RU2804853C1 - Способ идентификации видов хищных клещей рода Amblyseius - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ идентификации видов хищных клещей рода Amblyseius. Выделяют ДНК из предварительно собранного биологического материала, проводят ПЦР участка рибосомальной ДНК с использованием специфических праймеров. Проводят рестрикционный анализ ампликона и визуализацию продуктов рестрикции в агарозном геле. Для рестрикционного анализа используют эндонуклеазы рестрикции AccB1I, AccB7I, DseDI и HaeIII. Наличие фрагментов ДНК длиной 510 и 109 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 514 и 93 п.н. при обработке рестриктазой AccB7I указывает на принадлежность к виду A. swirskii, наличие фрагментов ДНК длиной 451 и 171 п.н. после рестрикционного анализа ферментом DseDI указывает на принадлежность к виду A. montdorensis, а наличие фрагментов ДНК длиной 496 и 120 п.н. после обработки рестриктазой HaeIII - на принадлежность к виду A. califomicus, в то время как другие рестриктазы не имеют сайты рестрикции. Способ обеспечивает возможность более быстрой и точной видовой идентификации четырех коммерчески доступных видов хищных клещей рода Amblyseius при помощи метода ПЦР-ПДРФ. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области биохимии, а именно к молекулярно-генетическим методам идентификации организмов - клещей рода Amblyseius, и может быть использовано для правильной диагностики выращиваемых клещей.

Применение хищных клещей для биологической защиты сельскохозяйственных культур становится все более популярным в сельском хозяйстве и садоводстве. Ныне хищные клещи семейств Amblyseius, Phytoseiidae, Laelapidae, Macrochelidae, Parasitidae, Tydeidae, Cheyletidae, Cunaxidae, Erythraeidae, Stigmaeidae используются или предлагаются для борьбы с вредителями, такими, как растительноядные клещи, трипсы и белокрылки. Предпосылкой коммерческого использования хищных клещей как средств биологической борьбы с вредителями является их доступность по приемлемым ценам.

Клещи рода Amblyseius (амблисейюс) - Amblyseius swirskii, Amblyseius cucumeris, Amblyseius montdorensis и Amblyseius californicus - являются важнейшими коммерчески значимыми энтомофагами, применяются в качестве биологического средства борьбы с трипсами и другими вредителями, повреждающими овощные культуры в теплицах.

Эти виды хищных клещей являются наиболее распространенными и трудно дифференцируемыми друг от друга видами. Важность дифференциации этих клещей обусловлена тем, что они выращиваются на схожих питательных субстратах, имея практически идентичные морфологические черты, в отличие от других клещей того же рода, и высока вероятность неправильного определения вида. Между тем это является важным вопросом, т.к. эти виды имеют различную коммерческую ценность. A. swirskii высокоэффективен против белокрылки и трипсов (Bolckmans K. et al. Biological control of whiteflies and western flower thrips in greenhouse sweet peppers with the phytoseiid predatory mite Amblyseius swirskii Athiashenriot (Acari: Phytoseiidae). Second International Symposium on Biological Control of Arthropods, Davos, Switzerland, 12-16 September, p 555-565), A. cucumeris применяют для защиты от различных видов трипсов (Gillespie D. R. Biological control of thrips [Thysanoptera: Thripidae] on greenhouse cucumber by Amblyseius cucumeris //Entomophaga - 1989 - vol. 34 - №. 2. - p 185-192), A. californicus используют для защиты от различных видов растительноядных клещей (Weintraub P., Palevsky Ε. Evaluation of the predatory mite, Neoseiulus californicus, for spider mite control on greenhouse sweet pepper under hot arid field conditions //Experimental and Applied Acarolog. - 2008 - vol. 45 - №. 1 - p 29-37), A. montdorensis против трипсов и других членистоногих вредителей (Holmes N. D. et al. Control of whitefly (Trialeurodes vaporariorum (Westwood)) and thrips (Thrips tabaci Lindeman) with the predatory Phytoseiid mite Typhlodromips montdorensis (Schicha) on cucumber plants //Control of whitefly (Trialeurodes vaporariorum (Westwood)) and thrips (Thrips tabaci Lindeman) with the predatory Phytoseiid mite Typhlodromips montdorensis (Schicha) on cucumber plants - 2011. - vol. 68 - p. 55-58).

