštrukcia verzií i a j zošlachteného H reťazca

Verzie i a j boli pripravené výmenou FR3 verzie a za FR3 odvodenú z inej ludskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii i za inú odvodenú z ludskej protilátky U95239 (DDBJ,

Manheimer-Lory AAJ. nepublikované) a aby bola zamenená verzia FR3 vo verzii j za inú, boli syntetizované 2 priméry, každý kódujúci FR3. Primér pre zámenu FR F3MMS (SEQ ID NO: 65) verzie i má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3MMA (SEQ ID NO: 66) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov.

Primér F3BMS (SEQ ID NO: 67) verzie j má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F3BMA (SEQ ID NO: 68) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA a 3'-konce primérov majú navzájom komplementárne sekvencie dlhé 18 bázových párov. F3MMS, F3MMA, F3BMS a F3BMA boli syntetizované a purifikovaní vo Pharmacia Biotech. PCR reakcia bola uskutočnená pomocou Ampli Taq Gold (Perkin Elmer) s použitím priloženého pufra za podmienok, keď obsahovala: 5 μΐ 1 μΜ primérov pre zámenu FR F3MMS a F3MMA alebo F3BMS a F3BMA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1 mM MgCl₂ a 2,5 jednotky Ampli Taq Gold v objeme 100 μΐ reakčnej zmesi, a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 74 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov F3PrS a F3PrA bola uskutočnená PCR reakcia 25 cyklov pri rovnakých teplotných cykloch.

Fragmenty DNA amplifikované PCR reakciou boli rozdelené pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2%

NuSIEVE GTG (FMC BioProducts). Agarózové prúžky, obsahujúce ·· ····

·· ··

·· fragmenty DNA dlhé asi 424 bázových párov boli vyrezané, k nim boli pridané tri objemy (ml/g) pufra TE a potom prebehlo extrahovanie fenolom, fenolom s chloroformom a chloroformom, aby boli DNA fragmenty purifikované. Po precipitácii purifikovanej DNA etanolom bola tretina objemu rozpustená v 14 μΐ vody. Získaná PCR reakčná zmes bola štiepená Balí a Ncol a potom ligovaná do plazmidového vektora hATR5Hva/CVIDEC (Ball/Ncol), pripraveného štiepením Balí a Ncol, a bola určená nukleotidová sekvencia.

Plazmidy, ktoré mali správnu sekvenciu, boli označené ako hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie i zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvi/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie i sú uvedené v SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 70. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie j zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvj/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie j sú uvedené v SEQ ID NO: 71 a SEQ ID NO: 72.

(vii) Konštrukcia verzií bl a dl zošlachteného H reťazca

Verzie bl a dl boli pripravené výmenou FR3 vo verziách b a d za FR2 odvodenú z inej ľudskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR2 za inú odvodenú z ľudskej protilátky P01742 (SWISS-PROT, Cunningham BA. Biochemistry, 9: 3161-3171, 1970), boli syntetizované 2 priméry kódujúce FR2. Primér pre zámenu FR F2MPS (SEQ ID NO: 73) má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F2MPA (SEQ ID NO: 74) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA. Tiež majú navzájom komplementárne sekvencie a rozpoznávacie miesta pre EcoT221 a Balí na oboch svojich koncoch.

·· ···· ··

·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· • · · • » ·

9 · · • · · · ·· ··

Priméry F2MPS a F2MPA boli syntetizované a purifikovaní vo Pharmacia Biotech. Priméry F2MPS a F2MPA boli tepelne hybridizované a štiepené EcoT221 a Balí. Boli vnesené do plazmidov hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/Ball) a hATR5Hvd/CVIDEC (EcoT221/Ball), pripravených štiepením EcoT221/Ball, a bola určená nukleotidová sekvencia. Plazmidy, ktoré mali správnu sekvenciu, boli označené ako hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie bl zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvbl/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie bl sú uvedené v SEQ ID NO: 7 5 a SEQ ID NO: 76. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie dl zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvdl/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie dl sú uvedené v SEQ ID NO: 77 a SEQ ID NO: 78.

(viii) Konštrukcia verzií b3 a d3 zošlachteného H reťazca

Verzie b3 a d3 boli pripravené výmenou FR3 vo verziách b a d za FR2 odvodenú z inej ludskej protilátky, pomocou metódy zámeny FR. Aby bola zamenená verzia FR2 za inú odvodenú z ludskej protilátky Z80844 (DDDJ, Thomsett AR. a kol., nepublikované), boli syntetizované 2 priméry kódujúce FR2. Primér pre zámenu FR F2VHS (SEQ ID NO: 79) má DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a primér F2VHA (SEQ ID NO: 80) má DNA sekvenciu v smere prepisu DNA. Tiež majú navzájom komplementárne sekvencie a rozpoznávacie miesta pre EcoT221 a Balí na oboch svojich koncoch. Syntéza a purifikácia primérmi F2VHS a F2VHA boli zadané Pharmacia Biotech.

Priméry F2VHS a F2VHA boli tepelne hybridizované a štiepené EcoT221 a Balí. Boli vnesené do plazmidov hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/Ball) a hATR5Hvd/CVIDEC (EcoT221/Ball) , pripravených štiepením EcoT221/Ball, a bola určená nukleotidová sekvencia. Plazmidy, ktoré mali správnu ·· ···· ··

·· ·· • · · · • · · • · · « · · ·· ···· • · · • · · • · · · · • · · · ·· ·· sekvenciu, boli označené ako hATR5Hvb3/CVIDEC a hATR5Hvd3/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie b3 zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvb3/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie b3 sú uvedené v SEQ ID NO: 81 a SEQ ID NO: 82. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie d3 zošlachteného H reťazca, ktorá je obsiahnutá v plazmide hATR5Hvd3/CVIDEC a aminokyselinová sekvencia verzie d3 sú uvedené v SEQ ID NO: 83 a SEQ ID NO: 84.

(2) Konštrukcia V oblasti L reťazca zošlachtenej protilátky (i) verzia a

V oblasť L reťazca zošlachtenej protilátky ATR-5 bola vytvorená prenosom CDR pomocou PCR metódy. Aby bol vytvorený L reťazec zošlachtenej protilátky (verzia a), ktorá má podporné oblasti odvodené z ludskej protilátky Z37332 (DDBJ, Welschof M. a kol., J. Immunol. Methods, 179: 203-214, 1995), bolo použitých 7 primérov.

Priméry na prenos CDR h5LvlS (SEQ ID NO: 85) a h5Lv4S (SEQ ID NO: 86) majú DNA sekvenciu proti smeru prepisu DNA a priméry na prenos CDR h5Lv2A (SEQ ID NO: 87), h5Lv3A (SEQ ID NO: 88) a h5Lv5A (SEQ ID NO: 89) majú DNA sekvenciu v smere prepisu DNA, pričom každý primér má 20 bázových párov komplementárnej sekvencie na oboch svojich koncoch. Vonkajšie priméry h5LvS (SEQ ID NO: 90) a h5LvA (SEQ ID NO: 91) majú homológiu s primérmi na prenos CDR h5LvlS a h5Lv5A.

Syntéza a purifikácia primérov na prenos CDR h5LvlS, h5Lv4S, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv5A, h5LvS a h5LvA boli zadané vo Pharmacia Biotech.

PCR reakčné roztoky obsahovali v 100 μΐ 120 mM TrisHCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100,

0,001% BSA, 0,2 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, ·· • · · ·· ··

9· ···· • 9 · · · • · · · · • · · · · • · · · · ·· ···· ·· ·· ·· · dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki) a 50 pmol primérov na prenos CDR h5LvlS, h5Lv4S, h5Lv2A, h5Lv3A a h5Lv5A.

PCR bola uskutočnená v DNA termálnom cykléri 480 (Perkin-Elmer) a to 5 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po ďalšom pridaní 100 pM vonkajších primérov h5LvS a h5LvA bola uskutočnená PCR reakcia 30 cyklov pri teplotách 94 °C počas 30 sekúnd, 52 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty pre amplifikáciu zostavených fragmentov.

PCR reakčná zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 2% NuSIEVE GTG (FMC BioProducts) a agarózové prúžky, obsahujúce fragmenty DNA dlhé asi 400 bázových párov boli vyrezané. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom s chloroformom a DNA fragmenty boli získané etanolovou precipitáciou. Získané DNA fragmenty boli štiepené reštrikčnými enzýmami Spil (Takara Shuzo) a Bglll (Takara Shuzo) pri 30 °C počas 4 hodín. Štiepajúca zmes bola extrahovaná fenolom s chloroformom a po etanolovej precipitácii boli DNA fragmenty rozpustené v 10 μΐ TE. DNA fragment Spll-Bglll, pripravený ako bolo opísané vyššie a kódujúca V oblasť zošľachteného L reťazca a vektor CVIDEC, pripravený štiepením Spil a Bglll, boli potom ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver.2 (Takara Shuzo) podía návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 ’C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média ·· ···· ·· · · • · • · • · ·· · ·· ·· • · · ·

9 · • · · · • · · ·· ···· • t · • · · • · · · • · · · ·· ··

LBA a z bunkových frakcií sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti v plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 37 3A (Perkin-Elmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primér 4 (Takara Shuzo) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch.

Plazmid, ktorý obsahuje gén kódujúci V oblasť L reťazca zošlachtenej protilátky a ktorý má rozpoznávaciu sekvenciu pre BglII a Kozákovu sekvenciu na 5'-konci a rozpoznávaciu sekvenciu pre Spil na 3'-konci, bol označený ako hATR5Lva/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia (vrátane jej odpovedajúcej aminokyselinovej sekvencie) verzie a zošľachteného L reťazca je uvedená v SEQ ID NO: 92.

Aminokyselinová sekvencie verzie NO: 93.

je uvedená aj v SEQ ID (ii) Verzie b a c

Verzie b a c boli pripravené výmenou (metóda výmeny FR) FR3 verzie a. Pre verziu b bola použitá FR3 odvodená z ľudskej protilátky S68699 (DDBJ, Houds L. a kol., Exp. Clin. Immunogen et., 10: 141-145, 1993) a pre verziu c bola použitá FR3 odvodená z ľudskej protilátky P01607 (SWISS-PROT, Epp O. a kol., Biochemistry, 14: 49434952, 1975).

Priméry F3SS (SEQ ID NO: 94) a F3SA (SEQ ID NO: 95) kódujúce FR3 verzie b alebo priméry F3RS (SEQ ID NO: 96) a F3RA (SEQ ID NO: 97) kódujúce FR3 verzie c majú navzájom komplementárne sekvencie a majú na oboch koncoch rozpoznávacie sekvencie pre reštrikčné enzýmy Kpnl a Pstl.

Syntéza a purifíkácia primérov F3SS, F3SA, F3RS a F3RA bola zadaná vo Pharmacia Biotech. 100 pM primérov F3SS a

F3SA, resp. F3RS a F3RA, bolo tepelne hybridizovaných pri • · · · · · ···· • · · I ·· ·· °C počas 2 minút a pri 50 °C počas 2 minút a tak boli vytvorené dvojreťazcové DNA fragmenty.

Tieto dvojreťazcové DNA fragmenty boli štiepené reštrikčným enzýmom Kpnl (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny a potom reštrikčným enzýmom Pst (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a po jej precipitácii bola rozpustená v 10 μΐ TE.

Plazmid hATR5Lva/CVIDEC bol štiepený reštrikčným enzýmom Kpnl (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny a potom reštrikčným enzýmom Pst (Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou agarovej elektroforézy na 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce DNA fragmenty dlhé asi 3000 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom a po precipitácii DNA fragmentov etanolom boli tieto rozpustené v TE.

DNA fragment Kpnl-Pstl, pripravený ako bolo opísané vyššie, kódujúci FR3 verzií b alebo c a vektor hATR5Lva/CVIDEC, z ktorého bola FR3 odstránená štiepením s Kpnl a Pstl, boli potom ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo), podlá návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA a z bunkových frakcií sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

BB	BB	B· BBBB	BB B
B B	B B	B B B	B B BB
B B	B	B B B B	B B B
BB	BBBB	BB BB	BB BB

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej oblasti v plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 37 3A (Perkin-Elmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primer 4 (Takara Shuzo) a M13 Primer RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch.

Plazmidy, ktoré obsahujú gén kódujúci verziu b alebo c, v ktorej bola nahradená FR3 verzie a L reťazca zošlachtenej protilátky, boli označené ako hATR5Lvb/CVIDEC alebo hATR5Lvc/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie b zošlachteného L reťazca obsiahnutého v plazmide hATR5Lvb/CVIDEC a aminokyselinová sekvencie verzie b sú uvedené v SEQ ID NO: 98 a SEQ ID NO: 99. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie c zošlachteného L reťazca obsiahnutého v plazmide hATR5Lvc/CVIDEC a aminokyselinová sekvencie verzie c sú uvedené v SEQ ID NO: 100 a SEQ ID NO: 101.

(iii) Verzie bl a b2

Verzie bl a b2 boli pripravené výmenou FR2 verzie b. Pre verziu bl bola použitá FR2 odvodená z ludskej protilátky S65921 (DDBJ, Tonge D.W: a kol·., Year Immunol., 7: 56-62, 1993) a pre verziu b2 bola použitá FR2 odvodená z ludskej protilátky X93625 (DDBJ, Cox J. P. a kol., Eur. J. Immunol., 24: 827-836, 1994).

