RU2765829C1 - Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria - Google Patents
Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria Download PDFInfo
- Publication number
- RU2765829C1 RU2765829C1 RU2021111909A RU2021111909A RU2765829C1 RU 2765829 C1 RU2765829 C1 RU 2765829C1 RU 2021111909 A RU2021111909 A RU 2021111909A RU 2021111909 A RU2021111909 A RU 2021111909A RU 2765829 C1 RU2765829 C1 RU 2765829C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mycobacterium
- probe
- detection
- differentiation
- mycobacteria
- Prior art date
Links
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 7
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title abstract description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- ZLGQHPLOIPARBS-UHFFFAOYSA-N [(3,4,5-trimethoxybenzoyl)amino] 3,4,5-trimethoxybenzoate Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)NOC(=O)C=2C=C(OC)C(OC)=C(OC)C=2)=C1 ZLGQHPLOIPARBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к детекции и дифференциации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий Mycobacterium avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.SUBSTANCE: invention relates to veterinary microbiology, to molecular diagnostic tools, namely to detection and differentiation of DNA marker regions of nontuberculous mycobacteria Mycobacterium avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare in real-time polymerase chain reaction.
В настоящее время в мире неуклонно растет количество заболеваний, которые связывают с потенциально патогенными микроорганизмами рода Mycobacterium, но отличающимися по своим характеристикам от микобактерий туберкулеза. Такие бактерии принято называть атипичными или нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), а вызываемые ими заболевания микобактериозами. НТМБ представлены более чем 20 видами широко распространенных в окружающей среде кислотоустойчивых микроорганизмов, не входящих в состав M. tuberculosis complex [1,2].Currently, the number of diseases that are associated with potentially pathogenic microorganisms of the genus Mycobacterium, but differing in their characteristics from Mycobacterium tuberculosis, is steadily growing in the world. Such bacteria are called atypical or non-tuberculous mycobacteria (NTMBs), and the diseases they cause are called mycobacterioses. NTMB are represented by more than 20 species of acid-resistant microorganisms that are widespread in the environment and are not part of the M. tuberculosis complex [1,2].
Заболевания, вызванные НТМБ, имеют схожую с туберкулезом локализацию патологического процесса, а также клиническую, и, на определенных этапах патогенеза, морфологическую картины [3,4]. Микобактериозам подвержены и люди, и животные, последние играют основную роль в распространении их.Diseases caused by NTMB have a localization of the pathological process similar to tuberculosis, as well as a clinical, and, at certain stages of pathogenesis, morphological picture [3,4]. Both humans and animals are susceptible to mycobacteriosis, the latter playing a major role in their spread.
На данный момент о микобактериозе у животных можно говорить при получении неспецифических реакций на туберкулинизацию. Дальнейшая дифференциальная диагностика заключается в бактериологическом исследовании патологического материала, полученного при контрольно-диагностическом убое, для установления наличия или отсутствия микобактерий туберкулезного комплекса. Как правило, результат этих исследований отрицательный. Однако, наличие и вид возбудителя НТМБ, вызвавшего проявление неспецифических реакций, остаются невыясненными.At the moment, one can speak of mycobacteriosis in animals when receiving nonspecific reactions to tuberculinization. Further differential diagnosis consists in the bacteriological examination of the pathological material obtained during the control and diagnostic slaughter to establish the presence or absence of Mycobacterium tuberculosis complex. As a rule, the result of these studies is negative. However, the presence and type of the NTMB pathogen that caused the manifestation of nonspecific reactions remain unclear.
Существуют методы бактериологического исследования для дифференциации нетуберкулезных микобактерий. Все они занимают длительное время проведения и не всегда дают точные результаты.There are methods of bacteriological research for the differentiation of non-tuberculous mycobacteria. All of them take a long time and do not always give accurate results.
