SE522077C2 - Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering - Google Patents

Description

25 30 35 , . : n e» .a o o; I 0 u n a" u v _ _°',, . .o I 0 I* v v u v I u I z . ' _ , , L-e' La' i: n u n a. s n:- o o a un ,, o u a f Q n n a II o: 2 ännu större antal olika sonder. För att påvisa en specifik mutation är urvalet mer begränsat, eftersom sondens sekvens måste överiappa den presumtiva mutationen, men det finns ändock flera alternativ.

I PCT/SE97/00953 föreslås att man väljer SID:s sekvens utifrån RG:s kända egenskaper, och för asymmetriska cyaninfärgämnen föreslås SID:s vars terminala baser är företrädesvis blandade pyrimidiner (-'l'l' eller -CT). Denna strategi har flera begränsningar. Dels krävs detaljerade studier av färgämnets egenskaper som dessutom inte trivialt kan extrapoleras till sondernas egenskaper, p.g.a. skillnader i experimentella betingelser etc., dels uppfylls sekvenskraven i regel av ett obekvämt stort antal sekvenser (1/8 av alla sekvenser, t.ex. slutar med antingen -TT eller -CT). Slutligen tas ingen hänsyn till sekvensen intill MS.

Föreliggande uppfinning överkommer dessa problem. Den är ett förfarande att undersöka vilken av ett stort antal potentiella sonder för en viss nukleinsyra, som har den lägsta bakgrundssignalen och vilken av dessa som erhåller starkast signal vid hybridisering. Skillnaden i bestämningar är den signalökning som erhålles med de olika sonderna.

Beskrivning av figurer Figur 1. Princip för homogen testning.

Figur 2. Sond för homogen testning bestående av en sekvens-igenkännande del (SID) och en reportergrupp (RG).

Figur 3. Princip som visar hur den ur känslighetshänseende lämpligaste sonden för viss nukleinsyra kan identifieras.

A: Exempel på sonder som alla känner igen samma nukleinsyra.

B: Dessa sonder syntetiseras på en fast matris.

C: Fluorescensen hos sonder mäts i såväl fritt som hybridiserat tillstånd. De som ger upphov till störst signalökning är de lämpligaste.

Beskrivning av uppfinningen Deoxyribonukleinsyror och flera nukleinsyraanaloger, såsom t.ex. peptid nukleinsyror (PNA), syntetiseras vanligen med fastfas syntes, vilket bl. a. tillåter syntes av stort antal fragment med olika sekvenser och även olika längder på en matris (Khrapko et al., FEBS Lett. 256, 118. 1989; Southern, E., et al., Genomics 13, 1008, 1992; Caviani-Pease, et 10 15 20 25 30 35 a. o a .nu n e n HI: .",, o n f: u n a g z ' . _. , :ef fu' 'an- a a os: ø nl' -- n u o n u» , u n n 1 - . . - n- n 3 al., Proc. Natt. Acad. Sci., 91, 5022, 1994; Weiler et al., Nucl. Acids Res. 25, 2792, 1997). Fragmenten på denna matris kan hybridiseras med märkt nukleinsyra , t.ex. med fluoreseenta eller radioaktiva grupper, och graden av hybridisering kan bestämmas från nukleinsyrans signal. Denna teknologi har många applikationer, och kallas ofta för DNA-chip teknologi.

I föreliggande uppfinning utnyttjas DNA-chip teknologin för att avgöra vilka av ett stort antal sonder, som alla, med tillräcklig specificitet, känner igen viss nukleinsyra, som lämpar sig bäst för nukleinsyrahybridisering, och då företrädesvis i homogen lösning.

Sonder, dvs oligodeoxyribonukleinsyror eller nukleinsyraanaloger utrustade med reportergrupper (RG), som alla är tillräckligt komplementära och tillräckligt specifika för viss nukleinsyra, syntetiseras på en matris (Figur 3). Signalen, företrädesvis fluorescensen, som de ger upphov till, dvs bakgrundssignalen registreras. Därefter tillsätts viss nukleinsyra och fluorescensen, denna gång från hybridiserade sonder, registreras. Skillnaden i signal i dessa mätningar är den signalökning som erhålles med de olika sonderna. De, som uppvisar störst signalskillnad, är de, som ur känslighetshänseende, är lämpligast.

Exempel (tillagt 2003-03-03) Femton 10-baser långa PNA-tiazolorange sonder, komplementära till olika segment för sekvensen GTCAGATGAGGAAGAGGCTATFGT, och en sond, komplementär i parallell orientering till den centrala polypurinregionen, syntetiserades på ett Perseptive-PP-NHZ- membran (åtskilda från membranet med PEG-500-Glu-Lys-kapronsyra länk) med användning av en ABIMED ASP 222 Automated SPOT Robot (Weiler, J. et al., Nilen: Acids Res., 25, 2792, (1997), Figur 1). PNA monomererna anbringades som beskrives av Weiler, J. et al., supra. I sista steget aktiverades tiazolorange-färgen substituerad med en karboxylsyraalkyl-länk och reagerades på samma sätt som Fmoc-PNA monomererna. Efter syntes eliminerades från PNA oligomererna sidokedjeskyddsgrupperna genom behandling med 90% TFA/5% vatten/5% trietylsilan under 1 timme.

Membranet fuktades sedan i en 10 mM boratbuffert vid pH 8,5 innehållande en tillsats av 100 mM NaCl under 2 timmar och belystes med en standard UV-lampa med Åmax = 312 nm, och fotograferades med en CCD kamera. Bakgrundsfluoroscensen för sonderna har uttryckts relativt sond 16 (CCT CTT CCT C-TO).

Claims (4)

1. . - n : a: u 522 077 PATENTKRÅV 1. 5 10

2.

3. 15

4. Förfarande att på en fast matris syntetísera sonder bestående av en sekvensigenkännande del (SID) och en reportergrupp (RG), vilka sonder är tillräckligt komplementära till olika delar av viss nukleinsyra, och i) bestämma deras signal i frånvaro av viss nukleinsyra, och ii) bestämma deras signal i närvaro av viss nukleinsyra genom hybridisering av en viss nukleinsyra på en fast matris med märkta sonder och välja de sonder som har störst signalförändring vid hybridiseringen av nämnda viss nukleinsyra. Förfarande enligt krav 1, vari reportergruppen avger en fluorescens-signal. Förfarande enligt krav 1-2, vari SID är en deoxyribonukleinsyra, ett deoxyribonukleinsyraderivat eller en deoxyribonukleinsyra-analog. Förfarande enligt krav 1-2, vari SID är en peptidnukleinsyra (PNA) eller ett peptidnukleinsyra (PNA)-derivat.