RU2785620C2 - Vaccine against lyme disease in dogs - Google Patents
Vaccine against lyme disease in dogs Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785620C2 RU2785620C2 RU2020120941A RU2020120941A RU2785620C2 RU 2785620 C2 RU2785620 C2 RU 2785620C2 RU 2020120941 A RU2020120941 A RU 2020120941A RU 2020120941 A RU2020120941 A RU 2020120941A RU 2785620 C2 RU2785620 C2 RU 2785620C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine
- ospc
- ospa
- burgdorferi
- borrelia
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 title claims abstract description 134
- 206010025169 Lyme disease Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 title abstract description 51
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 106
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims abstract description 103
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 claims abstract description 90
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 88
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 50
- 229940097269 Borrelia burgdorferi Drugs 0.000 claims abstract description 37
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims abstract description 33
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 claims abstract description 27
- 244000052769 pathogens Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101700041120 ospC Proteins 0.000 claims description 88
- 101700040477 ospA Proteins 0.000 claims description 83
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims description 82
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims description 82
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 16
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 8
- 230000001681 protective Effects 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 claims description 5
- 241001034584 Borrelia burgdorferi 297 Species 0.000 claims description 3
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 27
- 229960000856 Protein C Drugs 0.000 abstract description 7
- 108060005018 mobB Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 102100020223 PRH1 Human genes 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 49
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 42
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 20
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 17
- 206010014611 Encephalitis venezuelan equine Diseases 0.000 description 13
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 13
- 201000009145 Venezuelan equine encephalitis Diseases 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 11
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 11
- 230000003571 opsonizing Effects 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 229940001442 combination vaccines Drugs 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 6
- 229960001212 BACTERIAL VACCINES Drugs 0.000 description 6
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 6
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 5
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 5
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 5
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N BRL-49594 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 210000004731 Jugular Veins Anatomy 0.000 description 4
- 229940042470 Lyme Disease Vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229920002957 Naked DNA Polymers 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960003942 amphotericin B Drugs 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 108010034753 Complement Membrane Attack Complex Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 241000606646 Anaplasma Species 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 101710019842 Borrelia burgdorferi ospA Proteins 0.000 description 2
- 101700010995 CRIP2 Proteins 0.000 description 2
- 101710003706 CSTF64 Proteins 0.000 description 2
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 2
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 2
- 102000004040 Capsid Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101700025116 ESP1 Proteins 0.000 description 2
- 101700064146 ESPL1 Proteins 0.000 description 2
- 229940051998 Ehrlichia canis Drugs 0.000 description 2
- 241000605312 Ehrlichia canis Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 2
- 206010022095 Injection site reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 2
- 241001148628 Leptospira kirschneri Species 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241000694560 Mycoplasma cynos Species 0.000 description 2
- 102100005774 PRSS21 Human genes 0.000 description 2
- 101710036249 PRSS21 Proteins 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 101700032358 SMF1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000007434 bsk-medium Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 2
- -1 /or Species 0.000 description 1
- 241000605281 Anaplasma phagocytophilum Species 0.000 description 1
- 241000605280 Anaplasma platys Species 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 206010064097 Avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 101700044940 BM86 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001513 Elbow Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 Extremities Anatomy 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 210000003495 Flagella Anatomy 0.000 description 1
- 210000002683 Foot Anatomy 0.000 description 1
- 229940068931 Formalin Drugs 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- 102000004854 Immunoglobulin M Human genes 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241000238703 Ixodes scapularis Species 0.000 description 1
- 210000003127 Knee Anatomy 0.000 description 1
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 1
- 241000222732 Leishmania major Species 0.000 description 1
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 1
- 229940099789 OspA protein Drugs 0.000 description 1
- 101000474915 Outer surface protein C Proteins 0.000 description 1
- 229960000380 Propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 description 1
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 210000001179 Synovial Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940033663 Thimerosal Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L Thiomersal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101700053022 VGC Proteins 0.000 description 1
- 206010059080 Vaccination site reaction Diseases 0.000 description 1
- 210000000707 Wrist Anatomy 0.000 description 1
- 101710003767 YBX3 Proteins 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 108010003152 bacteriophage T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001449 borreliacidal Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 201000008286 diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 101710027502 pagA Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000000090 phagocyte Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000001902 propagating Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N β-Propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS
По этой заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C. § 119(c) на основании временной заявки на патент США с серийным номером 62/594342, поданной 4 декабря 2017 года.This application claims priority under 35 U.S.C. § 119(c) pursuant to interim U.S. patent application serial number 62/594342, filed December 4, 2017.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к новым вакцинам против болезни Лайма у собак. Изобретение также относится к способам получения и применения вакцины индивидуально или в комбинациях с другими защитными средствами.The present invention relates to new vaccines against Lyme disease in dogs. The invention also relates to methods for preparing and using the vaccine alone or in combination with other protective agents.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ BACKGROUND OF THE INVENTION
Болезнь Лайма у собак вызывается инфекцией спирохетов вида Borrelia (spp.), включающих, в основном, B. burgdorferi sensu stricto (ss) в США и B. burgdorferi ss, B. garinii и B. afzelii в Европе [Baranton et al., Int. J. Sys. Bacteriol. 42:378-383 (1992); Hovius et al., J. Clin. Microbiol. 38:2611-2621(2000)]. Спирохеты передаются при получении инфицированными клещами Ixodes spp. крови в качестве пищи, причем инфекция вызывает у собак клинические симптомы, которые варьируют от субклинического синовита до острого артрита и артралгии [Jacobson et al., Semin. Vet. Med. Surg. 11:172-182 (1996); Summers et al., J. Comp. Path. 133:1-13 (2005)]. Важно отметить, что частота случаев болезни Лайма у собак продолжает увеличиваться ежегодно, что совпадает с увеличением числа случаев заболевания людей [Haninkova et al., Emerg. Infect. Dis. 12:604-610 (2006)]. Более того, у собак некоторых пород, особенно у ретриверов и бернских горных собак, развивается тяжелый гломерулонефрит [Dambach et al., Vet Pathol 34:85-96 (1997)], and fatalities from the complication have been reported [Littman et al., J Vet Intern Med. 20:422-434 (2006)].Lyme disease in dogs is caused by infection with Borrelia (spp.) spirochetes, including mainly B. burgdorferi sensu stricto (ss) in the United States and B. burgdorferi ss, B. garinii, and B. afzelii in Europe [Baranton et al. , Int. J. Sys. Bacteriol. 42:378-383 (1992); Hovius et al. , J. Clin. microbiol. 38:2611-2621(2000)]. Spirochetes are transmitted when received by infected ticks with Ixodes spp. blood as food, with infection causing clinical symptoms in dogs that range from subclinical synovitis to acute arthritis and arthralgia [Jacobson et al. , Semin. Vet. Med. Surg. 11:172-182 (1996); Summers et al ., J. Comp. Path. 133:1-13 (2005)]. Importantly, the incidence of Lyme disease in dogs continues to increase annually, coinciding with an increase in human cases [Haninkova et al. , Emerge. Infect. Dis. 12:604-610 (2006)]. Moreover, some dog breeds, especially retrievers and Bernese mountain dogs, develop severe glomerulonephritis [Dambach et al., Vet Pathol 34:85-96 (1997)], and fatalities from the complication have been reported [Littman et al . , J Vet Intern Med. 20:422-434 (2006)].
Антитела, продуцируемые в ответ на заражение Borrelia spp. имеют две разные функции [Schwan, Biochem. Soc. Trans. 31:108-112 (2003); Tokarz et al., Infect. Immun. 72:5419-5432 (2004)]. Наиболее распространенный гуморальный иммунный ответ включает в себя продуцирование неспецифических связывающих/опсонизирующих (покрывающих) антител, которые "маркируют" спирохету для поглощения фагоцитарными клетками. Соответственно, указанный гуморальный иммунный ответ приводит к продукции антител, относящихся к иммуноглобулинам (Ig) M, которые связываются и индуцируют опосредованный комплементом мембраноатакующий комплекс, который убивает чужеродный антиген. Однако, в ответе, опосредованном антителами IgM, обычно класс антител переключается на IgG, которые связывают антиген, но больше не стимулируют опосредованное комплементом уничтожение. Скорее, антитела IgG связываются с антигеном-мишенью и эффективно "маркируют" спирохету для поглощения фагоцитарными клетками.Antibodies produced in response to Borrelia spp. have two different functions [Schwan, Biochem. soc. Trans. 31:108-112 (2003); Tokarz et al. , Infect. Immun. 72:5419-5432 (2004)]. The most common humoral immune response involves the production of non-specific binding/opsonizing (coating) antibodies that "mark" the spirochete for uptake by phagocytic cells. Accordingly, said humoral immune response results in the production of antibodies related to immunoglobulins (Ig) M, which bind to and induce a complement-mediated membrane attack complex that kills the foreign antigen. However, in an IgM antibody-mediated response, typically the antibody class switches to IgG, which bind the antigen but no longer stimulate complement-mediated killing. Rather, IgG antibodies bind to the target antigen and effectively "mark" the spirochete for uptake by phagocytic cells.
Этот более типичный ответ, опосредованный опсонизирующими антителами IgG, не обеспечивает эффективной защиты после вакцинации, прежде всего потому, что белки, которые индуцируют иммунный ответ, обычно являются общими для множества других микроорганизмов, а спирохеты, вызывающие болезнь Лайма, крайне редко обнаруживаются в кровотоке [Caine et al., Infect Immun 83: 3184-SI 94 (2015)], где взаимодействие с фагоцитарными клетками, вероятно, более эффективно. В действительности опсонизирующие антитела индуцируются несколькими белками, присутствующими также в других микроорганизмах (то есть белками размером 41 кДа, которые имеют бактериальные жгутики), что делает их значение для индуцированного вакцинацией и опосредованного антителами иммунитета, в лучшем случае сомнительным.This more typical response, mediated by opsonizing IgG antibodies, does not provide effective protection after vaccination, primarily because proteins that induce an immune response are usually shared by many other microorganisms, and spirochetes that cause Lyme disease are extremely rarely found in the bloodstream [ Caine et al., Infect Immun 83: 3184-SI 94 (2015)], where interaction with phagocytic cells is likely to be more efficient. In fact, opsonizing antibodies are induced by several proteins also present in other microorganisms (i.e., 41 kD proteins that have bacterial flagella), making their significance for vaccination-induced and antibody-mediated immunity questionable at best.
С другой стороны, несколько белков Borrelia spp. индуцируют опосредованный антителами ответ, при котором сохраняется способность фиксировать комплемент (боррелиацидный) даже после переключения на антитела IgG. Более конкретно, боррелиацидные антитела связываются со специфическим белком-мишенью и индуцируют комплемент, что приводит к образованию мембраноатакующего комплекса, который убивает организм, без необходимости утилизации фагоцитами. В отличие от опсонизирующих антител, указанный боррелиацидный ответ служит основой для наиболее эффективных бактериальных вакцин против болезни Лайма у собак.On the other hand, several Borrelia spp. induce an antibody-mediated response that retains the ability to fix complement (borreliacid) even after switching to IgG antibodies. More specifically, borreliacid antibodies bind to a specific target protein and induce complement, resulting in the formation of a membrane attack complex that kills the organism without the need for phagocyte utilization. Unlike opsonizing antibodies, this borreliacid response forms the basis for the most effective bacterial vaccines against Lyme disease in dogs.
Первые бактериальные вакцины против болезни Лайма у собак обеспечивали защиту путем индуцирования боррелиацидных антител, специфичных к белку внешней поверхности (Osp)A B. burgdorferi ss [Chu et al., JAVMA 201:403-411 (1992); Ma et al., Vaccine 14:1366-1374 (1996); Wikle et al., Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 4:23-28 (2006); and Straubinger et al., Vaccine 20:181-193 (2002)]. Этот подход может быть эффективным, однако сейчас понятно, что стратегия имеет существенные недостатки, которые могут привести к неудачной вакцинации. Например, антитела распознают только спирохеты B. burgdorferi ss, которые экспрессируют OspA [Jobe et al., J. Clin. Microbiol. 32:618-622 (1994); Lovrich et al., Infect. Immun. 63:2113-2119 (1995)], а клещи также обычно заражаются спирохетами B. burgdorferi ss, которые не экспрессируют OspA [Fikrig et al., Infect. Immun. 63:1658-1662 (1995); Ohnishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:670-675 (2001)]. Кроме того, клещи также часто инфицируются другими Borrelia spp., такими как B. afzelii или B. garinii [Ornstein et al., J. Clin. Microbiol. 39:1294-1298(2001)], которые также вызывают болезнь Лайма, а антитела против OspA являются специфичными к геновиду [Lovrich et al., Infect. Immun. 63:2113-2119 (1995)]. Более того, "диапазон возможностей" для обеспечения защиты является кратким, поскольку экспрессия OspA, которая опосредует прикрепление к средней кишке клеща [Pal et al., J Clin Invest 106: 561-569 (2000)], отключается вскоре после того, как инфицированный клещ начинает питаться [Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2909-2913 (1995)].The first bacterial vaccines against Lyme disease in dogs provided protection by inducing borreliacid antibodies specific for the outer surface protein (Osp)A of B. burgdorferi ss [Chu et al. , JAVMA 201:403-411 (1992); Ma et al. , Vaccine 14:1366-1374 (1996); Wikle et al. , Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 4:23-28 (2006); and Straubinger et al. , Vaccine 20:181-193 (2002)]. This approach can be effective, but it is now clear that the strategy has significant drawbacks that can lead to vaccine failure. For example, antibodies only recognize B. burgdorferi ss spirochetes that express OspA [Jobe et al. , J. Clin. microbiol. 32:618-622 (1994); Lovrich et al. , Infect. Immun. 63:2113-2119 (1995)], and ticks are also commonly infected with B. burgdorferi ss spirochetes that do not express OspA [Fikrig et al. , Infect. Immun. 63:1658-1662 (1995); Ohnishi et al. , Proc. Natl. Acad. sci. 98:670-675 (2001)]. In addition, ticks are also frequently infected with other Borrelia spp. such as B. afzelii or B. garinii [Ornstein et al. , J. Clin. microbiol. 39:1294-1298(2001)], which also cause Lyme disease, and anti-OspA antibodies are genospecies specific [Lovrich et al. , Infect. Immun. 63:2113-2119 (1995)]. Moreover, the "range of opportunity" for conferring protection is short because OspA expression, which mediates attachment to the midgut of the tick [Pal et al., J Clin Invest 106: 561-569 (2000)], is turned off shortly after the infected the tick begins to feed [Schwan et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA 92:2909-2913 (1995)].
Параллельно с разработкой вакцин против болезни Лайма на основе OspA исследователи показали, что белок OspC B. burgdorferi ss также индуцирует защитные боррелиацидные антитела [Rousselle et al., J. Infect. Dis. 178:733-741(1998); Ikushima et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29:15-21 (2000)], однако этот ответ не считается полезным для эффективной вакцины против болезни Лайма, поскольку OspC, даже среди изолятов B. burgdorferi ss, собранных из одного географического региона, является чрезвычайно гетерогенным [Ing-Nang et al., Genetics 151:15-30 (1999); Buckles et al., Clin. Vacc. Immunol. 13:1162-1165 (2006)]. Поэтому исследователи предполагают, что боррелиацидные антитела против OspC обеспечивают опосредованный антителами иммунитет лишь против небольшого числа спирохет, вызывающих болезнь Лайма.In parallel with the development of OspA-based vaccines against Lyme disease, researchers have shown that the B. burgdorferi ss OspC protein also induces protective borreliacid antibodies [Rousselle et al. , J. Infect. Dis. 178:733-741(1998); Ikushima et al. , FEMS Immunol. Med. microbiol. 29:15-21 (2000)], however this response is not considered useful for an effective Lyme disease vaccine because OspC, even among B. burgdorferi ss isolates collected from the same geographic region, is extremely heterogeneous [Ing-Nang et al. , Genetics 151:15-30 (1999); Buckles et al., Clin. Vacc. Immunol . 13:1162-1165 (2006)]. Therefore, the researchers suggest that borreliacid antibodies against OspC confer antibody-mediated immunity against only a small number of spirochetes that cause Lyme disease.
