RU2710377C1

RU2710377C1 - Method of producing an antifibic antibacterial emericillipsin a

Info

Publication number: RU2710377C1
Application number: RU2019104723A
Authority: RU
Inventors: Вера Сергеевна Садыкова; Евгений Александрович Рогожин; Анна Александровна Баранова; Марина Леонидовна Георгиева; Елена Николаевна Биланенко; Ирина Александровна Гаврюшина; Алексей Сергеевич Васильченко
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2019-12-26

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a method for producing a new peptide antimycotic antibiotic emericillipsin A, produced by a strain Emericellopsis alkalina F-1428, with antifungal activity in relation to C.glabrata 1402m, Aspergillus ochraceus 497m 2015, as well as Bipolaris hawaiiensis 988m 2015 and Aspergillus terreus 1133m 2011, having natural resistance to all used in chemotherapy antibiotics – azoles. A method for producing a new antibiotic on a specialized liquid alkaline nutrient medium with an output of an antifungal peptide of 0.25 g/l is developed.

EFFECT: emericillipsin A is effective in treating bronchopulmonary invasive fungal infections caused by mold fungi and yeast.

2 cl, 2 dwg, 4 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения противогрибкового антибиотика путем культивирования штамма алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina F -1428 на жидкой питательной среде и нового пептидного антибиотика эмерициллипсина А. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве противогрибкового антибиотика, эффективного при лечении бронхолегочных инвазивных микозов, вызываемых плесневыми грибами и дрожжами.The invention relates to biotechnology, and in particular to a method for producing an antifungal antibiotic by culturing a strain of the alkalophilic fungus Emericellopsis alkalina F -1428 on a liquid nutrient medium and a new peptide antibiotic emericillipsin A. The invention can be used in the medical industry in the production of an antifungal antibiotic effective in the treatment of bronchopulmonary invasive fungal infections caused by mold and yeast.

Поражения условно-патогенными грибами бронхов, легких и плевры относятся к вероятным инфекционным осложнениям туберкулеза, что обусловлено наличием тяжелого первичного заболевания легких (его течением и прогрессированием) и рядом предрасполагающих факторов: формированием полостных изменений и бронхоэктазов в легких; различными иммуносупрессивными состояниями, включая случаи туберкулеза, сочетанного с ВИЧ-инфекцией; длительным применением нескольких антибактериальных препаратов широкого спектра действия; наличием распространенной колонизации нижних дыхательных путей условно-патогенными грибами; проведением инвазивных процедур и другими факторами риска, связанными с пребыванием во фтизиатрическом стационаре [Климко Н.Н. Васильева Н.В., 2016; Нозокомиальная пневмония у взрослых: Российские национальные рекомендации, 2016]. Заселение и последующая колонизация нижних отделов дыхательных путей грибами родов Aspergillus или Candida может приводить к развитию аллергических форм заболеваний, способных осложнять течение туберкулезного процесса [Климко Н.Н. Васильева Н.В. Микозы легких. // В кн.: Пульмонология: Национальное руководство. Под ред. А.Г. Чучалина. - Москва: ГЭОТАР-Media. - 2016. - с. 236-249. У значительного числа пациентов наблюдаются два и более фактора, предрасполагающих к развитию микоза; особенно опасно их сочетание с наличием спор Aspergillus spp.и других мицелиальных грибов в воздухе лечебного стационара [Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008. - 336 с.].Lesions of opportunistic fungi of the bronchi, lungs, and pleura are among the probable infectious complications of tuberculosis due to the presence of severe primary lung disease (its course and progression) and a number of predisposing factors: the formation of abdominal changes and bronchiectasis in the lungs; various immunosuppressive conditions, including cases of tuberculosis associated with HIV infection; prolonged use of several broad-spectrum antibacterial drugs; the presence of widespread colonization of the lower respiratory tract by opportunistic fungi; invasive procedures and other risk factors associated with a stay in a TB hospital [Klimko N.N. Vasilieva N.V., 2016; Adult Nosocomial Pneumonia: Russian National Recommendations, 2016]. Population and subsequent colonization of the lower respiratory tract by fungi of the genera Aspergillus or Candida can lead to the development of allergic forms of diseases that can complicate the course of the tuberculous process [Klimko N.N. Vasilieva N.V. Mycosis of the lungs. // In the book: Pulmonology: National leadership. Ed. A.G. Chuchalina. - Moscow: GEOTAR-Media. - 2016. - p. 236-249. A significant number of patients have two or more factors predisposing to the development of mycosis; their combination with the presence of Aspergillus spp. spores and other mycelial fungi in the air of a medical hospital is especially dangerous [Klimko N.N. Mycoses: diagnosis and treatment. A guide for doctors. 2nd ed. reslave. and add. - M .: VG Group, 2008. - 336 p.].

