RU2808641C1 - Method of indirect determination of titer of infectious activity of causative agent of infectious feline rhinotracheitis fhv in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time - Google Patents
Method of indirect determination of titer of infectious activity of causative agent of infectious feline rhinotracheitis fhv in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808641C1 RU2808641C1 RU2023116309A RU2023116309A RU2808641C1 RU 2808641 C1 RU2808641 C1 RU 2808641C1 RU 2023116309 A RU2023116309 A RU 2023116309A RU 2023116309 A RU2023116309 A RU 2023116309A RU 2808641 C1 RU2808641 C1 RU 2808641C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- infectious
- fhv
- titer
- feline
- rhinotracheitis
- Prior art date
Links
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 148
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 title claims abstract description 82
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 81
- 241000282324 Felis Species 0.000 title claims abstract description 80
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 54
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 8
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 13
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001455214 Acinonyx jubatus Species 0.000 description 1
- 241000700114 Chinchillidae Species 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 description 1
- 229940099797 HIV integrase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241001455213 Leopardus pardalis Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282373 Panthera pardus Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000282374 Puma concolor Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000701067 Varicellovirus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005574 cross-species transmission Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003084 hiv integrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 229960004742 raltegravir Drugs 0.000 description 1
- CZFFBEXEKNGXKS-UHFFFAOYSA-N raltegravir Chemical compound O1C(C)=NN=C1C(=O)NC(C)(C)C1=NC(C(=O)NCC=2C=CC(F)=CC=2)=C(O)C(=O)N1C CZFFBEXEKNGXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против инфекционного ринотрахеита кошек FHV, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.The invention relates to the field of biotechnology and production of vaccines against infectious feline rhinotracheitis FHV, namely to a method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Инфекционный ринотрахеит кошек - контагиозное вирусное заболевание, характеризующееся поражением верхних дыхательных путей, конъюнктивитами и кератитами [1].Infectious feline rhinotracheitis is a contagious viral disease characterized by damage to the upper respiratory tract, conjunctivitis and keratitis [1].
Возбудителем инфекционного ринотрахеита кошек является вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alphaherpesvirus 1 (FHV-1 - Felid alphaherpesvirus-1) [2]. Нуклеиновая кислота вируса представлена двуцепочечной ДНК размером около 135 800 п.н. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности референтного штамма «С-27» вируса инфекционного ринотрахеита кошек представлена в GenBank под номером NC_013590.2 [3]. Важным для выявления генома возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек является thymidine-kinasa gene (TKG, ген тимидинкиназы), который располагается в диапазоне 66387…67419 п.н. и имеет размер 1033 п.н. [4].The causative agent of infectious feline rhinotracheitis is a virus belonging to the family Herpesviridae, genus Varicellovirus, species Alphaherpesvirus 1 (FHV-1 - Felid alphaherpesvirus-1) [2]. The nucleic acid of the virus is represented by double-stranded DNA with a size of about 135,800 bp. The nucleotide and amino acid sequences of the reference strain “C-27” of the feline infectious rhinotracheitis virus are presented in GenBank under number NC_013590.2 [3]. Important for identifying the genome of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis is the thymidine-kinasa gene (TKG, thymidine kinase gene), which is located in the range 66387...67419 bp. and has a size of 1033 bp. [4].
Инфекционный ринотрахеит зарегистрируется у многих представителей семейства кошачьих, таких как европейских дикие кошки, песчаные кошки, леопардовые кошки, гепарды, горные львы, оцелоты и др. [1]. К инфекции восприимчивы как взрослые кошки всех пород, так и котята, но у молодых животных, зараженных FHV-1, нередок летальный исход в результате осложнения пневмонией. В литературе описаны также случаи развития менингоэнцефалита в результате заражения FHV-1 [5] После острой фазы заболевание часто переходит в латентную форму с пожизненным вирусоносительством. Исследователи из Австралии определили серопревалентность FHV-1 на уровне 11-17% у диких представителей семейства кошачьих и 37% у домашних кошек, однако, по другим оценкам около 90% кошек считаются серопозитивными по отношению к FHV-1, из них 45% выделяют вирус в течение всей жизни [1, 5].Infectious rhinotracheitis has been reported in many felines, such as European wild cats, sand cats, leopard cats, cheetahs, mountain lions, ocelots, etc. [1]. Both adult cats of all breeds and kittens are susceptible to infection, but in young animals infected with FHV-1, death is common as a result of complications of pneumonia. The literature also describes cases of the development of meningoencephalitis as a result of infection with FHV-1 [5]. After the acute phase, the disease often passes into a latent form with lifelong carriage of the virus. Researchers in Australia have estimated the seroprevalence of FHV-1 to be 11-17% in wild felines and 37% in domestic cats, however, other estimates estimate that about 90% of cats are considered seropositive for FHV-1, of which 45% shed the virus throughout life [1, 5].
Система мер для борьбы с инфекционным ринотрахеитом кошек и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [6]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении не инактивированное вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности вируса для оценки его активности в клетках. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек в активном состоянии.The system of measures to combat infectious feline rhinotracheitis and its prevention involves immunization of domestic animals [6]. Vaccine preparations are used for this purpose. During their manufacture, non-inactivated virus-containing raw materials are examined to determine the titer of infectious activity of the virus to assess its activity in cells. In 1.0 cm 3 of virus suspension, the number of cell culture infectious doses causing 50% cell damage is determined, which actually reflects the concentration of complete viral particles containing DNA of the feline infectious rhinotracheitis virus in an active state.
