RU2825838C1

RU2825838C1 - Биспецифичное антитело против pd-l1/против 4-1вв в гетеродимерной форме, подобное по структуре природному антителу, и его получение

Info

Publication number: RU2825838C1
Application number: RU2023118835A
Authority: RU
Inventors: Цзяван ЛЮ; Япин ЯН; Сыци ЧЖАО; Ян Лю; Нанмэн СУН; Фэй ФАНЬ; Кайсюань СУ; Ланьсинь ЧЖАН; Цзин Ван; Цзянчэн СЮЙ; Кён У ЛИ
Original assignee: Бейджин Ханми Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2024-09-02

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено биспецифичное антитело, способное одновременно связываться с PD-L1 и 4-1BB, в гетеродимерной форме, подобное по структуре природному антителу. Также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий указанное антитело. Кроме того, изобретение относится к применению биспецифичного антитела для лечения опухоли, экспрессирующей PD-L1. Предложенное биспецифичное антитело является более эффективным в лечении опухолевых заболеваний и имеет меньше побочных эффектов. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 14 ил., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биспецифичному антителу против PD-L1/против 4-1ВВ в форме гетеродимера, подобного по структуре природному антителу, и к его получению. В частности, согласно настоящему изобретению предложено биспецифичное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ в форме высокостабильного гетеродимера с характеристиками природных IgG без несоответствий тяжелой и легкой цепи, а также способ его получения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лиганд-1 программируемой смерти (PD-L1) представляет собой лиганд рецептора-1 программируемой смерти иммунологической контрольной точки (программируемая смерть-1, PD-1). PD-L1 принадлежит к семейству В7 и экспрессируется индуцибельным способом на поверхности множества иммунных клеток, включая Т-клетки, В-клетки, моноциты, макрофаги, DC-клетки, эндотелиальные клетки, эпидермальные клетки и т.д. После связывания с PD-1 PD-L1, главным образом, участвует в негативной регуляции активации Т-клеток, и он способен регулировать силу и продолжительность иммунного ответа. Помимо действия в качестве лиганда PD-1, PD-L1 также может действовать в качестве лиганда CD80 для доставки негативных регуляторных сигналов к Т-клеткам и для индукции иммунологической толерантности Т-клеток (Autoimmun Rev, 2013, 12(11): 1091-1100.; Front Immunol, 2013, 4: 481.; Nat Rev Cancer, 2012, 12(4): 252-264.; Trends Mol Med. 2015 Jan; 21(1):24-33.; Clin Cancer Res. 2012 Dec 15; 18(24):6580-7.). Обычно PD-L1 и PD-1 могут опосредовать и поддерживать аутоиммунную толерантность организма, предупреждать избыточную активацию иммунной системы от поражения ее собственных тканей во время воспалительной реакции и, таким образом, играть положительную роль в предупреждении появления аутоиммунного заболевания. При патологических условиях PD-L1 и PD-1 участвуют в иммунитете опухоли, а также в появлении и развитии разных аутоиммунных заболеваний. В нескольких исследованиях сообщали о том, что PD-L1 сильно экспрессируется в целом ряде опухолевых тканях, PD-1 сильно экспрессируется в инфильтрующих опухоль лимфоцитах, и сверхэкспрессии PD-L1 и PD-1 тесно связаны с плохим клиническим прогнозом опухолей (Anticancer Agents Med Chem. 2015;15(3):307-13.; Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2014 Mar;7(l):l-17.; Trends Mol Med. 2015 Jan;21(l):24-33.; Immunity. 2013 Jul 25;39(l):61-73. J Clin Oncol. 2015 Jun 10; 33(17): 1974-82.). Блокирование взаимодействий PD-L1/PD-1 и CD80/PD-L1 моноклональным антителом против PD-L1 показало хорошие противоопухолевые эффекты и в доклинических экспериментальных исследованиях, и в клинических испытаниях. В настоящее время моноклональное антитело против PD-L1 одобрено для лечения разных опухолей, таких как немелкоклеточный рак легкого и уротелиальная карцинома.

4-1ВВ (также известный как CD 137, TNFRSF9 и т.д.) представляет собой транс мембранный белок надсемейства рецептора фактора некроза опухолей (TNFRSF). 4-1ВВ экспрессируется на DC (дендритные клетки), активированных моноцитах, NK-клетках (природные киллеры), нейтрофилах, эозинофилах и тучных клетках. 4-1BBL (CD137L) представляет собой гликопротеин - член надсемейства TNF и, главным образом, экспрессируется на активированных В-клетках, макрофагах, дендритных клетках и миелоидных клетках. 4-1ВВ представляет собой костимулирующую молекулу на Т-клетках CD8⁺и CD4⁺, регуляторных Т-клетках (Treg), Т-клетках -природных киллерах (МК-(Т)клетки), В-клетках и нейтрофилах. Связывание 4-1ВВ с 4-1BBL активирует пути внутриклеточной сигнализации. Исследования продемонстрировали то, что во многих моделях некоторые mAb (моноклональное антитело), агонистические в отношении 4-1ВВ, увеличивают экспрессию костимулирующих молекул и значимо усиливают ответ цитолитических Т-лимфоцитов, приводя к противоопухолевой эффективности.

Следовательно, в настоящей области все еще существует потребность в разработке нового терапевтического лекарственного средства, которое одновременно связывается с PD-L1 и 4-1ВВ.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложено новое бифункциональное антитело в форме высокостабильного гетеродимера с характеристиками природных IgG и без несоответствий тяжелой и легкой цепи, способное к одновременному связыванию с PD-L1 и 4-1ВВ, и способ его получения. Данное бифункциональное антитело имеет тенденцию к одновременному связыванию с опухолевыми клетками, сильно экспрессирующими PD-L1, и с Т-клеткой, экспрессирующей 4-1ВВ, и, таким образом, оказывает эффективные и специфичные эффекты умерщвления с меньшими токсичностью и побочными эффектами.

Один аспект настоящего изобретения относится к биспецифичному антителу, содержащему первую антигенсвязывающую функциональную область, которая специфично связывается с PD-L1, и вторую антигенсвязывающую функциональную область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, где первая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с PD-L1, содержит следующее:

(А) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая

(а) HCDR1 (определяющая комплементарность область 1 тяжелой цепи), которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15,

(б) HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, и

(в) HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 17; и

(Б) вариабельная область легкой цепи, содержащая

(а) LCDR1 (определяющая комплементарность область 1 легкой цепи), которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 18,

(б) LCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 19, и

(в) LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20.

В некоторых воплощениях вторая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит следующее:

(а) HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 21,

(б) HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 22, и

(в) HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 23; и

(а) LCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 24,

(б) LCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 25, и

(в) LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 26.

В некоторых воплощениях первая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела, которая специфично связывается с PD-L1, содержит следующее:

(а) HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15,

(а) LCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 18,

(в) LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20; и

вторая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит следующее:

Данные шесть CDR первой антигенсвязывающей функциональной области, которая специфично связывается с PD-L1, как изложено в SEQ ID NO: 15-20, и данные шесть CDR второй антигенсвязывающей функциональной области, которая специфично связывается с 4-1ВВ, как изложено в SEQ ID NO: 21-26, представляют собой CDR вариабельных областей тяжелой и легкой цепи моноклональных антител, полученных авторами данного изобретения с использованием технологии гибридомы с использованием человеческих PD-L1 и 4-1ВВ в качестве антигенов. Указанные моноклональные антитела отличаются от антител против PD-L1 и антител против 4-1ВВ, известных в предшествующем уровне техники, и имеют более высокие биологические активности, такие как большая специфичность связывания, противоопухолевая активность и так далее.

Данные шесть последовательностей CDR первой антигенсвязывающей функциональной области, которая специфично связывается с PD-L1, могут иметь по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную или большую идентичность с последовательностями, изложенными в SEQ ID NO: 15-20, соответственно, и сохраняют биологические активности соответствующих родительских последовательностей; или могут содержать одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3 или более чем 3 делеции, замены и/или присоединения аминокислот по сравнению с последовательностями, изложенными в SEQ ID NO: 15-20, соответственно, и сохраняют биологические активности соответствующих родительских последовательностей.

Данные шесть последовательностей CDR второй антигенсвязывающей функциональной области, которая специфично связывается с 4-1ВВ, могут иметь по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную или большую идентичность с последовательностями, изложенными в SEQ ID NO: 21-26, соответственно, и сохраняют биологические активности соответствующих родительских последовательностей; или могут содержать одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3 или более чем 3 делеции, замены и/или присоединения аминокислот по сравнению с последовательностями, изложенными в SEQ ID NO: 21-26, соответственно, и сохраняют биологические активности соответствующих родительских последовательностей.

В некоторых воплощениях первая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела, которая специфично связывается с PD-L1, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где данная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, или имеет по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или большую идентичность с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 6, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; или содержит одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или больше, чем 20 делеций, замен и/или присоединений аминокислот по сравнению с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 6, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; и данная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, или имеет по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или большую идентичность с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; или содержит одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или больше, чем 20 делеций, замен и/или присоединений аминокислот по сравнению с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности.

В некоторых воплощениях вторая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где данная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, или имеет по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или большую идентичность с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 12, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; или содержит одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или больше, чем 20 делеций, замен и/или присоединений аминокислот по сравнению с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 12, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; и данная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10, или имеет по меньшей мере 70%-ную, как, например, по меньшей мере 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или большую идентичность с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности; или содержит одну или более чем одну, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или больше, чем 20 делеций, замен и/или присоединений аминокислот по сравнению с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10, и сохраняет биологические активности соответствующей родительской последовательности.

В некоторых воплощениях первая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела, которая специфично связывается с PD-L1, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где данная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, и данная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2; и вторая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где данная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, и данная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10.

Специалисты в данной области знали бы, что комбинации аминокислотных последовательностей должны следовать биологическим законам, т.е. легкие и тяжелые цепи вариабельных областей, их антигенсвязывающие фрагменты, такие как SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 2, и SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 10 должны соответствовать друг другу.

В некоторых воплощениях первая антигенсвязывающая функциональная область и вторая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела выбраны из группы, состоящей из фрагментов Fab, фрагментов scFv и вариабельных доменов фрагментов Fv.

В некоторых воплощениях и первая антигенсвязывающая функциональная область, и вторая антигенсвязывающая функциональная область биспецифичного антитела представляют собой фрагменты Fab.

В некоторых воплощениях фрагмент Fab биспецифичного антитела содержит отличную первую вариабельную область тяжелой цепи и отличную вторую вариабельную область тяжелой цепи, а также отличную первую вариабельную область легкой цепи и отличную вторую вариабельную область легкой цепи.

В некоторых воплощениях одна из первой антигенсвязывающей функциональной области и второй антигенсвязывающей функциональной области биспецифичного антитела представляет собой фрагмент Fab, а другая представляет собой scFv.

В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит первую цепь Fc и вторую цепь Fc, и первую антигенсвязывающую функциональную область, способную к специфичному связыванию с PD-L1, и вторую антигенсвязывающую функциональную область, способную к специфичному связыванию с 4-1ВВ,

где и первая цепь Fc, и вторая цепь Fc представляют собой фрагменты Fc иммуноглобулина G, содержащие аминокислотные замены, и первая цепь Fc, и вторая цепь Fc совместно составляют гетеродимер, который может связываться с рецептором Fc;

где первая цепь Fc и вторая цепь Fc связываются с первой антигенсвязывающей функциональной областью и второй антигенсвязывающей функциональной областью, соответственно, посредством ковалентной связи или линкера; и

где либо первая цепь Fc, либо вторая цепь Fc содержат аминокислотные замены в положениях 366 и 399, а другая содержит аминокислотные замены в положениях 351, 407 и 409, где данные положения аминокислот пронумерованы согласно системе нумерации индекса EU Kabat.

