RU2708136C1 - Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases - Google Patents
Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2708136C1 RU2708136C1 RU2019111140A RU2019111140A RU2708136C1 RU 2708136 C1 RU2708136 C1 RU 2708136C1 RU 2019111140 A RU2019111140 A RU 2019111140A RU 2019111140 A RU2019111140 A RU 2019111140A RU 2708136 C1 RU2708136 C1 RU 2708136C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- ganglioside
- antibody
- cells
- fragments
- Prior art date
Links
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 40
- FFILOTSTFMXQJC-QCFYAKGBSA-N (2r,4r,5s,6s)-2-[3-[(2s,3s,4r,6s)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-5-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2r,3s,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(e)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hy Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCC(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)C2)C(O)C(O)CO[C@]2(O[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)C2)C(O)C(O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 FFILOTSTFMXQJC-QCFYAKGBSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 41
- CXQCLLQQYTUUKJ-ALWAHNIESA-N beta-D-GalpNAc-(1->4)-[alpha-Neup5Ac-(2->8)-alpha-Neup5Ac-(2->3)]-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp-(1<->1')-Cer(d18:1/18:0) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 CXQCLLQQYTUUKJ-ALWAHNIESA-N 0.000 claims description 29
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 9
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 36
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 36
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 28
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 27
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 13
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 7
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- -1 GD3 gangliosides Chemical class 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- CIVGYTYIDWRBQU-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 CIVGYTYIDWRBQU-UFLZEWODSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVGAOLHAWVNIQU-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 HVGAOLHAWVNIQU-UFLZEWODSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100091490 Caenorhabditis elegans hrp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004511 skin melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000010304 tumor cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения конструкций на основе антител к опухолеассоциированному ганглиозиду GD2. Данные антитела и их фрагменты могут найти применение в медицине, иммунологии и биотехнологии для приготовления диагностических реагентов и терапевтических препаратов для лечения GD2-позитивных онкологических заболеваний.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain structures based on antibodies to the tumor-associated ganglioside GD2. These antibodies and their fragments can be used in medicine, immunology and biotechnology for the preparation of diagnostic reagents and therapeutic drugs for the treatment of GD2-positive oncological diseases.
Уровень техникиState of the art
Ганглиозиды - универсальные компоненты мембран эукариотических клеток, известные как важные регуляторы и медиаторы межклеточных взаимодействий и иммунного ответа. В последнее время активно изучается их роль в опухолевом процессе. В трансформированных клетках появляются ганглиозиды, которые в нормальных клетках либо отсутствуют, либо экспрессированы в ограниченном количестве [Hakomori S. ,. Adv Cancer Res., 52, р. 257-331, 1986]. Наиболее ярким опухолеспецифическим ганглиозидом является GD2, маркер опухолей различного происхождения. Дисиалоганглиозид GD2 - это гликосфинголипид, содержащий два остатка сиаловой кислоты, экспрессируемый преимущественно на клеточной поверхности опухолевых клеток. Экспрессия GD2 в нормальных фетальных и взрослых тканях преимущественно ограничивается центральной нервной системой, периферическими нервами и меланоцитами кожи [Zhang S., et al., Int. Selection of tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry: I. Focus on gangliosides. J. Cancer, Sep 26;73(1):42-9., 1997]. В злокачественных новообразованиях описана повышенная экспрессия GD2 на клетках нейробластомы, глиомы, меланомы, мелкоклеточного рака легких, различных сарком и ряде других опухолей, с трудом поддающихся классическим методам лечения [F. Navid, V.M. Santana and R.C. Barfield., Anti-GD2 antibody therapy for GD2-expressing tumors. Current Cancer Drug Targets, Mar; 10(2):200-9, 2010]. Функциональные свойства ганглиозида GD2 изучены не до конца, однако точно известно, что он играет важную роль в адгезии опухолевых клеток на внеклеточном матриксе, а также усиливает пролиферацию и инвазивность опухолевых клеток [Shibuya, H., et al., Enhancement of malignant properties of human osteosarcoma cells with disialyl gangliosides GD2/GD3. Cancer Sci, 2012. 103(9): p. 1656-64.]. Кроме того, одним из важных механизмов иммуносупрессии у онкологических больных являются процессы, вызываемые свободными ганглиозидами, которые сбрасываются в кровь. Шеддинг опухолевых ганглиозидов с клеточной поверхности показан для большого числа опухолевых клеток, включая клетки нейробластомы, лимфомы, меланомы, лейкемии, опухолевые клетки мозга также сбрасывают ганглиозиды [Lauc G, Heffer-Lauc M., Shedding and uptake of gangliosides and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Biochim Biophys Acta., 1760(4):584-602. Epub 2005 Dec 20. 2006]. Биологическая роль шеддинга опухолевых ганглиозидов достаточно подробно изучена. Опухолевые ганглиозиды, свободно циркулирующие в крови, ингибируют некоторые иммунные ответы как in vivo, так и in vitro [Li R., Villacreses N., Ladisch S., Human tumor gangliosides inhibit murine immune responses in vivo., Cancer Res., 55(2):211-4., 1995]. Их сброс с поверхности трансформированных клеток стимулирует развитие опухолей у мышей и у человека. Благодаря его избирательной экспрессии на поверхности опухолевых клеток GD2 является привлекательной мишенью для таргетной иммунотерапии с применением моноклональных GD2-специфичных антител, кроме того они могут быть использованы для диагностического определения ганглиозида GD2 в сыворотке крови онкологических больных.Gangliosides are universal components of the membranes of eukaryotic cells, known as important regulators and mediators of intercellular interactions and the immune response. Recently, their role in the tumor process has been actively studied. Gangliosides appear in transformed cells, which are either absent or expressed in a limited amount in normal cells [Hakomori S.,. Adv Cancer Res., 52, p. 257-331, 1986]. The most striking tumor-specific ganglioside is GD2, a marker of tumors of various origins. GD2 disialoganglioside is a glycosphingolipid containing two sialic acid residues, expressed primarily on the cell surface of tumor cells. The expression of GD2 in normal fetal and adult tissues is mainly limited to the central nervous system, peripheral nerves and skin melanocytes [Zhang S., et al., Int. Selection of tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry: I. Focus on gangliosides. J. Cancer, Sep 26; 73 (1): 42-9., 1997]. In malignant neoplasms, increased expression of GD2 on cells of neuroblastoma, glioma, melanoma, small cell lung cancer, various sarcomas, and a number of other tumors that are difficult to treat with classical treatment methods is described [F. Navid, V.M. Santana and R.C. Barfield., Anti-GD2 antibody therapy for GD2-expressing tumors. Current Cancer Drug Targets, Mar; 10 (2): 200-9, 2010]. The functional properties of GD2 ganglioside are not fully understood, but it is known for certain that it plays an important role in the adhesion of tumor cells to the extracellular matrix, and also enhances the proliferation and invasiveness of tumor cells [Shibuya, H., et al., Enhancement of malignant properties of human osteosarcoma cells with disialyl gangliosides GD2 / GD3. Cancer Sci, 2012.103 (9): p. 1656-64.]. In addition, processes caused by free gangliosides, which are discharged into the blood, are one of the important mechanisms of immunosuppression in cancer patients. Cell surface tumor ganglioside shedding is indicated for a large number of tumor cells, including neuroblastoma, lymphoma, melanoma, leukemia, brain tumor cells, also dump gangliosides [Lauc G, Heffer-Lauc M., Shedding and uptake of gangliosides and glycosylphosphatidylinositol-anchor. Biochim Biophys Acta., 1760 (4): 584-602. Epub 2005 Dec 20. 2006]. The biological role of shedding of tumor gangliosides has been studied in sufficient detail. Tumor gangliosides that circulate freely in the blood inhibit some immune responses both in vivo and in vitro [Li R., Villacreses N., Ladisch S., Human tumor gangliosides inhibit murine immune responses in vivo., Cancer Res., 55 ( 2): 211-4., 1995]. Their discharge from the surface of transformed cells stimulates the development of tumors in mice and in humans. Due to its selective expression on the surface of tumor cells, GD2 is an attractive target for targeted immunotherapy using monoclonal GD2-specific antibodies, in addition, they can be used for diagnostic determination of GD2 ganglioside in the blood serum of cancer patients.
Основной проблемой в создании эффективных препаратов для иммунотерапии GD2-позитивных опухолей является получение антител, обладающих высокой аффинностью и специфичностью к ганглиозиду GD2. Известно, что иммунизация чистыми ганглиозидами индуцирует очень низкий титр ганглиозид-специфичных антител с очень коротким периодом полужизни. Как правило специфичность получаемых GD2-специфичных антител является низкой, поскольку имеется сильная структурная гомология между различными ганглиозидами, вследствие чего наблюдается значительная кроссреактивность разрабатываемых GD2-специфичных антител.The main problem in creating effective drugs for immunotherapy of GD2-positive tumors is the production of antibodies with high affinity and specificity for GD2 ganglioside. Immunization with pure gangliosides is known to induce a very low titer of ganglioside-specific antibodies with a very short half-life. Typically, the specificity of the resulting GD2-specific antibodies is low because there is a strong structural homology between the different gangliosides, as a result of which there is a significant cross-reactivity of the developed GD2-specific antibodies.
Большинство GD2-позитивных новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, обусловленная большими размерами этих молекул. Кроме того, нежелательные побочные эффекты терапии зачастую обусловлены наличием Fc- опосредованной цитотоксичности. Поэтому, в связи с общим ростом распространенности различных типов онкологических заболеваний в России и в мире, и возникновении резистентности к имеющимся лекарствам, имеется существенная потребность в создании новых лекарств, и лекарств нового формата, на основе антител к GD2. Данное изобретение расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения GD2-позитивных онкологических заболеваний.Most GD2-positive neoplasms are solid tumors, which are characterized by low antitumor efficacy of monoclonal antibodies, due to the large size of these molecules. In addition, undesirable side effects of therapy are often due to the presence of Fc-mediated cytotoxicity. Therefore, due to the general increase in the prevalence of various types of oncological diseases in Russia and in the world, and the emergence of resistance to existing drugs, there is a significant need for the creation of new drugs and drugs of a new format, based on antibodies to GD2. This invention expands the range of available candidates for the treatment of GD2-positive cancer.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Задачей настоящего изобретения является создание терапевтического агента на основе антител к GD2 и разработка нового эффективного и безопасного способа лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, характеризующимися присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли. Также задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для подавления пролиферации и индукции гибели О02-позитивных опухолевых клеток, а также для диагностики ганглиозида GD2 в сыворотке крови пациентов с С02-позитивными опухолями.The present invention is the creation of a therapeutic agent based on antibodies to GD2 and the development of a new effective and safe method for the treatment of patients with cancer, characterized by the presence of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells. It is also an object of the present invention to expand the arsenal of means for suppressing the proliferation and inducing the death of O02-positive tumor cells, as well as for diagnosing ganglioside GD2 in the blood serum of patients with CO2-positive tumors.
Указанные задачи решаются путем создания нового терапевтического агента для лечения онкологических заболеваний, представляющего собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающее ганглиозид GD2, включающее тяжёлую цепь, содержащую H-CDR1 с последовательностью SEQ ID N0:1, H-CDR2 с последовательностью SEQ ID N0:2, и H-CDR3 с SEQ ID N0:3, и лёгкую цепь, содержащую L-CDR1 с последовательностью SEQ ID N0:4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID N0:5, и L-CDR3 с SEQ ID N0:6.These problems are solved by creating a new therapeutic agent for the treatment of cancer, which is an antibody or its antigen-binding fragment that specifically binds GD2 ganglioside, including a heavy chain containing H-CDR1 with the sequence SEQ ID N0: 1, H-CDR2 with the sequence SEQ ID N0 : 2, and H-CDR3 with SEQ ID N0: 3, and a light chain containing L-CDR1 with the sequence SEQ ID N0: 4, L-CDR2 with the sequence SEQ ID N0: 5, and L-CDR3 with SEQ ID N0: 6.
В некоторых вариантах изобретения данное собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется тем, что тяжёлая цепь содержит вариабельный домен с последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID N0:7. В некоторых вариантах изобретения данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется тем, что лёгкая цепь содержит вариабельный домен с последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID N0:8. В некоторых вариантах изобретения данное антитело представляет собой химерное антитело.In some embodiments of the invention, the antibody or antigen binding fragment thereof is characterized in that the heavy chain comprises a variable domain with a sequence homologous to at least 95% of the sequence of SEQ ID N0: 7. In some embodiments of the invention, the antibody or antigen binding fragment thereof is characterized in that the light chain comprises a variable domain with a sequence homologous to at least 95% of the sequence of SEQ ID N0: 8. In some embodiments of the invention, the antibody is a chimeric antibody.
Указанная задача также решается путем создания мультивалентной конструкции, специфически связывающей ганглиозид GD2, и содержащей два, три или четыре описанных выше функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция характеризуется тем, что содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела с последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID N0:9 или последовательности SEQ ID N0:10.This problem is also solved by creating a multivalent construct that specifically binds GD2 ganglioside, and contains two, three or four functional fragments of antibodies described above that specifically bind GDG2 ganglioside and interconnected by covalent conjugation with a polyethylene glycol molecule. In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains an antigen binding fragment of an antibody with a sequence homologous to at least 95% of the sequence of SEQ ID N0: 9 or the sequence of SEQ ID N0: 10.
Указанные антитела или их функциональные фрагменты, а также указанные мультивалентные конструкции, содержащие такие антитела или их функциональные фрагменты, можно применять для лечения или диагностики С02-специфичных опухолей, таких как, например, нейробластома. Другими примерами онкологических заболеваний, характеризующихся увеличенной экспрессией ганглиозида GD2 на поверхности опухолевых клеток, являются мелкоклеточный рак легкого, саркома, глиома, ретинобластома и меланома. Диагностику подобных опухолей можно проводить как in vivo, как и по срезам тканей (ex vivo), а также с помощью других, известных специалистам методов.These antibodies or their functional fragments, as well as these multivalent constructs containing such antibodies or their functional fragments, can be used for the treatment or diagnosis of CO2-specific tumors, such as, for example, neuroblastoma. Other examples of oncological diseases characterized by increased expression of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells are small cell lung cancer, sarcoma, glioma, retinoblastoma and melanoma. Diagnosis of such tumors can be carried out both in vivo and tissue sections (ex vivo), as well as using other methods known to those skilled in the art.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:When carrying out the invention, the following technical results are achieved:
- создан новый вариант терапевтического агента на основе фрагментов антител к GD2 для лечения онкологических заболеваний, характеризующихся присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли;- created a new version of a therapeutic agent based on fragments of antibodies to GD2 for the treatment of cancer, characterized by the presence of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells;
- разработан новый эффективный способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2;- developed a new effective way to destroy cells in the body of the subject, on the surface of which there is a ganglioside GD2;
- разработан новый способ диагностики онкологических заболеваний, характеризующихся присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли.- A new method for the diagnosis of cancer, characterized by the presence of ganglioside GD2 on the surface of tumor cells, was developed.
