RU2810790C2

RU2810790C2 - Pharmaceutical composition for controlled release of weak acid drugs and its use

Info

Publication number: RU2810790C2
Application number: RU2021106329A
Authority: RU
Inventors: Пей КАНЬ; И Фон ЛИНЬ; Кочиэй ЧЭНЬ
Original assignee: Фармоса Биофарм Инк. (Pharmosa Biopharm Inc.)
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2023-12-28

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions discloses a pharmaceutical composition for the treatment of pulmonary hypertension or interstitial lung disease, containing the following: one or more liposomes suspended in the external environment, wherein the said liposome contains: (a) an external lipid bilayer containing a mixture of a first phospholipid, a second phospholipid and sterol, and (b) an internal aqueous medium containing a weakly acidic drug that is a prostaglandin, a prostacyclin (IP) receptor agonist, an endothelin (ET) receptor antagonist, a glucocorticoid or a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID), or any combination thereof, and salt weak acid, which is a carboxylic acid salt or bicarbonate salt, where the ratio of first phospholipid: sterol: second phospholipid in mole percent is 75-99:0-14.9:0.1-25. The group of inventions also discloses a method of treating pulmonary hypertension or interstitial lung disease and a method of reducing the side effects of a weakly acidic drug.

EFFECT: claimed group of inventions provides high therapeutic activity, with a reduction in potential side effects due to the liposomal composition that does not provide an initial explosive release.

24 cl, 2 dwg, 6 tbl, 6 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

Данная заявка испрашивает приоритет заявки США №62/731,101, поданной 14 сентября 2018 года, полное раскрытие которой включено в настоящем описании в качестве ссылки.This application claims priority to US Application No. 62/731,101, filed September 14, 2018, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

В настоящем документе раскрыты фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одну липосому, инкапсулирующую слабо кислотное лекарственное средство, где уменьшенное количество стерола во внешнем липидном бислое липосомы замедляет или предотвращает «взрывное» (burst) высвобождение и/или обеспечивает устойчивое высвобождение слабокислотного лекарственного средства.Disclosed herein are pharmaceutical compositions comprising at least one liposome encapsulating a weakly acidic drug, wherein a reduced amount of sterol in the outer lipid bilayer of the liposome slows or prevents burst release and/or provides sustained release of the weakly acidic drug.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Липосомы представляют собой микроструктуры, состоящие из двойного слоя (бислоя) природных или синтетических липидов, образующего внутренний компартмент, который служит резервуаром для терапевтического средства. В качестве носителей для доставки лекарств были разработаны различающиеся размером, проницаемостью и стабильностью разнообразные липосомальные композиции, каждая из которых предназначена для обеспечения замедленного высвобождения лекарственного средства. Однако, данные липосомальные композиции замедленного высвобождения обычно демонстрируют высокий начальный всплеск в высвобождении лекарственного средства, что приводит к усилению побочных эффектов во время взрывного высвобождения и/или уровням лекарственного средства в плазме крови за пределами терапевтического окна.Liposomes are microstructures consisting of a double layer (bilayer) of natural or synthetic lipids, forming an internal compartment that serves as a reservoir for the therapeutic agent. A variety of liposomal formulations have been developed as drug delivery vehicles that vary in size, permeability, and stability, each designed to provide sustained drug release. However, these sustained release liposomal formulations typically exhibit a high initial burst in drug release, resulting in increased side effects during burst release and/or plasma drug levels outside the therapeutic window.

Профиль высвобождения липосомальной композиции зависит от структуры липосомальной мембраны и влияет на эффективность липосом. Следовательно, контроль над профилем высвобождения становится важной предпосылкой для эффективного применения липосом в качестве средства доставки лекарств. Например, холестерол добавляется к внешнему липидному бислою для увеличения жесткости мембраны, ее стабильности и уменьшения проницаемости липидного бислоя (S. Kaddah et al., Food Chem Toxicol. 2018 Mar; 113: 40-48). S. Kaddah et al. показывает, что высвобождение инкапсулированного лекарственного средства уменьшается с увеличением содержания холестерола (до 30%) в липосомальном бислое. Е. Corvera et al. (Biochim Biophys Acta. 1992 Jun 30; 1107(2):261-70) сообщает, что добавление низких концентраций холестерола (от 5 до 8%) в липосомы из димиристоилфосфатидилхолина (dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC) и дипальмитоилфосфатидилхолина (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC) понижает стабильность липосом и увеличивает проницаемость мембран.The release profile of the liposomal composition depends on the structure of the liposomal membrane and affects the effectiveness of the liposomes. Therefore, control over the release profile becomes an important prerequisite for the effective use of liposomes as drug delivery vehicles. For example, cholesterol is added to the outer lipid bilayer to increase membrane stiffness, membrane stability, and decrease lipid bilayer permeability (S. Kaddah et al., Food Chem Toxicol. 2018 Mar; 113: 40-48). S. Kaddah et al. shows that the release of encapsulated drug decreases with increasing cholesterol content (up to 30%) in the liposomal bilayer. E. Corvera et al. (Biochim Biophys Acta. 1992 Jun 30; 1107(2):261-70) reports that addition of low concentrations of cholesterol (5 to 8%) to dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) liposomes reduces stability liposomes and increases membrane permeability.

Остается потребность в липосомальной композиции, не дающей начального взрывного высвобождения, с тем чтобы уменьшить потенциальный побочный эффект и увеличить терапевтическую эффективность слабокислотного лекарственного средства. Настоящее изобретение удовлетворяет данные и другие потребности.There remains a need for a liposomal composition that does not provide an initial burst release in order to reduce potential side effects and increase the therapeutic efficacy of a weakly acidic drug. The present invention satisfies these and other needs.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую одну или несколько липосом, суспендированных во внешней среде, причем указанная липосома включает: (а) внешний липидный бислой, содержащий по меньшей мере один везикулообразующий фосфолипид и менее 15 мол. % стерола и (b) внутреннюю водную среду, содержащую слабокислотное лекарственное средство и соль слабой кислоты, где менее 65 масс. % слабокислотного лекарственного средства высвобождается во внешнюю среду в течение 1 часа после введения фармацевтической композиции.The present invention provides a pharmaceutical composition containing one or more liposomes suspended in an external environment, said liposome comprising: (a) an external lipid bilayer containing at least one vesicle-forming phospholipid and less than 15 mol. % sterol and (b) an internal aqueous medium containing a weak acid drug and a salt of a weak acid, where less than 65 wt. % of the weakly acidic drug is released into the external environment within 1 hour after administration of the pharmaceutical composition.

Настоящее изобретение также раскрывает способы лечения респираторного заболевания, включающие стадию введения фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.The present invention also discloses methods of treating a respiratory disease, including the step of administering a pharmaceutical composition described herein.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ уменьшения побочного эффекта слабокислотного лекарственного средства, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в приеме слабокислотного лекарственного средства, эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в данном документе.The present invention also provides a method of reducing the side effect of a weak acid drug, comprising the step of administering to a subject in need of taking the weak acid drug an effective amount of a pharmaceutical composition described herein.

Термины «изобретение», «такое изобретение», «данное изобретение» и «настоящее изобретение», используемые в данном патенте, предназначены для широкого обозначения всего предмета данного патента и приведенной ниже формулы изобретения. Следует понимать, что утверждения, содержащие данные термины, не ограничивают предмет изобретения, описанный в данном документе, и не ограничивают значение или объем приведенной ниже формулы изобретения. Варианты осуществления изобретения, на которые распространяется данный патент, определяются приведенной ниже формулой изобретения, а не данным кратким изложением. Данное краткое изложение представляет собой общий обзор различных аспектов изобретения и знакомит с некоторыми концепциями, которые дополнительно описаны в разделе «Подробное описание» ниже. Данное краткое изложение не предназначено для идентификации ключевых или существенных характеристик заявленного предмета изобретения и не предназначено для использования отдельно для определения объема заявленного предмета изобретения. Для понимания предмета изобретения необходимо обращаться к соответствующим частям полного описания, любым или всем чертежам и каждому пункту формулы изобретения.The terms “invention,” “such invention,” “this invention,” and “the present invention” as used in this patent are intended to broadly refer to the entire subject matter of this patent and the claims below. It should be understood that statements containing these terms do not limit the subject matter of the invention described herein and do not limit the meaning or scope of the claims below. The embodiments covered by this patent are defined by the claims below and not by this summary. This summary provides a general overview of various aspects of the invention and introduces certain concepts that are further described in the Detailed Description section below. This summary is not intended to identify key or essential characteristics of the claimed subject matter and is not intended to be used alone to define the scope of the claimed subject matter. To understand the subject matter of the invention, reference must be made to the relevant portions of the complete specification, any or all of the drawings, and each claim.

Изобретение станет более очевидным при прочтении с сопровождающими фигурами и подробным описанием, которое следует ниже.The invention will become more apparent when read in conjunction with the accompanying figures and detailed description that follows.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны ниже со ссылкой на следующие фигуры.Exemplary embodiments of the present invention are described in detail below with reference to the following figures.

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий логарифм средней концентрации илопроста в плазме у крыс, которым вводили липосомальную композицию, содержащую ило прост, бикарбонат и HP-β-CD (LL021b3A2), липосомальную композицию, содержащую илопрост, бикарбонат и RM-β-CD (LL021m3A2), или раствор илопростаFIG. 1 is a graph showing the logarithm of the mean plasma concentration of iloprost in rats administered a liposomal composition containing iloprost, bicarbonate and HP-β-CD (LL021b3A2), a liposomal composition containing iloprost, bicarbonate and RM-β-CD (LL021m3A2 ), or iloprost solution

ФИГ. 2 представляет собой график, иллюстрирующий соотношение площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до определенного времени (AUC_t) и площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до бесконечности (AUC_inf) для липосомальной композиции, содержащей илопрост, бикарбонат и HP-β-CD (LL021b3A2), липосомальной композиции, содержащей илопрост, бикарбонат и RM-β-CD (LL021m3A2), или раствора илопроста.FIG. 2 is a graph illustrating the relationship between the area under the plasma concentration-time curve from zero to time (AUC _t ) and the area under the plasma concentration-time curve from zero to infinity (AUC _inf ) for a liposomal composition containing iloprost. bicarbonate and HP-β-CD (LL021b3A2), a liposomal composition containing iloprost, bicarbonate and RM-β-CD (LL021m3A2), or an iloprost solution.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

В данном контексте артикли «а» и «an» относятся к одному или более чем одному (то есть, по меньшей мере одному) грамматическому объекту статьи. В качестве примера, «элемент» означает один или более чем один элемент.In this context, the articles "a" and "an" refer to one or more than one (that is, at least one) grammatical object of the article. By way of example, "element" means one or more than one element.