В некоторых воплощениях аминокислотные замены первой цепи Fc и второй цепи Fc биспецифичного антитела являются следующими:

a) L351G, L351Y, L351V, L351P, L351D, L351E, L351К или L351W;

б) T366L, Т366Р, T366W или T366V;

в) D399C, D399N, D399I, D399G, D399R, D399T или D399A;

г) Y407L, Y407A, Y407P, Y407F, Y407T или Y407H и

д) К409С, К409Р, K409S, K409F, K409V, K409Q или K409R.

В некоторых воплощениях аминокислотные замены биспецифичного антитела включают следующие:

а) замены T366L и D399R либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L35 IE, Y407L и K409V на другой;

б) замены T366L и D399C либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351G, Y407L и К409С на другой;

в) замены T366L и D399C либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351Y, Y407A и К409С на другой;

г) замены Т366Р и D399N либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351V, Y407P и K409S на другой;

д) замены T366W и D399G либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351D, Y407P и K409S на другой;

е) замены Т366Р и D399I либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351P, Y407F и K409F на другой;

ж) замены T366V и D399T либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L35 IK, Y407T и K409Q на другой;

з) замены T366L и D399A либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351W, Y407H и K409R на другой.

В некоторых воплощениях аминокислотные замены биспецифичного антитела включают:

а) замены T366L и K409V либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L35 IE, Y407L и D399R на другой;

б) замены T366L и К409С либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351G, Y407L и D399C на другой;

в) замены T366L и К409Р либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351Y, Y407A и D399C на другой;

г) замены Т366Р и K409S либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351V, Y407P и D399N на другой;

д) замены T366W и K409S либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L35 ID, Y407P и D399G на другой;

е) замены Т366Р и K409F либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351P, Y407F и D399I на другой;

ж) замены T366V и K409Q либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L35 IK, Y407T и D399T на другой;

з) замены T366L и K409R либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc, и замены L351W, Y407H и D399A на другой.

В некоторых воплощениях замены либо на первой цепи Fc, либо на второй цепи Fc биспецифичного антитела представляют собой T366L и D399R, а замены на другой представляют собой L351E, Y407L и K409V.

В некоторых воплощениях массовые отношения гомодимеров, образованных первой цепью Fc и ковалентно связанной с ней первой антигенсвязывающей функциональной областью, и второй цепью Fc и ковалентно связанной с ней второй антигенсвязывающей функциональной областью указанного биспецифичного антитела составляют меньше чем 50%, как, например, меньше чем 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или меньше от общего количества всех полипептидных цепей в растворе, содержащем восстановитель, в котором не присутствуют другие полипептиды, за исключением указанных цепей Fc и упомянутых здесь выше антигенсвязывающих функциональных областей.

В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит пару первой тяжелой цепи/первой легкой цепи, которая специфично связывается с PD-L1, где данная первая тяжелая цепь имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8; данная первая легкая цепь имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит пару второй тяжелой цепи/второй легкой цепи, которая специфично связывается с 4-1ВВ, где данная вторая тяжелая цепь имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, и

константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 14; данная вторая легкая цепь имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.

Второй аспект настоящего изобретения относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему биспецифичное антитело в гетеродимерной форме, как описано выше.

В некоторых воплощениях нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности первой антигенсвязывающей функциональной области, содержат нуклеотидные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1 и 5.

В некоторых воплощениях нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности второй антигенсвязывающей функциональной области, содержат нуклеотидные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 11 и 9.

В некоторых воплощениях обе нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности первой легкой цепи и второй легкой цепи, содержат нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность либо первой тяжелой цепи, либо второй тяжелой цепи, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7, а нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность другой тяжелой цепи, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 13.

Третий аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному экспрессионному вектору, содержащему выделенный полинуклеотид, как описано выше.

В некоторых воплощениях данный экспрессионный вектор представляет собой плазмидный вектор X0GC, модифицированный из вектора pCDNA.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей выделенный полинуклеотид, как описано выше, или рекомбинантный экспрессионный вектор, как описано выше.

В некоторых воплощениях данная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток человеческой эмбриональной почки HEK293 или HEK293Т, HEK293Е, HEK293F, которые модифицированы из клеток HEK293; клеток яичника китайского хомячка СНО или CHO-S, CHO-dhfr", CHO/DG44, ExpiCHO, которые модифицированы из клеток СНО; Escherichia coli или Е. coli BL21, BL21(DE3), Rosetta, Origami, которые модифицированы из Е. coli; дрожжей или Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, которые модифицированы из дрожжей; клеток насекомых или клеток High5, SF9, которые модифицированы из клеток насекомых; растительных клеток; клеток молочной железы млекопитающих; соматических клеток.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей биспецифичное антитело, как описано выше, или выделенный полинуклеотид, как описано выше, или рекомбинантный экспрессионный вектор, как описано выше, или клетку-хозяина, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В других воплощениях данная композиция дополнительно содержит второе терапевтическое средство, предпочтительно второе терапевтическое средство и биспецифичное антитело, выделенный полинуклеотид, рекомбинантный экспрессионный вектор или клетка-хозяин находятся в разных частях данной композиции, и предпочтительно второе терапевтическое средство представляет собой антитело против PD-1 и/или агонист STING.

Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу получения биспецифичного антитела, как описано выше, включающему следующие стадии:

1) осуществление экспрессии выделенного полинуклеотид а, как описано выше, или рекомбинантного экспрессионного вектора, как описано выше, в клетках-хозяевах соответственно;

2) восстановление белков, соответственно, экспрессируемых в клетках-хозяевах;

и

3) смешивание восстановленных белков и затем окисление данной смеси.

В некоторых воплощениях клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток человеческой эмбриональной почки HEK293 или HEK293Т, HEK293Е и HEK293F, которые модифицированы из клеток HEK293; клеток яичника китайского хомячка СНО или CHO-S, CHO-dhfr", CHO/DG44, ExpiCHO, которые модифицированы из клеток СНО; Escherichia coli или Е. coli BL21, BL21(DE3), Rosetta, Origami, которые модифицированы из Е. coli; дрожжей или Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, которые модифицированы из дрожжей; клеток насекомых или клеток High5, SF9, которые модифицированы из клеток насекомых; растительных клеток; клеток молочной железы млекопитающих; соматических клеток.

В некоторых воплощениях стадия восстановления включает следующее: 1) проведение реакции восстановления в присутствии восстановителя, выбранного из группы, состоящей из 2-меркаптоэтиламина, дитиотрейтола, трис(2-карбоксиэтил)фосфина или их других химических производных; 2) удаление восстановителя. В некоторых воплощениях данный восстановитель представляет собой дитиотрейтол в концентрации 0,1 мМ или выше, как, например, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,3 мМ, 0,4 мМ, 0,5 мМ или выше, и данная реакция проводится при 4°С в течение по меньшей мере 3 часов, как, например, 3,5 часов, 4 часов, 4,5 часов, 5 часов, 5,5 часов, 6 часов или дольше.

В некоторых воплощениях стадия окисления проводится в воздухе или в присутствии окислителя, выбранного из группы, состоящей из L-дегидроаскорбиновой кислоты или ее химических производных. В некоторых воплощениях окислитель представляет собой L-дегидроаскорбиновую кислоту в концентрации 0,5 мМ или выше, как, например, 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,2 мМ, 1,5 мМ или выше, и данная реакция проводится при 4°С в течение по меньшей мере 5 часов, как, например, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов или дольше.

В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию разделения и очистки. В некоторых воплощениях разделение и очистка включают обмен на катионообменной смоле, обмен на анионообменной смоле, хроматографию с обращенной фазой, аффинную хроматографию, гель-фильтрацию и их комбинации.

Седьмой аспект настоящего изобретения относится к применению биспецифичного антитела, как описано выше, и/или к выделенному полинуклеотид у, как описано выше, и/или к рекомбинантному экспрессионному вектору, как описано выше, и/или к клетке-хозяину, как описано выше, и/или к композиции, как описано выше, в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболеваний у субъекта.

Восьмой аспект настоящего изобретения относится к биспецифичному антителу, как описано выше, и/или к выделенному полинуклеотиду, как описано выше, и/или к рекомбинантному экспрессионному вектору, как описано выше, и/или к клетке-хозяину, как описано выше, и/или к композиции, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболеваний у субъекта.

Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу предупреждения и/или лечения заболеваний, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, биспецифичного антитела, как описано выше, и/или выделенного биспецифичного антитела, как описано выше, и/или рекомбинантного экспрессионного вектора, как описано выше, и/или клетки-хозяина, как описано выше, и/или композиции, как описано выше.

В некоторых воплощениях данный субъект представляет собой млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека.

В некоторых воплощениях данное заболевание выбрано из группы, состоящей из следующих опухолей: лейкоз, лимфома, миелома, опухоль головного мозга, плоскоклеточный рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, носоглоточный рак, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, саркома матки, рак простаты, рак мочевого пузыря, почечно-клеточный рак, меланома, мелкоклеточный рак легкого и рак кости.

Другими словами, в настоящем изобретении разработано новое биспецифичное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ в форме гетеродимера, подобного по структуре природному антителу, с характеристиками природных IgG и отсутствием несоответствий тяжелой и легкой цепи, и, таким образом, оно представляет собой высокостабильное биспецифичное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ в гетеродимерной форме. Биспецифичное антитело, полученное в данном изобретении, способно к одновременному связыванию с двумя молекулами-мишенями - PD-L1 и 4-1ВВ и к оказанию лучшей эффективности с меньшими побочными эффектами, чем монотерапевтическое средство при его применении для лечения сложных заболеваний. Кроме того, по сравнению с комбинированной терапией многими лекарственными средствами, данное биспецифичное антитело в качестве одной терапевтической молекулы не только облегчает применение пациентами и медицинским персоналом, но также упрощает сложные способы разработки новых лекарственных средств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 проиллюстрирована хроматограмма пиков элюции экспрессионного продукта против PD-L1.

На Фиг. 2 проиллюстрирована хроматограмма пиков элюции экспрессионного продукта против 4-1ВВ.

На Фиг. 3 проиллюстрирована структура молекулы биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ.

На Фиг. 4 проиллюстрирована молекулярная структура половины антитела, содержащего одну тяжелую цепь и одну легкую цепь.

На Фиг. 5 проиллюстрированы результаты анализа ЕФ-ВЭЖХ (гель-фильтрация-высокоэффективная жидкостная хроматография) молекулы полуантитела, содержащей одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, где на панелях А и Б проиллюстрированы результаты молекулы полуантитела против PD-L1 и молекулы полуантитела против 4-1ВВ соответственно.

На Фиг. 6 проиллюстрированы результаты анализа ГФ-ВЭЖХ молекулы биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ.

На Фиг. 7 проиллюстрированы результаты анализа КЭ (капиллярный электрофорез) молекулы биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ.

Фиг. 8. На панели А проиллюстрирована аффинность биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ в отношении PD-L1, на панели Б проиллюстрирована аффинность биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ в отношении 4-1ВВ, и на панели В проиллюстрирована аффинность биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ в отношении 4-1ВВ.

Фиг. 9. На панели А проиллюстрирована активность блокирования биспецифичным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ связывания с PD-L1/PD-1, и на панели Б проиллюстрирована активность блокирования биспецифичным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ связывания с PD-L1/CD80.

На Фиг. 10 проиллюстрирована регулирующая Т-клетки активность биспецифичным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ.

На Фиг. 11 проиллюстрирована агонистическая активность 4-1ВВ, опосредованная биспецифичным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ.

На Фиг. 12 проиллюстрирована противоопухолевая эффективность биспецифичного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ в мышиной модели гомологичной опухоли с нокином гена.

На Фиг. 13 проиллюстрированы изменения объема опухоли мышей BALB/c-hPDl/hPDL1/hCD137.

На Фиг. 14 проиллюстрированы данные по объему опухоли мышей h4-lBB/hPD-1.

Подробное описание воплощений

Определения

Термин «антитело» в том виде, как он здесь используется, используется в его самом широком смысле и относится к белку, содержащему антигенсвязывающий(щие) сайт(ты), включая природные антитела и искусственные антитела с разными структурами, включая интактные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, но не ограничиваясь ими.