Традиционно для определения титра инфекционной активности данного вируса применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошки (CRFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [7]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с формированием цитопатического действия (ЦПД) в течение нескольких суток; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) наличие вероятности риска контаминации культуры клеток.Traditionally, to determine the titer of infectious activity of a given virus, a titration method is used in a continuous monolayer culture of cat kidney cells (CRFK), which is used to calculate the minimum dose of the virus that can cause lysis of 50% of cells (prototype) [7]. This method has some disadvantages: 1) a lengthy titration procedure associated with the formation of a cytopathic effect (CPE) over several days; 2) subjectivity when assessing the results of the study; 3) the high cost of the cell line as a test system and the cost of its maintenance; 4) there is a probability of risk of contamination of the cell culture.
В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.In this regard, it is advisable to search for an alternative method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в вируссодержащих суспензиях в течение 2,5 часов, что в 28,8 раз быстрее по сравнению с прототипным вариантом [7], не требует использования клеточной линии для количественного анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов.The proposed method is highly sensitive and specific, objective and allows you to determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in virus-containing suspensions within 2.5 hours, which is 28.8 times faster compared to the prototype version [7], does not require the use of a cell line for quantitative analysis does not imply contamination of the test samples.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, объективного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени с целью устранения вышеуказанных недостатков.The objective of the present invention is to develop a highly sensitive, highly specific, rapid, objective, and not involving the use of cell lines, method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time time in order to eliminate the above shortcomings.
Данная задача решена благодаря созданию нового способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением ПЦР и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса до 2,5 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных thymidine-kinasa gene (TKG); 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (TFHV) и циклом количественной оценки (Cq), представленной в виде логарифмической функции lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.This problem was solved by creating a new method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using PCR and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time. The developed method makes it possible to: 1) reduce the time of analyzing virus-containing suspensions to determine the titer of infectious activity of the virus to 2.5 hours; 2) exclude the possibility of contamination of the test sample; 3) increase the sensitivity and specificity of the analysis through the use of highly specific original primers and DNA probe calculated by the thymidine-kinasa gene (TKG); 4) increase the reliability of the analysis by establishing the relationship between the titer of infectious activity of feline infectious rhinotracheitis virus (T FHV ) and the quantitative assessment cycle (C q ), presented as a logarithmic function lg T FHV = -0.2998×C q +9.3735 with high approximation reliability (R 2 =0.9967) and amplification efficiency of 99.43%. The proposed model allows us to indirectly determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:The essence of the invention is reflected in graphic images:
Фиг. 1 - Позиции гена тимидинкиназы в геноме вируса инфекционного ринотрахеита кошек. Примечание: А - общий вид, Б - позиции в соответствии с порядковыми номерами нуклеотидов в ДНК вируса.Fig. 1 - Positions of the thymidine kinase gene in the genome of the feline infectious rhinotracheitis virus. Note: A - general view, B - positions in accordance with the serial numbers of nucleotides in the DNA of the virus.
Фиг. 2 - Точки начала (А) и конца (Б) ампликона, синтезированного во время проведения ПЦР для количественного анализа неинактивированного сырья для вакцин против инфекционного ринотрахеита.Fig. 2 - Start (A) and end (B) points of the amplicon synthesized during PCR for quantitative analysis of non-inactivated raw materials for vaccines against infectious rhinotracheitis.
Фиг. 3 - Изображение дизайна праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.Fig. 3 - Image of the design of primers and DNA probe calculated for the TKG gene of the DNA of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis.
Фиг. 4 - Зависимость титра инфекционной активности инфекционного ринотрахеита кошек (TFHV) и цикла количественной оценки (Cq) с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени (n=8, отмечены точки, отображающие средние значения Cq).Fig. 4 - Dependence of the titer of infectious activity of infectious feline rhinotracheitis (T FHV ) and the quantitative assessment cycle (C q ) using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time (n = 8, points representing average values are marked C q ).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:The essence of the invention is explained in the list of sequences, in which:
SEQ ID NO: 1 представляет участок последовательности нуклеотидов гена TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек;SEQ ID NO: 1 represents a portion of the nucleotide sequence of the TKG gene of the feline infectious rhinotracheitis virus DNA;
SEQ ID NO: 2 представляет участок последовательности аминокислот белка, соответствующего гену TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек.SEQ ID NO: 2 represents a portion of the amino acid sequence of the protein corresponding to the TKG gene of the feline infectious rhinotracheitis virus DNA.
Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2; 2) амплификации специфического фрагмента гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су 5.5 new (λmax флуоресценции=705 нм) и тушителем свечения BHQ-3 (λmax гашения=620-730 нм); 3) проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; 4) определении титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%.The essence of the invention lies in an approach to indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time. The inventive method is based on: 1) DNA extraction of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using 5 M guanidine isothiocyanate and 90% 2-propanol; 2) amplification of a specific fragment of the TKG gene DNA of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using original specific forward and reverse primers, as well as a molecular probe labeled with the fluorescent dye Su 5.5 new (λ max fluorescence = 705 nm) and the fluorescence quencher BHQ-3 (λ max quenching =620-730 nm); 3) carrying out an amplification reaction with detection of amplicons using fluorescent luminescence and displaying signal accumulation in the form of a sigmoid tending to an exponential curve; 4) determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using a logarithmic function expressed as the equation lg T FHV = -0.2998×C q +9.3735 with high approximation reliability (R 2 =0.9967) and amplification efficiency 99 .43%.
В настоящее время метод ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя ринотрахеита кошек. Для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ринотрахеита кошек ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени авторами не обнаружено.Currently, the real-time PCR method is used to indicate nucleic acids of various infectious agents, including the causative agent of feline rhinotracheitis. To indirectly determine the titer of infectious activity of the feline rhinotracheitis virus, this method using the developed system of original primers and a molecular probe has not been used previously. Thus, the authors did not find information about analogues of the proposed method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.The developed method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescent detection in real time, compared to the prototype, is characterized by higher sensitivity and specificity, objectivity and rapidity of analysis. and a significant reduction in the risk of contamination.
