RU2765495C1

RU2765495C1 - Method for the determination of francisella tularensis subspecies by multi-primer pcr

Info

Publication number: RU2765495C1
Application number: RU2021115716A
Authority: RU
Inventors: Владимир Михайлович Сорокин; Алексей Сергеевич Водопьянов; Наталья Владимировна Павлович; Марина Владимировна Цимбалистова
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2022-01-31

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. A method for the determination of Francisella tularensis subspecies by the method of multi-primer PCR is described, including the isolation of DNA from the investigated strain of F. tularensis, PCR with specific primers and registration of the reaction using electrophoresis. The proposed method differs in that two common INDEL genes with deletions of a certain size, namely ft1779 and ft426, are detected on F. tularensis DNA, followed by their amplification using designed specific primers: to the ft1779 gene - primers GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT and TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG, with the amplified fragment length of 98 bps, or 107 bps, or 950 bps, to the ft426 gene - the primers GATTACACGACTACG, with the amplified fragment length of 98 bps, or 107 bps, or 950 bps, to the ft426 gene - the primers GATTACCACGACCTAG and the amplified fragment of 174 bps or 196 bps.

EFFECT: invention expands the arsenal of methods for determining the subspecies of Francisella tularensis by multi-primer PCR.

3 cl, 1 dwg, 1 tbl, 4 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов F.tularensis, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации.The present invention relates to the field of medical microbiology, and in particular to methods for molecular genetic typing of strains of pathogens of infectious diseases, which are used in microbiological and molecular genetic monitoring of F.tularensis strains circulating in different territories in order to differentiate them.

Francisella tularensis, этиологический агент туляремии, относится к факультативным внутриклеточным патогенам, вызывающим тяжелое заболевание у многих видов животных и человека [1], и является агентом биотерроризма категории А [2]. В настоящее время F. tularensis делится на четыре подвида: F. tularensis subsp.tularensis (nearctica), F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp. novicida, которые различаются по своей патогенности и географическому распределению [3]. Исторически такое разделение было обусловлено различным ареалом циркуляции штаммов, их отличиями в биохимической активности и патогенностью для разных хозяев [4, 5]. F. novicida, официально признанная четвертым подвидом вида F. tularensis, обладает высокой гомологией ДНК с другими подвидами F, tularensis, но не является возбудителем типичной туляремийной инфекции [3].Francisella tularensis, the etiological agent of tularemia, is a facultative intracellular pathogen that causes severe disease in many animal and human species [1] and is a category A bioterrorism agent [2]. Currently, F. tularensis is divided into four subspecies: F. tularensis subsp. tularensis (nearctica), F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp. novicida, which differ in their pathogenicity and geographical distribution [3]. Historically, such a division was due to different areas of circulation of strains, their differences in biochemical activity, and pathogenicity for different hosts [4, 5]. F. novicida, officially recognized as the fourth subspecies of F. tularensis, has high DNA homology with other subspecies of F, tularensis, but is not the causative agent of a typical tularemia infection [3].

Дифференциация штаммов F. tularensis проводилась с помощью многих молекулярно-генетических методов, включая полногеномный анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) [3], мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) [6], риботипирование [7], анализ регионов различия (RD) [8], пульс-гель электрофорез [7, 9], AFLP [10], анализ канонических INDEL-маркеров [11], и мультилокусный УШТ1-анализ (MLVA) [12, 13]. Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [14].Differentiation of F. tularensis strains was carried out using many molecular genetic methods, including genome-wide analysis of single nucleotide polymorphism (SNP) [3], multilocus sequencing-typing (MLST) [6], ribotyping [7], analysis of regions of difference (RD) [8 ], pulse gel electrophoresis [7, 9], AFLP [10], analysis of canonical INDEL markers [11], and multilocus WST1 analysis (MLVA) [12, 13]. However, the practical use of many of them is limited both by the complexity of the methodological nature and by problems with reproducibility and evaluation of the results [14].