Природные антимикробные пептиды грибов являются одним из важнейших источников новых эффективных антибиотиков за счет широкого спектра действия в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов, низкой токсичности и отсутствия формирования резистентности. Только грибы продуцируют пептаиболы - антибиотические пептиды, активные в отношении грамположительных микроорганизмов и паразитов, некоторые из них также обладают противоопухолевой активностью.Natural antimicrobial peptides of fungi are one of the most important sources of new effective antibiotics due to the wide spectrum of action against opportunistic and pathogenic bacteria and fungi, low toxicity and the absence of resistance formation. Only mushrooms produce peptaiboles - antibiotic peptides that are active against gram-positive microorganisms and parasites, some of them also have antitumor activity.

Грибы рода Emericellopsis давно известны как продуценты антимикробных пептидов группы пептаиболов. Наиболее изученными являются 4 гомолога зервамицина, проявляющих фунгицидную и цитотоксическую активность [Balashova, Т.А., Shenkarev, Z.O., Tagev, А.А., Ovchinnikova, T.V., Raap, J. and Arseniev, A.S. (2000). “NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotrop solvents”. FEBS Letters, 466: 333 -336], выделены и описаны эмеримицины II, III, IV (продуцент Emericellopsis microspora). Известны бергофунгины А и В из Emericellopsis donezkii HKI 0059 [Berg, A., Schlegel, В., Ihn, W., Demuth, U. and

(1999). “Isolation and Structural Elucidation of New Peptaibols, Bergofungins В, С and D, from Emericellopsis donezkii HKI 0059”. The Journal of Antibiotics, 52(7): 666 -669]. Их гомологи, бергофунгины С и D, были обнаружены и у вида Е. salmosynnemata [Gessmann R., Axford D.,

Berg A., Petratos K. A natural, single-residue substitution yields a less active peptaibiotic: the structure of bergofungin A at atomic resolution/ Acta Cryst. - 2017. - P. 1-6].Fungi of the genus Emericellopsis have long been known as producers of antimicrobial peptides of the peptibole group. The most studied are 4 homologues of zervamycin with fungicidal and cytotoxic activity [Balashova, T.A., Shenkarev, ZO, Tagev, A.A., Ovchinnikova, TV, Raap, J. and Arseniev, AS (2000). “NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotrop solvents.” FEBS Letters, 466: 333 -336], emerimycins II, III, IV (producer of Emericellopsis microspora) were isolated and described. Bergofungins A and B are known from Emericellopsis donezkii HKI 0059 [Berg, A., Schlegel, B., Ihn, W., Demuth, U. and

(1999). “Isolation and Structural Elucidation of New Peptaibols, Bergofungins B, C and D, from Emericellopsis donezkii HKI 0059.” The Journal of Antibiotics, 52 (7): 666-666]. Their homologues, bergofungins C and D, were also found in the species E. salmosynnemata [Gessmann R., Axford D.,

Berg A., Petratos K. A natural, single-residue substitution yields a less active peptaibiotic: the structure of bergofungin A at atomic resolution / Acta Cryst. - 2017. - P. 1-6].

Новый вид Emericellopsis alkalina впервые описан в 2013 г., его изоляты выделены из содовых солончаков Кулундинской степи и Забайкалья (Россия). Известно, что алкалофильные грибы вида Emericellopsis alkalina способны к синтезу биологически активных пептидных соединений, которые содержатся в культуральной жидкости и вегетативном мицелии [Баранова А.А., Рогожин Е. А., Георгиева М. Л., Биланенко Е. Н., Кулько А. Б., Якушев А. В., Алферова В. А., Садыкова В. С.Антимикробные пептиды алкалофильных грибов Emericellopsis alkalina: Биосинтез и биологическая активность в отношении патогенных грибов с множественной резистентности/ Прикл. биохимия и микробиология.2019. - том 55. №2. -с.151-157].The new species Emericellopsis alkalina was first described in 2013; its isolates were isolated from soda solonchaks of the Kulundinskaya steppe and Transbaikalia (Russia). It is known that the alkalophilic fungi of the species Emericellopsis alkalina are capable of synthesizing biologically active peptide compounds contained in the culture fluid and vegetative mycelium [Baranova AA, Rogozhin EA, Georgieva M. L., Bilanenko E. N., Kulko A. B., Yakushev A. V., Alferova V. A., Sadykova V. S. Antimicrobial peptides of alkalophilic fungi Emericellopsis alkalina: Biosynthesis and biological activity against pathogenic fungi with multiple resistance / Prikl. Biochemistry and Microbiology. 2019. - Volume 55. No. 2. p.151-157].

