RU2824515C1 - Моноклональное антитело к активированному белку с человека и его получение и применение - Google Patents
Моноклональное антитело к активированному белку с человека и его получение и применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2824515C1 RU2824515C1 RU2022129742A RU2022129742A RU2824515C1 RU 2824515 C1 RU2824515 C1 RU 2824515C1 RU 2022129742 A RU2022129742 A RU 2022129742A RU 2022129742 A RU2022129742 A RU 2022129742A RU 2824515 C1 RU2824515 C1 RU 2824515C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- ser
- antibody
- gly
- apc
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 103
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 12
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims abstract description 35
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 43
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 37
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 37
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 37
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 33
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 25
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 24
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 17
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 15
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 13
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 11
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims description 9
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 9
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 4
- 206010053476 Traumatic haemorrhage Diseases 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 2
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 abstract 2
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 101
- 102220319450 rs1554378297 Human genes 0.000 description 66
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 47
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 33
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 26
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 25
- QTVUPXHPSXZJKH-ULQDDVLXSA-N Phe-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N QTVUPXHPSXZJKH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 25
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 108010026668 snake venom protein C activator Proteins 0.000 description 14
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 13
- ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 13
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 13
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 13
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 13
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 13
- HTSSXFASOUSJQG-IHPCNDPISA-N Asp-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HTSSXFASOUSJQG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 13
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 13
- XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N Gln-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 13
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 13
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 13
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 13
- YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 13
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 13
- XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N Gly-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 13
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 13
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 13
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 13
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 13
- DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N His-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N 0.000 description 13
- GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N Ile-Tyr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 13
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 13
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 13
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 13
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 13
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 13
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 13
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 13
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 13
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 13
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 13
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 13
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 13
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 13
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 13
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 13
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 13
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 13
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 13
- PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N Trp-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N 0.000 description 13
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 13
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 13
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 13
- MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 13
- LDKDSFQSEUOCOO-RPTUDFQQSA-N Tyr-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LDKDSFQSEUOCOO-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 13
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 13
- YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 13
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 description 13
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 13
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 13
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 13
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 13
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 13
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 13
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 13
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 13
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 13
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 12
- ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- CITDWMLWXNUQKD-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Asn Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CITDWMLWXNUQKD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 12
- DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N Glu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N 0.000 description 12
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 12
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 12
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 12
- OUUBKKIJQIAPRI-LAEOZQHASA-N Val-Gln-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OUUBKKIJQIAPRI-LAEOZQHASA-N 0.000 description 12
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 12
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 11
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 11
- GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 11
- MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 11
- YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 11
- 101000595198 Homo sapiens Podocalyxin Proteins 0.000 description 11
- QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N Pro-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 11
- IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 11
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 9
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 9
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 8
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 7
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 7
- ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 7
- 102220395086 c.170T>G Human genes 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102220100163 rs201567345 Human genes 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 5
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 5
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 4
- 206010067787 Coagulation factor deficiency Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 101710121440 Proteinase-activated receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- UCDOXFBTMLKASE-HERUPUMHSA-N Ala-Ser-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N UCDOXFBTMLKASE-HERUPUMHSA-N 0.000 description 3
- GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N Asp-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000009839 Endothelial Protein C Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 208000014763 coagulation protein disease Diseases 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 102200062502 rs786202398 Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 2
- LRCIOEVFVGXZKB-BZSNNMDCSA-N Asn-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LRCIOEVFVGXZKB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 2
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000033316 Acquired hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N Asn-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100037529 Coagulation factor V Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010000020 Platelet Factor 3 Chemical group 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 201000004283 Shwachman-Diamond syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- 101150045640 VWF gene Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229940105756 coagulation factor x Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013066 combination product Substances 0.000 description 1
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 208000011664 congenital factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- -1 hydroxyl amino Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical group O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к моноклональным антителам к активированному белку С (аРС). Аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела показаны в SEQ ID NO: 5-26, а последовательности CDR показаны в SEQ ID NO: 27-92. В настоящем изобретении дополнительно предлагается биологический материал, связанный с моноклональным антителом, и моноклональное антитело, способное селективно связываться с аРС, а не с неактивированным белком С, а также применение моноклонального антитела и связанного с ним биологического материала при приготовлении лекарственного средства для лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания, и связанного с ним способа лечения. Антитела по настоящему изобретению могут блокировать антикоагулянтную активность aPC и имеют широкие перспективы применения при лечении расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания. 12 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 6 пр.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение относится к технической области моноклональных антител и относится к моноклональному антителу к активированному белку C (aPC) человека и его применению.
Описание уровня техники
Метаболические пути белка C (PC) играют решающую роль в регуляции свертывания крови и воспаления. Тромбин образует комплекс с тромбомодулином (ТМ) на сосудистых эндотелиальных клетках, тем самым активируя белок C. Активированный белок C (aPC) расщепляет активированный фактор V и фактор VIII, тем самым отрицательно регулируя образование тромбина и поддерживая баланс между тромбозом и гемостазом in vivo. aPC защищает животных от воздействия эндотоксина (LPS) или Escherichia coli. Рекомбинантные человеческие продукты aPC были одобрены FDA (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов) в качестве первого препарата для лечения тяжелого сепсиса. В настоящее время молекулярные механизмы aPC, касающиеся противовоспалительного и цитопротекторного эффектов еще недостаточно изучены. Исследования мутаций показали, что антикоагулянтная активность aPC, очевидно, не является необходимой для антиапоптотического действия aPC на эндотелиальные клетки. Сосудистые эндотелиальные рецепторы белка C (EPCR) в основном экспрессируются на эндотелии крупных сосудов и способствуют активации белка C через комплекс тромбин-TM. Недавно было продемонстрировано, что aPC, связанный с EPCR, может расщеплять PAR-1 на эндотелиальных клетках. Кроме того, это исследование показывает, что все противовоспалительные и антиапоптотические эффекты передачи сигналов aPC опосредуются PAR-1 в эндотелиальных клетках. Однако при воздействии летальной дозы LPS (липосахарид) фенотип мышей с дефицитом PAR-1 был аналогичен фенотипу контрольных мышей дикого типа, что указывало на то, что PAR-1 может быть не единственным участником регуляции воспаления и апоптоза посредством передачи сигналов aPC.
Ввиду ключевой роли aPC в регуляции патофизиологических функций in vivo было получено моноклональное антитело HAPC1573. Это антитело специфически распознает активированную форму человеческого белка C (aPC), а не белка C (Xu, US8153766B2, US9127072B2). Это антитело изменяет амидолитическую активность aPC на хромогенных пептидных субстратах и блокирует антикоагулянтную активность aPC в плазме. Что еще более важно, это антитело не влияет на расщепление внеклеточных гистонов H3 и H4 aPC, а также на цитопротекторную активность aPC на индуцированной тромбином проницаемости эндотелиальных клеток. MAPC1591 представляет собой моноклональное антитело к aPC мыши, обладающее функциями, аналогичными HAPC1573. MAPC1591 может блокировать антикоагулянтную активность aPC у мышей и поддерживать цитопротекторную активность aPC, и, таким образом, защищать людей с гемофилией A от травматического кровоизлияния. Это указывает на то, что антитело к aPC можно применять при клинических состояниях, таких как гемофилия, травма и сепсис.
Zhao et al. сообщили о последовательностях CDR HAPC1573 и гуманизированного HAPC1573 только в отношении антикоагулянтной активности, но не других активностей aPC. Эти последовательности CDR продемонстрировали in vivo защитный эффект против кровотечения в модели острой приобретенной гемофилии A у обезьян (Zhao, US9657111B2, WO2017/087391A1, Nat. Communications 2020). Рентгеновская кристаллическая структура комплекса aPC и гуманизированного HAPC1573 Fab указывает на то, что HAPC1573 может не связываться с активным сайтом aPC, но связываться с петлей автолиза aPC, содержащей известный сайт связывания aPC-FVa. Следовательно, гуманизированный HAPC1573 может ингибировать антикоагулянтное действие aPC, препятствуя взаимодействию между aPC и FVa. Ингибирующее действие гуманизированного HAPC1573 ограничивается только антикоагулянтной активностью aPC, и не влияет на его цитопротекторные, противовоспалительные и клеточные сигнальные функции. Сообщается, что концентрация aPC в плазме крови человека составляет около 40 пМ, и согласно анализу на основе поверхностного плазмонного резонанса аффинность гуманизированного HAPC1573 к aPC составляет 10 нМ. Зависимое от концентрации действие HAPC1573 на укорочение пролонгированного АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время) в плазме с дефицитом FVIII человека и в плазме с дефицитом FIX человека было продемонстрировано в анализе коагулирующей активности АЧТВ, зависящей от Protac. Даже при концентрации 50 мкг/мл HAPC1573 все еще не мог достичь максимального ингибирующего эффекта на антикоагулянтную активность aPC в этом эксперименте in vitro. Это наблюдение согласуется с наблюдением in vivo гуманизированного HAPC1573 на обезьяньей модели острой приобретенной гемофилии. В исследованиях на животных было обнаружено, что только HAPC1573 в высоких дозах 10 мг/кг и 30 мг/кг может обеспечить значимый защитный эффект. Однако такие высокие дозы не подходят для клинического применения, поэтому гуманизированный HAPC 1573 с более высокой аффинностью является предпосылкой и гарантией потенциального использования aPC в лечении в будущем.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящего изобретения предлагается моноклональное антитело к aPC. Моноклональное антитело к aPC включает исходное антитело и мутантное антитело, полученное путем мутации одного или более из следующих 6 сайтов мутации в исходном антителе.
Исходное антитело включает:
(a) CDR (область, определяющую комплементарность) тяжелой цепи, представленную любой одной или более из SEQ ID NO: 27, 28 и 29; и/или
(b) CDR легкой цепи, представленную любой одной или более из SEQ ID NO: 30, 31 и 32.
6 мутантных сайтов представляют собой:
1) N57R/W, расположенный в VL CDR2;
2) E59G/P, расположенный в VL CDR2;
3) Q93V, расположенный в VL CDR3;
4) N31F, расположенный в VH CDR1;
5) S55K, расположенный в VH CDR2; и
6) Y104T, расположенный в VH CDR3.
В настоящем описании константная область моноклонального антитела к aPC включает одну или более последовательностей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека.
Предпочтительно, в настоящем описании сайты мутаций моноклонального антитела к aPC, где исходное антитело является мутированным, включают по меньшей мере: N31F, расположенный в VH CDR1; S55K, расположенный в VH CDR2; N57R, расположенный в VL CDR2; и E59G, расположенный в VL CDR2.
Предпочтительно, в настоящем описании сайты мутации моноклонального антитела к aPC, где исходное антитело является мутированным, включают по меньшей мере: N57R, расположенный в VL CDR2; E59G, расположенный в VL CDR2; Q93V, расположенный в VL CDR3; N31F, расположенный в VH CDR1; и S55K, расположенный в VH CDR2.
Другой аспект настоящего изобретения относится к биологическому материалу, относящемуся к моноклональному антителу к aPC, который представляет собой любое одно или более из 1) - 10):
1) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую моноклональное антитело к aPC, как описано выше;
2) экспрессионную кассету, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
3) конструкцию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
4) конструкцию, содержащую экспрессионную кассету, как описано в 2);
5) систему экспрессии, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
6) систему экспрессии, содержащую кассету экспрессии, как описано в 2);
7) систему экспрессии, содержащую конструкцию, как описано в 3);
8) систему экспрессии, содержащую рекомбинантный вектор, как описано в 4);
9) пару праймеров для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность моноклонального антитела к aPC, как описано выше; и
10) слитое антитело, содержащее моноклональное антитело к aPC, как описано выше.
