SE520150C2 - Förfarande för kvantitativ och kvalitativ bestämning av kemiska substanser vars funktionsprincip grundas på molekylär igenkänning och mätning av den magnetiska permeabiliteten - Google Patents

Description

520 1so~"““_ ' ' n n. 0 Analyser kan göras på analyter (A), vilka har låg magnetisk permeabilitet (ulæl) varvid en analytbindande markör (B) med en tillräckligt stor magnetisk perrneabilitet (ur>>l) tillåts binda (kovalent eller icke-kovalent) till analyten, antigen före eller efter analytens inbindning till igenkänningskomponenten (I), och således inducerar mätbara lokala förändringar av materialkonstanten (ur) beroende på bildandet av ett komplex mellan analyten (kopplad till markören) och igenkänningskomponenten.

Den analytbindande markören (B) innehåller dels ett ferromagnetiskt material (M) och dels en bindande substans (C) som riktas mot en annan epitop på analyten än den igenkänningskomponenten (I) är riktad emot. Se figur lb.

~ Analyser kan göras på analyter (A), vilka har låg magnetisk permeabilitet (ur: 1) varvid en analytliknande markör (E) med en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet (ur>>l) tillåts att vid ett med analyten (A) kompetitivt förfarande binda till igenkänningskomponenten (I) och således inducera mätbara lokala förändringar av materialkonstanten (ur) beroende på bildandet av ett komplex (A-I eller B-l) mellan analyten (A) eller markören (B) och igenkänningskomponenten (I). Den analytliknande markören (B) innehåller dels ett ferromagnetiskt material (M) och dels en substans (D) som är analyt (A) eller en analytliknande substans som kan tävla om inbindingen till igenkänningskomponenten (I). Se ñgur le.

Den magnetiska permeabilíteten för materialet inuti och i närheten av en spole eller ledare påverkar dess induktans. Detta gör att induktansmätningar möjliggör bestämningar av magnetisk perrneabilitet, vilket i vått fall leder till att halten analyt kan kvantifieras. Detta kan göras genom att den magnetiska permeabiliteten mäts på igenkänningskomponenten (eventuellt inklusive matrisen den är immobiliserad till) direkt. Ett mera indirekt tillvägagångssätt innebär en mätning av minskningen i magnetisk penneabilitet i mätlösningen beroende på att en del av analyten eller markören fastnar p g a molekylära igenkänningen på igenkänningskomponenten.

Induktansen för en lång spole bestäms av ekvationen: L=(uA/l) N 2 (generellt inne i spolen) där u betecknar den magnetiska permeabiliteten, l betecknar spolens längd, A betecknar spolens tvärsnittsarea och N är antalet líndade varv på spolen. Således om A, l och N hâlles konstanta, samt om en kontrollerad mängd material befinner sig inne i spolen kan den magnetiska permeabiliteten för detta material bestämmas.

Induktansen kan mätas på flera olika sättlß: * Genom att spolen placeras i en elektrisk mätbrygga, t.ex. en Maxwellbrygga.

* Genom att mäta resonansfrekvensen hos en LC-krets i vilken spolen ingår.

* Genom att applicera en potential puls och mäta strömsvaret.

* Genom att applicera en ström puls eller en icke-konstant ström (där strömförändringen per tidsenhet di/dt hålles konstant) och spänningssvaret studeras.

* Genom induktiv koppling mellan två spolar.

* Genom att mäta spolens impedans. 520 150 Q gj, _' ; ' , L , , _ . . .

Magnetism har använts för speciñk isolering i industriell skala, t.ex. den s.k. HGMS- tekniken (High Gradient Magnetic Separator) som används i samband med stora processer, såsom vattenrening, bearbetning av kaolin m m, samt cell/protein isolering med magnetiskt påverkbara partiklar (t ex av fabrikatet Dynal). Det finns på marknaden även induktiva givare, som bygger på att en spole fångar upp en magnetfältsändring. Dessa induktiva givare reagerar på fysikaliska egenskaper t.ex. att en flottör i en tank förses med en magnet eller ett ferromagnetiskt material. Den induktiva givaren reagerar således på tankens vätskenivå.