Priméry F2SS (SEQ ID NO: 102) a F2SA (SEQ ID NO: 103) kódujúce FR2 verzie bl alebo priméry F2XS (SEQ ID NO: 104) a F2XA (SEQ ID NO: 105) kódujúce FR2 verzie b2 majú navzájom komplementárne sekvencie a majú na oboch koncoch rozpoznávacie sekvencie pre reštrikčné enzýmy Aflll a Spel. Priméry F2SS, F2SA, F2XS a F2XA boli syntetizované vo Pharmacia Biotech. 100 pM primérov F2SS a F2SA, resp. F2XS a F2XA, bolo tepelne hybridizovaných pri 96 °C počas 2 ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ····

• · · ·· ···· ·· ·· minút a pri 50 °C počas 2 minút a tak boli vytvorené dvojreťazcové DNA fragmenty.

Tieto dvojreťazcové DNA fragmenty boli štiepené reštrikčnými enzýmami Aflll (Takara Shuzo) a Spel (Takara Shuzo) pri 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a po precipitácii DNA fragmentov etanolom boli tieto rozpustené v TE.

Plazmid hATR5Lvb/CVIDEC bol štiepený reštrikčnými enzýmami Aflll (Takara Shuzo) a Spel (Takara Shuzo) pri 37 °C počas 1 hodiny a potom reštrikčným enzýmom Pst pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou agarovej elektroforézy na 1,5% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce DNA fragmenty dlhé asi 3000 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a chloroformom a po precipitácii DNA fragmentov etanolom boli tieto rozpustené v TE.

DNA fragment Aflll-Spel, pripravený ako bolo opísané vyššie, kódujúci FR2 verzií bl alebo b2 a vektor hATR5Lvb/CVIDEC, z ktorého bola FR2 odstránená štiepením s Aflll a Spel, boli potom ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo), podía návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na agar v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli. Transformant bol cez noc inkubovaný v 3 ml média LBA a z bunkových frakcií sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

·· ···· ·· ·· ···· ·· · · • · ···· ·· · · · · · ···· • · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

Nukleotidové sekvencia cDNA kódujúcej oblasti v plazmide bola určená pomocou súpravy Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) pomocou sekvenátora DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 Primér 4 (Takara Shuzo) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) a sekvencia bola určená potvrdením nukleotidovej sekvencie v oboch smeroch.

Plazmidy, ktoré obsahujú gén kódujúci verziu bl alebo b2, v ktorej bola nahradená FR2 verzie b L reťazca zošľachtenej protilátky, boli hATR5Lvbl/CVIDEC resp. hATR5Lvb2/CVIDEC sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinové sekvencia verzie bl zošľachteného L reťazca obsiahnutého v plazmide hATR5Lvbl/CVIDEC a aminokyselinová sekvencie verzie bl sú uvedené v SEQ ID NO: 106 a SEQ ID NO: 107. Nukleotidová sekvencia a jej odpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie b2 zošľachteného L reťazca obsiahnutého v plazmide hATR5Lvb2/CVIDEC a aminokyselinová sekvencie verzie b2 sú uvedené v SEQ ID NO: 108 a SEQ ID NO: 109.

označené ako Nukleotidová (3) Konštrukcia expresného vektora pre zošlachtenú protilátku (i) Spojenie zošľachteného H reťazca a chimérneho L reťazca

Plazmid hATR5Hva/CVIDEC, obsahujúci V oblasť H reťazca bol štiepený Nhel a Sali a získaný cDNA fragment V oblasti zošlachteného H reťazca bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením chATR5/N5KG4P. obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorený plazmid bol označený hHva-chLv/N5KG4P.

Plazmid hATR5Hvb/CVIDEC, obsahujúci V oblasť H reťazca bol štiepený Nhel a Sali a získaný cDNA fragment V oblasti zošlachteného H reťazca bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením chATR5/N5KG4 P, obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora ·· ···· ·· ·· • · · · ·· ···· chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorený plazmid bol označený hHvb-chLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvc/CVIDEC, hATR5Hvd/CVIDEC a obsahujúce V oblasť H reťazca boli Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti reťazca boli vnesené do chATR5/N5KG4P pripraveného štiepením chATR5/N5KG4P, obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvc-chLv/N5KG4P, hHvd-chLv/N5KG4P a hHvechLv/N5KG4P.

hATR5Hve/CVIDEC, štiepené Nhel a zošlachteného (Sall/Nhell),

Plazmidy hATR5Hvf/CVIDEC a hATR5Hvh/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením chATR5/N5KG4P, obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvf-chLv/N5KG4P a hHvhchLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením chATR5/N5KG4P, obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvi-chLv/N5KG4P a hHvjchLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením chATR5/N5KG4P, obsahujúceho protilátku exprimujúceho plazmidového vektora chATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy bolí označené hHvblchLv/N5KG4P a hHvdl-chLv/N5KG4P.

• · · · · · ·· ·· ···· ·· · · • · · · · · · · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · ₈₈ ............

(ii) Spojenie zošlachteného L reťazca a chimérneho H reťazca

Pomocou protilátku exprimujúceho vektora N5KG4P bol zošľachrený L reťazec spojený s chimérnym H reťazcom a exprimovaný.

Plazmidy hATR5Lva/CVIDEC, hATR5Lvb/CVIDEC, hATR5Lvc/ CVIDEC, hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvb2/CVIDEC boli štiepené reštrikčnými enzýmami Bglll (Takara Shuzo) a Speli (Takara Shuzo) pri 37 °C počas 2-3 hodín. Štiepajúca zmes bola rozdelená pomocou elektroforézy na agarózovom géli 1,5% alebo 2% NuSieve GTG (FMC BioProducts) a boli vyrezané agarózové prúžky, obsahujúce DNA fragmenty dlhé asi 400 bázových párov. Agarózové prúžky boli extrahované fenolom a DNA fragmenty boli vyzrážané etanolom a potom rozpustené v TE.

DNA fragment Spll-Bglll, obsahujúci gén kódujúci V oblasť zošlachteného L reťazca každej z týchto verzií a hATR5Hv/CVIDEC štiepený Spil a Bglll, boli ligované pomocou DNA ligačnej súpravy ver. 2 (Takara Shuzo) tak, že reagovali pri 16 °C počas 1 hodiny, podlá návodu priloženého k súprave.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΐ kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippongene) a bola inkubovaná počas 30 minút na lade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo do zmesi pridaných 300 μΐ bujónu Hi-Competence Broth (Nippongene) a zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa Escherichia coli vysiala na 100 μg/ml agaru v LBA médiu a bola inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby bol získaný transformant E. coli.

Transformant bol cez noc inkubovaný v 250 alebo 500 ml média LBA a z bunkových frakcií sa pripravila plazmidová DNA pomocou súpravy QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Plazmidy, do ktorých boli vnesené gény kódujúce chimérny H reťazec a zošlachtený L reťazec, boli označené ako chHv·· ···· ·· ·· • · · ·

I · · · ·· ···· * · · ·· fl hLva/N5KG4P, chHv-hLvb/N5KG4P, chHv-hLvc/N5KG4P, chHvhLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P.

(iii) Spojenie zošlachteného L reťazca a chimérneho H reťazca

Plazmid hATR5Hva/CVIDEC, obsahujúci V oblasť H reťazca bol štiepený Nhel a Sali a získaný cDNA fragment V oblasti zošlachteného H reťazca bol vnesený do hLva/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením plazmidu chHvhLva/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie a L reťazca zošiachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorený plazmid bol označený hHva-hLva/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvb/CVIDEC a hATR5Hvc/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do hLva/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením plazmidu chHv-hLva/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie a L reťazca zošiachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvb-hLva/N5KG4P a hHvc-hLva/N5KG4P.

hATR5Hvb/CVIDEC, hATR5Hvd/CVIDEC a obsahujúce V oblasť H reťazca boli

Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti reťazca boli vnesené do hLva/N5KG4P pripraveného štiepením plazmidu chHvhLvb/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie a L reťazca zošiachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvb-hLvb/N5KG4P, hHvd-hLvd/N5KG4P a hHve-hLvb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvf/CVIDEC, hATR5Hvg/CVIDEC a obsahujúce V oblasť H reťazca boli Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti

H reťazca boli vnesené do hLvb/N5KG4P

Plazmidy hATR5Hve/CVIDEC, štiepené Nhel a zošlachteného (Sall/Nhell), hATR5Hvh/CVIDEC, štiepené Nhel a zošlachteného (Sall/Nhell) , pripraveného štiepením plazmidu chHvhLvb/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie b L reťazca zošiachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali.

• · • · · ·· ···· ·· ·· • · · · · · ·· ·

Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvf-hLvb/N5KG4P, hHvg-hLvd/N5KG4P a hHvh-hLvb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením plazmidu chHv-hLvb/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie b L reťazca zošlachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvi-hLvb/N5KG4P a hHvj-hLvb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením plazmidu chHv-hLvb/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie b L reťazca zošlachtenej protilátky ATR5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvbl-hLvb/N5KG4P a hHvdl-hLvb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvb3/CVIDEC a hATR5Hvd3/CVIDEC, obsahujúce V oblasť H reťazca boli štiepené Nhel a Sali a získané cDNA fragmenty V oblasti zošlachteného H reťazca boli vnesené do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhell), pripraveného štiepením plazmidu chHv-hLvb/N5KG4P, obsahujúceho cDNA sekvenciu verzie b L reťazca zošlachtenej protilátky ATR5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvb3-hLvb/N5KG4P a hHvd3-hLvb/N5KG4P.

Plazmid hATR5Hvb/CVIDEC, obsahujúci V oblasť H reťazca bol štiepený Nhel a Sali a získaný cDNA fragment V oblasti zošlachteného H reťazca bol vnesený do hLvbl/N5KG4P (Sall/Nhell) a hLvb2/N5KG4P (Sall/Nhell), pripravených štiepením plazmidov chHv-hLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P, obsahujúcich cDNA sekvenciu verzií bl a b2 L reťazca zošlachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvb-hLvbl/N5KG4P a hHvbhLvb2/N5KG4P.

·· ··· ··· · · · · · · ·· · A · · · · · · · · ·

Plazmid hATR5Hvi/CVIDEC, obsahujúci V oblasť H reťazca bol štiepený Nhel a Sali a získaný cDNA fragment V oblasti zošlachteného H reťazca bol vnesený do hLvbl/N5KG4P (Sall/Nhell) a hLvb2/N5KG4P (Sall/Nhell) , pripravených štiepením plazmidov chHv-hLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P, obsahujúcich cDNA sekvenciu verzií bl a o2 L reťazca zošľachtenej protilátky ATR-5, pomocou Nhel a Sali. Takto vytvorené plazmidy boli označené hHvi-hLvbl/N5KG4P a hHvihLvb2/N5KG4P.

(4) Transfekcia do buniek COS-7

Skonštruovaný expresný plazmidový vektor bol transdukovaný do buniek COS-7 elektroporáciou pomocou prístroja Gene Pulser (Bio Rad). 50 pg alebo 20 pg plazmidu bolo pridaných do 0,78 ml buniek COS-7, suspendovaných v PBS na bunkovú koncentráciu 1 x 10⁷ buniek/ml a zmes bola podrobená pulzom 1500 V, pri kapacite 25 gF.

Po 10 minútach zotavenia pri izbovej teplote boli elektroporované bunky suspendované v médiu DMEM obsahujúcom 5% fetálne hovädzie sérum s ultranízkym obsahom IgG (GIBCO) a kultivované v 10 cm alebo 15 cm kultivačných miskách v 5% CO2 inkubátore. Po 24 hodinovej kultivácii bol supernatant odsatý a bolo pridané médium HBCHO bez séra (Irvine Scientific). Po ďalšej 72 hodinovej alebo 96 hodinovej kultivácii bol supernatant odobraný a centrifugovaný, aby boli zvyšky buniek odstránené.

(5) Purifikácia protilátok

Zo supernatantov bunkových kultúr COS-7 boli purifikované chimérne protilátky pomocou súpravy Affigel

Protein A MAPS11 (Bio Rad) alebo rProtein A Sepharose Fast

Flow (Pharmacia Biotech). Purifikácia pomocou súpravy ·· ···· • * ···* · · · · ··· ·»·· · · ·· ···· ·· ·· ·· ·

Affigel Protein A MAPSll bola uskutočnená podľa návodu priloženého k súprave. Purifikácia pomocou súpravy rProtein A Sepharose Fast Flow bola uskutočnená nasledovným spôsobom.

Jeden ml rProtein A Sepharose Fast Flow bol naplnený do stĺpca a ten bol ekvilibrovaný 10 objemami TBS. Supernatant z bunkovej kultúry COS-7 bol nanesený na ekvilibrovaný stĺpec, ktorý bol potom premytý 10 objemami TBS. Absorbovaná protilátková frakcia bola potom vymytá 13,5 ml 2,5 mM HCl (pH 3,0) a eluát bol bezprostredne potom neutralizovaný pridaním 1,5 ml IM Tris-HCl (pH 8,0).

Rozpúšťadlo bolo potom v purifikovanej frakcii protilátok vymenené za TBS tak, že bola dvakrát alebo trikrát urobená ultrafiltrácia pomocou prípravkov Centriprep 30 alebo 100 (Amicon) a na záver bola frakcia protilátok koncentrovaná na 1,5 ml.