Наибольшую точность в определении вида возбудителя и его количества в исследуемом образце дает исследование методом полимеразной цепной реакции. К сожалению, на сегодняшний день не существует определенного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления и дифференциации нетуберкулезных микобактерий методом ПЦР в реальном времени.The greatest accuracy in determining the type of pathogen and its amount in the test sample is provided by the polymerase chain reaction method. Unfortunately, to date, there is no specific set of oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculous mycobacteria by real-time PCR.
Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для индикации нетуберкулезных микобактерийThe invention relates to a set of oligonucleotide primers and fluorescently labeled probes for the indication of non-tuberculous mycobacteria
1. Mycobacterium kansasii:1. Mycobacterium kansasii:
f-5`-TCGCGTCGGTGGAGGCAG-3`;f-5`-TCGCGTCGGTGGAGGCAG-3`;
r-5`-CGCACAGGGCCGCTGATTT-3`;r-5`-CGCACAGGGCCCGCTGATTT-3`;
зонд 5`-CGTAGACCCGTCCGCCGTTGAGG-3`;probe 5`-CGTAGACCCGTCCGCCGTTGAGG-3`;
2. Mycobacterium scrofulaceum:2. Mycobacterium scrofulaceum:
f-5`-GCTTTTGCGGTGTGGGATGG-3`;f-5`-GCTTTTGCGGTGTGGGATGG-3`;
r-5`-GCTACCCGTCGTCGCCTTGA-3`;r-5`-GCTACCCGTCGTCGCCTTGA-3`;
зонд 5`-TCACCCCACCAACTAGCTGATAGGCCG-3`;probe 5`-TCACCCCACCAACTAGCTGATAGGCCG-3`;
3. Mycobacterium smegmatis:3. Mycobacterium smegmatis:
f-5`-TCGGGCGCACAACGTTCC-3`;f-5`-TCGGGCGCACAACGTTCC-3`;
r-5`-GCAGGGTCGCGGTGCGT-3`;r-5`-GCAGGGTCGCGGTGCGT-3`;
зонд 5`-CGACGCCCTGCTCGACGAGTGG-3`;probe 5`-CGACGCCCTGCTCGACGAGTGG-3`;
4. Mycobacterium fortuitum:4. Mycobacterium fortuitum:
f-5`-GACCAGGACCAGGAAGATGAGGC-3`;f-5`-GACCAGGACCAGGAAGATGAGGC-3`;
r-5`-TGGCCTGGCTGGTGACCCT-3`;r-5`-TGGCCTGGCTGGTGACCCT-3`;
зонд 5`-GTCAGGGACTCGACGCCGTGAGA-3`;probe 5`-GTCAGGGACTCGACGCCGTGAGA-3`;
5. Mycobacterium paratuberculosis:5. Mycobacterium paratuberculosis:
f-5`-TTACGGAGGTGGTTGTGGCACA-3`;f-5`-TTACGGAGGTGGTTGTGGCACA-3`;
r-5`-AATCAACTCCAGCAGCGCGG-3`;r-5`-AATCAACTCCAGCAGCGCGG-3`;
зонд 5`-CGCAGCGATTGCTCTCGCAGC-3`;probe 5`-CGCAGCGATTGCTCTCGCAGC-3`;
6. Mycobacterium avium:6. Mycobacterium avium:
f-5`-CCCATCCCACACCGCAAAAG-3`;f-5`-CCCATCCCACACCCGCAAAAG-3`;
r-5`-AGCAATCTGCCCTGCACTTCG-3`;r-5`-AGCAATCTGCCCTGCACTTCG-3`;
зонд 5`-ACATGCGTCTTGAGGTCCTATCCGGTATTAGA-3`;probe 5`-ACATGCGTCTTGAGGTCCTATCCGGTATTAGA-3`;
7. Mycobacterium intracellulare:7. Mycobacterium intracellulare:
f-5`-GCCCATCCCACACCGCAA-3`;f-5`-GCCCATCCCACACCGCAA-3`;
r-5`-GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTA-3`;r-5`-GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTA-3`;
зонд 5`-TCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAGGTCCTAT-3`.probe 5`-TCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAGGTCCTAT-3`.