Другой аспект настоящего изобретения относится к препарату. Препарат представляет собой фармацевтическую композицию или набор для детектирования. Препарат включает моноклональное антитело к aPC, как описано выше, или любой один или более родственных биологических материалов. В случае фармацевтической композиции продукт приготовления дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения расстройств, связанных со свертыванием, который включает введение индивидууму, нуждающемуся в лечении, эффективного количества моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала, как описано выше. Индивид страдает от расстройств, связанных с нарушением или дефектом свертывания, или индивид нуждается в лечении свертывания крови, или индивид страдает от сепсиса или гемофилии, или индивид нуждается в регуляции гемостаза.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала при получении лекарственного средства для предотвращения и/или лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания. Расстройства, связанные с недостаточностью или дефектом свертывания включают нарушения, вызывающие коагулопатию из-за дефицита факторов свертывания крови и, таким образом, приводящие к кровотечению, и нарушения свертывания крови, вызванные травмой или хирургическим вмешательством. Кроме того, расстройства, связанные с недостаточностью или дефектом свертывания включают гемофилию, сепсис, травматическое кровотечение и тому подобное.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала для получения промотора для содействия способности aPC расщеплять гистоны H3 и H4, или для получения лекарственного средства для ингибирования антикоагулянтной активности активированного белка C у индивидуума, или для получения лекарственного средства для предупреждения и/или лечения у индивидуума, нуждающегося в свертывании крови, или для получения лекарственного средства для предупреждения и/или лечения у индивидуума, страдающего сепсисом, или для получения лекарственного средства для предупреждения и/или лечения у индивидуума, страдающего гемофилией, или для получения лекарственного средства для регулирования гемостаза у индивидуума, или для иммунологических анализов в целях диагностики и лечения заболеваний или не связанных с заболеванием, или для получения реагента или набора для детектирования aPC, или в комбинации с другими реагентами или лекарственными средствами.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения моноклонального антитела к aPC, как описано выше. Способ включает культивирование системы экспрессии моноклонального антитела к aPC в условиях, подходящих для экспрессии моноклонального антитела к aPC, для экспрессии моноклонального антитела к aPC.
Настоящее изобретение имеет следующие полезные эффекты: моноклональное антитело к aPC, представленное в настоящем изобретении, представляет собой гуманизированное антитело, полученное путем гуманизации HAPC 1573 или путем выполнения скрининга мутаций на одном сайте и комбинации сайтов одновременно. Моноклональное антитело к aPC селективно связывается и ингибирует активированный белок C, но не связывается и не ингибирует неактивированный белок C. Моноклональное антитело к aPC селективно связывается с активированным белком C человека, но не связывается с активированным белком C других видов или неактивированным белком C. Аффинность антитела значительно увеличена, и аффинность некоторых антител в 100 раз выше, по сравнению с HAPC 1573. В анализе Protac-зависимой коагуляции АЧТВ очень небольшое количество антитела, например 1 мкг/мл, используется в настоящем описании и может достичь максимального ингибирующего эффекта в отношении антикоагулянтной активности aPC. Антитело потенциально может блокировать антикоагулянтную активность aPC и имеет широкие перспективы применения при лечении расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1A-1D показана способность связывания гуманизированных моноклональных антител к aPC (Humab001-1 - Humab001-28 или HAPC-1 - HAPC-28) с aPC человека.
На фиг. 2A-2B показана способность связывания гуманизированных моноклональных антител к aPC (Humab001-13 - Humab001-20 или HAPC-13 - HAPC-20) с PC человека; на фиг 2C показана способность связывания 30120-mAb001 с aPC человека.
На фиг. 3A-3D показана способность связывания мутантных антител HAPC-14 (HAPC14-1 - HAPC14-10 или HAPC-14-1 - HAPC-14-10) с hAPC/hPC; где абсциссы на фиг. 3A-3D представляют собой соответственно 10-6 нМ, 10-4 нМ, 10-2 нМ, 100 нМ, 102 нМ и 104 нМ.
На фиг. 4A-4K показаны анализы аффинности HAPC-14 и его мутантных антител (HAPC14-1 - HAPC14-10 или HAPC-14-1 - HAPC-14-10).
На фиг. 5 показано влияние мутантного антитела HAPC-14-6 на способность aPC расщеплять гистоны.
На фиг. 6 показаны фармакодинамические эксперименты in vitro. Влияние мутантных антител HAPC-14, HAPC-14-3 и HAPC-14-6, на ингибирование антикоагулянтной активности aPC в плазме с дефицитом фактора свертывания: A: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FVIII, B: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FIX, C: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FXI, D: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FVII, E: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FXII, F: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FV, G: для плазмы с дефицитом фактора свертывания FX, H: для плазмы с дефицитом VWF.
На фиг. 7 показаны фармакодинамические эксперименты in vivo. A: эффекты инъекции фактора свертывания крови FVIII, HAPC1573 и HAPC-14-6 мышам с дефицитом фактора свертывания крови FVIII на функцию свертывания крови у указанных мышей с недостаточностью свертывания; B: эффекты инъекции различных доз HAPC-14-6 мышам с дефицитом фактора свертывания крови FVIII на функцию свертывания крови у указанных мышей с недостаточностью свертывания; C: эффекты инъекции HAPC1573 и различных доз HAPC-14-6 мышам с дефицитом фактора свертывания крови FIX на функцию свертывания крови у указанных мышей с недостаточностью свертывания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании HAPC 1573 гуманизируют, а затем оптимизируют в отношении аффинности, и оптимизированные сайты мутаций подвергают скринингу на основе Fab для окончательного получения 6 оптимальных сайтов. Кроме того, за счет комбинации мутаций аффинность полученных оптимизированных мутантов в 100 раз выше, чем у HAPC 1573, и в анализе Protac-зависимой коагуляции АЧТВ мутантное антитело в количестве 1 мкг/мл может достичь максимального ингибирующего эффекта на антикоагулянтную активность aPC и, таким образом, иметь возможность дальнейшего клинического применения.
В настоящем описании предложено антитело к aPC, а именно моноклональное антитело 14 (HAPC-14) к aPC. Антитело включает:
(a) тяжелую цепь, содержащую CDR тяжелой цепи, представленную любой одной или более из SEQ ID NO: 27, 28 и 29; и/или
(b) легкую цепь, содержащую CDR легкой цепи, представленную любой одной или более из SEQ ID NO: 30, 31 и 32.
Моноклональное антитело 14 к aPC (HAPC-14), представленное в настоящем описании, имеет последовательность тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 5, и последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 6.
Настоящее изобретение дополнительно относится к мутантному антителу моноклонального антитела (моноклональное антитело 14 к aPC) к активированному белку C (aPC) человека. После конструирования, скрининга и статистической оценки мутантного антитела на основе последовательности моноклонального антитела 14 к aPC было обнаружено, что мутации в одном или более из следующих шести сайтов значительно влияют на способность связывания фрагмента Fab моноклонального антитела с иммобилизованным антителом, и мутантное антитело обладает высокой аффинностью, высокой функциональной активностью и небольшими отличиями от последовательности зародышевой линии. Шесть сайтов представляют собой:
а) N57R/W, расположенный в VL CDR2 (N57R предпочтительнее N57W);
b) E59G/P, расположенный в VL CDR2 (E59G предпочтительнее E59P);
c) Q93V, расположенный в VL CDR3;
d) N31F, расположенный в VH CDR1;
e) S55K, расположенный в VH CDR2; и
f) Y104T, расположенный в VH CDR3.
Наиболее важными мутантными сайтами являются N57R в легкой цепи и N31F в тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация моноклонального антитела к aPC, необходимая для полного ингибирования антикоагулянтной активности aPC и восстановления нормальной функции свертывания крови в мышиной модели гемофилии гуманизированного белка C (haPC), составляет всего 1 мкг/мл.
Для удобства описания комбинации мутаций будут описаны в коротких формах. N57R относится к N57R, расположенному в VL CDR2, N57W относится к N57W, расположенному в VL CDR2, E59G относится к E59G, расположенному в VL CDR2, E59P относится к E59P, расположенному в VL CDR2, Q93V относится к Q93V, расположенному в VL CDR3, N31F относится к N31F, расположенному в VH CDR1, S55K относится к S55K, расположенному в VH CDR2, и Y104T относится к Y104T, расположенному в VH CDR3.
В настоящем описании комбинация мутаций в шести сайтах включает, но не ограничивается ими, (1) только одну мутацию в любом из следующих сайтов: N57R, N57W, E59G, E59P, Q93V, N31F или S55K; или (2) мутации в обоих из следующих сайтов: N57R и N57W; E59G и E59P; Q93V и N31F; N31F и S55K; N57R и E59G; N57R и E59P; N57R и Q93V; N57R и N31F; N57R и S55K; N57W и E59P; N57W и Q93V; N57W и N31F; N57W и S55K; E59G и Q93V; E59G и N31F; E59G и S55K; E59P и N31F; E59P и S55K; или Q93V и S55K; или (3) мутации во всех следующих трех сайтах: N57R, N57W и E59G; N57R, N57W и E59P; N57R, N57W и Q93V; N57R, N57W и N31F; N57R, N57W и S55K; N57R, E59G и E59P; N57R, E59G и Q93V; N57R, E59G и N31F; N57R, E59G и S55K; N57R, E59P и Q93V; N57R, E59P и N31F; N57R, E59P и S55K; N57R, Q93V и N31F; N57R, Q93V и S55K; N57R, N31F и S55K; N57W, E59G и E59P; N57W, E59G и Q93V; N57W, E59G и N31F; N57W, E59G и S55K; N57W, E59P и Q93V; N57W, E59P и N31F; N57W, E59P и S55K; N57W, Q93V и N31F; N57W, Q93V и S55K; N57W, N31F и S55K; E59G, E59P и Q93V; E59G, E59P и N31F; E59G, E59P и S55K; E59G, Q93V и N31F; E59G, Q93V и S55K; E59G, N31F и S55K; E59P, Q93V и N31F; E59P, Q93V и S55K; E59P, N31F и S55K; или Q93V, N31F и S55K; или (4) мутации во всех следующих четырех сайтах: N57R, N57W, E59G и E59P; N57R, N57W, E59G и Q93V; N57R, N57W, E59G и N31F; N57R, N57W, E59G и S55K; N57R, E59G, E59P и Q93V; N57R, E59G, E59P и N31F; N57R, E59G, E59P и S55K; N57R, E59G, Q93V и N31F; N57R, E59G, Q93V и S55K; N57R, E59P, Q93V и N31F; N57R, E59P, Q93V и S55K; N57R, E59P, N31F и S55K; N57R, Q93V, N31F и S55K; N57W, E59G, E59P и Q93V; N57W, E59G, E59P и N31F; N57W, E59G, E59P и S55K; N57W, E59P, Q93V и N31F; N57W, E59P, Q93V и S55K; N57W, E59P, N31F и S55K; N57W, Q93V, N31F и S55K; E59G, E59P, Q93V и N31F; E59G, E59P, Q93V и S55K; E59G, Q93V, N31F и S55K; или E59P, Q93V, N31F и S55K; или (5) мутации во всех следующих пяти сайтах: N57R, N57W, E59G, E59P и Q93V; N57R, N57W, E59G, E59P и N31F; N57R, N57W, E59G, Q93V и N31F; N57R, N57W, E59P, Q93V и N31F; N57R, E59G, E59P, Q93V и N31F; N57W, E59G, E59P, Q93V и N31F; N57R, N57W, E59G, E59P и S55K; N57R, N57W, E59G, Q93V и S55K; N57R, N57W, E59P, Q93V и S55K; N57R, E59G, E59P, Q93V и S55K; N57W, E59G, E59P, Q93V и S55K; N57R, N57W, E59G, N31F и S55K; N57R, N57W, E59P, N31F и S55K; N57R, E59G, E59P, N31F и S55K; N57W, E59G, E59P, N31F и S55K; N57R, N57W, Q93V, N31F и S55K; N57R, E59G, Q93V, N31F и S55K; N57W, E59G, Q93V, N31F и S55K; N57R, E59P, Q93V, N31F и S55K; N57W, E59P, Q93V, N31F и S55K; или E59G, E59P, Q93V, N31F и S55K; или (6) мутации во всех следующих шести сайтах: N57R, N57W, E59G, E59P, Q93V и N31F; N57R, N57W, E59G, E59P, Q93V и S55K; N57R, N57W, E59G, E59P, N31F и S55K; N57R, N57W, E59G, Q93V, N31F и S55K; N57R, N57W, E59P, Q93V, N31F и S55K; N57R, E59G, E59P, Q93V, N31F и S55K; или N57W, E59G, E59P, Q93V, N31F и S55K; или (7) мутации во всех следующих семи сайтах: N57R, N57W, E59G, E59P, Q93V, N31F и S55K.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения предлагается моноклональное антитело к aPC, которое включает:
одну, или две, или три из CDR1 тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 27 или 33, CDR2 тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 28 или 40, и CDR3 тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 29 или 77; и/или
одну, или две, или три из CDR1 легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 30, CDR2 легкой цепи, представленной любой из SEQ ID NO: 31, 37, 43, 49 и 73, и CDR3 легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 32 или 44.