Все числа модифицированы термином «около». Используемый в настоящем описании термин «около» относится к диапазону ±10% от указанного значения.All numbers are modified with the term "about". As used herein, the term “about” refers to a range of ±10% of the specified value.

Термин «содержать» или «содержащий» обычно используется в смысле «включать/включающий», что означает допущение наличия одного или нескольких признаков, ингредиентов или компонентов.The term “comprise” or “comprising” is generally used in the sense of “including”, which means the assumption of the presence of one or more features, ingredients or components.

Термин «субъект» может относиться к позвоночному животному, страдающему респираторным заболеванием, или к позвоночному животному, которое, как считается, нуждается в лечении респираторного заболевания. Субъекты включают теплокровных животных, таких как млекопитающие, таких как приматы, и, более предпочтительно, человека. Приматы также являются субъектами. Термин «субъект» включает домашних животных, таких как кошки, собаки и т.д., домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы и т.д.) и лабораторных животных (например, мышь, кролик, крыса, песчанка, морская свинка и др.). Таким образом, в настоящем описании рассматриваются ветеринарные применения и медицинские составы.The term "subject" may refer to a vertebrate animal suffering from a respiratory disease, or to a vertebrate animal that is considered to be in need of treatment for a respiratory disease. Subjects include warm-blooded animals such as mammals, such as primates, and more preferably humans. Primates are also subjects. The term "subject" includes domestic animals such as cats, dogs, etc., livestock (e.g., cattle, horses, pigs, sheep, goats, etc.) and laboratory animals (e.g., mouse, rabbit , rat, gerbil, guinea pig, etc.). Thus, veterinary applications and medicinal formulations are contemplated herein.

Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Лица, нуждающиеся в лечении, включают тех, кто уже страдает респираторным заболеванием или родственным расстройством, а также тех, кто склонен к респираторному заболеванию или родственному расстройству, или тех, у которых респираторное заболевание необходимо предотвратить.The term "treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. Persons in need of treatment include those already suffering from a respiratory disease or related disorder, as well as those who are prone to developing a respiratory disease or related disorder, or those in whom a respiratory disease is to be prevented.

Слабокислотное лекарственное средство, как используется в настоящем описании, если не указано иное или иное не очевидно из контекста, также включает его фармацевтически приемлемую соль и его протонированную форму. В одном варианте осуществления слабо кислотное лекарственное средство содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из карбоксильной группы (-СООН), гидроксильной группы (-ОН), фосфатной группы (-РО₄) и любой их комбинации. В другом варианте осуществления слабо кислотное лекарственное средство имеет pKa от 1 до менее чем около 7, от 2 до менее чем около 6, от 2 до 6,9 или от 2,5 до 6. Слабокислотное лекарственное средство также может содержать одну или несколько функциональных групп в дополнение к вышеуказанной карбоксильной группе (-СООН), гидроксильной группе (-ОН) и фосфатной группе (-РО₄); такая дополнительная функциональная группа (группы) не должна существенно изменять кислотность лекарственного средства по сравнению с кислотностью его нефункционализированных аналогов. В одном из вариантов осуществления слабокислотное лекарственное средство применяется для лечения легочной гипертензии. В другом варианте осуществления слабокислотное лекарственное средство представляет собой простагландин, агонист рецептора простациклина, глюкокортикоид или нестероидное противовоспалительное средство. В таблице 1 показаны неограничивающие примеры слабокислотного лекарственного средства по настоящему изобретению.A weak acid drug as used herein, unless otherwise indicated or otherwise apparent from the context, also includes its pharmaceutically acceptable salt and its protonated form. In one embodiment, the weakly acidic drug contains at least one functional group selected from the group consisting of a carboxyl group (-COOH), a hydroxyl group (-OH), a phosphate group (-PO ₄ ), and any combination thereof. In another embodiment, the weakly acidic drug has a pKa of 1 to less than about 7, 2 to less than about 6, 2 to 6.9, or 2.5 to 6. The weakly acidic drug may also contain one or more functional groups in addition to the above carboxyl group (-COOH), hydroxyl group (-OH) and phosphate group (-PO ₄ ); such additional functional group(s) should not significantly change the acidity of the drug compared to the acidity of its non-functionalized analogues. In one embodiment, the weak acid drug is used to treat pulmonary hypertension. In another embodiment, the weak acid drug is a prostaglandin, a prostacyclin receptor agonist, a glucocorticoid, or a nonsteroidal anti-inflammatory agent. Table 1 shows non-limiting examples of the weak acid drug of the present invention.

Используемые в настоящем описании термины «инкапсуляция», «нагруженный» и «захваченный» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к включению или связыванию биологически активного средства (например, илопроста) во внутренней водной среде липосомы.As used herein, the terms “encapsulation,” “loaded,” and “entrapped” can be used interchangeably and refer to the incorporation or binding of a biologically active agent (eg, iloprost) into the internal aqueous environment of a liposome.

В служащем примером варианте осуществления стерол во внешнем липидном бислое составляет менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 мол. %. В другом служащем примером варианте осуществления внешний липидный бислой по существу не содержит стерола.In an exemplary embodiment, the sterol in the outer lipid bilayer is less than 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 mol. %. In another exemplary embodiment, the outer lipid bilayer is substantially free of sterol.

Эффективность инкапсуляции слабокислотного лекарственного средства в фармацевтической композиции выше чем около 70, 75 или 80%.The encapsulation efficiency of a weakly acidic drug in a pharmaceutical composition is greater than about 70, 75 or 80%.

Фармацевтическая композиция уменьшает взрывное высвобождение инкапсулированного слабокислотного лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления менее чем около 70%, 69%, 68%, 67%, 66% или 65% слабокислотного лекарственного средства высвобождается в течение 1 часа после введения фармацевтической композиции. В результате, побочные эффекты слабокислотного лекарственного средства на месте целевого действия (например, кашель, раздражение горла, боль в глотке, носовое кровотечение, кровохарканье и свистящее дыхание в верхних дыхательных путях) уменьшаются по сравнению с побочными эффектами фармацевтической композиции, в которой стерол во внешнем липидном бислое составляет 15 мол. % или более. Кроме того, фармацевтическая композиция продлевает высвобождение слабокислого лекарственного средства и снижает частоту дозирования.The pharmaceutical composition reduces the burst release of the encapsulated weakly acidic drug. In one embodiment, less than about 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, or 65% of the weakly acidic drug is released within 1 hour after administration of the pharmaceutical composition. As a result, the side effects of a weakly acidic drug at the target site of action (eg, cough, throat irritation, sore throat, nosebleeds, hemoptysis, and wheezing in the upper respiratory tract) are reduced compared with the side effects of a pharmaceutical composition in which the sterol is in the external lipid bilayer is 15 mol. % or more. In addition, the pharmaceutical composition prolongs the release of the weakly acidic drug and reduces the frequency of dosing.

В одном варианте осуществления взрывное высвобождение слабокислотного лекарственного средства из описанной фармацевтической композиции дополнительно уменьшается при добавлении или инкапсулировании циклодекстрина во внутренней водной среде. Неограничивающие примеры циклодекстрина включают α-CD, β-CD, γ-CD, 2-гидроксипропил β-CD (HP-β-CD), сульфобутиловый эфир β-CD (SBE-β-CD), случайно метилированный β-CD (RM-β-CD) или их комбинацию. Предпочтительно циклодекстрин представляет собой HP-β-CD, RM-β-CD или их комбинацию. В одном примерном варианте осуществления мольное соотношение слабокислотного лекарственного средства и циклодекстрина (соотношение лекарственное средство/CD) меньше или равно около 0,06, 0,055, 0,05, 0,045, 0,04, 0,035 или 0,03.In one embodiment, the burst release of a weakly acidic drug from a disclosed pharmaceutical composition is further reduced by the addition or encapsulation of cyclodextrin in an internal aqueous environment. Non-limiting examples of cyclodextrin include α-CD, β-CD, γ-CD, 2-hydroxypropyl β-CD (HP-β-CD), sulfobutyl ether β-CD (SBE-β-CD), randomly methylated β-CD (RM -β-CD) or a combination thereof. Preferably the cyclodextrin is HP-β-CD, RM-β-CD or a combination thereof. In one exemplary embodiment, the molar ratio of weak acid drug to cyclodextrin (drug/CD ratio) is less than or equal to about 0.06, 0.055, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, or 0.03.

Также раскрыт способ лечения респираторного заболевания, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, в которой количество стерола во внешнем липидном бислое составляет менее 15 мол. %. Взрывное высвобождение слабокислотного лекарственного средства описанной в данном документе фармацевтической композиции уменьшено по сравнению с таковым фармацевтической композиции с содержанием стерола во внешнем липидном бислое, составляющим 15 мол. % или превышающим 15 мол. %. Неограничивающие примеры респираторного заболевания включают легочную гипертензию и интерстициальное заболевание легких.Also disclosed is a method of treating a respiratory disease, comprising the step of administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition disclosed herein, wherein the amount of sterol in the outer lipid bilayer is less than 15 mol. %. The burst release of the weakly acidic drug of the pharmaceutical composition described herein is reduced compared to that of the pharmaceutical composition with a sterol content of the outer lipid bilayer of 15 mol. % or exceeding 15 mol. %. Non-limiting examples of respiratory disease include pulmonary hypertension and interstitial lung disease.

Дополнительно раскрыто применение фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, для лечения респираторного заболевания или применение фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения респираторного заболевания.Further disclosed is the use of a pharmaceutical composition disclosed herein for the treatment of a respiratory disease or the use of a pharmaceutical composition disclosed herein for the manufacture of a medicament for the treatment of a respiratory disease.

Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения побочного эффекта слабокислотного лекарственного средства, включающим введение субъекту, нуждающемуся в приеме слабокислотного лекарственного средства, эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в данном документе, в которой количество стерола во внешнем липидном бислое составляет менее 15 мол. %.The present invention also provides methods for reducing the side effect of a weakly acidic drug, comprising administering to a subject in need of a weakly acidic drug an effective amount of a pharmaceutical composition described herein, wherein the amount of sterol in the outer lipid bilayer is less than 15 mol. %.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, раскрытую в настоящем документе, вводят путем ингаляции для уменьшения побочного действия слабокислотного лекарственного средства в верхних дыхательных путях.In some embodiments, a pharmaceutical composition disclosed herein is administered by inhalation to reduce the side effects of a weakly acidic drug in the upper respiratory tract.

А. Липосомальные компонентыA. Liposomal components

Используемый в настоящем описании термин «липосома» относится к микроскопическим везикулам или частицам, состоящим из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих внутреннюю водную среду. Для образования липосом необходимо присутствие по меньшей мере одного «везикулообразующего липида», который представляет собой амфипатический липид, способный либо образовывать липидный бислой, либо встраиваться в него. Любой подходящий везикулообразующий липид может быть использован для образования липидного бислоя, составляющего липосомы. Везикулообразующий липид включает, но без ограничения, фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилинозитол (PI), фосфатидную кислоту (РА), фосфатидилэтаноламин (РЕ) или фосфатидилсерин (PS), и заряженные липиды, такие как положительно заряженный липид или отрицательно заряженный липид.As used herein, the term “liposome” refers to microscopic vesicles or particles consisting of one or more lipid bilayers surrounding an internal aqueous environment. The formation of liposomes requires the presence of at least one “vesicle-forming lipid,” which is an amphipathic lipid capable of either forming or being incorporated into a lipid bilayer. Any suitable vesicle-forming lipid can be used to form the lipid bilayer constituting the liposomes. Vesicle-forming lipid includes, but is not limited to, phospholipids such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidic acid (PA), phosphatidylethanolamine (PE) or phosphatidylserine (PS), and charged lipids such as positively charged charged lipid or negatively charged lipid.

Липидный бислой липосомы включает в себя по меньшей мере один везикулообразующий липид и от 0 (нуля) до менее чем 15 мол. % стерола (например, от 0 до 14,99 мол. %), причем указанный стерол выбран из группы, состоящей из холестерола, холестерола гексасукцината, эргостерола, ланостерола и любой их комбинации, но без ограничения ими. В служащем примером варианте осуществления стерол представляет собой холестерол.The lipid bilayer of a liposome includes at least one vesicle-forming lipid and from 0 (zero) to less than 15 mol. % sterol (for example, from 0 to 14.99 mol.%), and the specified sterol is selected from the group consisting of, but not limited to, cholesterol, cholesterol hexasuccinate, ergosterol, lanosterol and any combination thereof. In an exemplary embodiment, the sterol is cholesterol.

В некоторых вариантах осуществления везикулообразующий липид представляет собой смесь первого фосфолипида и второго фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления первый фосфолипид представляет собой фосфатидилхолин (PC), который выбран из группы, состоящей из гидрогенизированного яичного фосфатидилхолина (НЕРС), гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина (HSPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), дистеарилохолинфосфатидил-фосфатидилфосфолина (DSPC) димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), яичного фосфатидилхолина (ЕРС), соевого фосфатидилхолина (SPC), олеоилпальмитоилфосфатидилхолинаа, диолеоилфосфатидилхолинаа (DOPC), дипетрозелиноилфосфатидилхолина, пальмитоилелаидоилфосфатидилхолина, пальмитоилолеилфосфатидилхолина, дилауроилфосфатидилхолина (DLPC), диундеканоилфосфатидилхолина, дидеканоилфосфатидилхолина, динонилфосфатидилхолина и любой их комбинации. В других вариантах осуществления второй фосфолипид представляет собой модифицированный полиэтиленгликолем фосфолипид, содержащий полиэтиленгликоль с молекулярной массой от около 500 до около 10000 дальтон, такой как 1,2-дистеаролили-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG2000), отрицательно заряженный фосфолипид, например, дистеарилоилфосфатидилглицерин (DSPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) или димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) или диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG). В служащем примером варианте осуществления соотношение первый фосфолипид : холестерол : второй фосфолипид в мольных процентах составляет 75-99:0-14,9:0,1-25.In some embodiments, the vesicle-forming lipid is a mixture of a first phospholipid and a second phospholipid. In some embodiments, the first phospholipid is phosphatidylcholine (PC), which is selected from the group consisting of hydrogenated egg phosphatidylcholine (HEPC), hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearylocholine phosphatidylphosphatidylphospholine (DSPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), egg phosphatidylcholine (EPC), soy phosphatidylcholine (SPC), oleoyl palmitoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipetrozelinoylphosphatidylcholine, palmitoylelaidoylphosphatidylcholine, palmitoyloleylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), diundecanoylphosphatidylcholine, didecanoylphosphati dilcholine, dinonylphosphatidylcholine and any combination thereof. In other embodiments, the second phospholipid is a polyethylene glycol modified phospholipid containing a polyethylene glycol with a molecular weight of about 500 to about 10,000 daltons, such as 1,2-distearolyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 ] (DSPE-PEG2000), a negatively charged phospholipid such as distearyloylphosphatidylglycerol (DSPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) or dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) or dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG). In an exemplary embodiment, the mole percent ratio of first phospholipid:cholesterol:second phospholipid is 75-99:0-14.9:0.1-25.

В других вариантах осуществления липиды, образующие везикулы, представляют собой смесь первого фосфолипида и заряженного липида. В служащем примером варианте осуществления липиды, образующие везикулы, представляют собой смесь первого фосфолипида, второго фосфолипида и заряженного липида. Заряженный липид включает стеариламин, 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерол (DC-холестерол), N⁴-холестерил-спермин (GL67), диметилдиоктадециламмоний (DDAB), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний пропан (DOTMA), этилфосфохолин (этил PC) или их комбинацию. В другом служащем примером варианте осуществления соотношение первый фосфолипид : холестерол : второй фосфолипид в мольных процентах составляет 75-99:0-14,9:0,1-25.In other embodiments, the vesicle-forming lipids are a mixture of a first phospholipid and a charged lipid. In an exemplary embodiment, the lipids forming the vesicles are a mixture of a first phospholipid, a second phospholipid, and a charged lipid. Charged lipid includes stearylamine, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol (DC-cholesterol), N ⁴ -cholesteryl-spermine (GL67), dimethyldioctadecylammonium (DDAB), 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (DOTMA), ethylphosphocholine (ethyl PC), or a combination thereof. In another exemplary embodiment, the mole percent ratio of first phospholipid:cholesterol:second phospholipid is 75-99:0-14.9:0.1-25.

В одном из вариантов осуществления соотношение в липидном бислое HSPC, холестерола и DSPG в мольных процентах составляет 75-99:0-14,9:0,1-25. В другом варианте осуществления соотношение HSPC, холестерола и DSPE-PEG2000 в мольных процентах в липидном бислое составляет 75-99:0-14,9:0,1-25.In one embodiment, the lipid bilayer ratio of HSPC, cholesterol and DSPG in mole percent is 75-99:0-14.9:0.1-25. In another embodiment, the mole percentage ratio of HSPC, cholesterol and DSPE-PEG2000 in the lipid bilayer is 75-99:0-14.9:0.1-25.

В одном варианте осуществления внешний липидный бислой липосом дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, которое может быть неионным поверхностно-активным веществом, катионным поверхностно-активным веществом или цвиттерионным поверхностно-активным веществом. Неионное поверхностно-активное вещество не имеет на своей головной части формально заряженных групп. Катионное поверхностно-активное вещество несет на своей головной части только положительный заряд. Цвиттерионное поверхностно-активное вещество электрически нейтрально, но несет формальные положительные и отрицательные заряды на различных атомах.In one embodiment, the outer lipid bilayer of the liposomes further comprises a surfactant, which may be a nonionic surfactant, a cationic surfactant, or a zwitterionic surfactant. A nonionic surfactant does not have formally charged groups on its head. A cationic surfactant carries only a positive charge on its head. A zwitterionic surfactant is electrically neutral, but carries formal positive and negative charges on various atoms.

Неограничивающие примеры неионного поверхностно-активного вещества включают в себя неионные водорастворимые моно-, ди- и три-глицериды; неионные водорастворимые сложные эфиры моно- и дижирных кислот и полиэтиленгликоля; неионные водорастворимые сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, моноолеаты сорбитана, такие как TWEEN 20 (полиоксиэтилен 20 сорбитанмоноолеат), SPAN 80); неионные водорастворимые триблок-сополимеры (например, триблок-сополимеры поли(этиленоксида)/полипропиленоксида)/поли(этиленоксида), такие как POLOXAMER 406 (PLURONIC F-127), или их производные.Non-limiting examples of non-ionic surfactant include non-ionic water-soluble mono-, di- and tri-glycerides; nonionic water-soluble esters of mono- and di-fatty acids and polyethylene glycol; non-ionic water-soluble sorbitan fatty acid esters (eg sorbitan monooleates such as TWEEN 20 (polyoxyethylene 20 sorbitan monooleate), SPAN 80); nonionic water-soluble triblock copolymers (eg, poly(ethylene oxide)/polypropylene oxide)/poly(ethylene oxide) triblock copolymers, such as POLOXAMER 406 (PLURONIC F-127), or derivatives thereof.

Неограничивающие примеры катионного поверхностно-активного вещества включают бромид диметилдиалкиламмония или бромид додецилтриметиламмония.Non-limiting examples of the cationic surfactant include dimethyldialkylammonium bromide or dodecyltrimethylammonium bromide.

Неограничивающие примеры цвиттерионного поверхностно-активного вещества включают 3-(N,N-диметилпальмитилламмонио)пропансульфонат.Non-limiting examples of zwitterionic surfactant include 3-(N,N-dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate.

Согласно настоящему изобретению, липосомы получают в среде, содержащей соль слабой кислоты, чтобы обеспечить градиент рН между внутренней водной средой и внешней средой липосомы. Когда везикулообразующий фосфолипид и менее чем 15% стерола находятся в контакте со средой, содержащей соль слабой кислоты, образуется суспензия липосом.According to the present invention, liposomes are prepared in a medium containing a weak acid salt to provide a pH gradient between the internal aqueous environment and the external environment of the liposome. When the vesicle-forming phospholipid and less than 15% sterol are in contact with a medium containing a weak acid salt, a suspension of liposomes is formed.