В качестве источника флуоресценции на 5' конце зондов применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3' конце - BHQ-2. Флуоресценцию у всех зондов измеряют по каналу ROX.The ROX dye is used as a source of fluorescence at the 5' end of the probes, and BHQ-2 is used to quench the fluorescence at the 3' end. The fluorescence of all probes is measured through the ROX channel.
При тестировании пробы на наличие маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий учитывают:When testing a sample for the presence of DNA marker regions of non-tuberculous mycobacteria, the following are taken into account:
- пересечение, кривой флуоресценции, пороговой линии с праймерами на геном НТМБ свидетельствует о наличии в образце маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий (один или несколько из перечисленных выше видов);- intersection of the fluorescence curve with the threshold line with primers for the NTMB genome indicates the presence in the sample of DNA marker regions of non-tuberculous mycobacteria (one or more of the species listed above);
- отсутствие пересечения, кривой флуоресценции, пороговой линии для всех систем праймеров свидетельствует об отсутствии маркерных участков ДНК НТМБ в исследуемом материале.- the absence of an intersection, a fluorescence curve, a threshold line for all primer systems indicates the absence of marker regions of NTMB DNA in the test material.
Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике для индикации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий в пробах патологического материала.The invention can be used in laboratory diagnostics to indicate DNA marker regions of non-tuberculous mycobacteria in samples of pathological material.
Технический результат от предлагаемого изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифичной тест-системы, предназначенной для индикации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.The technical result of the proposed invention consists in the development of a modern, highly specific test system designed to indicate DNA marker regions of non-tuberculous mycobacteria in a real-time polymerase chain reaction.
Сущность изобретения заключается в высокоспецифичной идентификации и дифференциации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий от микобактерий, входящих в группу MTB complex в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при одном термическом профиле в индивидуальных пробирках, что исключает возможную конкуренцию между праймерами во время амплификации.The essence of the invention lies in the highly specific identification and differentiation of DNA marker regions of non-tuberculous mycobacteria from mycobacteria belonging to the MTB complex group in a real-time polymerase chain reaction with one thermal profile in individual tubes, which eliminates possible competition between primers during amplification.
Для разработки праймеров из базы данных GenBank были получены полногеномные последовательности M. avium, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. smegmatis. Последовательности выравнивали с помощью программы VectorNTI91, затем визуально оценивали консервативные участки и проверяли их на специфичность с помощью BLAST-анализа. Специфичность каждого участка составляет более 99%. Далее в программе VectorNTI91, в соответствии с единым термическим профилем, был получен ряд праймеров. В результате проведения контрольного BLAST-анализа была получена оптимальная комбинация праймеров и зондов, которые показывают высокую специфичность и возможность амплификации при одном термическом профиле.To develop primers, genome-wide sequences of M. avium, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, and M. smegmatis were obtained from the GenBank database. Sequences were aligned using the VectorNTI91 program, then conservative regions were visually assessed and checked for specificity using BLAST analysis. The specificity of each site is over 99%. Further, in the VectorNTI91 program, in accordance with a single thermal profile, a number of primers were obtained. As a result of the control BLAST analysis, an optimal combination of primers and probes was obtained, which show high specificity and the possibility of amplification with one thermal profile.
ПЦР-РВ проводится в одну стадию с использованием ПЦР смесей, включающих на одну реакцию: фермент Taq-ДНК-полимеразу (0,25-0,5 мкл); буфер, содержащий хлорид магния, 10х для ПЦР-РВ (1,5 мкл); дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, 50х (0,3 мкл); олигонуклеотидные праймеры (0,5 мкл каждого праймера, в концентрации 10 пмоль); зонд (0,5 мкл, в концентрации 10 пмоль); выделенную ДНК (10 мкл); ТЕ-буфер или деионизированную воду, до получения объема одной пробы, равного 15 мкл, в программируемом амплификаторе. Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все необходимые компоненты реакции и встряхнуть на шейкере.PCR-RT is carried out in one stage using PCR mixtures, including for one reaction: enzyme Taq-DNA polymerase (0.25-0.5 μl); buffer containing magnesium chloride, 10x for real-time PCR (1.5 µl); deoxyribonucleotide triphosphates, 50x (0.3 µl); oligonucleotide primers (0.5 μl of each primer, at a concentration of 10 pmol); probe (0.5 µl, at a concentration of 10 pmol); isolated DNA (10 µl); TE buffer or deionized water to a single sample volume of 15 µl in a programmable cycler. Before starting the reaction, it is necessary to defrost all the necessary components of the reaction and shake on a shaker.