Известны способы получения пептидов и фармацевтических композиций на их основе химическим синтезом или химической модификацией антибиотиков полимиксина и октапептина, включая циркулин А, полимиксин А, полимиксин В, полимиксин D, октапептин В, октапептин С и полимиксин B_1; обладающих антибактериальными свойствами [Патент WO 2006/083317(10.08.2006)].Known methods for producing peptides and pharmaceutical compositions based on them by chemical synthesis or chemical modification of antibiotics polymyxin and octapeptin, including circulin A, polymyxin A, polymyxin B, polymyxin D, octapeptin B, octapeptin C and polymyxin B _1; possessing antibacterial properties [Patent WO 2006/083317 (08/10/2006)].

Известны способы получения природных пептидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных [патенты РФ №№2075944, 2104702, 2161501, 2043364]. Недостатком этого способа является дефицит этого вида природного сырья.Known methods for producing natural peptides from organs and tissues of farm animals [RF patents No. 2075944, 2104702, 2161501, 2043364]. The disadvantage of this method is the shortage of this type of natural raw material.

Известен способ получения природных комплексов пептидов с противогрибковой активностью, предназначенных для лечения бактериальных и грибковых инфекций человека и животных, включая устойчивые к антибиотикам формы из жирового тела насекомых [Патент РФ №2552157].A known method of producing natural complexes of peptides with antifungal activity intended for the treatment of bacterial and fungal infections of humans and animals, including antibiotic-resistant forms from the fat body of insects [RF Patent No. 2552157].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения противогрибкового пептида ареницина микробиологическим синтезом из генно-модифицированного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 [Патент РФ №2316595].Closest to the proposed invention is a method for producing an antifungal peptide of arenicin by microbiological synthesis from a gene-modified strain of Escherichia coli BL21 (DE3) / pE-His8-TrxL-Ar2 [RF Patent No. 2316595].

Недостатком этого способа является дорогостоящая очистка рекомбинатного пептида и отсутствие противогрибковой активности в отношении резистентных патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов -возбудителей системных и инвазивных микозов.The disadvantage of this method is the costly purification of the recombinant peptide and the lack of antifungal activity against resistant pathogenic mycelial and yeast fungi that cause systemic and invasive mycoses.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента природных пептидов и получение пептида с противогрибковой активностью.The invention solves the problem of expanding the range of natural peptides and obtaining a peptide with antifungal activity.

Техническим результатом описываемого изобретения является получение из штамма Emericellopsis alkalina F -1428 микробиологическим синтезом нового противогрибкового пептида эмерициллипсина А, подавляющего возбудителей инвазивных бронхолегочных микозов, резистентных к используемым в клинической практике антибиотикам - азолам.The technical result of the described invention is to obtain from a strain of Emericellopsis alkalina F -1428 microbiological synthesis of a new antifungal peptide emericillipsin A, which suppresses pathogens of invasive bronchopulmonary mycoses that are resistant to antibiotics used in clinical practice - azoles.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение.The following examples illustrate the invention.

Пример 1. Культивирование штамма Emericellopsis alkalina F -1428Example 1. Cultivation of a strain of Emericellopsis alkalina F -1428

Штамм F -1428 галофильного микромицета Emericellopsis alkalina относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Bionectriaceae, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota [Grum-Grzhimaylo A.A., Georgieva M.L., Debets A.J.M., Bilanenko E.N. Are alkalotolerant fungi of the Emericellopsis lineage {Bionectriaceae) of marine origin? // IMA Fungus. Vol. 4. N. 2. 2013. P. 211-226. DOI: 10.5598/imafungus.2013.04.02.07Strain F -1428 of the halophilic micromycete Emericellopsis alkalina belongs to mitospore fungi - anamorphs of the ascomycetic affinity: the genus Hypocrea, the family Bionectriaceae, order Hypocreales, class Sordariomycetes, department Ascomycota [Grum-Grzhimaylo A.A. M. Janov, Georgiev A. Are alkalotolerant fungi of the Emericellopsis lineage {Bionectriaceae) of marine origin? // IMA Fungus. Vol. 4. N. 2. 2013. P. 211-226. DOI: 10.5598 / imafungus.2013.04.02.02.07

http://www.imafungus.org/Issue/42/17.pdfl.http://www.imafungus.org/Issue/42/17.pdfl.