В отличие от прототипа разработанный способ включает этап экстрагирования ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2; амплификации специфического фрагмента гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су 5.5 new и тушителем свечения BHQ-3; проведения реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; новый подход к методике опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек с применением модели зависимости порогового цикла амплификации для кривой флуоресценции и титра инфекционной активности вируса в виде логарифмической функции. Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек до 2,5 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.Unlike the prototype, the developed method includes the stage of DNA extraction of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using 5 M guanidine isothiocyanate and 90% 2-propanol; amplification of a specific fragment of the TKG gene DNA of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using original specific forward and reverse primers, as well as a molecular probe labeled with fluorescent dye Su 5.5 new and fluorescent quencher BHQ-3; carrying out an amplification reaction with detection of amplicons using fluorescent luminescence and displaying signal accumulation in the form of a sigmoid tending to an exponential curve; a new approach to the method of indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of feline rhinotracheitis using a model of the dependence of the threshold amplification cycle for the fluorescence curve and the titer of infectious activity of the virus in the form of a logarithmic function. The use of the proposed method will reduce the time of analyzing virus-containing suspensions to determine the titer of infectious activity of the causative agent of feline rhinotracheitis to 2.5 hours; eliminate the possibility of contamination and the use of cell lines; increase the specificity and sensitivity of the analysis; increase the reliability of the analysis. Thus, it is relevant to apply the proposed method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction (PCR) and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки логистических кривых ПЦР и расчет титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с использованием разработанной логарифмической модели зависимости Cq и титра инфекционной активности вируса.The key element of the proposed method is the determination of the values of cycles for quantitative assessment of PCR logistic curves and the calculation of the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis using the developed logarithmic model of the dependence of C q and the titer of infectious activity of the virus.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на ген TKG, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.A comparative analysis with the prototype allows us to conclude that the novelty and inventive level of the claimed invention lies in the use of a method based on PCR and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time, original specific primers and a molecular probe designed for the TKG gene, and a developed logarithmic dependence function the magnitude of the quantitative assessment cycle and the titer of infectious activity of the causative agent of infectious rhinotracheitis for indirect determination of the titer of infectious activity of this virus in non-inactivated raw materials for vaccines.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины цикла количественной оценки (Cq) и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (TFHV) (n=8) (фиг. 4).The essence of the proposed invention is illustrated in graphic material - a graph of the relationship between the value of the quantitative assessment cycle (Cq) and the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis (T FHV ) (n=8) (Fig. 4).
С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3, которые разводят средой Игла до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.In order to determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis, a control panel of standards for this virus is prepared, which use freeze-dried suspensions with titers of infectious activity: 0.0; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.0; 8.0 lg TCD 50 / cm 3 , which are diluted with Needle medium to the required volume and titer of infectious activity. A suspension of CRFK cells not contaminated with microorganisms is used as negative controls.
Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2. К 100 мкл проб добавляют 500 мкл 5 М гуанидинизотиоцианата, нагретого до температуры 60°С, инкубируют 7 минут, наносят на стекловолокнистый фильтр, промывают с помощью 90%-ного раствора пропанола-2, внося его по 1000 мкл 3 раза. Элюируют полученную ДНК в стандартный буфер ТЕ в объеме 50 мкл.DNA was extracted from all standard positive samples and negative controls, as well as test samples, using 5 M guanidine isothiocyanate and 90% 2-propanol. To 100 µl of samples add 500 µl of 5 M guanidine isothiocyanate, heated to a temperature of 60°C, incubate for 7 minutes, apply to a glass fiber filter, wash with a 90% solution of 2-propanol, adding 1000 µl of it 3 times. Elute the resulting DNA into standard TE buffer in a volume of 50 μl.
На следующем этапе проводят ПЦР с количественной гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек штаммов, опубликованных в базах данных GenBank [3].At the next stage, PCR is carried out with quantitative hybridization-fluorescence detection in real time to study control samples and samples. To set up the reaction, prepare a reaction mixture, the recipe of which is presented in Table 1. The design of the primers and molecular probe are shown in Table 2. The calculation of the primers and probe was carried out based on the nucleotide sequences of the DNA of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis strains published in the GenBank databases [3].
В качестве гомологичных участку гена TKG возбудителя ринотрахеита кошек олигонуклеотидов используют:The following oligonucleotides are used as homologous to the TKG gene region of the causative agent of feline rhinotracheitis:
FHV-TKG-T-F (5' - CGTGGTGAATTATCAGCTGA - 3'),FHV-TKG-T-F (5' - CGTGGTGAATTATCAGCTGA - 3'),
FHV-TKG-T-R (5' - CTGTTATTGTGGATAGTCTGG - 3') иFHV-TKG-T-R (5' - CTGTTATTGTGGATAGTCTGG - 3') and
FHV-TKG-T-P (5' - Су 5.5 new - CAAGATTTGCCGCACCATACCT - BHQ-3 - 3') (фиг.1, 2, 3) в концентрации 10 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5×10-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1,5%). В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 2,5 мМ. В качестве катализатора ПЦР Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (2 ед.). Элюаты ДНК возбудителя ринотрахеита кошек каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.FHV-TKG-TP (5' - Su 5.5 new - CAAGATTTGCCGCACCATACCT - BHQ-3 - 3') (Fig. 1, 2, 3) at a concentration of 10 pM per reaction. For elongation, deoxyribonucleoside triphosphates are used with a concentration of 0.2 mM in the reaction mixture. A buffer solution (5x) is used as a base, the content of which is 20% of the total volume of the reaction mixture. The buffer solution includes potassium ions (K + ) (5×10 -2 M) and dimethyl sulfoxide (DMSO) (1.5%). Magnesium chloride is also added to the mixture to a concentration of 2.5 mM. As a PCR catalyst, Tag DNA-dependent DNA polymerase (2 units). DNA eluates of the causative agent of feline rhinotracheitis of each sample are added to the reaction mixture in 5 μl. The final volume of the mixture for one reaction is 25 μl.