Известен способ дифференциации клещей рода Amblyseius по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный специалист. Зачастую необходимо быстро идентифицировать вид, чтобы оценить партию приобретаемой продукции, а также видовую принадлежность выращиваемых энтомофагов на предмет замещения культуры клещами другого вида или рода, не имеющих полезных признаков. Также, зачастую, важно идентифицировать проживающих в теплицах клещей, чтобы скорректировать нормы внесения хищника (Анисимов А.И., Доброхотов С.А. Морфологические особенности хищных клещей Amblyseius mckenziei и A. cucumeris. Защита и карантин растений. №1, 2008).

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ дифференциации коммерчески значимых клещей рода Amblyseius на основе рестрикционного анализа, включающий выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение амплификации участка митохондриальной ДНК при помощи ПЦР, рестрикционного анализа ампликона, проведение электрофореза в агарозном геле, при этом, при проведении ПЦР используют праймеры: прямой ITS1 обратный ITS4 а для рестрикционного анализа используют рестриктазы AccB1I , AspLE, SspI , причем наличие фрагментов ДНК длиной 509 и 129 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 381 и 260 п.н. при обработке рестриктазой Ssp I указывает на принадлежность к виду A. barkeri, а наличие фрагментов ДНК длиной 405 и 227 п.н. при обработке рестриктазой AspLE указывает на принадлежность к виду A. swirskii, в то время как две другие рестриктазы не имеют сайты рестрикции (Патент RU 2631933 С1, опубл. 28.09.2017).

Недостатками прототипа являются ограниченные функциональные возможности, поскольку он обеспечивает идентификацию только трех видов хищных клещей рода Amblyseius, а именно Amblyseius swirskii, A. cucumeris и A. barkeri при помощи метода полиморфизма длины рестрикционного фрагмента после ПЦР (ПЦР-ПДРФ) с использованием рестриктаз AccB1I , AspLE и SspI.

Задачей изобретения является обеспечение возможности более быстрой и точной видовой идентификации четырех коммерчески доступных видов хищных клещей рода Amblyseius при помощи метода ПЦР-ПДРФ, который не требует привлечения высококвалифицированных акарологов.

Технический результат: расширение функциональных возможностей способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего следующие гены: 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК. Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между четырьмя видами хищных клещей (Amblyseius swirskii, A. cucumeris, A. montdorensis, A. californicus), которые позволяли разработать способ идентификации перечисленных видов клещей на основе рестрикционного анализа (ПЦР-ПДРФ).

Проводят сбор биологического материала и при необходимости образцы консервируют в 96% этиловом спирте. Из полученных образцов выделяют ДНК при помощи коммерческих наборов или классическими методами (фенол-хлороформная экстракция). При этом этап выделения ДНК из клеща можно опустить и собранный образец (яйцо, нимфа или взрослая особь любого пола) использовать непосредственно в качестве матрицы в реакции амплификации. Проводят ПЦР с использованием выделенной геномной ДНК в качестве матрицы. Для амплификации используют следующие праймеры: прямой 1TS1 GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA, обратный ITS4 ATGTGTTGAAGTTACGGTCA, которые являются универсальными для клещей данного рода.

Программа для амлификации: первичная денатурация при 94°С в течение 3 мин, 35 циклов последовательной денатурации при 94°С 30 сек, отжига праймеров при 51°С 30 сек и элонгации при 72°С 45 сек. Финальная элонгация при 72°С в течение 10 мин. Полученные ПЦР-продукты очищают из реакционной смеси и подвергают рестрикции ферментами AccB1I , AccB7I, DseDI и HaeIII. Реакционная смесь состоит из следующих компонентов: 200нг ПЦР-продукта, 1 мкл 10х буферного раствора, 0.5 мкл эндонуклеазы рестрикции, 1 мкл бычьего сывороточьего альбумина (BSA) с концентрацией 1 мг/мл (в случае эндонуклеаз AccB1I и DseDI), бидистилированная вода до объема 10 мкл. Реакцию инкубируют при 37°С в течение 1 ч и затем ферменты инактивируют при 65°С (в случае эндонуклеаз AccB1I и AccB7I) или 80°С (в случае эндонуклеаз DseDI и HaeIII) в течение 20 мин. Визуализацию продуктов рестрикции проводят в 1-2% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (1 х ТАЕ).