Príklad 4

Kvantifikácia protilátok a hodnotenie aktivity (1) Meranie koncentrácie protilátok pomocou platničiek

ELISA na meranie protilátok

Platničky ELISA na meranie koncentrácie protilátky boli pripravené nasledovným spôsobom: v každej jamke 96jamkovej platničky ELISA (Maxisorp, NUNC) bolo imobilizovaných 100 μΐ kozej protilátky proti ludskému IgGy (BioSource), pripravenej s koncentráciou 1 μg/ml v imobilizačnom pufre (0,1 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃, pH 9,6) (tu označovaný ako CB) . Po blokovaní pomocou 200 μΐ riedeného pufra (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovädzí sérumalbumín (BSA), pH 7,2), boli do každej jamky pridané supernatanty z bunkových kultúr COS-7 alebo buniek CHO, v ktorých bola exprimovaná ·· ···· ·· 0000 ·· ·· chimérna protilátka alebo zošlachtená protilátka sériovo riedená v DB a potom pridaná do každej jamky.

Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote nasledovalo premytie PBS podľa Dubecca, obsahujúcim 0,05% Tween 20 (tu označovaný ako RB), bolo pridaných 100 μΐ v DB lOOOx zriedenej kozej protilátky proti ľudskému IgG, konjugovanej s alkalickou fosfatázou (BioSource). Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ roztoku substrátu Sigma 104 (pnitrofenylfosfát, SIGMA) zriedeného v substrátovom pufre (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCl2, pH 9,8) na koncentráciu 1 mg/ml a nakoniec bola meraná absorbancia 405/655 nm odpočítacím zariadením pre mikrodoštičky Microplate Reader (Bio Rad). Ako štandard pre meranie koncentrácie bol použitý ľudský IgG4« (The Binding Site).

(2) Meranie väzobnej aktivity k antigénu Platničky bunkového ELISA testu na meranie väzobnej aktivity k antigénu boli pripravené nasledovným spôsobom: Boli použité bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (ATCC HTB-1). Do 60 jamôk 96-jamkovej platničky pestovanie bunkových kultúr bolo naočkovaných 1 x buniek J82. Toto bolo kultivované (médium RPMI na

10⁵

1640 obsahujúce 10 % fetálneho hovädzieho séra (Gibco)) jeden deň v CO2 inkubátore, aby bolo bunkám umožnené sa uchytiť. Po odstránení kultivačného média je každá jamka dvakrát premytá 300 μΐ PBS. Potom sa do každej jamky pridalo 100 μΐ PBS, obsahujúceho 4% paraformaldehyd (tento pufer je tu označený PFA/PBS) a na 10 minút sa to umiestnilo na ľad, aby došlo k imobilizácii buniek.

PFA/PBS bol odstránený a každá jamka bola dvakrát μΐ PBS a potom blokovaná 250 kultúr alebo riedené v DB, každej jamky. Po dvojhodinovej premytá 300 Supernatanty bunkových protilátky boli sériovo pridaných 100 μΐ do μΐ DB. purifikovanej ktorého bolo

9· β B B B

B B

BB B • · · • B · • · · · • B ΒΒ inkubácii pri izbovej teplote a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ kozej protilátky proti ludskému IgGy, konjugované s alkalickou fosfatázou (BioSource), ktorá bola lOOOx zriedená v DB. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premytí RB bol pridaný roztok substrátu a potom bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek (Bio Rad).

(3) Meranie neutralizačnej aktivity

Neutralizačná aktivita myšej protilátky, chimérnej protilátky a zošlachtenej protilátky bola meraná s použitím indexu inhibičnej aktivity produkcie faktora Xa tromboplastínom odvodeným z ludskej placenty, Thromborel S (Boehringer AG) . Teda 60 μΐ pufra (TBS obsahujúci 5 mM CaCl₂ a 0,1% BSA) bolo pridaných k 10 μΐ 1,25 mg/ml Thromborelu Sa 10 μΐ vhodne riedenej protilátky, potom bola zmes 1 hodinu inkubovaná v 96-jamkovéj platničke pri izbovej teplote. Ďalej bolo pridaných 10 μΐ ľudského faktora X (Celsus Laboratories) s koncentráciou 3.245 gg/ml a ľudského faktora Vila (Enzýme Research) s koncentráciou 82,5 ng/ml a inkubácia pokračovala pri izbovej teplote ďalšiu hodinu.

Reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 0,5 M EDTA, k nej bolo pridaných 50 μΐ roztoku chromogénneho substrátu a bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek Microplate Reader (Bio Rad). Po jednohodinovej reakcii pri izbovej teplote bola znovu meraná absorbancia pri 405/655 nm. Neutralizačná aktivita môže byť určená spočítaním zvyškovej aktivity (%) z každej zmeny v absorbancii, pričom zmena absorbancie za 1 hodinu pri nepridaní žiadnej protilátky je považovaná za 100 % aktivitu.

Roztok chromogénneho substrátu bol pripravený rozpustením chromogénneho substrátu Testzyme S-2222 • · ··· · ··· (Chromogenix) podía priložených inštrukcií, dvojnásobným zriedením purifikovanou vodou a potom zmiešaním s roztokom polybrénu (0,6 mg/ml hexametylénbromidu, SIGMA) v pomere 1:1.

(4) Hodnotenie aktivity (i) Kombinácia verzie a zošlachteného H reťazca a chimérneho L reťazca

Bola vytvorená protilátka (a-ch), v ktorej je kombinovaná verzia a zošlachteného H reťazca s chimérnym L reťazcom a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná jej väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že množstvo viazané k antigénu sa pri vysokých koncentráciách znižuje (obrázok 1). Neutralizačná aktivita proti antigénu, meraná pomocou inhibície produkcie FXa bola slabá v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky (ch-ch) (obrázok 2). Preto bolo rozhodnuté uskutočniť ďalšie verzie zošlachteného H reťazca pomocou zámen FR. Tu použitá chimérna protilátka bola jednou z tých, ktoré boli exprimovaná v bunkách COS-7 a boli purifikované a hodnotené.

(ii) Kombinácia verzie a zošlachteného L reťazca a chimérneho H reťazca

Bola vytvorená protilátka (ch-a), v ktorej je kombinovaná verzia a zošlachteného L reťazca s chimérnym H reťazcom a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná jej väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že má väzobnú aktivitu rovnakú alebo vyššiu ako je väzobná aktivita chimérnej protilátky (obrázok 1) . Na druhej strane bola neutralizačná aktivita proti antigénu, meraná pomocou inhibície produkcie FXa slabá v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky (obrázok 2). Preto bolo rozhodnuté uskutočniť ďalšie verzie zošlachteného L reťazca pomocou zámen FR. Tu použitá chimérna protilátka bola jednou z tých, ktoré boli ·· • · • « ·· ···· exprimované v bunkách COS-7 a boli purifikované a hodnotené.

(iii) Kombinácia verzie a zošľachteného H reťazca a verzie a zošľachteného L reťazca

Bola vytvorená protilátka (a-a), v ktorej je kombinovaná verzia a zošľachteného H reťazca s verziou a zošľachteného L reťazca a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná jej väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že množstvo viazané k antigénu sa pri vysokých koncentráciách znižuje (obrázok 3) . Neutralizačná aktivita proti antigénu, meraná pomocou inhibície produkcie FXa bola slabá v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky (obrázok 4) . Preto bolo rozhodnuté uskutočniť ďalšie verzie zošľachteného H reťazca a L reťazca pomocou zámen FR. Tu použitá chimérna protilátka bola jedna tých, ktoré boli exprimované v bunkách COS-7 a boli purifikované a hodnotené.

(iv) Kombinácia verzií b, c a d zošľachteného H reťazca a chimérneho L reťazca

Boli vytvorené protilátky (b-ch, c-ch a d-ch), v ktorých je kombinovaný zošľachtený H reťazec, u ktorého boli uskutočnené ďalšie verzie pomocou zámen FR, s chimérnym L reťazcom a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná ich väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že kombinácia d-ch vykazovala väzobnú aktivitu porovnateľnú s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky, a b-ch a cch vykazovali o niečo nižšiu väzobnú aktivitu (obrázky 5 a 6) . Na druhej strane neutralizačná aktivita proti antigénu bola, v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky, temer zhodná u b-ch a o niečo slabšia u d-ch. U kombinácie c-ch bola výrazne slabšia ako u chimérnej protilátky (obrázok 7) . Preto boli verzie b a d zošľachteného H reťazca považované za zošľachtené H reťazce, vykazujúce vysokú aktivitu.

·· • · · • · • · φ · ·· · ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · ···· • · · • · · • · · • · · · (v) Kombinácia verzie b zošlachteného H reťazca a zošlachteného L reťazca

Bola vytvorená protilátka (b-a), v ktorej je kombinovaná verzia b zošlachteného H reťazca, u ktorého boli uskutočnené ďalšie verzie pomocou zámen FR, s zošlachteným L reťazcom a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná jej väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že množstvo viazané k antigénu sa pri vysokých koncentráciách znižuje (obrázok 5). Na druhej strane neutralizačná aktivita proti antigénu bola v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky výrazne slabšia (obrázok 8) . Preto boli kombinácie b-a a a-a považované za zošlachtené H reťazce vykazujúce vysokú aktivitu. Tu použitá chimérna protilátka bola jednou z tých, ktoré boli exprimované v bunkách COS-7 a boli purifikované a hodnotené.

(vi) Kombinácia verzií b a c zošlachteného L reťazca a chimérneho H reťazca

Boli vytvorené protilátky (ch-b a ch-c), v ktorých sú kombinované verzie b a c zošlachteného L reťazca s chimérnym H reťazcom a u obidvoch bolo zistené, že majú väzobnú aktivitu k antigénu a neutralizačnú aktivitu proti antigénu zhodnú s chimérnou protilátkou (obrázky 9 a 10) . Preto boli verzie b a c vybrané ako kandidát pre L reťazec zošlachtenej protilátky. Myšia protilátka s verziou b, ktorá má počet aminokyselín o jednu menej, je považovaná, pokial ide o antigenecitu, za dokonalejšiu ako je verzia c. Tu použitá chimérna protilátka bola jednou z tých, ktoré boli exprimované v bunkách CHO DG44 a boli purifikované a hodnotené.

(vii) Kombinácia verzie b zošlachteného H reťazca a verzií b a c zošlachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (b-b a b-c), v ktorých je kombinovaná verzia b zošlachteného H reťazca s verziami b a c zošlachteného L reťazca a bola testovaná • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· · ·· • · · · · · • · · • · · ·· ···· ·· ···· ·· ich väzobná aktivita k antigénu a neutralizačná aktivita proti antigénu. Obe mali o niečo menšiu aktivitu ako má chimérna protilátka a to ako u väzobnej aktivity k antigénu, tak u neutralizačnej aktivity proti antigénu (obrázky 11 a 12).

(viii) Kombinácia verzií b a d zošlachteného H reťazca a verzie b zošlachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (b-b a d-b'j, v ktorých je kombinovaný zošlachtený H reťazec, u ktorého boli uskutočnené ďalšie verzie pomocou zámen FR, s verziou b zošlachteného L reťazca a pomocou bunkového ELISA testu bola testovaná ich väzobná aktivita k antigénu. Zistilo sa, že kombinácia d-b vykazovala väzobnú aktivitu porovnateľnú s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky, a b-b vykazovala o niečo menšiu väzobnú aktivitu pri vysokej koncentrácii (obrázok 13) . Na druhej strane neutralizačná aktivita proti antigénu bola v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky trochu nižšia u b-b a výrazne nižšia u d-b (obrázok 14). Bolo teda ukázané, že verzia b-b je verzia vykazujúca vysokú neutralizačnú aktivitu, zatial čo verzia d-b je verzia vykazujúca vysokú väzobnú aktivitu.

(ix) Kombinácia verzie e zošlachteného H reťazca a chimérneho L reťazca a verzie b zošlachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (e-ch a e-b), v ktorých je kombinovaná verzia e zošlachteného H reťazca s chimérnym L reťazcom a zošlachtenou verziou b. Kombinácia e-ch vykazovala väzobnú aktivitu porovnateľnú s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky, ale u kombinácie e-b bolo množstvo exprimovanej protilátky velmi malé a väčšina väzobnej aktivity bola stratená (obrázok 15). Neutralizačná aktivita proti antigénu bola u kombinácie e-ch v porovnaní s neutralizačnou aktivitou pozitívnej kontrolnej chimérnej protilátky výrazne nižšia (obrázok 16). Bolo teda ·· ···· • · · • · • · · · ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ·· konštatované, že verzia

H reťazca v kombinácii s verziou b L reťazca dobre nefunguje.

g a h zošľachteného H (x) Kombinácia verzií f, reťazca a verzie b zošľachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (f-b, g-b a h-b), v ktorých sú kombinované verzie f, g a h zošlachteného H reťazca s verziou b zošľachteného L reťazca. U protilátok f-b a h-b bolo množstvo exprimovanej protilátky veľmi malé. U verzií f a h bola kombinácia s chimérnym L reťazcom vytvorená, ale nebola exprimovaná. Kombinácia g-b dosiahla nasýtenie pri nízkej koncentrácii a vykazovala väzobnú aktivitu slabšiu ako chimérna protilátka (obrázok 17). Neutralizačná aktivita proti antigénu bola u kombinácie g-b, v porovnaní s neutralizačnou aktivitou chimérnej protilátky, výrazne slabšia (obrázok 18).

(xi) Kombinácia verzií bl a dl zošľachteného H reťazca a verzie b zošľachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (bl-b a dl-b), v ktorých sú kombinované verzie bl a dl zošľachteného H reťazca s verziou zošľachteného reťazca. Temer žiadna protilátka nebola u žiadnej z nich exprimovaná. Kombinácie s chimérnym L reťazcom boli pre nich vytvorené, ale neboli exprimované.

