RU2732610C1 - Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/КАНЗАС/2017/631 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Канзас/14/2017 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Предлагаемый штамм может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста. 5 табл., 1 ил.

Description

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В феврале 2019 Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) дала рекомендации о замене состава противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2019-20 гг. эпидемический сезон, поскольку большинство циркулирующих вирусов гриппа H3N2 антигенно отличались от рекомендованных ранее для подготовки противогриппозных вакцин для 2018-2019 эпидемического сезона в северном полушарии и 2019 эпидемического сезона на южное полушарие. При этом, поскольку в человеческой популяции с сентября 2018 по февраль 2019 одновременно коциркулировали вирусы гриппа подтипа H3N2, относящиеся к антигенно отличающимся клайдам 3C.2a1b и 3С.3а, решение по выбору штамма вируса гриппа для замены компонента H3N2 было перенесено на март. В марте после более подробного анализа ВОЗ для подготовки H3N2 компонента для противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2019-20 гг. эпидемический сезон были выбраны А/Канзас/14/2017 (H3N2)-подобные вирусы относящиеся к клайду 3С.3а [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2019-2020 northern hemisphere influenza season. 21 February 2019 (updated on 21 March 2019). https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2019_20_north/en/].

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Канзас/14/2017 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) - прототип [Ларионова Н.В., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Матюшенко В.А., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2683500 от 28.03.2019 - Опубл. БИ 2019. - №10] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной А/Канзас/14/2017-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Канзас/14/2017 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4, - С. 387-395.].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Канзас/14/2017 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие формуле вакцинного штамма живой гриппозной вакцины.

АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО ШТАММА.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Канзас/14/2017 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) и родительского штамма А/Канзас/14/2017 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Канзас/14/2017 (H3N2), полностью совпадали (табл. 1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования последовательности соответствующего сегмента генома и соответствует нейраминидазе вируса А/Канзас/14/2017 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины. // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Канзас/14/2017 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) представлены в табл.2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design. Пример пирограммы, полученной для фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1795 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приведен на фиг. 1, где показан результат пиросеквенирования фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1795 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для штаммов А/Ленинград/134/57 (H2N2) (фиг. 1а), А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1б), А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) (фиг. 1в).

В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, нет пика в первой позиции (Т), пик во второй позиции (С) обладает увеличенной высотой (фиг. 1, а). Наличие аттенуирующей мутации С→Т характеризуется пиками в позициях Т и С, одинаковой высоты, что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, б), черными стрелками отмечены пики, подтверждающие наличие мутации), а также на пирограмме, полученной для гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) (фиг. 1, в).

В таблице 3 приведены результаты пиросеквенирования всех генов вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2), содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2).

Таким образом, секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 5.0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с. ] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практик. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz199-site-dok.html1

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0,5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Канзас/14/2017 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) депонирован 12.07.2019 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2930.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 7.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Claims (1)

1. Штамм вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2930, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

Images