Tidigare känt är ett stort antal patentskrifter, vilka innefattar mätningar av magnetiska fält eller magnetisk perineabilitet för bestämning av innehållet av magnetiskt material i ett prov, såsom tex. magnetit i järnmalm, jämoxid i slagg, halten katalytiskt aktivt nickel vid hydrogenering av fett, hårdinetallegerings kontroll, järninnehållet i oljor, detektion av paramagnetiska joner, ferromagnetiska material i cementblandningar, samt magnetiska syrgas analysatorer. Vid dessa bestämningar sker ingen molekylär igenkänning av analyten, vilket bidrar till en oftast låg specificitet och att analysen blir starkt begränsad till ferromagnetiska material. Nämnas kan även följande patentskrifter: Magnetisla aktiva reagentbärare [se patent US 6674l4]: Dessa är användbara för transport av antikroppar, enzymer eller haptener, vid tex. immunoassayer. Skriften berör endast användandet av bäraren såsom ett medel för isolering eller upgrening och det föreslås att detta kan kombineras med andra kemiska analystekniker. Dock berörs överhuvudtaget inte mätningar av den magnetiska permeabiliteten på bärarpartiklarna per se. Det samma gäller en annan patentskrift [se patent JP 62118255 A], där magnetiska partiklar användes på ett dylikt sätt för kemisk analys, varvid själva mätningen sker med hjälp av ljusspridningsfenomen.

Mätning av magetfältsändringgr har rapporterats tidigare bl.a. i kombination med magnetotaktiska bakterier för förutsägelse av hypoxi i vatten [se patent US 7873031: Denna patentskriñ behandlar magnetfâltsmätriingar på magnetiskt anrikade lager av bakterier innehållande magnetiska partiklar. Mängden sådana bakterier i lagret (som bidrager till magnetfaltets styrka) korrelerar till syrgashalten i den omgivande miljön.

Vidare har nyligen ett arbete publicerats beskrivande biomagnetiska neurosensorer4. Även detta arbete bygger på mätningar av magnetfält, som i detta fall beror på jonvandringar (vilka motsvarar en elektrisk ström som ger upphov till ett inducerat magnetfält) i en nerv. således är det fråga om en helt annan typ av detektion, där det inte rör sig om mätningar av en materialkonstant, som i vårt fall. Det bör även påpekas att magnetfälts mätningar är känsliga för störningar av den stora mängd elektroniskt brus som finns runt omkring oss. Vidare kan endast ämnen som påverkar nerven respektive bakterier detekteras och svaret kan vara mycket svårtolkat och komplext.

För att raktiskt exem lifiera det av oss föreslagna n a förfarandet i denna P . p. . ~ Y. patentansökan, redovisar vi nedan resultat från gjorda förstudier.

Ett exempel på en användbar rnarlcör och bestämningen av denna: För att exemplifiera med en möjlig markör valde vi att använda speciella järnoxid-dextran partiklar, vilka uppvisar en stor magnetisk permeabilitet. Partiklarna är dock så små (uppskattningsvis 1-300 nm) att lösningen är kolloid och dextranhöljet (i kombination med att partiklarna har en låg magnetisk rernanens) medverkar till att ingen 520 150 ¿~» aggregering av partiklarna sker. Mätningar av den magnetiska permeabiliteten på lösningar innehållande olika koncentrationer av sådana partiklar utfördes.

Lösningama placerades i en mätspole vars induktans påverkades och i sin tur inverkade på antingen resonansfrekvensen (se figur 2) för en LC-krets i vilken spolen ingick eller på balanseringen (se figur 3), uttryckt som en spänningsskillnad (respons), av en Maxwell brygga i vilken spolen ingick. Av de båda figurerna (2 och 3) framgår att sambandet mellan utsignal (resonansfrekvens ändring i Hz eller spänningsskillnad (respons) i mV) står i ett linjärt samband med halten partiklar i mätlösningen (uttryckt i form av koncentrationen jäm). Detta exempel illustrerar att det är fullt möjligt att använda de beskrivna teknikema, baserade på mätningar av magnetisk permeabilitet, för att bestämma halten markör/analyt vilket är användbart om bestämningar av markörhalts-lanalythalts-minskningen i mätlösningen skall bestämmas.

Exempel på en kemisk analys av en modellanalyt vilken per se har en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet: I detta delförsök valde vi att använda järnoxid-dextran partiklarna såsom en modellanalyt för analyter vilka per se har en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet för att en bestämning, utan markörer, skall vara möjlig.

Concanavalin A valdes som igenkänningskomponent (eftersom den binder till dextran) och immobiliserades till en bärare (sepharos gel / Pharmacia). Efter inkubering i mätlösningar innehållande olika halt av modellanalyt användes Maxwellbrygge- principen, beskriven tidigare, för analys av den magnetiska penneabiliteten hos det bildade komplexet. Av figur 4 framgår att spänningsskillnaden (responsen) (övre kurvan) ökar med ursprungshalten modellanalyt i mätlösningen (uttryckt i form av koncentrationen järn). Då samma försök utfördes på en bärare utan Concanavalin A noterades inga spänningsskillnader (undre kurvan). Detta bestyrker vikten av den molekylära igenkänningen för den kemiska analysen.