(xii) Kombinácia verzií b3 a d3 zošľachteného H reťazca a verzie b zošľachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (b3-b a d3-b), v ktorých sú kombinované verzie b3 a d3 zošľachteného H reťazca s verziou zošľachteného L reťazca. Zistilo sa, že väzobná aktivita k antigénu u kombinácie d3-b bola v porovnaní s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky trochu nižšia a u kombinácie b3-b bola oveľa nižšia (obrázok 19). Neutralizačná aktivita proti antigénu bola u kombinácie b3-b vyššia ako u kombinácie b-b, ale bola nižšia v porovnaní s neutralizačnou aktivitou chimérnej protilátky a ·· ···

100 ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · · • · · · ·· ·· ·· · u kombinácií d3-b a b-b bola neutralizačná aktivita proti antigénu zhodná (obrázok 20).

(xiii) Kombinácia verzií i a j zošľachteného H reťazca a chimérneho L reťazca a verzie b zošľachteného L reťazca

Boli vytvorené protilátky (i-ch a j-b), v ktorých sú kombinované verzie i a j zošľachteného H reťazca s chimérnym L reťazcom a protilátky (i-b a j-b), v ktorých sú kombinované verzie i a j zošľachteného H reťazca s verziou b zošľachteného L reťazca a bola testovaná ich väzobná aktivita k antigénu a neutralizačná aktivita proti antigénu. Väzobná aktivita bola u ktoréhokoľvek z nich temer zhodná s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky (obrázky 21 a 22). Kombinácia i-ch vykazovala neutralizačnú aktivitu vyššiu ako chimérna protilátka a kombinácia j-ch vykazovala neutralizačnú aktivitu výrazne nižšiu ako chimérna protilátka (obrázok 23) . Kombinácia i-b vykazovala neutralizačnú aktivitu rovnakú ako chimérna protilátka a kombinácia j-b vykazovala neutralizačnú aktivitu výrazne nižšiu ako chimérna protilátka (obrázok 24).

(xiv) Verzie bl a b2 zošľachteného L reťazca

Keď boli vytvorené protilátky (ch-bl a ch-b2), v ktorých sú kombinované verzie bl a b2 zošľachteného L reťazca s chimérnym H reťazcom, obe vykazovali väzobnú aktivitu k antigénu zhodnú s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky (obrázok 25). Čo sa týka neutralizačnej aktivity proti antigénu, kombinácia ch-bl vykazovala väzobnú aktivitu zhodnú s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky, zatial čo kombinácia ch-b2 vykazovala pri vyššej koncentrácii väzobnú aktivitu trochu vyššiu ako chimérna protilátka (obrázok 26). Verzie bl a b2 môžu byť kandidátmi na L reťazec zošlachtenej protilátky, ale b2 je lepšia v tom, že jej aktivita je väčšia.

·· ····

ΙΟΙ (χν) Kombinácia verzie ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· · zošlachteného H reťazca a verzie b zošlachteného L reťazca

Bola vytvorená protilátka (b-b2), v ktorej je kombinovaná verzia b zošlachteného H reťazca s verziou b2 zošlachteného L reťazca a bola testovaná jej väzobná aktivita k antigénu a neutralizačná aktivita proti antigénu. Väzobná aktivita bola trochu nižšia ako väzobná aktivita chimérnej protilátky (obrázok 27) . Neutralizačná aktivita, hoci bola trochu vyššia ako neutralizačná aktivita kombinácie b-b, bola nižšia ako neutralizačná aktivita kombinácie i-b (obrázok 28).

(xvi) Kombinácia verzie

Boli vytvorené protilátky (i-bl a i-b2), v ktorých je kombinovaná verzia i zošlachteného H reťazca s verziami bl alebo b2 zošlachteného L reťazca a bola testovaná ich väzobná aktivita k antigénu a neutralizačná aktivita proti antigénu. Väzobná aktivita kombinácie i-b2 bola temer zhodná s väzobnou aktivitou chimérnej protilátky (obrázok 29) . Neutralizačná aktivita i-bl a i-b2 bola vyššia ako neutralizačná aktivita chimérnej protilátky a kombinácie i-b a mala klesajúcu tendenciu v rade i-b2> i-bl (obrázok 30).

Príklad 5

Príprava buniek CHO produkujúcich zošlachtenú protilátku a hodnotenie jej aktivity (1) Založenie bunkovej línie, ktorá stabilne produkuje protilátku

Aby bola založená bunková línia, ktorá stabilne produkuje zošlachtenú protilátku (b-b, i-b a i-b2), bol vektor exprimujúci protilátkový gén vnesený do buniek CHO (DG44), ktoré sú prispôsovené rastu v médiu bez séra.

·· ···· ··

102 ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·· ·

DNA plazmidov hHvb-hLvb/N5KG4P, hHvi-hLvb/N5KG4P a hHvi-hLvb2/N5KG4P boli štiepené reštrikčným enzýmom Sspl (Takara Shuzo) a linearizované, potom boli extrahované fenolom a chloroformom a purifikované etanolovou precipitáciou. Linearizovaný expresný vektor bol vnesený do buniek DG44 elektroporáciou pomocou prístroja (Gene Pulser; Bio Rad) . Bunky boli suspendované v PBS na bunkovú koncentráciu 1 x 10⁷ buniek/ml a k asi 0,8 ml tejto zmesi bolo pridaných 19 až 50 pg DNA a zmes bola podrobená pulzom 1500 V, pri kapacite 25 pF.

Po 10 minútach zotavenia pri izbovej teplote boli elektroporované bunky suspendované v médiu CHO-S-SFM11 (GIBCO), obsahujúcom hypoxantín/tymidín (GIBCO) (tu označované ako HT) a táto suspenzia v množstve 100 pl/jamku bola naočkovaná na 96-jamkové platničky (Falcon), ktoré boli kultivované v 5% CO2 inkubátore. Osem až deväť hodin po začiatku kultivácie bolo pridaných 100 pl/jamku média CHO-S-SFM11, obsahujúcehoHT a 1 mg/ml geneticínu (GIBCO), čím sa zmenila koncentrácia geneticínu v médiu na selektívnu koncentráciu 500 pg/ml a boli selektované bunky, do ktorých bol vnesený protilátkový gén. Médium bolo vymenené za čerstvé raz za 3 až 4 dni, pričom bola vždy vymenená polovica objemu. Asi 2 týždne po výmene za selekčné médium bola odobraná vzorka supernatantu z jamôk, v ktorých bol 4 až 5 dní po výmene pozorovaný uspokojivý rast buniek. Koncentrácia exprimovanej protilátky v supernatante bunkovej kultúry bola meraná pomocou testu ELISA, opísaného vyššie pri meraní koncentrácie protilátok a boli vybrané bunky, ktoré mali vysoký výťažok produkcie.

(2) Purifikácia zošlachtenej protilátky vo veľkom meradle

Bunkové línie DG44, ktorých selekcia bola opísaná vyššie a ktoré produkovali zošlachtené protilátky (b-b, i-b a i-b2), boli kultivované niekoľko dní v dvoch

103

BB

B B B B • · B • BBB

B B B

BB BBBB

B B B

BBB B B B B

B B B B

BB BB rolerových fľašiach (CORNING) s objemom 500 ml v médiu CHOS-SFMll, potom bolo kultivačné médium odobrané, bolo pridané čerstvé médium CHO-S-SFMll a pokračovalo sa v kultivácii. Kultivačné médium bolo centrifugované, aby boli odstránené zvyšky buniek a filtrované pomocou 0,22 μπι alebo 0,45 μπι fitra. Opakovaním tohto postupu boli získané celkom asi 2 litre supernatantu z každej kultúry. Zo získaných supernatantov kultúr boli purifikované protilátky pomocou systému ConSep LC 100 (Millipore), spojeného s afinitným stĺpcom Proteínu A (Poros).

(3) Meranie koncentrácie protilátok pomocou testu

ELISA

Platničky ELISA na meranie koncentrácie protilátok boli pripravené nasledovným spôsobom: v každej jamke 96jamkovej platničky ELISA (Maxisorp, NLJNC) bolo imobilizovaných 100 μΐ kozej protilátky proti ludskému IgGy (BioSource), pripravenej s koncentráciou 1 pg/ml v CB. Po blokovaní pomocou 200 μΐ DB boli do každej jamky pridané supernatanty z bunkových kultúr CHO, v ktorých bola exprimovaná protilátka, alebo bola purifikovaná protilátka sériovo riedená v DB a potom pridaná do každej jamky.

Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ v DB lOOOx zriedenej kozej protilátky proti ľudskému IgG, konjugovanej s alkalickou fosfatázou (BioSource). Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ roztoku substrátu a nakoniec bola meraná absorbancia 405/655 nm odpočítacím zariadením pre mikrodoštičky Microplate Reader (Bio Rad). Ako štandard pre meranie koncentrácie bol použitý ludský IgG4K (The Binding Site).

(4) Meranie väzobnej aktivity k antigénu

Μ ····

104 ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · • · · • · · · • · · · ·

Platničky bunkového ELISA testu na meranie väzobnej aktivity k antigénu boli pripravené nasledovným spôsobom: bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (ATCC HTB-1) boli naočkované do 96-jamkovej kultivačnej platničky, s koncentráciou 1 x 10⁵ buniek. Toto bolo kultivované (médium RPMI 1640 obsahujúce 10 % fetálneho hovädzieho séra /Gibco/) jeden deň v CO₂ inkubátore, aby bunkám bolo umožnené sa uchytiť. Po odstránení kultivačného média bola každá jamka dvakrát premytá PBS. Potom bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ PFA/PBS a na 10 minút to bolo umiestnené na lad, aby došlo k imobilizácii buniek.

PFA/PBS bol odstránený a každá jamka bola dvakrát premytá 300 μΐ PBS a potom blokovaná 250 μΐ DB. Na základe vyššie uvedených výsledkov merania boli purifikované protilátky sériovo riedené DB s faktorom 2, počínajúc od koncentrácie 10 μg/ml a 100 μΐ tohto riedenia bolo pridaných do každej jamky. Po inkubácii 2 hodiny pri izbovej teplote a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ kozej protilátky proti ludskému IgGy, konjugovanej s alkalickou fosfatázou (BioSource), ktorá bola lOOOx zriedená v DB. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premytí RB bolo pridaných 100 μΐ roztoku substrátu a potom bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek (Bio Rad).

(5) Meranie neutralizačnej aktivity proti TF (faktor inhibujúci aktivitu pôsobiacu proti produkcii FXa) Inhibičná aktivita zošlachtenej protilátky na produkciu faktora Xa bola meraná ako index inhibičnej aktivity proti aktivite podporujúcej produkciu faktora Xa, ktorú vykazuje tromboplastín odvodený z ľudskej placenty, Thromborel S (Boehringer AG). Teda 60 μΐ pufra (TBS obsahujúci 5 mM CaCl₂ a 0,1% BSA) bolo pridaných k 10 μΐ 5 mg/ml Thromborelu S a 10 μΐ protilátky, potom zmes bola 1 ·· ···· ·· • · · • · • · • · ·· ·

105 ·· ·· ·· • · · • · • · ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· hodinu inkubovaná v 96-jamkovej platničke pri izbovej teplote.

Ďalej bolo pridaných 10 μΐ ako ľudského faktora X (Celsus Laboratories) s koncentráciou 3.245 μς/πιΐ a ľudského faktora Vila (Enzýme Research) s koncentráciou 82,5 ng/ml a inkubácia pokračovala pri izbovej teplote ďalších 45 minút. Reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 0,5 M EDTA. Pridalo sa 50 μΐ roztoku chromogénneho substrátu a bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek Microplate Reader (Bio Rad). Po 30 minútovej reakcii pri izbovej teplote bola znovu meraná absorbancia pri 405/655 nm. Zvyšková aktivita (%) bola určená z každej zmeny v absorbancii, pričom zmena absorbancie za 30 minút pri nepridaní žiadnej protilátky je považovaná za 100 % aktivitu.

Roztok chromogénneho substrátu bol pripravený rozpustením chromogénneho substrátu Testzyme S-2222 (Chromogenix) podľa priloženého návodu a zmiešaním s roztokom polybrénu (0,6 mg/ml hexametylénbromidu, SIGMA) v pomere 1:1.

(6) Meranie neutralizačnej aktivity proti TF (inhibičná aktivita proti väzbe FX)

Inhibičná aktivita zošlachtenej protilátky proti väzbe FX bola meraná pomocou tromboplastínu odvodeného z ľudskej placenty - Thromborel S (Boehringer AG), pričom je vopred vytvorený komplex TF a faktora Vila a inhibičná aktivita proti väzbe FX bola meraná pomocou aktivity komplexu TFFVIIa na produkciu faktora Xa ako ukazovateľa. Teda 60 μΐ pufra (TBS obsahujúci 5 mM CaCl₂ a 0,1% BSA) bolo pridaných k 10 μΐ 5 mg/ml Thromborelu S a 10 μΐ ľudského faktora Vila (Enzýme Research) s koncentráciou 82,5 ng/ml protilátky, a zmes bola 1 hodinu preinkubovaná v 96-jamkovej platničke pri izbovej teplote.

·· ···· ··

106 ·· ·· ···· ·· · ··· • · ···· · ··· · · · · · · ······ ·· ·· ·· ·

Ďalej bolo pridaných 10 μΐ ludskej protilátky, inkubovanie pri izbovej teplote 5 minút a bolo pridaných 10 μΐ ľudského faktora X (Celsus Laboratories) s koncentráciou 3.245 μ9/ιη1 a inkubácia pokračovala pri izbovej teplote ďalších 45 minút. Protilátka bola sériovo riedená s faktorom 2 v pufre, pričom počiatočná koncentrácia bola 200 μς/ΓηΙ. Reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 0,5 M EDTA. Bolo k nej pridaných 50 μΐ roztoku chromogénneho substrátu a bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pomocou prístroja na odčítanie mikrodoštičiek Microplate Reader (Bio Rad). Po 30 minútovej reakcii pri izbovej teplote bola znovu meraná absorbancia pri 405/655 nm. Zvyšková aktivita (%) bola určená z každej zmeny v absorbancii, pričom zmena absorbancie za 30 minút pri nepridaní žiadnej protilátky je považovaná za 100 % aktivitu.