В конкретном варианте реализации антитело выбрано из следующего:
антитело, содержащее (а) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 27, 28 и 29; и/или
(b) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 30, 31 и 32;
антитело, содержащее (c) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 33, 34 и 35; и/или
(d) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 36, 37 и 38;
антитело, содержащее (e) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 39, 40 и 41; и/или
(f) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 42, 43 и 44;
антитело, содержащее (g) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 45, 46 и 47; и/или
(h) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 48, 49 и 50;
антитело, содержащее (i) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 51, 52 и 53; и/или
(j) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 54, 55 и 56;
антитело, содержащее (k) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 57, 58 и 59; и/или
(l) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 60, 61 и 62;
антитело, содержащее (m) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 63, 64 и 65; и/или
(n) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 66, 67 и 68;
антитело, содержащее (o) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 69, 70 и 71; и/или
(p) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 72, 73 и 74;
антитело, содержащее (q) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 75, 76 и 77; и/или
(r) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 78, 79 и 80;
антитело, содержащее (s) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 81, 82 и 83; и/или
(t) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 84, 85 и 86; и
антитело, содержащее (u) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 87, 88 и 89; и/или
(v) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 90, 91 и 92.
В настоящем изобретении каркасная область тяжелой цепи моноклонального антитела к aPC может представлять собой любую существующую каркасную область, подходящую для осуществления функций моноклонального антитела к aPC по настоящему изобретению, и может быть человеческого происхождения или мышиного происхождения.
В настоящем изобретении каркасная область легкой цепи моноклонального антитела к aPC может представлять собой любую существующую каркасную область, подходящую для осуществления функций моноклонального антитела к aPC по настоящему изобретению, и может быть человеческого происхождения или мышиного происхождения.
В конкретном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к aPC включает:
последовательность тяжелой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 и 25; и/или
последовательность легкой цепи, как показано в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26.
В конкретном варианте реализации моноклональное антитело к aPC выбрано из следующего:
антитело HaPC14, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 5, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6;
антитело HaPC14-1, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 8;
антитело HaPC14-2, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 9, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 10;
антитело HaPC14-3, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 11, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 12;
антитело HaPC14-4, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 13, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 14;
антитело HaPC14-5, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 15, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16;
антитело HaPC14-6, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18;
антитело HaPC14-7, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 19, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 20;
антитело HaPC14-8, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 21, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22;
антитело HaPC14-9, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 23, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 24; и
антитело HaPC14-10, содержащее последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 25, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 26.
В настоящем описании некоторые последовательности имеют одинаковый состав, но разные номера (для подробностей см. конкретные аминокислотные последовательности в перечне последовательностей).
Например, среди последовательностей, представляющих CDR1 тяжелой цепи антитела, последовательности 27 и 87 являются одинаковыми, и последовательности 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75 и 81 являются одинаковыми.
Среди последовательностей, представляющих CDR2 тяжелой цепи антитела, последовательности 28, 34, 52 и 70 являются одинаковыми, и последовательности 40, 46, 58, 64, 76, 82 и 88 являются одинаковыми.
Среди последовательностей, представляющих CDR3 тяжелой цепи антитела, последовательности 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65 и 71 являются одинаковыми, и последовательности 77, 83 и 89 являются одинаковыми.
Среди последовательностей, представляющих CDR1 легкой цепи антитела, последовательности 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 и 90 являются одинаковыми.
Среди последовательностей, представляющих CDR2 легкой цепи антитела, последовательности 37 и 61 являются одинаковыми, и последовательности 49, 55, 67, 79, 85 и 91 являются одинаковыми.
Среди последовательностей, представляющих CDR3 легкой цепи антитела, последовательности 32, 38, 68, 74 и 86 являются одинаковыми, и последовательности 44, 50, 56, 62, 80 и 92 являются одинаковыми.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к биологическому материалу, относящемуся к моноклональному антителу к aPC, которое представляет собой любое одно или более из 1) - 10) из следующего:
1) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую моноклональное антитело к aPC, как описано выше;
2) экспрессионную кассету, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
3) конструкцию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
4) конструкцию, содержащую экспрессионную кассету, как описано в 2);
5) систему экспрессии, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в 1);
6) систему экспрессии, содержащую кассету экспрессии, как описано в 2);
7) систему экспрессии, содержащую конструкцию, как описано в 3);
8) систему экспрессии, содержащую рекомбинантный вектор, как описано в 4);
9) пару праймеров для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность моноклонального антитела к aPC, как описано выше; и
10) слитое антитело, содержащее моноклональное антитело к aPC, как описано выше. Система экспрессии может представлять собой клетку или клеточную линию, и клетка или клеточная линия кодирует моноклональное антитело к aPC.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения предлагается препарат. Препарат представляет собой фармацевтическую композицию или реагент для детектирования или набор для детектирования.
В конкретном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем описании, включает моноклональное антитело к aPC, как описано выше, или любой один или более биологический материал, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Носитель может включать различные вспомогательные вещества и разбавители, которые не являются существенными активными ингредиентами как таковыми и не имеют чрезмерной токсичности после введения. Подходящие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, соответствующее содержание фармацевтически приемлемых носителей описано в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., N.J., 1991).
В конкретном варианте реализации изобретения детектирующий реагент или набор для детектирования, предложенный в настоящем изобретении, включает моноклональное антитело к aPC, как описано выше, или любой один или более биологический материал, как описано выше. Антитело является меченным.
Мечение может быть осуществлено любым существующим способом, таким как мечение хемилюминесценцией, флуорофор, радиоактивное мечение, хромофор или тому подобное.
Реагент или набор для детектирования может дополнительно содержать буферы, разбавители, инструкции по эксплуатации и тому подобное.
Антитело может присутствовать в любой форме, подходящей для его функционирования или активности, например, в форме водной суспензии.
В некоторых вариантах реализации изобретения моноклональное антитело к aPC согласно настоящему изобретению повышает способность aPC расщеплять гистоны H3 и H4, что указывает на то, что моноклональное антитело к aPC может оказывать цитопротекторное действие в отношении цитотоксичности гистонов H3 и H4.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания, как определено выше, и, в частности, к способу лечения наследственного и приобретенного недостаточностью свертывания крови или таких нарушений, как гемофилия A и гемофилия B или сепсис. Настоящее изобретение также относится к способу сокращения времени кровотечения путем введения моноклонального антитела к aPC нуждающемуся пациенту (например, травмированному пациенту или пациенту, нуждающемуся в свертывании крови). Настоящее изобретение дополнительно относится к способу ингибирования антикоагулянтной активности активированного белка С у субъекта. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу регулирования тромбоза у субъекта. В соответствии со способом согласно настоящему изобретению эффективное количество моноклонального антитела к aPC, описанного выше в настоящем изобретении, вводят индивидууму, нуждающемуся в лечении. Настоящее изобретение также относится к способу получения моноклонального антитела к aPC человека.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания, который включает введение эффективного количества моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала, как описано выше, индивидууму, нуждающемуся в лечении.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения расстройств, связанных со свертыванием, который включает введение эффективного количества моноклонального антитела к aPC, как описано выше, или любого одного или более биологических материалов, как описано выше, индивидууму, нуждающемуся в лечении. Индивид страдает от расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания, или индивид нуждается в лечении свертывания крови, или индивид страдает от сепсиса или гемофилии, или индивид нуждается в регуляции гемостаза.
Расстройства, связанные с недостаточностью или дефектом свертывания могут быть наследственными или приобретенными, включая нарушения, вызывающие коагулопатию из-за дефицита одного или нескольких факторов свертывания в плазме и, таким образом, вызывающие кровотечение, и, в частности, включающие: гемофилию A, гемофилию B и гемофилию C, которые вызваны дефицитом факторов свертывания VIII, IX и XI соответственно; и редкие дефициты факторов свертывания, которые представляют собой геморрагические заболевания, вызванные отсутствием или аномальной работой одного или нескольких других факторов свертывания (т.е. факторов свертывания I, II, V, V+VIII, VII, X или XIII), например, нарушения свертывания, вызванные травмой, и чрезмерное кровотечение, вызванное лечением сепсиса, трансплантацией, кардиохирургией и косметической хирургией.
В конкретном варианте реализации изобретения, в соответствии со способом стимулирования способности aPC расщеплять гистоны H3 и H4 согласно настоящему изобретению, после введения моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала или фармацевтической композиции, способность aPC расщеплять гистоны H3 и H4 может быть повышена, так что может быть обеспечен цитопротекторный эффект в отношении цитотоксичности гистонов H3 и H4.
В конкретном варианте реализации изобретения, в соответствии со способом ингибирования антикоагулянтной активности активированного белка С у индивидуума согласно настоящему изобретению, введение моноклонального антитела к aPC, или связанного с ним биологического материала, или фармацевтической композиции может ингибировать антикоагулянтную активность активированного белка С у индивидуума, так что функция свертывания индивидуума может регулироваться.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения предлагается применение моноклонального антитела к aPC или связанного с ним биологического материала:
i) при приготовлении лекарственного средства для предотвращения и/или лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания;
ii) при получении промотора для повышения способности aPC расщеплять гистоны H3 и H4;
iii) при получении лекарственного средства для ингибирования антикоагулянтной активности активированного белка С у индивидуума;
iv) при приготовлении лекарственного средства для лечения индивидуума, нуждающегося в свертывании крови;
vi) при приготовлении лекарственного средства для регулирования гемостаза у индивидуума;
vii) в иммунологических анализах для диагностики и лечения заболеваний или диагностики, не связанной с заболеванием, или при приготовлении реагента или набора для детектирования aPC; и
viii) в комбинации с другими реагентами или лекарственными средствами.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения дополнительно предложен способ получения моноклонального антитела к aPC, как описано выше. Способ включает культивирование системы экспрессии моноклонального антитела к aPC в условиях, подходящих для экспрессии моноклонального антитела к aPC, для экспрессии моноклонального антитела к aPC.