Exempel på en kemisk analys av en analyt (glukos), som har låg magnetisk permeabilitet (urr-l). genom ett kompetitivt förfarande mellan analyten och en markör: I detta delförsök visar vi att det är möjligt att kvantitativt och kvalitativt mäta halten av en analyt, som har låg magnetisk perrneabilitet (ul-el). Vi valde som modell att använda glukos som analyt, järnoxid-dextran partiklar (beskrivna ovan) som den kompetitiva markören och Concanavalin-A som igenkänningskomponenten. Concanavalin-A var immobiliserad till en bärare (sepharos gel / Pharmacia). Eftersom glukos och markören (via sin dextran komponent) båda har affinitet för Concanavalin-A tävlade dessa om inbindningen till denna. Vid låga halter eller i frånvaro av glukos binder endast markören till igenkänningskomponenten. Med ökande halt glukos i mätlösningen utgörs en allt mindre andel av de båda inbundna substanserna (glukos respektive markör) till igenkänningskomponenten av markören. Således är det möjligt att på detta sätt bestämma glukos koncentrationen i ett okänt prov. Genom att placera igenkänningskomponenten Concanavalin-A inuti spolen kunde mängden inbunden markör detekteras för olika glukoskoncentrationer. Resultatet finns avbildat i figur 5.

Av denna kalibreringskurva för glukosanalys framgår att spänningsskillnaden hos Maxwellbryggan, kompenserad för maximal inbindning av markör, (responsförändring) står i samband med glukoshalten i mätlösningen (övre kurvan).

Kontrollförsöket utan igenkänningskomponent bekräftar att frånvaron av molelcylär igenkänning medför att detta samband uteblir (undre kurvan). Vi lyckades även att utföra mätningar på glukos med igenkännigkomponenten immobiliserad inuti spolen, varvid alltså en kemisk (bio)senor för glukos demonstrerades. 520 2 LITTERATUR REFEREiNSEilš i 150 112* 5 ,¥' .' --r_.-'-V ¿'I 1. E. Dj urle, Electricitetslära, Teknisk Högskolelitteratur i Stockholm AB, 1983 2. D. Kriz, Towards chemical sensors, Lund 1994 3. L. Grahm, H.-G. J ubrink och A. Lauber, Elektrisk mätteknik 1 & 2, Bokförlaget teknikinforxnation, Lund och Linköping 1992. 4. Christopher W. Babb, David R. Coon, Garry A. Rechnitz, Anal. Chem., 1995, 67, 763-769. ' .i = ~“ c=' l ' 520150 gi :a 'f ' y :ax fl i g ;:*' .. 25 .i t 3 F IGURTEXTER Figur 1. Tre olika varianter (a, b och c) av ett mättörfarande byggande på kombinationen molekylär igenkánning och mätning av magnetisk pezmeabilitet.

Figur 2. Resonansfrekvensmâtningar på mâtlösningar innehållande olika halt järnoxid-dextran partiklar (markör).

Figur 3. Maxwellbryggemätningar på mätlösningar innehållande olika halt järnoxid-dextran partiklar (markör).

Figur 4. Maxwellbryggemâtningar på concanawalin-A sepharose (igenkänningskomponent-bärare) som har inkuberats i mâtlösningar innehållande olika halt jämoxid-dextran partiklar (modellanalyt).

Figur 5. Maxwellbryggemätningar på concanaxalin-A . sepharose (igenkänningskomponent-bärare) som har inkuberats i mâtlösningar innehållande olika halt glukos (modellanalyt) och konstant halt järnoxid-dextran partiklar (rnarkör), och där en kompetitiv inbindning har skett.

Claims (10)

10 l5 20 25 30 35 520 150 7 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för kvantitativ och kvalitativ bestäm- ning av kemiska substanser (analyter) k ä n n e - t e c k n a t av att funktionsprincipen dels grundas på mätning av magnetisk permeabilitet med hjälp av en spole innehållande sagda substans dels även på användandet av en eller flera igenkänningskomponenter, vilka ansvarar för den specifika molekylära identifieringen av analyten genom olika typer av interaktioner både kovalenta men även icke-kovalenta såsom t ex elektrostatiska, hydro- foba, vätebindningar och van der Waals.