В соответствии с вышесказанным Callister et al. [U.S. 6210676 и U.S. 6464985] предлагают использовать иммуногенный полипептидный фрагмент OspC, специфичный для карбокси (С) -конца Osp, индивидуально или в комбинации с полипептидом OspA для получения вакцины, защищающей людей и других млекопитающих от болезни Лайма. Конкретно стратегия заключается в том, чтобы индуцировать боррелиацидные антитела, которые специфически связываются с эпитопом из 7 аминокислот на карбокси (С)-конце OspC [Jobe et al., Clin. Diagn. Lab. Immuno. 10:573-578 (2003); Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:746-751 (2005)], поскольку этот эпитоп является консервативным среди разных штаммов B. burgdorferi ss, охарактеризованных к настоящему времени, а также присутствует у других патогенных видов Borrelia (которые можно найти с помощью поиска BLAST). Следовательно, можно ожидать, что вакцина, которая индуцирует боррелиацидные антитела OspC против консервативного эпитопа, обеспечит защиту против всех "штаммов" B. burgdorferi ss, независимо от филетической характеристики гена OspC, а также против других возбудителей болезни Лайма у собак, таких как B. garinii или B. afzelii. Livey et al. [U.S. 6872550] также предлагают вакцину для иммунизации против болезни Лайма, полученную с использованием сочетания рекомбинантных белков OspA, OspB и OspC.In accordance with the above, Callister et al. [US 6210676 and US 6464985] propose to use an immunogenic OspC polypeptide fragment specific for the carboxy (C)-terminus of Osp, alone or in combination with an OspA polypeptide, to obtain a vaccine that protects humans and other mammals from Lyme disease. Specifically, the strategy is to induce borreliacid antibodies that specifically bind to the 7 amino acid epitope at the carboxy(C)-terminus of OspC [Jobe et al. , Clinic. Diagn. Lab. Immuno . 10:573-578 (2003); Lovrich et al. , Clinic. Diagn. Lab. Immunol. 12:746-751 (2005)], since this epitope is conserved among the different B. burgdorferi ss strains characterized to date, and is also present in other pathogenic Borrelia species (which can be found using a BLAST search). Therefore, a vaccine that induces OspC borreliacid antibodies against a conserved epitope would be expected to provide protection against all B. burgdorferi ss 'strains', regardless of the phyletic characterization of the OspC gene, as well as against other causative agents of canine Lyme disease such as B. garinii or B. afzelii. Livey et al. [US 6872550] also propose a vaccine for immunization against Lyme disease, obtained using a combination of recombinant proteins OspA, OspB and OspC.
На основании этой стратегии в 2009 году Merck Animal Health, Inc. получила одобрение USDA на цельноклеточную бактериальную вакцину Nobivac® Lyme, состоящую из смеси двух отдельных изолятов B. burgdorferi, которые экспрессируют либо OspA, либо OspC на внешней поверхности мембраны, соответственно [U.S. 8137678 B2; U.S. 8414901 B2]. Наиболее важно то, что подход Merck Animal Health к обеспечению более комплексной защиты собак от болезни Лайма с помощью ее вакцины Nobivac® Lyme тщательно проверен. Например, исследователи подтверждают, что вакцина индуцирует боррелиацидные антитела OspA и OspC, а также демонстрируют, что ответ, опосредованный антителами против OspC, включает значительную долю боррелиацидных антител, специфичных к консервативному эпитопу на С-конце [LaFleur et al., Clin Vaccine Immunol 16:253-259 (2009)]. Более того, исследователи подтверждают, что вакцина надежно защищает собак-реципиентов в течение одного года после вакцинации [LaFleur et al., Clin Vacc Immunol 17:870-874 (2010)], а также демонстрируют, что спирохеты, экспрессирующие OspC, вносят значительный вклад в высокий уровень защиты [LaFleur et al., Clin Vacc Immunol 22:836-839 (2015)]. Однако, несмотря на это улучшение, по-прежнему существует потребность в более комплексной и долгосрочной защите, особенно в связи с тем, что генетическое разнообразие спирохет, вызывающих болезнь Лайма, продолжает расти.Based on this strategy, in 2009 Merck Animal Health, Inc. received USDA approval for the Nobivac® Lyme whole cell bacterial vaccine, consisting of a mixture of two separate B. burgdorferi isolates that express either OspA or OspC on the outer surface of the membrane, respectively [US 8137678 B2; US 8414901 B2]. Most importantly, Merck Animal Health's approach to providing more comprehensive protection for dogs against Lyme disease with its Nobivac ® Lyme vaccine has been thoroughly tested. For example, researchers confirm that the vaccine induces borreliacid antibodies OspA and OspC, and also demonstrate that the anti-OspC antibody-mediated response includes a significant proportion of borreliacid antibodies specific for the conserved epitope at the C-terminus [LaFleur et al., Clin Vaccine Immunol 16 :253-259 (2009)]. Moreover, the investigators confirm that the vaccine reliably protects recipient dogs up to one year after vaccination [LaFleur et al., Clin Vacc Immunol 17:870-874 (2010)] and also demonstrate that OspC-expressing spirochaetes contribute significantly contribution to a high level of protection [LaFleur et al. , Clin Vacc Immunol 22:836-839 (2015)]. However, despite this improvement, there is still a need for more comprehensive and long-term protection, especially as the genetic diversity of the spirochetes that cause Lyme disease continues to grow.
В последнее время исследователи используют другую стратегию для преодоления неоднородности OspC, и следовательно, обеспечения более полной защиты. Эта стратегия включает проведение филогенетического анализа OspC из многочисленных изолятов B. burgdorferi ss с целью идентификации участков последовательностей генов, которые являются гомогенными среди разных организмов [Earnhardt et al., Clin Vaccine Immunol 14:628-634 (2007)]. Затем исследователи конструируют "искусственный" ген, который содержит совокупность гомогенных участков, и используют его для получения химерного белка. Затем химерный белок можно использовать для получения вакцины, способной индуцировать боррелиацидные антитела против OspC, которые связываются со всеми включенными участками, что, в свою очередь, обеспечивает более полную защиту [Rhodes et al., Vet J 198:doi:10.1016/j.tvjl.2013.07.019 (2013)]. В результате получена утвержденная USDA в 2016 году коммерческая вакцина против болезни Лайма у собак (Vanguard® crLyme), состоящая из рекомбинантного (r)OspA и искусственно полученного химерного белка, который содержит эпитопы из 7 "типов" OspC [Zoetis technical bulletin - SAB-00233]. Однако из уровня техники не известно, как приготовить вакцину на основе субъединичного антигена OspC, которая могла бы индуцировать боррелиацидные антитела.Recently, researchers have been using a different strategy to overcome the heterogeneity of OspC, and therefore provide more complete protection. This strategy involves performing a phylogenetic analysis of OspC from multiple B. burgdorferi ss isolates to identify regions of gene sequences that are homogeneous across organisms [Earnhardt et al ., Clin Vaccine Immunol 14:628-634 (2007)]. The researchers then construct an "artificial" gene that contains a collection of homogeneous regions and use it to produce a chimeric protein. The chimeric protein can then be used to generate a vaccine capable of inducing anti-OspC borreliacid antibodies that bind to all of the included sites, which in turn provides more complete protection [Rhodes et al., Vet J 198:doi:10.1016/j.tvjl .2013.07.019 (2013)]. The result is a 2016 USDA-approved commercial canine Lyme disease vaccine (Vanguard® crLyme), consisting of recombinant (r)OspA and an artificially produced chimeric protein that contains epitopes from 7 "types" of OspC [Zoetis technical bulletin - SAB- 00233]. However, it is not known in the art how to prepare a vaccine based on the OspC subunit antigen that could induce borreliacid antibodies.
В течение ряда лет используют разные векторные стратегии, включающие применение альфавирусных частиц РНК-репликонов (RP) [Frolov et al., PNAS 93: 11371-11377 (1996); Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012) doi: 10.1017/S1466252312000011; Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)], полученных из нескольких разных альфавирусов, таких как вирус венесуэльского конского энцефалита (VEE) [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], вирус Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439-6446 (1993)] и вирус леса Семлики (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356- 1361 (1991)]. RP-вакцины доставляют не способные к размножению РНК-репликоны альфавирусов в клетки-хозяева и обеспечивают экспрессию целевого антигенного трансгена (трансгенов) in vivo [Pushko et al., Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP обладают выгодным профилем безопасности и эффективности по сравнению с некоторыми традиционными вакцинными композициями [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012)]. Платформу RP используют для кодирования патогенных антигенов и в качестве основы для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц. Кроме того, Gipson et al. [Vaccine. 21(25-26):3875-84. (2003)] используют платформу RP для кодирования антигена OpsA в исследованиях вакцинирования мышиных моделей, однако аналогичные исследования на собаках не проводились.Various vector strategies have been used for a number of years, including the use of alphavirus RNA replicon particles (RP) [Frolov et al., PNAS 93: 11371-11377 (1996); Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012) doi: 10.1017/S1466252312000011; Kamrud et al ., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)] derived from several different alphaviruses such as Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], Sindbis virus (SIN ) [Bredenbeek et al. , Journal of Virology 67:6439-6446 (1993)] and Semliki forest virus (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991)]. RP vaccines deliver non-propagating alphavirus replicon RNAs to host cells and allow in vivo expression of the target antigenic transgene(s) [Pushko et al. , Virology 239(2):389-401 (1997)]. RPs have an advantageous safety and efficacy profile over some conventional vaccine formulations [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012)]. The RP platform is used to encode pathogenic antigens and as the basis for several USDA-licensed porcine and avian vaccines. In addition, Gipson et al . [ Vaccine . 21(25-26):3875-84. (2003)] use the RP platform to encode the OpsA antigen in vaccination studies in mouse models, but similar studies have not been conducted in dogs.
Соответственно, несмотря на повышенную эффективность вакцины Nobivac® Lyme и многие предполагаемые тупики и/или неудачи прошлого, все еще существует давняя потребность в дополнительно улучшенной вакцине против болезни Лайма, которая будет лучше защищать млекопитающих, особенно собак, от этой изнурительной болезни.Accordingly, despite the improved efficacy of the Nobivac® Lyme vaccine and many perceived dead ends and/or past failures, there is still a longstanding need for a further improved Lyme disease vaccine that will better protect mammals, especially dogs, from this debilitating disease.
Цитирование любой ссылки в настоящем описании не должно истолковываться как допущение того, что такую ссылку можно использовать в качестве "уровня техники", предшествующего настоящей заявке.The citation of any reference in the present description should not be construed as an admission that such a reference can be used as "prior art" prior to this application.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Соответственно, настоящее изобретение относится к векторам, которые кодируют один или более антигенов Borrelia burgdorferi. Такие векторы можно использовать в иммуногенных композициях, содержащих эти векторы. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно использовать для получения вакцин. В одном аспекте настоящего изобретения вакцина помогает защитить вакцинированного индивидуума (например, млекопитающего) от болезни Лайма. В конкретном варианте осуществления этого типа вакцинированный индивидуум представляет собой собаку. В другом варианте осуществления вакцинированный индивидуум представляет собой домашнюю кошку. Вакцины и/или способы по настоящему изобретению позволяют защищать и других домашних млекопитающих, таких как лошадиные (например, лошади) и/или крупный рогатый скот. Настоящее изобретение также относится к комбинированным вакцинам, обеспечивающим защитный иммунитет против болезни Лайма и других заболеваний, например, других инфекционных заболеваний у собак или лошадей. Изобретение также относится к способам получения и применения иммуногенных композиций и вакцин по настоящему изобретению.Accordingly, the present invention relates to vectors that encode one or more Borrelia burgdorferi antigens. Such vectors can be used in immunogenic compositions containing these vectors. The immunogenic compositions of the present invention can be used to prepare vaccines. In one aspect of the present invention, the vaccine helps protect the vaccinated individual (eg, mammal) from Lyme disease. In a specific embodiment of this type, the vaccinated individual is a dog. In another embodiment, the vaccinated individual is a domestic cat. The vaccines and/or methods of the present invention can also protect other domestic mammals such as equines (eg horses) and/or cattle. The present invention also relates to combination vaccines providing protective immunity against Lyme disease and other diseases, such as other infectious diseases in dogs or horses. The invention also relates to methods for preparing and using the immunogenic compositions and vaccines of the present invention.
В конкретных вариантах осуществления вектор представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса, которая содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген Borrelia burgdorferi. В более конкретных вариантах осуществления частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу репликона альфавируса венесуэльского конского энцефалита (VEE). В еще более конкретных вариантах осуществления частица РНК-репликона альфавируса VEE представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса VEE ТС-83. В других вариантах осуществления частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу РНК-репликона вируса Синдбис (SIN). В других вариантах осуществления частица РНК-репликона альфавируса представляет собой частицу РНК-репликона альфавируса леса Семлики (SFV). В альтернативных вариантах осуществления вектор экспрессии, представляющий собой "оголенную" ДНК, содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиген Borrelia burgdorferi. В других альтернативных вариантах осуществления вектор экспрессии, представляющий собой "оголенную" ДНК, содержит последовательность репликона альфавируса, которая сама кодирует антиген Borrelia burgdorferi. Настоящее изобретение включает все конструкции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, в том числе синтетическую матричную РНК, РНК-репликоны, а также все частицы РНК-репликонов альфавирусов по настоящему изобретению, векторы, представляющие собой "оголенную" ДНК, и иммуногенные композиции и/или вакцины, которые содержат конструкции нуклеиновых кислот (например, синтетическую матричную РНК, РНК-репликоны), частицы РНК-репликонов альфавирусов и/или векторы, представляющие собой "оголенную" ДНК по настоящему изобретению.In specific embodiments, the vector is an alphavirus replicon RNA particle that contains a nucleic acid construct encoding a Borrelia burgdorferi antigen. In more specific embodiments, the alphavirus replicon RNA particle is a Venezuelan equine encephalitis (VEE) alphavirus replicon particle. In still more specific embodiments, the VEE alphavirus RNA replicon particle is a TC-83 VEE alphavirus RNA replicon RNA particle. In other embodiments, the alphavirus replicon RNA particle is a Sindbis virus (SIN) replicon RNA particle. In other embodiments, the alphavirus RNA replicon particle is a Semliki Forest Alphavirus (SFV) RNA replicon particle. In alternative embodiments, the naked DNA expression vector contains a nucleic acid construct that encodes a Borrelia burgdorferi antigen. In other alternative embodiments, the naked DNA expression vector contains an alphavirus replicon sequence that itself encodes a Borrelia burgdorferi antigen. The present invention includes all nucleic acid constructs of the present invention, including synthetic messenger RNA, RNA replicons, as well as all alphavirus RNA replicon particles of the present invention, naked DNA vectors, and immunogenic compositions and/or vaccines. that contain nucleic acid constructs (eg, synthetic messenger RNA, RNA replicons), alphavirus RNA replicon particles, and/or vectors representing the "naked" DNA of the present invention.
В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная конструкция по настоящему изобретению кодирует один или более антигенов Borrelia burgdorferi. В одном таком варианте осуществления антиген Borrelia burgdorferi представляет собой белок A внешней поверхности (OspA), или его антигенный фрагмент. В другом варианте осуществления антиген Borrelia burgdorferi представляет собой белок С внешней поверхности (OspC), или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления нуклеотидная конструкция кодирует от двух до четырех антигенов Borrelia burgdorferi или их антигенных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления этого типа нуклеотидная конструкция кодирует один или более OspA, или один или более их антигенных фрагментов, и один или более OspC, или их антигенных фрагментов. В частности, нуклеотидная конструкция кодирует OspA, или его антигенный фрагмент, и OspC, или его антигенный фрагмент, где OspA, или его антигенный фрагмент, кодируется нуклеотидной последовательностью, расположенной выше нуклеотидной последовательности, кодирующей OspC, или его антигенный фрагмент. В другом конкретном варианте осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspC, или его антигенный фрагмент, и OspA, или его антигенный фрагмент, где OspC или его антигенный фрагмент кодируется нуклеотидной последовательностью, расположенной выше нуклеотидной последовательности, кодирующей OspA, или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspA, или его антигенный фрагмент, полученный из двух или более штаммов Borrelia burgdorferi. В других вариантах осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspC, или его антигенный фрагмент, полученный из двух или более штаммов Borrelia burgdorferi. Настоящее изобретение также относится к частицам РНК-репликона альфавируса, которые содержат любую из указанных нуклеотидных конструкций. В альтернативных вариантах осуществления вектор представляет собой оголенную ДНК, которая содержит одну или более из указанных нуклеотидных конструкций.In specific embodiments, the nucleotide construct of the present invention encodes one or more Borrelia burgdorferi antigens. In one such embodiment, the Borrelia burgdorferi antigen is an outer surface protein A (OspA), or an antigenic fragment thereof. In another embodiment, the Borrelia burgdorferi antigen is an outer surface protein C (OspC), or an antigenic fragment thereof. In other embodiments, the nucleotide construct encodes two to four Borrelia burgdorferi antigens or antigenic fragments thereof. In some embodiments of this type, the nucleotide construct encodes one or more OspA, or one or more antigenic fragments thereof, and one or more OspC, or antigenic fragments thereof. In particular, the nucleotide construct encodes OspA, or an antigenic fragment thereof, and OspC, or an antigenic fragment thereof, wherein OspA, or an antigenic fragment thereof, is encoded by a nucleotide sequence upstream of the nucleotide sequence encoding OspC, or an antigenic fragment thereof. In another specific embodiment, the nucleotide construct encodes OspC, or an antigenic fragment thereof, and OspA, or an antigenic fragment thereof, wherein OspC or an antigenic fragment thereof is encoded by a nucleotide sequence upstream of the nucleotide sequence encoding OspA, or an antigenic fragment thereof. In other embodiments, the nucleotide construct encodes OspA, or an antigenic fragment thereof, derived from two or more strains of Borrelia burgdorferi . In other embodiments, the nucleotide construct encodes OspC, or an antigenic fragment thereof, derived from two or more strains of Borrelia burgdorferi . The present invention also relates to alphavirus replicon RNA particles that contain any of the indicated nucleotide constructs. In alternative embodiments, the vector is naked DNA that contains one or more of the specified nucleotide constructs.