(7) Meranie neutralizačnej aktivity proti inhibičnej aktivite plazmovej koagulácie

Ako ukazovateľ neutralizačnej aktivity zošľachtenej protilátky proti TF (inhibičnej aktivite plazmovej koagulácie) bol použitý protrombínový čas, určený pomocou tromboplastínu odvodeného z ludskej placenty - Thromborel S (Boehringer AG) . Teda 100 μΐ ludskej plazmy (Cosmo Bio) bolo umiestnených do skúmavky a bolo pridaných 50 μΐ protilátky zriedenej na rôzne koncentrácie, 3 minúty zohrievané na 37 °C. Ďalej bolo pridaných 50 μΐ 1,25 mg/ml Thromborelu S, ktorý bol vopred zohriaty na 37 °C, čím bola započatá koagulácia plazmy. DÍžka trvania koagulácie meraná ·· ····

107 ·· ·· • · · · · · • · · · 9 · »·· ···· · · ·· ···· ·· ·· ·· · pomocou Amelung KC-10A, spojeného s Amelung CR-A (obidva od M.C. Medical).

Protilátka bola sériovo riedená pufrom TBS (riediaci faktor 2), obsahujúcim 0,1% BSA (tu označovaný ako BSATBS), počínajúc koncentráciou 80 pg/ml. Ako 100% koagulačná aktivita plazmy bol uvažovaný čas koagulácie vzorky, kde nebola pridaná protilátka a zvyšková TF aktivita bola vypočítaná z každého času koagulácie nameraného u vzoriek s protilátkou na základe štandardnej krivky, ktorá bola zostrojená vynesením koncentrácií Thromborelu S a časov koagulácie.

Štandardná krivka bola zostrojená z rôznych koncentrácií Thromborelu S a nameraných časov koagulácie. 50 μΐ BSA-TBS bolo pridaných do 50 μΐ vhodne zriedeného Thromborelu S, 3 minúty zohrievané na 37 °C a potom bolo pridaných 100 μΐ ludskej plazmy predhriatej na 37 °C, čím bola započatá koagulácia plazmy a meranie časov koagulácie. Thromborel S bol sériovo zriedený (riediaci faktor 2) v Hanksovom pufre (GIBCO) obsahujúcom 25 mM CaCl₂, pričom počiatočná koncentrácia bola 6,25 mg/ml. Koncentrácie Thromborelu S boli vynesené na osi X a časy koagulácie na osi Y v dvojakom logaritmickom vynesení a to bolo považované za štandardnú krivku.

(8) Hodnotenie aktivity

Všetky zošlachtené protilátky, b-b, i-b a i-b2 mali aktivitu rovnakú alebo väčšiu ako je aktivita chimérnej protilátky (obrázok 31) . U inhibičnej aktivity proti produkcii FXa, aktivity inhibujúcej väzbu FX a taktiež u aktivity inhibujúcej koaguláciu plazmy mali zošlachtené protilátky b-b, i-b a i-b2 aktivitu rovnakú alebo väčšiu ako je aktivita chimérnej protilátky a aktivita mala zostupnú tendenciu v rámci radu i-b2 > ιό > b-b (obrázky 32, 33 a 34).

108 • · ···· ·· ·· • · · · ·· · ··· • · ···· · · • · · · · ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

Príklad 6

Kinetická analýza interakcií TF a protilátok proti TF pomocou BIACORE

Rekombinantný proteín G bol imobilizovaný na senzorickom čipe, na ktorý bola naviazaná protilátka. Ako antigén bol použitý purifikovaný rekombinantný TF (rozpustný TF, v ktorom bol označujúci FLAG peptid v polohe 1 až 219) a rozpustný TF pripravený s rôznymi koncentráciami bol použitý ako analytické činidlo. Zo získaného senzorogramu boli vypočítané kinetické parametre (konštanty rýchlosti disociácie kdiss a konštanty rýchlosti väzby kass). Pre kinetickú analýzu sa odkazuje na Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical systém (Karlsson, R. a kol., /1991/ J. Imunnol. Methods 145: 229-240).

(1) Imobilizácia proteínu G na senzorický čip

Proteín G (ZYMED) je imobilizovaný na senzorický čip CM5 (BIACORE). Ako pohyblivý pufer bol použitý HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,0, 1,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0, 005% polysorbát 20 (objem/objem)) (BIACORE) a rýchlost prietoku bola 5 μΐ/minútu. Karboxylové skupiny na karboxymetyldextráne na senzorickom čipe CM5boli aktivované injekciou zmesi 0,05 M N-hydroxysukcínimid (NHS)/ 0,2 M N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid (EDC). Potom bolo injektovaných 10 μΐ 50 μg/ml proteínu G a toto bolo trikrát opakované kvôli imobilizácii. Proteín G bol pripravený rozpustením v 10 mM pufra Tris-HCl (pH 7,5) na koncentráciu 10 mg/ml a zriedením na 50 μg/ml v 10 mM pufra octanu sodného (pH 4,0). Ďalej bolo injektovaných 100 μΐ 1,0 M hydrochloridu etanolamínu (pH 8,5), aby bol blokovaný prebytok aktívnych skupín. Ďalej bolo injektovaných 10 μΐ 1,0 M pufra glycín-kyselina chlorovodíková (pH 2,5) a 10 μΐ 10 mM kyseliny chlorovodíkovej, aby boli vymyté • · · · • · · · ·· · ··· ·· ···· · · nekovalentne viazané zlúčeniny. Keď toto bolo uskutočnené pre každú prietokovú bunku a bolo injektovaných 10 μΐ 72 mM verzie ib2 zošlachtenej protilátky proti TF, bolo potvrdené, že sa naviazalo približne 1000 RU.

(2) Interakcia imobilizovanej protilátky proti TF a ľudského TF

Ľudský TF, ktorý mal pripojený označujúci FLAG peptid k C-koncu aminokyselinovéj sekvencie 1 až 219, bol exprimovaný v bunkách CHO a purifikovaný. Tento preparát bol potom použitý ako rozpustný TF.

Vyššie uvedená procedúra bola uskutočnená u každej z prietokových buniek č. 1 až 3.

(3) Kinetická analýza interakcie

Súbory údajov boli načítané a bolo uskutočnené porovnanie vzoriek reakcií, pričom ako základný stav bol použitý senzorgram pufra HBS-EP. Ďalej bola uskutočnená kinetická analýza pomocou analytického aplikačného softvéru BlOevaluation 2.1 (Pharmacia), pripraveného výlučne pre BIACORE, ktorý počíta kinetické parametre (konštanty väzobnej rýchlosti kass a konštanty disociačnej rýchlosti kdiss) pomocou porovnávania kriviek. Na určenie konštánt väzobnej rýchlosti kass bol použitý model analýzy 4 (BlOevaluation 2.1 Softvérová príručka, Al až A5) . Na základe hodnôt vypočítaných pre každú prietokovú bunku boli získané kinetické parametre pre každú protilátku. Výsledok (priemer hodnôt vypočítaných pre každú prietokovú bunku ± štandardná odchýlka) je uvedený v tabulke 6.

Tabulka 6

Kinetické parametre chimérnych a zošľachtených protilátok proti ľudskému TF (n = 3) ·· »·»·

110 ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····

	chimérna	b-b	i-b	i-2b
kdiss [ x 10‘⁴ 1/s]	5,06 ± 0,12	9,52 ± 0,22	6, 49 ± 0,17	6,35 ± 1,15
kass [ x 10⁵ 1/Ms]	4,65 ± 0,32	4,15 ± 0,27	4,67 ± 0,30	5,44 ± 0,36
KD [ x 10'⁹ M]	1,09 ± 0,09	2,30 ± 0,15	1,39 ± 0,13	1,17 ± 0,11

Príklad 7

Meranie reaktivity zošlachtenej protilátky proti TF s ľudským TF

Pomocou hybridizačnej metódy typu dot-blot (Protein Experimental Method for Molecular Biological Research, Revised, Yodosha, vyd. Takenawa Tadaomi, str. 10) bola skúmaná reaktivita s nedenaturovaným TF, s TF denaturovaným v neredukujúcich podmienkach a TF denaturovaným v redukujúcich podmienkach. Bol použitý TF, v ktorom bolo použité označenie pomocou FLAG pre extracelulárnu oblasť, bol exprimovaný v bunkách CHO a bol purifikovaný (shTF). shTF bol riedený v každom z troch pufrov (pufer A: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; pufer B: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 M močovina; pufer C: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 M močovina, 5 mM DTT). Nereduktívne bol TF spracovaný pomocou pufra A, zatiaľ čo nereduktívna denaturácia TF bola uskutočnená pomocou pufra B a reduktívne denaturovaný TF bol získaný pomocou pufra C. Na každú vzorku bolo pôsobené 24 hodín pri izbovej teplote.Potom bola vzorka nanesená na nitrocelulózovú membránu (Bio Rad). Na membránu bolo nanesených 0,5 μΐ, 1 μΐ a 2 μΐ vzorky (3 μg/ml) a membrána bola na vzduchu usušená. Bola blokovaná v DB (50 mM TrisHCl, pH 8,1, 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,05% (objem/objem) Tween 20, 0,02% (hmotnosť/objem) NaN₃, 1% (hmotnosť/objem)

BSA). Membrána sa ponechala reagovať v DB obsahujúcom zošľachtenú protilátku proti TF alebo v samotnom DB (kontrola). Po premytí v PBS, obsahujúcom 0,05% (objem/objem) Tween 20, membrána reagovala s DB obsahujúcim ·· ····

111 ··· ······ ······ ···· ··· protilátku proti ľudskému IgG, označenú peroxidázou (DÁKO). Po premytí v PBS, obsahujúcom 0,05% (objem/objem) Tween 20, bola spracovaná pomocou činidla ECL Western Blotting reagent (Amersham) a 30 sekúnd bola exponovaná na róntgenový film.

Ako je znázornené na obrázku 35, chimérna protilátka proti TF a zošlachtená protilátka proti TF (verzie bb, ib a ib2) reagovali so všetkými formami TF nedenaturovaným TF, TF denaturovaným v neredukujúcich podmienkach a TF denaturovaným v redukujúcich podmienkach.

Príklad 8

Potvrdenie antitrombotických účinkov na krysích modeloch akútnej DIC

Antitrombotické účinky protilátky proti TF boli potvrdené na krysom modeli tromboplastínom indukovanej DIC. Roztok ludského tromboplastínu bol kontinuálne podávaný injekčné do žily krysích samcov kmeňa SD, v dávke 40 mg/kg v priebehu 3 hodín, aby sa vytvoril model DIC. Protilátka proti TF (chimérna protilátka a zošlachtená protilátka proti TF i-b2) bola podaná intravenózne v dávke 0,2 mg/kg, 5 minút pred začiatkom injekčného podávania roztoku tromboplastínu. 15 minút po ukončení kontinuálneho podávania roztoku tromboplastínu bola do citrátu odobraná krv z brušnej tepny a bol v nej zisťovaný 'počet krvných doštičiek, čas čiastočne aktivovaného tromboplastínu (aPTT), koncentrácia fibrinogénu (Fib), koncentrácia rozpustného komplexu monoméra fibrínu (sFMC) a komplex trombín/antitrombín III.

Výsledok uvedený v tabulke 7 naznačuje, že kontinuálne injekčné podávania roztoku tromboplastínu spôsobuje pokles počtu krvných doštičiek, zvýšenie aPTT, zníženú koncentráciu fibrinogénu, zvýšené koncentrácie sFMC a TAT a zrejmý hyperkoagulačný stav. Naopak, ako chimérna

112

ΦΦ φ φ ·· ···· ·· • · · · φ φ φ ··· • φ φ φ φ φ · φ

ΦΦ· φφφφφφφ • Φ ···· φφ φφ φφ ··· protilátka, tak zošľachtená protilátka proti ľudskému TF potláčajú tieto zmeny rovnako silno.

Tabulka 7

meraná veličina	skupina bez podávaného tromboplastinu	kontrolná skupina s podávaným roztokom	skúpi na s podávanou chimérnou protilátkou	skupina s podávanou zošlachtenou proti látkou
počet krvných doštičiek (xlOVmm³)	115,5 ± 11,8	82,9 ± 14,3	100,4 ± 12,9	96,1 ± 13,3
aPTT (s)	20,1 ± 1,1	36,2 ± 13,9	22,3 ± 0,7^a)	21,8 ± l,3^a)
koncentrácia fibrinogénu (norm. skupina je 100 %)	100,0 ± 4,2	64,8 ± 20,0	101,0 ± 6,6^dl	98,9 ± 5,7^a)
sFMC (gg/ml)	74,2 ± 5,5	3517 ± 3645	129, 9 ± 46, 8^a)	66,5 ± 23,0^al
koncentrácia TAT (ng/ml)	3,4 ± 0,6	29,6 ± 31,0	3,8 ± 0,7^a)	4,2 ± 0,9

(priemer ± štandardná odchýlka)

Hladiny významnosti odchýlok vzhľadom na skupinu s podávaným roztokom sú: a) p < 0,01, b) p < 0,05

Referenčný príklad 1

Príprava monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF (1) Purifikácia ludského TF

Purifikácia TF z ludskej placenty bola uskutočnená podía metódy Ita (Ito, T. a kol., J. Biol. Chem., 114: 691696, 1993). Ľudská placenta bola homogenizovaná vo fyziologickom roztoku pufrovanom Trisom (TBS, pH 7,5), obsahujúcom 1,0 mM hydrochlorid benzamidínu, 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu, 1 mM diizopropylfluorofosfátu a ·· ····

113 ··

• · • ···· ·· ·· • · · · • · • · · · • e · ·· ·

0,02% azid sodný a potom bol precipitát pomocou vychladeného acetónu zbavený tuku. Získaný odtučnenýprášok bol suspendovaný vo vyššie uvedenom pufre obsahujúcom 2% Triton X-100, aby došlo k rozpusteniu TF.