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
Рис. 1. (А). Результаты изотипирования при помощи IsoStrip Isotyping Kit. (Б). ПААГ-электрофорез в 10% геле антител B8(1)-H6 в восстанавливающих условиях: 1) Фракция антител B8(1)-H6 после очистки на Protein A колонке. 2) Фракция антител B8(1)-H6 после последующей очистки на HPLC. (В). Аналитическая гель-фильтрационная хроматография антител B8(1)-H6.Fig. 1. (A). Isotyping results with the IsoStrip Isotyping Kit. (B) PAGE-electrophoresis in 10% gel of antibodies B8 (1) -H6 under reducing conditions: 1) Fraction of antibodies B8 (1) -H6 after purification on a Protein A column. 2) B8 (1) -H6 antibody fraction after subsequent purification on HPLC. (IN). Analytical gel filtration chromatography of antibodies B8 (1) -H6.
Рис. 2. (А) Цитометрические измерения клеток EL-4, окрашенных GD2-специфичными антителами B8(1)-H6, вторые антитела anti-mouse fab-specific-FITC (Титр 1:2000). Пик, обозначенный цветом, отражает флуоресценцию клеток, окрашенных GD2-мАт, контур - пик контрольных клеток, окрашенных вторичными антивидовыми антителами. Представлены результаты репрезентативного эксперимента. Было проведено как минимум 3 эксперимента. (Б) PI-тест. Анализ уровня фрагментации ДНК клеток GD2-позитивной клеточной линий EL-4 после инкубации в течение 24 ч с GD2-специфичными антителами B8(1)-H6 (500 тыс. клеток /образец, 20 мкг/мл). Маркером обозначена доля клеток с фрагментированной ДНК. Представлены результаты репрезентативного эксперимента. Было проведено как минимум 3 эксперимента.Fig. 2. (A) Cytometric measurements of EL-4 cells stained with GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, second anti-mouse fab-specific-FITC antibodies (Title 1: 2000). The peak indicated by color reflects the fluorescence of cells stained with GD2-mAb; the contour is the peak of control cells stained with secondary antispecies antibodies. The results of a representative experiment are presented. At least 3 experiments have been conducted. (B) PI test. Analysis of the DNA fragmentation level of cells of GD2-positive EL-4 cell lines after incubation for 24 hours with GD2-specific antibodies B8 (1) -H6 (500 thousand cells / sample, 20 μg / ml). The marker indicates the proportion of cells with fragmented DNA. The results of a representative experiment are presented. At least 3 experiments have been conducted.
Рис. 3. Оценка кросс-реактивности различных GD2-специфичных антител с ганглиозидами GM2, GD1b и GD3 по результатам ИФА. Наносили различные разведения антител 14G2a, ME361 и B8(1)-H6. Антивидовые HRP-меченые анти-Fab-специфичные антитела (1:6000). На подложке 250 нг/лунка различных ганглиозидов. % кросс-реактивности рассчитывался по отношению OD раствора пероксидазной реакции после связывания антител с ганглиозидами GM2, GD1b или GD3 к OD раствора после связывания антител с ганглиозидом GD2.Fig. 3. Assessment of cross-reactivity of various GD2-specific antibodies with gangliosides GM2, GD1b and GD3 according to the results of ELISA. Various dilutions of antibodies 14G2a, ME361 and B8 (1) -H6 were applied. Anti-HRP-labeled anti-Fab-specific antibodies (1: 6000). On a substrate, 250 ng / well of various gangliosides. % cross-reactivity was calculated from the ratio of the OD of the peroxidase reaction solution after binding of antibodies to GM2, GD1b or GD3 gangliosides to the OD solution after binding of antibodies to GD2 ganglioside.
Рис. 4. Генетические конструкции, использованные при экспрессии химерных антител. Химерная легкая и тяжелая цепи антитела B8(1)-H6 находятся под контролем промотера цитомегаловируса (CMV promoter) и снабжены сигналами полиаденилирования (TK polyA). В качестве маркеров для селекции используются ген устойчивости к неомицину и дигидрофолатредуктаза, соответственно.Fig. 4. Genetic constructs used in the expression of chimeric antibodies. The chimeric light and heavy chains of B8 (1) -H6 are under the control of the cytomegalovirus promoter (CMV promoter) and are equipped with polyadenylation signals (TK polyA). As markers for selection, the neomycin resistance gene and dihydrofolate reductase are used, respectively.
Рис. 5. Схема получения мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител.Fig. 5. Scheme for the preparation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies.
А - получение димеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.A - preparation of dimers of scFv fragments using PEG-Maleimide2.
Б - получение димеров Fab-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.B - obtaining dimers of Fab fragments using PEG-Maleimide2.
В - получение тетрамеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид4.B — production of tetramers of scFv fragments using PEG-
Рис. 6. Анализ антиген-связывающей способности молекул на основе антител B8(1)-H6 методом проточной цитофлуориметрии. GD2-позитивная клеточная линия - клетки мышиной лимфомы EL-4, GD2-негативная клеточная линия - клетки человеческой нейробластомы NGP-127.Fig. 6. Analysis of the antigen-binding ability of molecules based on antibodies B8 (1) -H6 by flow cytometry. GD2-positive cell line - cells of murine lymphoma EL-4, GD2-negative cell line - cells of human neuroblastoma NGP-127.
Рис. 7. Анализ антиген-связывающей способности молекул на основе антител B8(1)-H6 методом ИФА с использованием ганглиозидов GD2, GD3 и GD1b, сорбированных на подложке планшета.Fig. 7. Analysis of the antigen-binding ability of molecules based on antibodies B8 (1) -H6 by ELISA using gangliosides GD2, GD3 and GD1b adsorbed on a tablet substrate.
Рис. 8. Оценка связывания биотинилированных антител/фрагментов антител B8(1)-H6 с ганглиозидом GD2. (А) - Цитометрические измерения клеток EL-4, окрашенных антителами/фрагментами B8(1)-H6 или их биотинилированными производными, вторичные антитела anti-human Fc-specific-FITC в случае антител или anti-FLAG-FITC в случае scFv-фрагментов, детекцию биотинилированных антител/фрагментов проводили с использованием стрептавидин-FITC. Представлены результаты репрезентативного эксперимента. Было проведено как минимум 3 эксперимента. (Б) и (В) - Оценка связывания антител/фрагментов антител B8(1)-H6 и их биотинилированных производных с ганглиозидом GD2 в прямом ИФА. Различные концентрации GD2-связывающих молекул, вторичные антитела anti-human Fc-specific-HRP в случае антител или anti-FLAG-HRP в случае scFv-фрагментов, детекцию биотинилированных антител/фрагментов проводили с использованием стрептавидин-HRP, титр вторых антител и стрептавидин-HRP 1:4000. На подложке ганглиозид GD2 (250 нг/лунка). Каждая точка в трех повторах.Fig. 8. Evaluation of the binding of biotinylated antibodies / antibody fragments B8 (1) -H6 to ganglioside GD2. (A) - Cytometric measurements of EL-4 cells stained with antibodies / B8 (1) -H6 fragments or their biotinylated derivatives, secondary anti-human Fc-specific-FITC antibodies in the case of antibodies or anti-FLAG-FITC in the case of scFv fragments , biotinylated antibodies / fragments were detected using streptavidin-FITC. The results of a representative experiment are presented. At least 3 experiments have been conducted. (B) and (C) - Evaluation of the binding of antibodies / antibody fragments B8 (1) -H6 and their biotinylated derivatives to GD2 ganglioside in direct ELISA. Different concentrations of GD2-binding molecules, anti-human Fc-specific-HRP secondary antibodies in the case of antibodies or anti-FLAG-HRP in the case of scFv fragments, biotinylated antibodies / fragments were detected using streptavidin-HRP, titer of the second antibodies and streptavidin HRP 1: 4000. On a substrate is ganglioside GD2 (250 ng / well). Each dot in three repetitions.
Рис. 9. (А) - Оценка связывания антител B8(1)-H6 и антител B8(1)-H6, меченных пероксидазой хрена, с ганглиозидом GD2 в прямом ИФА. Различные концентрации GD2-специфичных антител, вторичные антитела anti-human Fc-specific-HRP для немеченых антител B8(1)-H6, титр вторых антител 1:4000. На подложке ганглиозид GD2 (250 нг/лунка). Каждая точка в трех повторах. (Б) - Оценка связывания scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 и scFv-фрагментов антител B8(1)-H6, меченных пероксидазой хрена, с ганглиозидом GD2 в прямом ИФА. Различные концентрации фрагментов GD2-специфичных антител, вторичные антитела anti-FLAG-HRP для немеченных фрагментов антител B8(1)-H6, титр вторых антител 1:4000. На подложке ганглиозид GD2 (250 нг/лунка). Каждая точка в трех повторах.Fig. 9. (A) - Evaluation of the binding of antibodies B8 (1) -H6 and antibodies B8 (1) -H6 labeled with horseradish peroxidase with ganglioside GD2 in direct ELISA. Different concentrations of GD2-specific antibodies, anti-human Fc-specific-HRP secondary antibodies for unlabeled B8 (1) -H6 antibodies, titer of the second antibodies 1: 4000. On a substrate is ganglioside GD2 (250 ng / well). Each dot in three repetitions. (B) - Evaluation of the binding of scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 labeled with horseradish peroxidase with ganglioside GD2 in direct ELISA. Different concentrations of fragments of GD2-specific antibodies, secondary anti-FLAG-HRP antibodies for unlabeled B8 (1) -H6 antibody fragments, titer of the second antibodies 1: 4000. On a substrate is ganglioside GD2 (250 ng / well). Each dot in three repetitions.
Рис. 10. Дот-блот анализ ганглиозида GD2 в сыворотках крови, сорбированных на нитроцеллюлозной мембране. (А). Инкубация с немечеными антителами B8(1)-H6 с последующей инкубацией с антителами anti-human Fc-specific-HRP (титр 1:6000); (Б). Инкубация с биотинилированными антителами B8(1)-H6 с последующей инкубацией с стрептавидин-HRP; (В). Инкубация с антителами B8(1)-H6, меченными пероксидазой хрена. 1 - контрольная сыворотка здорового донора. 2 - экспериментальная сыворотка с экзогенно добавленным ганглиозидом GD2. 3 - сыворотка крови пациента с нейробластомой.Fig. 10. Dot blot analysis of ganglioside GD2 in serum adsorbed on a nitrocellulose membrane. (BUT). Incubation with unlabeled B8 (1) -H6 antibodies, followed by incubation with anti-human Fc-specific-HRP antibodies (titer 1: 6000); (B) Incubation with biotinylated antibodies B8 (1) -H6 followed by incubation with streptavidin-HRP; (IN). Incubation with B8 (1) -H6 antibodies labeled with horseradish peroxidase. 1 - control serum of a healthy donor. 2 - experimental serum with exogenously added ganglioside GD2. 3 - blood serum of a patient with neuroblastoma.
Рис. 11. ИФА анализ ганглиозида GD2 в сыворотках крови. А. Инкубация с немечеными антителами B8(1)-H6 с последующей инкубацией с антителами anti-human Fc-specific-HRP (титр 1:6000); Б. Инкубация с биотинилированными антителами B8(1)-H6 с последующей инкубацией с стрептавидин-HRP; В. Инкубация с антителами B8(1)-H6, меченными пероксидазой хрена.Fig. 11. ELISA analysis of ganglioside GD2 in blood serum. A. Incubation with unlabeled B8 (1) -H6 antibodies, followed by incubation with anti-human Fc-specific-HRP antibodies (titer 1: 6000); B. Incubation with biotinylated B8 (1) -H6 antibodies, followed by incubation with streptavidin-HRP; B. Incubation with B8 (1) -H6 antibodies labeled with horseradish peroxidase.
Рис. 12. Оценка клеточной гибели под действием GD2-специфичных антител B8(1)-H6, scFv- и ди-scFv-фрагментов антител B8(1)-H6. (А) - МТТ-тест, 72 ч инкубации, (Б) - PI-тест и 7AAD-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.Fig. 12. Assessment of cell death by GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, scFv- and di-scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6. (A) MTT test, 72 hours of incubation, (B) PI test and 7AAD test, 24 hours of incubation. K - intact cells.
Рис. 13. Оценка антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности антител B8(1)-H6 в клетках линии EL-4.Fig. 13. Assessment of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity of antibodies B8 (1) -H6 in cells of the EL-4 line.
Подробное раскрытие изобретенияDetailed Disclosure of Invention
Определения и терминыDefinitions and Terms
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.For a better understanding of the present invention, the following are some terms used in the present description of the invention.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of the present invention, the terms “includes” and “including” are interpreted as meaning “includes, inter alia,”. These terms are not intended to be construed as “consists of only”.
Под «субъектом» следует понимать человека или другое млекопитающее.By “subject” is meant a human or other mammal.
Ганглиозидом GD2 в настоящем описании называется дисиалоганглиозид, экспрессированный на поверхности опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения со следующей IUPAC формулой: (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl]-2,3-dihydroxypropoxy]-5-amino-4-hydroxy-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)oxane-2-carboxylic acid.GD2 ganglioside in the present description is a disialoganglioside expressed on the surface of tumor cells of neuroectodermal origin with the following IUPAC formula: (2R, 4R, 5S, 6S) -2- [3 - [(2S, 3S, 4R, 6S) -6 - [( 2S, 3R, 4R, 5S, 6R) -5 - [(2S, 3R, 4R, 5R, 6R) -3-acetamido-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan-2-yl] oxy-2 - [(2R, 3S, 4R, 5R, 6R) -4,5-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) -6 - [(E) -3-hydroxy-2- (octadecanoylamino) octadec-4-enoxy] oxan- 3-yl] oxy-3-hydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan-4-yl] oxy-3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl] -2,3-dihydroxypropoxy] -5-amino -4-hydroxy-6- (1,2,3-trihydroxypropyl) oxane-2-carboxylic acid.