2. Förfarande enligt krav 1 samt även k ä n n e - t e c k n a t av att analyten per se har tillräckligt (pr>>l) förändring av materialkonstanten (pr) hos komplexet stor magnetisk permeabilitet så att en måtbar mellan analyten och igenkänningskomponenten sker vid in- bindning.

3. Förfarande enligt krav 1 samt även k ä n n e - t e c k n a t av att analyten har låg magnetisk per- meabilitet (pfßl) varvid en analytbindande markör med en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet (pr>>l) tilläts binda (kovalent eller icke-kovalent) till analyten, antingen före eller efter analytens inbindning till igen- känningskomponenten, och således inducerar mätbara för- ändringar av materialkonstanten (pr) hos komplexet mellan analyten (kopplad till markören) och igenkänningskompo- nenten.

4. Förfarande enligt krav l samt även k ä n n e - t e c k n a t av att analyten har låg magnetisk permea- bilitet (pfwl) varvid en analytliknande markör med en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet (pr>>l) tillåts att vid ett med analyten kompetitivt förfarande binda till igenkänningskomponenten och således inducera mätbara förändringar av materialkonstanten (pr) hos komplexet mellan analyten eller markören och igenkänningskomponen- ten. lO 15 20 25 30 35 520 150 8

5. Förfarande enligt endera av kraven 1-4 samt även k ä n n e t e c k n a t av att mätbara förändringar av materialkonstanten (ur) hos själva mätlösningen, efter inkubering med igenkänningskomponenten och efterföljande separation av densamma, användes för den kvalitativa och kvantitativa bestämningen av analyten.

6. Förfarande enligt endera av kraven 3-5 samt även k ä n n e t e c k n a t av att markörsubstanserna erhål- ler en tillräckligt stor magnetisk permeabilitet (ur>>1) p g a att de innehåller material med stor magnetisk per- meabilitet såsom övergångselement och faser av dessa: järn, nickel, kobolt, gadolium och mangan, samt kemiska föreningar eller legeringar eller halvledare, innehållan- k ä n n e t e c k n a s markörsubstan- de dessa. Vidare serna, i de fall de är analytbindande, att de innehåller igenkänningskomponenten som binder (kovalent eller icke- kovalent) till en annan epitop på analyten än igenkän- ningskomponenten beskriven i krav 1-5, och i de fall de är analytliknande, att de innehåller kovalent eller icke- kovalent bunden analyt eller annan substans som till sin form och placering av funktionella grupper efterliknar analyten och således kan binda in till igenkänningskompo- nenten beskriven i krav 1-5.

7. Förfarande enligt endera av kraven 1-6 samt även k ä n n e t e c k n a t av att mätningarna av den magne- tiska permeabiliteten sker genom mätning av sagda spoles induktans med en elektrisk mätbrygga (t ex Maxwell) eller med hjälp av resonansfrekvensen hos en LC-krets i vilken spolen ingår eller med hjälp av potential/ström pulser eller med metoder där potential/ström derivatan med av- seende på tiden är konstant eller med impedansmätningar eller mätningar grundade på induktiv koppling.

8. Anordning vars funktionsprincip grundas på endera av kraven 1-7 och som även k ä n n e t e c k n a s av att mätningen av den magnetiska permeabiliteten och igen- känningskomponenten är fysiskt integrerade varvid anord- lO l5 20 520 150 9 ningen är en kemisk sensor eller biosensor i de fall igenkånningskomponenten har ett biologiskt ursprung.

9. Anordning vars funktionsprincip grundas på endera av kraven l-7 och som även k ä n n e t e c k n a s av att mätningen av den magnetiska permeabiliteten och igen- känningskomponenten är fysiskt separerade eller integre- rade i ett flödessystem där analyt injiceras, varvid an- ordningen är ett kemiskt flödesinjektions-analyssystem (FIA, Flow-injection analyses).

10. Anordning vars funktionsprincip grundas på endera av kraven l-9 och som även k ä n n e t e c k - n a s av att den är avsedd för klinisk diagnostik (för t ex proteiner, virus, HIV, bakterier, fager, svampar, hormoner, antigen, antikroppar, cancermarkörer och andra sjukdomsmarkörer, metaboliter, glukos, gifter, presta- tionshöjande medel och droger) i olika typer av kropps- vätskor (såsom helblod, plasma, serum, saliv, urin, svett, tårar, våvnadsextrakt och fecesextrakt) eller för industriell analys eller för tillämpningar inom jord- bruksteknik/veterinärmedicin eller för militära försvars ändamål eller som del av medicinska anordningar eller för miljöövervakande applikationer eller för tillämpningar inom robotik.