Олигонуклеотиды для ДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [8]. Длины FHV-TKG-T-F, FHV-TKG-T-R и FHV-TKG-T-P составляют 20, 21, 22 н.о., что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 6172,1; 6498,3; 6639,4, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор Су 5.5 new присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ-3 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени.Oligonucleotides for the DNA template were selected in accordance with a number of general rules, which are reflected in the works of V. Deiman and R. Sooknanan [8]. The lengths of FHV-TKG-T-F, FHV-TKG-T-R and FHV-TKG-T-P are 20, 21, 22 nt, which meets the requirements. The molecular weight of the forward, reverse primer and probe oligonucleotides is 6172.1; 6498.3; 6639.4, respectively. The primers and probe were purified by polyacrylamide gel and high-performance liquid chromatography, respectively. The nucleotide sequence of the probe is not complementary to the oligonucleotide primers. There are no 4 or more identical nucleotides in a row in the primer and probe chain. The fluorophore Cy 5.5 new is attached to the 5' end, and the fluorescence quencher BHQ-3 is attached to the 3' end. These conditions correspond to the requirements for oligonucleotide primers and molecular probes that are involved in real-time PCR.
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.When analyzing the nucleotide sequences of the oligonucleotides, it was found that the primers and probe are not characterized by the formation of “hairpins”, and also that 3’-complementarity and sites annealing to themselves were not detected. Calculation of the probability of the formation of “hairpins” and dimers of oligonucleotides was carried out under the condition that the minimum number of base pairs required for dimerization is 5, and for the formation of “hairpins” - 4.
Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрацию солей в буферном растворе и метод ближайших соседей [9].Melting temperatures ( Tm ) for oligonucleotide primers and probe were determined. Accurate determination of melting point plays an important role in molecular biology studies, including the selection of DNA primers and probe for real-time PCR of DNA from the causative agent of infectious feline rhinotracheitis. To estimate the melting temperature of oligonucleotides, a method was used that took into account the concentration of salts in the buffer solution and the nearest neighbors method [9].
Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-F составили 158,2 ккал/моль, 24,6 ккал/моль, 414,7 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-R составили 160,6 ккал/моль, 24,0 ккал/моль, 424,5 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-P - 180,9 ккал/моль, 29,3 ккал/моль, 472,8 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 51, 49, 56°С, соответственно.Physical, thermodynamic constants and calculation of melting temperatures of the developed oligonucleotide DNA primers and molecular probe are presented in Table 3. It follows that the entropy, Gibbs energy and enthalpy for FHV-TKG-TF were 158.2 kcal/mol, 24.6 kcal /mol, 414.7 cal/(°K×mol), respectively. The entropy, Gibbs energy, and enthalpy for FHV-TKG-TR were 160.6 kcal/mol, 24.0 kcal/mol, 424.5 cal/(°K×mol), respectively. The entropy, Gibbs energy and enthalpy for FHV-TKG-TP are 180.9 kcal/mol, 29.3 kcal/mol, 472.8 cal/(°K×mol), respectively. These values are necessary to calculate the melting temperatures of the presented oligonucleotides. T m when using the nearest neighbors algorithm for the forward, reverse primers and probe were 51, 49, 56°C, respectively.
При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) Tm для прямого, обратного праймеров и зонда составили 56, 57, 62°С.When using a simpler method that takes into account the concentrations of K + ions and dimethyl sulfoxide (DMSO), T m for the forward, reverse primers and probe were 56, 57, 62°C.
Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 54°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком в гене TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек при температуре 54°С.It was experimentally revealed that the optimal annealing temperature for the oligonucleotides under consideration is 54°C. To carry out real-time PCR, it was decided to hybridize the primers and probe with a region in the TKG gene of the feline infectious rhinotracheitis virus DNA at a temperature of 54°C.
Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот возбудителя FHV. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.The sequences of the designed primers and molecular probe were checked for unwanted matches with other nucleic acid sequences using the FHV Nucleic Acid Sequence Data Bank. The primer and probe sequences were also analyzed for internal secondary structures using the nucleic acid folding program Mfold. It was revealed that for the developed oligonucleotides there were no unwanted matches with other nucleic acid sequences, as well as the presence of internal secondary structures.
Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.The reaction was carried out in a detecting thermal cycler of any brand at temperature and time parameters, information about which is presented in Table 4.
Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы и инактивации MMLV-ревертазы.Before real-time PCR, the mixture is preheated at a temperature of 96°C for 5 minutes. to activate the enzyme Taq DNA polymerase and inactivate MMLV reversetase.
ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 96°С в течение 15 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 54°С в течение 20 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 40 с (таблица 4).Real-time PCR includes 3 substeps: denaturation, annealing of oligonucleotides, elongation. Denaturation is carried out at a temperature of 96°C for 15 s, annealing of oligonucleotides at a temperature of 54°C for 20 s, elongation at a temperature of 72°C for 40 s (Table 4).