Термин «функциональный фрагмент антитела» в использованном здесь значении означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ганглиозидом GD2). Примеры функциональных фрагментов включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела; (iv) два домена Fv-фрагмента, VL и VH, объединенных при помощи синтетического линкера в одну белковую цепь, в которой VL и VH области спариваются с образованием одновалентной конструкции (известна как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird et al., Science, 1988, 242:423-426). Указанные фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения функциональные фрагменты антител не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями; в частности, функциональные фрагменты антител могут не содержать Fc-регион.The term “functional antibody fragment” as used herein means one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, GD2 ganglioside). Examples of functional fragments include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F (ab ') 2 fragment, a divalent fragment comprising two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (iv) two domains of the Fv fragment, VL and VH, joined by a synthetic linker into one protein chain, in which the VL and VH regions mate to form a monovalent construct (known as a single chain Fv fragment (scFv); see, for example, Bird et al., Science, 1988, 242: 423-426). These antibody fragments are prepared by conventional methods known to those skilled in the art. In preferred embodiments of the present invention, the functional antibody fragments do not have or have reduced effector functions; in particular, functional antibody fragments may not contain an Fc region.
Некоторые мультивалентные конструкции по настоящему изобретению могут содержать от двух до нескольких функциональных фрагментов антител, каждый из которых способен специфически связываться с ганглиозидом GD2; таким образом, содержать два или несколько антиген-связывающих участков. Функциональные фрагменты антител в мультивалентной конструкции могут включать вариабельные области, а также, иногда, константные области, выделенные из последовательностей иммуноглобулинов, специфически связывающих GD2. Предпочтительно, но без обязательных ограничений, функциональные фрагменты в составе мультивалентной конструкции по настоящему изобретению не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями. Мультивалентность, т.е. способность связывать сразу несколько молекул антигена, обеспечивает конструкции по настоящему изобретению высокую авидность (стабильность взаимодействия между конструкцией и клеткой, экспрессирующей антигены на поверхности), что в свою очередь обеспечивает улучшенные функциональные свойства конструкции.Some multivalent constructs of the present invention may contain from two to several functional antibody fragments, each of which is capable of specifically binding to the GD2 ganglioside; thus, contain two or more antigen binding sites. Functional antibody fragments in a multivalent construct may include variable regions, as well as, sometimes, constant regions isolated from immunoglobulin sequences that specifically bind GD2. Preferably, but without mandatory restrictions, the functional fragments in the multivalent construct of the present invention do not have or have reduced effector functions. Multivalence, i.e. the ability to bind several antigen molecules at once, provides the constructs of the present invention with high avidity (stability of the interaction between the construct and the cell expressing antigens on the surface), which in turn provides improved functional properties of the construct.
Используемые функциональные фрагменты антител по настоящему изобретению могут представлять собой «химерные» или «гуманизированные» фрагменты антител. Химерные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей из одного вида и последовательности константной области из другого вида. Гуманизированные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности фрагментов человеческих антител, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) заменены остатками аналогичных сайтов из антител грызунов.Used functional fragments of antibodies of the present invention can be a "chimeric" or "humanized" antibody fragments. Chimeric fragments mean antibody fragments that include the sequences of the variable region of the heavy and / or light chains from one species and the sequences of the constant region from another species. Humanized fragments mean antibody fragments that include sequences of fragments of human antibodies in which some residues of the CDR and possibly some residues of the frame region (FR) are replaced by residues of similar sites from rodent antibodies.
В некоторых вариантах изобретения функциональные фрагменты антител согласно изобретению содержат области тяжелых и/или легких цепей, включающие в себя аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям, описанным в Таблице 1 предпочтительных фрагментов антител, где указанные функциональные фрагменты антител сохраняют нужные функциональные свойства согласно изобретению (связывание с ганглиозидом GD2 и индукция клеточной гибели). Гомологичные фрагменты антител могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного фрагмента антител на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.In some embodiments, the functional antibody fragments of the invention comprise heavy and / or light chain regions including amino acid sequences homologous to the amino acid sequences described in Table 1 of the preferred antibody fragments, where the indicated functional antibody fragments retain the desired functional properties of the invention (binding to GD ganglioside and induction of cell death). Homologous antibody fragments can be obtained by mutagenesis (e.g., site-directed or PCR-mediated mutagenesis) of the corresponding nucleic acid molecules, followed by testing the encoded modified antibody fragment to maintain its functions in accordance with the functional assays described herein.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).As used herein, the term “percent homology of two sequences” is equivalent to the term “percent identity of two sequences”. The percentage of identity of two sequences is determined by the number of positions of identical amino acids in these two sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space that must be entered for optimal comparison of the two sequences by alignment. The percentage of identity is equal to the number of identical amino acids in these positions, taking into account sequence alignment divided by the total number of positions and multiplied by 100. The percentage of identity of two amino acid sequences can be determined using the NCBI Protein BLAST program (https: //blast.ncbi.nlm.nih .gov /).
Создание гибридомы, продуцирующей GD2-специфичные моноклональные антитела B8(1)-H6.Creating a hybridoma producing GD2-specific monoclonal antibodies B8 (1) -H6.
Подбор и синтез GD2-мимикрирующих пептидов. В качестве иммуногена были выбраны ганглиозид-мимикрирующие пептиды, полученные с использованием GD2-специфичных антител 14G2a или МЕ61, наиболее схожие по своей пространственной структуре с углеводными детерминантами ганглиозида GD2, а также их KLH-модифицированные аналоги. Были отобраны следующие ганглиозид GD2-мимикрирующие пептиды: 14G2a-94L (RCNPNMEPPRCWAAEGD) и 361-P10S (WRYTAPVHLGDG), а так же их KLH-модифицированные варианты: 14G2a-94L-KLH (RCNPNMEPPRCWAAEGD-KLH) и 361-P10S-KLH (WRYTAPVHLGDG-KLH), синтезированные методом твердофазного синтеза. Пришивка KLH осуществлялась с N-конца пептидов (Peptide 2.0 inc, США). Структура данных пептидов основана на результатах рентгеноструктурного анализа комплексов GD2-антитело. Основным преимуществом пептидов по сравнению с ганглиозидом GD2 является повышенная иммуногенность. Кроме того, известно, что при образовании коньюгатов с опухолевыми антигенами, гемоцианин улитки (KLH) существенно повышает их иммуногенность.Selection and synthesis of GD2-mimicking peptides. Ganglioside-mimicking peptides obtained using GD2-specific antibodies 14G2a or ME61, the most similar in their spatial structure to the carbohydrate determinants of the ganglioside GD2, as well as their KLH-modified analogues, were chosen as an immunogen. The following GD2-mimicking peptides were selected: 14G2a-94L (RCNPNMEPPRCWAAEGD) and 361-P10S (WRYTAPVHLGDG), as well as their KLH-modified variants: 14G2a-94L-KLH (RCNPNMEPDHHPLWPLHPKLPHPLWPHPLWPHPLPHPHPHWPHLPHPHLPHPHLPHPHWPHLPHPLWPHPLWPHPLWPHPHPHWPHWPHWPHW -KLH) synthesized by solid-phase synthesis. KLH was sutured from the N-terminus of the peptides (Peptide 2.0 inc, USA). The structure of these peptides is based on the results of X-ray diffraction analysis of GD2 antibody complexes. The main advantage of peptides over GD2 ganglioside is increased immunogenicity. In addition, it is known that when conjugates with tumor antigens are formed, cochlear hemocyanin (KLH) significantly increases their immunogenicity.
В качестве объекта для иммунизации были выбраны лабораторные мыши линии BALB/с. Была проведена четырехкратная иммунизация лабораторных мышей с последующим слиянием выделенных спленоцитов и клеток миеломы X63 в полиэтиленгликоле с получением клеток гибридомы. Самки мышей линии BALB/c возрастом 10 недель были четырехкратно иммунизированы 40 мкг GD2-мимикрирующих пептидов (чистота более 95%), растворенных в стерильном PBS в объеме 250 мкл, смешанными с равным объемом полного адъюванта Фрейнда до образования устойчивой эмульсии. Иммунизация проводилась внутрибрюшинно с интервалами раз в две недели. Эффективность иммунизации и оценку продукции антител в сыворотке крови животных проводили методом иммуноферментного анализа сыворотки животных, согласно методике, описанной выше. Через 3 дня после последней иммунизации, выделенные мышиные спленоциты были слиты с клетками миеломы X63 в полиэтиленгликоле согласно общепринятой методике с использованием ПЭГ 4000.As an object for immunization, BALB / s laboratory mice were selected. Four-fold immunization of laboratory mice was carried out, followed by fusion of the isolated splenocytes and X63 myeloma cells in polyethylene glycol to obtain hybridoma cells. Female 10-week old BALB / c mice were immunized four times with 40 μg of GD2-mimicking peptides (purity greater than 95%) dissolved in sterile PBS in a volume of 250 μl mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant until a stable emulsion was formed. Immunization was carried out intraperitoneally at intervals of once every two weeks. The effectiveness of immunization and the assessment of the production of antibodies in the blood serum of animals was performed by enzyme-linked immunosorbent assay of animal serum, according to the method described above. 3 days after the last immunization, the isolated mouse splenocytes were fused to X63 myeloma cells in polyethylene glycol according to the generally accepted method using PEG 4000.
Отбор и анализ моноклонов. Поиск и отбор клонов, продуцирующих GD2-специфичные моноклональные антитела, осуществлялся методом лимитирующих разведений. Контроль эффективности и специфичности связывания полученных антител с ганглиозидом GD2 осуществлялся методом иммуноферментного анализа.Selection and analysis of monoclones. Search and selection of clones producing GD2-specific monoclonal antibodies was carried out by the method of limiting dilutions. The effectiveness and specificity of binding of the obtained antibodies to the GD2 ganglioside was monitored by enzyme-linked immunosorbent assay.
Исходя из сравнения аффинности полученных антител, продуцированных различными клонами, при помощи иммуноферментного анализа, были выбраны наиболее оптимальные по ряду характеристик гибридомы, продуцирующие антитела, связывающие ганглиозид GD2 (антитела, продуцирующиеся в выбранных клетках гибридомы, были обозначены как B8(1)-H6). Изотипирование этих антител показало, что они относятся к IgM классу. Изотипирование полученных антител проводилось при помощи IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Santa Cruz, США) согласно методике производителя. Наработка и выделение выбранных антител осуществлялась с использованием асцитов и Protein A. Антитела B8(1)-H6 проявили способность связывания с Protein A, однако для получения чистой фракции антител использовали дополнительную хроматографическую очистку с использованием гель-фильтрации. Дополнительная очистка полученных на Protein A-колонке антител B8(1)-H6 проводилась на колонке TSKgel 2000pw (7.5 мм × 300 мм, Tosoh Corporation, Japan) с использованием ВЭЖХ-системы Beckman System gold в PBS. Скорость потока 1 мл/мин. Белковые фракции собирали с использованием детектора на 280 нм. Очищенную фракцию антител концентрировали на фильтрах Amicon Ultra (максимальная пропускающая способность 100 кДа) при 1000 g в течение 20 мин. Использование хроматографии позволило получить фракции антител B8(1)-H6 с чистотой порядка 80% (Рис. 1), что было показано при помощи ПААГ-электрофореза.Based on a comparison of the affinity of the obtained antibodies produced by various clones, using an enzyme-linked immunosorbent assay, the most optimal hybridomas producing antibodies that bind GD ganglioside (the antibodies produced in the selected hybridoma cells were identified as B8 (1) -H6) were selected according to a number of characteristics. . Isotyping of these antibodies showed that they belong to the IgM class. Isotyping of the obtained antibodies was carried out using the IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Santa Cruz, USA) according to the manufacturer's procedure. Selected antibodies were produced and isolated using ascites and Protein A. Antibodies B8 (1) -H6 showed the ability to bind to Protein A, however, additional chromatographic purification using gel filtration was used to obtain a pure antibody fraction. Additional purification of the B8 (1) -H6 antibodies obtained on the Protein A column was performed on a TSKgel 2000pw column (7.5 mm × 300 mm, Tosoh Corporation, Japan) using a Beckman System gold HPLC system in PBS.
Оценка кросс-реактивности полученных GD2-специфичных антител класса IgM с ганглиозидами GM1, GD1b и GD3 проводилась согласно стандартной методике ИФА.The cross-reactivity of the obtained GD2-specific IgM class antibodies with gangliosides GM1, GD1b and GD3 was evaluated according to the standard ELISA.
Полученные антитела B8(1)-H6 обладают хорошей GD2-связывающей способностью, сравнимой с контрольными моноклональными антителами МЕ361, что было показано в ходе прямого иммуноферментного анализа с ганглиозидом GD2. Также полученные антитела способны эффективно связываться с ганглиозидом GD2 опухолевых клеток линии мышиной лимфомы EL-4. Более того, после 24-х часов инкубации клеток мышиной лимфомы EL-4 с антителами B8(1)-H6 в концентрации 20 мкг/мл процент клеток с фрагментированной ДНК увеличивался в 1.9+0.4 по сравнению с базовым уровнем (Рис. 2), что показывает индукцию гибели GD2-позитивных опухолевых клеток под действием GD2-специфичных антител.The obtained antibodies B8 (1) -H6 have good GD2-binding ability, comparable with the control monoclonal antibodies ME361, which was shown during direct enzyme-linked immunosorbent assay with ganglioside GD2. Also, the obtained antibodies are able to effectively bind to the ganglioside GD2 tumor cells of the mouse lymphoma line EL-4. Moreover, after 24 hours of incubation of EL-4 mouse lymphoma cells with B8 (1) -H6 antibodies at a concentration of 20 μg / ml, the percentage of cells with fragmented DNA increased by 1.9 + 0.4 compared to the baseline (Fig. 2), which shows the induction of death of GD2-positive tumor cells under the influence of GD2-specific antibodies.
Далее проводили анализ кроссреактивности B8(1)-H6 с другими ганглиозидами. Контрольные антитела ME361 проявляют кросс-реактивность к ганглиозиду GD3, который является очень близким к ганглиозиду GD2 по структуре, но при этом его экспрессия отмечается на клетках нормальных тканей и органов, что существенно ограничивает возможности использования полноразмерных антител этого типа. Для изучения кроссреактивности полученных антител B8(1)-H6 был использован метод иммуноферментного анализа. Как и ожидалось, антитела МЕ361 обладают значимой кросс-реактивностью с ганглиозидом GD3 составляющей около 15% от связывания с GD2 (Рис. 3). Для антител 14G2a и B8(1)-H6 параметры кросс-реактивности для всех исследованных ганглиозидов не превышали 5%, что говорит о строгой специфичности этих антител к ганглиозиду GD2 (Рис. 3).Next, an analysis of the cross-reactivity of B8 (1) -H6 with other gangliosides was performed. ME361 control antibodies show cross-reactivity to GD3 ganglioside, which is very close to GD2 ganglioside in structure, but its expression is observed on normal tissue and organ cells, which significantly limits the possibility of using full-sized antibodies of this type. An enzyme-linked immunosorbent assay was used to study the cross-reactivity of the obtained B8 (1) -H6 antibodies. As expected, ME361 antibodies have significant cross-reactivity with GD3 ganglioside, which is about 15% of GD2 binding (Fig. 3). For antibodies 14G2a and B8 (1) -H6, the cross-reactivity parameters for all studied gangliosides did not exceed 5%, which indicates the strict specificity of these antibodies to ganglioside GD2 (Fig. 3).