В настоящем изобретении полипептид, имеющий определенную идентичность с аминокислотной последовательностью моноклонального антитела к aPC, также находится в пределах объема защиты настоящего изобретения, например, антитело или фрагмент антитела (имеющий 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности), на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичные последовательности моноклонального антитела к aPC, и имеющие функции моноклонального антитела к aPC, и, в частности, полипептидный фрагмент, полученный путем замены, делеции или добавления одной или более (в частности, 1-50, 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1, 2 или 3) аминокислот в моноклональном антителе к aPC, или путем добавления одной или более (в частности, 1-50, 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-5, 2 или 3 аминокислоты, 3 или 3) аминокислоты к N-концу и/или С-концу моноклонального антитела к aPC, и обладающие функциями моноклонального антитела к aPC.
Термин "белок С" или "PC" относится к любому варианту, изоформе и/или видовому гомологу белка С в форме зимогена, который естественным образом экспрессируется клетками и присутствует в плазме, и отличается от активированной формы белка С.
Термин "активированный белок C" или "aPC" относится к активированной форме белка C.
Термин "моноклональное антитело к aPC" относится к антителу, которое специфически связывается с эпитопом aPC и представляет собой моноклональное антитело к aPC человека. Моноклональное антитело к aPC может находиться в различных формах антител, включая, но не ограничиваясь ими, полное антитело, фрагмент антитела, человеческое антитело, гуманизированное антитело и генетически сконструированное антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело или рекомбинантное антитело, а также фрагменты этих антител, при условии, что они сохраняют свои свойства в соответствии с настоящим изобретением.
Фрагмент антитела дополнительно определен как Fab', Fab, F(ab')2, однодоменное антитело, Fv или scFv. Моноклональное антитело к aPC, используемое в настоящем документе, относится к препарату молекулы антитела с одним молекулярным компонентом. Компонент моноклонального антитела проявляет единую специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу и может иметь вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Например, фрагмент Fab относится к моновалентному фрагменту, состоящему из доменов VL, VH, CL и CH1; фрагмент F(ab')2 относится к двухвалентному фрагменту, содержащему два фрагмента Fab, связанных дисульфидными мостиками в шарнирной области; и фрагмент Fv относится к фрагменту Fv, состоящему из доменов VL и VH одного плеча антитела.
"Идентичность" может быть оценена невооруженным глазом или с помощью компьютерного программного обеспечения. Используя компьютерное программное обеспечение, идентичность между двумя или более последовательностями может быть выражена в процентах (%), которые могут быть использованы для оценки идентичности между родственными последовательностями.
Термин "индивидуум" обычно включает людей и приматов, не являющихся людьми, таких как млекопитающие, собаки, кошки, лошади, козы, свиньи и крупный рогатый скот, которые могут извлечь выгоду из лечения с использованием антитела, лекарственного средства, композиции, родственного препарата, набора или комбинированного препарата, описанного выше.
Термин "терапевтически эффективное количество" обычно относится к количеству, которое может достичь эффекта лечения заболеваний, перечисленных выше, после соответствующего периода введения.
Термин "моноклональное антитело" относится к получению молекулы антитела одной аминокислотного состава, которое может иметь вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте реализации изобретения моноклональное антитело получают из гибридомы, включающей В-клетки, которая получена от трансгенного животного, не являющегося человеком, такого как трансгенная мышь, имеющая геном, включающий трансгены тяжелой цепи человека и трансгены легкой цепи человека, слитые с иммортализованными клетками.
Термин "гибридное антитело" относится к продукту, полученному путем слияния фрагмента антитела с другими биологически активными белками с использованием технологии генной инженерии. Это рекомбинантный белок с двумя вышеуказанными доменами, в котором целевой ген связан с генами фрагмента Ig на генном уровне и экспрессируется в эукариотических или прокариотических клетках. Гибридные антитела можно разделить на две категории в соответствии с различными фрагментами Ig, связанными с целевым белком: слитые белки Fab(Fv); и слитые белки Fc. Два разных белка связаны вместе в одну макромолекулу. Линейность может быть реализована химическим способом или путем слияния генов. Способ получения гибридного антитела включает традиционные методы рекомбинантной ДНК и трансфекции генов, хорошо известные в данной области техники. Из-за различных слитых белков этот слитый белок антитела имеет много биологических функций, и экспрессируемый рекомбинантный белок не влияет ни на антигенсвязывающую способность одноцепочечного антитела, ни на биологические характеристики белка, слитого с ним.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, в котором каркасная область или "участок, определяющий комплементарность" (CDR) были модифицированы в CDR иммуноглобулина, имеющего другую специфичность по сравнению с исходным иммуноглобулином.
При ссылке на ингибирование и/или блокирование связывания субстрата aPC с aPC термин "ингибирование" и "блокирование" также включает измеримое снижение аффинности связывания aPC с физиологическим субстратом, когда aPC находится в контакте с антителом к aPC, по сравнению с ситуацией, когда aPC не находится в контакте с антителом к aPC, например, блокирование взаимодействия aPC с его субстратами, включая фактор Va или фактор VIIIa, по меньшей мере на около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%.
"Участок, определяющий комплементарность" или "CDR" относится к одной из трех гипервариабельных областей в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи молекулы антитела, которая образует N-концевую антигенсвязывающую поверхность, комплементарную трехмерной структуре связанного антигена. Начиная с N-конца тяжелой цепи или легкой цепи, эти определяющие комплементарность области обозначаются как "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. CDR включают связывание антигена с антителом, а CDR3 включает уникальную область, специфичную для связывания антигена с антителом. Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, которые включают CDR из каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи.
Термин "эпитоп" означает диапазон или область антигена, с которым антитело специфически связывается или взаимодействует, и в некоторых вариантах реализации изобретения "эпитоп" указывает, где антиген физически контактирует с антителом.
Термин "консервативная замена" означает полипептидную модификацию, которая включает замену одной или более аминокислот аминокислотами, которые имеют сходные биохимические характеристики, но не вызывают потери биологических или биохимических функций полипептида. "Консервативная аминокислотная замена" означает замену аминокислотного остатка аминокислотным остатком, имеющим аналогичные боковые цепи. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, были определены в данной области техники. Общие консервативные замены представляют собой, например, взаимные замены между ароматическими аминокислотами Phe, Trp и Tyr, взаимные замены между гидрофобными аминокислотами Leu, Ile и Val, взаимные замены между полярными аминокислотами Gln и Asn, взаимные замены между основными аминокислотами Lys, Arg и His, взаимные замены между кислотными аминокислотами Asp и Glu и взаимные замены между гидроксильными аминокислотами Ser и Thr.
Термин "идентичность" относится к доле нуклеотидов, являющихся идентичными, когда сравниваются две нуклеиновые кислоты или два полипептида, например, по меньшей мере около 80% нуклеотидов или аминокислот, обычно по меньшей мере около 85%, в некоторых вариантах реализации изобретения около 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, по меньшей мере в одном варианте реализации изобретения по меньшей мере около 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% или 99,5% нуклеотидов или аминокислот являются идентичными.
Указанные нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целой клетке, в клеточном лизате, или в частично очищенной или в значительно чистой форме. Нуклеиновые кислоты "выделены" или "сделаны по существу чистыми" при очистке от других клеточных компонентов, которые обычно связаны с нуклеиновыми кислотами в естественной среде. Нуклеиновые кислоты могут быть выделены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, таких как обработка щелочью/SDS (додецилсульфат натрия), связывание CsCl, колоночная хроматография, электрофорез в агарозном геле и тому подобное.
Соответствующие термины, используемые в настоящем описании, объясняются следующим образом:
| CDR | Участки, определяющие комплементарность |
| CV | Объем колонки |
| ELISA | Твердофазный иммуноферментный анализ |
| Fab | Антигенсвязывающий фрагмент |
| ч | час |
| HRP | Пероксидаза хрена |
| кДа | Килодальтоны |
| koff | Скорость диссоциации |
| OD | Оптическая плотность |
| PBS | Фосфатно-солевой буфер |
| ПЦР | Полимеразная цепная реакция |
| PE | Периплазматический экстракт |
| SA | Стрептавидин |
| scFv | Одноцепочечный вариабельный фрагмент |
| SPR | Поверхностный плазмонный резонанс |
| TMB | Тетраметилбензидин |
| VH | Вариабельный домен тяжелой цепи |
| VL | Вариабельный домен легкой цепи |
Дополнительные описания настоящего изобретения приведены ниже со ссылкой на варианты реализации изобретения. Следующие варианты осуществления используются для описания настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. За исключением содержания, конкретно упомянутого ниже, способ, условия, экспериментальные способы и т.п. для осуществления настоящего изобретения являются общими знаниями и хорошо известными знаниями в данной области, и настоящее изобретение не является конкретно ограниченным.
Пример 1. Гуманизация мышиного моноклонального антитела к aPC
Последовательности вариабельных областей мышиных гибридомных антител были гуманизированы. Аминокислотные последовательности VH/VL нумеруют с использованием системы Kabat. Затем последовательности VH/VL анализировали на наличие сайтов горячих точек, включая непарные остатки цистеина, сайты N-связанного гликозилирования и сайты дезаминирования внутри CDR. N-связанные сайты гликозилирования, близкие к CDR, также будут рассматриваться как сайты высокого риска. Если такие сайты распознаются, их необходимо удалить. Основываясь на выравнивании последовательностей VH/VL, были выбраны лучшие каркасные последовательности генов зародышевой линии человека, а последовательности J-области были выбраны и сплайсированы на основе лучшей гомологии. Моделирование гомологии проводилось на мышиных последовательностях VH/VL для формирования 3D-структур. Остатки FR в пределах 5Å от CDR, остатки на VH/VL связывающей поверхности, которые влияют на связывание антигена после изменения, и тому подобное будут рассматриваться как потенциальные сайты, нуждающиеся в обратных мутациях. Важность обратных мутаций была определена с помощью анализа с использованием компьютера, и были разработаны различные комбинации, содержащие одну или несколько обратных мутаций.
ДНК целевого сегмента амплифицировали с помощью ПЦР и конструировали плазмиды, кодирующие гуманизированные последовательности антител. Антитела подвергали временной трансфекции и экспрессии и очищали с помощью колонки аффинной хроматографии с белком А. Гуманизированные антитела анализировали с помощью SEC-HPLC и SDS-PAGE-электрофореза и получали 28 клонов гуманизированных моноклональных антител к aPC.
1.1 Анализы аффинности моноклональных антител к aPC к aPC человека (haPC) медотом ELISA
Аффинность химерных антител и вышеуказанных 28 гуманизированных антител к haPC анализировали с помощью анализов ELISA и FACS.
Результаты анализа показаны на фиг. 1. №№ 1-28 (от Humab001-1 до Humab001-28 или от HAPC-1 до HAPC28) гуманизированные антитела, 3657 положительное контрольное антитело (3657 PC mAb) и химерное антитело (30120-mAb001×hIgG) имели хорошее связывание с haPC. Антитела №№ 13-20 имели низкие значения EC50, что указывало на то, что эти антитела обладали более высокой способностью связывания с haPC.