Результаты ПЦР анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Cq, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (Cq). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде логистической кривой). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.PCR results are analyzed by evaluating and comparing graphs of fluorescent signal accumulation according to the values of threshold amplification cycles C q determined by crossing the threshold line and logarithmic display of the function Fl=f (C q ). The results of the reaction are taken into account at each cycle. The fluorimeter determines the level of fluorescence and builds a kinetic curve in the coordinates: fluorescence level - amplification reaction cycle. If a specific DNA template is present in the test sample, the kinetic curve has an exponential dependence (the graph is presented as a logistic curve). Samples that correspond to sigmoids obtained by analyzing the fluorescence of the dye included in the molecular probe are considered positive. Samples are considered negative if there is no exponential curve in their analysis.
Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:The relationship between the quantitative assessment cycle and the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine is established in the process of constructing a logarithmic function. The efficiency of the amplification reaction (E) is estimated using the formula:
Е=(10-1/k-1),E=(10 -1/k -1),
где k - угловой коэффициент в зависимости Cq=-k×lg TFHV+b,where k is the slope depending on C q =-k×lg T FHV +b,
а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины.as well as the reliability of the approximation (R 2 ). Based on the developed model, the titer of infectious activity of feline infectious rhinotracheitis virus in non-inactivated raw materials for the vaccine is calculated.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the proposed invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин и цикла количественной оценки по результатам ПЦР в виде логарифмической функции.Example 1. Identification of the dependence of the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines and the quantitative assessment cycle based on PCR results in the form of a logarithmic function.
С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3, которые разводят средой Игла до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.In order to determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis, a control panel of standards for this virus is prepared, which use freeze-dried suspensions with titers of infectious activity: 0.0; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.0; 8.0 lg TCD 50 / cm 3 , which are diluted with Needle medium to the required volume and titer of infectious activity. A suspension of CRFK cells not contaminated with microorganisms is used as negative controls.
Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2. К 100 мкл проб добавляют 500 мкл 5 М гуанидинизотиоцианата, нагретого до температуры 60°С, инкубируют 7 минут, наносят на стекловолокнистый фильтр, промывают с помощью 90%-ного раствора пропанола-2, внося его по 1000 мкл 3 раза. Элюируют полученную ДНК в стандартный буфер ТЕ в объеме 50 мкл.DNA was extracted from all standard positive samples and negative controls, as well as test samples, using 5 M guanidine isothiocyanate and 90% 2-propanol. To 100 µl of samples add 500 µl of 5 M guanidine isothiocyanate, heated to a temperature of 60°C, incubate for 7 minutes, apply to a glass fiber filter, wash with a 90% solution of 2-propanol, adding 1000 µl of it 3 times. Elute the resulting DNA into standard TE buffer in a volume of 50 μl.
Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации Cq, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (Cq). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные выражены в виде логарифмического уравнения:The reaction results were analyzed by evaluating and comparing graphs of fluorescent signal accumulation according to the values of the cycles of quantification of the amplification reaction C q determined using the intersection of the threshold line and the logarithmic display of the function Fl=f (C q ). The relationship between the quantitative assessment cycle and the titer of infectious activity of feline infectious rhinotracheitis virus in non-inactivated raw materials for the vaccine was established in the process of constructing a logarithmic function. The obtained data are expressed in the form of a logarithmic equation:
lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.log T FHV =-0.2998×C q +9.3735 with high approximation reliability (R 2 =0.9967) and amplification efficiency of 99.43%. The proposed model makes it possible to indirectly determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using real-time PCR.
Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.Example 2. Application of a method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for a vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescent detection in real time.
В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД50/см3, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения ДНК, и постановку ПНР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1.The study used 6 suspensions of cultured feline infectious rhinotracheitis virus with titers of infectious activity of 6.50; 6.75; 7.00; 7.25; 7.50; 7.75 lg TCD 50 /cm 3 , respectively (samples No. 1-6). A suspension of cultured feline infectious rhinotracheitis virus with a titer of 7.00 lg TCD 50 /cm 3 was used as a positive control. A suspension of CRFK cells not contaminated with microorganisms was used as negative controls. Test samples and control samples were examined in five replicates. The stages of DNA isolation and real-time PNR were carried out as described in example 1.
Средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 9,58±0,01, 8,76±0,02, 7,90±0,02, 7,10±0,01, 6,25±0,01, 5,42±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735, рассчитали средние значения титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек для проб №1-6, которые составили 6,50; 6,74; 7,00; 7,24; 7,50; 7,45 lg ТЦД50/см3, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,92±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.The average values of threshold amplification cycles for samples No. 1-6 were 9.58±0.01, 8.76±0.02, 7.90±0.02, 7.10±0.01, 6.25±0, 01, 5.42±0.01, respectively. Using the developed logarithmic function lg T FHV = -0.2998×C q +9.3735, we calculated the average titer of infectious activity of feline infectious rhinotracheitis virus for samples No. 1-6, which amounted to 6.50; 6.74; 7.00; 7.24; 7.50; 7.45 lg TCD 50 / cm 3 , respectively. For the positive control, the value of the threshold amplification cycle was 7.92±0.01, which corresponded to the titer of infectious activity of the feline infectious rhinotracheitis virus equal to 7.00 lg TCD 50 /cm 3 . For negative controls, exponential plots were not generated, which meant the absence of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in these samples.
Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=8). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности FHV в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.The studied samples were tested in parallel using the classical titration method in the CRFK monolayer cell line. It was found that the data obtained using the developed method correlated with the titration method in cell culture by 99-100% (n=8). The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed method for indirectly determining the titer of FHV infectious activity in non-inactivated raw materials for the vaccine using real-time PCR.