В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат частицы РНК-репликона альфавируса, которые содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую один или более антигенов Borrelia burgdorferi, или их антигенные фрагменты. В родственных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат частицы РНК-репликона альфавируса, которые содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую от двух до четырех антигенов Borrelia burgdorferi, или их антигенные фрагменты.In specific embodiments, the immunogenic compositions comprise alphavirus replicon RNA particles that contain a nucleotide construct encoding one or more Borrelia burgdorferi antigens, or antigenic fragments thereof. In related embodiments, the immunogenic compositions comprise alphavirus replicon RNA particles that contain a nucleotide construct encoding two to four Borrelia burgdorferi antigens, or antigenic fragments thereof.
В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат частицы РНК-репликона альфавируса, которые содержат нуклеотидную конструкцию по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления этого типа частицы РНК-репликона альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую OspA. В родственных вариантах осуществления частицы РНК-репликона альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую антигенный фрагмент OspA. В других вариантах осуществления частицы РНК-репликона альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую OspA, или его антигенные фрагменты, из двух или более разных штаммов Borrelia burgdorferi. В других вариантах осуществления частицы РНК-репликона альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую OspC. В родственных вариантах осуществления частицы РНК-репликона альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую антигенный фрагмент OspC. В других вариантах осуществления частицы РНК-репликонов альфавируса содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую OspC, или его антигенные фрагменты, из двух или более разных штаммов Borrelia burgdorferi.In specific embodiments, the immunogenic compositions comprise alphavirus replicon RNA particles that comprise the nucleotide construct of the present invention. In particular embodiments of this type, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding OspA. In related embodiments, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding an OspA antigenic fragment. In other embodiments, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding OspA, or antigenic fragments thereof, from two or more different strains of Borrelia burgdorferi . In other embodiments, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding OspC. In related embodiments, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding an OspC antigenic fragment. In other embodiments, the alphavirus replicon RNA particles comprise a nucleotide construct encoding OspC, or antigenic fragments thereof, from two or more different strains of Borrelia burgdorferi .
В других вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат частицы РНК-репликона альфавируса, которые содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую сочетание двух или более следующих антигенов Borrelia burgdorferi: OspA из одного или более штаммов, OspC из одного или более штаммов и/или антигенные фрагменты любого из этих белков. В конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит частицы РНК-репликона альфавируса, которые представляют собой частицы РНК-репликона альфавируса венесуэльского конского энцефалита (VEE).In other embodiments, the immunogenic compositions comprise alphavirus replicon RNA particles that comprise a nucleotide construct encoding a combination of two or more of the following Borrelia burgdorferi antigens: OspA from one or more strains, OspC from one or more strains, and/or antigenic fragments of any of these proteins . In specific embodiments, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles, which are Venezuelan equine encephalitis (VEE) alphavirus RNA replicon particles.
В родственных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит два или более наборов частиц РНК-репликона альфавируса. В конкретных вариантах осуществления этого типа один набор частиц РНК-репликона альфавируса содержит первую нуклеотидную конструкцию, а другой набор частиц РНК-репликона альфавируса содержит вторую нуклеотидную конструкцию. В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит первую нуклеотидную конструкцию, другой набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит вторую нуклеотидную конструкцию, и третий набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит третью нуклеотидную конструкцию. В следующих вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит первую нуклеотидную конструкцию, второй набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит вторую нуклеотидную конструкцию, третий набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит третью нуклеотидную конструкцию, и четвертый набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит четвертую нуклеотидную конструкцию. В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит первую нуклеотидную конструкцию, второй набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит вторую нуклеотидную конструкцию, третий набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит третью нуклеотидную конструкцию, четвертый набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит четвертую нуклеотидную конструкцию, и пятый набор частиц РНК-репликона альфавируса, который содержит пятую нуклеотидную конструкцию. В таких вариантах осуществления нуклеотидные последовательности первой нуклеотидной конструкции, второй нуклеотидной конструкции, третьей нуклеотидной конструкции, четвертой нуклеотидной конструкции и пятой нуклеотидной конструкции являются разными.In related embodiments, the immunogenic composition comprises two or more sets of alphavirus replicon RNA particles. In particular embodiments of this type, one set of alphavirus RNA replicon particles comprises a first nucleotide construct and another set of alphavirus replicon RNA particles comprises a second nucleotide construct. In other embodiments, the immunogenic composition comprises one set of alphavirus RNA replicon particles that contains a first nucleotide construct, another set of alphavirus RNA replicon particles that contains a second nucleotide construct, and a third set of alphavirus RNA replicon particles that contains a third nucleotide construct. In the following embodiments, the immunogenic composition comprises one set of alphavirus RNA replicon particles that contains a first nucleotide construct, a second set of alphavirus RNA replicon particles that contains a second nucleotide construct, a third set of alphavirus RNA replicon particles that contains a third nucleotide construct, and a fourth set of alphavirus replicon RNA particles that contains a fourth nucleotide construct. In other embodiments, the immunogenic composition comprises a set of alphavirus RNA replicon particles that contains a first nucleotide construct, a second set of alphavirus RNA replicon particles that contains a second nucleotide construct, a third set of alphavirus RNA replicon particles that contains a third nucleotide construct, a fourth set of alphavirus RNA replicon particles that contain a fourth nucleotide construct; and a fifth set of alphavirus RNA replicon particles that contain a fifth nucleotide construct. In such embodiments, the nucleotide sequences of the first nucleotide construct, the second nucleotide construct, the third nucleotide construct, the fourth nucleotide construct, and the fifth nucleotide construct are different.
Соответственно, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим две или более частиц РНК-репликона альфавируса, каждая из которых по отдельности кодирует один или более антигенов Borrelia burgdorferi. В конкретных вариантах осуществления этого типа одна частица РНК-репликона альфавируса кодирует белок A внешней поверхности Borrelia burgdorferi (OspA), или его антигенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления одна частица РНК-репликона альфавируса кодирует белок C (OspC) внешней поверхности Borrelia burgdorferi, или его антигенный фрагмент. В следующем варианте осуществления одна частица РНК-репликона альфавируса кодирует OspA Borrelia burgdorferi, или его антигенный фрагмент, а вторая частица РНК-репликона альфавируса кодирует OspC Borrelia burgdorferi, или его антигенный фрагмент. В родственных вариантах осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит частицы РНК-репликона альфавируса, которые содержат нуклеотидную конструкцию, кодирующую два или более антигена Borrelia burgdorferi, или их антигенные фрагменты.Accordingly, the present invention relates to immunogenic compositions comprising two or more alphavirus replicon RNA particles, each of which individually encodes one or more Borrelia burgdorferi antigens. In specific embodiments of this type, a single alphavirus replicon RNA particle encodes Borrelia burgdorferi outer surface protein A (OspA), or an antigenic fragment thereof. In some embodiments, one alphavirus replicon RNA particle encodes the outer surface protein C (OspC) of Borrelia burgdorferi , or an antigenic fragment thereof. In a further embodiment, one alphavirus replicon RNA particle encodes Borrelia burgdorferi OspA, or an antigenic fragment thereof, and a second alphavirus replicon RNA particle encodes Borrelia burgdorferi OspC, or antigenic fragment thereof. In related embodiments, the immunogenic composition further comprises alphavirus replicon RNA particles that contain a nucleotide construct encoding two or more Borrelia burgdorferi antigens, or antigenic fragments thereof.
В частности, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим первую и вторую частицу РНК-репликона альфавируса, каждая из которых отдельно кодирует OspA, или его антигенный фрагмент, и OspC, или его антигенный фрагмент (двойные конструкции), где первая частица РНК-репликона содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую OspA, или его антигенный фрагмент, которая расположена перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей OspC, или ее антигенный фрагмент, а вторая частица репликона РНК содержит нуклеотидную конструкцию, кодирующую OspC, или ее антигенный фрагмент, который расположен выше нуклеотидной последовательности, кодирующей OspA, или его антигенный фрагмент.In particular, the present invention relates to immunogenic compositions containing a first and a second particle of an alphavirus replicon RNA, each of which separately encodes OspA, or an antigenic fragment thereof, and OspC, or an antigenic fragment thereof (dual constructs), where the first particle of the replicon RNA contains a nucleotide sequence encoding OspA, or an antigenic fragment thereof, which is located before the nucleotide sequence encoding OspC, or an antigenic fragment thereof, and the second RNA replicon particle contains a nucleotide construct encoding OspC, or an antigenic fragment thereof, which is located upstream of the nucleotide sequence encoding OspA, or its antigenic fragment.
В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspA, или его антигенный фрагмент, полученный из штамма 297 B. burgdorferi. В конкретных вариантах осуществления этого типа OspA содержит аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В более конкретных вариантах осуществления OspA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В еще более конкретных вариантах осуществления OspA кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.In specific embodiments, the nucleotide construct encodes OspA, or an antigenic fragment thereof, derived from B. burgdorferi strain 297. In specific embodiments of this type, the OspA contains an amino acid sequence that is 95% or more identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In more specific embodiments, the OspA contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. the sequence of SEQ ID NO: 1.
В родственном варианте осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspC, или его антигенный фрагмент, полученный из штамма 50772 B. burgdorferi (ATCC № PTA-439). В конкретных вариантах осуществления этого типа OspC содержит аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В более конкретных вариантах осуществления OspC содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В еще более конкретных вариантах осуществления OspC кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3. В следующих вариантах осуществления нуклеотидная конструкция кодирует OspA, полученный из штамма 297 B. burgdorferi, и OspC, полученный из штамма 50772 B. burgdorferi.In a related embodiment, the nucleotide construct encodes OspC, or an antigenic fragment thereof, derived from B. burgdorferi strain 50772 (ATCC No. PTA-439). In specific embodiments of this type, OspC contains an amino acid sequence that is 95% or more identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In more specific embodiments, OspC contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3. In further embodiments, the nucleotide construct encodes OspA derived from B. burgdorferi strain 297 and OspC derived from B. burgdorferi strain 50772.
Настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим иммуногенные композиции по настоящему изобретению, более конкретно, вакцины представляют собой не адъювантные вакцины. В конкретных вариантах осуществления вакцина помогает предотвращать заболевание, вызываемое B. burgdorferi. В конкретных вариантах осуществления заболевание, вызываемое B. burgdorferi, представляет собой болезнь Лайма. В более конкретных вариантах осуществления болезнь Лайма представляет собой болезнь Лайма у собак. В конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению эффективна для вакцинации здоровых собак возрастом 6-8 недель от болезни Лайма собак. В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцина по настоящему изобретению эффективна для вакцинации здоровых собак возрастом 7 недель против болезни Лайма собак. В некоторых вариантах осуществления антитела индуцируются у собаки после ее иммунизации вакциной. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой опсонизирующие IgG. В других вариантах осуществления индуцированные антитела являются боррелиацидными. В других вариантах осуществления индуцируются как опсонизирующие IgG, так и боррелиацидные антитела. В более конкретных вариантах осуществления индуцированные антитела против OspA представляют собой боррелиацидные и опсонизирующие IgG, и индуцированные антитела против OspC представляют собой боррелиацидные и опсонизирующие IgG.The present invention relates to vaccines containing the immunogenic compositions of the present invention, more specifically, the vaccines are non-adjuvanted vaccines. In specific embodiments, the vaccine helps prevent disease caused by B. burgdorferi . In specific embodiments, the disease caused by B. burgdorferi is Lyme disease. In more specific embodiments, Lyme disease is Lyme disease in dogs. In specific embodiments, the vaccine of the present invention is effective for vaccinating healthy dogs 6-8 weeks of age against canine Lyme disease. In specific embodiments of this type, the vaccine of the present invention is effective for vaccinating healthy 7 week old dogs against canine Lyme disease. In some embodiments, antibodies are induced in a dog after it has been immunized with a vaccine. In specific embodiments, the antibodies are opsonizing IgG. In other embodiments, the induced antibodies are borreliacid. In other embodiments, both opsonizing IgG and borreliacid antibodies are induced. In more specific embodiments, the induced anti-OspA antibodies are borreliacid and opsonizing IgG, and the induced anti-OspC antibodies are borreliacid and opsonizing IgG.
В некоторых вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один отличный от Borrelia иммуноген, индуцирующий защитный иммунитет к отличному от Borrelia патогену. В конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению дополнительно содержит частицу РНК-репликона альфавируса, которая кодирует, по меньшей мере, один белковый антиген из отличного от Borrelia иммуногена, индуцирующий защитный иммунитет к отличному от Borrelia патогену. В некоторых вариантах осуществления отличный от Borrelia иммуноген получают из отличного от Borrelia патогена, такого как вирус чумы собак, собачий аденовирус, собачий парвовирус, вирус собачьего парагриппа, собачий коронавирус, вирус собачьего гриппа, серовар Leptospira, организм Leishmania, Bordetella bronchiseptica, виды Mycoplasma, вирус бешенства, Ehrlichia canis, организм Anaplasma и/или их сочетания.In some embodiments, the vaccine of the present invention further comprises at least one non- Borrelia immunogen that induces protective immunity to a non- Borrelia pathogen. In specific embodiments, the vaccine of the present invention further comprises an alphavirus replicon RNA particle that encodes at least one protein antigen from a non- Borrelia immunogen that induces protective immunity to a non- Borrelia pathogen. In some embodiments, the non- Borrelia immunogen is derived from a non- Borrelia pathogen, such as canine distemper virus, canine adenovirus, canine parvovirus, canine parainfluenza virus, canine coronavirus, canine influenza virus, Leptospira serovar, Leishmania organism, Bordetella bronchiseptica , Mycoplasma spp. rabies virus, Ehrlichia canis , Anaplasma organism and/or combinations thereof.
В конкретных вариантах осуществления отличный от Borrelia иммуноген из серовара Leptospira представляет собой гриппотифозный серовар Leptospira kirschneri. В других вариантах осуществления иммуноген из серовара Leptospira представляет собой лептоспирозный серовар Leptospira interrogans. В следующих вариантах осуществления иммуноген из серовара Leptospira представляет собой иктерогеморрагический серовар Leptospira interrogans. В следующих вариантах осуществления иммуноген из серовара Leptospira представляет собой серовар pomona Leptospira interrogans. В следующих вариантах осуществления вакцина содержит иммуногены из нескольких сероваров Leptospira. В конкретных вариантах осуществления отличный от Borrelia иммуноген из вида Mycoplasma представляет собой Mycoplasma cynos.In specific embodiments, the non- Borrelia immunogen from the Leptospira serovar is the Leptospira kirschneri influenza typhoid serovar. In other embodiments, the immunogen from the Leptospira serovar is a leptospira interrogans serovar. In further embodiments, the immunogen from the Leptospira serovar is an icterohemorrhagic serovar of Leptospira interrogans . In further embodiments, the immunogen from the Leptospira serovar is a pomona Leptospira interrogans serovar. In further embodiments, the vaccine contains immunogens from multiple Leptospira serovars. In specific embodiments, the non- Borrelia immunogen from the Mycoplasma species is Mycoplasma cynos .
Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации млекопитающего против патогенных генотипов Borrelia, включающим введение млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцину вводят путем подкожной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления вакцину вводят путем внутримышечной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят путем внутривенной инъекции. В следующих вариантах осуществления вакцину вводят путем внутрикожной инъекции. В следующих вариантах осуществления вакцину вводят перорально. В других вариантах осуществления вакцину вводят интраназально. В конкретных вариантах млекопитающее представляет собой собаку. В других вариантах осуществления млекопитающее относится к семейству лошадиных (например, оно представляет собой лошадь).The present invention also provides methods for immunizing a mammal against pathogenic Borrelia genotypes, comprising administering to the mammal an immunologically effective amount of the vaccine of the present invention. In specific embodiments, the implementation of the vaccine is administered by subcutaneous injection. In alternative embodiments, the vaccine is administered by intramuscular injection. In other embodiments, the implementation of the vaccine is administered by intravenous injection. In further embodiments, the vaccine is administered by intradermal injection. In further embodiments, the vaccine is administered orally. In other embodiments, the vaccine is administered intranasally. In specific embodiments, the mammal is a dog. In other embodiments, the mammal is equine (eg, it is a horse).