1.2 Анализ связывания моноклональных антител к aPC с человеческим PC (hPC) методом ELISA
Отбирали №№ 13-20 гуманизированных моноклональных антител к aPC (от Humab001-13 до Humab001-20 или от HAPC-13 до HAPC-20) и анализировали их способность связываться с hPC.
Результаты показаны на Фиг. 2. Результаты показали, что №№ 13-20 гуманизированных моноклональных антител к aPC вообще не связываются с hPC.
Антитело № 13 (HAPC-13), антитело № 14 (HAPC-14) и антитело № 16 (HAPC-16) были тремя родительскими антителами, выбранными для оптимизации аффинности. Эти три антитела имели одинаковые каркасные области тяжелой цепи и разные каркасные области легкой цепи. HAPC-13 было оригинальным, HAPC-14 имело 1 обратную мутацию на основе HAPC-13, а HAPC-16 имело 5 обратных мутаций на основе HAPC-13. В следующих вариантах реализации изобретения антитело HAPC-14 было выбрано для последующей оптимизации аффинности.
Пример 2. Оптимизация аффинности моноклонального антитела к aPC HAPC-14
На основе антитела № 14 (Humab001-14 или HAPC14 или HAPC-14), описанного выше, оптимизировали аффинность этого антитела и сконструировали мутантов.
| Материалы | Поставщик/Производитель | № по каталогу |
| Блокатор казеина в PBS | Pierce | 37528 |
| SA-HRP | Sigma | S5512 |
| Козье антитело к IgG человека Fd | Southern Biotech | 2046-01 |
| Козье антитело к человеческому IgG F(ab’)2-HRP | Jackson | 109-035-006 |
| Козье анти-c-myc HRP конъюгированное | BETHYL | A190-104P |
| Блокатор казеина в PBS | Pierce | 37528 |
| SA-HRP | Sigma | S5512 |
| Клетки Expi293F™ | Thermo Fisher | A14527 |
| Набор для трансфекции ExpiFectamine293 | Thermo Fisher | A14524 |
| Экспрессионная среда Expi293F™ | Thermo Fisher | A1435101 |
| Реагент для трансфекции Lipofectamine™ 2000 | Thermo Fisher | 11668019 |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Corning | 35-076-CV |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 |
| Колонка MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 |
| Гель NuPAGE4% - 12% Bis-Tris | Thermo Fisher | NP0322BOX |
| Белковый неокрашенный леддер PageRuler™ | Thermo Fisher | 26614 |
| Колонка HPLC-SEC | TOSOH | 08541 |
| Чип датчика серии S CM5 | GE Healthcare | 29-1496-03 |
| Набор иммобилизации по амино-группе | GE Healthcare | BR100633 |
| 10×HBS-EP+ буфер | GE Healthcare | BR100669 |
| анти-IgG Fc человека | Jackson | 109-005-098 |
| 10 мМ глицин, pH 1,5 | Cool pharm | KH-59224 |
2.1 Сайт-направленная мутация
Каждая аминокислота из шести определяющих комплементарность областей (CDR) родительского клона HAPC-14 Fab была соответственно мутирована в 19 других аминокислот с использованием сайт-специфической мутации. Праймеры ДНК, содержащие кодоны NNS, кодирующие 20 аминокислот, использовали для введения мутаций в каждую целевую позицию CDR. Фосфорилированные вырожденные праймеры использовали в сайт-направленных мутационных реакциях.
2.2 ПЦР
ПЦР проводили при 94°C в течение 2 минут (94°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 5 минут) в течение 16 циклов, а затем при 72°C в течение 10 минут.
Продукт ПЦР очищали, а затем вводили в Escherichia coli TG1 путем электропорации для образования колоний и получения Fab-фрагмента.
2.3 Предварительный скрининг библиотеки мутантов Fab
Предварительный скрининг включал одноточечный анализ ELISA (SPE), проведенный с помощью ELISA захвата.
Каждая лунка 96-луночных планшетов была покрыта анти-Fab антителом в покрывающем буфере PBS с pH 7,4 при 4°C. На следующий день планшеты блокировали казеином в PBS с pH 7,4 при 25°C в течение 1 часа. Затем в планшеты добавляли Fab PE и инкубировали при 25°С в течение 1 часа. После промывки планшетов в лунки добавляли биотинилированный антиген и инкубировали при 25°C в течение 1 часа. Затем биотинилированный антиген инкубировали с конъюгатом пероксидазы SA-хрена (HRP) при 25°С в течение 1 часа. Активность HRP обнаруживали с помощью субстрата тетраметилбензидина (TMB), и реакцию гасили с помощью 2M HCl. Планшеты считывали при 450 нМ. Клоны, демонстрирующие сигнал оптической плотности (OD) при 450 нм, который был в 3 раза больше, чем у родительского клона, отбирали и секвенировали. Улучшенные связыванием мутанты с уникальными последовательностями HAPC-14 были продемонстрированы с помощью ELISA захвата при рН 7,4. Улучшенные связыванием мутанты с уникальными последовательностями HAPC-14 ранжировались на основе прямого антигенного покрытия ELISA. Результаты приведены ниже в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Антитело | Мутация | Захват ELISA OD450 |
Bmax | EC50 |
| HAPC-14-Fab | Дикий тип | около 0,6196 | 0,221 | 221,3 |
| HAPC-14-R1-1H1-F2 | N - F | 2,5193 | 0,2776 | 20,33 |
| HAPC-14-R1-2H6-C2 | S - K | 1,8358 | 0,2621 | 19,42 |
| HAPC-14-R1-3H4-C5 | Y - S | 1,77415 | 0,3275 | 102,80 |
| HAPC-14-R1-3H4-C6 | Y - T | 1,4995 | 0,3245 | 55,82 |
| HAPC-14-R1-3H7-F2 | Y - P | 1,42405 | 0,1933 | 25,13 |
| HAPC-14-R1-1L7-B9 | D - A | 1,34885 | 0,1509 | 28,41 |
| HAPC-14-R1-2L4-A1 | N - L | 2,1465 | 0,2441 | 13,38 |
| HAPC-14-R1-2L4-B2 | N - W | 2,99075 | 0,6618 | 4,82 |
| HAPC-14-R1-2L4-D4 | N - R | 3,0343 | 0,5669 | 10,45 |
| HAPC-14-R1-2L4-G9 | N - K | 2,3219 | 0,2868 | 13,19 |
| HAPC-14-R1-2L6-G1 | E - G | 2,00495 | 0,4919 | 35,65 |
| HAPC-14-R1-2L6-F2 | E - K | 1,37175 | 0,2995 | 28,24 |
| HAPC-14-R1-2L6-G11 | E - P | 1,56065 | 0,2199 | 18,04 |
| HAPC-14-R1-3L1-D11 | Q - W | 2,06855 | 0,2612 | 13,64 |
| HAPC-14-R1-3L1-G8 | Q - V | 1,4895 | 0,2405 | 30,79 |
Как показано в Таблице 1, мутации с улучшенной аффинностью у девяти индивидуумов (HAPC-14-R1-1H1-F2, HAPC-14-R1-2H6-C2, HAPC-14-R1-3H4-C6, HAPC-14-R1-2L4-B2, HAPC-14-R1-2L4-D4, HAPC-14-R1-2L6-G1, HAPC-14-R1-2L6-G11, HAPC-14-R1-3L1-D11 и HAPC-14-R1-3L1-G8), идентифицированные при предварительном скрининге HAPC-14, дополнительно использовали для дизайна и конструирования комбинаторной библиотеки мутантов.
2.4 Верификация основной библиотеки мутантов Fab путем прямого ранжирования KD ELISA
Ранжирование KD улучшенного связывания Fab каждого мутанта определяли с помощью KD ELISA прямого антигенного покрытия ELISA.
Каждая лунка 96-луночных планшетов была покрыта hPro1. биотином в буфере 1xPBS с pH 7,4, и инкубацию проводили в течение ночи при 4°C. На следующий день планшеты блокировали казеином в буфере 1xPBS с pH 7,4 при 25°C в течение 1 часа. Fab PE каждого мутанта, разведенного в соответствии с одной концентрацией, добавляли к планшетам и инкубировали при 25°С в течение 1 часа. Затем Fab PE инкубировали с козьим HRP к c-myc, конъюгированным при 25°C в течение 1 часа. Активность HRP обнаруживали с помощью субстрата тетраметилбензидина (TMB), и реакцию гасили с помощью 2M HCl. Значения OD каждого планшета считывали при 450 нМ.
2.5 Комбинаторный скрининг библиотеки HAPC-14 Fab
Точечные мутации в VH и VL, определенные как полезные для связывания антигена, дополнительно объединяли для дополнительной синергии связывания. Вкратце, каждый вырожденный праймер фосфорилировали, а затем использовали с урацилированной одноцепочечной ДНК в соотношении 10:1. Смесь нагревали до 85°C в течение 5 минут, а затем охлаждали до 55°C в течение более 1 часа. Затем добавляли лигазу T4 и ДНК-полимеразу T4 и смесь инкубировали при 37°С в течение 1,5 часов. 100 нг комбинаторной библиотечной ДНК вводили в TG1 путем электропорации с образованием колоний и получением Fab-фрагментов.
Комбинаторные мутанты экспрессировали как Fab и скринировали с использованием захвата ELISA. Клоны, демонстрирующие сигнал оптической плотности (OD) при 450 нм, который был в 3 раза больше, чем у клона-предшественника первого раунда, отбирали и секвенировали. Мутанты с улучшенным связыванием с уникальными последовательностями дополнительно демонстрировали с помощью ELISA захвата и секвенировали с помощью ELISA с прямым антигенным покрытием.
Множество комбинаторных мутантов HAPC-14 были подвергнуты скринингу, и 16 лучших комбинаторных мутантов со значительно улучшенной аффинностью были подтверждены с помощью KD ELISA (как показано в № 1-16 в таблице 2).
| Таблица 2 | |||||||||
| Захват ELISA | Рейтинг KD ELISA | VHCDR1 | VHCDR2 | VHCDR3 | VLCDR2 | VLCDR3 | |||
| № | Название | OD450 | Bmax | EC50 | NYYLN | DIRLKSNNYEKHYAESVKG | EGDYFDY | LASNLES | QQNNEDPYT |
| HAPC-14 | 0,0758 | / | / | ||||||
| 1 | R2-24F3 | 2,7928 | 1,366 | 1,373 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. G. | V . . . . . . . . |
| 2 | R2-23H2 | 2,6867 | 1,26 | 1,934 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. G. | . . . . . . . . . |
| 3 | R2-25G5 | 2,6576 | 1,045 | 5,659 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. P. | V . . . . . . . . |
| 4 | R2-26E4 | 2,5923 | 1,211 | 1,838 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R . G. | V . . . . . . . . |
| 5 | R2-25B7 | 2,5891 | 1,067 | 2,724 | F . . . . | . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. P. | V . . . . . . . . |
| 6 | R2-27G7 | 2,58 | 0,7152 | 1,004 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R . G. | . . . . . . . . . |
| 7 | R2-29D9 | 2,5494 | 0,9603 | 7,854 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . T . . . | . . . R . P. | V . . . . . . . . |
| 8 | R2-24H1 | 2,4255 | 1,251 | 2,517 | F . . . . | . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R . G. | V . . . . . . . . |
| 9 | R2-22A10 | 2,3922 | 1,015 | 2,679 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R. . . | V . . . . . . . . |
| 10 | R2-24D4 | 2,373 | 0,7169 | 2,104 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . T . . . | . . . W. P. | . . . . . . . . . |
| 11 | R2-30F7 | 2,3418 | 0,6171 | 7,274 | F . . . . | . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R . P. | V . . . . . . . . |
| 12 | R2-23E10 | 2,3192 | 1,235 | 1,299 | F . . . . | . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. G. | . . . . . . . . . |
| 13 | R2-22B1 | 2,3056 | 1,225 | 1,194 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . T . . . | . . . W. P. | V . . . . . . . . |
| 14 | R2-32E6 | 2,1754 | 1,41 | 3,879 | . . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. G. | V . . . . . . . . |
| 15 | R2-22B6 | 2,1719 | 1,214 | 3,971 | F . . . . | . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . R . G. | . . . . . . . . . |
| 16 | R2-9C1 | 1,9471 | 1,089 | 1,8 | F . . . . | . . . . . K . . . . . . . . . . . . . | . . . . . . . | . . . W. . . | V . . . . . . . . |
После скрининга и статистического анализа было обнаружено, что мутации в следующих 6 сайтах значительно влияют на способность связывания Fab-фрагмента с иммобилизованным антителом. Этими шестью сайтами были:
а) N57R/W, расположенный в VL CDR2 (N57R предпочтительнее N57W);
b) E59G/P, расположенный в VL CDR2 (E59G предпочтительнее E59P);
c) Q93V, расположенный в VL CDR3;
d) N31F, расположенный в VH CDR1;
e) S55K, расположенный в VH CDR2; и
f) Y104T, расположенный в VH CDR3.