Иными словами, разработанный способ позволяет оценивать титр инфекционной активности FHV в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.In other words, the developed method makes it possible to evaluate the titer of FHV infectious activity in non-inactivated raw materials for the vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.Example 3. Determination of the degree of reliability of determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Для анализа использовали 260 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД50/см3. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального FHV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 5.For the analysis, 260 suspensions of cultured feline infectious rhinotracheitis virus with a titer of infectious activity from 1.00 to 8.00 lg TCD 50 /cm 3 were used. A suspension of cultured FHV with a titer of infectious activity of the virus of 7.00 lg TCD 50 /cm 3 was used as a positive control. A suspension of CRFK cells not infected with microorganisms was used as negative controls. Test samples and control samples were examined in triplicate. The stages of nucleic acid extraction and real-time PCR were carried out as shown in example 1. The results of the analysis are presented in Table 5.
Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735 (R2=0,9967, Е=99,43%) с получением значений TFHV для каждой из 260 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,92±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.The interpretation of the results was carried out using the developed logarithmic function lg T FHV = -0.2998 × Cq + 9.3735 (R 2 = 0.9967, E = 99.43%) to obtain T FHV values for each of the 260 samples. For the positive control, the value of the threshold amplification cycle was 7.92±0.01, which corresponded to a titer of infectious activity of the virus equal to 7.00 lg TCD 50 /cm 3 . For negative controls, exponential plots were not generated, which meant the absence of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in these samples.
Анализируемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток CRFK на 98,99-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=65), на 98,64-99,74% для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3 (n=65), на 96,74-99,01% для 3,9-1,5 lg ТЦД50/см3 (n=65), на 94,04-98,74% для 1,4-1,0 lg ТЦД50/см3 (n=65). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.The analyzed samples and controls were also tested by the classical titration method in the monolayer CRFK cell line and in real-time PCR. It was found that the data obtained using the developed method correlated with the titration method in CRFK cell culture by 98.99-100.00% for 8.0-6.0 lg TCD 50 /cm 3 (n=65), by 98 ,64-99.74% for 5.9-4.0 lg TCD 50 /cm 3 (n=65), by 96.74-99.01% for 3.9-1.5 lg TCD 50 /cm 3 (n=65), by 94.04-98.74% for 1.4-1.0 lg TCD 50 /cm 3 (n=65). The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
Иными словами, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в реальном времени.In other words, the developed method allows us to estimate with a high degree of reliability the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using real-time PCR.
Пример 4. Оценка аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.Example 4. Evaluation of the analytical sensitivity of a method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for a vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
При определении аналитической чувствительности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя FHV подготавливали серию стандартов вируса разных штаммов с TFHV. равными 1,00-8,00 lg ТЦД50/см3 с шагом 0,1 lg ТЦД50/см3. Контрольные образцы тестировали в 4 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано в примере 1. Выявлено, что с достоверностью 98,99-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности FHV со значениями от 6,0 до 8,0 lg ТЦД50/см3, с достоверностью 98,64-99,74% - с титрами от 4,0 до 5,9 lg ТЦД50/см3, с достоверностью 96,74-99,01% - с титрами от 2,0 до 3,9 lg ТЦД50/см3, с достоверностью 96,74-98,96% - с титрами от 1,5 до 2,0 lg ТЦД50/см3, с достоверностью 94,04-98,74% - с титрами от 1,0 до 1,4 lg ТЦД50/см3. При изготовлении вакцин применяют не инактивированное вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥6,00 lg ТЦД50/см3. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности FHV составляла 98,99-100,00%.When determining the analytical sensitivity of the developed method for indirectly determining the titer of infectious activity of the FHV pathogen, a series of virus standards of different strains with T FHV were prepared. equal to 1.00-8.00 lg TCD 50 /cm 3 with a step of 0.1 lg TCD 50 /cm 3 . Control samples were tested in 4 replicates. Stages of nucleic acid elution and real-time PCR, as described in example 1. It was revealed that the developed method determined FHV infectious activity titers with values from 6.0 to 8.0 lg TCD with a confidence of 98.99-100.00%. 50 / cm 3 , with a reliability of 98.64-99.74% - with titers from 4.0 to 5.9 lg TCD 50 / cm 3 , with a reliability of 96.74-99.01% - with titers from 2.0 up to 3.9 lg TCD 50 / cm 3 , with a reliability of 96.74-98.96% - with titers from 1.5 to 2.0 lg TCD 50 / cm 3 , with a reliability of 94.04-98.74% - with titers from 1.0 to 1.4 lg TCD 50 / cm 3 . In the manufacture of vaccines, non-inactivated virus-containing raw materials are used only with virus infectious activity titres ≥6.00 lg TCD 50 /cm 3 . For these samples, the reliability of determining the titer of FHV infectious activity was 98.99-100.00%.
Следовательно, аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя FHV в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, составляет не менее 1,0 lg ТЦД50/см3 с достоверностью результатов исследования не менее 94,04%.Therefore, the analytical sensitivity of the test system developed for the method of indirectly determining the titer of infectious activity of the FHV pathogen in non-inactivated raw materials for the vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time is at least 1.0 lg TCD 50 /cm 3 with reliability of the research results of at least 94.04%.
Пример 5. Оценка специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.Example 5. Assessment of the specificity of the method for indirectly determining the titer of infectious activity of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time.
При оценке специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени, исследовали суспензии вируса инфекционного ринотрахеита кошек, вируса бешенства, коронавируса кошек, калицивируса кошек и чумы плотоядных животных. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД50/см3. Исследования проводили в 5 повторностях.When assessing the specificity of the method for indirectly determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using real-time PCR, suspensions of the infectious feline rhinotracheitis virus, rabies virus, feline coronavirus, feline calicivirus and canine distemper were studied. The number of infectious doses of viruses in suspensions was at least 6.0 lg TCD 50 /cm 3 . The studies were carried out in 5 replicates.