Липосома в суспензии подвергается уменьшению размера. Размер липосомы обычно определяется ее диаметром. Уменьшение размера липосом может быть достигнуто с помощью ряда способов, таких как экструзия, обработка ультразвуком, способы гомогенизации или способы измельчения, которые хорошо известны и могут быть выполнены специалистами в данной области техники. Экструзия включает пропускание липосом под давлением один или несколько раз через фильтры с определенными размерами пор. Фильтры обычно изготавливаются из поликарбоната, но также могут быть изготовлены из любого прочного материала, который не взаимодействует с липосомами и который достаточно прочен, чтобы обеспечить экструзию при достаточном давлении. Размер липосом можно уменьшить с помощью обработки ультразвуком, которая использует звуковую энергию для разрушения или сдвига липосом, которые спонтанно превращаются в липосомы меньшего размера. Например, обработка ультразвуком может быть проведена путем погружения стеклянной пробирки, содержащей суспензию липосом, в звуковой эпицентр, созданный в ультразвуковом устройстве типа ванны, или может быть использован ультразвуковой излучатель зондового типа, в котором звуковая энергия генерируется вибрацией титанового зонда в прямом контакте с суспензией липосом. В настоящем изобретении липосомы обычно имеют диаметр от около 50 нм до 500 нм, например около 500 нм или менее, около 400 нм или менее, около 300 нм или менее, около 200 нм или менее, или около 100 нм или менее.The liposome in suspension undergoes a reduction in size. The size of a liposome is usually determined by its diameter. Reduction in the size of liposomes can be achieved by a number of methods, such as extrusion, sonication, homogenization methods or grinding methods, which are well known and can be performed by those skilled in the art. Extrusion involves passing liposomes under pressure one or more times through filters of specific pore sizes. Filters are usually made of polycarbonate, but can also be made of any durable material that does not interact with liposomes and that is strong enough to allow extrusion under sufficient pressure. The size of liposomes can be reduced by sonication, which uses sonic energy to disrupt or shear liposomes, which spontaneously transform into smaller liposomes. For example, sonication can be accomplished by immersing a glass tube containing a liposome suspension in a sonic epicenter created in a bathtub-type sonicator, or a probe-type sonicator can be used in which sound energy is generated by vibrating a titanium probe in direct contact with the liposome suspension. . In the present invention, liposomes typically have a diameter of from about 50 nm to 500 nm, such as about 500 nm or less, about 400 nm or less, about 300 nm or less, about 200 nm or less, or about 100 nm or less.

После получения нужного размера концентрацию кислоты слабой соли во внешней среде регулируют таким образом, чтобы обеспечить градиент рН между внутренней водной средой и внешней средой, что может быть осуществлено несколькими способами, например, путем замены внешней среды подходящим буфером, в котором отсутствуют соли слабой кислоты, таким как буфер лимонной кислоты (Н₃С₆Н₅О) и буфер фосфорной кислоты (H₃PO₄), такими способами, как диафильтрация, диализ, ультрафильтрация или фильтрация с тангенциальным потоком.Once the desired size is obtained, the concentration of the weak salt acid in the external medium is adjusted to provide a pH gradient between the internal aqueous medium and the external medium, which can be done in several ways, for example, by replacing the external medium with a suitable buffer that does not contain weak acid salts, such as citric acid buffer (H ₃ C ₆ H ₅ O) and phosphoric acid buffer (H ₃ PO ₄ ), by methods such as diafiltration, dialysis, ultrafiltration or tangential flow filtration.

Соль слабой кислоты обеспечивает градиент рН, более низкий снаружи и более высокий внутри, между внешней средой и внутренней водной средой липосом. В одном варианте осуществления рН внутренней водной среды по меньшей мере на 0,1 единицы выше рН внешней среды. В другом варианте осуществления рН внутренней водной среды по меньшей мере на 1 единицу выше рН внешней среды. В еще одном варианте осуществления рН внутренней водной среды составляет около 7, 8, 9 или 10, и рН внешней среды составляет менее 7, менее 6, менее 5, менее 4, менее 3, около 3-7, около 3,5-6,5 или около 4-6. В еще одном служащем примером варианте осуществления рН внешней среды превышает pKa слабокислотного лекарственного средства.The weak acid salt provides a pH gradient, lower on the outside and higher on the inside, between the external environment and the internal aqueous environment of the liposomes. In one embodiment, the pH of the internal aqueous environment is at least 0.1 unit higher than the pH of the external environment. In another embodiment, the pH of the internal aqueous environment is at least 1 unit higher than the pH of the external environment. In yet another embodiment, the internal aqueous pH is about 7, 8, 9, or 10, and the external pH is less than 7, less than 6, less than 5, less than 4, less than 3, about 3-7, about 3.5-6 .5 or about 4-6. In yet another exemplary embodiment, the pH of the external environment is greater than the pKa of the weakly acidic drug.

Неограничивающие примеры соли слабой кислоты включают соли карбоновой кислоты и бикарбонатную соль.Non-limiting examples of a weak acid salt include carboxylic acid salts and a bicarbonate salt.

Термин «бикарбонатная соль», как он используется в настоящем описании, относится к фармацевтически приемлемой соли соединения, включающей бикарбонатный анион и катионный компонент. В одном варианте осуществления катионный компонент солевого соединения представляет собой металл. Неограничивающие примеры металла включают металл группы IA или IIA, такой как калий (K), натрий (Na), кальций (Са), магний (Mg), цезий (Cs) и литий (Li), или металл, отличный от металлов группы IA или IIA, такой как двухвалентное железо (Fe) и никель (Ni). Примеры бикарбонатной соли включают, но не ограничиваются ими, бикарбонат калия, бикарбонат натрия, бикарбонат кальция, бикарбонат магния, бикарбонат цезия, бикарбонат лития, бикарбонат никеля, бикарбонат двухвалентного железа или любую их комбинацию.The term "bicarbonate salt" as used herein refers to a pharmaceutically acceptable salt of a compound comprising a bicarbonate anion and a cationic moiety. In one embodiment, the cationic component of the salt compound is a metal. Non-limiting examples of the metal include a Group IA or IIA metal such as potassium (K), sodium (Na), calcium (Ca), magnesium (Mg), cesium (Cs) and lithium (Li), or a metal other than Group IA metals or IIA, such as ferrous iron (Fe) and nickel (Ni). Examples of the bicarbonate salt include, but are not limited to, potassium bicarbonate, sodium bicarbonate, calcium bicarbonate, magnesium bicarbonate, cesium bicarbonate, lithium bicarbonate, nickel bicarbonate, ferrous bicarbonate, or any combination thereof.

Используемый в настоящем описании термин «соль карбоновой кислоты» включает, но не ограничивается ими, формиат, ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерат, изовалерат или их комбинацию. В одном служащем примером варианте осуществления ацетат представляет собой ацетат натрия, ацетат кальция или их комбинацию.As used herein, the term “carboxylic acid salt” includes, but is not limited to, formate, acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate, isovalerate, or a combination thereof. In one exemplary embodiment, the acetate is sodium acetate, calcium acetate, or a combination thereof.

Концентрация соли бикарбоната или кислоты карбоновой соли составляет 50 мМ или выше, 100 мМ или выше, 150 мМ или выше, 200 мМ или выше, 250 мМ или выше, 300 мМ или выше, 350 мМ или выше, 400 мМ или выше, 450 мМ или выше, 500 мМ или выше, 600 мМ или выше, 700 М или выше, 800 мМ или выше 900 мМ, менее 1000 мМ, от 50 мМ до менее 1000 мМ, от 50 мМ до 800 мМ, от 200 до менее 1000 мМ, от 200 до 800 мМ или от 200 до 600 мМ, от 250 до менее 1000 мМ, от 250 до 800 мМ или от 250 до 600 мМ, от 300 от мМ до 600 мМ.The concentration of the bicarbonate salt or carboxylic acid salt is 50 mM or higher, 100 mM or higher, 150 mM or higher, 200 mM or higher, 250 mM or higher, 300 mM or higher, 350 mM or higher, 400 mM or higher, 450 mM or higher, 500 mM or higher, 600 mM or higher, 700 mM or higher, 800 mM or higher 900 mM, less than 1000 mM, 50 mM to less than 1000 mM, 50 mM to 800 mM, 200 to less than 1000 mM , from 200 to 800 mM or from 200 to 600 mM, from 250 to less than 1000 mM, from 250 to 800 mM or from 250 to 600 mM, from 300 to less than 600 mM.

Приготовленные липосомы можно хранить в течение значительных периодов времени перед загрузкой слабокислотного лекарственного средства и введением субъекту. Например, липосомы можно хранить в условиях охлаждения в течение значительных периодов времени перед загрузкой слабокислотного лекарственного средства. Альтернативно, липосомы можно дегидратировать, хранить и затем регидратировать и нагружать слабокислотным лекарственным средством перед введением. Липосомы также могут быть дегидратированы после загрузки слабокислотным лекарственным средством. Дегидратация может быть проведена рядом способов, доступных и известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления липосомы дегидратируют с использованием стандартного устройства для сублимационной сушки, то есть дегидратации в условиях низкого давления. Также липосомы можно замораживать, например, с использованием жидкого азота. Сахариды можно добавлять в липосомальную среду, например, в буфер, содержащий липосомы, до дегидратации, чтобы гарантировать стабильность и целостность липосом во время дегидратации. Примеры сахаридов включают, но не ограничиваются ими, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстрозу, сорбит, маннит, ксилит или их комбинации.The prepared liposomes can be stored for significant periods of time before loading the weakly acidic drug and administering it to the subject. For example, liposomes can be stored under refrigerated conditions for significant periods of time before loading with a weakly acidic drug. Alternatively, the liposomes can be dehydrated, stored and then rehydrated and loaded with a weakly acidic drug before administration. Liposomes can also be dehydrated after loading with a weakly acidic drug. Dehydration can be carried out by a number of methods available and known in the art. In some embodiments, the liposomes are dehydrated using a standard freeze-drying apparatus, that is, dehydration under low pressure conditions. Liposomes can also be frozen, for example, using liquid nitrogen. Saccharides can be added to the liposomal medium, such as a buffer containing the liposomes, prior to dehydration to ensure the stability and integrity of the liposomes during dehydration. Examples of saccharides include, but are not limited to, maltose, lactose, sucrose, trehalose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, or combinations thereof.