Наиболее важными мутантными сайтами были N57R в легкой цепи и N31F в тяжелой цепи.
Пример 3. Моноклональные антитела к aPC на основе сайтов комбинаторной мутации HAPC-14 (конструирование целого IgG1)
3.1 Конструирование моноклональных антител к aPC (HAPC14-1 - HAPC14-10) на основе комбинирования сайтов мутации HAPC14
Основываясь на 6 сайтах мутаций из примера 2, проводили комбинаторное конструирование для получения 10 мутантов (14-1 - 14-10 в таблице 3 ниже) (HAPC14-1 - HAPC14-10), а затем последовательности конструировали в целую форму IgG для экспрессии и очистки. Исследовали уровень экспрессии, аффинность и другие биологические активности антител.
Аминокислотные последовательности HAPC-14 и 10 мутантов показаны в SEQ ID NO: 5-26.
Гуманизированное антитело 13 (HAPC-13)
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYLNWVRQAPGK
GLEWVGDIRL
KSNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
Гуманизированное антитело 16 (HAPC-16)
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYLNWVRQAP
GKGLEWVGDIRLK
SNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCA
REGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 4)
Гуманизированное антитело 14 (HAPC-14)
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYLNWVRQAPGKGL
EWVGDIRLKS
NNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
EGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 6)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-1
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKSNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 8)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASWLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-2
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 9)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 10)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASWLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-3
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 12)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-4
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKSNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 14)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-5
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 15)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 16)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASWLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-6
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 18)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-7
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 19)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKSNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDYFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 20)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-8
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 21)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDTFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 22)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-9
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 23)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDTFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 24)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14-10
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 25)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYLNWVRQAPGKGLEWVGDIRLKKNNYEKHYAESVKGRFTISRDDSKSITYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDTFDYWGQGTTVTVSS
Легкая цепь (SEQ ID NO: 26)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSFGATFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNNEDPYTFGQGTKLEIK
HAPC-14
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 27)
NYYLN
HAPC-14
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 28)
DIRLKSNNYEKHYAESVKG
HAPC-14
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 29)
EGDYFDY
HAPC-14
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 30)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 31)
LASNLES
HAPC-14
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 32)
QQNNEDPYT
HAPC-14-1
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 33)
FYYLN
HAPC-14-1
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 34)
DIRLKSNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-1
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 35)
EGDYFDY
HAPC-14-1
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 36)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-1
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 37)
LASWLGS
HAPC-14-1
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 38)
QQNNEDPYT
HAPC-14-2
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 39)
FYYLN
HAPC-14-2 (SEQ ID NO: 40)
CDR2 тяжелой цепи
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-2
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 41)
EGDYFDY
HAPC-14-2
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 42)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-2
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 43)
LASWLES
HAPC-14-2
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 44)
VQNNEDPYT
HAPC-14-3
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 45)
FYYLN
HAPC-14-3
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 46)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-3
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 47)
EGDYFDY
HAPC-14-3
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 48)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-3
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 49)
LASRLGS
HAPC-14-3
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 50)
VQNNEDPYT
HAPC-14-4
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 51)
FYYLN
HAPC-14-4
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 52)
DIRLKSNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-4
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 53)
EGDYFDY
HAPC-14-4
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 54)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-4
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 55)
LASRLGS
HAPC-14-4
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 56)
VQNNEDPYT
HAPC-14-5
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 57)
FYYLN
HAPC-14-5
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 58)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-5
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 59)
EGDYFDY
HAPC-14-5
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 60)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-5
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 61)
LASWLGS
HAPC-14-5
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 62)
VQNNEDPYT
HAPC-14-6
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 63)
FYYLN
HAPC-14-6
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 64)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-6
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 65)
EGDYFDY
HAPC-14-6
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 66)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-6
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 67)
LASRLGS
HAPC-14-6
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 68)
QQNNEDPYT
HAPC-14-7
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 69)
FYYLN
HAPC-14-7
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 70)
DIRLKSNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-7
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 71)
EGDYFDY
HAPC-14-7
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 72)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-7
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 73)
LASRLES
HAPC-14-7
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 74)
QQNNEDPYT
HAPC-14-8
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 75)
FYYLN
HAPC-14-8
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 76)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-8
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 77)
EGDTFDY
HAPC-14-8
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 78)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-8
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 79)
LASRLGS
HAPC-14-8
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 80)
VQNNEDPYT
HAPC-14-9
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 81)
FYYLN
HAPC-14-9
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 82)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-9
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 83)
EGDTFDY
HAPC-14-9
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 84)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-9
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 85)
LASRLGS
HAPC-14-9
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 86)
QQNNEDPYT
HAPC-14-10
CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 87)
NYYLN
HAPC-14-10
CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 88)
DIRLKKNNYEKHYAESVKG
HAPC-14-10
CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 89)
EGDTFDY
HAPC-14-10
CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 90)
RASESVDSFGATFMH
HAPC-14-10
CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 91)
LASRLGS
HAPC-14-10
CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 92)
VQNNEDPYT
Подробная информация приведена в таблице 3.
Таблица 3
Подчеркнутые части являются CDR, а другие части являются каркасными областями.
Гуманизированное антитело 14 (моноклональное антитело 14 к aPC)
Тяжелая цепь
Легкая цепь
Подчеркнутые части представляют собой CDR, другие части представляют собой каркасные области, а белый шрифт указывает на гуманизированные сайты.
| Число белков | Сайты мутаций |
| HPAC14-1 | L57W,L59G,H31F |
| HPAC 14-2 | L57W,L93V,H31F,H55K |
| HPAC 14-3 | L57R,L59G,L93V,H31F,H55K |
| HPAC 14-4 | L57R,L59G,L93V,H31F |
| HPAC 14-5 | L57W,L59G,L93V,H31F,H55K |
| HPAC 14-6 | L57R,L59G,H31F,H55K |
| HPAC 14-7 | L57R,H31F |
| HPAC 14-8 | L57R,L59G,L93V,H31F,H55K,H104T |
| HPAC 14-9 | L57R,L59G,H31F,H55K,H104T |
| HPAC 14-10 | L57R,L59G,L93V,H55K,H104T |
| HAPC14 |
3.2 Анализы связывающей способности моноклональных антител к aPC, сконструированных на основе сайтов комбинаторных мутаций HAPC14 к haPC/hPC (HAPC14-1 - HAPC14-10)
Метод анализа:
Способность связывания моноклональных антител к aPC с haPC/hPC анализировали с помощью Elisa.
1. Планшеты для ELISA покрывали haPC/hPC (1 мкг/мл в PBS), 100 мкл/лунку, при 4°C в течение ночи.
2. Планшеты промывали 3 раза PBST (фосфатно-солевой буфер с твином) (0,1% Tween 20), 200 мкл/лунку.
3. Планшеты блокировали 2% BSA (раствор PBS), 200 мкл/лунку, при комнатной температуре в течение 1 часа.
4. Планшеты промывали 3 раза PBST (0,1% Tween 20), 200 мкл/лунку.
5. Планшеты инкубировали с моноклональным антителом к aPC в качестве первичного антитела (разбавленного от 10 мкг/мл в 2% BSA), 100 мкл/лунку, при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Планшеты промывали 3 раза PBST (0,1% Tween 20), 200 мкл/лунку.
7. Планшеты инкубировали с антителом HRP к hIgG-Fc (разведенным в 5000 раз в 2% буфере BSA) при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. Планшеты промывали 6 раз PBST (0,1% Tween 20), 200 мкл/лунку.
9. Планшеты инкубировали с субстратом TMB (приготовленным из растворов A и B в соотношении 1:1 (об./об.)), 100 мкл/лунку, не на свету в течение 10 минут.
10. Реакцию гасили HCl (1 M), 100 мкл/лунку и считывали OD450.
Результаты анализа показаны на Фиг. 3, Таблице 4 и Таблице 5. Как можно видеть, моноклональные антитела к aPC связываются с hAPC и не связываются с hPC.
| Таблица 4 | |||
| Антиген | Антитело | EC50 (нМ) | Время |
| hAPC | HAPC14-1 | 0,1141 | 2,106 |
| HAPC14-2 | 0,111 | 1,775 | |
| HAPC14-3 | 0,0618 | 1,615 | |
| HAPC14-4 | 0,06052 | 1,52 | |
| HAPC14-5 | 0,09239 | 1,631 | |
| HAPC14-6 | 0,08212 | 1,854 | |
| HAPC14-7 | 0,1304 | 1,578 | |
| HAPC14-8 | 0,1382 | 1,046 | |
| HAPC14-9 | 0,07608 | 1,07 | |
| HAPC14-10 | 0,2799 | 0,7453 | |
| HAPC14 | 0,2203 | 0,2909 | |
| Таблица 5 | ||
| Антиген | Антитело | Время |
| hPC | HAPC14-1 | 0,023 |
| HAPC14-2 | 0,01042 | |
| HAPC14-3 | около 0,2673 | |
| HAPC14-4 | 0,1571 | |
| HAPC14-5 | около 0,04753 | |
| HAPC14-6 | около 0,01332 | |
| HAPC14-7 | около 0,006612 | |
| HAPC14-8 | -0,004647 | |
| HAPC14-9 | 0,012 | |
| HAPC14-10 | около 0,001450 | |
| HAPC14 | около 0,03871 | |
3.3 Анализы аффинности моноклональных антител к aPC, сконструированных на основе сайтов комбинаторных мутаций HAPC-14 с использованием системы Octet для биомолекулярных взаимодействий (HAPC-14-1 - HAPC-14-10)
Метод анализа: анализ Octet проводили при 25°C с использованием биосенсора протеина A Octet в 1× кинетическом буфере. Во время кинетического анализа исходный этап анализа проводили в 1× кинетическом буфере в течение 120 секунд, а затем в течение 240 секунд после загрузки антитела в биосенсор. Затем исходный двухэтапный анализ проводили в 1× кинетическом буфере в течение 120 секунд. Затем биосенсор с иммобилизованным антителом погружали в лунки, содержащие антиген (huAPC) в 5 концентрациях (3,13 нМ, 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ) в течение 180 сек, и затем проводили диссоциацию в 1× кинетическом буфере в течение 400 сек. 1× кинетический буфер использовали в качестве холостого контроля для демонстрации естественной диссоциации антитела в буфере. Для стадии регенерации использовали 10 мМ глицина при рН 1,5. Программное обеспечение для анализа данных Octet использовалось для расчета кинетики связывания, а модель связывания 1:1 использовалась для подгонки кривой.