Термин «биспецифичное антитело» в том виде, как он здесь используется, включает антигенсвязывающие домены, специфично связывающиеся с эпитопами на двух разных биологических молекулах. Если не определено иначе, порядок антигенов, связанных биспецифичным антителом, является производным. То есть, в некоторых воплощениях термины «биспецифичное антитело против PD-L1/4-lBB» и «биспецифичное антитело против 4-lBB/PD-L1» используются взаимозаменяемо. В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит два полуантитела, где каждое полуантитело содержит одну вариабельную область тяжелой цепи и возможно по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, а также одну вариабельную область легкой цепи и возможно по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит два полуантитела, где каждое полуантитело содержит одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи, и содержит не больше, чем одну одиночную вариабельную область тяжелой цепи и не больше, чем одну одиночную вариабельную область легкой цепи. В некоторых воплощениях данное биспецифичное антитело содержит два полуантитела, где каждое полуантитело содержит одиночную вариабельную область тяжелой цепи и одиночную вариабельную область легкой цепи, и где первое полуантитело связывается с первым антигеном и не со вторым антигеном, и второе полуантитело связывается со вторым антигеном и не с первым антигеном.

Термин «область, определяющая комплементарность» или «область CDR» или «CDR» (используемый здесь взаимозаменяемо с термином «гипервариабельная область» «HVR») относится к области в вариабельном домене антитела, которая является гипервариабельной по последовательности и образует структурно определенную петлю («гипервариабельная петля») и/или содержит остатки, контактирующие с антигеном («точки контакта с антигеном»). CDR, главным образом, отвечают за связывание с эпитопом антигена. В настоящем изобретении три CDR тяжелой цепи называются HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а три CDR легкой цепи называются LCDR1, LCDR2 и LCDR3.

Следует заметить то, что границы CDR вариабельных областей того же самого антитела, полученные на основе разных систем нумерации, могут быть отличными. То есть, последовательности CDR вариабельной области того же самого антитела, определенные при разных системах нумерации, могут быть отличными. Следовательно, для антитела, ограниченного конкретными последовательностями CDR, определенными согласно настоящему изобретению, объем данного антитела также охватывает антитела, последовательности вариабельной области которых содержат указанные специфические последовательности CDR, но с отличной указанной границей CDR от конкретной границы CDR, определенной в настоящем изобретении, из-за применения других схем (например, других правил системы нумерации или их комбинаций).

Ковалентная связь означает то, что две цепи Fc или любая из цепей Fc и связанная с ней антигенсвязывающая функциональная область в гетеродимерном биспецифичном антителе связываются друг с другом посредством ковалентной связи с образованием одной молекулы. Среди них цепи Fc содержат первую антигенсвязывающую функциональную область и вторую антигенсвязывающую функциональную область, связанные посредством одной или более чем одной ковалентной связи (например, дисульфидной связи); данная первая и вторая цепи Fc связываются с антигенсвязывающей функциональной областью посредством ковалентной связи (например, иминной или амидной связи) соответственно.

Антигенсвязывающая функциональная область представляет собой область, которая может специфично взаимодействовать с молекулой-мишенью, такой как антиген, и действие которой является высокоселективным, и последовательность, которая распознает одну целевую молекулу, обычно не способна распознавать другие молекулярные последовательности. Репрезентативная антигенсвязывающая функциональная область включает вариабельную область антитела, структурный вариант вариабельной области антитела, связывающий домен рецептора, связывающий домен лиганда или связывающий домен фермента.

Одна или более чем одна дисульфидная связь межцепочечных связей относится к образованию гетеродимерного фрагмента посредством связей между первой цепью Fc и второй цепью Fc посредством одной или более чем одной дисульфидной связи. В настоящем изобретении одна или более чем одна дисульфидная связь может быть образована, когда в той же самой клетке синтезируется первая цепь Fc и вторая цепь Fc или первая цепь Fc и вторая цепь Fc, и связанные с ними антигенсвязывающие функциональные области, или может быть образована посредством восстановления-окисления in vitro после того, как в разных клетках синтезируется первая цепь Fc и вторая цепь Fc или первая цепь Fc и вторая цепь Fc, и связанные с ними антигенсвязывающие функциональные области соответственно.

Первая цепь Fc и вторая цепь Fc относится к образованию связывающего фрагмента посредством ковалентной связи, где данная ковалентная связь содержит дисульфидную связь, и каждая цепь содержит по меньшей мере одну часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина; и первая цепь Fc и вторая цепь Fc отличаются друг от друга по их аминокислотным последовательностям и содержат по меньшей мере одну отличную аминокислоту. Что касается первой и второй цепей Fc по настоящему изобретению, между идентичными цепями существует сильная взаимная сила отталкивания, а между разными цепями существует сила притяжения. Соответственно, первая и вторая цепи Fc или первая и вторая цепи Fc, и связанные с ними антигенсвязывающие функциональные области имеют тенденцию к тому, чтобы подвергаться образованию гетеродимера при совместной экспрессии в клетке. При экспрессии первой и второй цепей Fc или первой и второй цепей Fc, и связанного с ними антигенсвязывающего домена в двух клетках-хозяевах, соответственно, первые цепи Fc или первая цепь Fc и связанный с ней антигенсвязывающий домен не имеют тенденции к тому, чтобы подвергаться образованию гомодимера, и вторые цепи Fc или вторая цепь Fc и связанный с ней антигенсвязывающий домен не имеют тенденции к тому, чтобы подвергаться образованию гомодимера. В настоящем изобретении при экспрессии первой и второй цепей Fc или первой и второй цепей Fc и связанных с ними антигенсвязывающих функциональных областей в двух клетках-хозяевах, соответственно, и присутствии восстановителя, процентная доля гомодимеров составляет меньше чем 50%, то есть, процентная доля мономеров (одна цепь Fc или одна цепь Fc и одна связанная с ней антигенсвязывающая функциональная область) составляет выше 50%.

Иммуноглобулин имеет симметричную структуру, имеющую четыре полипептидные цепи, в которой две цепи представляют собой идентичные тяжелые цепи, которые являются относительно длинными и имеют относительно высокую молекулярную массу, причем каждая включает 450-550 аминокислотных остатков и имеет относительную молекулярную массу 55000-70000 Да; а другие две цепи представляют собой идентичные легкие цепи (L цепи), которые являются относительно короткими и имеют относительно низкую молекулярную массу, включая примерно 210 аминокислотных остатков и имея относительную молекулярную массу примерно 24000 Да. Последовательности из примерно 110 аминокислот в длину около N-концов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина являются высоковариабельными и называются вариабельными областями (V областями), тогда как остальные аминокислотные отрезки около его С-концов являются относительно стабильными и называются константными областями (С областями). Каждая тяжелая цепь антитела состоит из вариабельной области тяжелой цепи (именуемой здесь VH) и константной области тяжелой цепи (именуемой здесь СН), и каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (именуемой здесь VL) и константной области легкой цепи (именуемой здесь CL). Вариабельная область в тяжелой цепи занимает приблизительно 1/4 длины тяжелой цепи, а константная область занимает приблизительно 3/4 длины тяжелой цепи. Известные пять типов Ig представляют собой IgG (у), IgA (a), IgD (5), IgM (ц) и IgE (s). Среди них первые три типа Ig имеют три константные области в цепи Н, а именно: CHI, СН2 и СНЗ. Последние два типа Ig (IgM и IgE) имеют одну область VH и четыре константные области в цепи Н, а именно: СН1-СН4. Константные области представляют собой не только каркас молекулы иммуноглобулина, но также и одной из областей, активирующих иммунные ответы. Хотя воплощения данного изобретения и относятся к IgG, специалистам в данной области было бы известно то, что класс антител по изобретению может быть переключен известными способами, если это желательно. Например, у антитела по изобретению, которое исходно представляет собой IgM, может быть переключен класс на антитело IgG по изобретению. Кроме того, можно использовать методики переключения класса для превращения одного подкласса IgG в другой, как, например, от IgG1 до IgG2. Таким образом, эффекторные функции антител по изобретению могут быть переключены посредством изотипов, например, до антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для разных терапевтических применений. В одном воплощении антитело по изобретению представляет собой антитело IgG1, такое как IgG1, к.

Часть константной области по настоящему раскрытию включает по меньшей мере область взаимодействия первой цепи Fc и второй цепи Fc, и, в случае IgG, данная область является частью аминокислот, расположенных в домене СНЗ, и она включает по меньшей мере GLN 347, TYR 349, THR 350, LEU 351, SER 354, ARG 355, ASP 356, GLU 357, LYS 360, SER 364, THR 366, LEU 368, LYS 370, ASN 390, LYS 392, THR 394, PRO 395, VAL 397, ASP 399, SER 400, PHE 405, TYR 407, LYS 409 и LYS 439.

Каждая из первой цепи Fc и второй цепи Fc связана с антигенсвязывающей функциональной областью посредством ковалентной связи или линкера, означая то, что каждая из первой цепи Fc и второй цепи Fc связана с антигенсвязывающим фрагментом антитела или одноцепочечным антителом, способным распознавать антиген, или другим вариантом фрагмента антитела, способным распознавать антиген, или рецептором, способным распознавать лиганд, или лигандом, способным распознавать рецептор, посредством ковалентной связи или линкера. Ковалентная связь представляет собой одну из химических связей, в которых два или более чем два атома совместно используют их наружные электроны для достижения в идеальной ситуации состояния электронного насыщения, таким образом, образуя относительно стабильную химическую структуру, именуемую ковалентной связью. Другими словами, ковалентная связь представляет собой взаимодействие между атомами посредством обобществления их электронов. Атомы того же самого элемента или разных элементов могут связываться друг с другом посредством ковалентных связей. Ковалентные связи между первой цепью Fc и второй цепью Fc по изобретению включают амидную связь, образованную реакцией дегидратации карбоксила между аминогруппой молекулы аминокислоты и карбоксильной группой другой молекулы аминокислоты, или амидную связь или иминную связь, образованную между альдегидной группой этиленгликоля или полиэтиленгликоля, или другого соединения, или их полимера и аминогруппой молекулы аминокислоты, но не ограничиваясь ими; где линкер представляет собой один отрезок аминокислотной последовательности или одно соединение, или один мультимер одного соединения, способного связывать две полипептидные цепи посредством ковалентных связей, где один отрезок аминокислотной последовательности включает, маленький пептид, такой как GGGGSGGGGSGGGGS, но не ограничивающийся им, который связывает совместно первую цепь Fc или вторую цепь Fc и одноцепочечное антитело, способное распознавать антиген, или другой структурный вариант фрагмента антитела, способный распознавать антиген, посредством амидных связей.

Первая цепь Fc и вторая цепь Fc имеют тенденцию к тому, чтобы подвергаться образованию гетеродимера, а не тенденцию к тому, чтобы подвергаться образованию гомодимера, что означает, что, как и в первой цепи Fc, и второй цепи Fc, существует сила отталкивания между идентичными полипептидными цепями, и существует сила притяжения между разными полипептидными цепями, и, следовательно, первая цепь Fc и вторая цепь Fc, или первая и вторая цепи Fc и антигенсвязывающие функциональные области, связанные с ними, имеют тенденцию к тому, чтобы подвергаться образованию гетеродимера при совместной экспрессии в клетке. При экспрессии в двух клетках-хозяевах первой цепи Fc и второй цепи Fc, или первой и второй цепей Fc, и связанных с ними антигенсвязывающих функциональных областей, соответственно, первые цепи Fc или первая цепь Fc и связанная с ней антигенсвязывающая функциональная область не имеют тенденции к тому, чтобы подвергаться образованию гомодимера, и вторые цепи Fc или вторая цепь Fc и связанная с ней антигенсвязывающая функциональная область также не имеют тенденции к тому, чтобы подвергаться образованию гомодимера.