Для подтверждения результатов также было проведено цитометрическое окрашивание клеток различными GD2-специфичными антителами. Исходя из анализа ганглиозидного состава клеточных линий, а также результатов окрашивания клеток анти-GD2-мАт 14G2a и анти-GD3-мАт R24 были отобраны GD2+GD3--, GD2+GD3+-, GD2-GD3+- и GD2-GD3--клеточные линии. Результаты поверхностного окрашивания этих линий подтверждают результаты об отсутствии кросс-реактивности антител B8(1)-H6 с ганглиозидом GD3, поскольку они не показали связывания с GD3-позитивными клетками линии SKOV-3.To confirm the results, cytometric staining of cells with various GD2-specific antibodies was also performed. Based on the analysis of the ganglioside composition of cell lines, as well as the results of staining cells with anti-GD2-mAb 14G2a and anti-GD3-mAb R24, GD2 + GD3--, GD2 + GD3 + -, GD2-GD3 + - and GD2-GD3 were selected lines. The results of surface staining of these lines confirm the results of the lack of cross-reactivity of B8 (1) -H6 antibodies with GD3 ganglioside, since they did not show binding to GD3-positive SKOV-3 cells.
Определение вариабельных областей антитела B8(1)-H6.Determination of the variable regions of the antibody B8 (1) -H6.
Полученная гибридома продуцировала антитела класса IgM, что не является оптимальным в силу большой молекулярной массы антител (700-1100 кДа). Поскольку антитела B8(1)-H6 обладали хорошими характеристиками связывания и специфичностью, их использовали для получения фрагментов антител и различных рекомбинантных вариантов антител, специфичных к GD2, и имеющих большие перспективы применения на практике.The resulting hybridoma produced antibodies of the IgM class, which is not optimal due to the large molecular weight of the antibodies (700-1100 kDa). Since B8 (1) -H6 antibodies had good binding characteristics and specificity, they were used to obtain antibody fragments and various recombinant antibody variants specific for GD2 and with great practical prospects.
Секвенирование вариабельных доменов антител. Для определения последовательностей антитела B8(1)-H6 были выделены фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепей этих антител. Для этого из клеток гибридомы выделяли тотальную РНК набором RNeasy mini kit (Qiagen). Качество препаратов РНК контролировали с помощью агарозного электрофореза с последующим окрашиванием гелей бромистым этидием.Sequencing of variable domains of antibodies. To determine the sequences of antibodies B8 (1) -H6 were isolated DNA fragments encoding the variable domains of the light and heavy chains of these antibodies. For this, total RNA was isolated from hybridoma cells using the RNeasy mini kit (Qiagen). The quality of RNA preparations was monitored by agarose electrophoresis followed by staining of the gels with ethidium bromide.
Получение библиотеки кДНК проводили набором RevertAid H Minus First strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientific) c использованием oligo dT20 праймера. ПЦР с препаратов кДНК проводили с панелями вырожденных праймеров, комплементарных сигнальным пептидам иммуноглобулинов (Chardes et al., 1999). В качестве обратных праймеров использовали последовательности, комплементарные константным доменам тяжелых и легких цепей. Обратные праймеры также содержали рестриктный сайт SalI для последующего клонирования в плазмидный вектор. Положительным контролем для ПЦР служили прямые олигонуклеотиды, комплементарные консервативным FR1 районам вариабельных доменов иммуноглобулинов.The cDNA library was prepared using the RevertAid H Minus First strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientific) using an oligo dT20 primer. PCR from cDNA preparations was performed with panels of degenerate primers complementary to immunoglobulin signal peptides (Chardes et al., 1999). Sequences complementary to the constant domains of heavy and light chains were used as reverse primers. Reverse primers also contained the SalI restriction site for subsequent cloning into a plasmid vector. Direct oligonucleotides complementary to conserved FR1 regions of the immunoglobulin variable domains served as a positive control for PCR.
Реакцию ПЦР проводили с использованием High Fidelity Enzyme mix (Thermo Scientific), с использованием минимального числа циклов. Продукты реакции анализировали на агарозном электрофорезе; идентифицировали комбинации вырожденных олигонуклеотидов, давших ПЦР продукт. Подходящие комбинации использовали для препаративной ПЦР, продукты очищали с помощью электрофореза, расщепляли рестриктазой SalI и клонировали в вектор pBluescript KS+ по сайтам EcoRV и SalI. Бактериальные клоны выращивали в жидкой культуре, содержащей селективный антибиотик; плазмидную ДНК выделяли с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), и вставки секвенировали.The PCR reaction was carried out using a High Fidelity Enzyme mix (Thermo Scientific) using a minimum number of cycles. Reaction products were analyzed on agarose electrophoresis; identified combinations of degenerate oligonucleotides giving the PCR product. Suitable combinations were used for preparative PCR, the products were purified by electrophoresis, digested with SalI restriction enzyme and cloned into pBluescript KS + vector at EcoRV and SalI sites. Bacterial clones were grown in liquid culture containing a selective antibiotic; plasmid DNA was isolated using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), and the inserts were sequenced.
Сравнение полученных последовательностей с последовательностями ближайших гомологов по базам данных подтвердило принадлежность последовательности антител B8(1)-H6 к генам иммуноглобулинов класса IgM. В Таблице 1 представлены последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител.Comparison of the obtained sequences with the sequences of the nearest homologues in the databases confirmed that the B8 (1) -H6 antibody sequence belongs to the IgM class immunoglobulins. Table 1 presents the sequences of the variable regions of the heavy and light chains of antibodies.
Таблица 1.Table 1.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.
Примеры создания молекул на основе GD2-специфичного антитела B8(1)-H6 для терапии онкологических заболеваний.Examples of creating molecules based on the GD2-specific antibody B8 (1) -H6 for the treatment of cancer.
Пример 1. Получение химерных моноклональных антител.Example 1. Obtaining chimeric monoclonal antibodies.
Последовательности химерных антител создавались на основе синтезированных вариабельных доменов антител B8(1)-H6. Одновременно с синтезом последовательностей проводили оптимизацию кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Для получения тяжелых и легких цепей вариабельные домены сшивали с константными доменами тяжелых цепей (ТЦ) и легких цепей (ЛЦ) изотипа IgG1 человека. Данные последовательности были также оптимизированы по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающих. Для получения химерных ТЦ и ЛЦ использовали стратегию overlap extension, позволяющую сшить два фрагмента ДНК, используя реакцию ПЦР. Реакцию ПЦР проводили с использованием полимеразы High Fidelity PCR mix (Thermo Scientific) c минимальным числом циклов. Кроме полноразмерных антител, аналогично были сконструированы функциональные фрагменты антител (см. ниже).Chimeric antibody sequences were created based on the synthesized variable domains of antibodies B8 (1) -H6. Simultaneously with sequence synthesis, codons were optimized for expression in mammalian cells. To obtain heavy and light chains, variable domains were crosslinked with constant domains of heavy chains (TC) and light chains (LC) of human IgG1 isotype. These sequences were also optimized for codons for expression in mammalian cells. To obtain chimeric TCs and LCs, the overlap extension strategy was used, which allows two DNA fragments to be crosslinked using the PCR reaction. The PCR reaction was performed using High Fidelity PCR mix polymerase (Thermo Scientific) with a minimum number of cycles. In addition to full-sized antibodies, functional fragments of antibodies were similarly constructed (see below).
Продукты ПЦР клонировали в вектор pcDNA3.4 (Thermo Scientific). Для снижения фона при лигировании вектора со вставками вектор подвергали дефосфорилированию с использованием фосфатазы FastAP (Thermo Scientific). Бактериальные колонии скринировали с помощью ПЦР. Плазмиды выделяли набором Wizard DNA purification system kit (Promega), после чего проверяли рестрикцией. Плазмиды проверяли секвенированием, и в дальнейшей работе использовали конструкции, не содержащие ни единой нуклеотидной замены. Получение ДНК, пригодной для трансфекции, проводили с использованием набора Qiagen plasmid maxi kit c небольшими модификациями. Концентрацию и чистоту ДНК определяли по оптическому поглощению при 260 и 280 нм. Препараты стерилизовали фильтрованием через фильтры с размером пор 0.22 мкм.PCR products were cloned into pcDNA3.4 vector (Thermo Scientific). To reduce the background when ligating a vector with inserts, the vector was dephosphorylated using FastAP phosphatase (Thermo Scientific). Bacterial colonies were screened by PCR. Plasmids were isolated using the Wizard DNA purification system kit (Promega), and then checked by restriction. Plasmids were checked by sequencing, and constructs that did not contain a single nucleotide substitution were used in further work. The preparation of DNA suitable for transfection was carried out using the Qiagen plasmid maxi kit with small modifications. DNA concentration and purity were determined by optical absorption at 260 and 280 nm. The preparations were sterilized by filtration through filters with a pore size of 0.22 μm.
Для постоянной экспрессии химерных антител на основе B8(1)-H6 был создан клон-продуцент на основе клеток CHO. Получение кодирующей последовательности легкой цепи ДНК проводили методом ПЦР, с использованием праймеров, содержащих сайты клонирования в экспрессионный вектор pcDNA3.3 с измененным полилинкером (Thermo Fisher Scientific). Клонирование проводили по сайтам XbaI и NotI.For the constant expression of chimeric antibodies based on B8 (1) -H6, a clone producer based on CHO cells was created. Obtaining the coding sequence of the DNA light chain was carried out by PCR using primers containing cloning sites in the pcDNA3.3 expression vector with modified polylinker (Thermo Fisher Scientific). Cloning was performed at XbaI and NotI sites.
Клонирование тяжелой цепи осуществляли в вектор pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) с использованием рестриктных сайтов XbaI и NheI. Генетические карты полученных конструкций показаны на Рис. 4. Препараты ДНК очищали с помощью ионообменной хроматографии и использовали для трансфекции клеток DXB-11.Cloning of the heavy chain was carried out in the vector pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) using restriction sites XbaI and NheI. Genetic maps of the resulting constructs are shown in Fig. 4. DNA preparations were purified by ion exchange chromatography and used to transfect DXB-11 cells.
Введение экспрессионных конструкций в клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulser Xcell System (BioRad), с использованием смеси плазмид, несущих тяжелую и легкую цепи антитела. Спустя 48 часов после начала трансфекции проводили смену среды культивирования на бессывороточную среду, содержащую 200 мкг/мкл G418 и лишенную гипоксантина и тимидина. Культивирование продолжали в течение 20 дней, в присутствии антибиотика G418 в среде, не содержащей гипоксантина и тимидина; в течение этого периода проводили регулярное измерение клеточной плотности и жизнеспособности.The expression constructs were introduced into cells by electroporation on a Gene Pulser Xcell System (BioRad) instrument using a mixture of plasmids carrying the antibody heavy and light chains. 48 hours after the start of transfection, the culture medium was changed to serum-free medium containing 200 μg / μl G418 and lacking hypoxanthine and thymidine. Cultivation was continued for 20 days, in the presence of the antibiotic G418 in a medium not containing hypoxanthine and thymidine; during this period, regular measurements of cell density and viability were performed.
После достижения устойчивых показателей роста (жизнеспособность выше 95% и время удвоения - не более 30 часов) стабильный клеточный пул клонировали лимитирующими разведениями (1 клетка на лунку 96 луночного планшета). В среду для клонирования клеток добавляли низкие концентрации метотрексата (25нМ). Спустя еще 14 дней, позитивные по росту клеток лунки анализировали с помощью ИФА на предмет секреции рекомбинантных антител. Из 225 проанализированных колоний детектируемой экспрессией обладали 25 первичных клона. Колонии с максимальными значениями продукции масштабировали до лунок 24 луночного планшета и подвергали второму раунду амплификации с использованием 100 нМ метотрексата. Клоны с максимальными значениями продуктивности дополнительно амплифицировали при 500 нМ метотрексата, после чего повторно клонировали методом лимитирующих разведений. Полученные финальные клоны с максимальными значениями продуктивности и хорошими показателями роста масштабировали и далее культивировали в суспензионной культуре для получения препаративных количеств химерных антител.Once steady growth was achieved (viability above 95% and doubling time not more than 30 hours), the stable cell pool was cloned by limiting dilutions (1 cell per well of a 96 well plate). Low concentrations of methotrexate (25nM) were added to the cell cloning medium. After another 14 days, cell growth positive wells were analyzed by ELISA for secretion of recombinant antibodies. Of the 225 colonies analyzed, 25 primary clones had detectable expression. Colonies with maximum production values were scaled to the wells of a 24 well plate and subjected to a second round of amplification using 100 nM methotrexate. Clones with maximum productivity values were further amplified at 500 nM methotrexate, and then re-cloned by limiting dilution method. The resulting final clones with maximum productivity and good growth rates were scaled and further cultured in suspension culture to obtain preparative amounts of chimeric antibodies.
Было выбрано два финальных клона (№6 и №74), обладавших хорошими значениями удельной продуктивности и приемлемыми ростовыми характеристиками. Клоны выращивали в суспензионном состоянии, в объемах 30 мл в среде Dynamis (ThermoFisher Scientific) с использованием двух комбинаций коммерчески доступных подпиток - Cell Boost 7a и 7b (Hyclone) или Efficient Feed C+ (ThermoFisher Scientific). Ежедневно корректировали содержание глюкозы в среде и оценивали клеточную плотность и жизнеспособность. Культивирование продолжали в течение 13-14 дней и заканчивали после снижения жизнеспособности культуры ниже 60%. Кондиционированную среду осветляли центрифугированием и наносили на SDS электрофорез. Продукция антител B8(1)-H6 клоном №74 была на достаточно высоком уровне (около 30 мг/л), что позволило выделить достаточные количества антител для проведения последующих экспериментов.Two final clones (No. 6 and No. 74) were selected, which possessed good values of specific productivity and acceptable growth characteristics. Clones were grown in suspension, in 30 ml volumes in Dynamis medium (ThermoFisher Scientific) using two combinations of commercially available feeds - Cell Boost 7a and 7b (Hyclone) or Efficient Feed C + (ThermoFisher Scientific). The glucose content in the medium was adjusted daily and cell density and viability were evaluated. Cultivation was continued for 13-14 days and ended after the decline in culture viability below 60%. The conditioned medium was clarified by centrifugation and applied to SDS electrophoresis. The production of B8 (1) -H6 antibodies by clone No. 74 was at a fairly high level (about 30 mg / L), which allowed us to isolate sufficient quantities of antibodies for subsequent experiments.