Аффинность мутантных антител анализировали при pH 7,4. Результаты представлены на Фиг. 4 и в таблице 6.
| Таблица 6 | ||||
| Образец | KD (M) | Kon (1/Mс) | kdis (1/с) | Полный R^2 |
| HAPC14-1 | 3,83E-09 | 3,06E+05 | 1,17E-03 | 0,9932 |
| HAPC14-2 | 3,78E-09 | 3,07E+05 | 1,16E-03 | 0,9877 |
| HAPC14-3 | 2,67E-09 | 3,20E+05 | 8,54E-04 | 0,9933 |
| HAPC14-4 | 4,06E-09 | 3,10E+05 | 1,26E-03 | 0,9911 |
| HAPC14-5 | 2,83E-09 | 3,22E+05 | 9,11E-04 | 0,9924 |
| HAPC14-6 | 3,64E-09 | 2,97E+05 | 1,08E-03 | 0,9917 |
| HAPC14-7 | 7,72E-09 | 2,56E+05 | 1,97E-03 | 0,9929 |
| HAPC14-8 | 1,05E-08 | 2,50E+05 | 2,62E-03 | 0,9901 |
| HAPC14-9 | 9,69E-09 | 2,45E+05 | 2,38E-03 | 0,9917 |
| HAPC14-10 | 1,90E-08 | 2,25E+05 | 4,28E-03 | 0,9906 |
| HAPC14 | 2,54E-07 | 6,40E+04 | 1,62E-02 | 0,9866 |
Как видно из результатов на фиг. 4 и в таблице 6, мутантные антитела все еще могут связываться с haPC, но не могут связываться с hPC, и их аффинность была увеличена по сравнению с немутированным антителом № 14 HAPC-14. Особенно № 6 (HAPC14-6) и № 3 (HAPC14-3) показали почти 100-кратное увеличение.
Пример 4. Расщепление гистонов моноклональным антителом к aPC HAPC14-6 и aPC
Метод анализа:
| Реагент | Содержание (мкг/мкл) | Инкубация | |
| Гистон телячьего тимуса в каждой пробирке | 0,2 | 37°C | 4 ч |
| aPC присутствует или отсутствует в каждой пробирке | Когда aPC присутствовал, его содержание составляло 0,012 | ||
| HAPC присутствует или отсутствует в каждой пробирке | Когда HAPC присутствовал, его содержание составляло 0,06 | ||
| Буфер PBS при pH 7,3 добавляли до тех пор, пока объем реакции не достиг 100 мкл | |||
После ДСН-ПААГ-электрофореза проводили окрашивание Кумасси синим и наблюдали, способствовало ли или ингибировало моноклональное антитело HAPC расщеплению гистонов aPC.
Результаты анализа показаны на фиг. 5 (слева направо на фиг. 5: только гистоны; гистоны и aPC; гистоны, APC и HAPC1573; гистоны, APC и HAPC14-6). Как можно видеть, HAPC1573 и HAPC14-6 повышали способность aPC расщеплять гистоны, что указывает на то, что моноклональное антитело HAPC14-6 по настоящему изобретению может оказывать цитопротекторное действие в отношении цитотоксичности гистонов H3 и H4.
В соответствии с HAPC1573, HAPC-14-6 не ингибирует, а фактически способствует расщеплению гистонов H3 и H4 посредством aPC. В отличие от HAPC1573, HAPC-14-6 слегка ингибировал расщепление гистона H1 посредством aPC. Это указывает на то, что HAPC-14-6 может оказывать цитопротекторное действие в отношении цитотоксичности гистонов H3 и H4.
Пример 5. Фармакодинамические исследования in vitro моноклональных антител к aPC HAPC-14-3 и HAPC-14-6
В этом примере было проанализировано влияние различных антител в различных концентрациях на плазму с дефицитом фактора свертывания крови.
Для измерения минимальной дозы моноклонального антитела для ингибирования антикоагулянтной активности aPC в плазме человека, с дефицитом нескольких факторов свертывания, проводили эксперименты с АЧТВ, индуцированные Protc. Было обнаружено, что концентрация не более 1 мкг/мг может ингибировать 95% или более антикоагулянтной активности aPC, в то время как для HAPC1573 требуется концентрация 100 мкг/мл или выше.
5.1 Экспериментальный метод и принцип
Принцип анализа активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ): При 37°C факторы XII и XI активировали каолином, тромбоцитарный фактор 3 заменяли цефалином (частичным тромбопластином), а в присутствии Ca2+ наблюдали время, необходимое для свертывания плазмы, которое было активированным частичным тромбопластиновым временем. Анализ АЧТВ является чувствительным и наиболее часто используемым скрининговым тестом для врожденной системы свертывания.
Недавно разработанное моноклональное антитело к aPC HAPC-14-6 в концентрации не более 1 мкг/мл может ингибировать антикоагулянтную активность aPC в плазме человека с дефицитом различных факторов свертывания крови, включая дефицит в плазме крови человека фактора свертывания крови V, фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови VIII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови XI, фактора свертывания крови XII, VWF и т.п.
5.2 Анализ влияния антител на плазму с дефицитом фактора свертывания крови
(1) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания VIII и плазму с дефицитом VIX
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FVIII плюс антитела в различных разведениях в таблице 7 (конечная концентрация), плюс 0,05 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FVIII 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FIX плюс антитела в различных разведениях в таблице 7 (конечная концентрация), плюс 0,01 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FIX 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Результат анализа: Как показано в таблице 7, в плазме с дефицитом факторов свертывания VIII и VIX моноклональные антитела к aPC HAPC14-1 - HAPC14-10 могут в разной степени ингибировать антикоагулянтную активность aPC. При той же концентрации моноклональные антитела к aPC HAPC14-1 - HAPC14-10 все имели лучшие эффекты в ингибировании антикоагулянтной активности aPC, чем мышиные антитела 1573, HAPC13 и HAPC14.
| Таблица 7 | |||
| Антитело | Концентрация антитела к aPC (мкг/мл) | Среднее время свертывания (с) | |
| Плазма с дефицитом FVIII | Плазма с дефицитом FIX | ||
| 1573 | 5 | 388,9 | 403,5 |
| 1 | 629 | 566,8 | |
| 0,5 | 600 | 584,2 | |
| HAPC-13 | 5 | 300,7 | 325,7 |
| 1 | 546,3 | 402,3 | |
| 0,5 | 628,8 | 502,1 | |
| HAPC-14 | 5 | 324,4 | 310,2 |
| 1 | 457,3 | 415,3 | |
| 0,5 | 574,5 | 457 | |
| HAPC14-1 | 5 | 165,8 | 171,3 |
| 1 | 222,5 | 194,6 | |
| 0,5 | 327,1 | 219,3 | |
| HAPC14-2 | 5 | 158,9 | 142,9 |
| 1 | 195,6 | 210,8 | |
| 0,5 | 358,4 | 233,2 | |
| HAPC14-3 | 5 | 176,4 | 185,1 |
| 1 | 188 | 199,6 | |
| 0,5 | 205,2 | 208,4 | |
| HAPC14-4 | 5 | 158,3 | 176,2 |
| 1 | 184,3 | 193,7 | |
| 0,5 | 220,6 | 219,6 | |
| HAPC14-5 | 5 | 171,2 | 166,1 |
| 1 | 200,2 | 187,5 | |
| 0,5 | 223,9 | 197,4 | |
| HAPC14-6 | 5 | 161,7 | 179,5 |
| 1 | 186,9 | 198,5 | |
| 0,5 | 182,3 | 181,3 | |
| HAPC14-7 | 5 | 175,5 | 146,5 |
| 1 | 197,9 | 145,4 | |
| 0,5 | 296,7 | 240,9 | |
| HAPC14-8 | 0,5 | 189,7 | 276,4 |
| 0,1 | 251,9 | 392 | |
| 0,05 | 315,9 | 732 | |
| HAPC14-9 | 0,5 | 181,6 | 170 |
| 0,25 | - | 497,8 | |
| 0,1 | 217,3 | 610,8 | |
| 0,05 | 261,6 | 670,1 | |
| HAPC14-10 | 1 | - | 158,2 |
| 0,5 | 254,5 | 330,7 | |
| 0,1 | 309,1 | 595,5 | |
| 0,05 | 414,6 | 733,3 | |
(2) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FVIII
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FVIII плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6А (конечная концентрация), плюс 0,05 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FVIII 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6А, в плазме с дефицитом фактора свертывания FVIII моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(3) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FIX
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FIX плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6В (конечная концентрация), плюс 0,01 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FIX 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6В, в плазме с дефицитом фактора свертывания FIX моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(4) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FXI
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FIX плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6C (конечная концентрация), плюс 0,06 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FXI 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6C, в плазме с дефицитом фактора свертывания FXI моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(5) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FVII
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FVII плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6D (конечная концентрация), плюс 0,1 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FVII 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6D, в плазме с дефицитом фактора свертывания FVII моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(6) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FXII
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FXII плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6E (конечная концентрация), плюс 0,025 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания FXII 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6E, в плазме с дефицитом фактора свертывания FXII моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(7) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FV
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FV (содержащая 5% стандартной плазмы) плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6F (конечная концентрация), плюс 0,05 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора коагуляции FV (содержащая 5% стандартной плазмы) 150 мкл + буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6F, в плазме с дефицитом фактора свертывания FV моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(8) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания FX
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания FX (содержащая 1% стандартной плазмы) плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6G (конечная концентрация), плюс 0,05 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора коагуляции FX (содержащая 1% стандартной плазмы) 150 мкл + буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6G, в плазме с дефицитом фактора свертывания FX моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
(9) Экспериментальные результаты влияния различных антител в различных концентрациях на фактор свертывания VWF
Экспериментальный метод: антитела разбавляли до соответствующих концентраций буфером OWREN-KOLLER.
Плазма с дефицитом фактора свертывания VWF плюс антитела в различных разведениях на фиг. 6H (конечная концентрация), плюс 0,01 ед./мл Protac (конечная концентрация), плюс буфер OWREN-KOLLER, при комнатной температуре в течение 15 мин.
150 мкл всего 150 мкл
Контроль: плазма с дефицитом фактора свертывания VWF 150 мкл плюс буфер OWREN-KOLLER 150 мкл.
Метод анализа: STAGO Compact Max APTT-процедура.
Экспериментальный результат: Как показано на фиг. 6H, в плазме с дефицитом фактора свертывания VWF моноклональные антитела к aPC полностью ингибировали антикоагулянтную активность aPC.
Пример 6. Фармакодинамический эксперимент in vivo
В мышиной модели гемофилии на основе гуманизированного белка С (со ссылкой на абз. [0230] - [0238] в китайской патентной заявке № CN201911027061,6), после введения мышам определенной дозы моноклонального антитела к aPC измеряли объем кровотечения после ампутации кончика хвоста для определения эффекта свертывания моноклонального антитела к aPC путем ингибирования антикоагулянтной функции aPC.