Система нумерации индекса EU Kabat относится к способу, использованному Kabat для приписывания номера каждой аминокислоте последовательности антитела, и данный способ приписывания номера для каждого остатка стал стандартным способом в данной области. Протокол Kabat можно применять к другим антителам, которые не были описаны в его исследовании. На основе консервативных аминокислот целевое антитело выравнивают с одной из консенсусных последовательностей, идентифицированных Kabat. В контексте настоящего изобретения, если не определено иначе, все положения аминокислот антитела пронумерованы согласно системе нумерации индекса EU Kabat.

Домен Fc относится к кристаллизуемому фрагменту (Fc), соответствует доменам СН2 и СНЗ Ig и представляет собой сайт, где Ig взаимодействует с эффекторной молекулой или клеткой.

IgG представляет собой сокращение иммуноглобулина G (IgG) и является главным типом антител в сыворотке. Человеческий IgG имеет четыре подкласса, а именно: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 на основе антигенных различий в r-цепях молекул IgG.

Термин «молекула полуантитела» относится к структуре, образованной одной тяжелой цепью и одной легкой цепью антитела, где данные тяжелая цепь и легкая цепь могут быть связаны посредством или не связаны посредством ковалентной связи, и представляет собой одновалентную структуру антитела, распознающую антиген.

Фрагмент Fab представляет собой последовательность, распознающую молекулы, т.е. фрагмент связывания антигена (Fab), и соответствует двум ручкам молекулы антитела, состоящим из полной легкой цепи и доменов VH и СН1 тяжелой цепи. scFv последовательность, распознающая молекулу представляет собой структурный вариант фрагмента антитела, полученный генноинженерной модификацией вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела. Внеклеточная область мембранного рецептора представляет собой последовательность, распознающую молекулу, и данный мембранный рецептор обычно содержит внеклеточную область, расположенную вне клетки, которая распознает и связывается с соответствующим антигеном или лигандом, трансмембранную область, которая заякоривает рецептор на поверхности клетки, и внутриклеточную область в клетке, которая имеет киназную активность или передает сигнал. Лиганд мембранного рецептора клетки относится к белку, маленькому пептиду или соединению, которое может распознаваться и связываться внеклеточной областью мембранного рецептора. Цитокины представляют собой низкомолекулярные растворимые белки, которые продуцируются из-за индукции разных типов клеток иммуногенами, митогенами или другими стимуляторами, и они имеют разные функции, такие как регуляция врожденного иммунитета и адаптивного иммунитета, гематопоэза, роста клетки, APSC плюрипотентной клетки и репарации повреждения ткани и т.д. Цитокины могут классифицироваться на интерлейкины, интерфероны, надсемейства фактора некроза опухоли, колониестимулирующие факторы, хемокины, факторы роста и т.д. «Метка экспрессии белка» означает аминокислотную последовательность, добавленную к N-концу или С-концу белка-мишени, и она может представлять собой маленький пептид или длинную аминокислотную последовательность. Добавление метки может быть полезным для правильного фолдинга белков, выделения и очистки белков и уменьшения внутриклеточной деградации белков. Часто используемые метки могут включать НА (гемагглютинин), SUMO, His, GST (глутатион-8-трансфераза), GFP и Flag.

Нет ограничения по антителам, используемым для биспецифичного антитела в гетеродимерной форме по настоящему изобретению. Предпочтительно в настоящем изобретении можно использовать все антитела, известные в предшествующем уровне техники, которые можно использовать для лечения и/или предупреждения заболеваний.

Биспецифичное антитело в гетеродимерной форме по настоящему изобретению может иметь одну или более чем одну замену, делецию, присоединение и/или вставку. Например, определенные аминокислоты могут заменять другие аминокислоты в структуре белка без значимой потери способности к связыванию с другими полипептидами (такими как антигены) или клетками. Поскольку способность к связыванию и свойства белка определяют биоактивности и функции белка, в последовательности белка могут быть сделаны замены определенных аминокислотных последовательностей без значимой потери их биологической эффективности или активностей.

Во многих случаях вариант полипептида содержит одну или более чем одну консервативную замену. Термин «консервативная замена» означает замену, при которой аминокислота в полипептиде заменяется другой аминокислотой с аналогичными свойствами таким образом, что специалист в области химии пептидов предположил бы то, что вторичная структура и гидрофильные свойства полипептида по существу являются неизменными.

Аминокислотные замены обычно основываются на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, таких как их гидрофобность, гидрофильность, заряды, размер и т.д. Типичные заместители, для которых учитываются вышеупомянутые характеристики, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин; глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.

Термин «идентичность» в том виде, как он здесь используется, имеет значение, обычно известное в данной области. Специалисты в данной области также знакомы с правилами и критериями для определения идентичности между разными последовательностями, и термин «идентичность» относится к процентной доле остатков в варианте полинуклеотидной или полипептидной последовательности, которые являются идентичными невариантной последовательности после выравнивания данных последовательностей и введения пробелов (если необходимо, для того, чтобы получать максимальный процент гомологии). В настоящем изобретении, при условии, что удовлетворяется ограничение идентичности, полученный вариант последовательности также должен иметь биологические активности, которыми обладает родительская последовательность. Специалисты в данной области хорошо бы знали способы и средства для скрининга вариантов последовательностей согласно вышеописанным активностям. Такие варианты последовательностей могли бы быть легко получены специалистами в данной области в свете раскрытия настоящей заявки. В конкретном воплощении варианты полинуклеотид а и полипептида имеют по меньшей мере примерно 70%-ную, по меньшей мере примерно 75%-ную, по меньшей мере примерно 80%-ную, по меньшей мере примерно 90%-ную, по меньшей мере примерно 95%-ную, по меньшей мере примерно 98%-ную или по меньшей мере примерно 99%-ную, или по меньшей мере примерно 99,1%-ную, 99,2%-ную, 99,3%-ную, 99,4%-ную, 99,5%-ную, 99,6%-ную, 99,7%-ную, 99,8%-ную или 99,9%-ную идентичность полинуклеотида или полипептида с описанным здесь полинуклеотидом и полипептидом. Из-за избыточности генетических кодонов будут варианты данных последовательностей, кодирующие ту же самую аминокислотную последовательность.

В другом воплощении настоящего изобретения предложена полинуклеотидная композиция, способная к гибридизации с полинуклеотидной последовательностью или ее фрагментом, или комплементарной последовательностью, предложенными в настоящем изобретении, при условиях от умеренно до сильно жестких. Методики гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации подходящие умеренно жесткие условия для анализа гибридизации полинуклеотида по настоящему изобретению с другими полинуклеотидами включают предварительную промывку раствором 5х SSC (раствор хлорида и цитрата натрия), 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) и 1,0 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (рН 8,0); гибридизацию при 50-60°С, 5х SSC в течение ночи и затем промывку дважды 2х, 0,5х и 0,2х SSC, содержащего 0,1% SDS, при 65°С в течение 20 минут. Специалистам в данной области было бы известно то, что жесткостью гибридизации можно легко манипулировать, например, посредством изменения содержания соли гибридизационного раствора и/или температуры во время гибридизации. Например, в другом воплощении подходящие сильно жесткие условия гибридизации включают описанные выше условия, за исключением того, что температура гибридизации повышается, например, до 60-65°С или 65-70°С.

Клетка-хозяин по настоящему изобретению может представлять собой любую клетку, используемую для экзогенной экспрессии генов, включая Escherichia coli, дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки и клетки млекопитающих, но не ограничиваясь ими.

Вектор по настоящему изобретению включает вектор, который может реплицироваться в любом типе клеток или организмов, включая, например, плазмиды, бактериофаги, космиды и минихромосомы. В некоторых воплощениях вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению, представляет собой подходящий вектор для размножения или репликации данного полинуклеотида или подходящий вектор для осуществления экспрессии полипептида по настоящему изобретению. Такие векторы известны в данной области и имеются в продаже.

Термин «вектор» включает челночные векторы и экспрессионные векторы. В общем, конструкция плазмиды также включает репликатор (такой как репликатор ColE1) и селектируемый маркер (такой как устойчивость к ампициллину или тетрациклину) для репликации и отбора плазмиды у бактерий соответственно. Термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, содержащему контрольные последовательности или регуляторные элементы, требующиеся для осуществления экспрессии антитела по настоящему изобретению, включая фрагменты антитела, у бактерий или эукариотических клеток.

Вектор по настоящему изобретению может представлять собой любой вектор, используемый для экспрессии экзогенного гена, включая плазмидные векторы, которые содержат по меньшей мере репликатор, промотор, целевой ген, сайт множественного клонирования и ген селектируемого маркера, но не ограничиваясь ими, и, предпочтительно, вектор по настоящему изобретению включает модифицированный плазмидный вектор, полученный на основе pCDNA, такой как вектор X0GC, но не ограничивается им.

Композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит второе терапевтическое средство, предпочтительно второе терапевтическое средство и биспецифичное антитело, выделенный полинуклеотид, рекомбинантный экспрессионный вектор или клетка-хозяин расположены в разных частях композиции, и, предпочтительно, второе терапевтическое средство представляет собой антитело против PD1 и/или агонист STING.

Второе терапевтическое средство, содержащееся в композиции по настоящему изобретению, не имеет конкретного ограничения, при условии, что оно является физиологически совместимым с биспецифичным антителом, выделенным полинуклеотидом, рекомбинантный экспрессионным вектором или клеткой-хозяином по настоящему изобретению. Термин «физиологически совместимый» означает то, что нет избыточной стимуляции, токсичности или других вредных реакций при введении субъекту. В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство и биспецифичное антитело, выделенный полинуклеотид, рекомбинантный экспрессионный вектор или клетка-хозяин присутствуют в данной композиции в виде смеси. В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство и биспецифичное антитело, выделенный полинуклеотид, рекомбинантный экспрессионный вектор или клетка-хозяин присутствуют в разных частях данной композиции. Термин «в разных частях данной композиции» означает то, что композиция состоит из частей, отделенных друг от друга, и отдельные части могут находиться в разных контейнерах или в разных отсеках, отделенных друг от друга, в том же самом контейнере, как, например, разные флаконы, шприцы, сосуды. Части, отделенные друг от друга, могут быть смешаны друг с другом для совместного введения перед введением или вводиться последовательно с определенными интервалами, такими как интервал 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут, 1 час, 5 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 1 неделя, 1 месяц или дольше. Второе терапевтическое средство может представлять собой лекарственное средство для лечения того же самого или отличных заболеваний, чем заболевания, подлежащие лечению биспецифичным антителом, выделенным полинуклеотидом, рекомбинантный экспрессионным вектором или клеткой-хозяином, например, для лечения лейкоза, или одно служит для лечения лейкоза, а другое - для лечения колоректального рака. В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство включает противовоспалительное средство, такое как ингибиторы IL-6 (интерлейкин-6), ингибиторы фактора некроза опухолей a (TNF-ot), ингибиторы интерферона у (IFN-y), кортикостероиды, противогистаминные средства, жаропонижающие средства и/или антибиотики. В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из следующих: второе антитело, иммунотерапевтическое средство, таргетное терапевтическое средство или химиотерапевтическое средство.

В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство представляет собой антитело, и мишень данного антитела выбрана из группы, состоящей из следующих: CD47, CD70, CD200, CD154, CD223 (LAG-3), KIR (рецепторы, подобные иммуноглобину клетки-убийцы), GITR, CD20, CD28, CD40, CD86, CD160, CD258, CD270, CD275, CD276, OX40L, В7-Н4, GITRL, 4-1ВВЦ CD3, CD25, CD48, CD66a, CD80, CD94, CD96, CD 112, CD 115, CD205, CD226, CD244, CD262, CD284, CD288, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), TNFSF15, TD02, IGF-1R, GD2, TMIGD2, RGMB, VISTA, BTNL2, Btn, TIGIT, Siglec ((Ig-подобные лектины, связывающий сиаловую кислоту, т.е. SIGLEC 15), VEGFR, семейство ILT, MICA, TGFp, путь STING (путь гена-стимулятора интерферона), аргиназа, EGFRvIII, HHLA2, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, BTLA, индоламин-2,3-диоксигеназа (IDOl), TIM3, рецептор аденозина A2A (рецептор ADO), CD39, CD73, CD27, ICOS (CD278), CD 137 (4-IBB), OX40, TNFSF25, IL-10, галектины, NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2A, NKG2D, DNAM1, DAP 10, CD 16 (CD16a, CD16b или оба), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (также известный как SEMA4D), NKp80, CD244 (также известный как SLAMF4 или 2 В4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E или CD160.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой антитело против PD-1. В некоторых воплощениях антитело против PD-1 представляет собой ниволумаб, пембролизумаб, цемиплимаб, камрелизумаб, торипалимаб, синтилимаб, тислелизумаб, пенпулимаб или зимберэлимаб.