В качестве посевного материала используют споровую суспензию 5-суточной культуры гриба, полученной на сусло-агаре.As a seed, a spore suspension of a 5-day-old fungal culture obtained on wort agar is used.

Культивирование штамма F -1428 Emericellopsis alkalina осуществляют в аэробных условиях стационарным способом на специализированной щелочной среде (г/л): минеральная основа: Na₂CO₃ - 24, NaHCO₃ - 6, NaCl - 6, KNO₃ - 1, K₂HPO₄ - 1; солодовый экстракт (15°Б) - 200 мл, дрожжевой экстракт - 1, агар - 20; H₂O дистиллированная 800 мл. Для приготовления отдельно стерилизуют минеральную основу и остальные компоненты в течение 30 мин при избыточном давлении 0.5 атм. Все компоненты среды объединяют при 50°С. Данную среду разливают в колбы, стерилизуют и засевают споровой суспензией гриба из расчета 1×10⁴ КОЕ мл среды. Стационарное культивирование продуцента проводят в течение 14 суток, затем биомассу мицелия и спор отделяют центрифугированием на центрифуге. Для получения целевого пептидного противогрибкового антибиотика эмерициллипсина А используют культуральную жидкость.The cultivation of strain F -1428 Emericellopsis alkalina is carried out under aerobic conditions in a stationary way on a specialized alkaline medium (g / l): mineral base: Na ₂ CO ₃ - 24, NaHCO ₃ - 6, NaCl - 6, KNO ₃ - 1, K ₂ HPO ₄ to 1; malt extract (15 ° B) - 200 ml, yeast extract - 1, agar - 20; H ₂ O distilled 800 ml. For preparation, the mineral base and other components are separately sterilized for 30 minutes at an overpressure of 0.5 atm. All components of the medium are combined at 50 ° C. This medium is poured into flasks, sterilized and inoculated with a spore suspension of the fungus at the rate of 1 × 10 ⁴ CFU ml of medium. The producer is stationary cultured for 14 days, then the mycelium biomass and spores are separated by centrifugation in a centrifuge. To obtain the target peptide antifungal antibiotic emericillipsin A, culture fluid is used.

Пример 2. Выделение пептидного антибиотика эмерициллипсина АExample 2. Isolation of the peptide antibiotic emericillipsin A

Культуральную жидкость продуцента экстрагируют этилацетатом в соотношении органический растворитель - культуральная жидкость 5:1. Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе

(Швейцария) при 42°С досуха, остаток растворяют в водном 70%-ном этаноле и получают спиртовые концентраты антибиотика.The producer culture fluid was extracted with ethyl acetate in an organic solvent-culture fluid ratio of 5: 1. The resulting extracts are evaporated in vacuo on a rotary evaporator.

(Switzerland) at 42 ° C to dryness, the residue is dissolved in aqueous 70% ethanol and alcoholic antibiotic concentrates are obtained.

Для фракционирования антибиотического комплекса фракции разделяют с помощью прямофазной флеш-хроматографии последовательно в системах: хлороформ-метанол (50:1→20:1→10:1→3:1), 96% этанол и этанол-вода (7:3).For fractionation of the antibiotic complex, the fractions are separated using direct phase flash chromatography sequentially in systems: chloroform-methanol (50: 1 → 20: 1 → 10: 1 → 3: 1), 96% ethanol and ethanol-water (7: 3).