Устанавливают пробирки в амплификатор для постановки ПЦР-РВ, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (ROX), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.The test tubes are installed in the cycler for RT-PCR, the location and characteristics of the samples are noted in the program, the working dye (ROX) is selected, and the temperature-time profile of the reaction is set in the program.
После первоначальной денатурации при 95°С в течение 3 мин, проводят ПЦР в режиме реального времени в следующих условиях: 95°С - 15 с, 60°С - 30 с - 5 повторов; 95° -15 с, 60° - 30 с - детекция - 40 повторов.After initial denaturation at 95°C for 3 min, real-time PCR is performed under the following conditions: 95°C - 15 s, 60°C - 30 s - 5 repetitions; 95° -15 s, 60° - 30 s - detection - 40 repetitions.
Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов реакции, выведенной в результате машинного анализа.The results are interpreted based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line, which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value "Ct" in the corresponding column in the table of reaction results derived from the machine analysis.
Образец считается положительным, если значение Ct не более 35. Однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 30 до 37, необходимо повторить реакцию с этапа выделения ДНК, с целью подтвердить или опровергнуть наличие ДНК искомой бактерии в исследуемой пробе.The sample is considered positive if the Ct value is not more than 35. However, if the Ct value for the samples is in the range from 30 to 37, it is necessary to repeat the reaction from the DNA isolation step in order to confirm or disprove the presence of DNA of the desired bacterium in the test sample.
Образец считается отрицательным на наличие маркерной ДНК, если для него значение Ct отсутствует или более 37.A sample is considered negative for marker DNA if its Ct value is absent or greater than 37.
Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для индикации генетического материала нетуберкулезных микобактерий в патологических образцах, для постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач по мониторингу распространения нетуберкулезных микобактерий среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зондов позволяет выявить и дифференцировать от патогенных микобактерий генетический материал НТМБ в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (РВ).Thus, the invention can be used in veterinary practice to indicate the genetic material of non-tuberculous mycobacteria in pathological samples, to establish and clarify the diagnosis, to solve research problems for monitoring the spread of non-tuberculous mycobacteria among susceptible animals. The use of specific primers and probes makes it possible to identify and differentiate from pathogenic mycobacteria the genetic material of NTMB in the studied samples by polymerase chain reaction (PCR) with real-time hybridization-fluorescence detection (RT).
Для оценки специфичности набора использовались следующие образцы штаммов нетуберкулезных микобактерий: ДНК Mycobacterium smegmatis (шт. 9-77), Mycobacterium scrofulaceum (шт.526), Mycobacterium kansasii (шт. ВИЭВ), Mycobacterium paratuberculosis (шт. Центрально-Любинский), Mycobacterium avium (шт. Vet. 1387), Mycobacterium intracellulare (шт. TMC 1473), Mycobacterium fortuitum (шт.409).To assess the specificity of the kit, the following samples of non-tuberculous mycobacteria strains were used: DNA of Mycobacterium smegmatis (piece 9-77), Mycobacterium scrofulaceum (piece 526), Mycobacterium kansasii (piece VIEV), Mycobacterium paratuberculosis (piece Central Lyubinsky), Mycobacterium avium (piece Vet. 1387), Mycobacterium intracellulare (piece TMC 1473), Mycobacterium fortuitum (piece 409).
Процедуру выделения ДНК из исследуемого материала проводили с использованием промышленного набора реагентов.The procedure for DNA extraction from the test material was carried out using an industrial kit of reagents.
ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):Real-time PCR was performed in the reaction mixture of the following composition (for 1 study):
- фермент Taq-ДНК-полимераза (0,5 мкл), буфер, содержащий хлорид магния, (1,5 мкл), дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,3 мкл), олигонуклеотидные праймеры (0,5 мкл каждого праймера 10 пмоль), зонд (0,5 мкл 10 пмоль), выделенную (ДНК 10 мкл) и ТЕ-буфер или деионизированную воду до получения объема одной пробы, равного 15 мкл в программируемом амплификаторе.- enzyme Taq-DNA polymerase (0.5 µl), buffer containing magnesium chloride (1.5 µl), deoxynucleotide triphosphates (0.3 µl), oligonucleotide primers (0.5 µl of each primer 10 pmol), probe ( 0.5 µl 10 pmol), isolated (DNA 10 µl) and TE buffer or deionized water to obtain a volume of one sample equal to 15 µl in a programmable cycler.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в ПЦР-РВ приборе по программе, описанной выше.Real-time PCR and registration of the results were carried out in a real-time PCR device according to the program described above.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.The results were interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which corresponds to the presence (or absence) of the Ct threshold cycle value in the corresponding column in the results table. The result was considered positive if the fluorescence accumulation curve for the corresponding sample had a characteristic "sigmoid" shape and crossed the threshold line.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Набор высокоспецифичных олигонкулеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации нетуберкулезных микобактерий»:Sources of information taken into account when compiling the description of the invention to the application for a patent of the Russian Federation for the invention "A set of highly specific oligonculotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculous mycobacteria":
1. Макарова МВ, Гунтупова ЛД. Нетуберкулезные микобактерии. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(2):97-102. doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-97-1021. Makarova MV, Guntupova LD. Nontuberculous mycobacteria. BIOpreparations. Prevention, diagnosis, treatment. 2020;20(2):97-102. doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-97-102
2. Marras TK, Mendelson D, Marchand-Austin A, May K, Jamieson FB. Pulmonary nontuberculous mycobacte-rial disease, Ontario, Canada, 1998-2010. Emerg Infect Dis. 2013;19(11):1889-91. doi.org/10.3201/eid1911.1307372. Marras TK, Mendelson D, Marchand-Austin A, May K, Jamieson FB. Pulmonary nontuberculous mycobacterial disease, Ontario, Canada, 1998-2010. Emerge Infect Dis. 2013;19(11):1889-91. doi.org/10.3201/eid1911.130737
3. Griffith D.E., Aksamit T., Brown-Elliott B.A., et al. An official ATS/ IDSA statement: Diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175(4):367-416.3. Griffith D.E., Aksamit T., Brown-Elliott B.A., et al. An official ATS/ IDSA statement: Diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175(4):367-416.
4. Найманов А. Х. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и совершенствование симультанной пробы для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / А. Х. Найманов, Г. И. Устинова, Н. Г. Толстен-ко, Е. П. Вангели, О. Д. Кучерук // Ветеринария. № 6. М., 2015. С. 20-25.4. Naimanov A. Kh., Ustinova G. I., Tolstenko N. G., Vangeli E. P., O D. Kucheruk // Veterinary. No. 6. M., 2015. S. 20-25.