Суспензия липосом, содержащая менее 15 мол. % стерола или практически не содержащая стерола, как описано выше, готова для нагрузки слабо кислотным лекарственным средством. Обычно, слабо кислотное лекарственное средство добавляют во внешнюю среду липосомы, и полученную суспензию инкубируют, обеспечивая диффузию слабокислотного лекарственного средства во внутреннюю водную среду липосомы и до достижения желаемой концентрации нагрузки и эффективности инкапсуляции (процентное содержание внутреннего/инкапсулированного количества слабокислотного лекарственного средства по отношению к общему количеству слабокислотного лекарственного средства в фармацевтической композиции).A liposome suspension containing less than 15 mol. % sterol or substantially free of sterol as described above is ready for weakly acidic drug loading. Typically, a weakly acidic drug is added to the external environment of the liposome and the resulting suspension is incubated, allowing the weakly acidic drug to diffuse into the internal aqueous environment of the liposome until the desired loading concentration and encapsulation efficiency (percentage of internal/encapsulated amount of weakly acidic drug relative to the total) is achieved. amount of weakly acidic drug in the pharmaceutical composition).

В. Связь между содержанием стерола во внешнем липидном бислое и профилем контролируемого высвобожденияB. Relationship between sterol content of the outer lipid bilayer and controlled release profile

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, имеющая менее 15 мольных процентов (например, от 0 до 14,99 мол. %) стерола в липосомальном внешнем липидном бислое уменьшает взрывное высвобождение инкапсулированной кислоты слабокислотного лекарственного средства и, следовательно, уменьшает побочный эффект слабокислотного лекарственного средства. Дополнительно, количество слабокислотного лекарственного средства, достаточное для достижения желаемого терапевтического эффекта, высвобождается из фармацевтической композиции и профиль высвобождения неожиданно расширяется по сравнению с таковым фармацевтической композиции с более чем 15 мол. % стерола в липосомальном внешнем липидном бислое.The pharmaceutical composition of the present invention having less than 15 mole percent (eg, 0 to 14.99 mole percent) of sterol in the liposomal outer lipid bilayer reduces the burst release of the encapsulated acid of the weak acid drug and therefore reduces the side effect of the weak acid drug. Additionally, an amount of a weakly acidic drug sufficient to achieve the desired therapeutic effect is released from the pharmaceutical composition and the release profile is unexpectedly expanded compared to that of a pharmaceutical composition with more than 15 mol. % sterol in the liposomal outer lipid bilayer.

Как использован в данном описании, термин «взрывное высвобождение» относится к быстрому и/или в некоторой степени неконтролируемому высвобождению более чем 70, 69, 68, 67, 66 или 65% инкапсулированного слабокислотного лекарственного средства из фармацевтической композиции в течение 1 часа (60 минут) после введения фармацевтической композиции.As used herein, the term "burst release" refers to the rapid and/or somewhat uncontrolled release of more than 70, 69, 68, 67, 66 or 65% of the encapsulated weak acid drug from the pharmaceutical composition within 1 hour (60 minutes ) after administration of the pharmaceutical composition.

Используемый в настоящем описании термин «продленное высвобождение» может использоваться взаимозаменяемо с «контролируемым высвобождением», «отсроченным высвобождением», «модифицированным высвобождением», «пролонгированным высвобождением», «запрограммированным высвобождением», «высвобождением по времени», «с контролируемой скоростью» или «замедленным высвобождением» и относится к высвобождению менее чем 50, 45 или 40% слабокислотного лекарственного средства в течение 1 часа после введения фармацевтической композиции.As used herein, the term "extended release" may be used interchangeably with "controlled release", "delayed release", "modified release", "extended release", "programmed release", "timed release", "controlled rate" or "sustained release" and refers to the release of less than 50, 45 or 40% of the weakly acidic drug within 1 hour after administration of the pharmaceutical composition.

В одном варианте осуществления профиль быстрого высвобождения или замедленного высвобождения фармацевтической композиции основан на анализе высвобождения in vitro (in vitro release (IVR)) и/или исследовании in vivo фармакокинетики захваченного слабокислотного лекарственного средства.In one embodiment, the immediate release or sustained release profile of the pharmaceutical composition is based on an in vitro release (IVR) assay and/or an in vivo pharmacokinetics study of the entrapped weak acid drug.

В некоторых вариантах осуществления, основанных на анализе высвобождения in vitro (IVR) и/или исследовании in vivo фармакокинетики, фармацевтическая композиция имеет профиль высвобождения, где менее чем около 70, 69, 68, 67, 66 или 65% по массе захваченного слабокислотного лекарственного средства высвобождается в течение 1 часа с момента введения фармацевтической композиции.In some embodiments, based on an in vitro release assay (IVR) and/or an in vivo pharmacokinetics study, the pharmaceutical composition has a release profile wherein less than about 70, 69, 68, 67, 66, or 65% by weight of the entrapped weak acid drug released within 1 hour from the moment of administration of the pharmaceutical composition.

С. ВведениеC. Introduction

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена в полость субъекта, которая не имеет непосредственного контакта с кровотоком. Примеры способов введения включают, но не ограничиваются ими, ингаляцию, интратрахеальную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрисуставную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интравитреальную инъекцию и интратекальную инъекцию.The pharmaceutical composition of the present invention can be introduced into a cavity of a subject that does not have direct contact with the bloodstream. Examples of routes of administration include, but are not limited to, inhalation, intratracheal injection, subcutaneous injection, intra-articular injection, intramuscular injection, intravitreal injection, and intrathecal injection.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может вводиться непосредственно в кровоток субъекта.The pharmaceutical composition of the present invention can also be administered directly into the bloodstream of a subject.

Согласно данному раскрытию, фармацевтическая композиция может вводиться от одного до трех раз в день, один раз каждые 2 дня или один раз каждые 3 дня.According to this disclosure, the pharmaceutical composition can be administered one to three times a day, once every 2 days, or once every 3 days.

Настоящее раскрытие будет дополнительно описано в следующих примерах. Однако следует понимать, что следующие примеры предназначены исключительно для целей иллюстрации и не должны толковаться как ограничение настоящего раскрытия на практике.The present disclosure will be further described in the following examples. It should be understood, however, that the following examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the present disclosure in practice.

ПримерыExamples

Общие экспериментальные процедуры:General experimental procedures:

1. Приготовление липосомальной композиции с илопростом1. Preparation of liposomal composition with iloprost

Липосомальную коллоидную суспензию получали с использованием техники этанольной инъекции. Все липидные ингредиенты, включая первый фосфолипид (HSPC) и второй фосфолипид (DSPE-PEG2000 или DSPG) в мольном соотношении 98:2 или 98,5:1,5, растворяли в 2,86 мл раствора этанола при приблизительно 60°С. Полученный раствор липидов вводили в 17,4 мл раствора натрия бикарбоната (от 100 до 400 мМ; рН 8,5) и, необязательно, с (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрином (т.е. от 45 до 120 мМ), и смешивали при интенсивном перемешивании при 60°С для гидратации липосом. Смесь экструдировали от 6 до 10 раз через поликарбонатные мембраны с размером пор 0,2 или 0,1 мкм для получения суспензии липосом, имеющих средний размер частиц в диапазоне от около 100 нм до 200 нм и индекс полидисперсности (PdI) <0,2. Суспензию липосом диализовали с помощью системы фильтрации с тангенциальным потоком против 10 мМ натрий-цитратного буфера (рН 5,5) для образования трансмембранного градиента рН между внутренней водной средой липосомы и внешней средой (т.е. градиента с более высоким внутренним и более низким внешним рН). Суспензию липосом, имеющих такой градиент рН, затем хранили при 4°С перед процессом нагрузки лекарственным средством.Liposomal colloidal suspension was prepared using ethanol injection technique. All lipid ingredients, including the first phospholipid (HSPC) and the second phospholipid (DSPE-PEG2000 or DSPG) in a molar ratio of 98:2 or 98.5:1.5, were dissolved in 2.86 ml of ethanol solution at approximately 60°C. The resulting lipid solution was injected into 17.4 ml of sodium bicarbonate solution (100 to 400 mM; pH 8.5) and optionally with (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (i.e. 45 to 120 mM), and mixed with vigorous stirring at 60°C to hydrate the liposomes. The mixture was extruded 6 to 10 times through polycarbonate membranes with a pore size of 0.2 or 0.1 μm to obtain a suspension of liposomes having an average particle size ranging from about 100 nm to 200 nm and a polydispersity index (PdI) of <0.2. The liposome suspension was dialyzed using a tangential flow filtration system against 10 mM sodium citrate buffer (pH 5.5) to form a transmembrane pH gradient between the internal aqueous environment of the liposome and the external environment (i.e., a gradient with higher internal and lower external pH). The liposome suspension having this pH gradient was then stored at 4°C before the drug loading process.

Илопрост (приобретенный у Cayman Chemical, США) растворяли в 50 мМ растворе цитрата натрия и добавляли в суспензию липосом для достижения концентрации лекарственного средства от 1000 до 250 мкг/мл и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. К полученному продукту добавляли натрий-цитратный буфер (рН 5,5) для получения липосомальной композиции, содержащей илопрост, имеющей рН 5,5 во внешней среде и фосфолипидную концентрацию 10 мМ в суспензии липосом.Iloprost (purchased from Cayman Chemical, USA) was dissolved in 50 mM sodium citrate solution and added to the liposome suspension to achieve a drug concentration of 1000 to 250 μg/mL and incubated at 37 °C for 30 min. Sodium citrate buffer (pH 5.5) was added to the resulting product to obtain a liposomal composition containing iloprost having an external pH of 5.5 and a phospholipid concentration of 10 mM in the liposome suspension.