На фиг. 1 представлена электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР-продукта, полученного при амплификации фрагмента рДНК с помощью рестриктаз AccB1I , AccB7I и HaeIII, где: 1) A.cucumeris, 2) A.swirskii, 3) A.montdorensis, 4) A.californicus. Μ - маркер молекулярного веса ДНК Step 100 (Биолабмикс, Новосибирск). На фиг. 2 представлена электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР-продукта, полученного при амплификации фрагмента рДНК с помощью рестриктазы DseDI 1) A.cucumeris, 2) A.swirskii, 3) A.montdorensis, 4) A.californicus. Μ - маркер молекулярного веса ДНК Step 100 (Биолабмикс, Новосибирск).

Наличие фрагментов ДНК длиной 510 и 109 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 514 и 93 п.н. при обработке рестриктазой AccB7I указывает на принадлежность к виду A. swirskii, наличие фрагментов ДНК длиной 451 и 171 п.н. после рестрикционного анализа ферментом DseDI указывает на принадлежность к виду A. montdorensis, а наличие фрагментов ДНК длиной 496 и 120 п.н. после обработки рестриктазой HaeIII - на принадлежность к виду A. californicus.

В таблице 1 приведены данные о длине ожидаемых фрагментов рестрикции ПЦР-продукта, полученного в ходе амплификации с использованием праймеров ITS1 и ITS4 у данных клещей.

Предлагаемый способ дифференциации хищных клещей является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов, анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих ДНК-амплификатор, центрифугу, термостат, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.

Определяющим отличием предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что на этапе рестрикционного анализа применяют экспериментально подобранные эндонуклеазы рестрикции - AccB1I , AccB7I, DseDI и HaeIII, что позволяет идентифицировать 4 хищных вида клеща рода Amblyseius: Amblyseius swirskii, A. cucumeris, Α. montdorensis и A. californicus.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Производят сбор биологического материала и при необходимости образцы консервируют в 96% этиловом спирте. Из полученных образцов выделяют ДНК при помощи коммерческих наборов или классическими методами (фенол-хлороформная экстракция). Проводят ПЦР с использованием выделенной геномной ДНК в качестве матрицы. Для амплификации используют следующие праймеры: прямой ITS1 обратный ITS4 Программа для амлификации: первичная денатурация при 94°С в течение 3 минут, 35 циклов последовательной денатурации при 94°С 30 сек, отжига праймеров при 51°С 30 сек и элонгации при 72°С 45 сек. Финальная элонгация при 72°С в течение 10 мин.

Полученные ПЦР-продукты очищают из реакционной смеси и подвергаются рестрикции ферментами AccB1I , AccB7I, DseDI и HaeIII. Реакционная смесь состоит из следующих компонентов: 200нг ПЦР-продукта, 1 мкл 10х буферного раствора, 0.5 мкл эндонуклеазы рестрикции, 1 мкл бычьего сывороточьего альбумина (BSA) с концентрацией 1 мг/мл (в случае эндонуклеаз AccB1I и DseDI), бидистилированная вода до объема 10 мкл. Реакцию инкубируют при 37°С в течение 1 ч и затем ферменты инактивируют при 65°С (в случае эндонуклеаз AccB1I и AccB7I) или 80°С (в случае эндонуклеаз DseDI и HaeIII) в течение 20 мин. Визуализацию продуктов рестрикции проводят в 1-2% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (1 х ТАЕ).