Дальнейшее разделение активной фракции после флэш-хроматографии проводят путем аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки XBridge 5 мкм 100А размером 250×4.6 мм в растущем линейном градиенте концентрации ацетонитрила в качестве подвижной фазы (элюент А - 0.1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ) в воде MQ, элюентом В - 80%-ный ацетонитрил с 0.1%-ной водной ТФУ) при скорости потока 950 мкл/мин. Для ОФ-ВЭЖХ используют ультраградиентный ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания) и ТФУ производства «Sigma-Aldrich» (США). С целью получения индивидуального антибиотика эмерициллипсина А проводят разделение методом полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ на колонке XBridge 10 мкм 100А (250×10 мм). Поглощение определяют при длине волны 214 нм и скорости потока подвижной фазы 4 мл/мин (рисунок 1). Выход антибиотика эмерициллипсина А составляет 0,25 г/л.Further separation of the active fraction after flash chromatography is carried out by analytical reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) using a 5 μm 100A XBridge column with a size of 250 × 4.6 mm in a growing linear gradient of acetonitrile concentration as the mobile phase (eluent A - 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water MQ, eluent B - 80% acetonitrile with 0.1% aqueous TFA) at a flow rate of 950 μl / min. For RP-HPLC, ultra-gradient acetonitrile from Panreac (Spain) and TFU manufactured by Sigma-Aldrich (USA) are used. In order to obtain an individual antibiotic, emericillipsin A is separated by semi-preparative RP-HPLC on an XBridge column of 10 μm 100A (250 × 10 mm). The absorption is determined at a wavelength of 214 nm and a flow rate of the mobile phase of 4 ml / min (Figure 1). The yield of the antibiotic emericillipsin A is 0.25 g / L.

Пример 3. Определение структуры эмерициллипсина АExample 3. Determination of the structure of emericillipsin A

Масс-спектрометрический анализ эмерицеллипсина А проводят с использованием установки для хроматомасс-спектрометрии LC-MS/MS (Agilent Technologies, США). Раствор пептида объемом 40 мкл и концентрацией 1 мг/мл наносят с помощью системы автоматического ввода образцов на колонку ОФ-ВЭЖХ Zorbax 300SB-C18, 5 μм, размерами 0.75×150 мм и разделяют в системе «подвижная фаза», содержащей смесь 96.9% воды MQ, 3% ацетонитрила и 0.1% муравьиной кислоты (v/v) (буфер А) и 99,9% ацетонитрила в присутствии 0.1% муравьиной кислоты (v/v) (буфер Б), скорость потока 300 нл/мин, линейный градиент: 15-85% буфера Б в течение 30 минут.Mass spectrometric analysis of emeryllipsin A is carried out using an LC-MS / MS chromatographic mass spectrometry apparatus (Agilent Technologies, USA). A peptide solution with a volume of 40 μl and a concentration of 1 mg / ml was applied using a system of automatic injection of samples onto a Zorbax 300SB-C18 RP-HPLC column, 5 μm, 0.75 × 150 mm in size and separated in a “mobile phase” system containing 96.9% water mixture MQ, 3% acetonitrile and 0.1% formic acid (v / v) (buffer A) and 99.9% acetonitrile in the presence of 0.1% formic acid (v / v) (buffer B), flow rate 300 nl / min, linear gradient : 15-85% of buffer B for 30 minutes.

Запись спектров ЯМР осуществляют на приборе Avance Bruker 800 МГц (Bruker Biospin, Германия). Концентрация пептида составляет примерно 3 мг/мл DMSO. Структуру эмерицеллипсина А расшифровывают путем анализа гомоядерных (2D COSY, 2D ¹Н-¹³С HSQC, 2D 1H-15N HSQC, 2D ¹Н-¹³С НМВС, 2D 1H-15N НМВС) и гетероядерных (2D 1Н-13С HSQC-TOCSY) спектров. Дополнительно записывают спектр 2D ROESY с целью выявления конфигурации стереоцентров данной молекулы.NMR spectra were recorded on an Avance Bruker 800 MHz instrument (Bruker Biospin, Germany). The concentration of the peptide is approximately 3 mg / ml DMSO. The structure of emeryllipsin A is deciphered by analysis of homonuclear (2D COSY, 2D ¹ H- ¹³ C HSQC, 2D 1H-15N HSQC, 2D ¹ H- ¹³ C NMVC, 2D 1H-15N NMVC) and heteronuclear (2D 1H-13C HSQC-TOCSY) spectra. Additionally, a 2D ROESY spectrum is recorded in order to reveal the configuration of the stereo centers of a given molecule.

Сигналы в спектрах ЯМР ¹Н и ¹³С представлены в Таблице 4. Структура соединения представлена на рисунке 2.The signals in the ¹ H and ¹³ C NMR spectra are presented in Table 4. The structure of the compound is shown in Figure 2.