Вакцины по настоящему изобретению можно вводить в виде праймерной вакцины и/или в виде бустерной вакцины. В определенных вариантах осуществления, в случае введения как праймерной вакцины, так и бустерной вакцины, праймерную вакцину и бустерную вакцину можно вводить одинаковым способом. В некоторых вариантах этого типа праймерную вакцину и бустерную вакцину вводят путем подкожной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления в случае введения как праймерной вакцины, так и бустерной вакцины, введение праймерной вакцины можно осуществлять одним способом, а введение бустерной вакцины - другим способом. В некоторых вариантах осуществления этого типа праймерную вакцину можно вводить путем подкожной инъекции, а бустерную вакцину можно вводить перорально.The vaccines of the present invention can be administered as a primer vaccine and/or as a booster vaccine. In certain embodiments, when both a primer vaccine and a booster vaccine are administered, the primer vaccine and the booster vaccine can be administered in the same manner. In some embodiments of this type, the primer vaccine and the booster vaccine are administered by subcutaneous injection. In alternative embodiments, when both the primer vaccine and the booster vaccine are administered, the primer vaccine may be administered in one manner and the booster vaccine may be administered in another manner. In some embodiments of this type, the primer vaccine may be administered by subcutaneous injection and the booster vaccine may be administered orally.
Вакцинная композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать иммунологически эффективное количество инактивированных организмов одного или более других штаммов (которые могут указываться здесь как второй штамм), относящихся к патогенному генотипу Borrelia. В конкретных вариантах осуществления второй штамм содержит антигены OspA и OspB. Примеры подходящих вторых штаммов включают один или более из следующих: B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC № PTA-1680), B. burgdorferi ss B-31 (ATCC № 35210), B. afzelii {например, доступный как ATCC № 51567), B. garinii (например, доступный как ATCC № 51383 и 51991), B. burgdorferi ss DK7, B. burgdorferi ss 61 BV3, B. burgdorferi ss ZS7, B. burgdorferi ss Pka, B. burgdorferi ss IP1, IP2, IP3, B. burgdorferi ss HII, B. burgdorferi ss P1F, B. burgdorferi ss Mil, B. burgdorferi ss 20006, B. burgdorferi ss 212, B. burgdorferi ss ESP1, B. burgdorferi ss Ne-56, B. burgdorferi ss Z136, B. burgdorferi ss ia, и/или любые их сочетания.The vaccine composition of the present invention may further comprise an immunologically effective amount of inactivated organisms of one or more other strains (which may be referred to herein as a second strain) belonging to the pathogenic Borrelia genotype. In specific embodiments, the implementation of the second strain contains antigens OspA and OspB. Examples of suitable second strains include one or more of the following: B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC no. PTA-1680), B. burgdorferi ss B-31 (ATCC no. 35210), B. afzelii {for example, available as ATCC No. 51567), B. garinii (e.g., available as ATCC Nos. 51383 and 51991), B. burgdorferi ss DK7, B. burgdorferi ss 61 BV3, B. burgdorferi ss ZS7, B. burgdorferi ss Pka, B. burgdorferi ss IP1, IP2, IP3, B. burgdorferi ss HII, B. burgdorferi ss P1F, B. burgdorferi ss Mil, B. burgdorferi ss 20006, B. burgdorferi ss 212, B. burgdorferi ss ESP1, B. burgdorferi ss Ne-56, B. burgdorferi ss Z136, B. burgdorferi ss ia, and/or any combination thereof.
Настоящее изобретение также относится к способу иммунизации млекопитающего против патогенных видов Borrelia, в частности B. burgdorferi ss, включающему введение млекопитающему иммунологически эффективного количества описанных выше вакцин согласно изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцины могут содержать, например, примерно от 1×104 до 1×1010 RP или больше. В более конкретных вариантах осуществления вакцины могут содержать примерно от 1×105 до 1×109 RP. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины могут содержать примерно от 1×106 до 1×108 RP. В конкретных вариантах осуществления после вакцинации иммунизированное млекопитающее продуцирует боррелиацидные антитела. В конкретных воплощениях млекопитающее представляет собой собаку. В других вариантах осуществления млекопитающее относится к семейству лошадиных (например, оно представляет собой лошадь).The present invention also relates to a method for immunizing a mammal against pathogenic species of Borrelia , in particular B. burgdorferi ss, comprising administering to the mammal an immunologically effective amount of the above-described vaccines according to the invention. In specific embodiments, the implementation of the vaccine may contain, for example, from about 1x10 4 to 1x10 10 RP or more. In more specific embodiments, the implementation of the vaccine may contain from about 1x10 5 to 1x10 9 RP. In even more specific embodiments, the implementation of the vaccine may contain from about 1x10 6 to 1x10 8 RP. In specific embodiments, after vaccination, the immunized mammal produces borreliacid antibodies. In specific embodiments, the mammal is a dog. In other embodiments, the mammal is equine (eg, it is a horse).
В некоторых воплощениях вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,05 мл до 3 мл. В более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,1 мл до 2 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,2 мл до 1,5 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,3 до 1,0 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,4 мл до 0,8 мл.In some embodiments, the vaccines of the present invention are administered in doses of 0.05 ml to 3 ml. In more specific embodiments, the implementation of the administered dose is from 0.1 ml to 2 ml. In even more specific embodiments, the implementation of the administered dose is from 0.2 ml to 1.5 ml. In even more specific embodiments, the implementation of the administered dose is from 0.3 to 1.0 ml. In even more specific embodiments, the implementation of the administered dose is from 0.4 ml to 0.8 ml.
Настоящее изобретение также относится к комбинированным вакцинам, которые дополнительно содержат векторы (например, частицы РНК-репликонов альфавируса), кодирующие один или более иммуногенов других патогенов собак, такие как, например, иммуногены, индуцирующие иммунитет против вируса собачьей чумы, аденовируса собак, парвовируса собак, вируса собачьего парагриппа, собачьего коронавируса, вируса собачьего гриппа и/или сероваров Leptospira, например, гриппотифозный серовар Leptospira kirschneri, лептоспирозный серовар Leptospira interrogans, иктерогеморрагический серовар Leptospira interrogans, и/или серовар pomona Leptospira interrogans. Другие собачьи патогены, которые можно добавить в комбинированную вакцину по настоящему изобретению, включают организмы Leishmania, такие как Leishmania major и Leishmania infantum, Bordetella bronchiseptica, виды Mycoplasma (например, Mycoplasma cynos), вирус бешенства, виды анаплазмы, такие как Anaplasma phagocytophilum и Anaplasma platys; и Ehrlichia canis. В конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению дополнительно содержит частицу РНК-репликона альфавируса, которая кодирует по меньшей мере один или более антигенов из одного или более таких иммуногенов.The present invention also relates to combination vaccines which further comprise vectors (e.g., alphavirus replicon RNA particles) encoding one or more immunogens of other canine pathogens, such as, for example, immunogens that induce immunity against canine distemper virus, canine adenovirus, canine parvovirus. , canine parainfluenza virus, canine coronavirus, canine influenza virus, and/or Leptospira serovars, e.g., Leptospira kirschneri influenza typhoid serovar, Leptospira interrogans leptospiral serovar, Leptospira interrogans icterohemorrhagic serovar, and/or pomona Leptospira interrogans serovar. Other canine pathogens that can be added to the combination vaccine of the present invention include Leishmania organisms such as Leishmania major and Leishmania infantum , Bordetella bronchiseptica , Mycoplasma species (e.g. Mycoplasma cynos ), rabies virus, Anaplasma species such as Anaplasma phagocytophilum and Anaplasma platys ; and Ehrlichia canis . In specific embodiments, the vaccine of the present invention further comprises an alphavirus replicon RNA particle that encodes at least one or more antigens from one or more such immunogens.
Нижеследующее подробное описание позволяет лучше понять приведенные и другие аспекты настоящего изобретения.The following detailed description allows a better understanding of the above and other aspects of the present invention.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, которые содержат иммунологически эффективное количество частиц РНК-репликона альфавируса, кодирующих белок A внешней поверхности Borrelia burgdorferi (OspA), или его антигенный фрагмент, и белок C внешней поверхности Borrelia burgdorferi (OspC), или его антигенный фрагмент, иммунологически эффективное количество двух или более векторов, содержащих по меньшей мере одну частицу РНК-репликона альфавируса, кодирующую белок A внешней поверхности Borrelia burgdorferi (OspA), или его антигенный фрагмент, и по меньшей мере другую частицу РНК-репликона альфавируса, кодирующую белок C (OspC) внешней поверхности Borrelia burgdorferi, или его антигенный фрагмент, или сочетание частиц РНК-репликонов альфавируса, которые кодируют как Osp A, или его антигенный фрагмент, так и OspB, или его антигенный фрагмент, с частицами РНК-репликона альфавируса, которые кодируют Osp A, или его антигенный фрагмент, и/или Osp C, или его антигенный фрагмент. Все указанные иммуногенные композиции можно использовать для получения вакцин млекопитающих. В одном аспекте настоящего изобретения вакцина обеспечивает защиту вакцинированного индивидуума (например, млекопитающего) от болезни Лайма. В конкретном воплощении этого типа вакцинированный индивидуум представляет собой собаку. Соответственно, настоящее изобретение относится к новым иммунологическим композициям, которые повышают надежность вакцинации для предотвращения болезни Лайма у собак в результате того, что они (i) значительно снижают вероятность неблагоприятных побочных эффектов вследствие отсутствия вакцинации неродственными антигенами из бактериальных вакцин и (ii) по-прежнему обеспечивают всестороннюю защиту. Вакцинные композиции против болезни Лайма по настоящему изобретению также значительно увеличивают "окно эффективности", вызывая эффективный анамнестический вторичный иммунный ответ.The present invention relates to immunogenic compositions and/or vaccines that comprise an immunologically effective amount of alphavirus replicon RNA particles encoding Borrelia burgdorferi outer surface protein A (OspA), or an antigenic fragment thereof, and Borrelia burgdorferi outer surface protein C (OspC), or its antigenic fragment, an immunologically effective amount of two or more vectors containing at least one alphavirus RNA replicon RNA particle encoding the outer surface protein A of Borrelia burgdorferi (OspA), or an antigenic fragment thereof, and at least another alphavirus RNA replicon RNA particle, encoding protein C (OspC) of the outer surface of Borrelia burgdorferi , or an antigenic fragment thereof, or a combination of alphavirus RNA replicon particles that encode both Osp A, or antigenic fragment thereof, and OspB, or antigenic fragment thereof, with alphavirus replicon RNA particles , which encode Osp A, or its antigenic fragment, and/or Osp C, or its anti gene fragment. All of these immunogenic compositions can be used to prepare mammalian vaccines. In one aspect of the present invention, the vaccine provides protection to the vaccinated individual (eg, mammal) from Lyme disease. In a specific embodiment of this type, the vaccinated individual is a dog. Accordingly, the present invention relates to novel immunological compositions that improve the reliability of vaccination for the prevention of Lyme disease in dogs by the fact that they (i) significantly reduce the likelihood of adverse side effects due to the lack of vaccination with unrelated antigens from bacterial vaccines and (ii) still provide comprehensive protection. The Lyme disease vaccine compositions of the present invention also significantly increase the "window of efficacy" by inducing an effective anamnestic secondary immune response.
Нижеследующие определения приведены для более полного понимания изобретения.The following definitions are provided for a more complete understanding of the invention.
Использование отдельных терминов для удобства описания никоим образом не подразумевает ограничения. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую "полипептид", включает ссылку на один или более таких полипептидов. Кроме того, ссылка на "организм" включает ссылку на множество таких организмов, если не указано иное.The use of individual terms for convenience of description is not meant to be limiting in any way. Thus, for example, reference to a composition containing a "polypeptide" includes reference to one or more such polypeptides. In addition, reference to "organism" includes reference to a plurality of such organisms, unless otherwise indicated.
В настоящем описании термины "примерно" и "приблизительно", используемые как взаимозаменяемые, означают, что значение находится в пределах пятидесяти процентов от указанного значения, то есть композиция, содержащая "примерно" 1×108 частиц РНК-репликона альфавируса на миллилитр, содержит от 5×107 до 1,5×108 частиц РНК-репликона альфавируса на миллилитр.In the present description, the terms "about" and "approximately", used interchangeably, mean that the value is within fifty percent of the specified value, that is, a composition containing "about" 1×10 8 alphavirus replicon RNA particles per milliliter contains 5×10 7 to 1.5×10 8 alphavirus replicon RNA particles per milliliter.
Если не указано иное, используемый здесь термин "собачьи" включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris.Unless otherwise indicated, the term "canine" as used herein includes all domestic dogs, Canis lupus familiaris or Canis familiaris .
Термин "геновид", который впервые использовали и определили G. Baranton et al., 1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383, применяется здесь так же, как и термин "вид", для описания таксономии отличных от Borrelia организмов.The term "genospecies", which was first used and defined by G. Baranton et al., 1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383, is used here in the same way as the term "species" to describe the taxonomy of organisms other than Borrelia . .
Термин "отличный от Borrelia" используют в применении к таким терминам, как организм, патоген и/или антиген (или иммуноген), для обозначения того, что соответствующий организм, патоген и/или антиген (или иммуноген) не является организмом Borrelia, не является патогеном Borrelia и/или не является антигеном (или иммуногеном) Borrelia соответственно, и что отличный от Borrelia белковый антиген (или иммуноген) получают не из организма Borrelia.The term "other than Borrelia " is used with terms such as organism, pathogen, and/or antigen (or immunogen) to mean that the corresponding organism, pathogen, and/or antigen (or immunogen) is not a Borrelia organism, is not is a Borrelia pathogen and/or is not a Borrelia antigen (or immunogen), respectively, and that a non- Borrelia protein antigen (or immunogen) is not derived from a Borrelia organism.
Термины "происходить из", "получают из" и "получаемый из" используются взаимозаменяемо в отношении конкретного белкового антигена и патогена, или штамма патогена, который его кодирует в природе, и в настоящем документе означают, что немодифицированная и/или усеченная аминокислотная последовательность конкретного белкового антигена кодируется указанным патогеном или штаммом указанного патогена. Последовательность нуклеотидной конструкции по настоящему изобретению, кодирующую белковый антиген, полученный из патогена, могла быть подвергнута генетическому изменению с достижением модификации и/или усечения аминокислотной последовательности экспрессируемого белкового антигена по сравнению с соответствующей последовательностью указанного белкового антигена, присутствующего в патогене или штамме патогена (включая природно-аттенуированные штаммы), из которого он происходит.The terms "derived from", "derived from" and "derived from" are used interchangeably with respect to a particular protein antigen and the pathogen or pathogen strain that naturally encodes it, and as used herein means that the unmodified and/or truncated amino acid sequence of a particular the protein antigen is encoded by said pathogen or a strain of said pathogen. The sequence of the nucleotide construct of the present invention encoding a protein antigen derived from a pathogen could be genetically altered to achieve modification and/or truncation of the amino acid sequence of the expressed protein antigen compared to the corresponding sequence of the specified protein antigen present in the pathogen or pathogen strain (including naturally -attenuated strains) from which it originates.
"Стандартные условия роста" для культивирования геновидов Borrelia включают выращивание при температуре в диапазоне примерно от 33°C до 35°C в среде BSK (Barbour Stoenner Kelly). Среду BSK, как описано здесь, получают по методу Callister et al. [Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Sections 11.5.1-11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003), включенному в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме] (среду BSK также можно приобрести на коммерческой основе, например, в Sigma, St. Louis, MO)."Standard growth conditions" for culturing Borrelia genospecies include growing at a temperature in the range of about 33°C to 35°C in BSK medium (Barbour Stoenner Kelly). BSK medium, as described here, is prepared according to the method of Callister et al. [ Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry , Sections 11.5.1-11.5.12, Current Protocols in Cytometry , John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003), incorporated herein by reference in its entirety] (BSK media is also available commercially, eg, from Sigma, St. Louis, MO).
Используемый здесь термин "OspC7" относится к иммунодоминантному эпитопу боррелиацидного антитела против OspC, расположенному в участке из 7 аминокислот [Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005)] С-конца, состоящего из 50 аминокислот OspC, как описано Callister et al. [U.S. 6210676 B1 и U.S. 6464985 B1], который является консервативным среди известных патогенных видов Borrelia spp. Данная консервативность легко подтверждается поиском BLAST сегмента кодона, кодирующего сегмент из 7 аминокислот, как описано Lovrich et al. [Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005)]. Такой поиск, проведенный 9 октября 2006 г., позволил получить список результатов из 100 видов Borrelia, содержащих указанный выше сегмент, кодирующий 7-мономерный эпитоп OspC. В конкретных вариантах осуществления частица РНК-репликона альфавируса кодирует антигенный фрагмент OspC, который включает OspC7.The term "OspC7" as used herein refers to an immunodominant epitope of a borreliacid anti-OspC antibody located in a 7 amino acid region [Lovrich et al. , Clinic. Diagn. Lab. Immunol. , 12:746-751, (2005)] the 50 amino acid OspC-terminus as described by Callister et al. [US 6210676 B1 and US 6464985 B1], which is conservative among the known pathogenic species of Borrelia spp. This conservatism is readily confirmed by searching for the BLAST segment of the codon encoding the 7 amino acid segment as described by Lovrich et al. [ clin. Diagn. Lab. Immunol. , 12:746-751, (2005)]. Such a search, conducted on October 9, 2006, produced a list of results from 100 Borrelia species containing the above segment encoding the 7-monomeric OspC epitope. In specific embodiments, the alphavirus replicon RNA particle encodes an OspC antigenic fragment that includes OspC7.