2. Приготовление липосомальной композиции с амбризентаном2. Preparation of a liposomal composition with ambrisentan

Суспензию липосом готовили в соответствии с описанной выше стадией 1 с использованием или без использования (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрина. Амбризентан (приобретенный у Cayman Chemical, США) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), затем добавляли в суспензию липосом для достижения заданной концентрации лекарственного средства около 500 мкг/мл и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. К полученному продукту добавляли натрий-цитратный буфер (рН 5,5), чтобы получить нагруженную амбризентаном липосомальную композицию, имеющую рН 5,5 во внешней среде и концентрацию афосфолипидов 10 мМ в суспензии липосом.The liposome suspension was prepared according to Step 1 described above with or without (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. Ambrisentan (purchased from Cayman Chemical, USA) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), then added to the liposome suspension to achieve a target drug concentration of approximately 500 μg/mL and incubated at 37°C for 30 min. Sodium citrate buffer (pH 5.5) was added to the resulting product to obtain an ambrisentan-loaded liposomal composition having an ambient pH of 5.5 and an aphospholipid concentration of 10 mM in the liposome suspension.

3. Количественная характеристика липосомальных композиций3. Quantitative characterization of liposomal compositions

а. Концентрации инкапсулированного и свободного илопроста/амбрисентана:A. Concentrations of encapsulated and free iloprost/ambrisentan:

Липосомальную композицию, содержащую илопрост или амбризентан, заливали в колонку PD MiniTrapTM G-25 (GE Healthcare) для отделения инкапсулированного лекарственного средства от свободного лекарственного средства. Липосомальную композицию, содержащую илопрост или амбризентан, смешивали с метанолом (90% по объему метанола и 10% по объему суспензии липосом) с образованием липосомально-метанольной смеси.A liposomal formulation containing iloprost or ambrisentan was loaded onto a PD MiniTrapTM G-25 column (GE Healthcare) to separate encapsulated drug from free drug. The liposomal composition containing iloprost or ambrisentan was mixed with methanol (90% by volume methanol and 10% by volume liposome suspension) to form a liposomal-methanol mixture.

Концентрации инкапсулированного илопроста и свободного илопроста анализировали путем инъекции 30 мкл липосомально-метанольной смеси в систему Waters Acquity HPLC, оборудованную детектором на фотодиодной матрице (PDA). Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрила, метанола и фосфатного буфера (рН 2,5) при объемном соотношении 36:17:47, скорость потока подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин. Разделение выполняли с использованием колонки С8, имеющей размер 3,9 мм×15,0 см, 5,0 мкм, при 25°С, и пик поглощения обнаруживали при 205 нм.Concentrations of encapsulated iloprost and free iloprost were analyzed by injecting 30 μl of liposomal-methanol mixture into a Waters Acquity HPLC system equipped with a photodiode array (PDA) detector. The mobile phase was a mixture of acetonitrile, methanol and phosphate buffer (pH 2.5) at a volume ratio of 36:17:47, and the flow rate of the mobile phase was 1.0 ml/min. Separation was performed using a C8 column having a size of 3.9 mm×15.0 cm, 5.0 μm, at 25°C, and the absorbance peak was detected at 205 nm.

Концентрации инкапсулированного амбризентана и концентрацию свободного амбризентана анализировали путем инъекции 1 мкл смеси липосом и метанола в систему Waters Acquity UPLC, снабженную масс-детектором (QDa). Подвижная фаза А включала 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле, и подвижная фаза В содержала 0,1% муравьиной кислоты в ddH2O. Градиентные условия были следующими: 50% подвижной фазы А в течение 0,2 минуты, 10% подвижной фазы А до 2 минут и 50% подвижной фазы А до 5,5 минут. Разделение выполняли с использованием колонки С18, имеющей размер 4,6 мм×10,0 см, 3,0 мкм, при 35°С со скоростью потока 1,0 мл/мин. Регистрация МС была выполнена в режиме SIR с использованием ионов [М+Н]⁺, m/z 347,2 для амбризентана.The concentrations of encapsulated ambrisentan and the concentration of free ambrisentan were analyzed by injecting 1 μl of a mixture of liposomes and methanol into a Waters Acquity UPLC system equipped with a mass detector (QDa). Mobile phase A contained 0.1% formic acid in acetonitrile, and mobile phase B contained 0.1% formic acid in ddH2O. The gradient conditions were as follows: 50% mobile phase A for 0.2 minutes, 10% mobile phase A for up to 2 minutes, and 50% mobile phase A for up to 5.5 minutes. Separation was performed using a C18 column having a size of 4.6 mm×10.0 cm, 3.0 μm, at 35°C with a flow rate of 1.0 ml/min. MS recording was performed in SIR mode using [M+H] ⁺ ions, m/z 347.2 for ambrisentan.

b. Эффективность инкапсулирования (ЕЕ) и соотношение лекарственного средства и циклодекстрина:b. Encapsulation efficiency (EE) and drug to cyclodextrin ratio:

Концентрация общего количества лекарственного средства (илопроста или амбризентана) в липосомальной композиции включает инкапсулированное лекарственное средство во внутренней водной среде (L) и свободное лекарственное средство во внешней среде (F).The concentration of the total drug (iloprost or ambrisentan) in the liposomal composition includes the encapsulated drug in the internal aqueous environment (L) and the free drug in the external environment (F).

Эффективность инкапсулирования (Encapsulation efficiency (ЕЕ)) лекарственного средства рассчитывали как процент от инкапсулированного лекарственного средства во внутренней водной среде липосом (L) по отношению к общему количеству препарата (L+F), см. формулу А ниже:The encapsulation efficiency (EE) of the drug was calculated as the percentage of the encapsulated drug in the internal aqueous environment of the liposomes (L) relative to the total amount of drug (L+F), see formula A below:

ЕЕ(%)=[L/(L+F)]X100EE(%)=[L/(L+F)]X100

Соотношение ILO/CD липосомальной композиции илопроста и соотношение AMB/CD липосомальной композиции амбризентана рассчитывали по следующим формулам:The ILO/CD ratio of the iloprost liposomal composition and the AMB/CD ratio of the ambrisentan liposomal composition were calculated using the following formulas:

Соотношение ILO/CD={[ILO]×EE}/[CD]Ratio ILO/CD={[ILO]×EE}/[CD]

Соотношение AMB/CD={[АМВ]×EE}/[CD]Ratio AMB/CD={[AMB]×EE}/[CD]

[ILO] (мМ) = концентрация общего количества илопроста (L+F)[ILO] (mM) = total iloprost concentration (L+F)

[АМВ] (мМ) = концентрация общего количества амбристентана (L+F)[AMB] (mM) = concentration of total ambristentan (L+F)

ЕЕ (%) = эффективность инкапсуляцииEE (%) = Encapsulation Efficiency

[CD] (мМ) = концентрация циклодекстрина[CD] (mM) = cyclodextrin concentration

c. Средний размер частиц и индекс полидисперсности (PdI):c. Average particle size and polydispersity index (PdI):

Средний размер частиц липосомы оценивали динамическим светорассеянием. Индекс полидисперсности (PdI), значение, показывающее распределение липосом по размерам, определяли с использованием той же методики оценки, что и для среднего размера частиц, с использованием анализатора частиц Beckman Coulter Delsa ТМ Nano С.The average liposome particle size was assessed by dynamic light scattering. The polydispersity index (PdI), a value indicating the size distribution of liposomes, was determined using the same evaluation methodology as for average particle size using a Beckman Coulter Delsa TM Nano C particle analyzer.

Пример 1: Профиль высвобождения in vitro (IVR) липосомальных композиций с илопростом с различным количеством стеролаExample 1: In vitro release profile (IVR) of iloprost liposomal formulations with different amounts of sterol

А. Анализ высвобождения in vitro (IVR)A. In Vitro Release Assay (IVR)

Были приготовлены липосомальные композиции с илопростом, и концентрация илопроста была проанализирована в соответствии с процедурами, описанными в предыдущих разделах «Общие экспериментальные процедуры». Средний размер частиц липосом составлял от 100 до 200 нм, и PdI был менее чем 0,20.Liposomal formulations with iloprost were prepared and iloprost concentration was analyzed according to the procedures described in the previous General Experimental Procedures sections. The average particle size of the liposomes was from 100 to 200 nm, and the PdI was less than 0.20.

Для оценки профиля IVR можно использовать различные анализы IVR. Фактический анализ IVR известен или будет очевиден специалистам в данной области техники в зависимости от илопроста в заявленной липосомальной композиции. Профили высвобождения илопроста из липосом были получены путем десятикратного разбавления раствора липосом, нагруженного илопорстом, с исходной концентрацией фосфолипидов 10 мМ в имитации легочной жидкости (simulated lung fluid (SLF)) [Dissolution Technologies 2011, 18, 15-28] при 37°C при скорости встряхивания 100 об/мин. Процент высвобожденного илопроста (% высвобождения) в каждый момент времени рассчитывали путем сравнения эффективности инкапсуляции (ЕЕ) после инкубации в определенный момент времени (Т) с исходной эффективностью инкапсуляции (Т₀) по следующей формуле:Various IVR analyzes can be used to evaluate the IVR profile. The actual IVR analysis is known or will be apparent to those skilled in the art depending on the iloprost in the claimed liposomal composition. Release profiles of iloprost from liposomes were obtained by tenfold diluting a solution of iloprost-loaded liposomes with an initial phospholipid concentration of 10 mM in simulated lung fluid (SLF) [Dissolution Technologies 2011, 18, 15-28] at 37°C at shaking speed 100 rpm. The percentage of iloprost released (% release) at each time point was calculated by comparing the encapsulation efficiency (EE) after incubation at a specific time point (T) with the initial encapsulation efficiency ( _T0 ) using the following formula:

Высвобождение_{при T}(%)=(ЕЕ_{при T0}-ЕЕ_{при T})/ЕЕ при _Т0 Release _{at T} (%)=(EE _{at T0} -EE _{at T} )/EE at _T0

Результаты:Results:

Физико-химические характеристики и IVR профиль липосомальных композиций с илопростом с различным количеством стерола показаны в таблице 1.The physicochemical characteristics and IVR profile of iloprost liposomal formulations with different amounts of sterol are shown in Table 1.