Supernatant bol spracovaný afinitnou chromatografiou s použitím stĺpca Concanavalin A-Sepharose 4B (Pharmacia) a stĺpca Sepharose 4B s naviazanými protilátkami proti TF a bol získaný purifikovaný TF. Ten bol koncentrovaný pomocou ultrafiltračnej membrány (PM-10, Amicon) a bol uložený ako purifikovaná vzorka pri 4 °C.

Obsah TF v purifikovanej vzorke bol kvantifikovaný sendvičovým testom ELISA, ktorý kombinuje komerčne dostupné monoklonálne protilátky proti TF (American Diagnostica) s rekombinantným TS ako štandardom.

Čistota v purifikovanej vzorke bola potvrdená testovaním vzorky pomocou SDS-PAGE s použitím 4 až 20% hustotného gradientového polyakrylamidového gélu so záverečným zafarbením striebrom.

(2) Imunizácia a príprava hybridómu

Po zmiešaní purifikovaného ludského TF (približne 70 μg/ml) s rovnakým objemom kompletného adjuvans (Difco) boli do brucha subkutánne imunizovaní 5 týždňov starí myší samci kmeňa Balb/c (Nippon Charles River) dávkou 10 μg TF/myš. 12. 18. a 25. deň boli subkutánne podávané zosilňovacie dávky 5 μg/myš TF zmiešaného s Freudovým nekompletným adjuvans a ako záverečná imunizácia pol 32. deň intraperitoneálne podaný roztok TF zriedeného v PBS, v dávke 5 μg/myš.

Tri dni po záverečnej imunizácii boli zo štyroch myší pripravené slezinové bunky, ktoré boli fúzované pomocou polyetylénglykolovej metódy s myšou myelómovou bunkovou líniou P3U1 pri pomere buniek 1/5. Fúzované bunky boli suspendované v médiu RPMI-1640 (tu ďalej označované ako médium RPMI)(Lifetech Oriental), ktoré obsahovalo 10% ·· ···· • ·

114 ·· ·· • · · · · · • · · · • · · • · · · · · • · · • · · • · · · • · · · • · ·· fetálne hovädzie sérum a boli vysiate do 400 jamôk/myš (asi 400 buniek/jamku) na 96-jamkových platničkách. Prvý, 2., 3. a 5. deň po fúzii bola polovica média vymenená za médium RPMI (tu ďalej označované ako médium HAT) obsahujúce HAT (Dainippon Seiyaku) s prísadou Hl (Boehringer Mannheim GmBH), aby bola uskutočnená HAT selekcia hybridómov.

Hybridómy selektované pomocou ďalej opísanej prehľadávacej metódy boli klonované tak, že bolo dvakrát uskutočnené koncové riedenie.

Pri koncovom riedení bolo do 96-jamkových platničiek vysiatych priemerne 0,8 bunky na jamku. Z jamôk, v ktorých bol mikroskopickým pozorovaním potvrdený rast jednej kolónie, boli vybrané klony na základe merania väzobnej aktivity k TF a neutralizačnej aktivity proti TF. Získané klony boli prevedené z média HAT do média RPMI. Pokial sa potvrdilo, že pri prispôsobovaní novému médiu nedošlo k zníženiu produkcie protilátky, bolo znovu uskutočnené koncové riedenie, ktorým bolo klonovanie ukončené. Prdchádzajúcim postupom boli pripravené hybridómy, ktoré produkovali 6 protilátok (ATR-2, 2, 4, 5, 7 a 8) , ktoré silne inhibovali väzbu komplexu TF/faktor Vila a faktora X.

(3) Tvorba ascitov a purifikácia protilátok

Tvorba ascitov z pripravených hybridómov bola uskutočnená štandardným postupom. Teda 10⁶ hybridómových buniek, ktoré boli kultivované in vitro, bolo intraperitoneálne naočkovaných samcom myšieho kmeňa Balb/c, ktorým bol vopred dvakrát intravenózne podaný minerálny olej. Ascity boli odobrané od myší, ktoré mali 1 až 2 týždne po očkovaní zdurené brucho.

Purifikácia protilátky z ascitov bola uskutočnená pomocou systému ConSepLCIOO (Millipore), ktorý bol vybavený stĺpcom s proteínom A (Nippon Gaishi).

(4) Bunkový ELISA test

Bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (Fair D. S. a kol., J. Biol. Chem., 262: 11692-11698, 1987), o

115 ·· ·· ·· ···· ·· • · · · ·· · ··· • · ···· ·· ··· ······· ·· ···· ·· ·· ·· ··· ktorých je známe, že veími silne exprimujú TF, boli získané z ATCC a boli pasážované a udržiavané v médiu RPMI pri 37 °C, 5% C0₂ a 100% vlhkosti.

Platničky bunkového ELISA testu boli pripravené naočkovaním buniek J82 do 96-jamkovej platničky s koncentráciou 1 x 10⁵ buniek/jamku, potom kultivácia 1 deň pri vyššie uvedených podmienkach, odstránenenie média a dvojnásobné opláchnutie fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Nasledovalo pridanie 4% roztoku paraformaldehydu (PFA) a umiestnenie na 10 minút na lad, aby došlo k imobilizácii buniek. Po odstránení PFA bola platnička opláchnutá PBS, bol na ňu pridaný Tris pufer (blokujúci pufer), obsahujúci 1% BSA a 0,02% azid sodný a platnička bola uložená pri 4 °C na použitie.

Bunkový ELISA test bol uskutočnený nasledovným spôsobom. Z platničky pripravenej vyššie opísaným spôsobom bol odstránený blokujúci pufer, bol pridaný roztok protilátky proti TF alebo supernatantu z hybridómových kultúr a ponechalo sa to reagovať 1,5 hodiny pri izbovej teplote. Po premytí PBS, ktorý obsahuje 0,05% Tweenu 20, bola pridaná kozia protilátka proti myšiemu IgG (H+L) (Zymed), konjugovaná s alkalickou fosfatázou a ponechaná 1 hodinu reagovať. Po premytí bola pridaná 1 mg/ml dvoj sodná sol p-nitrofenylfosfátu (Sigma) a o hodinu neskôr bola meraná absorbancia pri 405/655 nm pre určenie množstva protilátky proti TF, viazanej k bunkám J82.

(5) Systém na testovanie neutralizačnej aktivity proti

TF, využívajúci ako ukazovatel aktivitu faktora Xa

K 50 μΐ trisom pufrovaného fyziologického roztoku (TBS: pH 7,6), obsahujúceho CaCl₂ a C,l% hovädzí sérumalbumín, bolo pridaných 10 μΐ roztoku tromboplastínu odvodeného z ludskej placenty (5 mg/ml) (Thromborel S) (Boehring) a 10 μΐ roztoku faktora Vila (82,5 ng/ml) (American Diagnostics) a reakcia prebiehala 1 hodinu pri ·· ···· • · · ·

I 16 ·· ···· · · · · ··· · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· * izbovej teplote, aby mohol vzniknúť komplex TF/faktor Vila. Potom bolo pridaných 10 μΐ roztoku protilátky proti TF s vopred určenou koncentráciou alebo supernatantu z hybridómovej kultúry a 10 μΐ roztoku faktora X (Celsus Laboratories) a reakcia prebiehala 45 minút pri izbovej teplote a potom bola zastavená pridaním 10 μΐ 0, 5 M EDTA. Potom bolo do reakčnej zmesi pridaných 50 μΐ roztoku 2 mM S-2222 (Daiichi Kagaku Yakuhin) a namerané zmeny v absorbancii pri 405/655 nm po 30 minútach boli brané za mieru aktivity TF, podporujúcej produkciu faktora X. Touto metódou môže byť určená aktivita protilátky, ktorá inhibuje väzbu komplexu TF/faktor VII a faktora X.

(6) Systém na testovanie inhibičnej aktivity proti koagulácii plazmy μΐ vhodne riedeného roztoku protilátky proti TF bolo zmiešaných so 100 μΐ komerčne dostupnej normálnej ludskej plazmy (Kojin Bio) a toto sa 3 minúty ponechanlo reagovať pri 37 °C. Potom bolo pridaných 50 μΐ roztoku tromboplastínu odvodeného z ludskej placenty (1,25 mg/ml) a bola meraný čas koagulácie plazmy pomocou prístroja na meranie koagulácie plazmy (CR-A: Amelung).

(7) Určenie izotypu protilátky

Pre supernatanty z hybridómových kultúr a pri purifikovaných protilátkach bola na potvrdenie izotypu protilátky používaná súprava s protilátkami (vyrobené Amersham). ďalej.

myšími monoklonálnymi Výsledok je uvedený

117

BB BB BB BBBB BB

BBBB BB B BBB • B BBBB B B

BBB BBBB BBB

BB BBBB BB BB BB BBB

Tabuľka 8

Imunoglobulínový izotyp monoklonálnej protilátky proti TF

ATR-2	IgGl, k
ATR-3	IgGl, k
ATR-3	IgGl, k
ATR-4	IgGl, k
ATR-5	IgGl, k
AT R-7	IgG2a, k
ATR-8	IgG2a, k

Referenčný príklad 2

Spôsob prípravy rozpustného ľudského TF

Rozpustný ludský TF (shTF) bol pripravený nasledovným spôsobom. Gén kódujúci leader oblasť ľudského TF, v ktorej boli aminokyseliny v pozícii 220 a ďalej zamenené značkovacím peptidom FLAG M2, bol vložený do expresného vektora cicavčích buniek (obsahujúce gén rezistencie proti neomyeínu a gén pre DHFR) a vnesený do buniek CHO. Pokiaľ ide o cDNA sekvenciu ľudského TF, bol odkaz na článok James H. Morrissey a kol.,(Celí (1987) 50: 129-135). Génová sekvencia a aminokyselinová sekvencia tohto rozpustného ľudského TF je ukázaná v SEQ ID NO: 151. Po selekcii látkou G418 boli vybrané exprimujúce bunky, ktoré boli podrobené amplifikácii expresie pomocou metotrexátu a boli založené bunky exprimujúce shTF.

Bunky boli kultivované v médiu bez séra CHO-S-SFMll (GIBCO), aby bol získaný supernatant kultúr, obsahujúci shTF. Ten bol dvakrát zriedený rovnakým objemom pufra 40 mM Tris-HCl (pH 8,5) a potom bol nanesený na stĺpec QSepharose Fast Flow (100 ml, Pharmacia Biotech), ekvilibrovaný pufrom 20 mM Tris-HCl (pH 8,5). Po premytí tým istým pufrom, obsahujúcim 0,1 M NaCl, bola koncentrácia NaCl zmenená na 0,3 M a shTF bol zo stĺpca eluovaný. Do • 4 ·♦ ···· · · 9 9 9 9 • · ···· ·· • · ···· 9 9 9 9 _11Ο ··· ······

118 ·· ···· ·· 99 99 9 získanej frakcie shTF bol pridávaný síran amónny do konečnej koncentrácie 2,5 M a bola centrifugovaná (10 000 ot/min, 20 min), aby sa vyzrážali kontaminujúce proteíny. Supernatant bol pridaný k Butyl TOYOPEARL (30 ml, TOSOH) a potom bol premývaný 50 mM Tris-HCl pufrom (pH 6,8), obsahujúcim 2,5 M síran amónny. V 50 mM Tris-HCl pufre (pH 6,8) bola koncentrácia síranu amónneho lineárne znižovaná z 2,5 na 0 M, aby došlo k vymytiu shTF zo stĺpca. Frakcie obsahujúce najviac shTF boli koncentrované pomocou CentriPrep 10 (Amicon). Koncentrát bol nanesený na stĺpec TSKgel G3000SWG (21,5 x 600 mm, TOSOH), ekvilibrovaný pufrom 20 mM Tris-HCl (pH 7,0), obsahujúcim 150 mM NaCl a boli odobrané frakcie, ktoré obsahovali najviac shTF. Tieto boli sterilizované filtráciou cez membránový filter 0,22 μιη a produkt bol používaný ako rozpustný ľudský TF (shTF). Koncentrácia vzorky bola vypočítaná za predpokladu, že molárny extinkčný koeficient vzorky ε = 40 130 a molekulová hmotnosť = 43 210.