Используемые здесь термины "защита" или "обеспечение защиты" или "индукция защитного иммунитета" и "способствует защите" не подразумевают наличие полной защиты от каких-либо признаков инфекции. Например, термин "способствует защите" может означать, что защита является достаточной для того, чтобы после заражения симптомы основной инфекции, по меньшей мере, уменьшались, и/или чтобы одна или более из основных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшались и/или устранялись. Следует понимать, что "уменьшенный" в данном контексте означает относительный статус инфекции, включая молекулярный статус инфекции, а не только физиологический статус инфекции.As used herein, the terms "protection" or "provide protection" or "induce protective immunity" and "promote protection" do not imply complete protection against any signs of infection. For example, the term "contributes to protection" may mean that the protection is sufficient so that after infection, the symptoms of the underlying infection are at least reduced, and/or that one or more of the main cellular, physiological or biochemical causes or mechanisms that cause symptoms , decreased and/or eliminated. It should be understood that "reduced" in this context means the relative status of the infection, including the molecular status of the infection, and not just the physiological status of the infection.
Используемый здесь термин "вакцина" представляет собой композицию, подходящую для применения животному, например, представителю собачьих, кошачьих или лошадиных (включая, в некоторых вариантах осуществления, человека, хотя в других вариантах осуществления конкретно указано: не для людей), содержащую один или более антигенов, как правило, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, которая при введении животному вызывает достаточно сильный иммунный ответ, чтобы минимально способствовать защите от заболевания, возникающего в результате инфекции микроорганизма дикого типа, то есть достаточно сильный, чтобы способствовать профилактике заболевания и/или профилактике, ослаблению или излечению заболевания.The term "vaccine" as used herein is a composition suitable for administration to an animal, such as a canine, feline, or equine (including, in some embodiments, a human, although other embodiments specifically state: not for humans), comprising one or more antigens, typically in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, such as a liquid containing water, which, when administered to an animal, elicits an immune response strong enough to minimally contribute to protection against disease resulting from infection of the wild-type microorganism, i.e. strong enough to contribute to the prevention of a disease and/or the prevention, mitigation or cure of a disease.
В настоящем описании поливалентная вакцина представляет собой вакцину, которая содержит два или более разных антигенов. В конкретном воплощении данного типа поливалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента против двух или более разных патогенов.As used herein, a polyvalent vaccine is one that contains two or more different antigens. In a specific embodiment of this type, the multivalent vaccine stimulates the recipient's immune system against two or more different pathogens.
Используемый здесь термин "репликон" относится к модифицированному геному РНК-вируса, в котором отсутствует один или более элементов (например, кодирующих последовательности структурных белков), которые, в случае присутствия, могли бы обеспечить успешное размножение исходного вируса в клеточных культурах или животных-хозяевах. В подходящем клеточном окружении репликон сам амплифицируется и может продуцировать один или более видов субгеномных РНК.The term "replicon" as used herein refers to a modified RNA virus genome that lacks one or more elements (eg, structural protein coding sequences) that, if present, would allow the parent virus to successfully propagate in cell cultures or animal hosts. . In a suitable cellular environment, the replicon is itself amplified and can produce one or more subgenomic RNAs.
Используемый здесь термин "частица РНК-репликона альфавируса", сокращенно "RP", представляет собой полученный из альфавируса РНК-репликон, упакованный в структурные белки, например капсид и гликопротеины, которые также получены из альфавируса, например, как описано Pushko et al., [Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP не может размножаться в клеточных культурах или животных-хозяевах (без херперной плазмиды или аналогичного компонента), поскольку репликон не кодирует структурные компоненты альфавируса (например, капсид и гликопротеины). Транскрипция гетерологичных нуклеиновых последовательностей РНК-RP, кодирующих OspA и/или OspC, или их антигенные фрагменты, находится под контролем субгеномного (sg) альфавирусного промотора, в частности промотора 26S sg, предпочтительно промотора VEEV 26S sg.The term "alphavirus RNA replicon particle", as used herein, "RP" for short, is an alphavirus derived RNA replicon packaged in structural proteins, eg capsid and glycoproteins, which are also derived from alphavirus, eg as described by Pushko et al. , [ Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP cannot propagate in cell cultures or animal hosts (without a herper plasmid or similar component) because the replicon does not encode the structural components of the alphavirus (eg capsid and glycoproteins). Transcription of heterologous RNA-RP nucleic sequences encoding OspA and/or OspC, or antigenic fragments thereof, is under the control of a subgenomic (sg) alphavirus promoter, in particular the 26S sg promoter, preferably the VEEV 26S sg promoter.
В случае двойных RP-конструкций последовательностей, кодирующих OspA и OspC, каждая из кодирующих последовательностей конструкции может находиться под транскрипционным контролем отдельного субгеномного промотора. В такой двойной конструкции расположенная выше по ходу считывания кодирующая последовательность соответствует 5'-позиции промотора, а расположенная ниже кодирующая последовательность соответствует 3'-позиции промотора (положительная смысловая РНК). Предпочтительно расположенные выше и ниже кодирующие последовательности являются смежными.In the case of dual RP sequence constructs encoding OspA and OspC, each of the coding sequences of the construct may be under the transcriptional control of a separate subgenomic promoter. In this dual construct, the upstream coding sequence corresponds to the 5' position of the promoter, and the downstream coding sequence corresponds to the 3' position of the promoter (positive sense RNA). Preferably, the coding sequences above and below are contiguous.
В настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый" используют в качестве прилагательного для обозначения того, что модифицированное существительное подходит для применения в фармацевтическом продукте. При использовании, например, для описания вспомогательного вещества, входящего в состав фармацевтической вакцины, он характеризует вспомогательное вещество как совместимое с другими ингредиентами композиции и не являющееся излишне вредным для предполагаемого животного-реципиента, например собаки.In the present description, the term "pharmaceutically acceptable" is used as an adjective to indicate that the modified noun is suitable for use in a pharmaceutical product. When used, for example, to describe an excipient in a pharmaceutical vaccine, it characterizes the excipient as compatible with the other ingredients of the composition and not unnecessarily harmful to the intended recipient animal, such as a dog.
"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, субмукозальные инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию."Parenteral administration" includes subcutaneous injections, submucosal injections, intravenous injections, intramuscular injections, intradermal injections and infusion.
Термин "антигенный фрагмент", используемый здесь в применении к конкретному белку (например, белковому антигену), обозначает фрагмент этого белка (включающий большие фрагменты, в которых отсутствует только одна аминокислота полноразмерного белка), который обладает антигенными свойствами, то есть способностью специфически взаимодействовать с антиген-распознающей молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор Т-клеточного антигена. Например, антигенный фрагмент белка A внешней поверхности (OspA) представляет собой фрагмент белка OspA, который обладает антигенными свойствами. Предпочтительно антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для распознавания антителом и/или рецептором Т-клеток. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент по отношению к данному белковому антигену представляет собой фрагмент этого белка, который сохраняет по меньшей мере 25% антигенности полноразмерного белка. В предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 50% антигенности полноразмерного белка. В более предпочтительных вариантах осуществления он сохраняет по меньшей мере 75% антигенности полноразмерного белка. The term "antigenic fragment" as used herein in reference to a specific protein (e.g., protein antigen) refers to a fragment of that protein (including large fragments lacking only one amino acid of the full-length protein) that has antigenic properties, that is, the ability to specifically interact with an antigen-recognizing molecule of the immune system, such as an immunoglobulin (antibody) or a T-cell antigen receptor. For example, an antigenic fragment of the outer surface protein A (OspA) is a fragment of the OspA protein that has antigenic properties. Preferably, the antigenic fragment of the present invention is immunodominant for recognition by an antibody and/or a T cell receptor. In specific embodiments, an antigenic fragment with respect to a given protein antigen is a fragment of that protein that retains at least 25% of the antigenicity of the full-length protein. In preferred embodiments, the antigenic fragment retains at least 50% of the antigenicity of the full length protein. In more preferred embodiments, it retains at least 75% of the antigenicity of the full length protein.
Антигенные фрагменты могут содержать всего 7-20 аминокислот (см. выше) или, с другой стороны, они могут представлять собой большие фрагменты, в которых по сравнению с полноразмерным белком отсутствует всего одна аминокислота. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 25 до 150 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 50 до 250 аминокислотных остатков. Antigenic fragments may be as small as 7-20 amino acids (see above) or, alternatively, they may be large fragments missing only one amino acid compared to a full-length protein. In specific embodiments, the implementation of the antigenic fragment contains from 25 to 150 amino acid residues. In other embodiments, the implementation of the antigenic fragment contains from 50 to 250 amino acid residues.
"OspC-специфическое боррелиацидное антитело" представляет собой антитело, присутствующее, например, в сыворотке животного, вакцинированного B. burgdorferi ss 50772 (ATCC № PTA-439), и способное избирательно связываться с любым эпитопом антигена OspC и уничтожать спирохеты, зависимо или независимо от комплемента. "OspC7-специфическое боррелиацидное антитело" представляет собой антитело, присутствующее, например, в сыворотке животного, вакцинированного B. burgdorferi ss 50772 (ATCC № PTA-439), и способное избирательно связываться с 7 C-концевыми аминокислотами OspC, как описано Lovrich et al. [Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005)], и уничтожать спирохеты (обычно путем индукции комплемент-опосредованного мембраноатакующего комплекса). Специфичность OspC боррелиацидных антител хорошо известна. Например, боррелиацидные антитела OspC обычно детектируют в сыворотке пациентов с болезнью Лайма путем измерения чувствительности к B. burgdorferi ss 50772 в тесте на боррелиацидные антитела. Сыворотки пациентов-людей с близкородственными заболеваниями только в редких случаях (2%) содержат перекрестные антитела, способные также уничтожать штамм 50772 [подробно описано в Callister, et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4): 399-4021(1996)]. Более того, пептидный ELISA, в котором используется боррелиацидный эпитоп OspC7, позволяет точно обнаружить боррелиацидные антитела в сыворотке пациентов с болезнью Лайма, а сыворотка пациентов с другими близкородственными заболеваниями лишь иногда (<2%) содержит перекрестные антитела, которые также связывают пептид OspC7.An "OspC-specific borreliacid antibody" is an antibody present, for example, in the serum of an animal vaccinated with B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439), and is capable of selectively binding to any epitope of the OspC antigen and killing spirochetes, dependent or independent of complement. An "OspC7-specific borreliacid antibody" is an antibody present, for example, in the serum of an animal vaccinated with B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439) and capable of selectively binding to the 7 C-terminal amino acids of OspC as described by Lovrich et al. . [ clin. Diagn. Lab. Immunol ., 12:746-751, (2005)], and destroy spirochetes (usually by inducing a complement-mediated membrane attack complex). The specificity of OspC borreliacid antibodies is well known. For example, OspC borreliacid antibodies are typically detected in the sera of Lyme disease patients by measuring sensitivity to B. burgdorferi ss 50772 in a borreliacid antibody test. Sera from human patients with closely related diseases only rarely (2%) contain cross-over antibodies capable of also killing the 50772 strain [detailed in Callister, et al. , Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3 (4): 399-4021 (1996)]. Moreover, a peptide ELISA using the OspC7 borreliacid epitope accurately detects borreliacid antibodies in the sera of patients with Lyme disease, and the sera of patients with other closely related diseases only occasionally (<2%) contain cross-antibodies that also bind the OspC7 peptide.
Если "значительная доля" индуцированных вакциной OspC-специфичных боррелиацидных антител в сыворотке специфична к консервативному эпитопу OspC7, это означает, что происходит заметное снижение OspC-специфичных боррелиацидных антител в сыворотке после абсорбции сыворотки на OspC7. Предпочтительно данный термин определяют как по меньшей мере 2-кратное снижение титра боррелиацидных антител в сыворотке, обнаруженное с использованием B. burgdorferi ss 50772, и более предпочтительно, как 2-4-кратное или более сильное снижение титра боррелиацидных антител сыворотки после абсорбции этой сыворотки на OspC7.If a "significant proportion" of vaccine-induced OspC-specific borreliacid antibodies in serum is specific for a conserved OspC7 epitope, this means that there is a marked decrease in serum OspC-specific borreliacid antibodies after serum absorption to OspC7. Preferably, the term is defined as at least a 2-fold reduction in serum borreliacid antibody titer as detected using B. burgdorferi ss 50772, and more preferably as a 2-4-fold or greater reduction in serum borreliacid antibody titer following absorption of this serum to OspC7.
"Комплемент-специфичная реакция" представляет собой реакцию антитела, включающую уничтожение организма (организмов) Borrelia spp. под действием боррелиацидных антител, для которой требуется наличие комплемента в сыворотке."Complement-specific reaction" is an antibody reaction, including the destruction of the organism (organisms) Borrelia spp. under the action of borreliacid antibodies, which requires the presence of complement in the serum.
В настоящем описании термин "инактивированный" микроорганизм используется взаимозаменяемо с термином "убитый" микроорганизм. В целях настоящего изобретения "инактивированный" организм Borrelia burgdorferi ss представляет собой организм, способный вызывать иммунный ответ у животного, но не способный инфицировать животное. Изоляты Borrelia burgdorferi ss можно инактивировать средством, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, формалина, бета-пропиолактона, тимеросала или нагревания. В конкретном варианте осуществления изоляты Borrelia burgdorferi ss инактивируют бинарным этиленимином.In the present description, the term "inactivated" microorganism is used interchangeably with the term "killed" microorganism. For the purposes of the present invention, an "inactivated" organism Borrelia burgdorferi ss is an organism capable of inducing an immune response in an animal, but not capable of infecting the animal. Isolates of Borrelia burgdorferi ss can be inactivated with an agent selected from the group consisting of binary ethyleneimine, formalin, beta-propiolactone, thimerosal, or heat. In a specific embodiment, Borrelia burgdorferi ss isolates are inactivated with binary ethyleneimine.
Используемый здесь термин "неадъювантная вакцина" относится к вакцине, или поливалентной вакцине, которая не содержит адъюванта.As used herein, the term "non-adjuvanted vaccine" refers to a vaccine, or a multivalent vaccine, that does not contain an adjuvant.
B. burgdorferi ss 50772 (ATCC № PTA-439), описанный в US 6210676, и B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC № PTA-1680), описанный в US 6316005, помещены в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 University Boulevard Manassas (VA) 20110, 30 июля 1999 г и 1 апреля 2000 г, соответственно.B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439), described in US 6210676, and B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC No. PTA-1680), described in US 6316005, are placed in the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas (VA) 20110, July 30, 1999 and April 1, 2000, respectively.
В данном описании одна аминокислотная последовательность на 100% "идентична" второй аминокислотной последовательности или обладает 100% "идентичностью" со второй аминокислотной последовательностью, если аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Соответственно, аминокислотная последовательность на 50% "идентична" второй аминокислотной последовательности, если 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнение последовательностей проводят по непрерывному блоку аминокислотных остатков, входящих в состав конкретного белка, например, сравниваемого белка или фрагмента полипептида. В конкретном варианте осуществления учитывают выбранные делеции или вставки, которые в противном случае могли бы изменить соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.As used herein, one amino acid sequence is 100% "identical" to a second amino acid sequence, or has 100% "identity" to a second amino acid sequence if the amino acid residues of both sequences are identical. Accordingly, an amino acid sequence is 50% "identical" to a second amino acid sequence if 50% of the amino acid residues of the two amino acid sequences are identical. Sequence comparison is carried out on a contiguous block of amino acid residues that make up a particular protein, for example, the compared protein or polypeptide fragment. In a specific embodiment, the selected deletions or insertions are taken into account, which might otherwise change the correspondence between two amino acid sequences.