Таблица 1 показывает, что >90% ЕЕ было достигнуто с солью бикарбоната натрия и содержащими илопрост липосомальными композициями с менее чем 15 мол % холестерола, высвобождающими менее 65% илопроста в течение 1 часа с момента SLF инкубации, в то время как содержащие илопрост липосомальные композиции с 15 мол % или более чем 15 мол % холестерола высвобождали более 70% илопроста в течение 1 часа с момента SLF инкубации при 37°С.Table 1 shows that >90% EE was achieved with sodium bicarbonate salt and iloprost-containing liposomal formulations with less than 15 mol % cholesterol, releasing less than 65% iloprost within 1 hour of SLF incubation, while iloprost-containing liposomal formulations with 15 mol% or more than 15 mol% cholesterol, more than 70% of iloprost was released within 1 hour of SLF incubation at 37°C.

Пример 2: Профиль высвобождения in vitro (IVR) липосомальных композиций с амбризентаном, различающихся количеством стеролаExample 2: In vitro release profile (IVR) of ambrisentan liposomal formulations differing in the amount of sterol

Были приготовлены липосомальные композиции, содержащие амбризентан, и концентрация амбризентана была проанализирована в соответствии с процедурами, описанными в предыдущих разделах «Общие экспериментальные процедуры». Средний размер частиц липосомы составлял от 100 до 200 нм, и PdI был менее чем 0,20.Liposomal formulations containing ambrisentan were prepared, and the concentration of ambrisentan was analyzed according to the procedures described in the previous General Experimental Procedures sections. The average particle size of the liposome was from 100 to 200 nm, and the PdI was less than 0.20.

Результаты:Results:

Физико-химические характеристики и IVR профиль содержащих амбризентан липосомальных композиций с различным количеством стерола показаны в таблице 2.The physicochemical characteristics and IVR profile of ambrisentan-containing liposomal formulations with different amounts of sterol are shown in Table 2.

Таблица 2 показывает, что >95% ЕЕ было достигнуто с солью бикарбоната натрия и содержащими амбризентан липосомальными композициями с менее чем 15 мол % холестерола, высвобождающими менее 50% амбризентана в течение 1 часа с момента SLF инкубации при 37°С.Table 2 shows that >95% EE was achieved with sodium bicarbonate salt and ambrisentan-containing liposomal formulations with less than 15 mol% cholesterol, releasing less than 50% ambrisentan within 1 hour of SLF incubation at 37°C.

Пример 3: Профиль высвобождения in vitro (IVR) липосомальных композиций с илопростом с циклодекстрином (CD) или без негоExample 3: In vitro release profile (IVR) of liposomal formulations of iloprost with or without cyclodextrin (CD)

Исследование in vitro было выполнено для оценки влияния циклодекстрина ((2-гидроксипропил)-β-циклодекстрина (HP-β-CD)) во внутренней водной среде липосомы на профиль высвобождения в случае липосомальных композиций с илопростом из Примера 1.An in vitro study was performed to evaluate the effect of cyclodextrin ((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (HP-β-CD)) in the internal aqueous environment of the liposome on the release profile of the iloprost liposomal formulations of Example 1.

Результаты:Results:

Физико-химические характеристики и профиль IVR липосомальных композиций с илопростом с циклодекстрином (HP-β-CD) или без него показаны в таблице 3.The physicochemical characteristics and IVR profile of iloprost liposomal formulations with or without cyclodextrin (HP-β-CD) are shown in Table 3.

В таблице 3 показано, что добавление циклодекстрина дополнительно уменьшает взрывное высвобождение (менее 60% илопроста высвобождалось в течение 1 часа с момента SLF инкубации при 37°С) и обеспечивает устойчивое высвобождение из липосомальных композиций с илопростом (менее 40% илопроста высвобождалось в течение 1 часа с момента SLF инкубации при 37°С).Table 3 shows that the addition of cyclodextrin further reduces burst release (less than 60% of iloprost was released within 1 hour of SLF incubation at 37°C) and provides sustained release from liposomal formulations with iloprost (less than 40% of iloprost was released within 1 hour from the moment of SLF incubation at 37°C).

Пример 4: Эффективность инкапсуляции для липосомальных композиций с илопростом при использовании различных солей слабой кислотыExample 4: Encapsulation Efficiency for Liposomal Formulations with Iloprost Using Various Weak Acid Salts

Было проведено исследование in vitro для оценки влияния различных солей слабой кислоты на эффективность инкапсуляции в случае липосомальных композиций с илопростом из Примера 1. Для загрузки илопроста в данном примере использовали раствор бикарбоната натрия (400 мМ) и раствор ацетата натрия.An in vitro study was conducted to evaluate the effect of various weak acid salts on the encapsulation efficiency of the iloprost liposomal formulations of Example 1. Sodium bicarbonate solution (400 mM) and sodium acetate solution were used to load iloprost in this example.

Результаты:Results:

Эффективность инкапсуляции липосомальных композиций с илопростом при использовании различных солей слабых кислот показана в таблице 4.The encapsulation efficiency of liposomal formulations with iloprost using various weak acid salts is shown in Table 4.

Таблица 4 показывает, что >80% ЕЕ было достигнуто с бикарбонатными и ацетатными солями, и присутствие циклодекстрина во внутренней водной среде дополнительно уменьшает взрывное высвобождение и поддерживает высвобождение илопроста из липосомальных композиций.Table 4 shows that >80% EE was achieved with bicarbonate and acetate salts, and the presence of cyclodextrin in the internal aqueous medium further reduces burst release and supports the release of iloprost from liposomal formulations.

Пример 5: Профиль высвобождения in vitro (IVR) и in vivo фармакокинетический (PK) параметр липосомальных композиций с илопростом, различающихся соотношением илопроста и циклодекстрина (ILO/CD)Example 5: In vitro release profile (IVR) and in vivo pharmacokinetic (PK) parameter of liposomal formulations with iloprost differing in the ratio of iloprost to cyclodextrin (ILO/CD)

Было проведено in vitro исследование с целью оценки влияния различных соотношений ILO/CD на IVR профиль липосомальных композиций с илопростом. Были приготовлены липосомальные композиции данного исследования, и IVR профили были проанализированы в соответствии с процедурами, описанными в примере 1. Раствор илопроста (20 мкг/мл) был приготовлен путем растворения илопроста в 2 мМ растворе трометамина с доведением рН до приблизительно 8,4.An in vitro study was conducted to evaluate the effect of different ILO/CD ratios on the IVR profile of iloprost liposomal formulations. The liposomal formulations of this study were prepared and IVR profiles were analyzed according to the procedures described in Example 1. Iloprost solution (20 μg/ml) was prepared by dissolving iloprost in 2 mM tromethamine solution adjusting the pH to approximately 8.4.

В. Исследование in vivo фармакокинетики (РК) липосомальных композиций с илопростомB. Study of in vivo pharmacokinetics (PK) of liposomal compositions with iloprost

В данном in vivo PK исследовании три крысы-самца Sprague-Dawley (приобретенные у BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) в каждой группе были анестезированы изофлураном и надежно размещены на спине на изогнутой платформе в дорсальном положении на плоскости под углом от 45° до 50° с помощью ленты, закрепленной на верхних резцах. Наконечник для аэрозоля с микроспреем (Microsprayer, PennCentury, Филадельфия, США) вставляли в бифуркацию трахеи каждой крысы, и тестируемый образец (т.е. композиции в таблице 5 или раствор илопроста) вводили интратрахеально каждой крысе в заданной дозе 60 мкг/г с помощью шприца высокого давления, который был прикреплен к устройству для распыления аэрозоля.In this in vivo PK study, three male Sprague-Dawley rats (purchased from BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) in each group were anesthetized with isoflurane and securely placed dorsally on a curved platform in a dorsal position on a plane at an angle of 45° to 50°. ° using a tape attached to the upper incisors. A microspray aerosol tip (Microsprayer, PennCentury, Philadelphia, USA) was inserted into the tracheal bifurcation of each rat, and the test sample (i.e., the compositions in Table 5 or iloprost solution) was administered intratracheally to each rat at a given dose of 60 μg/g using a high-pressure syringe that was attached to an aerosol spray device.

В заранее определенный момент времени (т.е. через 5, 30 мин, 1,5, 3, 6, 7 и 8 часов после введения) у каждой крысы собирали образец крови в пробирку, покрытую гепарином, и помещали на влажный лед. Затем образец крови центрифугировали при приблизительно 2500×g в течение 15 минут и при 4±2°С в течение 1 часа после сбора для отделения плазмы от клеток крови. Около 0,1 мл образца плазмы от каждой крысы добавляли в новую пробирку для хранения и хранили при -70±2°С.At a predetermined time point (i.e., 5, 30 min, 1.5, 3, 6, 7, and 8 h postadministration), a blood sample was collected from each rat in a heparin-coated tube and placed on wet ice. The blood sample was then centrifuged at approximately 2500×g for 15 minutes and at 4±2°C for 1 hour after collection to separate the plasma from the blood cells. About 0.1 ml of plasma sample from each rat was added to a new storage tube and stored at -70 ± 2°C.

Для определения концентрации илопроста в плазме 50 мкл образца плазмы переносили в лунку 96-луночного планшета с последующим добавлением 150 мкл ацетонитрила в каждую лунку. Полученную смесь встряхивали в течение 1 минуты, чтобы нарушить связывание белков плазмы с илопростом, с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость (150 мкл) смешивали с равным объемом Н₂О и анализировали методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) для определения концентрации илопроста в плазме крысы.To determine plasma iloprost concentration, 50 μL of plasma sample was transferred to a well of a 96-well plate, followed by the addition of 150 μL of acetonitrile to each well. The resulting mixture was shaken for 1 minute to disrupt the binding of plasma proteins to iloprost, followed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. The supernatant (150 μl) was mixed with an equal volume of H ₂ O and analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to determine the concentration of iloprost in rat plasma.

Результаты:Results:

IVR профиль и PK-параметр (C_max) липосомальных композиций с илопростом с различным соотношением ILO/CD показаны в таблице 5, на ФИГ. 1 и ФИГ. 2.The IVR profile and PK parameter ( _Cmax ) of iloprost liposomal formulations with different ILO/CD ratios are shown in Table 5, FIG. 1 and FIG. 2.