В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство представляет собой иммунотерапевтическое средство. Неограничивающие примеры

иммунотерапевтических средств включают следующие: антитела, низкомолекулярные модуляторы, Т-клетки с химерным рецептором антигена (CAR), NK-клетки, дендритные клетки (DC), адоптивная пересадка клеток (ACT), модуляторы иммунологической контрольной точки, цитокины, противораковые вакцины, адъюванты, онколитические вирусы или их комбинации. В некоторых воплощениях иммунотерапевтические средства представляют собой агонисты STING.

В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство представляет собой таргентное терапевтическое средство. Термин «таргентное терапевтическое средство» относится к молекулам, которые специфично нацелены на и ингибируют один или более чем один онкогенный белок сигнализации (например, белки, участвующие в росте и выживании клеток). Неограничивающие примеры таких таргетных терапевтических средств включают следующие: ингибиторы тирозинкиназы (например, иматиниб (GLEEVEC®), гефитиниб (IRES S А®), эрлотиниб (Т ARC EVA®), сорафениб (NEXAVAR®), сунитиниб (SUTENT®), дазатиниб (SPRYCL®), лапатиниб (TYKERB®), нилотиниб (TASIGNA®), бортезомиб (VELCADE®), тамоксифен (NOLVADEX®), тофацитиниб (XELJANZ®), ингибиторы ALK (например, кризотиниб), ингибиторы Вс1-2 (например, обатоклакс, навитоклакс, госсипол), ингибиторы PARP (например, инипариб, олапариб), ингибиторы PI3K (например, перифбсин), апатиниб, AN-152, ингибиторы Braf (например, траметиниб, МЕК162), ингибиторы CDK (например, PD-0332991, LEE011), ингибиторы Hsp90, салиномицин, VAL-083)); конъюгаты низкомолекулярных лекарственных средств (например, винтафолид); ингибиторы серин-треониновых киназ (например, темсиролимус (TORISEL®), эверолимус (AFINITOR®), вемурафениб (ZELBORAF®), траметиниб (MEKINIST®), дабрафениб (TAFINLAR®)); антитела (например, антитела против CD20 (например, ритуксимаб (RITUXAN®)), антитела против HER2/neu (например, трастузумаб (HERCEPTIN®)), алемтуксумаб (САМРАТН®), антитела против EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) (например, цетуксимаб, панитумумаб), антитела против VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) (например, бевацизумаб (AVASTIN®)); конъюгаты антител, такие как конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), иммуностимулирующие конъюгаты антител (ISAC) и конъюгаты антитело-олигонуклеотид (АОС). В некоторых воплощениях конъюгаты антител представляют собой лекарственные средства класса ADC. Неограничивающие примеры ADC включают следующие: Her2-ADC, Trop2-ADC, CD22-ADC, BCMA-ADC, CD 19-ADC, нектин-4-ADC.

В некоторых воплощениях второе терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают следующие: алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; темозоломид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие алтретамин, триэтиленемеламин, триэтиленефосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналогии KW-2189 и СВ 1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенстерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гаммалл и калихеамицин омегал 1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бифосфанаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатина хромофор и родственные хромо протеиновые энедииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофилин, хромомицинис, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, ADRTAMYCIN® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиандренали, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, TAXOL® паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® не содержащая кремофор, модифицированная альбумином композиция наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.) и TAXOTERE® доксетаксел (Rhone- Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлоранбуцил; GEMZAR® гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин, винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NAVELBINE, винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Camptosar, СРТ-11) (включая схему лечения иринотекана с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); лапатиниб (TYKERB); ингибиторы РКС-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (TARCEVA®)) и VEGF-A, которые уменьшают пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из приведенных выше.

Субъекты по настоящему изобретению включают птиц, рептилий, млекопитающих и т.д. Предпочтительно млекопитающие включают грызунов и приматов, и, предпочтительно, приматы включают человека.

Объем заболеваний, включенных в настоящее изобретение, включает опухоли, но не ограничивается ими. Предпочтительно данные опухоли включают следующие: лейкоз, лимфома, миелома, опухоль головного мозга, плоскоклеточный рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, носоглоточный рак, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, саркома матки, рак простаты, рак мочевого пузыря, почечно-клеточный рак, меланома, мелкоклеточный рак легкого и рак кости.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к фармацевтическому носителю, обычно используемому в области фармации, такому как разбавители, эксципиенты и вода, и т.д.; наполнители, такие как крахмал, сахароза, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза и т.д.; связующие вещества, такие как производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажнители, такие как глицерин; разрыхлители, такие как натрий кар бокс иметил крахмал, гидроксипропилцеллюлоза, кроскармеллоза, агар, карбонат кальция и гидрокарбонат натрия; усилители поглощения, такие как четвертичные соединения аммония; поверхностно-активные вещества, такие как цетанол, лаурилсульфат натрия; носители для адсорбции, такие как каолинит и бентонит; смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния, микронизированный силикагель и полиэтиленгликоль, и т.д. Кроме того, в данную композицию также могут быть добавлены другие адъюванты, такие как корригенты и подсластители.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Специалистам в данной области было бы известно то, что в отношении настоящего изобретения могут быть сделаны многие модификации без отступления от сущности настоящего изобретения, и такие модификации также попадают в пределы объема настоящего изобретения.

Все следующие экспериментальные способы представляют собой традиционные способы, если не определено иначе, и все использованные экспериментальные вещества являются легко доступными в коммерческих компаниях, если не определено иначе. Все разные антитела, используемые в следующих примерах настоящего изобретения, представляют собой стандартные антитела, имеющиеся в продаже.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование вектора для молекулы гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Конструировали экспрессионные векторы X0GC, содержащие тяжелую цепь или легкую цепь антитела против человеческого PD-L1 соответственно. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи изложена в SEQ ID NO: 1, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи изложена в SEQ ID NO: 3, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 4; нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи изложена в SEQ ID NO: 5, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 6; нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи изложена в SEQ ID NO: 7, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 8. Вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи, а также вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи индивидуально амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция). Во всех ПЦР-реакциях в настоящей заявке использовали ультраточную ДНК-полимеразу Phusion (F-530L) от NEB. ПЦР праймеры традиционно конструировали согласно принципу комплементарно ста оснований и потребности в рестрикционных сайтах. Каждая реакционная система состоит из следующего: 8,9 мкл Н2О, 4 мкл буфера 5х ультраточной ДНК-полимеразы Phusion, 4 мкл 1 мМ dNTP, 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 0,1 мкл ультраточной ДНК-полимеразы Phusion, 1 мкл матрицы. ПЦР-продукты вариабельных и константных областей электрофоретически разделяли на 1,5%-ном агарозном геле, и соответствующие фрагменты выделяли с использованием набора для выделения ДНК (Promega, А9282, тот же самый используется далее). Затем проводили другой цикл ПЦР-реакции с выделенными фрагментами вариабельной области и фрагментами константной области в качестве матрицы с использованием прямого праймера вариабельной области и обратного праймера константной области для получения полноразмерных фрагментов легкой цепи или тяжелой цепи. Векторы X0GC и полноразмерные фрагменты расщепляли EcoRI (Thermo, каталожный номер FD0275) и Hindlll (Thermo, каталожный номер FD0505), и реакционная система для расщепления представляла собой: 6 мкл 10х буфера, 2 мкл EcoRI и 2 мкл Hindlll, 40 мкл полноразмерных фрагментов, полученных извлечением из геля, 10 мкл ЩО, и реакцию системы расщепления проводили при 37°С в течение 1 часа. Расщепленные продукты лигировали с использованием Т4 ДНК-лигазы (Thermo, каталожный номер EL0011) (ту же самую использовали далее), и реакционная система представляла собой: 1 мкл 10х буфера лигазы, 0,5 мкл лигазы, 7,5 мкл полноразмерных фрагментов, полученных извлечением из геля, 1 мкл вектора X0GC, полученного извлечением из геля, и реакцию лигирования проводили при 22°С в течение 30 мин. Продукты лигирования трансформировали в компетентную клетку DH5a Е. coli (Tiangen, СВ104, такую же использовали далее). Получали экспрессионные векторы X0GC для тяжелой цепи и легкой цепи антитела против человеческого PD-L1 и использовали для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи антитела против человеческого PD-L1 в эукариотических клетках соответственно.

В настоящем изобретении также конструировали экспрессионные векторы X0GC, содержащие, соответственно, последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела против человеческого 4-1ВВ. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи изложена в SEQ ID NO: 9, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 10; нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи изложена в SEQ ID NO: 3, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 4; нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи изложена в SEQ ID NO: 11, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 12; нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи изложена в SEQ ID NO: 13, и ее аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 14. Экспрессионные векторы X0GC для тяжелой цепи и легкой цепи антитела против человеческого 4-1ВВ получали и использовали, соответственно, для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи антитела против человеческого 4-1ВВ в эукариотических клетках.

Пример 2. Экспрессия молекулы гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Экспрессионные векторы, содержащие тяжелую или легкую цепи антитела против человеческого PD-L1, сотрансфицировали в клетки ExpiCHO (клетки ExpiCHO™, каталожный номер А29127, Invitrogen). Кроме того, экспрессионные векторы, содержащие тяжелую или легкую цепи антитела против человеческого 4-1ВВ, также сотрансфицировали в клетки ExpiCHO. Данные клетки высевали при плотности посева 3,5х10⁶ клеток/мл за сутки перед трансфекцией. В сутки трансфекции клетки разводили свежей экспрессионной средой ExpiCHO (экспрессионная среда ExpiCHO™, каталожный номер А29100-01, Invitrogen) до плотности после разведения 6×10⁶клеток/мл. Плазмиды извлекали согласно трансфекционному объему с достижением конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Плазмиды разводили до 4% трансфекционного объема с использованием среды OptiPRO™ SFM (OptiPRO™ SFM, каталожный номер 12309-019, Invitrogen) и гомогенно смешивали посредством переворачивания. Отбирали трансфеционный реактив ExpiFectamine™ (набор для трансфекции СНО ExpiFectamine™, каталожный номер А29129, Invitrogen) в количестве в 6,4 раза превышающем количество плазмиды, разводили до 4% трансфекционного объема с использованием среды OptiPRO™ SFM и гомогенно смешивали посредством переворачивания. Разведений трансфекционный реактив добавляли к разведенным плазмидам, легко перемешивали, оставляли при комнатной температуре в течение 1-5 мин и медленно добавляли по каплям к клеткам. Клетки затем помещали в инкубатор для клеток (концентрация 8% СО2) и инкубировали при 37°С в течение 20 часов на шейкере при 125 об./мин. В клетки медленно добавляли энхансер ExpiCHO™ (набор для трансфекции СНО ExpiFectamine™, каталожный номер А29129, Invitrogen) в количестве, составляющем 0,006 от трансфекционного объема, и подпитку ExpiCHO™ (подпитка ExpiCHO™, каталожный номер А29101-02, Invitrogen) в количестве, составляющем 0,24 от трансфекционного объема. Данные клетки помещали на шейкер при 125 об./мин и инкубировали при 32°С.Супернатант культуры клеток отбирали центрифугированием через 10 суток после трансфекции.

Уровни экспрессии определяли посредством анализа белка А. Осуществляли стадию фильтрования с использованием 0,22 мкм фильтровальной мембраны для удаления осадков перед применением очистки на хроматографической колонке. Данную стадию проводили при 4°С.