Пример 2. Получение scFv- и Fab-фрагментов антитела B8(1)-H6.Example 2. Obtaining scFv and Fab fragments of antibody B8 (1) -H6.
Для экспрессии в клетках линии СНО scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в векторы для стабильной экспрессии в клетках CHO линии DXB-11, дефицитной по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR). Для Fab-фрагмента получение кодирующей последовательности легкой цепи ДНК проводили методом ПЦР; далее использовали клонирование по сайтам XbaI и NotI в экспрессионный вектор pcDNA3.3 с измененным полилинкером (Thermo Fisher Scientific). Клонирование части тяжелой цепи осуществляли в вектор pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) с использованием рестриктных сайтов XbaI и NheI. Для гена scFv-фрагмента использовали клонирование по сайтам XbaI и NotI в экспрессионный вектор pcDNA3.3. Полученные конструкции проверяли секвенированием. Препараты ДНК очищали с помощью ионообменной хроматографии и использовали для трансфекции клеток DXB-11. Введение экспрессионных конструкций в клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulser Xcell System (BioRad), с использованием смеси плазмид, несущих тяжелую и легкую цепи антитела. Спустя 48 часов после начала трансфекции проводили смену среды культивирования на бессывороточную среду, содержащую 200 мкг/мкл G418 и лишенную гипоксантина и тимидина. Культивирование продолжали 19 дней, в течение которых проводили регулярное измерение клеточной плотности и жизнеспособности. После достижения устойчивых показателей роста (жизнеспособность выше 95% и время удвоения - не более 30 часов) стабильный клеточный пул клонировали лимитирующими разведениями (1 клетка на лунку 96 луночного планшета). В среду для клонирования клеток добавляли низкие концентрации метотрексата (25нМ). Спустя еще 14 дней позитивные по росту клеток лунки анализировали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на предмет секреции фрагментов антител. Колонии с максимальными значения продукции масштабировали до 24 луночных планшетов и подвергали второму раунду амплификации с использованием 100 нМ метотрексата. Клоны с максимальными значениями продуктивности дополнительно амплифицировали при 250 и 500 нМ метотрексата, после чего повторно клонировали методом лимитирующих разведений, как описано выше.To express scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in CHO cells, the corresponding cDNAs were inserted into vectors for stable expression in the CHO cells of the DXB-11 line deficient in the dihydrofolate reductase gene (DHFR). For the Fab fragment, the coding sequence of the DNA light chain was obtained by PCR; Further, cloning at XbaI and NotI sites into the pcDNA3.3 expression vector with modified polylinker (Thermo Fisher Scientific) was used. Partial cloning of the heavy chain was carried out into the pOptiVec vector (Thermo Fisher Scientific) using the restriction sites XbaI and NheI. For the scFv fragment gene, cloning at XbaI and NotI sites into the pcDNA3.3 expression vector was used. The resulting constructs were checked by sequencing. DNA preparations were purified by ion exchange chromatography and used to transfect DXB-11 cells. The expression constructs were introduced into cells by electroporation on a Gene Pulser Xcell System (BioRad) instrument using a mixture of plasmids carrying the antibody heavy and light chains. 48 hours after the start of transfection, the culture medium was changed to serum-free medium containing 200 μg / μl G418 and lacking hypoxanthine and thymidine. Cultivation continued for 19 days, during which regular measurements of cell density and viability were performed. Once steady growth was achieved (viability above 95% and doubling time not more than 30 hours), the stable cell pool was cloned by limiting dilutions (1 cell per well of a 96 well plate). Low concentrations of methotrexate (25nM) were added to the cell cloning medium. After another 14 days, cell growth positive wells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the secretion of antibody fragments. Colonies with maximum production values were scaled to 24 well plates and subjected to a second round of amplification using 100 nM methotrexate. Clones with maximum productivity values were further amplified at 250 and 500 nM methotrexate, and then re-cloned by the method of limiting dilutions, as described above.
Полученные финальные клоны с максимальными значениями продуктивности и хорошими показателями роста масштабировали и далее культивировали в суспензионной культуре для получения препаративных количеств фрагментов антител.The resulting final clones with maximum productivity and good growth rates were scaled and further cultured in suspension culture to obtain preparative amounts of antibody fragments.
Для экспрессии в E.coli scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pET22b+ по рестриктным сайтам NdeI и XhoI. Идентичность конструкций ожидаемым была подтверждена секвенированием. Для экспрессии конструкции pET22b+/scFv и pET22b+/Fab трансформировали в штаммы E. coli Rosetta2(DE3)pLysS или HMS174(DE3)pLysS, и проводили индукцию экспрессии по стандартному протоколу, известному специалистам, в течение 4 ч при 25°С или 22 ч при 20°С. Количество, а также локализацию белка оценивали при помощи BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения тотальной фракции белка клетки E. coli, осажденные из 0.5 л культуры, тщательно ресуспендировали в 5 мл холодного лизирующего буфера (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторид (PMSF), pH 7.2) и дополнительно охлаждали в течение 15 мин на льду. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток. Полученный лизат центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин при 4°С. Осадок, содержащий клеточный дебрис, удаляли. Перевод белка в конечный буфер (фосфатный буфер (PBS), дополненный 0.02% NaN3) осуществляли центрифугированием на фильтрах Amicon Ultra-4 с диаметром пор 10 кДа.To express scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in E. coli, the corresponding cDNAs were inserted into the pET22b + vector at the NdeI and XhoI restriction sites. The identity of the constructs expected was confirmed by sequencing. To express the constructs, pET22b + / scFv and pET22b + / Fab were transformed into E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS or HMS174 (DE3) pLysS strains, and expression was induced according to the standard protocol known to specialists for 4 hours at 25 ° C or 22 hours at 20 ° C. The amount and localization of the protein was evaluated using a BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) in accordance with the manufacturer's instructions. To isolate the total protein fraction, E. coli cells precipitated from 0.5 L of culture were carefully resuspended in 5 ml of cold lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.2 ) and additionally cooled for 15 min on ice. Then the suspension was treated with ultrasound until complete destruction of the cells. The resulting lysate was centrifuged at 10,000 g for 20 min at 4 ° C. The pellet containing cell debris was removed. Protein was transferred to the final buffer (phosphate buffer (PBS) supplemented with 0.02% NaN 3 ) by centrifugation on Amicon Ultra-4 filters with a pore diameter of 10 kDa.
Для экспрессии в Pichia pastoris scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pPICZalphaB по сайтам рестрикции XhoI/NotI. При этом пропептид для секреции (альфа-фактор из Saccharomyces cerevisiae) находился в одной рамке считывания с фрагментами антител. Для отщепления альфа-фактора были предусмотрены сайты действия протеаз Kex2 (EKRE) и Ste13 (EA EA). Клонирование проводили в стандартном штамме E. coli XL1-blue, селекцию осуществляли при посеве на низко-солевую среду LB c 25 мкг/мл зеоцина. Методом электропорации трансфицировали клетки Pichia pastoris штаммов GS115 и smd1168h согласно инструкции к EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Трансформанты сеяли на среду YPDS-агар с разной концентрацией зеоцина (500-2000 мкг/мл), трансформанты вырастали на 4-5 сутки. Полученные колонии рассевали для получения отдельных клонов, которые высевали на среду BMGH в 24-луночные планшеты и инкубировали при 30°C и 200 об/мин трое суток. Затем клетки собирали центрифугированием при 1500×g и комнатной температуре, и высевали на среду BMMH в 24-луночные планшеты. После чего инкубировали при 30°C и 200 об/мин в течение 4 суток. Каждые сутки добавляли 0,5% метанола. После окончания инкубации клетки отделяли центрифугированием при 5000×g, супернатанты оставляли для анализа.To express scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in Pichia pastoris, the corresponding cDNAs were inserted into the pPICZalphaB vector at the XhoI / NotI restriction sites. Moreover, the propeptide for secretion (alpha factor from Saccharomyces cerevisiae) was in the same reading frame with antibody fragments. For cleavage of the alpha factor, protease action sites Kex2 (EKRE) and Ste13 (EA EA) were provided. Cloning was performed in a standard E. coli strain XL1-blue, selection was carried out by plating on low-salt LB medium with 25 μg / ml zeocin. Pichia pastoris cells of strains GS115 and smd1168h were transfected by electroporation according to the instructions for the EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Transformants were seeded on YPDS agar medium with different concentrations of zeocin (500-2000 μg / ml), transformants grew on 4-5 days. The resulting colonies were scattered to obtain individual clones, which were seeded on BMGH medium in 24-well plates and incubated at 30 ° C and 200 rpm for three days. Cells were then harvested by centrifugation at 1500 × g and room temperature, and plated on BMMH medium in 24-well plates. Then they were incubated at 30 ° C and 200 rpm for 4 days. Every day, 0.5% methanol was added. After incubation, the cells were separated by centrifugation at 5000 × g, supernatants were left for analysis.
Пример 3. Выделение и очистка фрагментов антител на примере экспрессии в E.coli.Example 3. Isolation and purification of antibody fragments on the example of expression in E. coli.
Для очистки scFv-фрагментов к полученным лизатам добавляли 50% суспензии Ni-NTA-агарозы и инкубировали 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Затем суспензию переносили в колонку и дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол (pH 7.2). Элюцию проводили буфером, содержащим 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол (pH 7.2).To purify scFv fragments, a 50% suspension of Ni-NTA agarose was added to the obtained lysates and incubated for 1 h at 4 ° C with gentle stirring. Then the suspension was transferred to a column and washed twice with buffer containing 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole (pH 7.2). Elution was performed with a buffer containing 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole (pH 7.2).
Для выделения и очистки Fab-фрагментов из клеточных лизатов использовали колонку с Protein L агарозой из набора реактивов HiTrap Protein L (GE Healthcare, США). После промывки и активации колонки связывающим буфером на нее наносили лизат клеток E.coli. Колонку промывали от несвязавшихся белков, затем элюировали Fab-фрагменты, используя элюирующий буфер. Очищенные фрагменты собирали в 15 мл пробирку, содержащую 750 мкл нейтрализующего буфера. Нейтрализованный раствор Fab-фрагментов переводили в фосфатный буфер (PBS), содержащий азид натрия (0.02%), центрифугированием через фильтры Amicon Ultra (максимальная пропускающая способность 100 кДа) при 1000 g в течение 20 мин.To isolate and purify Fab fragments from cell lysates, a Protein L agarose column from the HiTrap Protein L reagent kit (GE Healthcare, USA) was used. After washing and activating the column with binding buffer, an E. coli cell lysate was applied to it. The column was washed from unbound proteins, then Fab fragments were eluted using elution buffer. The purified fragments were collected in a 15 ml tube containing 750 μl of neutralization buffer. The neutralized solution of Fab fragments was transferred to phosphate buffer (PBS) containing sodium azide (0.02%) by centrifugation through Amicon Ultra filters (
Чистота полученных Fab- и scFv-фрагментов по белковому электрофорезу составила >95%. Полученные препараты были переведены в PBS, pH 7,4, и затем стерилизованы фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.The purity of the obtained Fab and scFv fragments by protein electrophoresis was> 95%. The resulting preparations were transferred to PBS, pH 7.4, and then sterilized by filtration through a 0.22 μm membrane. Protein concentration was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm.
Пример 4. Мультимеризация scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител через пегилирование.Example 4. Multimerization of scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies through pegylation.
Мультимеризация является одной из стратегий улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств фрагментов антител. Больший молекулярный размер мультимеров на основе фрагментов антител способствует увеличению периода полужизни в сыворотке, а также более быстрому поглощению опухолью за счет EPR-эффекта, что приводит к их лучшему накоплению в опухоли по сравнению с исходными IgG антителами или мономерами фрагментов. Кроме того, мультимеризация, как правило, способствует мультивалентности против антигена-мишени, которая приводит не только к более высокой аффинности благодаря эффекту авидности, но также может способствовать улучшению функциональных свойств и компенсировать отсутствие индукции вторичных иммунных функций ADCC и CDC. В случае моноклональных антител к ганглиозиду GD2 Fc-фрагмент полноразмерных антител во многом определяет побочные эффекты, и иммунные механизмы ADCC и CDC имеют ограниченный положительный терапевтический эффект. В связи с этим, создание мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител для терапии онкологических заболеваний имеет значительный потенциал.Multimerization is one of the strategies for improving the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antibody fragments. The larger molecular size of multimers based on antibody fragments increases the half-life in serum, as well as faster tumor uptake due to the EPR effect, which leads to their better accumulation in the tumor compared to the initial IgG antibodies or fragment monomers. In addition, multimerization tends to promote multivalency against the target antigen, which not only leads to higher affinity due to the avidity effect, but can also improve functional properties and compensate for the lack of induction of secondary immune functions of ADCC and CDC. In the case of monoclonal antibodies to the ganglioside GD2, the Fc fragment of full-length antibodies largely determines side effects, and the immune mechanisms of ADCC and CDC have a limited positive therapeutic effect. In this regard, the creation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies for the treatment of cancer has significant potential.
В то же время мультимеры фрагментов антител, полученные стандартными способами, такими как использование стерической агрегации, формирования цистеиновых мостиков или кроссшивающих реагентов, часто характеризуются крайне низкой стабильностью и проблемами с масштабированием, что ограничивает перспективы их использования.At the same time, multimers of antibody fragments obtained by standard methods, such as the use of steric aggregation, the formation of cysteine bridges or cross-linking reagents, are often characterized by extremely low stability and scaling problems, which limits the prospects for their use.
Одной из стратегий увеличения времени полужизни терапевтических молекул в кровотоке является увеличение гидродинамического объема молекулы путем связывания с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или другими гидрофильными полимерами. Причем только полиэтиленгликоль (ПЭГ)-производные белков одобрены FDA и другими регуляторными ведомствами для использования в медицине. Действительно, слияние или конъюгация различных пептидных молекул с полимерами существенно повышает их время полужизни, что было подтверждено экспериментально и в клинической практике.One strategy for increasing the half-life of therapeutic molecules in the bloodstream is to increase the hydrodynamic volume of the molecule by binding to inert polymers such as polyethylene glycol or other hydrophilic polymers. Moreover, only polyethylene glycol (PEG) derivatives of proteins are approved by the FDA and other regulatory agencies for use in medicine. Indeed, the fusion or conjugation of various peptide molecules with polymers significantly increases their half-life, which was confirmed experimentally and in clinical practice.