При обработке рестриктазой AccB1I продукта ПЦР образца ДНК A. cucumeris образовались фрагменты ДНК длиной 510 и 109 п.н., рестриктазы AccB7I, DseDI и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой AccB7I ПЦР-продукта образца ДНК A. swirskii образовались фрагменты ДНК длиной 514 и 93 п.н., рестриктазы AccB1I , DseDI и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой DseDI продукта ПЦР образца ДНК A. montdorensis образовались фрагменты ДНК длиной 451 и 171 п.н., рестриктазы AccB1I , AccB7I и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой HaeIII ПЦР-продукта образца ДНК A. californicus образовались фрагменты ДНК длиной 496 и 120 п.н., рестриктазы AccB1I , AccB7I и DseDI сайтов рестрикции не имели.

Пример 2

Идентификацию клещей проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что геномную ДНК перед постановкой ПЦР не выделяли, и в качестве матрицы в реакции ПЦР использовали целого клеща на любой стадии жизненного цикла (яйцо, нимфа, взрослая особь).

Полученные ПЦР-продукты очищали из реакционной смеси и подвергали гидролизу ферментами AccB1I , AccB7I, DseDI и HaeIII. Реакционная смесь состоит из следующих компонентов: 200нг ПЦР-продукта, 1 мкл 10х буферного раствора, 0.5 мкл эндонуклеазы рестрикции, 1 мкл бычьего сывороточьего альбумина (BSA) с концентрацией 1 мг/мл (в случае эндонуклеаз AccB1I и DseDI), бидистилированная вода до объема 10 мкл. Реакцию инкубируют при 37°С в течение 1 ч и затем ферменты инактивируют при 65°С (в случае эндонуклеаз AccB1I и AccB7I) или 80°С (в случае эндонуклеаз DseDI и HaeIII) в течение 20 мин. Визуализацию продуктов рестрикции проводят в 1-2% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (1 х ТАЕ).

При обработке рестриктазой AccB1I продукта ПЦР образца ДНК A. cucumeris образовались фрагменты ДНК длиной 510 и 109 п.н., рестриктазы AccB7I, DseDI и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой AccB7I ПЦР-продукта образца ДНК A. swirskii образовались фрагменты ДНК длиной 514 и 93 п.н., рестриктазы AccB1I , DseDI и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой DseDI продукта ПЦР образца ДНК A. montdorensis образовались фрагменты ДНК длиной 451 и 171 п.н., рестриктазы AccB1I , AccB7I и HaeIII не имели сайтов рестрикции. При обработке рестриктазой HaeIII ПЦР-продукта образца ДНК A. californicus образовались фрагменты ДНК длиной 496 и 120 п.н., рестриктазы AccB1I , AccB7I и DseDI сайтов рестрикции не имели.

Использование предлагаемого изобретения позволит быстро и точно идентифицировать 4 вида хищных клещей рода Amblyseius: Amblyseius swirskii, A. cucumeris, Α. montdorensis и A. californicus. Изобретение расширяет арсенал способов идентификации коммерчески значимых хищных клещей при помощи рестрикционного анализа.

Claims (1)

1. Способ идентификации видов хищных клещей рода Amblyseius, включающий выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, проведение ПЦР участка рибосомальной ДНК с использованием праймеров: прямой ITS1 GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA, обратный ITS4 ATGTGTTGAAGTTACGGTCA, рестрикционный анализ ампликона с использованием эндонуклеазы рестрикции AccB1I, проведение электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что для рестрикционного анализа наряду с эндонуклеазой рестрикции AccB1I используют эндонуклеазы рестрикции AccB7I, DseDI и HaeIII, причем наличие фрагментов ДНК длиной 510 и 109 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 514 и 93 п.н. при обработке рестриктазой AccB7I указывает на принадлежность к виду A. swirskii, наличие фрагментов ДНК длиной 451 и 171 п.н. после рестрикционного анализа ферментом DseDI указывает на принадлежность к виду A. montdorensis, а наличие фрагментов ДНК длиной 496 и 120 п.н. после обработки рестриктазой HaeIII - на принадлежность к виду A. californicus, в то время как другие рестриктазы не имеют сайты рестрикции.