Пример 3. Очистка экспрессионных продуктов молекулы гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Очистку проводили при комнатной температуре с использованием системы очистки белка АКТА explorer 100 (GE Healthcare) и колонки аффинной хроматографии MabSelect SuRe (GE Healthcare). Хроматографическую колонку сначала уравновешивали подвижной фазой А (20 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4), супернатант клеток, обработанный, как описано выше, загружали, как только исходный уровень становился стабильным, и затем уравновешивали подвижной фазой А. Данные образцы представляли собой экспрессионные продукты против PD-L1 и экспрессионные продукты против 4-1ВВ соответственно. Затем колонку сперва промывали 2-3 объемами колонки подвижной фазы Б (подвижная фаза А, содержащая 1 М хлорид натрия), затем промывали 2-3 объемами колонки подвижной фазы А, затем элюировали 5 объемами колонки подвижной фазы В (100 мМ глицин, рН 3,5), и отобранный пик элюции представлял собой пик целевого белка. Хроматограмма пика элюции экспрессионных продуктов против PD-L1 показана на Фиг. 1, и пик элюции экспрессионных продуктов против 4-1ВВ показан на Фиг. 2. Отбирали отмеченный пик элюции (серая область на Фиг. ), доводили до рН 7,2 посредством добавления по каплям 1 М раствора Tris, доводили до конечной концентрации 0,15 М посредством добавления NaCl, осуществляли стерилизующую фильтрацию и хранили при 2~8°С.

Пример 4. Получение и очистка молекулы гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Структура молекулы гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ показана на Фиг. 3.

Продукты, очищенные описанным выше способом MabSelect SuRe (GE Healthcare), подвергали воссозданию in vitro с получением гетеродимеров. Во-первых, описанные выше отобранные растворы белка подвергали способу восстановления цистеина для открытия дисульфидных связей, и дисульфидные связи в шарнирной области гомодимерных молекул антитела, содержащихся в продуктах против PD-L1 и против 4-1ВВ, также открывались с образованием молекул полуантитела, содержащих одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, структура из которых показана на Фиг. 4. Восстановленный образец анализировали посредством ГФ-ВЭЖХ (гель-фильтрация-высокоэффективная жидкостная хроматография) (shodex, белок kw-803) с буфером подвижной фазы, содержащим восстановитель 1 мМ DTT (дитиотрейтол). Результаты показаны на Фиг. 5А и 5Б соответственно. Отношения обеих гомодимерных молекул против PD-L1 и против 4-1ВВ меньше чем 10%, и отношения молекул полуантитела больше, чем 90%.

Затем восстановленные молекулы полуантитела против PD-L1 и против 4-1ВВ смешивали в эквимолярном соотношении, и проводили реакцию воссоздания при комнатной температуре в течение 0,5 часов. Во время процесса воссоздания молекулы полуантитела против PD-L1 и против 4-1ВВ образовали гетеродимерное биспецифичное антитело, содержащее и молекулы полуантитела против PD-L1, и против 4-1ВВ посредством нековалентной силы между доменами СН2 и СНЗ. Белковый раствор затем подвергали ультрафильтрационному концентрированию (номинальный порог отсечения молекулярной массы 10 кДа), и данный раствор заменяли 20 мМ фосфатным буфером, 0,15 М NaCl, 0,1 мМ цистином и затем инкубировали при комнатной температуре в течение ночи на протяжении реакции окисления для повторного образования дисульфидных связей в гетеродимерном биспецифичном антителе.

Молекулы гетеродимерного антитела, полученные выше посредством восстановления и окисления экспрессионных продуктов против PD-L1 и против 4-1ВВ, подвергали ультрафильтрационному концентрированию (номинальный порог отсечения молекулярной массы 10 кДа), и данный раствор заменяли 20 мМ цитратным буфером, рН 6,0. Очистку проводили при комнатной температуре с использованием системы очистки белка АКТА explorer 100 (GE Healthcare) и колонки ионообменной хроматографии Poros XS (ThermoFisher). Во-первых, хроматографическую колонку уравновешивали подвижной фазой А (20 мМ лимонная кислота, рН 6,0). Белковый раствор, обработанный, как описано выше, загружали, как только исходный уровень становился стабильным, и затем уравновешивали подвижной фазой А. Затем данную колонку промывали 15 объемами колонки градиента от А (20 мМ лимонная кислота, рН 6,0) до Б (20 мМ лимонная кислота, 200 мМ аргинин, рН 6,0) (0% Б - 100% Б, 80 мин). Отбирали главный пик элюции, и отобранный белковый раствор подвергали ультрафильтрационному концентрированию (номинальный порог отсечения молекулярной массы 10 кДа), и затем данный раствор заменяли 20 мМ лимонной кислотой, 140 мМ аргинином, рН 6,0; стерилизовали посредством фильтрования и затем хранили при 4°С после добавления 0,02% Tween 80. Чистота очищенных молекул гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h, проанализированная ГФ-ВЭЖХ, составляла 98,54%, как показано на Фиг. 6; также проводили анализ КЭ, и чистота составляет 96,44%, как показано на Фиг. 7.

Пример 5. Активность связывания мишени гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Для определения способности к связыванию гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ с одним антигеном использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Подробный способ является следующим: 96-луночный планшет ELISA с сильной адсорбцией (Costar, каталожный номер 42592) покрывали 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого PD-L1 (Sino Biological Inc., каталожный номер 100 84-Н08Н) или человеческого 4-1ВВ (Sino Biological Inc., каталожный номер 10041-Н08Н) в объеме 100 мкл на лунку с использованием раствора карбонатного буфера, рН 9,6, при 4°С в течение ночи. Данный планшет 5 раз промывали PBST (фосфатно-солевой буфер с Tween) и затем блокировали с использованием PBST с 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) - 300 мкл/лунку, инкубировали при 25°С в течение 1 часа и затем промывали 5 раз PBST. Образцы гетеродимерного антитела серийно разводили в PBST с 1% BSA, и добавляли контроль -100 мкл на лунку и инкубировали при 25°С в течение 1 часа. Данный планшет 5 раз промывали PBST. Затем добавляли меченное пероксидазой хрена антитело против человеческого IgG (Chemicon, каталожный номер АР309Р), разведенное 1:10000 в PBST с 1% BSA, 100 мкл на лунку, и инкубировали при 25°С в течение 1 часа. Данный планшет 5 раз промывали PBST. Добавляли колориметрический субстрат ТМВ (тетраметилбензидин), 100 мкл/лунку, и проявляли при комнатной температуре в течение 10 минут.Добавляли 1 М H2SO4, 100 мкл/лунку, для остановки развития окраски. Считывали поглощение при 450 нм на микропланшетридере.

Тем временем, использовали клетки GS-H2/4-1BB для определения способности связывания гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ с антигеном 4-1ВВ. Подробный способ является следующим: клетки GS-H2/4-1BB (приобретенные у GenScript) отбирали и один раз промывали холодным DPBS (фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко) (GIBCO, каталожный номер 14190-136), содержащим 2% FBS (фетальная бычья сыворотка) (Hyclone, каталожный номер SH30084.03). Клетки GS-H2/4-1BB ресуспендировали в холодном DPBS с 2% FBS при плотности 5×10⁶ клеток/мл. 100 мкл суспензии клеток добавляли в каждую пробирку, а также 100 мкл образца серийно разведенного гетеродимерного антитела и контроль. Пробирки инкубировали на льду в течение 30 минут, дважды промывали DPBS, содержащим 2% FBS, и ресуспендировали в 200 мкл холодного DPBS с 488A-Fab против человеческого IgG (конечная концентрация 5 мкг/мл), содержащего 2% FBS. Пробирки затем инкубировали на льду в течение 30 минут, защищая их от света, дважды промывали DPBS, содержащим 2% FBS, и вновь ресуспендировали в 500 мкл холодного DPBS. Суспензию клеток выявляли и анализировали на проточном цитометре (BD, FACS Calibur), и считывали интенсивность флуоресценции клеток.

Как продемонстрировано результатами Фиг. 8А, гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h имеет высокую аффинность с PD-L1, которая слегка ниже, чем активность связывания антигена двухвалентного моноклонального антитела против PD-L1. Как показано на Фиг. 8Б, аффинность гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h с 4-1ВВ является относительно низкой - ниже, чем активность связывания антигена 4-1ВВ двухвалентного моноклонального антитела. Как показано на Фиг. 8В, аффинность гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h с 4-1ВВ является относительно высокой выше, чем активность связывания антигена двухвалентного моноклонального антитела против 4-1ВВ.

Пример 6. Активность блокирования связывания лиганд-рецептор гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ

Способ выявления активности блокирования связывания PD-L1 с PD-1 и CD80 является следующим: 96-луночный планшет ELISA с высоким связыванием покрывали 1 мкг/мл человеческого PD-L1-Fc (ACROBiosystems, каталожный номер PD1-H5258), 100 мкл на лунку, с использованием раствора карбонатного буфера, рН 9,6, при 4°С в течение ночи и 5 раз промывали PBST. Данный планшет затем блокировали PBST, содержащим 1% BSA, 300 мкл/лунку, инкубировали при 25°С в течение 1 часа и 5 раз промывали PBST. Добавляли образцы гетеродимерного антитела, серийно разведенные в PBST с 1% BSA, и контроль, 50 мкл на лунку, а также 50 мкл меченного биотином PD-l-Fc (Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., LTD.) в концентрации 40 нМ (конечная концентрация 20 нМ) или 50 мкл меченного биотином CD80-Fc (ACROBiosystems, каталожный номер B71-H82F2) в концентрации 100 нМ (конечная концентрация 50 нМ), и данный планшет инкубировали при 25°С в течение 90 минут и 5 раз промывали PBST. Затем добавляли стрептавидин-HRP (пероксидаза хрена) (BD Pharmingen, каталожный номер 554066), разведенный 1:1000 в PBST с 1% BSA, 100 мкл на лунку, и данный планшет инкубировали при 25°С в течение 1 часа и 5 раз промывали PBST. Добавляли колориметрический субстрат ТМВ, 100 мкл на лунку, и проявляли при комнатной температуре в течение 10 минут.Затем добавляли 1 М H2SO4, 100 мкл/лунку, для остановки развития окраски. Считывали поглощение при 450 нм на микропланшетридере.

Как демонстрируется результатом Фиг. 9А, гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h способно блокировать связывание PD-L1 с PD-1 со слегка более слабой активностью, чем активность двухвалентного моноклонального антитела против PD-L1. Как показано на Фиг. 9Б, гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h способно блокировать связывание PD-L1 с CD80.

Пример 7. Модулирование активности Т-клеток гетер одимерным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ

Использовали реакцию смешанных лимфоцитов (MLR) для определения модулирующей активности гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ на иммунный ответ Т-клеток.

Получение человеческих дендритных клеток (DC): человеческие моноциты выделяли согласно инструкциям набора для выделения клеток-моноцитов (Miltenyi Biotech, каталожный номер 130091153). Вкратце, РВМС (одноядерные клетки периферической крови) (Allcells, каталожный номер РВ0005-С) один раз промывали DPBS (GIBCO, каталожный номер 14190-136) и затем ресуспендировали в количестве 10⁷ клеток на 40 мкм буфера для разделения (PBS с 2 мМ EDTA, 0,5% BSA, рН 7,2) (все следующие использованные количества приводятся для 10⁷ клеток), добавляли 10 мкл реактива, блокирующего FcR, и 10 мкл смеси антитела к биотину и инкубировали при 4°С в течение 5 минут.Затем добавляли 30 мкл буфера для разделения и 20 мкл микрошариков против биотина, и инкубировали при 4°С в течение 10 минут.Человеческие моноциты получали после пропускания через разделяющую колонку MACS (магнитно-активированная клеточная сортировка). Человеческие моноциты ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI 1640 (GIBCO, каталожный номер 22400-089) при плотности клеток 5хЮ^б/мл и высевали во флакон для культивирования клеток и культивировали в полной среде (RPMI 1640 с 10% FBS) с добавлением 200 нг/мл GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) (Sino Biological Inc., каталожный номер 10015-HNAH) и 100 нг/мл IL-4 (Sino Biological Inc., каталожный номер 11846-HNAE). Клетки инкубировали в течение 3 суток, среду заменяли и инкубировали в течение еще 3 суток. Затем данную среду заменяли полной средой (RPMI 1640 с 10% FBS), содержащей 200 нг/мл GM-CSF, 100 нг/мл IL-4 (интерлейкин-4) и 20 нг/мл TNF-a (Sino Biological Inc., каталожный номер 10602-HNAE) и инкубировали в течение одних суток с получением DC.