Используемый здесь процент идентичности нуклеотидной и аминокислотной последовательности можно определить с помощью алгоритмов C MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W, используя параметры выравнивания по умолчанию и параметры идентичности по умолчанию. Указанные коммерчески доступные программы также можно использовать для определения подобия последовательностей с использованием таких же или аналогичных параметров по умолчанию. В качестве альтернативы можно использовать расширенный поиск Blast в условиях фильтра по умолчанию, например, с использованием программы для наложения GCG (Genetics Computer Group, Руководство по программе для пакета GCG, версия 7, Madison, Wisconsin) и параметров по умолчанию.The percent nucleotide and amino acid sequence identity used here can be determined using the MacVector C algorithms (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996), and Clustal W using alignment parameters default and default identity settings. These commercially available programs can also be used to determine sequence similarity using the same or similar default settings. Alternatively, you can use Advanced Blast Search under default filter conditions, such as using a GCG overlay program (Genetics Computer Group, Program Guide for GCG Package, version 7, Madison, Wisconsin) and default settings.
Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными конфигурациями, стадиями способов и материалами, описанными в настоящем описании, поскольку такие конфигурации, стадии способов и материалы могут немного варьировать. Также следует понимать, что приведенная здесь терминология используется только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначается для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.It should also be understood that the present invention is not limited to the particular configurations, method steps, and materials described herein, as such configurations, method steps, and materials may vary slightly. It should also be understood that the terminology provided herein is used only to describe specific embodiments and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention is limited only by the appended claims and their equivalents.
Альтернативные штаммы OspAAlternative strains of OspA
Штаммы, содержащие антиген OspA, могут представлять собой обычные патогенные лабораторные изоляты B. burgdorferi ss [Barbour et al., J. Clin. Microbiol. 52: 478-484 (1985)], такого как B. burgdorferi ss B-31 (ATCC № 35210). Конкретным вторым организмом является представленный в качестве примера штамм B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC № PTA-1680). Другие штаммы, подходящие для использования в качестве второго организма в вакцинных композициях, оптимизированных для регионов за пределами Северной Америки, включают, например, следующие штаммы: B. burgdorferi ss B-31 (ATCC № 35210), B. afzelii (например, доступный как ATCC 51567) и B. garinii (например, доступный как ATCC № 51383 и 51991), а также перечисленные в таблице 1 ниже.Strains containing the OspA antigen may be common pathogenic laboratory isolates of B. burgdorferi ss [Barbour et al., J. Clin. microbiol. 52: 478-484 (1985)], such as B . burgdorferi ss B-31 (ATCC no. 35210). A specific second organism is the exemplary strain B. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC No. PTA-1680). Other strains suitable for use as a second organism in vaccine compositions optimized for regions outside of North America include, for example, the following strains: B. burgdorferi ss B-31 (ATCC No. 35210), B. afzelii (for example, available as ATCC 51567) and B. garinii (for example, available as ATCC Nos. 51383 and 51991), as well as those listed in Table 1 below.
Таблица 1Table 1
1 Lagal et al., J. Clin. Microbiol. 41:5059-5065 (2003) 1 Lagal et al. , J. Clin. microbiol . 41:5059-5065 (2003)
2 Heikkila et al., J. Clin. Microbiol. 40:1174-1180 (2002) 2 Heikkila et al. , J. Clin. microbiol. 40:1174-1180 (2002)
Композицию вакцины можно вводить любым стандартным способом, например, путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, пероральной, интраназальной, внутрикожной и/или внутрибрюшинной вакцинации. Специалисту должно быть понятно, что вакцинную композицию предпочтительно получают соответствующим образом для каждого типа животного-реципиента и способа введения.The vaccine composition can be administered by any standard route, for example, by intravenous, intramuscular, subcutaneous, oral, intranasal, intradermal and/or intraperitoneal vaccination. The specialist should be clear that the vaccine composition is preferably obtained in an appropriate manner for each type of recipient animal and route of administration.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам иммунизации собак против B. burgdorferi ss и других видов Borrelia. Один такой способ включает введение собакам иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению, так чтобы собака продуцировала соответствующие OspA и/или OspC. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой боррелиацидные антитела.Thus, the present invention also relates to methods for immunizing dogs against B. burgdorferi ss and other Borrelia species. One such method comprises administering to dogs an immunologically effective amount of the vaccine of the present invention such that the dog produces the appropriate OspA and/or OspC. In specific embodiments, the antibodies are borreliacid antibodies.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Нижеследующие примеры служат для дальнейшего понимания изобретения, но никоим образом не предназначаются для ограничения эффективного объема изобретения.The following examples serve to further the understanding of the invention, but are not intended to limit the effective scope of the invention in any way.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
КОНСТРУИРОВАНИЕ ВАКЦИН OspA и OspC, ДОСТАВЛЯЕМЫХ ЧАСТИЦАМИ РНК-РЕПЛИКОНОВ АЛЬФАВИРУСАCONSTRUCTION OF OspA AND OspC VACCINES DELIVERED BY ALPHAVIRUS RNA REPLICON PARTICLES
РНК-вирусы используют в качестве векторов-переносчиков для введения вакцинных антигенов, встроенных в их геномы посредством генетических манипуляций. Однако их использование до настоящего времени было ограничено, в основном, включением вирусных антигенов в РНК-вирус и затем введением вируса реципиенту-хозяину. Результатом является индукция защитных антител против включенных вирусных антигенов. Например, вектор на основе альфавирусного репликона используют для защиты мышей от нейротоксина ботулина и сибирской язвы посредством экспрессии нейротоксина HC C. botulinum или защитного антигена B. anthracis, соответственно [Lee et al., Vaccine 24 (47-48) 6886-6892 (2006)]. Частицы РНК-репликона альфавируса используют для кодирования патогенных антигенов. Такие платформы альфавирусных репликонов разработаны на основе нескольких разных альфавирусов, таких как вирус венесуэльского конского энцефалита (VEE) [Pushko et al., Virology 239: 389-401 (1997)], вирус Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439 -6446 (1993), содержание которого полностью включено в настоящий документ] и вирус леса Семлики (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1611 (1991), содержание которого настоящим включено в данный документ во всей полноте]. Кроме того, частицы РНК-репликона альфавируса являются основой нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птицы. К ним относятся: вакцина против эпизоотической диареи свиней, РНК-частица (код продукта 19U5.P1), вакцина против свинного гриппа, РНК (код продукта 19A5.D0), вакцина против птичьего гриппа, РНК (код продукта 1905.D0) и рецептурный препарат, РНК-частица (код продукта 9PP0.00). Как описано ниже, исследована способность векторной системы на основе РНК-репликона альфавируса индуцировать у собак продуцирование боррелиацидных антител, специфичных к OspA, OspC и DbpA.RNA viruses are used as carrier vectors to introduce vaccine antigens inserted into their genomes through genetic manipulation. However, their use has so far been limited mainly to incorporating viral antigens into an RNA virus and then introducing the virus into the recipient host. The result is the induction of protective antibodies against the incorporated viral antigens. For example, an alphavirus replicon vector is used to protect mice against botulinum neurotoxin and anthrax by expressing C. botulinum neurotoxin H C or B. anthracis protective antigen, respectively [Lee et al., Vaccine 24 (47-48) 6886-6892 ( 2006)]. Alphavirus replicon RNA particles are used to encode pathogenic antigens. Such alphavirus replicon platforms have been developed from several different alphaviruses, such as the Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus [Pushko et al ., Virology 239: 389-401 (1997)], the Sindbis virus (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439 -6446 (1993), the contents of which are incorporated herein in their entirety] and Semliki Forest Virus (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1611 (1991), the contents of which are hereby incorporated herein in its entirety]. In addition, alphavirus replicon RNA particles are the basis of several USDA-licensed swine and poultry vaccines. These include: porcine epizootic diarrhea vaccine, RNA particle (product code 19U5.P1), swine flu vaccine, RNA (product code 19A5.D0), avian influenza vaccine, RNA (product code 1905.D0) and prescription drug, RNA particle (product code 9PP0.00). As described below, the ability of the alphavirus RNA replicon vector system to induce the production of borreliacid antibodies specific for OspA, OspC and DbpA in dogs was tested.
Включение последовательностей, кодирующих OspA или OspC в альфавирусный репликон: Incorporation of sequences encoding OspA or OspC into an alphavirus replicon :
Аминокислотные последовательности OspA (штамм 297) и OspC (штамм 50772) используют для получения оптимизированных по кодонам (частота использования кодонов у Canis lupus) нуклеотидных последовательностей путем компьютерного моделирования. Оптимизированные последовательности получает коммерческий поставщик в виде синтетической ДНК (ATUM, Newark, CA).The amino acid sequences of OspA (strain 297) and OspC (strain 50772) are used to generate codon-optimized ( canis lupus codon frequency) nucleotide sequences by computer simulation. The optimized sequences are obtained from a commercial supplier in the form of synthetic DNA (ATUM, Newark, CA).
Векторы репликона VEE, предназначенные для экспрессии OspA или OspC, сконструированы по описанному ранее способу [см. US 9441247 B2; содержание которого настоящим включено в данный документ посредством ссылки], с нижеследующими модификациями. Вектор на основе репликона, полученного из TC-83 "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляют рестриктазами AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержащую оптимизированную по кодонам последовательность открытой рамки считывания OspA или OspC,VEE replicon vectors designed to express OspA or OspC were constructed as described previously [cf. US 9441247 B2; the contents of which are hereby incorporated herein by reference], with the following modifications. The replicon vector derived from TC-83 "pVEK" [disclosed and described in US 9441247 B2] is digested with AscI and PacI restriction enzymes. A DNA plasmid containing a codon-optimized sequence of the OspA or OspC open reading frame,
с 5'-фланкирующей последовательностью (5'-GGCGCGCCGCACC-3') [SEQ ID NO: 5] иwith a 5' flanking sequence (5'-GGCGCGCCGCACC-3') [SEQ ID NO: 5] and
3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’),3'-flanking sequence (5'-TTAATTAA-3'),
аналогичным образом расщепляют рестриктазами AscI и PacI. Затем синтетическую генную кассету лигируют в расщепленный вектор pVEK, и полученные клоны переименовывают в "pVHV-OspA" и "pVHV-OspC".similarly cleaved with restriction endonucleases AscI and PacI . The synthetic gene cassette is then ligated into the digested pVEK vector and the resulting clones are renamed "pVHV-OspA" and "pVHV-OspC".
Получение частиц РНК-репликона ТС-83 (RP) проводят по описанным ранее способам [U.S. 9441247 B2 и US 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки]. Коротко говоря, ДНК-вектор на основе репликона pVHV и хелперные ДНК-плазмиды линеаризуют с помощью рестриктазы NotI и затем подвергают транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы MegaScript T7 и cap-аналога (Promega, Madison, WI). Важно, что хелперные РНК, используемые для продукции, не содержат субгеномную промоторную последовательность VEE, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91 (Часть 7): 1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК репликона и хелперные компоненты объединяют и смешивают с суспензией клеток Vero, проводят электропорацию в кюветах 4 мм и возвращают в бессывороточные среды для культивирования клеток, полученные от Thermo Fisher, Waltham MA, продаваемые под названием OptiPro SFM®. После инкубации в течение ночи частицы РНК-репликонов альфавируса очищают от клеток и среды путем пропускания суспензии через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap (3M, Maplewood, MN), промывания фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозы (масс./об.), и, наконец, элюирования оставшихся RP буфером, содержащим 400 мМ NaCl. Элюированные RP доводят до конечной концентрации сахарозы 5% (масс./об.), пропускают через мембранный фильтр 0,22 микрон и распределяют по аликвотам для хранения. Титр функциональных RP определяют с помощью иммунофлуоресцентного анализа на инфицированных монослоях клеток Vero. Партии RP идентифицируют в соответствии с геном, кодируемым упакованным репликоном: RP-OspA или RP-OspC.Obtaining particles of RNA replicon TS-83 (RP) is carried out according to the previously described methods [US 9441247 B2 and US 8460913 B2; the contents of which are incorporated herein by reference]. Briefly, pVHV replicon vector DNA and helper DNA plasmids are linearized with NotI and then transcribed in vitro using MegaScript T7 RNA polymerase and a cap analog (Promega, Madison, WI). Importantly, the helper RNAs used for production do not contain the VEE subgenomic promoter sequence as previously described [Kamrud et al., J Gen Virol . 91 (Part 7): 1723-1727 (2010)]. Purified replicon RNA and helper components are combined and mixed with the Vero cell suspension, electroporated in 4 mm cuvettes and returned to serum-free cell culture media obtained from Thermo Fisher, Waltham MA, sold under the name OptiPro SFM®. After overnight incubation, alphavirus replicon RNA particles are cleared of cells and media by passing the suspension through a ZetaPlus BioCap (3M, Maplewood, MN) depth filter, washing with phosphate buffered saline containing 5% sucrose (w/v), and finally, eluting the remaining RPs with a buffer containing 400 mM NaCl. The eluted RPs are adjusted to a final sucrose concentration of 5% (w/v), passed through a 0.22 micron membrane filter and aliquoted for storage. The functional RP titer is determined by immunofluorescence assay on infected Vero cell monolayers. RP batches are identified according to the gene encoded by the packaged replicon: RP-OspA or RP-OspC.
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ КОНСТРУКЦИЮ RP-OspAVACCINE CONTAINING RP-OspA CONSTRUCTION
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS
Конструкция: Конструкцию RP-OspA получают, как описано выше, с использованием нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген, содержащий иммуногенные эпитопы белка А внешней поверхности. Construct : The RP-OspA construct is prepared as described above using a nucleotide sequence encoding an antigen containing immunogenic epitopes of outer surface protein A.
Животные: Биглей возрастом пять месяцев (Marshall Bioresources) содержат совместно на приподнятых площадках для выгула собак, где еда и вода находятся в свободном доступе. Animals : Five-month-old Beagles (Marshall Bioresources) are kept cooperatively in raised dog run areas where food and water are freely available.
Получение вакцины RP-OspA: РНК OspA вместе с хелперными РНК вводят в клетки Vero путем электропорации. После совместной электропорации OspA упаковывается в RP, образуя RP- OspA. Затем RP-OspA смешивают со стабилизатором (сахароза, экстракт казеина, содержащий аминокислоты и белки, желатин), 0,9% солевым раствором, амфотерицином B и гентамицином, так чтобы доза в объеме 1,0 мл содержала 1,0×108 частиц репликона/мл. Затем вакцину лиофилизируют. Preparation of the RP-OspA vaccine : OspA RNA along with helper RNAs are introduced into Vero cells by electroporation. After co-electroporation, OspA packs into RP to form RP-OspA. RP-OspA is then mixed with a stabilizer (sucrose, casein extract containing amino acids and proteins, gelatin), 0.9% saline, amphotericin B and gentamicin so that a 1.0 ml dose contains 1.0×10 8 particles replicon/ml. The vaccine is then lyophilized.
Вакцинация и сбор сыворотки: Собак вакцинируют подкожно в шею дозой вакцины RP-OspA 1 мл и в качестве повторной иммунизации вводят еще дозу 1 мл через 21 день. Целую кровь собирают на 7, 14, 20, 29, 35 и 42 дни исследования путем венопункции яремной вены. Сыворотку отделяют центрифугированием и хранят при -10°C или при более низкой температуре до тестирования. Vaccination and Serum Collection : Dogs are vaccinated subcutaneously in the neck with a 1 ml dose of RP-OspA vaccine and given a further 1 ml dose 21 days later as a booster. Whole blood is collected on days 7, 14, 20, 29, 35 and 42 of the study by venipuncture of the jugular vein. Serum is separated by centrifugation and stored at -10°C or lower until testing.
Детекция боррелиацидных антител против OspA: Боррелиацидные антитела против OspA детектируют методом проточной цитометрии с использованием B. burgdorferi ss S-1-10 [Callister et al., Arch. Intern. Med. 154:1625-1632 (1994)]. Detection of anti-OspA borreliacid antibodies : Anti-OspA borreliacid antibodies are detected by flow cytometry using B. burgdorferi ss S-1-10 [Callister et al., Arch. Intern. Med . 154:1625-1632 (1994)].
Детекция антител IgG против OspA: Опсонизирующие антитела IgG против OspA детектируют методом ИФА. Detection of anti-OspA IgG antibodies : Opsonizing anti-OspA IgG antibodies are detected by ELISA.
РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS
Вакцинация с использованием вакцины RP-OspA надежно индуцирует высокий уровень антител IgG, причем гуморальный ответ включает выработку значительного количества боррелиацидных антител против OspA через 2 недели после повторной вакцинации.Vaccination with the RP-OspA vaccine reliably induces high levels of IgG antibodies, with a humoral response including the production of significant anti-OspA borreliacid antibodies 2 weeks after booster vaccination.
ТАБЛИЦА 2TABLE 2
Средние титры антител (n=5) после вакцинации RP-OspAMean antibody titers (n=5) after RP-OspA vaccination
a ND=не обнаружены a ND=not found
Результаты, приведенные выше в таблице 2, демонстрируют способность вакцины, содержащей RP-OspA, индуцировать значительные уровни боррелиацидных антител против OspA.The results in Table 2 above demonstrate the ability of the RP-OspA containing vaccine to induce significant levels of anti-OspA borreliacid antibodies.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ КОНСТРУКЦИЮ RP-OspCVACCINE CONTAINING RP-OspC CONSTRUCTION
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS
Конструкция: Конструкцию RP-OspC получают, как описано выше, с использованием нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген, содержащий иммуногенные эпитопы белка С внешней поверхности. Construct : The RP-OspC construct is prepared as described above using a nucleotide sequence encoding an antigen containing immunogenic epitopes of the C protein on the outer surface.