В таблице 5 показаны илопрост-липосомальные композиции с соотношением ILO/CD менее 0,06, демонстрирующие уменьшенный профиль взрывного высвобождения (менее 68,7% илопроста высвобождается в течение 1 часа с момента введения). Свойство более устойчивого высвобождения (менее 45% илопроста высвобождается в течение 1 часа с момента инкубации SLF при 37°С) было отмечено в илопрост-липосомальных композициях с соотношением ILO/CD менее 0,026. Аналогичная тенденция была отмечена при добавлении циклодекстрина во внутреннюю водную среду.Table 5 shows iloprost-liposomal formulations with an ILO/CD ratio of less than 0.06 demonstrating a reduced burst release profile (less than 68.7% of iloprost released within 1 hour of administration). A more sustained release property (less than 45% of iloprost released within 1 hour of SLF incubation at 37°C) was observed in iloprost-liposomal formulations with an ILO/CD ratio of less than 0.026. A similar trend was observed when cyclodextrin was added to the internal aquatic environment.

На ФИГ. 1 показан логарифм средней концентрации илопроста в плазме у крыс, которым вводили илопрост-липосомальные композиции из таблицы 6 (LL021b3A2/LL021m3A2) или раствор илопроста в заданной дозе в зависимости от времени введения на временном интервале до 24 часов. После введения липосомальных композиций с илопростом нет значимого пика по сравнению с пиком в течение 1 часа после введения раствора илопроста. Уменьшение пикового высвобождения предотвращает побочный эффект лекарственного средства, например меньшее местное раздражение в верхних дыхательных путях при прямом контакте с заявленной липосомальной композицией.In FIG. Figure 1 shows the logarithm of the average iloprost plasma concentration in rats administered iloprost-liposomal compositions from Table 6 (LL021b3A2/LL021m3A2) or iloprost solution at a given dose depending on the time of administration over a time interval of up to 24 hours. After administration of liposomal compositions with iloprost, there is no significant peak compared to the peak within 1 hour after administration of iloprost solution. Reducing peak release prevents side effects of the drug, such as less local irritation in the upper respiratory tract upon direct contact with the inventive liposomal composition.

На ФИГ. 2 показано соотношение площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до определенного времени (AUC_t) и площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до бесконечности (AUC_inf) для определения общего воздействия илопроста в течение определенного периода времени и для нормализации различных доз илопроста в каждой композиции (илопрост-липосомальные композиции из таблицы 6 или раствор илопроста). Более 80% илопроста высвобождалось в течение 24 часов с момента введения илопрост-липосомальных композиций по сравнению с 100% высвобождения илопроста в течение 1 часа после введения раствора илопроста. Результаты показывают снижение накопления лекарственного средства в целевом участке и, следовательно, меньший побочный эффект.In FIG. 2 shows the ratio of the area under the plasma concentration-time curve from zero to time (AUC _t ) and the area under the plasma concentration-time curve from zero to infinity (AUC _inf ) to determine the total exposure to iloprost over a specified period of time and to normalize the different doses of iloprost in each composition (iloprost-liposomal compositions from Table 6 or iloprost solution). More than 80% of iloprost was released within 24 hours of administration of iloprost-liposomal formulations compared to 100% of iloprost released within 1 hour of administration of iloprost solution. The results show reduced drug accumulation at the target site and therefore less side effects.

Пример 6: Профиль высвобождения in vitro (IVR) и in vivo фармакокинетический (PK) параметр липосомальных композиций с илопростом, различающихся содержанием циклодекстрина (CD).Example 6: In vitro release profile (IVR) and in vivo pharmacokinetic (PK) parameter of liposomal formulations with iloprost varying in cyclodextrin (CD) content.

Были приготовлены липосомальные композиции с илопростом, содержащие (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрин (HP-β-CD) или случайно метилированный-β-циклодекстрин (RM-β-CD), и профили IVR были оценены в соответствии с процедурами, изложенными в Примере 1.Liposomal formulations of iloprost containing (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (HP-β-CD) or randomly methylated-β-cyclodextrin (RM-β-CD) were prepared and IVR profiles were assessed according to the procedures outlined in Example 1.

Результаты:Results:

В таблице 6 представлены физико-химические характеристики липосомальных композиций с илопростом, различающихся по CD. Как HP-β-CD, так и RM-β-CD уменьшали быстрое высвобождение из илопрост-липосомальных композиций (менее 20% илопроста высвобождается в течение 1 часа с момента инкубации SLF при 37°С).Table 6 presents the physicochemical characteristics of liposomal compositions with iloprost, differing in CD. Both HP-β-CD and RM-β-CD reduced rapid release from iloprost-liposomal formulations (less than 20% of iloprost released within 1 hour of SLF incubation at 37°C).

В приведенном выше описании с целью пояснения были изложены многочисленные конкретные детали с тем, чтобы обеспечить полное понимание вариантов осуществления. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что один или несколько других вариантов осуществления могут быть реализованы на практике без некоторых из данных конкретных деталей. Также следует принимать во внимание, что ссылки в данном описании на «один вариант осуществления», «вариант осуществления», вариант осуществления с указанием порядкового номера и так далее означают, что конкретная особенность, структура или характеристика могут быть включены в практику раскрытия. Также следует понимать, что в описании различные признаки иногда сгруппированы вместе в одном варианте осуществления, чертеже или их описании с целью упрощения раскрытия и помощи в понимании различных аспектов изобретения, и что один или несколько признаков или конкретные детали из одного варианта осуществления могут быть применены на практике вместе с одной или несколькими особенностями или конкретными деталями из другого варианта осуществления, где это уместно, на практике раскрытия.In the foregoing description, numerous specific details have been set forth for purposes of explanation in order to provide a thorough understanding of the embodiments. However, it will be apparent to one skilled in the art that one or more other embodiments may be practiced without some of these specific details. It should also be appreciated that references in this specification to “one embodiment,” “an embodiment,” an embodiment by reference number, and so on mean that a particular feature, structure, or characteristic may be included in the practice of the disclosure. It should also be understood that in the specification, various features are sometimes grouped together in one embodiment, drawing, or description thereof to simplify the disclosure and assist in understanding various aspects of the invention, and that one or more features or specific details from one embodiment may be applied to practice together with one or more features or specific details from another embodiment, where appropriate, in practice of the disclosure.

Claims

1. A pharmaceutical composition for the treatment of pulmonary hypertension or interstitial lung disease, containing:

one or more liposomes suspended in an external environment, said liposome containing:

(a) an outer lipid bilayer containing a mixture of a first phospholipid, a second phospholipid and a sterol, and

(b) an internal aqueous medium containing a weak acid drug that is a prostaglandin, a prostacyclin (IP) receptor agonist, an endothelin (ET) receptor antagonist, a glucocorticoid or a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID), or any combination thereof, and a weak acid salt that is a carboxylic acid salt or bicarbonate salt,

where the ratio of the first phospholipid: sterol: second phospholipid in mole percent is 75-99: 0-14.9: 0.1-25.

2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the outer lipid bilayer contains less than 10 mol.% sterol.

3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the outer lipid bilayer is substantially free of sterol.

4. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the sterol is selected from the group consisting of cholesterol, cholesterol hexasuccinate, ergosterol, lanosterol and combinations thereof.

5. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the outer lipid bilayer contains less than 13 mol.% sterol.

6. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the first phospholipid is phosphatidylcholine (PC), the second phospholipid is a polyethylene glycol modified phospholipid or a negatively charged phospholipid.

7. The pharmaceutical composition according to claim 6, wherein said PC is hydrogenated egg phosphatidylcholine (HEPC), hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearylocholine phosphatidyl-phosphatidylphospholine (DSPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), egg phosphatidylcholine (EPC) , soy phosphatidylcholine (SPC), oleoyl palmitoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipetrozelinoylphosphatidylcholine, palmitoylelaidoylphosphatidylcholine, palmitoyloleylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), diundecanoylphosphatidylcholine, didecanoylphosphatidylcholine, dinonylphosphatidylcholine choline or any combination thereof, wherein said polyethylene glycol modified phospholipid is 1,2-distearolyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) and said negatively charged phospholipid is distearyloylphosphatidylglycerol (DSPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) or dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) or dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG).

8. The pharmaceutical composition according to claim 6, wherein the first phospholipid is HSPC and the second phospholipid is DSPE-PEG2000 or DSPG.

9. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the carboxylic acid salt is formate, acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate, isovalerate, benzoate or any combination thereof.

10. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the bicarbonate salt is potassium bicarbonate, sodium bicarbonate, calcium bicarbonate, magnesium bicarbonate, cesium bicarbonate, lithium bicarbonate, nickel bicarbonate, ferrous bicarbonate, or any combination thereof.

11. The pharmaceutical composition according to claim 1, in which the internal aqueous medium additionally contains cyclodextrin.

12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the molar ratio of weakly acidic drug and cyclodextrin is less than or equal to 0.06.

13. The pharmaceutical composition according to claim 11, in which the molar ratio of weakly acidic drug and cyclodextrin is less than or equal to 0.03.

14. Pharmaceutical composition according to claim 1, in which the prostaglandin is iloprost or treprostinil.

15. The pharmaceutical composition according to claim 1, in which the ET receptor antagonist is ambrisentan or bosentan.

16. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein said IP receptor agonist is MRE-269.

17. The pharmaceutical composition according to claim 1, in which the specified NSAID is ketorolac or meloxicam.

18. Pharmaceutical composition according to claim 1, in which the glucocorticoid is methylprednisolone or dexamethasone.

19. A method of treating pulmonary hypertension or interstitial lung disease, comprising the steps of administering an effective amount of a pharmaceutical composition according to claims. 1-18 by intratracheal injection, inhalation or injection directly into the bloodstream.

20. The method of claim 19, wherein the weak acid drug is treprostinil, iloprost, ambrisentan, bosentan, MRE-269, methylprednisolone hemisuccinate (MPSS), dexamethasone, meloxicam or ketorolac.

21. The method of claim 20, wherein the weakly acidic drug is a prostaglandin or an endothelin (ET) receptor antagonist.

22. A method for reducing the side effects of a weakly acidic drug, comprising the step of administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition according to claims. 1-18.

23. The method of claim 22, wherein the weakly acidic drug is inhaled to reduce the side effects of the weakly acidic drug on the upper respiratory tract.

24. The method of claim 23, wherein the weak acid drug is treprostinil, iloprost, ambrisentan, bosentan, MRE-269, methylprednisolone hemisuccinate (MPSS), dexamethasone, meloxicam or ketorolac.