Zoznam sekvencii

Obsah zoznamu sekvencii <223> je nasledovný:

SEQ ID NO: 1: Primér MHC-Gl SEQ ID NO: 2: Primér MHC-G2a SEQ ID NO: 3: Primér MKC SEQ ID NO: 4: M13 Primér M4 SEQ ID NO: 5: Ml 3 Primér RV

SEQ ID NC: 6: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-2 proti TF a jej aminokyselinové sekvencia

SEQ ID NO: 7: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-3 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

119 »· ·· • · · · • · · • · 9 • · · ·· ···· ·· ···· ·· • e · · · · • « · · · « · · · · · • · · · · ·

SEQ ID NO: 8: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-4 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 9: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 10: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-7 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 11: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-8 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 12: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-2 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 13: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-3 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 14: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-4 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 15: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 16: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-7 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ ID NO: 17: Nukleotidová sekvencia kódujúca V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-8 proti TF a jej aminokyselinová sekvencia

SEQ	ID	NO:	18:	Primér	ch5HS
SEQ	ID	NO:	19:	Primér	ch5HA
SEQ	ID	NO:	20:	Primér	ch5LS
SEQ	ID	NO:	21:	Primér	ch5LA
SEQ	ID	NO:	22:	Primér	hR5HvlS na prenos CDR

·· • · · • ·

120 ·· ·· • · · · • · · ·· ···· • · · ·« ···· • · · • · · • · · · ·« ·· • · ·· ·

SEQ	ID	NO:	23:	Primér	hR5Hv2S	na	prenos	CDR
SEQ	ID	NO:	24 :	Primér	hR5Hv4S	na	prenos	CDR
SEQ	ID	NO:	25:	Primér	hR5Hv3A	na	prenos	CDR
SEQ	ID	NO:	26:	Primér	hR5Hv5A	na	prenos	CDR
SEQ	ID	NO:	27 :	Primér	hR5HvPrS
SEQ	ID	NO:	28:	Primér	hRSHvPrA

SEQ ID NO: 29: Aminokyselinová sekvencia verzie a

V oblasti zošľachteného H reťazca a nukleotidová sekvencia, ktorá ju kóduje

SEQ ID NO: 30: Aminokyselinová sekvencia verzie a

V oblasti zošľachteného H reťazca

SEQ	ID	NO:	31:	Primér	F3RFFS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	32:	Primér	F3RFBS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	33:	Primér	F3RFFA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	34:	Primér	F3RFBA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	35:	Primér	F3NMFS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	36:	Primér	F3NMBS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	37:	Primér	F3NMFA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	38:	Primér	F3NMBA	pre	zámenu	FR

SEQ ID NO: 39: Aminokyselinová sekvencia verzie b

SEQ ID NO: 40: Aminokyselinová sekvencia verzie a

V oblasti zošľachteného H reťazca

SEQ ID NO: 41: Aminokyselinová sekvencia verzie c

SEQ ID NO: 42: Aminokyselinová sekvencia verzie c

V oblasti zošľachteného H reťazca

SEQ	ID	NO:	43:	Primér	F3EPS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	44 :	Primér	F3EPA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	45:	Primér	F3PrS
SEQ	ID	NO:	46:	Primér	F3PrA
SEQ	ID	NO:	47:	Primér	F3VHS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	48:	Primér	F3VHA	pre	zámenu	FR

·· • « · • ·

121 ·· ·· • · · · • · · ·· ···· • · · · · · · ···· ··

SEQ ID NO: 49: Aminokyselinová sekvencia verzie d

V oblasti zošlachteného H reťazca a nukleotidová sekvencia, ktorá ju kóduje

SEQ ID NO: 50: Aminokyselinová sekvencia verzie d

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 51: Aminokyselinová sekvencia verzie e

SEQ ID NO: 52: Aminokyselinová sekvencia verzie e

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ	ID	NO:	53:	Primér	F3SSS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	54:	Primér	F3SSA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	55:	Primér	F3CDS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	56:	Primér	F3CDA	pre	zámenu	FR

SEQ ID NO: 57: Aminokyselinová sekvencia verzie f

SEQ ID NO: 58: Aminokyselinová sekvencia verzie f

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 59: Aminokyselinová sekvencia verzie g

SEQ ID NO: 60: Aminokyselinová sekvencia verzie g

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 61: Primér F3ADS pre zámenu FR

SEQ ID NO: 62: Primér F3ADA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 63: Aminokyselinová sekvencia verzie h

SEQ ID NO: 64: Aminokyselinová sekvencia verzie h

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ	ID	NO:	65:	Primér	F3MMS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	66:	Primér	F3MMA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	67:	Primér	F3BMS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	68:	Primér	F3BMA	pre	zámenu	FR

BB

B B B

B ·

122 • B BB B B B B

B B B ·· ····

B B B B B BBBB

B B B B BB B B

B B BB B

SEQ ID NO: 69: Aminokyselinová sekvencia verzie i

SEQ ID NO: 70: Aminokyselinová sekvencia verzie i

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 71: Aminokyselinová sekvencia verzie j

SEQ ID NO: 72: Aminokyselinová sekvencia verzie j

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 73: Primér F2MPS pre zámenu FR

SEQ ID NO: 74: Primér F2MPA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 75: Aminokyselinová sekvencia verzie bl

SEQ ID NO: 76: Aminokyselinová sekvencia verzie bl

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 77: Aminokyselinová sekvencia verzie dl

SEQ ID NO: 78: Aminokyselinová sekvencia verzie dl

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 79: Primér F2VHS pre zámenu FR

SEQ ID NO: 80: Primér F2VHA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 81: Aminokyselinová sekvencia verzie b3

SEQ ID NO: 82: Aminokyselinová sekvencia verzie b3

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 83: Aminokyselinová sekvencia verzie d3

SEQ ID NO: 84: Aminokyselinová sekvencia verzie d3

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 85: Vektor h5LvlS pre zámenu FR ·· • · · · • · · t · · · • · · ·· ·· ·

123 • · ·· • · · · • · · • · · • · · • · · · · · ·· ····

SEQ	ID	NO:	86:	Vektor	h5Lv4S	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	87:	Vektor	h5Lv2A	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	88:	Vektor	h5Lv3A	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	89:	Vektor	h5Lv5A	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	90:	Primér	h5LvS
SEQ	ID	NO:	91:	Primér	h5LvA

SEQ ID NO: 92: Aminokyselinová sekvencia verzie a

V oblasti zošlachteného L reťazca a nukleotidová sekvencia, ktorá ju kóduje

SEQ ID NO: 93: Aminokyselinová sekvencia verzie a

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 94: Primér F3SS pre zámenu FR

SEQ ID NO: 95: Primér F3SA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 96: Primér F3RA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 97: Primér F3RA pre zámenu FR

SEQ ID NO: 98: Aminokyselinová sekvencia verzie b

SEQ ID NO: 99: Aminokyselinová sekvencia verzie b

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 100: Aminokyselinová sekvencia verzie c

SEQ ID NO: 101: Aminokyselinová sekvencia verzie c

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ	ID	NO:	102:	Primér	F2SS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	103:	Primér	F2SA	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	104:	Primér	F2XS	pre	zámenu	FR
SEQ	ID	NO:	105:	Primér	F2XA	pre	zámenu	FR

SEQ ID NO: 106: Aminokyselinová sekvencia verzie bl

SEQ ID NO: 107: Aminokyselinová sekvencia verzie bl

V oblasti zošlachteného L reťazca ·· ··· ··

• ·

124 ··

SEQ ID NO: 108: Aminokyselinová sekvencia verzie b2

SEQ ID NO: 109: Aminokyselinová sekvencia verzie b2

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 110: Aminokyselinová sekvencia FR1 všetkých verzií V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 111: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzií a až j V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 112: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzií bl a dl V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 113: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzií b3 a d3 V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 114: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie a

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 115: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzií b, bl a b3 V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 116: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie c

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 117: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzií d, dl a d3 V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 118: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie e

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 119: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie f

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 120: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie g

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 121: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie h

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 122: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie i

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 123: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie j

V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 124: Aminokyselinová sekvencia FR4 všetkých verzií V oblasti zošlachteného H reťazca

125 ·· ····

SEQ ID NO: 125: Aminokyselinová sekvencia FRl všetkých verzií V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 126: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzií a, b a c V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 127: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzie bl

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 128: Aminokyselinová sekvencia FR2 verzie b2

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 129: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie a

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 130: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzií b, bl a b2 V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 131: Aminokyselinová sekvencia FR3 verzie c

V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 132: Aminokyselinová sekvencia FR4 všetkých verzií V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 133: Aminokyselinová sekvencia CDR1 všetkých verzií V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 134: Aminokyselinová sekvencia CDR2 všetkých verzií V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 135: Aminokyselinová sekvencia CDR3 všetkých verzií V oblasti zošlachteného H reťazca

SEQ ID NO: 136: Aminokyselinová sekvencia CDR1 všetkých verzií V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 137: Aminokyselinová sekvencia CDR2 všetkých verzií V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 138: Aminokyselinová sekvencia CDR3 všetkých verzií V oblasti zošlachteného L reťazca

SEQ ID NO: 139: Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-2 proti ludskému TF

SEQ ID NO: 140: Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-3 proti ludskému

TF

126 ·· ·· • · · · • · · • 9 9999 ·· 9

SEQ ID NO: 141: Aminokyselinová sekvencia V oblastí H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-4 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 142: Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 143: Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-7 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 144: Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-8 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 145: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-2 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 146: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-3 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 147: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-4 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 148: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-5 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 149: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-7 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 150: Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca myšej monoklonálnej protilátky ATR-8 proti ľudskému TF

SEQ ID NO: 151: Aminokyselinová sekvencia rozpustného ludského TF a nukleotidová sekvencia, ktorá ju kóduje

SEQ ID NO: 152: Aminokyselinová sekvencia rozpustného ľudského TF

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chimérny ťažký (H) reťazec obsahujúci variabilnú (V) oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF) a konštantnú (C) oblasť H reťazca ľudskej protilátky, pričom uvedená V oblasť H reťazca má ktorúkoľvek z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

(1) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 139 (ATR-2) (2) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 140 (ATR-3) (3) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 141 (ATR-4) (4) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 142 (ATR-5) (5) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 143 (ATR-7) (6) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 144 (ATR-8).

2. Chimérny H reťazec podľa nároku 1, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 142.

3. Chimérny H reťazec podľa nároku 1 alebo 2, kde uvedená C oblasť H reťazca je oblasť Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4.

4. Chimérny H reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 142 a uvedená C oblasť H reťazca je oblasť Cy4.

5. Cnimérny lahký (L) reťazec obsahujúci (V) oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF a C oblasť L reťazca ľudskej protilátky, pričom uvedená V oblasť L reťazca má ktorúkoľvek z nasledujúcich aminokyselinových sekvencii:

(1) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 145 (ATR-2) (2) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 146 (ATR-3) ·· • · ·

128 • · ·· • · · · · ·· ···· (3) aminokyselinová (4) aminokyselinová (5) aminokyselinová (6) aminokyselinová

6. Chimérny L oblasť H reťazca 148.

sekvencia SEQ ID NO: sekvencia SEQ ID NO: sekvencia SEQ ID NO: sekvencia SEQ ID NO:

reťazec podľa nároku 5, kde má aminokyselinová sekvenciu

147 (ATR-4)

148 (ATR-5)

149 (ATR-7)

150 (ATR-8).

uvedená V SEQ ID NO:

7. Chimérny L reťazec podľa nárokov 5 alebo 6, kde uvedená C oblasť L reťazca je oblasť CX alebo Ck.

8. Chimérny L reťazec podlá ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinová sekvenciu SEQ ID NO: 148 a uvedená C oblasť L reťazca je oblasť Ck.

9. Chimérna protilátka proti ľudskému TF obsahujúca chimérny H reťazec podľa ktoréhokoívek z nárokov 1 až 4 a chimérny L reťazec podlá ktoréhokoívek z nárokov 5 až 8.

10. Chimérna protilátka proti ludskému TF obsahujúca chimérny H reťazec podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 a chimérny L reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 8.

11. V oblasť zošlar-hteného H reťazca obsahujúca oblasť určujúcu komplementaritu (CDR) z V oblasti H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF a podpornú oblasť (FR) V oblasti H reťazca ľudskej protilátky, pričom uvedené CDRs obsahujú nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

H-CDR1: Asp Tyr Tyr Met His (SEQ ID NO: 133) , H-CDR2: Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe Gin Gly (SEQ ID NO: 134) a

129 ·· ···· «· é · · · · · • · 9 · · · · · · · • · · · · · ·· ·· ···· ·· ·· ·· ·

H-CDR3: Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 135).

12. V oblasť zošlachteného H reťazca, kde uvedené FRs obsahujú nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

H-FR1: Gin Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys íle Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys (SEQ ID NO: 110),

H-FR2: ktorákoľvek z nasledujúcich sekvencií (1) až (3):

(1) Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle Gly (SEQ ID NO: 111) , (2) Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly (SEQ ID NO: 112) , (3) Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle Gly (SEQ ID NO: 113) , H-FR3: ktorákolvek z nasle iduji úcict l sekv ^rencií (1 ) až (10) (D Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser íle Ala Tyr Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO ': 13 4) , (2) Arg Val Thr íle Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala íle Tyr Tyr Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO >: 11 5), (3) Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO : 11 6), (4) Arg Val Thr íle Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala A rg (SEQ ID NO : 11 .7), (5) Arg Val Ser íle Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys íle Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala A rg (SEQ ID NO : 11 8), (6) Arg Val Thr íle Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala A rg (SEQ ID NO : 11 9) ,

• · · · • · · • · · · • · · ·· ·· ·

130 ·· ···· ·· ····

(7) Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr ser Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO : 12 :o), (8) Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Leu Gin Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala íle Tyr Phe Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO : 12 :i), (9) Arg Val Thr íle Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala A ,rg (SEQ ID NO : 12 :2) a (10) Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala A >rg (SEQ ID NO : 12 !3) α H-FR4: Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

Ser (SEQ ID NO: 124) .