В соответствии с ЯМР-спектрами эмерициллипсин А представляет собой линейный полипептид, с 2-метилдекановой кислотой (2MDA) на N-конце и N-(2-гидроксиэтил) -1,2-пропандиамина на С-конце. Пептид образует альфа-спираль и содержит 8 карбоксильных и кетоновых групп. Из 7 аминокислотных остатков два представлены аланином и изолейцином, а остальные - 3-метилпролином (3МП), 2-амино-4-метил-6-гидрокси-8-оксодекановой кислотой (AHMOD), 2-аминоизобутиратом (AIB), изовалином и β-аланином. ЯМР-спектры показывают молекулярную формулу C₅₄H₉₉N₉O₁₁ с изотопной молекулярной массой 1049,746.According to NMR spectra, emericillipsin A is a linear polypeptide, with 2-methyldecanoic acid (2MDA) at the N-terminus and N- (2-hydroxyethyl) -1,2-propanediamine at the C-terminus. The peptide forms an alpha helix and contains 8 carboxyl and ketone groups. Of the 7 amino acid residues, two are represented by alanine and isoleucine, and the rest by 3-methylproline (3MP), 2-amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxodecanoic acid (AHMOD), 2-aminoisobutyrate (AIB), isovalin and β -alanine. NMR spectra show the molecular formula C ₅₄ H ₉₉ N ₉ O ₁₁ with an isotopic molecular weight of 1049.746.

Эмерициллипсин А является типичным представителем липоаминопептидов. Эти пептиды характеризуются присутствием альфа-метилразветвленной жирной кислоты на N-конце, с последующим производным пролина в положении 2 и AHMOD в положении 3.Emericillipsin A is a typical representative of lipoaminopeptides. These peptides are characterized by the presence of alpha-methyl-branched fatty acid at the N-terminus, followed by a proline derivative at position 2 and AHMOD at position 3.

Для оценки противогрибковых свойств полученного вышеописанным способом пептидного антибиотика эмерициллипсина А проводят тесты на условно-патогенных и патогенных клинических грибах, оценивающих активность противогрибкового антибиотика.To evaluate the antifungal properties of the peptide antibiotic emericillipsin A obtained by the above method, tests are carried out on conditionally pathogenic and pathogenic clinical fungi that evaluate the activity of the antifungal antibiotic.

Пример 4. Оценка фунгицидной активности эмерициллипсина А в отношении штаммов условно-патогенных и токсигенных мицелиальных и дрожжевых грибовExample 4. Evaluation of the fungicidal activity of emericillipsin A in relation to strains of opportunistic and toxigenic mycelial and yeast fungi

Тест-объектами берут коллекционные штаммы условно - патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A.terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8К. Контролем служат стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 5-7 сутки. Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро, с патогенными и условно-патогенными микроскопическими грибами при 28°С на среде Чапека. Эмерициллипсин А обладает широким спектром фунгицидной активности в отношении условно-патогенных грибов (таблица 2).Collected strains of conditionally pathogenic mycelial and yeast microscopic fungi Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 and conditionally pathogenic micromycetes A. oryzae 1K, A. niger 2K, A. fumigatus 4K are taken as test objects A.terreus 4K, A. fisheri 3K, A. flavus 7K, A.ustus 8K. The control is standard disks with amphotericin B (NII Pasteur, 40 μg / ml). The diameter of the zone of inhibition of growth of test cultures is estimated at 5-7 days. Petri dishes with yeast are incubated at 37 ° C in Saburo medium, with pathogenic and conditionally pathogenic microscopic fungi at 28 ° C in Chapek medium. Emericillipsin A has a wide range of fungicidal activity against opportunistic fungi (table 2).

* - ошибка измерения зоны подавления 1-2 мм.* - error in measuring the suppression zone of 1-2 mm.

Антибиотик ингибирует рост всех условно-патогенных и токсигенных тест-культур мицелиальных грибов, особенно эффективен против A. fumigatus 4K, A.niger INA 00760, P.chrysogenum VKM F-4499. Активность антибиотика в большинстве случаев превышает активность амфотерицина В.The antibiotic inhibits the growth of all opportunistic and toxigenic test cultures of mycelial fungi, it is especially effective against A. fumigatus 4K, A.niger INA 00760, P. chrysogenum VKM F-4499. The activity of the antibiotic in most cases exceeds the activity of amphotericin B.