Получение человеческих Т-клеток: человеческие клетки РВМС выделяли и отбирали для обеспечения того, что данные РВМС и РВМС для индуцирования клеток DC происходят от разных индивидов. Человеческие Т-клетки выделяли согласно инструкциям набора для выделения всех Т-клеток (Miltenyi Biotech, каталожный номер 130096535). Вкратце, РВМС один раз промывали DPBS и затем ресуспендировали в количестве 10⁷ клеток на 40 мкл буфера для разделения (PBS с 2 мМ EDTA, 0,5% BSA, рН 7,2) (все следующие использованные количества приводятся для 10⁷ клеток). Добавляли 10 мкл смеси для антитела против биотина для всех Т-клеток и инкубировали при 4°С в течение 5 минут.Затем добавляли 30 мкл буфера для разделения и 20 мкл смеси микрошариков для всех Т-клеток и инкубировали при 4°С в течение 10 минут.Т-клетки получали после пропускания через разделяющую колонку MACS.

Отобранные человеческие DC и человеческие Т-клетки ресуспендировали в полной среде (RPMI 1640 с 10% FBS) и высевали в 96-луночный планшет в количестве 1х10⁴ клеток/лунку и 1×10⁵ клеток/лунку, соответственно, смешивали и инкубировали. Добавляли образцы гетеродимерного антитела, серийно разведенного полной средой, и контроль. Культуральный планшет помещали в инкубатор с СО₂ при 37°С и инкубировали в течение 5 суток. После инкубации супернатанты удаляли из лунок и содержание цитокинов выявляли с использованием набора для выявления IL-2 (RayBiotech, каталожный номер ELH-IL2) согласно его инструкциям. Вкратце, 100 мкл стандартных и разведенных образцов добавляли в планшет для выявления образца и инкубировали при 25°С в течение 2,5 часов. Данный планшет 5 раз промывали PBST. Затем добавляли 100 мкл меченного биотином выявляющего антитела и инкубировали при 25°С в течение 1 часа. Планшет 5 раз промывали PBST. Затем добавляли стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, 100 мкл/лунку, и инкубировали при 25°С в течение 45 минут.Планшет 5 раз промывали PBST. Добавляли колориметрический субстрат ТМВ, 100 мкл на лунку, и проявляли при комнатной температуре в течение 10 минут.Затем добавляли 1 М H₂SO₄, 100 мкл/лунку, для остановки развития окраски. Считывали поглощение при 450 нм на микропланшетридере.

Как демонстрируется результатами Фиг. 10, человеческие Т-клетки могут секретировать IL-2 при стимуляции аллогенными DC. Добавления двухвалентных антител против PD-L1 и против 4-1ВВ могут усиливать активацию Т-клеток и стимулировать секрецию цитокинов. Гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h также демонстрировало очень сильную активность модуляции Т-клеток и значимо стимулировало секрецию цитокина IL-2.

Пример 8. Агонистическая активность 4-1ВВ, опосредованная гетеродимерным антителом против PD-L1/против 4-1ВВ

Клетки GS-H2/4-1BB (приобретенные у GenScript) отбирали и один раз промывали средой MEM+Glu (GIBCO, каталожный номер 41090101) с 2% FBS (Hyclone, каталожный номер SH30084.03). Клетки GS-H2/4-1BB ресуспендировали в среде MEM+Glu с 2% FBS при плотности 1х10⁵ клеток/мл. Данную суспензию клеток добавляли в 96-луночный культуральный планшет с плоскодонными ячейками (Costar, каталожный номер 3599), 100 мкл на лунку, и затем помещали в инкубатор с СО₂ при 37°С в течение 2 часов для обеспечения прикрепления клеток к культур ал ьному планшету. Образцы гетеродимерного антитела и контроля разводили в среде MEM+Glu с 2% FBS, из которой отбирали 50 мкл и добавляли в планшет для культуры клеток с посеянными клетками GS-H2/4-1BB. Тем временем, клетки DLD-1/PD-L1 (DLD-1 приобретали в Китайской академии наук) отбирали и использовали для получения суспензии клеток с концентрацией 1х10⁵ клеток/мл с использованием среды MEM+Glu с 2% FBS, из которой затем отбирали 50 мкл и добавляли в планшет для культуры клеток с добавленными образцами гетеродимерного антитела и контроля, и с посеянными клетками GS-H2/4-1BB. Данный планшет для культуры клеток помещали в инкубатор с СОг при 37°С на 24 часа. Отбирали супернатанты культуры клеток и выявляли их содержание цитокинов с использованием набора для выявления IL-8 (Dakewe Biotech Co., Ltd., каталожный номер 1110802) согласно его инструкциям. Вкратце, в планшет для выявления образца добавляли 100 мкл стандартных и разведенных образцов, а также 50 мкл выявляющего антитела, меченного биотином, инкубировали при 25°С в течение 1 часа и 5 раз промывали PBST. Затем добавляли стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, 100 мкл/лунку, и планшет инкубировали в течение 1 часа при 25°С, и 5 раз промывали PBST. Затем добавляли колориметрический субстрат ТМВ, 100 мкл на лунку, и проявляли планшет при комнатной температуре в течение 10 минут.Добавляли 1 М H₂SO₄, 100 мкл/лунку, для остановки развития окраски. Считывали поглощение при 450 нм на микропланшетридере.

Как демонстрируют результаты Фиг. 11, добавление двухвалентного моноклонального антитела против 4-1ВВ может в определенной степени опосредовать активацию клеток GS-H2/4-1BB и секрецию небольшого количества IL-8. Добавление двухвалентного антитела против PD-L1 не может активировать клетки GS-H2/4-1BB. В то время как гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h может сшивать PD-L1 на клетках DLD-1/PD-L1 с 4-1ВВ на клетках GS-H2/4-1BB, приводя к агрегации 4-1ВВ и сильной активации клеток GS-H2/4-1BB, а также к продукции большого количества IL-8.

Пример 9. Исследование эффективности гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ против опухоли МС38 у мышей с нокаутированным геном

В качестве экспериментального материала выбирали 6-8-недельных самок дважды гуманизированных мышей hPD-L1/h4-lBB (у которых были нокаутированы PD-L1 и 4-1BB мышиного происхождения и сверхэкспрессированы PD-L1 и 4-1ВВ человеческого происхождения, Biocytogen, Jiangsu). Через одну неделю после адаптации данных мышей к среде каждой мыши подкожно инокулировали в правую часть спины 5х10⁵ клеток мышиной опухоли толстой кишки MC38/hPD-L1 (МС38 приобретали у Shunran Biology, Шанхай). Как только опухоли вырастали до объема примерно 100 мм³, мышей делили на разные группы согласно объемам опухолей, по 6 несущих опухоль мышей на группу. Вводили, соответственно, носитель (DPBS, GIBCO, каталожный номер 14190-136), 35 нмоль/кг моноклонального антитела против PD-L1, 35 нмоль/кг моноклонального антитела против 4-1ВВ и 70 нмоль/кг гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ (принимая во внимание тот факт, что данное моноклональное антитело представляет собой двухвалентное антитело, а обе активности биспецифичного антитела - против PD-L1 и против 4-1ВВ являются одновалентными) 3 раза в неделю в течение 2 последовательных недель посредством внутрибрюшинной инъекции. Объемы опухоли измеряли дважды в неделю, начиная с суток введения, и измеряли длинное измерение - а и короткое измерение 6, и формула для расчета объема опухоли представляет собой: объем опухоли (мм³)=(а × b²)/2. Измерение объема опухоли продолжалось в течение 4 недель, т.е. наблюдение продолжалось в течение еще 2 недель после прекращения введения лекарственного средства.

Как демонстрируют результаты Фиг. 12, гетеродимерное антитело против PD-L1/против 4-1ВВ BH3120h имеет более сильную противоопухолевую эффективность, чем двухвалентное антитело против PD-L1 и двухвалентное антитело против 4-1ВВ в модели гомологичной опухоли.

Пример 10. Исследование эффективности совместного введения гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ и антитела против PD-1 против опухоли СТ-26 у нокаутированных мышеи

В качестве экспериментального материала выбирали 6-8-недельных самок трижды нокаутированных мышей hPD-l/hPD-L1/hCD137 (Gempharmatech Co., Ltd, Jiangsu). Через одну неделю после адаптации данных мышей к среде каждой мыши подкожно инокулировали в правую часть спины 5×10⁵ клеток мышиной опухоли толстой кишки CT-26/hPD-L1 (Gempharmatech Co., Ltd, Jiangsu). Как только опухоли вырастали до объема примерно 100 мм³, мышей случайным образом делили на разные группы согласно объемам опухоли. Вводили, соответственно, носитель (DPBS), 10 мг/кг гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ, 5 мг/кг моноклонального антитела против PD-1 (ВН2917b), а в группе совместного введения 10 плюс 5 мг/кг - один раз каждые двое суток, всего 4 раза посредством внутрибрюшинной инъекции. Объемы опухоли измеряли трижды в неделю, начиная с суток введения, и измеряли длинное измерение и короткое измерение, и формула для расчета объема опухоли представляет собой: объем опухоли=[(короткое измерение² х длинное измерение)/2]. Показатель ингибирования роста опухоли рассчитывали следующим образом: показатель ингибирования роста опухоли=[1-RTV (опытная rpynna)/RTV (контрольная группа)] × 100%. RTV: относительный объем опухоли, RTV=V_t/V₀, V_t: объем опухоли во время t, V₀: объем опухоли в начале. Как демонстрируют результаты Фиг. 13, совместное введение гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ ВИЗ 120 и антитела против PD-1 демонстрирует более сильную синергическую противоопухолевую эффективность в модели гомологичной опухоли. Через 20 суток после инокулирования клеток CT-26-hPD-L1 объемы опухолей как в отношении ВН2917b (5 мг/кг), так и ВИЗ 120 (10 мг/кг) снижались по сравнению с контрольной группой с показателями ингибирования роста опухоли 44,1% и 37,3% соответственно. ВН3120 плюс ВН2917b (10 плюс 5 мг/кг) могут значимо ингибировать пролиферацию опухоли с показателем ингибирования роста опухоли 79,6%. При осуществлении анализа с использованием t-критерия и при сравнении с группой ВИЗ 120 (10 мг/кг) объем опухоли для группы совместного введения очевидно снижался, и данное различие является статистически значимым (р меньше 0,05) по сравнению с группой ВН2917b (5 мг/кг), объем опухоли для группы совместного введения снижался, но данное различие не является статистически значимым (р больше 0,05).

