SE503225C2 - Virus-antikroppskomplex för införing av virus i mammalieceller - Google Patents

Description

503 225 10 15 20 25 30 35 2 antigen förmågan att mediera inträngning av en virusvektor eller infektiös virus i cellen.

Antikroppen kan endera vara en monoklonal antikropp eller ett fragment av en hel antikropp.

Antikroppen kan bindas till viruset på olika sätt, såsom genom kemisk konjugering, genom bindning av anti- kroppen till viruset via ett immunokemiskt reagens eller genom användning av en bifunktionell antikropp, som binder såväl till viruset som till ett cellulärt antigen.

Antikroppen kan även uttryckas pà virusets ythölje efter kloning i virusets genom av gen eller gener för hela antikroppen eller fragment därav.

Inaktiveringen av den virala cellreceptorn i enlighet med föreliggande uppfinning kan ske på kemisk väg, medelst en specifik antikropp eller genom teknisk genmanipulation av det virala genomet. Genen för den virala cellreceptorn eller delar därav kan sålunda ersättas med antikropps- gener.

Komplexet enligt föreliggande uppfinning är avsett för medicinsk användning. Komplexet kan sålunda användas som vektor för introduktion av gener i celler eller organ för specifika terapeutiska ändamål. Komplexet kan även an- vändas för att uttrycka virala antigener på cellytan för sådana ändamål eller det kan användas för att åstadkomma en infektion i celler bärande det antigen, mot vilket an- tikroppen är reaktiv.

Genom användning av en antikropp som binder till ett cellulärt membranantigen som kan internaliseras i cellen kan virus bindas till cellen via en antikropp-antigenreak- tion och sedan penetrera in i cellen och replikera föror- sakande en viral infektion. Vidare kan eftersom antigener är kända, vilka är mer eller mindre unika för vissa typer av celler, virus selektivt riktas för att tränga in i och infektera specifika celler i kroppen. Exempel på sådana antigener är vissa celldifferentierande antigener, såsom CDl9 på B-celler och vissa tumörassocierade antigener på carcinomceller. 10 15 20 25 30 35< 503 225 3 Uppfinningen gör det därför möjligt att rikta virus- vektorer eller infektiösa virus till specifika celler i kroppen med möjlighet att introducera funtkionella gener i utvalda celler eller organ in vivo eller för att åstadkom- ma en viral infektion i vissa celler.

Följande tabell visar exempel pá virala receptorer och deras cellulära ligander. Receptorer såsom dessa är' tänkbara kandidater för användning inom ramen för förelig- gande uppfinning.

TABELL 1 Vissa virala receptorer och deras cellulära ligander.

Virus Cellulär ligand Distribution Viral receptor Epstein- CD2l B-celler gp350/220 Barr Influen- Sialylglykolipid Många cell- Hemagglutinin sa A eller Sialylgly- typer Q koprotein inne- hållande 4 NeuAc2-3Gal-R Para- Kolhydrater inne- Många cell- HN, H och G myxovirus hållande sialin- typer prot syra Retrovirus Protein Många cell- SU-protein typer När virus replikerar i cellen nedrytes vissa virala proteiner till peptider. Dessa peptider är bundna till s.k. MHC-antigener inne i cellen och transporteras där- efter till cellmembranet, där peptid-MHC-komplexet tjänar som máltavla för ett mycket väsentligt försvarssystem, dvs virusspecifika cytotoxiska T-celler, vilka i själva verket dödar den virusinfekterade cellen. Vissa virus, exempelvis retrovirus, integreras i värdcellens genom i form av pro- virus som därefter kan replikeras. Retrovirus kan manipu- 503 225 10 15 20 25 30 35 4 leras genom metoder med "genetic engineering", så att de ej längre replikerar men kan användas som vektorer för introduktion av nya gener i mammalieceller. Användningen av retrovirala vektorer erbjuder ett praktiskt verktyg för genterapi i människor. För närvarande är emellertid an- vändningen av retrovirala vektorer i stor utsträckning be- gränsad till celler av hemopoietiskt ursprung.

Det finns ett flertal tekniska vägar genom vilka den cellbildande receptorn i ett virus kan ersättas med en an- tikropp. Sådana principiella vägar är uppställda nedan och illustreras pà bilagda ritningar, nämligen Figurerna 1 till 3. 1. Den virala receptorn kan blockeras med en anti- kropp, som i sin tur kan konjugeras med en antikropp av önskad specificitet. 2. Den virala receptorn kan inaktiveras genom kemiska eller gentekniska förfaranden och den ersättande antikrop- pen kan sedan kemiskt kopplas direkt till viruspartikeln. 3. Genen för den virala receptorn kan ersättas med gener för den ersättande antikroppen.

De möjligheter som föreliggande uppfinning erbjuder är många. Ett omrâde är genterapi pà människor, där retro- virala vektorer redan använts för att introducera gener i 'humana celler för terapeutiska ändamål. Föreliggande upp- finning kan förväntas förhöja effektiviteten av denna tek- nik, ävensom möjliggöra nya användningsområden, såsom av- siktlig introduktion av gener i tumörceller.