Этапы элюирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (таблица 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю инфекционного ринотрахеита кошек и может быть использован для определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.The stages of elution of nucleic acids and real-time PCR were carried out as described in example 1. For samples containing other viruses, the formation of exponential graphs was not observed, and they did not go beyond the threshold level of the fluorescent signal (0.005 a.u.) (table 6). Thus, the developed method is specific to the causative agent of infectious feline rhinotracheitis and can be used to determine the titer of infectious activity of this virus in non-inactivated raw materials for vaccines.
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа неинактивированного вируссодержащего сырья для вакцины до 2,5 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (TFHV) и циклом количественной оценки (Cq) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg TFHV=-0,2998×Cq+9,3735 (R2=0,9967, Е=99,43%). Разработанная математическая модель дает возможность оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для производства вакцин.The main advantages of the proposed invention are the ability to reduce the time of analysis of non-inactivated virus-containing raw materials for a vaccine to 2.5 hours; to increase the specificity and sensitivity of the analysis for determining the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis. In the present invention, a relationship is established between the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis (T FHV ) and the quantitative assessment cycle (Cq), reflected in the form of a logarithmic function lg T FHV =-0.2998×C q +9.3735 (R 2 =0 .9967, E=99.43%). The developed mathematical model makes it possible to evaluate the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for vaccine production.
Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени и разработанной логарифмической модели.The present invention allows you to quickly and with a high degree of reliability determine the titer of infectious activity of the causative agent of infectious feline rhinotracheitis in non-inactivated raw materials for the vaccine using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescent detection in real time and a developed logarithmic model.
Источники информацииInformation sources
1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi:10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.
2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-l (Дата обращения: 14.04.2023).2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-l (Date of access: 04/14/2023).
3. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.04.2023).3. GenBank. [Electronic resource] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Date of access: 04/02/2023).
4. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.4. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.
5. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.5. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1 ) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.
6. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087. doi: 10.2460/ajvr.21.07.0087. PMID: 35930783.6. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087. doi: 10.2460/ajvr.21.07.0087. PMID: 35930783.
7. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.7. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.
8. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus deteCqion-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.8. Sooknanan R., van Gemen V., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.
9. Эверитт, Брайан С.; Ландау, Сабина; Лиз, Морвен; и Шталь, Дэниел (2011) "Разные методы кластеризации", в кластерном анализе, 5-е издание, John Wiley & Sons, Ltd., Чичестер, Великобритания.9. Everitt, Brian S.; Landau, Sabina; Liz, Morven; and Stahl, Daniel (2011) "Different Clustering Methods", in Cluster Analysis, 5th edition, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, UK.
Примечание: объем вносимого элюата ДНК - 5 мкл;Note: the volume of added DNA eluate is 5 µl;
объем реакционной смеси - 25 мкл.the volume of the reaction mixture is 25 µl.
Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (pH) 7,0.Note: the thermodynamic parameters of the developed oligonucleotide primers were calculated under the following conditions: NaCl concentration 1 M, temperature 25°C, pH 7.0.
Примечание: * - на данном подэтапе регистрируют степень флуоресцентного сигнала.Note: * - at this substage the degree of fluorescent signal is recorded.
Примечание: CRFK - монослойная перевиваемая клеточная линия из почки кошки;Note: CRFK is a monolayer continuous cell line from cat kidney;
Т - титр инфекционной активности FHV.T - titer of FHV infectious activity.
Примечание: «+» - наличие экспоненциального графика (положительный образец);Note: “+” - presence of an exponential graph (positive sample);
«-» - отсутствие экспоненциального графика (отрицательный образец).“-” - absence of exponential graph (negative sample).
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FHV Titre PCR.xml" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FHV Titre PCR.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
productionDate="2023-05-04">productionDate="2023-05-04">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-05-04</FilingDate> <FilingDate>2023-05-04</FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>505</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>505</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification> <EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-05-04</FilingDate> <FilingDate>2023-05-04</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification> </EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны <ApplicantName languageCode="ru">FSBI "Federal Security Center"
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>animal health" (FSBI "ARRIAH")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin> <ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим <InventorName languageCode="ru">Doronin Maxim
Игоревич</InventorName>Igorevich</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin> <InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения <InventionTitle languageCode="ru">Method of indirect determination
титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита titer of infectious activity of the causative agent of infectious rhinotracheitis
кошек FHV в неинактивированном сырье для вакцин с применением cats FHV in non-inactivated raw materials for vaccines using
полимеразной цепной реакции и количественной polymerase chain reaction and quantitative
гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального hybridization-fluorescence detection in real mode