Claims (29)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021111909A RU2765829C1 (en) | 2021-04-27 | 2021-04-27 | Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021111909A RU2765829C1 (en) | 2021-04-27 | 2021-04-27 | Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2765829C1 true RU2765829C1 (en) | 2022-02-03 |
Family
ID=80214803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021111909A RU2765829C1 (en) | 2021-04-27 | 2021-04-27 | Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2765829C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2154106C2 (en) * | 1994-06-24 | 2000-08-10 | Иннодженетикс Н.В. | Simultaneous determination, identification and differentiation of eubacterial taxons using hybridization analysis |
| WO2012064978A2 (en) * | 2010-11-10 | 2012-05-18 | Brandeis University | Compositions, methods, and kits for detecting and identifying mycobacteria |
| KR20140000810A (en) * | 2012-06-25 | 2014-01-06 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | Immunomagnetic capture method to rapid detect mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fecal sample |
-
2021
- 2021-04-27 RU RU2021111909A patent/RU2765829C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2154106C2 (en) * | 1994-06-24 | 2000-08-10 | Иннодженетикс Н.В. | Simultaneous determination, identification and differentiation of eubacterial taxons using hybridization analysis |
| WO2012064978A2 (en) * | 2010-11-10 | 2012-05-18 | Brandeis University | Compositions, methods, and kits for detecting and identifying mycobacteria |
| KR20140000810A (en) * | 2012-06-25 | 2014-01-06 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | Immunomagnetic capture method to rapid detect mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fecal sample |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МАКАРОВА М.В. ГУНДУПОВА Л.Д. Нетуберкулезные микобактерии. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. Т.20 N2, 2020, стр. 97-102. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2006209416B2 (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rRNA | |
| Vasylyeva | Identification of Bordetella bronchiseptica bacteria with the help of polymerase chain reaction in monoand multyplex format | |
| US8188256B2 (en) | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare | |
| Fearnley et al. | The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue | |
| Choi et al. | Conventional and real-time PCR targeting 16S ribosomal RNA for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex | |
| Bosshard et al. | Application of an F57 sequence-based real-time PCR assay for Mycobacterium paratuberculosis detection in bulk tank raw milk and slaughtered healthy dairy cows | |
| WO2014003583A2 (en) | Detection of pathogens | |
| Bölske et al. | Diagnosis of paratuberculosis by PCR. | |
| EP2107114B1 (en) | Primer and probe for detection of mycobacterium avium and method for detection of mycobacterium avium by using the primer or probe | |
| RU2765829C1 (en) | Set of highly specific oligonucleotide primers and probes for the detection and differentiation of non-tuberculosis mycobacteria | |
| Li et al. | A real-time loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Lawsonia intracellularis in porcine fecal samples | |
| Liu et al. | A novel isothermal amplification-based method to detect Mycobacterium tuberculosis complex | |
| CN106939330B (en) | Real-time fluorescent nucleic acid isothermal amplification detection kit for mycobacterium avium, and special primer and probe thereof | |
| RU2715333C1 (en) | Kit of reagents for detection and identification of dna of brucellosis agents by real-time polymerase chain reaction om-screen-brucellosis-rv | |
| Helmy et al. | Evaluation of Different PCR-Based Techniques in Diagnosis of Bovine Tuberculosis in Infected Cattle Lymph Nodes | |
| RU2809735C1 (en) | Method for identifying mycobacterium tuberculosis bacteria using loop isothermal amplification (lamp) | |
| RU2435852C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING DNA OF Mycobacterium paratuberculosis THAT IS PARATUBERCULOSIS AGENT BY METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) | |
| CN111876511A (en) | LAMP (loop-mediated isothermal amplification) rapid detection kit and method for mycobacterium tuberculosis complex | |
| Akapelwa et al. | Evaluation of IS1245 LAMP in Mycobacterium avium and the influence of host-related genetic diversity on its application | |
| RU2755690C1 (en) | METHOD FOR DETECTING METHICILLIN RESISTANCE GENES mecA AND mecC IN STAPHYLOCOCCI | |
| RU2802081C2 (en) | Oligonucleotides for detection of 8 serotype of streptococcus pneumoniae | |
| Jabber Benellam et al. | Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis using GeneXpert MTB/RIF and TB-LAMP techniques from pulmonary and extra-pulmonary TB patients in Iraq. Revis Bionatura 2022; 7 (2) 50 | |
| Sharma et al. | Polymerase chain reaction (PCR) amplification of IS6110 sequences to detect Mycobacterium tuberculosis complex from formalin-fixed paraffin-embedded tissues of deer (Axis axis) | |
| RU2831277C1 (en) | Method for detecting dna of mollicutes microorganisms in blood and other biomaterials by rt-pcr | |
| Qin et al. | Identification and evaluation of a new nucleic acid amplification test target for specific detection of Mycobacterium tuberculosis |