Животные: Биглей возрастом пять месяцев (Marshall Bioresources) содержат совместно на приподнятых площадках для выгула собак, где еда и вода находятся в свободном доступе. Animals : Five-month-old Beagles (Marshall Bioresources) are kept cooperatively in raised dog run areas where food and water are freely available.
Получение вакцины RP-OspC: РНК OspC вместе с хелперными РНК вводят в клетки Vero путем электропорации. После совместной электропорации OspC упаковывается в RP, образуя RP-OspC. Затем RP-OspC смешивают со стабилизатором (сахароза, экстракт казеина, содержащий аминокислоты и белки, желатин), 0,9% солевым раствором, амфотерицином B и гентамицином, так чтобы доза в объеме 1,0 мл содержала 1,0×108 частиц репликона/мл. Затем вакцину лиофилизируют. Preparation of the RP-OspC vaccine : OspC RNA along with helper RNAs are introduced into Vero cells by electroporation. After co-electroporation, OspC packs into RP, forming RP-OspC. RP-OspC is then mixed with a stabilizer (sucrose, casein extract containing amino acids and proteins, gelatin), 0.9% saline, amphotericin B and gentamicin so that a 1.0 ml dose contains 1.0×10 8 particles replicon/ml. The vaccine is then lyophilized.
Вакцинация и сбор сыворотки: Собак вакцинируют подкожно в шею дозой вакцины RP-OspC 1 мл и в качестве повторной иммунизации вводят еще дозу 1 мл через 21 день. Целую кровь собирают на 7, 14, 20, 29, 35 и 42 дни исследования путем венопункции яремной вены. Сыворотку отделяют центрифугированием и хранят при -10°C или при более низкой температуре до тестирования. Vaccination and Serum Collection : Dogs are vaccinated subcutaneously in the neck with a 1 ml dose of RP-OspC vaccine and given a further 1 ml dose 21 days later as a booster. Whole blood is collected on days 7, 14, 20, 29, 35 and 42 of the study by venipuncture of the jugular vein. Serum is separated by centrifugation and stored at -10°C or lower until testing.
Детекция боррелиацидных антител против OspC: Боррелиацидные антитела против OspC детектируют методом проточной цитометрии с использованием B. burgdorferi ss 50772 [Callister et al., Arch. Intern. Med. 154:1625-1632 (1994)]. Anti-OspC borreliacid antibody detection : Anti-OspC borreliacid antibodies are detected by flow cytometry using B. burgdorferi ss 50772 [Callister et al., Arch. Intern. Med . 154:1625-1632 (1994)].
Детекция антител IgG против OspC: Опсонизирующие антитела IgG против OspC детектируют методом ИФА. Detection of anti-OspC IgG antibodies : Opsonizing anti-OspC IgG antibodies are detected by ELISA.
РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS
Вакцинация с использованием вакцины RP-OspC надежно индуцирует высокий уровень антител IgG, причем гуморальный ответ включает выработку значительного количества боррелиацидных антител против OspC через 2 недели после повторной вакцинации.Vaccination with the RP-OspC vaccine reliably induces high levels of IgG antibodies, with a humoral response including the production of a significant amount of anti-OspC borreliacid antibodies 2 weeks after booster vaccination.
ТАБЛИЦА 3TABLE 3
Средние титры антител (n=5) после вакцинации RP-OspCMean antibody titers (n=5) after RP-OspC vaccination
a ND=не обнаружены a ND=not found
Результаты демонстрируют способность вакцины, содержащей RP-OspC, индуцировать значительные уровни боррелиацидных антител против OspC.The results demonstrate the ability of the RP-OspC containing vaccine to induce significant levels of anti-OspC borreliacid antibodies.
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ RP-OspA и RP-OspCCOMBINATION VACCINE CONTAINING RP-OspA and RP-OspC
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS
Конструкция: Конструкции RP-OspA и RP-OspC получают по описанному выше способу. Construct : The RP-OspA and RP-OspC constructs were prepared as described above.
Животные: Биглей возрастом пять месяцев (Marshall Bioresources) содержат совместно на приподнятых площадках для выгула собак, где еда и вода находятся в свободном доступе. Animals : Five-month-old Beagles (Marshall Bioresources) are kept cooperatively in raised dog run areas where food and water are freely available.
Получение комбинированной вакцины RP-OspA и RP-OspC: Антигены RP-OspA и RP-OspC смешивают со стабилизатором (сахароза, экстракт казеина, содержащий аминокислоты и белки, желатин), 0,9% солевым раствором, амфотерицином B и гентамицином, так чтобы доза в объеме 1,0 мл содержала 1,0×108 частиц репликона/мл. Затем вакцину лиофилизируют. Preparation of the combined RP-OspA and RP-OspC vaccine : RP-OspA and RP-OspC antigens are mixed with a stabilizer (sucrose, casein extract containing amino acids and proteins, gelatin), 0.9% saline, amphotericin B and gentamicin, so that the 1.0 ml dose contained 1.0×10 8 replicon particles/ml. The vaccine is then lyophilized.
Вакцинация и сбор сыворотки: Собак вакцинируют подкожно в шею дозой комбинированной вакцины 1 мл и в качестве повторной иммунизации вводят еще дозу 1 мл через 21 день. Целую кровь собирают на 7, 14, 20, 29, 35 и 42 дни исследования путем венопункции яремной вены. Сыворотку отделяют центрифугированием и хранят при -10°C или при более низкой температуре до тестирования. Vaccination and Serum Collection : Dogs are vaccinated subcutaneously in the neck with a 1 ml dose of the combination vaccine and a further 1 ml dose is given as a booster 21 days later. Whole blood is collected on days 7, 14, 20, 29, 35 and 42 of the study by venipuncture of the jugular vein. Serum is separated by centrifugation and stored at -10°C or lower until testing.
Детекция боррелиацидных антител: Боррелиацидные антитела против OspA and OspC детектируют методом проточной цитометрии с использованием B. burgdorferi ss S-1-10 или B. burgdorferi ss 50772, соответственно [Callister et al., Arch. Intern. Med. 154:1625-1632 (1994)]. Detection of Borreliacid Antibodies : Borreliacid antibodies against OspA and OspC are detected by flow cytometry using B. burgdorferi ss S-1-10 or B. burgdorferi ss 50772, respectively [Callister et al., Arch. Intern. Med . 154:1625-1632 (1994)].
Детекция антител IgG: Антитела IgG против OspA и OspC детектируют методом ИФА. Detection of IgG antibodies : IgG antibodies against OspA and OspC are detected by ELISA.
РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS
Вакцинация с использованием комбинированной вакцины надежно индуцирует высокий уровень IgG и боррелиацидные антитела против OspA и OspC через 2 недели после повторной вакцинации.Vaccination with the combination vaccine reliably induces high levels of IgG and borreliacid antibodies against OspA and OspC 2 weeks after booster vaccination.
Результаты демонстрируют способность комбинированной вакцины, содержащей RP-OspA и RP-OspC, индуцировать высокие уровни боррелиацидных антител против OspA и OspC и индуцировать высокие уровни опсонизирующих антител IgG против RP-OspC.The results demonstrate the ability of the combination vaccine containing RP-OspA and RP-OspC to induce high levels of borreliacid antibodies against OspA and OspC and to induce high levels of opsonizing IgG antibodies against RP-OspC.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ RP-OspA и RP-OspCCOMBINATION VACCINE CONTAINING RP-OspA and RP-OspC
Конструкции: Конструкции RP-OspA и RP-OspC получают по описанному выше способу. Constructs : The RP-OspA and RP-OspC constructs were prepared as described above.
Животные: Биглей возрастом три месяца (Ridglan Farms) размещают совместно на площадках для выгула собак, где еда и вода находятся в свободном доступе. Animals : Three-month-old Beagles (Ridglan Farms) are co-housed in dog run areas where food and water are freely available.
Получение комбинированной вакцины RP-OspA и RP-OspC: Группа лечения А получает сочетание инактивированных бактериальных вакцин BEI штаммов S-1-10 и 50772 (смешанных с 5% раствором адъюванта Emulsigen-MVP Laboratories Inc., Omaha, US). Антигены RP-OspA и RP-OspC смешивают со стабилизатором (сахароза, экстракт казеина, содержащий аминокислоты и белки, желатин), 0,9% солевым раствором, амфотерицином B и гентамицином так, чтобы доза в объеме 1,0 мл содержала 5,0×107 (группа лечения B), 5,0×106 (группа лечения C) или 5,0×105 (группа лечения D) частиц репликона каждой конструкции/мл. Вакцины лиофилизируют. Preparation of RP-OspA and RP-OspC Combined Vaccine : Treatment Group A receives a combination of BEI strains S-1-10 and 50772 inactivated bacterial vaccines (mixed with 5% adjuvant solution of Emulsigen-MVP Laboratories Inc., Omaha, US). RP-OspA and RP-OspC antigens are mixed with a stabilizer (sucrose, casein extract containing amino acids and proteins, gelatin), 0.9% saline, amphotericin B and gentamicin so that a 1.0 ml dose contains 5.0 x10 7 (treatment group B), 5.0 x 10 6 (treatment group C) or 5.0 x 10 5 (treatment group D) of each design replicon particles/ml. Vaccines are lyophilized.
Вакцинация и реакция в месте инъекции: Собак вакцинируют подкожно в шею дозой комбинированной вакцины 1 мл и в качестве повторной иммунизации вводят еще дозу 1 мл через 21 день. У собак регистрируют реакции в месте инъекции на 3 и 4 дни исследования после первой вакцинации и через 24 и 25 дней после второй вакцинации до тех пор, пока реакция не перестает ощущаться (таблица 4). Реакции в месте инъекции оценивают по типу и размеру. Реакции оценивают как видимые, утолщающие, мягкие, твердые или слабые, а размер реакции оценивают как S1 <1,0 см, S2=1,0-2,0 см или S3 >2,0 см. Vaccination and Injection Site Reactions : Dogs are vaccinated subcutaneously in the neck with a 1 ml dose of the combination vaccine and a further 1 ml dose is administered as a booster 21 days later. In dogs, reactions at the injection site are recorded on study days 3 and 4 after the first vaccination and 24 and 25 days after the second vaccination until the reaction is no longer felt (table 4). Injection site reactions are graded by type and size. Reactions are rated as visible, thickening, soft, hard, or weak, and reaction size is rated as S1 <1.0 cm, S2=1.0-2.0 cm, or S3 >2.0 cm.
РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS
ТАБЛИЦА 4TABLE 4
Реакции в месте инъекцииReactions at the injection site
Цельнокле-точная бактериальная вакцина
Мин. защитная дозаA
Whole cell bacterial vaccine
Min. protective dose
OspA, OspC7, DbpA-tpA
5,0×107 B
OspA, OspC7, DbpA-tpA
5.0×10 7
OspA, OspC7, DbpA-tPA
5,0×106 C
OspA, OspC7, DbpA-tPA
5.0×10 6
OspA, OspC7, Dbpa-tpA
5,0×105 D
OspA, OspC7, Dbpa-tpA
5.0×10 5
S1 <1,0 см; S2=1,0-2,0 см; S3 >2,0 см; Т=утолщение; S=мягкий; H=жесткий; V=видимыйS1 <1.0 cm; S2=1.0-2.0 cm; S3 >2.0 cm; T=thickness; S=soft; H=hard; V=visible
o=нет реакцииo=no response
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА С ДВОЙНОЙ ВСТАВКОЙ КОНСТРУКЦИЙ RP-OspA/CCOMBINED VACCINE WITH DOUBLE INSERT OF RP-OspA/C STRUCTURES
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS
Включение последовательностей, кодирующих OspA и OspC, в альфавирусный репликон: Incorporation of sequences encoding OspA and OspC into the alphavirus replicon :
Вектор "pVEK" на основе репликона, полученного из TC-83, расщепленный AscI и PacI, получают по способу, описанному в примере 1. Две ДНК-плазмиды, содержащие оптимизированные по кодонам последовательности открытых рамок считывания как OspA, так и OspC, с 5'-фланкирующей последовательностью (5'-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 5] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляют рестриктазами AscI и PacI. Конструкция кассеты синтетического гена содержит одну из последовательностей открытой рамки считывания (OspA или OspC), некодирующую последовательность, содержащую субгеномный промотор альфавируса и фланкирующие последовательности, а затем последовательность другой целевую открытой рамки считывания (OspA или OspC). Субгеномный промотор альфавируса и фланкирующие последовательности представляют собойA TC-83 derived replicon vector "pVEK" digested with AscI and PacI was prepared as described in Example 1. Two DNA plasmids containing codon-optimized open reading frame sequences of both OspA and OspC with The '-flanking sequence (5'-GGCGCGCCGCACC-3') [SEQ ID NO: 5] and the 3'-flanking sequence (5'-TTAATTAA-3') are similarly digested with AscI and PacI restriction enzymes. The synthetic gene cassette construct contains one of the open reading frame sequences (OspA or OspC), a non-coding sequence containing the alphavirus subgenomic promoter and flanking sequences, and then another target open reading frame sequence (OspA or OspC). The alphavirus subgenomic promoter and flanking sequences are
Этот дизайн дублирует короткую часть 3' nsP4 открытой рамки считывания, нативный субгеномный промотор альфавируса и 5'-нетранслируемый фрагмент нативной субгеномной последовательности. Также присутствуют участки распознавания рестрикционных ферментов, некодирующие случайные последовательности, участки связывания праймеров и консенсусная последовательность Козака, которая непосредственно примыкает к 5’-концу второй открытой рамки считывания. Затем синтетические генные кассеты лигируют в расщепленный вектор pVEK и полученным клонам дают новые названия "pVDG-OspA-OspC" или "pVDG-OspC-OspA", где названия приведены в порядке относительно 5'- и 3’-положения в кассете.This design duplicates the short portion of the 3' nsP4 open reading frame, the native alphavirus subgenomic promoter, and the 5' untranslated fragment of the native subgenomic sequence. Also present are restriction enzyme recognition sites, non-coding random sequences, primer binding sites, and a Kozak consensus sequence that is immediately adjacent to the 5' end of the second open reading frame. The synthetic gene cassettes are then ligated into a digested pVEK vector and the resulting clones are given new names "pVDG-OspA-OspC" or "pVDG-OspC-OspA" where the names are given in order of 5' and 3' positions in the cassette.
RP получают по способу, описанному в примере 1.RP is obtained according to the method described in example 1.
Животные: Биглей возрастом 7-8 недель (Ridglan Farms) содержат совместно на площадках для выгула собак, где еда и вода находятся в свободном доступе. Animals : 7-8 week old Beagles (Ridglan Farms) are kept cooperatively on dog run areas where food and water are freely available.
Получение вакцин RP-OspA/OspC или RP-OspC/OspA: Obtaining RP-OspA/OspC or RP-OspC/OspA vaccines :
РНК-репликон каждой конструкции вместе с хелперными РНК (полученными из капсидных хелперных и гликопротеиновых последовательностей VEE) вводят методом электропорации в клетки Vero. Каждый репликон упаковывается в RP после совместной электропорации с образованием RP-антигенов. Полученные RP затем собирают в фосфатный буфер, содержащий 0,4 М NaCl и 5% (масс./об.) сахарозы, и количественно определяют путем иммунофлуоресцентного анализа.The replicon RNA of each construct, together with helper RNAs (derived from VEE capsid helper and glycoprotein sequences), are electroporated into Vero cells. Each replicon is packaged into RP after co-electroporation to form RP antigens. The resulting RPs are then collected in phosphate buffer containing 0.4 M NaCl and 5% (w/v) sucrose and quantified by immunofluorescence analysis.
Три отдельные вакцины смешивают со стабилизатором (сахароза, N-Z амин, желатин) и 0,9% солевым раствором так, чтобы 1 мл содержал 1 дозу. Целевая доза вакцины в группе лечения А составляет 5,0×107 каждого отдельного антигена RP-OspA и RP-OspC. Целевая доза вакцины в группе лечения B составляет 5,0×107 двойной антигенной конструкции RP-OspA/OspC. Целевая доза вакцины в группе лечения C составляет 5,0×107 двойной антигенной конструкции RP-OspC/OspA. Вакцины лиофилизируют.Three separate vaccines are mixed with a stabilizer (sucrose, NZ amine, gelatin) and 0.9% saline so that 1 ml contains 1 dose. The target vaccine dose in treatment group A is 5.0×10 7 of each individual RP-OspA and RP-OspC antigen. The target vaccine dose in treatment group B is 5.0×10 7 of the RP-OspA/OspC dual antigen construct. The target vaccine dose in treatment group C is 5.0×10 7 of the RP-OspC/OspA dual antigen construct. Vaccines are lyophilized.