13. V oblasť zošlachteného H reťazca podía nárokov 11 alebo 12, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 30 (verzia a), SEQ ID NC: 40 (verzia b), SEQ ID NO: 42 (verzia c), SEQ ID NO: 50 (verzia d), SEQ ID NO: 52 (verzia e), SEQ ID NO: 58 (verzia f), SEQ ID NO: 60 (verzia g), SEQ ID NO: 64 (verzia h), SEQ ID NO: 70 (verzia i), SEQ ID NO: 72 (verzia j), SEQ ID NO: 76 (verzia bl), SEQ ID NO: 78 (verzia dl), SEQ ID NO: 82 (verzia b3) alebo SEQ ID NO: 84 (verzia d3).

14. V oolasť zošlachteného H reťazca podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 12, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 40 (verzia b).

15. V oblasť zošlachteného H reťazca podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 12, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 70 (verzia i).

·· ···· ··

131 • · ·· • · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ·· • · ·· ·

16. V oblasť zošlachteného L reťazca obsahujúca CDRs V oblasti zošlachteného L reťazca z myšej monoklonálnej protilátky proti ludskému TF a FRs V oblasti ľudského L reťazca, kde uvedené CDRs zahŕňajú nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

L-CDR1: Lys Ala Ser Gin Asp íle Lys Ser Phe Leu Ser (SEQ ID NO: 136),

L-CDR2: Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp (SEQ ID NO: 137) a L-CDR3: Leu Gin His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr (SEQ ID NO: 138) .

17. V oblasť zošľachteného L reťazca podlá nároku 16 alebo 12, kde uvedené FRs zahŕňajú nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

L-FR1: Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys (SEQ ID NO: 125) t L-FR2: ktorákoľvek z nasledujúcich sekvencií (1) až (3) : (1) Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr (SEQ ID NO: 126), (2) Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu íle Tyr (SEQ ID NO: 127) a (3) Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu íle Tyr (SEQ ID NO: 128), L-FR3: ktorákoľvek z nasledujúcich : sekvencií • (D až (3) : (1) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys (SEQ ID NO: 129) , (2) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys (SEQ ID NO: 130) a (3) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys (SEQ ID NO: 131) a

L-FR4: Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys (SEQ ID NO: 132) .

·· • · · ·

132 ·· ·· ····

18. V oblasť zošľachteného L reťazca podľa nárokov 16 alebo 17, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 93 (verzia a) , SEQ ID NO: 99 (verzia b), SEQ ID NO: 101 (verzia c), SEQ ID NO: 107 (verzia bl) alebo SEQ ID NO: 109 (verzia b2).

19. V oblasť zošľachteného L reťazca podlá ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 18, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 99 (verzia b).

20. V oblasť zošľachteného L reťazca podlá ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 18, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 109 (verzia b2).

21. Zošlachtený H reťazec protilátky proti ľudskému TF, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť zošľachteného H reťazca podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 15 a C oblasť H reťazca Iudskej protilátky.

22. Zošlachtený H reťazec protilátky proti ľudskému TE, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť (verziu b) zošľachteného H reťazca podľa nároku 14 a C oblasť H reťazca Iudskej protilátky.

23. Zošlachtený H reťazec protilátky proti ľudskému TF, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť (verziu i) zošľachteného H reťazca podlá nároku 15 a C oblasť H reťazca Iudskej protilátky.

24. Zošlachtený H reťazec podlá ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 23, kde uvedená C oblasť H reťazca ľudskej protilátky je Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4 .

·· ···· ·· • 9

133 • 9 9 · « · · • · * • · ·

99 ·· ·· ····

25. Zošlachtený L reťazec protilátky proti ľudskému TF, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť zošlachteného L reťazca podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 20 a C oblasť L reťazca ludskej protilátky.

26. Zošlachtený L reťazec protilátky proti ludskému TF, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť (verziu b) zošlachteného L reťazca podlá nároku 19 a C oblasť L reťazca ludskej protilátky.

27. Zošlachtený L reťazec protilátky proti ludskému TF, kde uvedený reťazec obsahuje V oblasť (verziu b2) zošľachteného L reťazca podlá nároku 20 a C oblasť L reťazca ľudskej protilátky.

28. Zošlachtený L reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, kde uvedená C oblasť L reťazca je oblasť CX alebo Ck.

29. Zošlachtená protilátka proti ľudskému TF, kde uvedená protilátka obsahuje zošlachtený H reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 27 a zošlachtený L reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 28.

30. Zošľachtená protilátka proti ludskému TF, kde uvedená protilátka obsahuje zošlachtený H reťazec (verziu b) podlá nároku 22 a zošlachtený L reťazec (verziu b) podľa nároku

26.

31. Zošľachtená protilátka proti ludskému TF, kde uvedená protilátka obsahuje zošlachtený H reťazec (verziu i) podľa nároku 23 a zošlachtený L reťazec (verziu b) podía nároku 26.

·· ···· ··

134 ·· ··

32. Zošľachtená protilátka proti ľudskému TF, kde uvedená protilátka obsahuje zošlachtený H reťazec (verziu i) podľa nároku 23 a zošlachtený L reťazec (verziu b2) podľa nároku

27.

33. DNA kóduj úca chimérny H reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 . 34. DNA z nárokov kódujúca 2 až 4. chimérny H reťazec podľa ktoréhokoľvek 35. DNA z nárokov kóduj úca 5 až 8. chimérny H reťazec podľa ktoréhokoľvek 36. DNA z nárokov kódujúca 6 až 8 . chimérny L reťazec podľa ktoréhokoľvek 37. DNA kódujúca V oblasť zošlachteného H reťazca podľa

ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 15.

38 . DNA kódujúca V oblasť zošlachteného H reťazca (verziu b) podľa nároku 14 • 39 . DNA kódujúca V oblasť zošlachteného H reťazca (verziu i) podľa nároku 15 • 40 . DNA kódujúca V oblasť zošlachteného L reťazca i podľa

ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 20.

41. DNA kódujúca V oblasť zošlachteného L reťazca (verziu b) podľa nároku 19.

42. DNA kódujúca V oblasť zošlachteného H reťazca (verziu b2) podľa nároku 20.

·· ···· ··

135 ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· ··

43. DNA kódujúca zošlachtený H reťazec podlá ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 24.

44. DNA kódujúca zošlachtený H reťazec (verziu b) podlá nároku 22 alebo 24.

45. DNA kódujúca zošlachtený H reťazec (verziu i) podlá nároku 23 alebo 24.

46. DNA kódujúca zošlachtený L reťazec podlá ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 28.

47. DNA kódujúca zošlachtený L reťazec (verziu b) podľa nároku 26 alebo 28.

48. DNA kódujúca zošlachtený L reťazec (verziu b2) podľa nároku 27 alebo 28.

49. Expresný vektor, reťazec H podlá nároku ktorý 33. obsahuje DNA kódujúcu chimérny 50. Expresný vektor, reťazec H podľa nároku ktorý 34. obsahuje DNA kódujúcu chimérny 51. Expresný vektor, reťazec L podľa nároku ktorý 35. obsahuje DNA kódujúcu chimérny 52. Expresný vektor, reťazec L podlá nároku ktorý 36. obsahuje DNA kódujúcu chimérny 53. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec H podľa nároku 33 a DNA kódujúcu chimérny reťazec L

podía nároku 35.

·· ···· ·· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· ·

136 • · · • · · • · · · · • · · · ·· ··

54. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec H podlá nároku 34 a DNA kódujúcu chimérny reťazec L podlá nároku 36.

55. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu zošlachtený reťazec H podľa nároku 43.

56. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošlachteného reťazca H podlá nároku 44.

57. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu i zošlachteného reťazca H podía nároku 45.

58. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu zošlachtený reťazec L podía nároku 46.

59. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošlachteného reťazca L podía nároku 47.

60. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b2 zošlachteného reťazca L podía nároku 48.

61. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu zošlachtený reťazec H podía nároku 43 a DNA kódujúcu zošlachtený reťazec L podía nároku 46.

62. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošIachLeného reťazca H podía nároku 44 a DNA kódujúcu verziu h zošlachteného reťazca L podía nároku 47.

63. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu i zošlachteného reťazca H podía nároku 45 a DNA kódujúcu verziu b zošlachteného reťazca L podía nároku 47.

·· ···· • · · • · • · • · ·· ·

137 ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· « · · • · · • · · · · • · · · ·· ··

64. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu i zošlachteného reťazca H podľa nároku 45 a DNA kódujúcu verziu b2 zošlachteného reťazca L podľa nároku 48.

65. Hostiteľ transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec H podľa nároku 49 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec L podľa nároku 51.

66. Hostite! transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec H podľa nároku 50 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu chimérny reťazec L podlá nároku 52.

67. Hostiteľ transformovaný expresným vektorom podía nároku 53. 68. Hostite! transformovaný expresným vektorom podľa nároku 54. 69. Hostite! transformovaný expresným vektorom, ktorý

obsahuje DNA kódujúcu zošlachtený reťazec H podlá nároku 55 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu zošlachtený reťazec L podľa nároku 58.

70. Hostite! transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošlachteného reťazca H podía nároku 56 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošlachteného reťazca L podlá nároku 59.

71. Hostite! transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu i zošlachteného reťazca H podľa nároku 57 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b2 zošlachteného reťazca L podía nároku 60.

·· ····

4 4 4

4 4

138 ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · •· ···· • · · • · · • · ··

4 · · ·

4· 44

44 ·

72. Hostiteľ nároku 61. transformovaný expresným vektorom podľa 73. Hostiteľ nároku 62. transformovaný expresným vektorom podľa 74. Hostiteľ nároku 63. transformovaný expresným vektorom podľa 75. Hostiteľ nároku 64. transformovaný expresným vektorom podľa

76. Hostiteľ transformovaný expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu i zošľachteného reťazca H podľa nároku 57 a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA kódujúcu verziu b zošľachteného reťazca L podľa nároku 59.

77. Spôsob prípravy chimérnej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 65 a odoberanie chimérnej protilátky z uvedenej kultúry.

78. Spôsob prípravy chimérnej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 66 a odoberanie chimérnej protilátky z uvedenej kultúry.

79. Spôsob prípravy chimérnej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 67 a odoberanie chimérnej protilátky z uvedenej kultúry.

80. Spôsob prípravy chimérnej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ·· ···· • · ·

9 · · • · · • 9 9 9

99 99

139 ·· ·· • · ·

9 9 9 « · · • · · ·· ···

9 9 9

9 · • · · • · ·· · kultiváciu hostiteľa podľa nároku 68 a odoberanie chimérnej protilátky z uvedenej kultúry.

81. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 69 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

82. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 70 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

83. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 71 a odoberanie zošlachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

84. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 72 a odoberanie zošlachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

85. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ludskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostitela podľa nároku 73 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

86. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 74 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

87. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ľudskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje • · ···· • ·

140 • · »· ···· kultiváciu hostiteľa podľa nároku 75 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

88. Spôsob prípravy zošľachtenej protilátky proti ludskému TF, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľa podľa nároku 76 a odoberanie zošľachtenej protilátky z uvedenej kultúry.

89. Spôsob prípravy prirodzenej zošlachtenej protilátky, ktorá má oblasti určujúce komplementaritu (CDRs) odvodené z iného organizmu ako človeka a podpornú oblasť (FR) má odvodenú z prirodzenej ľudskej protilátky a ktorá má zníženú imunogenitu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:

(1) príprava monoklonálnej protilátky živočícha iného ako človeka, reagujúcej proti záujmovému antigénu;

(2) príprava množstva druhov ľudských protilátok, ktoré majú vysokú homológiu s aminokyselinovými sekvenciami v FRs monoklonálnych protilátok, ktoré sú uvedené vyššie v bode (1);
(3) zámena štyroch FRs jednej ludskej protilátky, uvedených vyššie v bode (2), za odpovedajúce FRs monoklonálnej protilátky iného organizmu ako človeka, ktorá je uvedená vyššie v bode (1) a vytvorenie prvej zošlachtenej protilátky;
(4) určenie schopnosti zošlachtenej protilátky, ktorá je pripravená vyššie v bode (3) viazať sa k antigénu alebo neutralizovať biologickú aktivitu antigénu;
(5) zámena jednej až troch FRs zošlachtenej protilátky pripravenej v bode (3) za odpovedajúce FRs ludskej protilátky, ktoré sa líšia od protilátky použitej v bode (3), u ľudských ·· ··· ·· ·· • · · 1 • · 1

141 (6) ·· ····

I · · · • · ·· protilátok pripravených v bode (2) a vytvorenie druhej zošlachtenéj protilátky;

porovnanie protilátky schopnosti vytvorenej druhej zošlachtenej v bode (5) a prvej (7) (8) zošlachtenej protilátky vytvorenej v bode (3) viazať sa k antigénu alebo neutralizovať biologickú aktivitu antigénu a podľa toho výber zošlachtenej protilátky s výhodnejšou aktivitou; uskutočnenie vyššie uvedených krokov (3) až (6) u zošlachtenej protilátky vybranej v bode (6); a opakovanie vyššie uvedených krokov (3) až (6) , dokiaľ sa nepodarí získať zošľachtenú protilátku, ktorá má aktivitu odpovedajúcu monoklonálnej protilátke iného živočícha ako je človek, uvedenej v bode (1).

90. Spôsob prípravy podľa nároku 89, vyznačujúci sa t ý m, že uvedeným antigénom, o ktorý ide, je ľudský tkanivový faktor (TF).

91. Zošľachtená protilátka pripravená spôsobom prípravy podľa nároku 89.

92. Zošľachtená protilátka pripravená spôsobom prípravy podľa nároku 90.

93. Liečebné činidlo pre syndróm roztrúsenej vnútrožilovej zrážavosti (DIC), vyznačujúce sa tým, že obsahuje zošľachtenú protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 29 až 32 a nároku 92.