Ett annat område är immunoterapi av tumörsjukdomar, där uppfinningen kan användas för genterapi eller för att introducera virus i tumörceller med avsikten att uttrycka virala antigener vid cellytan så att cellerna omvandlas till tänkbara màltavlor för de virusspecifika cytotoxiska T-cellerna.

Uppfinningen kommer att illustreras ytterligare i det följande genom konkreta exempel, vilka ej avser att in- skränka uppfinningens omfattning pà annat sätt än som definieras genom bilagda patentkrav. 10 15 20 25 30 35 505 225 EXEMPEL 1 Följande exempel visar att bindningsspecificiteten för ett virus kan blockeras och ersättas med den för en antikropp. I exemplen användes bindningen och infektionen av influensavirus A/PR/8 till humana koloncarcinomceller Colo 205. Cellbindningen för influensavirus är beroende av en specifik bindningsmolekyl, Hemagglutinin (HA), som är närvarande i det virala höljet och som binder till NeuAc2- 3Gal-R närvarande pà manga mammalieceller.

I detta exempel användes följande strategi. 1. Bindningen av A/PR/8 till málcellen blockerades medelst den monoklonala antikroppen HK-PEG-1 mot influensa HA (Koprowski H, Gerhard W och Croce CM: Production of an- tibodies against influenza virus by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells. Proc.Nat1.

Acad.Sci USA, Vol. 74, pp 2985-2988, 1977). Cellinjen pro- ducerande denna antikropp kan erhållas frán the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA: 2. En ny bindningsspecificitet pàfördes viruset genom en annan antikropp som kemiskt konjugerats till HK-PEG-1- antikroppen som användes för att blockera virusets natur- liga cellbindning. Antikroppen OKT9 (US-patentet 4,364,934) som reagerar med transferrinreceptorn pá proli- ferande mammalieceller användes för detta ändamål. En an- tikropp mot transferrinreceptorn användes pá grund av att transferrinreceptorn snabbt och konstitutionellt interna- liseras av cellerna jämte en antikropp som omsatts med receptorn (Schwartz AL: Cell Biology of Intracellular Protein Trafficking, Ann.Rev.Immunol., Vol 8, pp 195-229, 1990). Cellinjen som producerar OKT9-antikroppen kan er- hàllas från the American Type Culture Collection.

Den förväntade duala effekten pà virusbindningen av antikroppskonjugatet som användes visas schematiskt i Fig. 4 av ritningarna. 503 225 10 15 20 25 30 35 EXEMPEL 2 Influensa A/PR/8 erhölls från Statens Bakteriologiska Laboratorium, S-10521 Stockholm, Sverige.

HK-PEG-1 och OKT9-antikropp Hybridomceller erhölls frán the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. Hybrodimceller odlades i Iscoves medium supp- lemeterat med 10% fetalt kalvserum. Antikroppsproduktion utfördes i dialysrör (Sjögren-Jansson E och Jeansson S: Large-Scale Production of Monoclonal Antibodies in Dia- lysis Tubin, J.Immunol.Meth., Vol 84, pp 359-364, 1985) och antikroppar renades genom affinitetskromatografi pà ett Protein A-Sepharos CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sverige) (Ey PL, Prowse SJ och Jenkin CR: Isolation of pure IgGl, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using Protein A-Sepharose. Immunochemistry Vol 15, pp 429-436, 1978).

Antikroppskonjugat: Antikroppskonjugat framställdes under användning av det heterobifunktionella reagenset N-succinimidyl (2- pyridylditio)-propionat, SPDP (Pharmacia, Uppsala, Sverige) (Carlsson J, Drevin H och Axén R: Protein thiola- tion and reversible protein protein conjugation. N-succi- nimidyl 3(2 pyridy1dithio)propionate - a new heterobifunc- tional reagent. Biochem.J., Vol 173, pp 723-737, 1978).

Konjugaten renades från oreagerad antikropp genom gelfil- trering pà Superdex 200 (Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Titreringgav virus_ggnom Hemagglutination: Hemagglutination av röda blodkroppar av human blod- grupp 0 utfördes 96-brunnars tràg under användning av standardmetoder (Mahy BWJ, ed: Virology, a practical ap- proach. IRL Press, Oxford, 1985). 10 15 20 25 30 35 5,03 225 7 Colo 205 koloncarcinomceller erhölls frán the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, och innehölls i Iscoves medium med 10% fetalt kalvserum.

Resultat Inhibering av viral bindning genom HK-PEG-1-antikropp och HK-PEG-l-konjugat Inhibering av viral bindning till dess cellulära li- gand uppmättes genom hemagglutinationsmetoden. Virus, 800 HAU (HemAgglutinating Units)/ml inkuberades i 1 timme vid rumstemperatur med antikropp vid olika koncentrationer och tilläts sedan agglutinera humana röda blodkroppar;'HK-PEG- 1-antikropp medförde fullständig inhibering av agglutina- tion vid 7pg/ml eller mer, medan motsvarande siffra för HK-PEG-1 konjugerade till OKTQ var 10pg/ml.