6.1 Экспериментальный метод
Введение осуществляли путем внутривенной инъекции через кант мыши. Через 1 час после введения мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия. Хвост анестезированной мыши отрезали на 2 мм от кончика хвоста мыши, а рану хвоста погружали в 15 мл физиологического раствора при 37°С для сбора крови. Через 20 минут сбор был остановлен. После лизирования эритроцитов в собранном растворе супернатант собирали центрифугированием. Надосадочную жидкость испытывали с помощью ультрафиолетового спектрофотометра при длине волны 600 нм. Для представления объема кровотечения у мыши использовали измеренное значение OD, которое использовали для измерения функции свертывания крови у мыши. Группа WT (дикий тип) представляет собой нормальных мышей, и группа "без лечения" представляет собой мышей с гемофилией A или гемофилией B, которым не вводили гуманизированный белок С.
6.2 Результат эксперимента
Как показано на фиг. 7A, мышам с гемофилией A с гуманизированным белком C вводили 1 ед. фактора свертывания FVIII, 20 мкг мышиного антитела 1573 и 1 мкг HAPC-14-6 соответственно. Коагуляционная функция у мышей, которым вводили новое моноклональное антитело к aPC HAPC-14-6, была восстановлена до уровня нормальных мышей, что совпало с эффектом лечения мышей фактором свертывания FVIII.
Как показано на фиг. 7B, у мышей с гемофилией A с гуманизированным белком С после введения различных доз HAPC-14-6, соответственно, функция свертывания крови дефицитных мышей могла быть восстановлена до нормального уровня не более чем 1 мкг HAPC-14-6.
Как показано на фиг. 7C, у мышей с гемофилией В с гуманизированным белком С после введения различных доз HAPC-14-6, соответственно, функция свертывания крови дефицитных мышей могла быть восстановлена до нормального уровня не более чем 1 мкг HAPC-14-6.
Раскрытый в настоящем описании результат экспериментов с АЧТВ, индуцированным (protac) активирующим белок C ферментом, которые использовали для тестирования минимальной дозы моноклональных антител к aPC для ингибирования антикоагулянтной активности aPC в плазме крови человека с дефицитом нескольких факторов свертывания, показал, что концентрация не более 1 мкг/мг моноклональных антител к aPC может полностью ингибировать антикоагулянтную активность aPC, в то время как для мышиного антитела HAPC1573 требуется концентрация 100 мкг/мл или выше.
Вышеуказанные варианты осуществления предназначены только для описания технических решений настоящего изобретения, но не для ограничения настоящего изобретения. Хотя настоящее раскрытие подробно описано со ссылкой на предшествующие варианты осуществления, специалисты в данной области техники должны понимать, что они все еще могут вносить изменения в конкретные варианты осуществления, описанные в предшествующих вариантах осуществления, или делать эквивалентные замены некоторых технических признаков. Изменения и преимущества, которые могут быть поняты специалистами в данной области техники без отклонения от сущности и объема концепции изобретения, должны подпадать под объем технических решений, заявленных в настоящем описании.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн
<120> МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К АКТИВИРОВАННОМУ БЕЛКУ С ЧЕЛОВЕКА
И ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 210411
<160> 92
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 4
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Trp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Trp Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 12
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 14
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 16
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Trp Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 24
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 26
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 27
Asn Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 28
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 28
Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 29
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 29
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 30
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 31
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 32
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 33
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 34
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 34
Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 35
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 35
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 36
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 36
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 37
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 37
Leu Ala Ser Trp Leu Gly Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 38
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 39
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 40
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 40
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 41
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 41
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 42
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 42
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 43
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 43
Leu Ala Ser Trp Leu Glu Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 44
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 45
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 46
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 46
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 47
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 47
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 48
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 48
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 49
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 49
Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 50
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 51
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 52
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 52
Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 53
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 53
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 54
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 54
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 55
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 55
Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 56
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 57
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 58
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 58
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 59
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 59
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 60
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 60
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 61
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 61
Leu Ala Ser Trp Leu Gly Ser
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 62
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 63
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 64
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 64
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 65
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 65
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 66
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 66
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 67
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 67
Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 68
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 69
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 70
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 70
Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 71
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 71
Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 72
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 72
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 73
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 73
Leu Ala Ser Arg Leu Glu Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 74
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 75
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 75
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 76
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 76
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 77
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 77
Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 78
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 78
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 79
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 79
Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 80
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 81
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 81
Phe Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 82
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 82
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 83
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 83
Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 84
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 84
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 85
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 85
Leu Ala Ser Arg Leu Gly Ser
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 86
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 87
Asn Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210> 88
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 88
Asp Ile Arg Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 89
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 89
Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 90
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 90
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 91
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 92
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 92
Val Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<---
Claims (49)
1. Моноклональное антитело для связывания с aPC (активированный белок C) или его фрагмент, где антитело содержит одно из следующего:
антитела, содержащего (c) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 33, 34 и 35; и
(d) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 36, 37 и 38;
антитела, содержащего (e) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 39, 40 и 41; и
(f) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 42, 43 и 44;
антитела, содержащего (g) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 45, 46 и 47; и
(h) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 48, 49 и 50;
антитела, содержащего (i) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 51, 52 и 53; и
(j) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 54, 55 и 56;
антитела, содержащего (k) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 57, 58 и 59; и
(l) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 60, 61 и 62;
антитела, содержащего (m) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 63, 64 и 65; и
(n) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 66, 67 и 68;
антитела, содержащего (o) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 69, 70 и 71; и
(p) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 72, 73 и 74;
антитела, содержащего (q) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 75, 76 и 77; и
(r) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 78, 79 и 80;
антитела, содержащего (s) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 81, 82 и 83; и
(t) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 84, 85 и 86; и
антитела, содержащего (u) CDR тяжелой цепи, представленные SEQ ID NO: 87, 88 и 89; и
(v) CDR легкой цепи, представленные SEQ ID NO: 90, 91 и 92.
2. Моноклональное антитело по п. 1, которое выбрано из одного из следующего: антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 7, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 8;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 10;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 12;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 14;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 15, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 16;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 18;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 19, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 20;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 21, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 22;
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 23, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 24; и
антитела, содержащего тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 26.
3. Моноклональное антитело по п. 1, где фрагмент антитела представляет собой Fab', Fab, F(ab')2, однодоменное антитело, Fv или scFv.
4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело по любому из пп. 1-3.
5. Конструкция для экспрессии моноклонального антитела по любому из пп. 1-3, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 4.
6. Система экспрессии, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 4.
7. Фармацевтическая композиция, ингибирующая антикоагулянтную активность aPC, содержая моноклональное антитело по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Набор для детектирования aPC, содержащий моноклональное антитело по любому из пп. 1-3 и буфер, разбавитель, инструкции по эксплуатации.
9. Способ лечения расстройств, связанных со свертыванием, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в лечении, эффективного количества моноклонального антитела по любому из пп. 1-3; причем индивидуум страдает от расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания, или индивидууму необходимо лечение свертывания крови, или индивидуум страдает сепсисом или гемофилией, или индивидууму необходимо регулирование гемостаза.
10. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 при приготовлении лекарственного средства, ингибирующего антикоагулянтную активность aPC.
11. Применение по п. 10, где лекарственное средство предназначено для предотвращения и/или лечения расстройств, связанных с недостаточностью или дефектом свертывания.
12. Применение по п. 11, где расстройства, связанные с недостаточностью или дефектом свертывания, включают расстройства, вызывающие коагулопатию из-за дефицита факторов свертывания и, таким образом, вызывающие кровотечение, и нарушения свертывания, вызванные травмой или хирургическим вмешательством.
13. Применение по п. 11, где расстройства, связанные с недостаточностью или дефектом свертывания, включают гемофилию, сепсис и травматическое кровоизлияние.
14. Применение по п. 10, где лекарственное средство предназначено для ингибирования антикоагулянтной активности активированного белка С у индивидуума.
15. Применение по п. 10, где лекарственное средство предназначено для лечения индивидуума, нуждающегося в свертывании крови.
16. Применение по п. 10, где лекарственное средство предназначено для регулирования гемостаза у индивидуума.
17. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 при получении промотора для повышения способности aPC расщеплять гистоны H3 и H4.
18. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 в иммунологических анализах для диагностики и лечения заболеваний или не связанных с заболеванием.
19. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 при приготовлении реагента для детектирования aPC.
20. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 при приготовлении набора для детектирования aPC.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110791310X | 2021-07-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2824515C1 true RU2824515C1 (ru) | 2024-08-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014085527A1 (en) * | 2012-11-29 | 2014-06-05 | Bayer Healthcare Llc | Humanized monoclonal antibodies against activated protein c and uses thereof |
| RU2539729C2 (ru) * | 2007-10-26 | 2015-01-27 | Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн | Моноклональные антитела против активированного протеина с |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539729C2 (ru) * | 2007-10-26 | 2015-01-27 | Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн | Моноклональные антитела против активированного протеина с |
| WO2014085527A1 (en) * | 2012-11-29 | 2014-06-05 | Bayer Healthcare Llc | Humanized monoclonal antibodies against activated protein c and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAN S.B. et al., Evaluation of anti-activated protein C antibody development in patients with severe sepsis from four clinical studies with drotrecogin alpha (activated), J Thromb Haemost, 2009, vol. 7, N. 11, pp. 1787-1794. ZHAO X. Y. et al., Targeted inhibition of activated protein C by a non-active-site inhibitory antibody to treat hemophilia. Nat Commun, 2020, vol. 11, N. 1, 2992. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101692085B1 (ko) | 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 모노클로날 항체 | |
| TW201741340A (zh) | Cd47抗體及使用其之方法 | |
| EP3262075B1 (en) | Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same | |
| KR101853604B1 (ko) | α２ 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 이와 관련된 방법 및 용도 | |
| US9908944B2 (en) | Antibodies that bind urokinase plasminogen activator | |
| JP2016514687A (ja) | 組織因子経路インヒビターに対するプロドラッグ抗体 | |
| KR20140019375A (ko) | 인간 조직 인자 항체 및 이의 용도 | |
| KR20170138494A (ko) | 항-ｔｙｒ０３ 항체 및 이의 용도 | |
| JPWO2005007800A1 (ja) | 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体 | |
| JP2023531822A (ja) | タウ結合分子 | |
| WO2023284012A1 (zh) | 针对人活化蛋白c的单克隆抗体及其制备和应用 | |
| JP2023528535A (ja) | セリン４１３においてリン酸化されたタウを標的化する高親和性抗体 | |
| EP3957652A1 (en) | Anti-fxi/fxia antibody and use thereof | |
| RU2824515C1 (ru) | Моноклональное антитело к активированному белку с человека и его получение и применение | |
| WO2023016516A1 (zh) | 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 | |
| TWI857319B (zh) | 針對人活化蛋白c的單株抗體及其製備和應用 | |
| KR101804988B1 (ko) | 신규 항-tfpi 항체 및 이를 포함하는 조성물 | |
| KR101744899B1 (ko) | 신규 항-tfpi 항체 및 이를 포함하는 조성물 | |
| JP2016501875A (ja) | 活性化プロテインｃに対するヒト化モノクローナル抗体およびその使用 | |
| KR20240038716A (ko) | 신규 항-masp-2 항체 | |
| CA3152860A1 (en) | Anti-tfpi monoclonal antibodies | |
| WO2023116771A1 (zh) | 一种抗masp-2抗体及其制备方法与用途 | |
| WO2024027771A1 (zh) | 靶向FAP和TGFβ的抗体融合蛋白及其用途 | |
| CN118459583B (zh) | 抗N3pGlu淀粉样蛋白β抗体及其用途 | |
| WO2024188179A1 (zh) | 一种靶向ctgf的抗体或其抗原结合片段及其应用 |