Пример 5. Оценка фунгицидной активности эмерициллипсина А в отношении клинических изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, резистентных к азолам.Example 5. Evaluation of the fungicidal activity of emericillipsin A against clinical azole-resistant mycelial and yeast fungal isolates.

Опыт проводят согласно примеру 4, но в качестве тест-объектов используют клинические изоляты дрожжевых грибов, возбудителей инвазивных кандидозов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Candida albicans 1582м 2016 - возбудитель кандидоза пищевода на фоне туберкулеза, туберкулезом селезенки и ВИЧ, Candida glabrata 1402м 2016 - возбудитель кандидоза легких, Candida krusei 1447м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, Saccharomyces cerevisiae 775м 2017 - туберкулезный плеврит, Cryptococcus laurentii 801м 2017 - туберкулез легких. Также используют изоляты мицелиальных грибов - возбудителей инвазивных аспергиллезов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Aspergillus fumigatus 163м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus flavus 905м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus terreus 1133м 2011 - туберкулез легких; Aspergillus ochraceus 497м 2015 - туберкулез легких; Aspergillus niger 219_-2016 фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких.The experiment is carried out according to example 4, but as test objects, clinical isolates of yeast fungi, invasive candidiasis pathogens with multiple resistance to the antibiotics used are used - azoles: Candida albicans 1582m 2016 - esophageal candidiasis pathogen against tuberculosis, spleen tuberculosis and HIV, Candida glabrata 1402m 2016 - causative agent of lung candidiasis, Candida krusei 1447m 2016 - fibro-cavernous pulmonary tuberculosis, Saccharomyces cerevisiae 775m 2017 - tuberculous pleurisy, Cryptococcus laurentii 801m 2017 - pulmonary tuberculosis. Also used are isolates of mycelial fungi - pathogens of invasive aspergillosis with multiple resistance to the antibiotics used - azoles: Aspergillus fumigatus 163m 2016 - fibro-cavernous pulmonary tuberculosis; Aspergillus flavus 905m 2016 - fibro-cavernous pulmonary tuberculosis; Aspergillus terreus 1133m 2011 - pulmonary tuberculosis; Aspergillus ochraceus 497m 2015 - pulmonary tuberculosis; Aspergillus niger 219 _- 2016 fibro-cavernous pulmonary tuberculosis; Bipolaris hawaiiensis 988m 2015 - fibro-cavernous pulmonary tuberculosis.

Эмерициллипсин А эффективен против С.glabrata 1402м, Aspergillus ochraceus 497м 2015, обладающих природной резистентностью ко всем применяемым в химиотерапии антибиотикам - азолам, а также Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 к Aspergillus terreus 1133м 2011 (таблица 3 и 4).Emericillipsin A is effective against C. glabrata 1402m, Aspergillus ochraceus 497m 2015, which have natural resistance to all antibiotics used in chemotherapy - azoles, as well as Bipolaris hawaiiensis 988m 2015 to Aspergillus terreus 1133m 2011 (table 3 and 4).

Приведенные в таблицах результаты позволяют сделать вывод о наличии достаточно высокой противогрибковой активности нового пептидного антибиотика эмерициллипсина А, полученного описываемым способом. The results presented in the tables allow us to conclude that there is a sufficiently high antifungal activity of the new peptide antibiotic emericillipsin A obtained by the described method.

Claims

1. The method of obtaining the antifungal antibiotic emericillipsin A of the formula

by preparing a spore suspension of micromycete Emericellopsis alkalina strain VKPM F-1428, preparing a specialized alkaline medium (g / l): mineral base: Na ₂ CO ₃ -24, NaHCO ₃ -6, NaCl-6, KNO ₃ -1, K ₂ HPO ₄ -1; malt extract (15 ° B) - 200 ml, yeast extract-1, agar-20; H ₂ O dist. 800 ml, its sterilization, inoculation of sterile liquid nutrient medium with prepared seed mycelium, cultivation of the fungus in it under aerobic conditions stationary, followed by separation into biomass and culture liquid, separation and purification of the target product by column and HPLC chromatography to obtain the antifungal antibiotic emericillipsin A.

2. A new antifungal peptide antibiotic - emericillipsin A of the formula

,

obtained by the method of claim 1, active against pathogens of bronchopulmonary invasive mycoses with multiple resistance.