Пример 11. Исследование эффективности совместного введения гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ и антитела против PD-1 против опухоли МС38 у нокаутированных мышей

В качестве экспериментального материала выбирали 6-8-недельных самок дважды нокаутированных мышей hPD-l/hCD137 (Gempharmatech Co., Ltd и Biocytogen, Jiangsu). Через одну неделю после адаптации данных мышей к среде каждой мыши подкожно инокулировали в правую часть спины 1×10⁶ клеток мышиной опухоли толстой кишки MC38/hPD-L1 (Gempharmatech Co., Ltd, Jiangsu). Как только опухоли вырастали до объема примерно 100 мм³, мышей случайным образом делили на разные группы согласно объемам опухоли. Вводили, соответственно, носитель (DPBS), 1 мг/кг и 3 мг/кг гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ, 5 мг/кг моноклонального антитела против PD-1 (ВН2917b), а в группе совместного введения 1 плюс 5 мг/кг - 2 раза в неделю 6 раз посредством внутрибрюшинной инъекции. Объемы опухоли измеряли трижды в неделю, начиная с суток введения, и измеряли длинное измерение и короткое измерение, и формула для расчета объема опухоли представляет собой: объем опухоли=[(короткое измерение² х длинное измерение)/2]. Показатель ингибирования роста опухоли рассчитывали следующим образом: показатель ингибирования роста опухоли=[1-RTV (опытная rpynna)/RTV (контрольная группа)] × 100%. RTV: относительный объем опухоли, RTV=V_t/V₀, V_t: объем опухоли во время t, V₀: объем опухоли в начале. Как демонстрируют результаты Фиг. 14, совместное введение гетеродимерного антитела против PD-L1/против 4-1ВВ ВИЗ 120 и антитела против PD-1 демонстрирует более сильную синергическую противоопухолевую эффективность в модели гомологичной опухоли. Через 33 суток после инокулирования клеток hPD-L1/MC38 группы введения одиночного антитела демонстрировали определенный эффект ингибирования на опухоль дозозависимым способом, причем показатели ингибирования роста опухоли являются следующими: ВН2917b (5 мг/кг) 76,58%, ВИЗ 120 (3 мг/кг) 47,07%, ВИЗ 120 (1 мг/кг) 30,95% соответственно. Совместное введение ВН3120 плюс BH2917b (1 плюс 5 мг/кг) может значимо ингибировать пролиферацию опухоли с TGItv% (процент ингибирования роста опухоли по объему опухоли) 122,40%. При осуществлении анализа с использованием t-критерия и при сравнении с группой ВН3120 (1 мг/кг) данное различие является статистически значимым (р меньше 0,05) по сравнению с группой ВН2917b (5 мг/кг), данное различие является статистически значимым (р меньше 0,01).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BEIJING HANMI PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> Биспецифичное антитело против PD-L1/против 4-1BB в гетеродимерной

форме, подобное по структуре природному антителу, и его получение

<130> LZ2120047CN07

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи

<400> 1

gacatccaga tgacccagtc cccttcctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca aggcctccca ggatgtgcac accgccgtgg cttggattca gcagaagccc 120

ggcaagtccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaacc ggtacaccgg cgtgcctagc 180

aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatctcctc cctgcagcct 240

gaggacatcg ccacctatta ctgccagcag cactacatca cccccctgac cttcggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область легкой цепи

<400> 3

cgtacggtgg ccgcccccag cgtcttcatt tttccaccct ctgacgaaca gctgaagtca 60

gggacagctt ccgtggtctg tctgctgaac aatttttacc ccagggaggc caaagtgcag 120

tggaaggtcg ataacgctct gcagagcgga aattctcagg agagtgtgac agaacaggac 180

tcaaaagatt ccacttatag cctgtctagt accctgacac tgtccaaggc agactacgaa 240

aagcataaag tgtatgcctg tgaggtcaca catcagggtc tgtcaagccc cgtcactaag 300

tccttcaacc ggggagaatg c 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область легкой цепи

<400> 4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи

<400> 5

gaagtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ctggctcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctccggctt caacatcgag gacacctaca tccactgggt gaggcaggct 120

cccggacagg gactggagtg gatgggcagg atcgatcccg ccaacgccaa caccaagtac 180

gaccccaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgata ccagcaccaa caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgag gtccgaggac acagccgtgt actactgtgg caggggactg 300

ggcgcctggt ttgcctactg gggacagggc accctggtga ccgtgtcctc c 351

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область тяжелой цепи

<400> 7

gctagcacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaaccc 300

aagtcctgcg ataagaccca cacatgccct ccctgtcctg ctcccgaact gctgggagga 360

ccctccgtct tcctgttccc ccccaagccc aaagacacac tgatgatcag caggacccct 420

gaagtgacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtcaa gtttaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt ccacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540

agcacctaca gggtcgtgtc cgtgctgacc gtgctccacc aagattggct caacggcaag 600

gagtataagt gcaaagtcag caacaaggcc ctccccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 660

aaggccaagg gccaaccgcg ggaacctcaa gtgtataccc tccctcccag ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaagtctc cctcttgtgc ctggtcaagg gattctaccc ttccgacatt 780

gccgtcgaat gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagacaac cccccccgtc 840

ctgcgcagcg acggatcctt cttcctgtac tccaagctca ccgtggacaa gagccggtgg 900

caacagggca acgtgttctc ctgtagcgtg atgcacgaag ccctccacaa ccactatacc 960

cagaagagcc tgagcctcag ccccggcaaa 990

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область тяжелой цепи

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Arg Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи

<400> 9

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca gagccagcca ggacatcagc aattacctga attggtacca gcagaagcct 120

ggcaaggtgc ctaagctgct gatctaccac accagcagac tgcacagcgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240

gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcag ggccacaccc tgcctagaac cttcggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи

<400> 11

caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggcagcag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tcaattgggt gagacaggct 120

ccgggccaag ggctggagtg gatgggcaat atctacccta gcgacagcta caccaattac 180

aatcagaagt tcaaggacag agtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgtac 300

tacggcagca gccctttcga ctactgggga caaggcacca ccgtgaccgt gagcagc 357

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область тяжелой цепи

<400> 13

gctagcacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaaccc 300

aagtcctgcg ataagaccca cacatgccct ccctgtcctg ctcccgaact gctgggagga 360

ccctccgtct tcctgttccc ccccaagccc aaagacacac tgatgatcag caggacccct 420

gaagtgacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtcaa gtttaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt ccacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacgcc 540

agcacctaca gggtggtcag cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct caacggcaag 600

gagtacaagt gcaaagtctc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc 660

aaggctaagg gacagcccag ggagccccaa gtgtacaccg agcctcccag ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaagtctc cctcacctgc ctggtcaagg gattctaccc ttccgacatt 780

gccgtcgaat gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagacaac cccccccgtc 840

ctggatagcg acggatcctt cttcctgctc tccgtgctca ccgtcgacaa gagcagatgg 900

cagcagggca acgtgttcag ctgtagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

cagaagagcc tgtccctcag ccccggcaag 990

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> константная область тяжелой цепи

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Glu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Leu Ser Val Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 PD-L1

<400> 15

Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2 PD-L1

<400> 16

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 PD-L1

<400> 17

Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 PD-L1

<400> 18

Lys Ala Ser Gln Asp Val His Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR2 PD-L1

<400> 19

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3 PD-L1

<400> 20

Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 4-1BB

<400> 21

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn

1 5 10

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2 4-1BB

<400> 22

Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 4-1BB

<400> 23

Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 4-1BB

<400> 24

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR2 4-1BB

<400> 25

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3 4-1BB

<400> 26

Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg Thr

1 5

<---

Claims

1. Биспецифичное антитело, способное одновременно связываться с PD-L1 и 4-1BB, содержащее первую антигенсвязывающую функциональную область, которая специфично связывается с PD-L1 (лиганд-1 программируемой смерти), и вторую антигенсвязывающую функциональную область, которая специфично связывается с 4-1BB,

где

первая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с PD-L1, содержит:

(А) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

(а) HCDR1 (определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи), которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15,

(Б) вариабельную область легкой цепи, содержащую

(а) LCDR1 (определяющую комплементарность область 1 легкой цепи), которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 18,

(в) LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и где

вторая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит:

2. Биспецифичное антитело по п. 1, в котором первая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с PD-L1, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2.

3. Биспецифичное антитело по п. 1 или 2, в котором вторая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10.

4. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-3,

в котором первая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с PD-L1, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2; и

в котором вторая антигенсвязывающая функциональная область, которая специфично связывается с 4-1ВВ, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10.

5. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-4, в котором первая антигенсвязывающая функциональная область и вторая антигенсвязывающая функциональная область выбраны из группы, состоящей из фрагментов Fab, фрагментов scFv и фрагментов Fv вариабельного домена.

6. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-5, в котором и первая антигенсвязывающая функциональная область, и вторая антигенсвязывающая функциональная область представляют собой фрагменты Fab.

7. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-6, в котором его фрагмент Fab содержит отличную первую вариабельную область тяжелой цепи и отличную вторую вариабельную область тяжелой цепи, а также отличную первую вариабельную область легкой цепи и отличную вторую вариабельную область легкой цепи.

8. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-5, в котором одна из первой антигенсвязывающей функциональной области и второй антигенсвязывающей функциональной области представляет собой фрагмент Fab, а другая представляет собой scFv.

9. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-8, содержащее первую цепь Fc и вторую цепь Fc,

где и первая цепь Fc и вторая цепь Fc представляют собой фрагменты Fc иммуноглобулина G, содержащие аминокислотные замены, и первая цепь Fc, и вторая цепь Fc совместно составляют гетеродимер, который может связываться с рецептором Fc;

где первая цепь Fc и вторая цепь Fc связаны с первой антигенсвязывающей функциональной областью и второй антигенсвязывающей функциональной областью, соответственно, посредством ковалентной связи или линкера; и

где либо первая цепь Fc, либо вторая цепь Fc содержит аминокислотные замены T366L и D399R в положениях 366 и 399, а другая содержит аминокислотные замены L351E, Y407L и K409V в положениях 351, 407 и 409, где данные положения аминокислот пронумерованы согласно системе нумерации индекса EU Kabat.

10. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-9, в котором массовые отношения гомодимеров, образованных первой цепью Fc и ковалентно связанной с ней первой антигенсвязывающей функциональной областью, и второй цепью Fc и ковалентно связанной с ней второй антигенсвязывающей функциональной областью указанного биспецифичного антитела составляют меньше чем 50% от общего количества всех полипептидных цепей в растворе, содержащем восстановитель, в котором не присутствуют другие полипептиды, за исключением указанных цепей Fc и антигенсвязывающих функциональных областей.

11. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-10, содержащее пару первой тяжелой цепи/первой легкой цепи, которая специфично связывается с PD-L1, где данная первая тяжелая цепь имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8; данная первая легкая цепь имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.

12. Биспецифичное антитело по любому из пп. 1-11, содержащее пару второй тяжелой цепи/второй легкой цепи, которая специфично связывается с 4-1ВВ, где данная вторая тяжелая цепь имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 14; данная вторая легкая цепь имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.

13. Выделенный полинуклеотид, кодирующий биспецифичное антитело по любому из пп. 1-12.

14. Композиция для лечения опухоли, экспрессирующей PD-L1, содержащая биспецифичное антитело по любому из пп. 1-12 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Композиция по п. 14, дополнительно содержащая второе терапевтическое средство, предпочтительно второе терапевтическое средство и биспецифичное антитело находятся в разных частях данной композиции, и предпочтительно второе терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из второго антитела, иммунотерапевтического средства, таргетного терапевтического средства или химиотерапевтического средства, предпочтительно данное второе терапевтическое средство представляет собой антитело против PD-1 и/или агонист STING.

16. Применение биспецифичного антитела по любому из пп. 1-12, и/или композиции по п. 14 или 15 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения опухолей, экспрессирующих PD-L1, у субъекта.

17. Применение по п. 16, где субъект представляет собой млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека.

18. Применение по п. 16, где опухоли, экспрессирующие PD-L1, выбраны из группы, состоящей из следующих опухолей: лейкоз, лимфома, миелома, опухоль головного мозга, плоскоклеточный рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, носоглоточный рак, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, саркома матки, рак простаты, рак мочевого пузыря, почечно-клеточный рак, меланома, мелкоклеточный рак легкого и рак кости.

19. Способ предупреждения и/или лечения опухолей, экспрессирующих PD-L1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, биспецифичного антитела в гетеродимерной форме по любому из пп. 1-12 и/или композиции по п. 14 или 15.

20. Способ по п. 19, где субъект представляет собой млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека.

21. Способ по п. 19, где опухоли, экспрессирующие PD-L1, выбраны из группы, состоящей из следующих опухолей: лейкоз, лимфома, миелома, опухоль головного мозга, плоскоклеточный рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, носоглоточный рак, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, саркома матки, рак простаты, рак мочевого пузыря, почечно-клеточный рак, меланома, мелкоклеточный рак легкого и рак кости.