Förm§ga_för HK-PEG-1-koniugat att mediera viral infektion HK-PEG-1 eller HK-PEG-1-konjugerad till OKT9 inkube- rades med 100 HAU av A/PR/8-virus i 1 timme vid rumstempe- ratur för att blockera HA-molekylerna i det virala höljet.

Därefter inkuberades virusberedningarna tillsammans med 2x1o6 com 205-celler 1 1 m1 Pas 1 1 timme vid 37°C. cel- lerna tvättades tre gånger med PBS genom centrifugering, suspenderades i l ml komplett medium och inkuberades vid 37°C i 24 timmar. Närvaro av virus i mediet bestämdes ge- nom hemagglutination. Resultaten visas i Tabell 2 nedan.

Det är uppenbart, att konjugationen av OKT9 till HK-PEG-1 tillåter viruset att infektera cellerna genom att ge viru- set ett nytt bindställe i cellmembranet så att därigenom undvikes den inhibition som förorsakas av enbart HK-PEG-l- antikroppen. Den minskande infektiviteten med stigande an- tikroppskoncentration är förmodligen en effekt av bild- ningen av stora virus-antikroppskomplex, eftersom sådana komplex tas mindre effektivt upp i cellen. 503 225 10 15 20 25 30 35 TABELL 2 Produktion av virus uppmätt genom hemagglutination genom Colo 205-celler infekterade med Influensa A/PR/8 förbe- handlad med olika antikroppar.

Antikropp Koncentration (gg/ml) HA-titer Ingen 1/16 HK-PEG-1 30 Negativ (<1/2) HK-PEG-1 100 Negativ (<1/2) HK-PEG-1 300 Negativ (<1/2) HK-PEG-1/OKT9 30 1/8 HK-PsG-l /ox'r9 100 1/4 HK-PEG-1/OKT9 300 1/2

Claims (14)

10 15 20 25 30 35 503 225 9 PATENTKRAV

1. Komplex mellan ett virus, som har förmåga att intränga i mammalieceller efter bindning mellan ett viralt adsorptionsprotein och en kemisk struktur eller ligand i cellmembranet, men vars virala adsorptionsprotein inakti- verats, och en antikropp, vilken har förmåga att inter- agera med ett specifikt antigen på ytan av en mammalie- cell, vilket antigen skiljer sig från det virala adsorp- tionsproteinet som i annat fall skulle mediera bindning av viruset till cellytan, och vilket har förmåga att mediera inträngning av en virusvektor eller infektiöst virus i mammalieceller.

2. Komplex enligt patentkravet 1, vari antikroppen är en monoklonal antikropp.

3. Komplex enligt patentkravet 1, vari antikroppen är ett fragment av en hel antikropp, vare sig den framställts på kemisk väg eller genom expression av antikroppsgener eller DNA-sekvenser innehållande information härledd från antikroppsgener. enligt något av de föregående patentkra- viruset genom kemisk

4. Komplex ven, vari antikroppen är bunden till konjugering.

5. Komplex enligt något av ven, vari antikroppen är bunden till viruset via ett im- såsom en anti-species-antikropp, de föregående patentkra- munokemiskt reagens, avidin eller streptavidin.

6. Komplex enligt något av de föregående patentkra- ven, vari antikroppen är en bifunktionell antikropp bin- dande till såväl ett virus som till ett cellulärt antigen.

7. Komplex enligt något av patentkraven 1 till 3, vari antibindningsställe eller -ställen är uttryckta på den virala ytan efter kloning av antikroppsgen eller -sekvenser kodande för en an- -ge- ner eller DNA-sekvens eller tikroppsbindande struktur eller strukturer i det virala genomet. 503 225 10 15 20 25 30 35 10

8. Komplex enligt något av patentkraven 1 till 3, vari antikroppen är reaktivt med ett cellulärt antigen med förmåga att mediera inträngning av ett virus i en cell.

9. Komplex enligt något av de föregående patentkra- ven, vari det virala adsorptionsproteinet inaktiverats på kemisk väg, medelst en specifik antikropp eller genom gen- teknologisk manipulation av det virala genomet.

10. Komplex enligt något av patentkravet l till 8, vari genen för det virala adsorptionsproteinet eller delar därav ersatts med antikroppsgener.

11. ll. Komplex enligt något av de föregående patentkra- ven för medicinsk användning.

12. Komplex enligt patentkravet 11 för användning som vektor för introduktion av gener i celler eller organ för terapeutiska ändamål.

13. Komplex enligt patentkravet 12 för användning för att uttrycka virala antigener på cellytan för terapeutiska ändamål.

14. Komplex enligt patentkravet 12 för användning för terapeutiska ändamål för att förorsaka en infektion i cel- ler bärande det antigen, mot vilket antikroppen är reak- tiv.