времени</InventionTitle>time</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>267</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>267</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..267</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..267</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1"> <INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgacgtggtgaattatcagctgaagatgctacctatatcaccgcccact <INSDSeq_sequence>cgacgtggtgaattatcagctgaagatgctacctatatcaccgcccact
atcaagcaagatttgcggcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaatcaagcaagatttgcggcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaa
agttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgtagttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgt
ttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagtctaatggcaacacttcttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagtctaatggcaacacttc
cacgagaa</INSDSeq_sequence>cacgagaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>89</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>89</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..89</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..89</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RRGELSAEDATYITAHYQARFAAPYLLLHSRLSTITGYQKVVCEEHPDV <INSDSeq_sequence>RRGELSAEDATYITAHYQARFAAPYLLLHSRLSTITGYQKVVCEEHPDV
TLIIDRHPLASLVCFPLARYFVGDMTLGSVLSLMATLPRE</INSDSeq_sequence>TLIIDRHPLASLVCFPLARYFVGDMTLGSVLSLMATLPRE</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (9)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808641C1 true RU2808641C1 (en) | 2023-11-30 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2377982C1 (en) * | 2008-12-29 | 2010-01-10 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Method of treating cat rednose |
| CN109338015A (en) * | 2018-11-05 | 2019-02-15 | 苏州蝌蚪生物技术有限公司 | Detect primer, trapping nucleic acids gold label test strip, kit and the application of FHV-1 virus |
| CN109811088A (en) * | 2018-12-21 | 2019-05-28 | 广州芭卡生物科技有限公司 | A kind of primer, kit and application detecting cat infection of the upper respiratory tract pathogen |
| CN111187855A (en) * | 2020-02-06 | 2020-05-22 | 广州普世利华科技有限公司 | RDA method and kit for rapidly detecting Feline Herpes Virus (FHV) |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2377982C1 (en) * | 2008-12-29 | 2010-01-10 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Method of treating cat rednose |
| CN109338015A (en) * | 2018-11-05 | 2019-02-15 | 苏州蝌蚪生物技术有限公司 | Detect primer, trapping nucleic acids gold label test strip, kit and the application of FHV-1 virus |
| CN109811088A (en) * | 2018-12-21 | 2019-05-28 | 广州芭卡生物科技有限公司 | A kind of primer, kit and application detecting cat infection of the upper respiratory tract pathogen |
| CN111187855A (en) * | 2020-02-06 | 2020-05-22 | 广州普世利华科技有限公司 | RDA method and kit for rapidly detecting Feline Herpes Virus (FHV) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tao et al. | Application of CRISPR-Cas12a enhanced fluorescence assay coupled with nucleic acid amplification for the sensitive detection of African swine fever virus | |
| Kulesh et al. | Monkeypox virus detection in rodents using real-time 3′-minor groove binder TaqMan® assays on the Roche LightCycler | |
| CN110760620A (en) | Classical swine fever virus and African classical swine fever virus dual-fluorescence PCR detection reagent, kit and detection method | |
| CN110872637A (en) | Reagent for identifying African swine fever gene deletion vaccine, detection method and application | |
| CN113652505B (en) | Method and kit for detecting novel coronavirus and VOC-202012/01 mutant strain thereof | |
| CN116171333A (en) | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-COV-2), influenza A and influenza B | |
| Zeng et al. | Molecular detection of genotype II grass carp reovirus based on nucleic acid sequence-based amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay (NASBA-ELISA) | |
| KR20190030878A (en) | Multiplex Kit for Simultaneously Detecting Multiple Honeybee Virus and Their Use | |
| Bohorquez et al. | Efficient detection of African Swine Fever Virus using minimal equipment through a LAMP PCR method | |
| CN108411041B (en) | Fluorescent quantitative RT-PCR kit for detecting novel chicken reovirus and application thereof | |
| CN113046484B (en) | Primer probe, kit and method for detecting African swine fever virus p72 gene | |
| RU2808641C1 (en) | Method of indirect determination of titer of infectious activity of causative agent of infectious feline rhinotracheitis fhv in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time | |
| CN114395643A (en) | Double-channel digital PCR detection kit and method for African swine fever virus | |
| RU2812858C1 (en) | Method of indirect determination of titer of infectious activity of canine mastadenovirus in raw materials for vaccines using real-time pcr | |
| EP0789081A2 (en) | Process for the genome amplification and mixtures of inducer oligonucleotides for the detection and identification of related infectious agents | |
| RU2815533C1 (en) | Method of indirect determining of titre of infectious activity of causative agent of canine distemper in raw materials for vaccines using method of reverse transcription and amplification reaction in real time | |
| RU2808585C1 (en) | Method for indirect determination of titer of infectious activity of canine mastadenovirus in raw materials for vaccines using real-time pcr | |
| RU2809221C1 (en) | Method for indirect determining of the titer of infectious activity of feline calicivirus in raw materials for vaccine using real-time pcr | |
| CN107653345B (en) | Real-time fluorescence quantitative PCR method for simian B virus, universal primer, MGB probe and kit thereof | |
| RU2811995C1 (en) | METHOD OF INDIRECT DETERMINING TITER OF INFECTIOUS ACTIVITY OF RABIES VIRUS IN RAW MATERIALS FOR PRODUCTION OF ATTENUATED RABIES VACCINE USING TECHNOLOGY OF ALGEBRAIC ANALYSIS OF SECOND-ORDER DIFFERENTIAL OF MAXIMUM POINT d CPmax OF PCR LOGISTIC CURVE | |
| RU2829837C1 (en) | Method for mediated determination of ribonucleoprotein concentration of canine distemper agent in raw material for vaccines by data of quantitative assessment cycle during n-gene amplification | |
| RU2812441C1 (en) | METHOD OF INDIRECTLY DETERMINING TITER OF INFECTIOUS ACTIVITY OF CANINE INFECTIOUS HEPATITIS VIRUS GENOTYPE CAV-1 IN RAW MATERIALS FOR CULTURED VACCINES USING REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION USING QUANTITATIVE ASSESSMENT CYCLE Cq | |
| CN113046481A (en) | Primer, probe and kit for B-type fluorescence quantitative detection of pigeon adenovirus | |
| CN114174540A (en) | Compositions and methods for detecting epstein-barr virus (EBV) | |
| RU2823930C1 (en) | Method for indirect determination of concentration of a-antigen of industrial strain "vgnki" of causative agent of infectious hepatitis of dogs in raw material for cultural vaccines according to quantitative assessment cycle during amplification of target region of orf25-gene |