Для усиления терапевтического потенциала фрагментов GD2-специфичных антител и улучшения их фармакокинетических свойств авторами было использовано сайт-направленное пегилирование, целью которого было не только увеличение времени циркуляции фрагментов в крови, но и усиление цитотоксических свойств за счет получения стабильных мультимеров фрагментов GD2-специфичных антител. Для получения ди-, три- и тетрамеров фрагментов антител использовали стандартные реагенты ПЭГ-малеимид-2 и ПЭГ-малеимид-4 (JenKem Technology USA, США https://www.jenkemusa.com). Использованные производные ПЭГ позволяют присоединять к одной молекуле ПЭГ несколько (от 1 до 4) молекул фрагментов. Схемы реакций пегилирования представлены на Рис. 5.To enhance the therapeutic potential of fragments of GD2-specific antibodies and improve their pharmacokinetic properties, the authors used site-directed pegylation, the purpose of which was not only to increase the circulation time of fragments in the blood, but also to enhance cytotoxic properties by obtaining stable multimers of fragments of GD2-specific antibodies. To obtain di-, tri- and tetramers of antibody fragments, standard reagents PEG-maleimide-2 and PEG-maleimide-4 were used (JenKem Technology USA, USA https://www.jenkemusa.com). The used PEG derivatives make it possible to attach several (from 1 to 4) fragment molecules to one PEG molecule. Pegylation reaction schemes are shown in Fig. 5.
Для проведения реакции пегилирования scFv- и Fab-фрагментов моноклональных антител к раствору фрагментов (2.5 мг/мл) в буфере для пегилирования (20 mM фосфатный буфер, с добавлением 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.5) добавляли стоковый раствор 15 mM TCEP до достижения конечной концентрации TCEP 0.1 mM. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 90 мин при аккуратном перемешивании. От восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4 (максимальная пропускающая способность 10 кДа), либо используя колонки для высаливания Zeba Desalting Columns (TermoFisher, США). Затем к раствору фрагментов антител добавляли соответствующие растворы малеимид-ПЭГ, в различных соотношениях. Инкубация длилась 16-18 ч при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием на шейкере. Эффективность пегилирования оценивали с помощью ПААГ-электрофореза. После подбора оптимальных условий проведения пегилирования выход реакций составлял не менее 90%.To carry out the pegylation reaction of scFv and Fab fragments of monoclonal antibodies to a solution of fragments (2.5 mg / ml) in a pegylation buffer (20 mM phosphate buffer, with the addition of 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.5), a stock solution of 15 mM TCEP was added until a final TCEP concentration of 0.1 mM is reached. Incubation was carried out at room temperature for 90 min with gentle stirring. The reducing agent was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters (
Для разделения полученных пегилированных фрагментов и получения чистых фракций, содержащих индивидуальные моно- и мультимеры фрагментов антител, проводили хроматографическую очистку с использованием анионообменной хроматографии или гель-фильтрации.To separate the obtained pegylated fragments and obtain pure fractions containing individual mono- and multimers of antibody fragments, chromatographic purification was carried out using anion exchange chromatography or gel filtration.
В одном из вариантов, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования фрагментов антител проводили катионообменную хроматографию на колонке TSK-GEL SP-5PW с использованием ВЭЖХ-системы Beckman System gold, подвижная фаза: элюирующий буфер (25 мМ CH3COOH, pH 4.0), линейный градиент 0 mM - 250 mM NaCl (в течение 90 мин при комнатной температуре, скорость потока 1 мл/мин).In one embodiment, to separate the obtained products of the pegylation reactions of antibody fragments, cation exchange chromatography was performed on a TSK-GEL column SP-5PW using an Beckman System gold HPLC system, mobile phase: elution buffer (25 mM CH 3 COOH, pH 4.0),
Альтернативно, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования использовали гель-фильтрацию (эксклюзионную хроматографию) - колонку Superdex 200 10/30 GL и элюент PBS, пропущенный через фильтр 0.22 мкм. Скорость потока 0.6 мл/мин.Alternatively, gel filtration (size exclusion chromatography) was used to separate the resulting pegylation reaction products — a Superdex 200 10/30 GL column and a PBS eluent passed through a 0.22 μm filter. Flow rate 0.6 ml / min.
Пример 5. Определение антиген-связывающих свойств GD2-специфичных антител B8(1)-H6, scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 и мультимерных фрагментов антител B8(1)-H6.Example 5. Determination of the antigen-binding properties of GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 and multimeric fragments of antibodies B8 (1) -H6.
Изучение антиген-связывающих свойств полученных GD2-специфичных молекул на основе антител B8(1)-H6 проводили методами проточной цитофлуориметрии (Рис. 6) и иммуноферментного анализа (ИФА) (Рис. 7). The antigen-binding properties of the obtained GD2-specific molecules based on antibodies B8 (1) -H6 were studied by flow cytofluorimetry (Fig. 6) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Fig. 7).
Рекомбинантные GD2-специфичные антитела B8(1)-H6, а также scFv-фрагменты антител B8(1)-H6 и их модифицированные производные проявили способность специфически взаимодействовать с ганглиозидом GD2. Так, при окрашивании GD2-позитивной линии EL-4 антителами B8(1)-H6 и фрагментами антител наблюдалось значимое увеличение интенсивности флуоресценции клеток по сравнению с контрольными клетками, к которым были добавлены только вторичные антивидовые антитела. GD2-негативные клетки линии NGP не связывались с молекулами на основе GD2-специфичного антитела B8(1)-H6 (Рис. 6).Recombinant GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, as well as scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 and their modified derivatives showed the ability to specifically interact with the ganglioside GD2. So, when staining the GD2-positive EL-4 line with B8 (1) -H6 antibodies and antibody fragments, a significant increase in the fluorescence intensity of cells was observed in comparison with control cells to which only secondary antispecies antibodies were added. GD2-negative cells of the NGP line did not bind to molecules based on the GD2-specific antibody B8 (1) -H6 (Fig. 6).
Аналогично, в ИФА было показано дозо-зависимое увеличение интенсивности развития пероксидазной реакции при добавлении последовательных разведений GD2-специфичных антител B8(1)-H6 и scFv- фрагментов антител B8(1)-H6 к сорбированному на подложке ганглиозиду GD2. Было показано отсутствие кросс-реактивности использованных соединений к ганглиозидам GD3 и GD1b, которые являются структурно схожими с ганглиозидом GD2 (Рис. 7).Similarly, ELISA showed a dose-dependent increase in the intensity of the development of peroxidase reaction with the addition of successive dilutions of GD2-specific antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 to the ganglioside GD2 adsorbed on the substrate. The absence of cross-reactivity of the compounds used to the gangliosides GD3 and GD1b, which are structurally similar to the ganglioside GD2 (Fig. 7), was shown.
Также оценка связывания различных фрагментов GD2-специфичных антител показала, что пегилирование с образованием мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител показывало значимое увеличение связывания с антигеном (почти в 2 раза по сравнению с мономерным scFv-фрагментом), что подтверждалось как методом ИФА (рис. 2 В, Г), так и окрашиванием GD2-позитивных опухолевых линий с последующей оценкой на проточном цитофлуориметре (Рис. 6).Evaluation of the binding of various fragments of GD2-specific antibodies showed that pegylation with the formation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies showed a significant increase in antigen binding (almost 2 times as compared to the monomeric scFv fragment), which was confirmed by ELISA (Fig. 2 C, D), as well as staining of GD2-positive tumor lines with subsequent evaluation using a flow cytometer (Fig. 6).
Пример 6. Получение конъюгатов GD2-специфичных антител B8(1)-H6 и scFv- фрагментов антител B8(1)-H6 с биотином и пероксидазой хрена (HRP).Example 6. Obtaining conjugates of GD2-specific antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 with biotin and horseradish peroxidase (HRP).
Полученные GD2-специфичные антитела можно использовать для определения ганглиозида GD2, локализованного на поверхности опухолевых клеток, а также в сыворотке крови больных с GD2-позитивными онкологическими заболеваниями. Для сокращения стадий детектирования ганглиозида GD2, повышения чувствительности метода, а также снижения неспецифического связывания антител была проведена модификация антител и фрагментов для получения биотин- и HRP-меченных антител B8(1)-H6 и их scFv-фрагментов.The obtained GD2-specific antibodies can be used to determine the GD2 ganglioside located on the surface of tumor cells, as well as in the blood serum of patients with GD2-positive oncological diseases. To reduce the stages of detection of the ganglioside GD2, increase the sensitivity of the method, and also reduce non-specific binding of antibodies, we modified antibodies and fragments to obtain biotin and HRP-labeled antibodies B8 (1) -H6 and their scFv fragments.
Биотинилирование антител B8(1)-H6 проводили с использованием биотин-сукцинимида (Termo Scientific, США). К раствору антител с концентрацией 2 мг/мл в боратном буфере, рН 9.0, добавляли биотин-сукцинимид в двух весовых соотношениях антитело:биотин - 1:0.1 и 1:0.05. После инкубации в течение 4 ч добавляли NH4Cl (10 мкл 1М NH4Cl на 100 мкг эфира) и проводили диализ против PBS в течение 24 ч. Для оценки эффективности прохождения реакции биотинилирования антител B8(1)-H6 использовали методы проточной цитофлуориметрии и ИФА (Рис. 8).Biotinylation of antibodies B8 (1) -H6 was performed using biotin-succinimide (Termo Scientific, USA). To a solution of antibodies with a concentration of 2 mg / ml in borate buffer, pH 9.0, biotin-succinimide was added in two weight ratios of antibody: biotin - 1: 0.1 and 1: 0.05. After an incubation of 4 hours, NH4Cl was added (10 μl of 1M NH4Cl per 100 μg of ether) and dialysis against PBS was performed for 24 hours. Flow cytofluorimetry and ELISA were used to evaluate the effectiveness of the biotinylation reaction of antibodies B8 (1) -H6 (Fig. 8).
Биотинилирование scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 проводили с использованием биотин-малеимида (Termo Scientific, США). К раствору фрагментов антител с концентрацией 2 мг/мл в фосфатном буфере, рН 6.0, содержащем 100 мМ EDTA, добавляли восстановитель TCEP до конечной концентрации 0.5 мМ. После инкубации в течение 1.5 ч от восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4, либо используя колонки для высаливания. Затем к раствору фрагментов антител добавляли биотин-малеимид в 4-х кратном молярном избытке. Инкубация длилась 18 ч при 4°С с аккуратным перемешиванием на шейкере, после чего от не связавшегося биотин-малеимид избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4. Для оценки эффективности прохождения реакции биотинилирования scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 использовали методы проточной цитофлуориметрии и ИФА (Рис. 8).Biotinylation of scFv fragments of B8 (1) -H6 antibodies was performed using biotin-maleimide (Termo Scientific, USA). To a solution of antibody fragments with a concentration of 2 mg / ml in phosphate buffer, pH 6.0, containing 100 mM EDTA, TCEP reducing agent was added to a final concentration of 0.5 mM. After incubation for 1.5 h, the reducing agent was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters, or using salting out columns. Then, biotin-maleimide in a 4-fold molar excess was added to the solution of antibody fragments. Incubation lasted 18 hours at 4 ° С with gentle stirring on a shaker, after which the unbound biotin-maleimide was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters. To evaluate the effectiveness of the biotinylation reaction of scFv fragments of B8 (1) -H6 antibodies, flow cytometry and ELISA were used (Fig. 8).
Для оценки свойств биотинилированных антител B8(1)-H6 и scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 использовали GD2-позитивные клетки мышиной лимфомы EL-4. Клетки инкубировали с биотинилированными и немечеными антителами и фрагментами в течение 1 ч, а затем с антивидовыми FITC-меченными антителами или стрептавидин-FITC в случае полноразмерных антител, либо с FITC-меченными анти-FLAG антителами или стрептавидин-FITC в случае фрагментов антител в течение 1 часа. Измерения проводили на проточном цитофлуриметре (EpicsCoulter XL). Результаты эксперимента представлены на Рис. 8.To evaluate the properties of biotinylated antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6, GD2-positive cells of murine lymphoma EL-4 were used. Cells were incubated with biotinylated and unlabeled antibodies and fragments for 1 h, and then with anti-species FITC-labeled antibodies or streptavidin-FITC in the case of full-length antibodies, or with FITC-labeled anti-FLAG antibodies or streptavidin-FITC in the case of antibody fragments for 1 hour Measurements were taken on a flow cytometer (EpicsCoulter XL). The experimental results are presented in Fig. 8.
В случае полноразмерных антител B8(1)-H6 биотинилирование привело к сравнимому сигналу флуоресценции клеток инкубированных с немечеными и биотинилированными антителами с последующим окрашиванием клеток антивидовыми FITC-меченными антителами или стрептавидин-FITC, соответственно. Данные результаты говорят об эффективном прохождении реакции биотинилирования антител B8(1)-H6.In the case of full-length B8 (1) -H6 antibodies, biotinylation resulted in a comparable fluorescence signal for cells incubated with unlabeled and biotinylated antibodies, followed by staining of the cells with antivisual FITC-labeled antibodies or streptavidin-FITC, respectively. These results indicate the effective passage of the biotinylation reaction of antibodies B8 (1) -H6.
При использовании биотинилированных scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 и FITC-меченного стрептавидина было зарегистрировано значительное усиление сигнала флуоресценции клеток по сравнению с окрашиванием клеток немодифицированными scFv-фрагментами и анти-FLAG антителами (Рис. 8А).Using biotinylated scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 and FITC-labeled streptavidin, a significant increase in cell fluorescence signal was recorded compared to staining of cells with unmodified scFv fragments and anti-FLAG antibodies (Fig. 8A).
Также эффективность реакции биотинилирования оценивалась методом ИФА. Проведение анализа было аналогично вышеописанной методике. Использование пары биотин-меченные антитела B8(1)-H6 и стрептавидин-HRP также позволило детектировать минимальные значения сорбированного ганглиозида GD2 (Рис. 8 Б), а в случае определения ганглиозида GD2 scFv-фрагментами битинилирование позволило существенно усилить детекцию сигнала (Рис. 8В).The effectiveness of the biotinylation reaction was also evaluated by ELISA. The analysis was similar to the method described above. Using a pair of biotin-labeled antibodies B8 (1) -H6 and streptavidin-HRP also allowed us to detect the minimum values of the adsorbed ganglioside GD2 (Fig. 8 B), and in the case of determining the ganglioside GD2 by scFv fragments, bitinylation significantly increased signal detection (Fig. 8B )
Мечение антител B8(1)-H6 и scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 пероксидазой хрена.Labeling of antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 with horseradish peroxidase.