Вакцинация и сбор сыворотки: Vaccination and serum collection :
Собак вакцинируют подкожно в шею дозой вакцины 1 мл и в качестве повторной иммунизации вводят еще дозу 1 мл через 21 день. Целую кровь собирают на 1, 28, 35, 70, 92 и 119 дни исследования путем венопункции яремной вены. Сыворотку отделяют центрифугированием и хранят при -10°C или при более низкой температуре до тестирования.Dogs are vaccinated subcutaneously in the neck with a 1 ml dose of vaccine and a further 1 ml dose is given as a booster 21 days later. Whole blood is collected on days 1, 28, 35, 70, 92 and 119 of the study by venipuncture of the jugular vein. Serum is separated by centrifugation and stored at -10°C or lower until testing.
Детекция боррелиацидных антител против OspA и OspC: Боррелиацидные антитела против OspA детектируют методом проточной цитометрии с использованием B. burgdorferi ss S-1-10 [Callister et al., Arch. Intern. Med. 154:1625-1632 (1994)]. Боррелиацидные антитела против OspC детектируют методом проточной цитометрии с использованием B. burgdorferi ss 50772 [Callister et al., Arch. Intern. Med. 154:1625-1632 (1994)]. Detection of borreliacid antibodies against OspA and OspC : Borreliacid antibodies against OspA are detected by flow cytometry using B. burgdorferi ss S-1-10 [Callister et al., Arch. Intern. Med . 154:1625-1632 (1994)]. Borreliacid antibodies against OspC are detected by flow cytometry using B. burgdorferi ss 50772 [Callister et al., Arch. Intern. Med . 154:1625-1632 (1994)].
РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS
Вакцина, содержащая отдельные антигены RP-OspA и RP-OspC, индуцирует умеренные уровни боррелиацидных антител через 1 неделю после повторной вакцинации. Через 1 неделю после повторной вакцинации вакцина, содержащая двойную антигенную конструкцию RP-OspA/OspC, индуцирует высокие уровни боррелиацидных антител против OspC, но относительно низкие уровни боррелиацидных антител против OspA. И наоборот, вакцина, содержащая двойную антигенную конструкцию RP-OspC/OspA, индуцирует высокие уровни боррелиацидных антител против OspA, но относительно низкие уровни боррелиацидных антител против OspC. Полученные данные свидетельствуют о том, что более сильный ответ, опосредуемый боррелиацидными антителами против OspA или OspC, наблюдается в том случае, если этот ген находится в конструкции в нижестоящем положении (таблица 5).A vaccine containing separate RP-OspA and RP-OspC antigens induces moderate levels of borreliacid antibodies 1 week after booster vaccination. At 1 week post-vaccination, the vaccine containing the RP-OspA/OspC dual antigen construct induces high levels of anti-OspC borreliacid antibodies but relatively low levels of anti-OspA borreliacid antibodies. Conversely, a vaccine containing the RP-OspC/OspA dual antigen construct induces high levels of anti-OspA borreliacid antibodies but relatively low levels of anti-OspC borreliacid antibodies. The data obtained indicate that a stronger response mediated by borreliacid antibodies against OspA or OspC is observed if this gene is in the construct in a downstream position (table 5).
ТАБЛИЦА 5TABLE 5
Результаты по боррелиацидным антителамResults for borreliacid antibodies
OspA+OspC
(отдельные конструкции)Treatment group A
OspA+OspC
(separate designs)
OspA/OspC
(двойная конструкция)Treatment group B
OspA/OspC
(double design)
OspA/OspC
(двойная конструкция)Treatment Group C
OspA/OspC
(double design)
ПлацебоTreatment Group D
placebo
*Значение 40 используют для определения среднего геометрического*The value 40 is used to determine the geometric mean
Заражение клещами Ixodes scapularis, инфицированными B. burgdorferi: Infestation with Ixodes scapularis ticks infected with B. burgdorferi :
Экспериментальное заражение клещами, инфицированными B. burgdorferi, проводят примерно через 2 недели после второй вакцинации. Коротко говоря, на выбритую сторону каждой собаки помещают 9 самок и 8 самцов взрослых клещей в резиновой чашке, которую фиксируют на месте с помощью ленты и бинтов. Клещам дают кормиться на собаках в течение 7 дней, после чего их удаляют. Через 1, 2 и 3 месяца после заражения у каждой собаки берут биопсию кожи с помощью пункционного устройства диаметром 4 мм в месте, прилегающем к месту прикрепления клеща, с целью выделения B. burgdorferi. Биопсийные образцы кожи инкубируют в среде, обогащенной BSA, и в течение 4 недель наблюдают рост B. burgdorferi. Образцы ткани с левой стороны собаки или с конечности, на которую припадает и/или прихрамывает собака, берут из локтя, запястья, колена и лапки и обрабатывают с целью выделения B. burgdorferi методом ПЦР (таблица 6).Experimental infestation with ticks infected with B. burgdorferi is carried out approximately 2 weeks after the second vaccination. Briefly, on the shaved side of each dog, 9 female and 8 male adult ticks are placed in a rubber cup, which is fixed in place with tape and bandages. Ticks are allowed to feed on dogs for 7 days, after which they are removed. At 1, 2 and 3 months after infection, a skin biopsy is taken from each dog with a 4 mm diameter needle device at the site adjacent to the tick attachment site in order to isolate B. burgdorferi . Skin biopsies are incubated in BSA-enriched medium and growth of B. burgdorferi is observed for 4 weeks. Tissue samples from the left side of the dog or from the dog's crouching and/or limping limb were taken from the elbow, wrist, knee, and paw and processed to isolate B. burgdorferi by PCR (Table 6).
ТАБЛИЦА 6TABLE 6
Число собак, у которых образцы кожи или суставов дают положительные результаты в анализе на B. burgdorferi Number of dogs with positive skin or joint samples for B. burgdorferi
OspA/OspC
(двойная конструкция)Treatment group B:
OspA/OspC
(double design)
OspC/OspA
(двойная конструкция)Treatment Group C:
OspC/OspA
(double design)
ПлацебоTreatment Group D:
placebo
ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE TABLE
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИSEQUENCES
Белок A внешней поверхности (SEQ ID NO: 1)Protein A outer surface (SEQ ID NO: 1)
atgaaaaagtaccttttgggaatcggactcattctcgccctgatcgcctgcaagcaaaacgtgtcctccctcgacgaaaagaactcagtgtcggtggatctgcccggcgaaatgaaggtgctcgtgtccaaagagaagaacaaggatggaaaatacgacctgattgccaccgtggacaagctggagttgaagggcacctcagacaagaacaacgggtctggagtgctggaaggagtcaaagcggacaagtccaaggtcaagctgactatttcggacgacctgggccagactaccctggaagtgttcaaggaggacggaaagaccctggtgtccaagaaggtcacctccaaggataagtcgagcaccgaagagaagttcaatgagaagggagaagtgtcggagaagatcatcacccgcgccgatggaacccggctggagtacaccgagatcaagtccgatggttcggggaaggctaaggaagtcctgaagggctacgtgcttgagggtactctgactgcggaaaagaccactctggtggtcaaggaaggcaccgtgactctgtcaaagaacatctccaagagcggagaagtcagcgtggaactgaacgacacagattcctccgctgccacgaaaaagaccgccgcctggaacagcgggaccagcactctcaccattaccgtgaacagcaaaaagactaaggacctggtgttcaccaaggagaacacgatcaccgtgcagcagtatgactccaacggtaccaagctcgaagggtccgccgtggagatcactaagctggacgagattaagaatgcactgaagtgaatgaaaaagtaccttttgggaatcggactcattctcgccctgatcgcctgcaagcaaaacgtgtcctccctcgacgaaaagaactcagtgtcggtggatctgcccggcgaaatgaaggtgctcgtgtccaaagagaagaacaaggatggaaaatacgacctgattgccaccgtggacaagctggagttgaagggcacctcagacaagaacaacgggtctggagtgctggaaggagtcaaagcggacaagtccaaggtcaagctgactatttcggacgacctgggccagactaccctggaagtgttcaaggaggacggaaagaccctggtgtccaagaaggtcacctccaaggataagtcgagcaccgaagagaagttcaatgagaagggagaagtgtcggagaagatcatcacccgcgccgatggaacccggctggagtacaccgagatcaagtccgatggttcggggaaggctaaggaagtcctgaagggctacgtgcttgagggtactctgactgcggaaaagaccactctggtggtcaaggaaggcaccgtgactctgtcaaagaacatctccaagagcggagaagtcagcgtggaactgaacgacacagattcctccgctgccacgaaaaagaccgccgcctggaacagcgggaccagcactctcaccattaccgtgaacagcaaaaagactaaggacctggtgttcaccaaggagaacacgatcaccgtgcagcagtatgactccaacggtaccaagctcgaagggtccgccgtggagatcactaagctggacgagattaagaatgcactgaagtga
Белок A внешней поверхности (SEQ ID NO: 2)Protein A outer surface (SEQ ID NO: 2)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGMKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDG
KYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLE
VFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTEIVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTEI
KSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVEKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVE
LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSLNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDS
NGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK*NGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK*
Белок C внешней поверхности (SEQ ID NO: 3)Protein C outer surface (SEQ ID NO: 3)
atgaagaagaatactctctccgccattctgatgaccctgttcctgtttatctcctgcaacaactccgggaaggatggcaacacctcggccaactccgccgatgaaagcgtcaagggtcccaacctgactgagatctcgaagaaaatcaccgagtccaacgcggtggtgttggcagtgaaggaggtcgaaactctgctgactagcatcgacgagcttgccaaggccattggaaagaagattaagaacgacgtgtcactggacaacgaagctgaccataacggatctcttatctcgggcgcttacctgatttcgaccctcatcaccaagaagatctccgcgatcaaggacagcggggagctcaaggccgaaattgagaaagcaaagaagtgctccgaagagttcaccgcgaagctcaagggagaacacaccgacctgggaaaggaaggcgtcaccgatgataacgcgaagaaggccatcctcaaaaccaacaacgacaagacaaagggcgccgacgaactggagaagctgttcgagagcgtgaagaatctgtccaaggccgccaaggaaatgttgacgaacagcgtgaaggaactgacctcccctgtggtggccgagtcaccgaaaaagccatgaatgaagaagaatactctctccgccattctgatgaccctgttcctgtttatctcctgcaacaactccgggaaggatggcaacacctcggccaactccgccgatgaaagcgtcaagggtcccaacctgactgagatctcgaagaaaatcaccgagtccaacgcggtggtgttggcagtgaaggaggtcgaaactctgctgactagcatcgacgagcttgccaaggccattggaaagaagattaagaacgacgtgtcactggacaacgaagctgaccataacggatctcttatctcgggcgcttacctgatttcgaccctcatcaccaagaagatctccgcgatcaaggacagcggggagctcaaggccgaaattgagaaagcaaagaagtgctccgaagagttcaccgcgaagctcaagggagaacacaccgacctgggaaaggaaggcgtcaccgatgataacgcgaagaaggccatcctcaaaaccaacaacgacaagacaaagggcgccgacgaactggagaagctgttcgagagcgtgaagaatctgtccaaggccgccaaggaaatgttgacgaacagcgtgaaggaactgacctcccctgtggtggccgagtcaccgaaaaagccatga
Белок C внешней поверхности (SEQ ID NO: 4) Protein C outer surface (SEQ ID NO: 4)
MKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITMKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKIT
ESNAVVLAVKEVETLLTSIDELAKAIGKKIKNDVSLDNEADHNGSLISGAESNAVVLAVKEVETTLLTSIDELAKAIGKKIKNDVSLDNEADHNGSLISGA
YLISTLITKKISAIKDSGELKAEIEKAKKCSEEFTAKLKGEHTDLGKEGVYLISTLITKKISAIKDSGELKAEIEKAKKCSEEFTAKLKGEHTDLGKEGV
TDDNAKKAILKTNNDKTKGADELEKLFESVKNLSKAAKEMLTNSVKELTSTDDNAKKAILKTNNDKTKGADELEKLFESVKNLSKAAKEMLTNSVKELTS
PVVAESPKKP*PVVAESPKKP*
Объем настоящего изобретения не ограничивается описанными здесь конкретными вариантами осуществления. Действительно, разные модификации изобретения, помимо описанных в настоящем описании, станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.The scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described here. Indeed, various modifications of the invention other than those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are intended to be within the scope of the appended claims.
Кроме того, следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярных весов или молекулярных масс, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и представлены для описания.In addition, it should be understood that all base sizes or amino acid sizes and all molecular weights or molecular weights given for nucleic acids or polypeptides are approximate and are provided for description.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762594342P | 2017-12-04 | 2017-12-04 | |
US62/594,342 | 2017-12-04 | ||
PCT/EP2018/083306 WO2019110486A1 (en) | 2017-12-04 | 2018-12-03 | Canine lyme disease vaccine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020120941A RU2020120941A (en) | 2022-01-13 |
RU2020120941A3 RU2020120941A3 (en) | 2022-04-21 |
RU2785620C2 true RU2785620C2 (en) | 2022-12-09 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007047749A1 (en) * | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles |
EP1939294A1 (en) * | 2000-08-18 | 2008-07-02 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
WO2013006834A1 (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Novartis Ag | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
WO2013116770A1 (en) * | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors |
WO2013158818A2 (en) * | 2012-04-18 | 2013-10-24 | Zoetis Llc | Vaccines and methods to treat lyme disease in dogs |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1939294A1 (en) * | 2000-08-18 | 2008-07-02 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
WO2007047749A1 (en) * | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles |
WO2013006834A1 (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Novartis Ag | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
WO2013116770A1 (en) * | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors |
WO2013158818A2 (en) * | 2012-04-18 | 2013-10-24 | Zoetis Llc | Vaccines and methods to treat lyme disease in dogs |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GIPSON C. L. et al. Evalution of Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) replicon-based Outer surface protein A (OspA) vaccines in a tick challenge mouse model of Lyme disease, Vac, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol.21, no 25-26, 08.09.2003, p. 3875-3884, abstract, figures 1, 4, DOI: 10.1016/S0264-410X (03)00307-4. DUSTIN BRISSON et al. Biodiversity of Borrelia burgdorferi Strains in Tissues of Lyme Disease Patents, Plos one, 01.02.2011, p. e22926, DOI: 10.1371/journal.pone.0022926, the whole document. LAFLEUR R.L., et al. Bacterian that Induces Anti-OspC, Borreliacidal Antibodies Provides a High level of Protection against Canine Lyme disease, Clinical and Vaccine immunology, vol. 16, no2, 01.02.2009, p.256-259, abstract, p.256, column2, paragraph 2, p.258, column 1. * |
Под редакцией доктора ветеринарных наук, профессора СИДОРЧУКА А. А. Руководство по вакцинации собак и кошек, 31 декабря 2016 г., с.11-19, найдено в Интернет 21.04.2022, адрес сайта: https://docs.yandex.ru/docs/view?tm=1650525760&tld=ru&lang=ru&name=WSAVA-vaccination-guidelines-2015-Russian.pdf. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20210092762A (en) | Immunogenic composition against African swine fever virus | |
JP2022125026A (en) | Senecavirus A immunogenic compositions and methods thereof | |
DK2750704T3 (en) | SYNTHETIC CAPSID PROTEINS AND APPLICATIONS THEREOF | |
US20240181027A1 (en) | Canine lyme disease vaccine | |
JP2023159327A (en) | feline leukemia virus vaccine | |
JP2023159325A (en) | feline calicivirus vaccine | |
JP7472019B2 (en) | Rabies Virus Vaccine | |
JP7346417B2 (en) | swine influenza A virus vaccine | |
RU2785620C2 (en) | Vaccine against lyme disease in dogs | |
US20220211839A1 (en) | Feline leukemia virus vaccine | |
CN115697398A (en) | Swine influenza A virus vaccine comprising two different RNA replicon particles | |
EP4061414A1 (en) | A novel vaccine against heamophilus parasuis | |
RU2787596C9 (en) | Vaccine to swine influenza a virus | |
RU2782350C2 (en) | Vaccine against rabies virus | |
RU2784533C2 (en) | Vaccine against feline leukemia virus | |
US20240269259A1 (en) | Rabies virus vaccine | |
TW202221012A (en) | Attenuated porcine epidemic diarrhea virus | |
CN115768785A (en) | Swine influenza A virus vaccine comprising a nucleic acid construct comprising first, second and third nucleic acid sequences encoding different neuraminidase antigens of the virus | |
CN115836082A (en) | Swine influenza A virus vaccines comprising nucleic acid constructs encoding antigens of a particular viral lineage |