Конъюгацию антител B8(1)-H6 проводили с использованием набора реагентов EZ-link Plus activated peroxidase kit (Thermo Scientific, США), содержащих аминореактивную пероксидазу хрена, согласно инструкции производителя. Для конъюгации 1 мг антител B8(1)-H6 переводили в бикарбонатный буфер, pH 9.4, гельфильтрацией, используя колонку Zeba (Thermo Scientific, США). Растворяли 1 мг лиофилизированной EZ-link Plus активированной пероксидазы в 100 мкл ddH2O и добавляли к раствору антител. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением цианоборгидрида натрия. Затем проводили диализ против PBS в течение 24 ч.B8 (1) -H6 antibodies were conjugated using the EZ-link Plus activated peroxidase kit (Thermo Scientific, USA) containing the amine reactive horseradish peroxidase according to the manufacturer's instructions. For conjugation, 1 mg of B8 (1) -H6 antibodies was transferred to bicarbonate buffer, pH 9.4, by gel filtration using a Zeba column (Thermo Scientific, USA). 1 mg of lyophilized EZ-link Plus activated peroxidase was dissolved in 100 μl of ddH2O and added to the antibody solution. After incubation for 1 h at room temperature, the reaction was stopped by the addition of sodium cyanoborohydride. Then dialysis against PBS was performed for 24 hours.
Активность полученных HRP-меченных антител B8(1)-H6 определяли, используя метод ИФА, по методике, описанной выше. В качестве контроля использовали немеченые антитела B8(1)-H6 с последующим добавлением вторичных антител anti-human Fc-specific-HRP. Результаты представлены на Рис. 9.The activity of the obtained HRP-labeled antibodies B8 (1) -H6 was determined using the ELISA, according to the method described above. As a control, unlabeled B8 (1) -H6 antibodies were used, followed by the addition of secondary anti-human Fc-specific-HRP antibodies. The results are presented in Fig. nine.
Конъюгацию scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 проводили с использованием набора реагентов EZ-Link™ Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Thermo Scientific, США), содержащих пероксидазу хрена, модифицированную малеимидными группами (HRP-малеимид), согласно инструкции производителя. К раствору фрагментов антител с концентрацией 2 мг/мл в фосфатном буфере, рН 6.0, содержащем 100 мМ EDTA, добавляли восстановитель TCEP до конечной концентрации 0.5 мМ. После инкубации в течение 1.5 ч от восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4, либо используя колонки для высаливания. Затем к раствору фрагментов антител добавляли HRP-малеимид в 4-х кратном молярном избытке. Инкубация длилась 18 ч при 4°С с аккуратным перемешиванием на шейкере, после чего от не связавшегося HRP-малеимид избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4.Conjugation of scFv fragments of B8 (1) -H6 antibodies was performed using the EZ-Link ™ Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit reagent kit (Thermo Scientific, USA) containing horseradish peroxidase modified with maleimide groups (HRP-maleimide), according to the manufacturer's instructions. To a solution of antibody fragments with a concentration of 2 mg / ml in phosphate buffer, pH 6.0, containing 100 mM EDTA, TCEP reducing agent was added to a final concentration of 0.5 mM. After incubation for 1.5 h, the reducing agent was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters, or using salting out columns. Then, HRP-maleimide in a 4-fold molar excess was added to the solution of antibody fragments. The incubation lasted 18 hours at 4 ° С with gentle stirring on a shaker, after which the unbound HRP-maleimide was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters.
Активность полученных HRP-меченных scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 определяли, используя метод ИФА, по методике описанной выше. В качестве контроля использовали немеченые scFv-фрагменты антител B8(1)-H6 с последующим добавлением вторичных антител anti-FLAG-HRP. Результаты представлены на Рис. 9Б.The activity of the obtained HRP-labeled scFv fragments of B8 (1) -H6 antibodies was determined using the ELISA method as described above. Unlabeled scFv fragments of B8 (1) -H6 antibodies were used as a control followed by the addition of secondary anti-FLAG-HRP antibodies. The results are presented in Fig. 9B.
Из Рис. 9 видно, что мечение антител B8(1)-H6 и scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 пероксидазой хрена не привело к потере аффинности связывания с антигеном и при этом позволило сократить количество стадий метода ИФА по определению ганглиозида GD2.From Fig. Figure 9 shows that the labeling of antibodies B8 (1) -H6 and scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 with horseradish peroxidase did not lead to a loss of binding affinity for the antigen, and at the same time, the number of steps of the ELISA method for determining the GD2 ganglioside was reduced.
Пример 7. Определение ганглиозида GD2 в сыворотке крови пациентов с нейробластомой с использованием антител B8(1)-H6.Example 7. Determination of ganglioside GD2 in the blood serum of patients with neuroblastoma using antibodies B8 (1) -H6.
Наличие ганглиозида GD2 в сыворотке крови с использованием немеченых, биотинилированных и HRP-меченных GD2-специфичных антител B8(1)-H6 было проведено методами дот-блота и ИФА. В экспериментальной сыворотке с экзогенно добавленным ганглиозидом и в сыворотке крови пациента с нейробластомой было зафиксировано наличие GD2, в отличие от контрольной сыворотки здорового донора при использовании биотинилированных и HRP-меченных GD2-специфичных антител B8(1)-H6. Окрашивание мембраны при использовании немеченых антител B8(1)-H6 с последующей инкубацией с антителами anti-human Fc-specific-HRP привело к развитию пероксидазной реакции во всех сыворотках, что было обусловлено связыванием вторичных anti-human Fc-specific-HRP антител с различными антителами, содержащимися в сыворотках крови (Рис. 10).The presence of ganglioside GD2 in serum using unlabeled, biotinylated and HRP-labeled GD2-specific antibodies B8 (1) -H6 was carried out by dot blot and ELISA. The presence of GD2 was detected in experimental serum with exogenously added ganglioside and in the blood serum of a patient with neuroblastoma, in contrast to the control serum of a healthy donor using biotinylated and HRP-labeled GD2-specific antibodies B8 (1) -H6. Membrane staining using unlabeled B8 (1) -H6 antibodies, followed by incubation with anti-human Fc-specific-HRP antibodies, led to the development of a peroxidase reaction in all sera, which was due to the binding of secondary anti-human Fc-specific-HRP antibodies to various antibodies contained in blood serum (Fig. 10).
Аналогичная картина наблюдалась в ИФА (Рис. 11). После сорбции трех вариантов сывороток, в различных разведениях в течение 2 ч проводилась стандартная методика ИФА с использованием немеченых, биотинилированных и HRP-меченных GD2-специфичных антител B8(1)-H6.A similar pattern was observed in ELISA (Fig. 11). After sorption of three serum variants, in different dilutions for 2 h, the standard ELISA was performed using unlabeled, biotinylated and HRP-labeled GD2-specific antibodies B8 (1) -H6.
Из представленных данных видно, что биотинилированные и HRP-меченные антитела B8(1)-H6 можно использовать для определения ганглиозида GD2 в сыворотках крови пациентов с GD2-позитивными онкологическими заболеваниями, в частности с нейробластомой.The data presented show that biotinylated and HRP-labeled B8 (1) -H6 antibodies can be used to determine the GD2 ganglioside in the blood serum of patients with GD2-positive oncological diseases, in particular, with neuroblastoma.
Пример 8. Иммуногистохимия биопсийного материала пациентов.Example 8. Immunohistochemistry of biopsy material of patients.
Из биопсийного материала нейробластомы, саркомы и рака эндометрия, замороженного в жидком азоте, получали срезы толщиной 5 мкм на криотоме HM550 MVP, Thermo. Стекла со срезами держали при комнатной температуре 30 мин, затем фиксировали холодным ацетоном и окрашивали с помощью непрямого иммунопероксидазного метода. Для блокирования внутренней пероксидазной активности срезы инкубировали в течение 30 мин в 3% перекиси водорода. После отмывок в PBS, содержащем 0,1% Tween-20, блокировали неспецифическое связывание с антигеном, инкубируя срезы в PBS, содержащем 0,1% Tween-20 и 5% человеческой сыворотки, а затем инкубировали с биотинилированными GD2-специфическими антителами 14G2a и B8(1)-Н6, после чего проводили инкубацию с HRP-меченным стрептавидином. Реакцию проявляли реактивом TMB 1-Step Solution (Thermo). Срезы контрастировали гематоксилином и эозином, после чего их покрывали мовиолом (Mowiol), накрывали покровным стеклом и запаивали. Визуализацию изображений проводили на микроскопе Zeiss Axiovert 40. Результаты иммуногистохимических экспериментов представлены в Таблице 2.From biopsy material of neuroblastoma, sarcoma, and endometrial cancer frozen in liquid nitrogen, 5 μm thick sections were obtained on the cryotome HM550 MVP, Thermo. Slice glasses were kept at room temperature for 30 minutes, then fixed with cold acetone and stained using the indirect immunoperoxidase method. To block internal peroxidase activity, sections were incubated for 30 min in 3% hydrogen peroxide. After washing in PBS containing 0.1% Tween-20, nonspecific binding to the antigen was blocked by incubating sections in PBS containing 0.1% Tween-20 and 5% human serum, and then incubated with biotinylated GD2-specific antibodies 14G2a and B8 (1) -H6, followed by incubation with HRP-labeled streptavidin. The reaction was performed with TMB 1-Step Solution (Thermo). Sections were contrasted with hematoxylin and eosin, after which they were covered with Mowiol, covered with a coverslip and sealed. Image visualization was performed on a
Таблица 2.Table 2.
Обозначения в Таблице 2: +++ - сильное положительное окрашивание, ++ - положительное окрашивание, + слабое положительное окрашивание, - отсутствие окрашивания.The notations in Table 2: +++ - strong positive staining, ++ - positive staining, + weak positive staining, - lack of staining.
Использованные антитела B8(1)-Н6 показали избирательное окрашивание биопсийного материала опухолей различного происхождения. В случае срезов нейробластомы антитела показали сильное положительное или положительное окрашивание, срезы саркомы характеризовались слабым развитием реакции, а срезы рака эндометрия не окрашивались антителами B8(1)-Н6. Аналогичная картина была характерна для GD2-специфичных антител 14G2a, которые широко используются для определения ганглиозида GD2 методом иммуногистохимии. Исходя из этих данных можно заключить, что антитела B8(1)-Н6 могут применяться для определения GD2 в биопсийных образцах онкологических больных.Used antibodies B8 (1) -H6 showed selective staining of biopsy material of tumors of various origins. In the case of sections of a neuroblastoma, antibodies showed strong positive or positive staining, sections of the sarcoma were characterized by a weak development of the reaction, and sections of endometrial cancer were not stained with B8 (1) -H6 antibodies. A similar picture was characteristic of GD2-specific antibodies 14G2a, which are widely used to determine the ganglioside GD2 by immunohistochemistry. Based on these data, it can be concluded that antibodies B8 (1) -H6 can be used to determine GD2 in biopsy samples of cancer patients.
Пример 9. Прямая цитотоксическая активность GD2-специфичных антител B8(1)-H6, scFv-фрагментов антител B8(1)-H6 и мультимерных фрагментов антител B8(1)-H6.Example 9. Direct cytotoxic activity of GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6 and multimeric fragments of antibodies B8 (1) -H6.
Сравнительная оценка цитотоксических эффектов, индуцируемых антителами и фрагментами GD2-специфичных антител, проводилась с использованием нескольких классических подходов. В качестве клеточной модели исследования была использована линия мышиной лимфомы EL-4, которая характеризуется гиперэкспрессией ганглиозида GD2. A comparative assessment of the cytotoxic effects induced by antibodies and fragments of GD2-specific antibodies was carried out using several classical approaches. As the cell model of the study, the mouse lymphoma line EL-4 was used, which is characterized by overexpression of the ganglioside GD2.
МТТ тест проводили с использованием стандартной колориметрической процедуры. При этом клетки GD2-позитивных опухолевых линий инкубировали в 96-луночных планшетах с последовательными разведениями GD2-специфических антител и их фрагментов в течение 72 ч, затем центрифугировали (8 мин, 300 g), осадок суспендировали и добавляли по 30 мкл/лунка раствора MTT (5 мг/мл в PBS). После выпадения кристаллов формазана (2-4 ч) его растворяли добавлением 100 мкл DMSO. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре для планшетов Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм.The MTT test was performed using a standard colorimetric procedure. At the same time, GD2-positive tumor line cells were incubated in 96-well plates with serial dilutions of GD2-specific antibodies and their fragments for 72 hours, then centrifuged (8 min, 300 g), the pellet was suspended and 30 μl / well of MTT solution was added (5 mg / ml in PBS). After crystals of formazan precipitated (2-4 h), it was dissolved by adding 100 μl of DMSO. Optical absorption was measured on a Multiscan FC plate spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) at a wavelength of 540 nm.
Оценка клеточной гибели в PI-тестеCell death assessment in the PI test
Окрашивание пропидиум иодидом (PI) проводили по общепринятой методике. Вкратце, после окончания инкубации с GD2-специфичными антителами и их фрагментами в течение 24 ч, клетки EL-4 осаждали, фиксировали ледяным 70% EtOH в течение 1 ч при 4°С, дважды отмывали в PBS (300 g, 10 мин, 4°C). Затем клетки ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (PBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 10 мкг/мл РНКазы). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). В каждом образце регистрировали не менее 1×104 клеток. На гистограммах клетки с фрагментированной ДНК, дифференцировали от нормальных клеток по более низкой интенсивности флуоресценции. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.Staining with propidium iodide (PI) was carried out according to standard methods. Briefly, after incubation with GD2-specific antibodies and their fragments for 24 h, EL-4 cells were besieged, fixed with ice-cold 70% EtOH for 1 h at 4 ° C, washed twice in PBS (300 g, 10 min, 4 ° C). Then the cells were resuspended in a DNA staining solution (PBS containing 20 μg / ml PI and 10 μg / ml RNase). The measurements were carried out on an EPICS ELITE flow cytometer (Coulter, USA). At least 1 × 10 4 cells were recorded in each sample. On histograms, cells with fragmented DNA were differentiated from normal cells by lower fluorescence intensities. The results were processed using the WinMDI program.
Оценку проницаемости плазматической мембраны клеток проводили с помощью флуоресцентного ДНК-красителя 7-AAD. Перед окрашиванием клетки однократно отмывали в PBS и к осадку добавляли 0.5 мл раствора 7-AAD (2 мкг/мл). Флуоресценцию клеток регистрировали цитофлуориметрически. В каждом образце регистрировали не менее 1×104 клеток. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.The permeability of the plasma membrane of cells was assessed using 7-AAD fluorescent DNA dye. Before staining, cells were washed once in PBS and 0.5 ml of 7-AAD solution (2 μg / ml) was added to the pellet. Cell fluorescence was recorded cytofluorimetrically. At least 1 × 10 4 cells were recorded in each sample. The results were processed using the WinMDI program.
На Рис. 12 представлены данные цитотоксической активности GD2-специфичных антител B8(1)-H6, scFv- и ди-scFv-фрагментов антител B8(1)-H6.In Fig. 12 shows the cytotoxic activity of GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, scFv and di-scFv fragments of antibodies B8 (1) -H6.
Как видно из. Рис. 12А в МТТ-тесте жизнеспособность клеток EL-4 под действием GD2-связывающих молекул падала в дозозависимой манере. Наибольшей цитотоксической активностью обладали полноразмерные GD2-специфические антитела, так при максимальной концентрации антител жизнеспособность опухолевых клеток падала на 60%. Воздействие scFv-фрагментов оказывало меньший эффект, снижая жизнеспособность клеток только на 25%, а пегилированные димеры scFv-фрагментов обладали значительно большим цитотоксическим эффектом, который приближался к действию полноразмерных антител B8(1)-H6 (Рис. 12Б).As can be seen from. Fig. 12A in the MTT assay, the viability of EL-4 cells under the influence of GD2-binding molecules fell in a dose-dependent manner. Full-sized GD2-specific antibodies had the highest cytotoxic activity, so at the maximum antibody concentration, tumor cell viability decreased by 60%. The effect of scFv fragments had a smaller effect, reducing cell viability by only 25%, and the pegylated dimers of scFv fragments had a significantly greater cytotoxic effect, which was close to the action of full-sized antibodies B8 (1) -H6 (Fig. 12B).
Методом проточной цитофлуориметрии в PI- и 7AAD-тестах было также показано, что инкубация клеток с scFv-фрагментами приводила к незначительному увеличению количества клеток с фрагментированной ДНК и клеток с нарушением целостности плазматической мембраны относительно интактных клеток, в то время как пегилированные димеры scFv-фрагментов характеризовались большими цитотоксическими эффектами по отношению к GD2-позитивным опухолевым клеткам линии EL-4.It was also shown by flow cytometry in PI and 7AAD tests that incubation of cells with scFv fragments led to a slight increase in the number of cells with fragmented DNA and cells with impaired plasma membrane integrity relative to intact cells, while pegylated dimers of scFv fragments characterized by large cytotoxic effects in relation to GD2-positive tumor cells of the EL-4 line.
Полученные данные говорят о том, что GD2-специфичные антитела B8(1)-H6, а также их scFv-фрагменты обладают прямой цитотоксической активностью по отношению к GD2-позитивным опухолевым клеткам, что может служить существенным вкладом в противоопухолевые эффекты при использовании данных соединений в иммунотерапии GD2-позитивных заболеваний.The data obtained indicate that GD2-specific antibodies B8 (1) -H6, as well as their scFv fragments, have direct cytotoxic activity against GD2-positive tumor cells, which can serve as a significant contribution to the antitumor effects when using these compounds in immunotherapy of GD2-positive diseases.
Пример 10. Оценка антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности антител B8(1)-H6.Example 10. Evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity of antibodies B8 (1) -H6.
В качестве клеток мишеней использовали GD2-позитивную клеточную линию EL-4. До проведения теста клетки линии EL-4 окрашивали флуоресцентным красителем calcein AM Molecular Probes (Eugene, USA). Для этого клетки EL-4 переводили в полную ростовую среду DMEM с концентрацией 4 млн/мл и добавляли calcein AM до концентрации 10 мкМ. После инкубации в течение 30 мин при 37°С клетки три раза отмывали и ресуспендировали в полной среде в концентрации необходимой для проведения теста. В качестве эффекторных клеток использовали NK-клетки человека. Клетки периферических мононуклеаров выделяли из крови здоровых доноров по стандартной методике на градиенте фиколла. Фракцию периферических мононуклеаров дважды отмывали и ресуспендировали в буфере для сепарации. Выделения NK-клеток из периферических мононуклеаров проводили при помощи метода отрицательной магнитной сепарации с использованием набора для изоляции NK-клеток (Miltenyi Biotec, Германия). Сепарацию осуществляли при помощи колонки и магнита (MACS Columns and MACS Separator, Miltenyi Biotech, Германия). Чистота выделения NK-клеток составляла не менее 97%.As target cells, a GD2-positive EL-4 cell line was used. Prior to the test, cells of the EL-4 line were stained with calcein AM Molecular Probes fluorescent dye (Eugene, USA). For this, EL-4 cells were transferred to complete DMEM growth medium at a concentration of 4 million / ml and calcein AM was added to a concentration of 10 μM. After incubation for 30 min at 37 ° C, the cells were washed three times and resuspended in complete medium at the concentration necessary for the test. Human effector cells were used as effector cells. Cells of peripheral mononuclear cells were isolated from the blood of healthy donors according to the standard method on the ficoll gradient. The peripheral mononuclear fraction was washed twice and resuspended in the separation buffer. NK cells were isolated from peripheral mononuclear cells using the negative magnetic separation method using an NK cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Germany). Separation was carried out using a column and a magnet (MACS Columns and MACS Separator, Miltenyi Biotech, Germany). The purity of the selection of NK cells was at least 97%.
Оценку клеточно-опосредованной цитотоксичности антител B8(1)-H6 на клетках EL-4 проводили с использованием модифицированного метода высвобождения кальцеина [Lichtenfels et al., 1994; Neri et al., 2001]. Мембранно-проницаемый краситель calcein-AM при проникновении в клетку за счет активности внутриклеточных эстераз расщепляется до зеленого флуоресцентного красителя кальцеина. В результате лизиса клеток мишеней флуоресцентный краситель высвобождается в среду культивирования и интенсивность ее флуоресценции отражает уровень антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.Evaluation of the cell-mediated cytotoxicity of B8 (1) -H6 antibodies on EL-4 cells was performed using a modified calcein release method [Lichtenfels et al., 1994; Neri et al., 2001]. The membrane-permeable dye calcein-AM, when penetrated into the cell due to the activity of intracellular esterases, is cleaved to a green fluorescent dye calcein. As a result of lysis of target cells, the fluorescent dye is released into the culture medium and the intensity of its fluorescence reflects the level of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.
При проведении теста calcein-AM-меченные клетки EL-4 рассевали в лунки 96-луночного планшета и добавляли серийные разведения антител B8(1)-H6. После инкубации с антителами к клеткам мишеням добавляли эффекторные клетки и продолжали инкубацию в течение 3-х часов. Соотношение клеток-мишеней и эффекторных клеток составляло 1:2. После инкубации клетки осаждали центрифугированием, собирали супернатант и измеряли интенсивность флуоресценции на планшетном спектрофлуориметре Glomax (Promega, США) при λвозб. = 490 нм и λ исп. = 510-570 нм.In the test, calcein-AM-labeled EL-4 cells were scattered into the wells of a 96-well plate and serial dilutions of B8 (1) -H6 antibodies were added. After incubation with antibodies to the target cells, effector cells were added and the incubation continued for 3 hours. The ratio of target cells and effector cells was 1: 2. After incubation, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was collected and the fluorescence intensity was measured on a Glomax plate spectrofluorimeter (Promega, USA) at λexcitation. = 490 nm and λ isp. = 510-570 nm.
Эффективность клеточно-опосредованной цитотоксичности антител определялась по формуле: % ADCC = 100*(MFI образца - MFI AICC)/(MFI максимального высвобождения красителя - MFI спонтанного высвобождения красителя).The efficiency of cell-mediated antibody cytotoxicity was determined by the formula:% ADCC = 100 * (MFI Sample — MFI AICC) / (MFI Maximum Dye Release — MFI Spontaneous Dye Release).
Где MFI - средняя интенсивность флуоресценции, AICC - антитело независимое высвобождение образца, MFI AICC определяется по измерению флуоресценции образца, в котором инкубировались клетки-мишени и эффекторные клетки без антител, MFI максимального высвобождения красителя определяется по измерению флуоресценции образца, в котором инкубировались клетки-мишени с добавлением 1% детергента Triton X-100, MFI спонтанного высвобождения красителя определяется по измерению флуоресценции образца, в котором инкубировались клетки-мишени без эффекторных клеток и антител. В качестве отрицательного контроля использовали антитела R24, специфичные к ганглиозиду GD3, не содержащегося на поверхности клеток EL-4.Where MFI is the average fluorescence intensity, AICC is an antibody independent sample release, MFI AICC is determined by measuring the fluorescence of a sample in which target cells and effector cells without antibodies were incubated, MFI is the maximum dye release determined by measuring the fluorescence of a sample in which target cells are incubated with the addition of 1% Triton X-100 detergent, the MFI of spontaneous dye release is determined by measuring the fluorescence of a sample in which target cells were incubated without effector cells and ntitel. As a negative control, R24 antibodies specific for GD3 ganglioside not contained on the surface of EL-4 cells were used.
Как видно из Рис. 13, антитела B8(1)-H6 опосредуют значимую цитотоксичность NK-клеток в GD2-позитивных клетках EL-4 в отличие от GD3-специфичных антител R24, которые не активировали ADCC даже при высоких концентрациях.As can be seen from Fig. 13, B8 (1) -H6 antibodies mediate the significant cytotoxicity of NK cells in GD2-positive EL-4 cells, in contrast to GD3-specific R24 antibodies that did not activate ADCC even at high concentrations.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are for the purpose of illustrating the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the gist of the present invention.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019111140A RU2708136C1 (en) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019111140A RU2708136C1 (en) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2708136C1 true RU2708136C1 (en) | 2019-12-04 |
Family
ID=68836569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019111140A RU2708136C1 (en) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2708136C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366664C2 (en) * | 2002-12-17 | 2009-09-10 | Мерк Патент Гмбх | Humanised antibody (h14,18) based on mouse antibody 14,18, contacting gd2, and its fusion with il-2 |
| RU2015143208A (en) * | 2013-03-15 | 2017-04-27 | Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер | HIGH AFFINE ANTIBODIES KGD2 |
| RU2016145128A (en) * | 2016-11-17 | 2018-05-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" | STRAIN OF HYBRID CULTIVATED ANIMAL ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS RT1H2-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO GD2 GANGLIOSIDE FOR DIAGNOSIS AND THERAPY OF GD2-NOSE-BURNING OPTIMES |
| RU2663104C1 (en) * | 2017-07-13 | 2018-08-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" | Producing pegylated fragments of gd2-specific antibodies inducing direct cell death of gd2-positive tumor cells, and use thereof in therapy of gd2-positive tumors |
-
2019
- 2019-04-15 RU RU2019111140A patent/RU2708136C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366664C2 (en) * | 2002-12-17 | 2009-09-10 | Мерк Патент Гмбх | Humanised antibody (h14,18) based on mouse antibody 14,18, contacting gd2, and its fusion with il-2 |
| RU2015143208A (en) * | 2013-03-15 | 2017-04-27 | Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер | HIGH AFFINE ANTIBODIES KGD2 |
| RU2016145128A (en) * | 2016-11-17 | 2018-05-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" | STRAIN OF HYBRID CULTIVATED ANIMAL ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS RT1H2-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO GD2 GANGLIOSIDE FOR DIAGNOSIS AND THERAPY OF GD2-NOSE-BURNING OPTIMES |
| RU2663104C1 (en) * | 2017-07-13 | 2018-08-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" | Producing pegylated fragments of gd2-specific antibodies inducing direct cell death of gd2-positive tumor cells, and use thereof in therapy of gd2-positive tumors |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STEFANO JE et al. "High-Affinity VEGF Antagonists by Oligomerization of a Minimal Sequence VEGF-Binding Domain", Bioconjugate Chemistry, 2012, Vol. 23, pp. 2354-2364. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3878863A1 (en) | Anti-claudin18.2 antibody and use thereof | |
| US20220098319A1 (en) | Cd73 antibody, preparation method therefor and application thereof | |
| CA2555503C (en) | Humanized anti-cd3 bispecific binding molecules having reduced immunogenicity, uses and compositions relating thereto | |
| JP6363021B2 (en) | Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T cells and their use in medicine | |
| JP2022513002A (en) | Anti-PD-L1 / VEGF bifunctional antibody and its uses | |
| US12018078B2 (en) | SEMA4D antibody, preparation method therefor and use thereof | |
| WO2020114479A1 (en) | Multispecific protein molecule | |
| KR20130004277A (en) | Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer | |
| WO2020114478A1 (en) | Cd3 antibody and pharmaceutical use thereof | |
| WO2022057871A1 (en) | Anti-4-1bb-anti-pd-l1 bispecific antibody, and pharmaceutical composition and use thereof | |
| CA3138414A1 (en) | Antibodyagainst claudin 18a2 and use thereof | |
| EP4286410A1 (en) | Single-domain antibody against cd16a and use thereof | |
| JP2022507679A (en) | HER2 / PD1 bispecific antibody | |
| EP3495390A1 (en) | Novel antibody against programmed cell death protein (pd-1), and use thereof | |
| JP7288984B2 (en) | Tetravalent bispecific antibodies targeting PD-1 and PD-L1 | |
| JP2024525822A (en) | Homologous dimerizing peptide and antibody containing same | |
| CN116731169B (en) | Nano antibody with sortilin 1 specificity and application thereof | |
| JP6862828B2 (en) | Pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer | |
| KR20210007916A (en) | A composition for preventing, alleviating or treating immune checkpoint inhibitor resistant cancer | |
| RU2708136C1 (en) | Novel protein structures for diagnosing and therapy of gd2-positive diseases | |
| US20210230292A1 (en) | Antibody complex and uses thereof | |
| US12122845B2 (en) | Anti-HER2/anti-4-1BB bispecific antibodies and uses thereof | |
| US20090075339A1 (en) | Autophilic antibodies | |
| RU2663104C1 (en) | Producing pegylated fragments of gd2-specific antibodies inducing direct cell death of gd2-positive tumor cells, and use thereof in therapy of gd2-positive tumors | |
| JP2023551113A (en) | Bispecific antibodies and their applications |