Известен способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба [15], заключающийся в ПЦР амплификации с использованием специфических для гена ig1C и регионов хромосомы, содержащих Chi-последовательности, подобные Е. coli, праймеров Fig1C: AAGGATAAGACCTGTCTG, Rig1C:TTGAAACCATACCGGGTA и Chi1f:CTAGG-GCTGGTGG-G, с последующим электрофорезом продуктов амплификации и с последующей дифференциацией путем сравнения электрофоретической подвижности полученных ампликонов с подвижностью маркерных фрагментов ДНК, причем при наличии специфической светящейся полосы на уровне 986 п.о. данные штаммы регистрируют как бактерии рода Francisella, а характер распределения полос в диапазоне 190-830 п.о. позволяет дифференцировать исследуемые образцы на уровне подвидов туляремийного микроба: 190 п.о. для subsp. novicida, 500-570 п.о. для subsp. mediasiatica, 570 п.о. для subsp. holarctica, тогда как для subsp. tularensis характерен фрагмент размером 500 п.о.There is a known method for differentiating subspecies of the tularemia microbe [15], which consists in PCR amplification using primers specific for the ig1C gene and chromosome regions containing Chi sequences similar to E. coli: Fig1C: AAGGATAAGACCTGTCTG, Rig1C:TTGAAACCATACCGGGTA and Chi1f:CTAGG-GCTGGTGG-G , followed by electrophoresis of the amplification products and subsequent differentiation by comparing the electrophoretic mobility of the obtained amplicons with the mobility of marker DNA fragments, and in the presence of a specific luminous band at the level of 986 p. these strains are registered as bacteria of the genus Francisella, and the nature of the distribution of bands in the range of 190-830 b.p. allows to differentiate the studied samples at the level of subspecies of the tularemia microbe: 190 b.p. for subsp. novicida, 500-570 b.p. for subsp. mediasiatica, 570 b.p. for subsp. holarctica, while for subsp. tularensis is characterized by a 500 bp fragment.

Однако используемый при проведении данного способа праймер Chi1f не является специфичным (более десяти фрагментов в электрофорезе), что исключает получение традиционного специфического ампликона строго определенного размера. Поэтому амплифицированные фрагменты, полученные с представителями даже одного подвида туляремийного микроба, характеризуют значительный разброс молекулярной массы. Например, для subsp. mediasiatica размер ампликона может варьировать от 500 до 570 п.о., а для subsp. holarctica характерен ампликон массой около 570 п.о., а для представителя другого подвида- subsp. tularensis характерен фрагмент размером 500 п.о. Столь высокая вариация размеров ампликонов при осуществлении данного способа может приводить к появлению ампликонов одинакового размера в случае анализа штаммов разных подвидов туляремийного микроба, что делает маловероятным надежное определение подвидов туляремийного микроба с помощью данного способа.However, the Chi1f primer used in this method is not specific (more than ten fragments in electrophoresis), which precludes obtaining a traditional specific amplicon of a strictly defined size. Therefore, amplified fragments obtained with representatives of even one subspecies of the tularemia microbe characterize a significant spread in molecular weight. For example, for subsp. mediasiatica, the amplicon size can vary from 500 to 570 bp, and for subsp. holarctica is characterized by an amplicon weighing about 570 bp, and for a representative of another subspecies, subsp. tularensis is characterized by a 500 bp fragment. Such a high variation in amplicon sizes during the implementation of this method can lead to the appearance of amplicons of the same size in the case of analysis of strains of different subspecies of the tularemia microbe, which makes it unlikely to reliably determine the subspecies of the tularemia microbe using this method.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica [16], который включает стадии выделения ДНК микроорганизма из исследуемого материала и проведение с полученной ДНК двух реакций амплификации, при этом используют набор сконструированных специфических праймеров к вариабельным участкам области RD6 туляремийного микроба, где набор состоит из трех праймеров:Closest to the proposed invention in terms of essential features is a method for identifying subspecies of the causative agent of tularemia Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica and Francisella tularensis subsp. holarctica [16], which includes the stages of isolating the DNA of a microorganism from the material under study and carrying out two amplification reactions with the obtained DNA, while using a set of designed specific primers to the variable regions of the RD6 region of the tularemia microbe, where the set consists of three primers:

RD6-comATACTAGCTTCAATCTCTGTGGCTTT,RD6-comATACTAGCTTCAATCTCTGTGGCTTT,

RD6-holATGCACTGGTTGGAATACAAATC,RD6-holATGCACTGGTTGGAATACAAATC,

RD6-tulCACATAGCAAATTAGTTGGATATGGA и второй из двух праймеров:RD6-tulCACATAGCAAATTAGTTGGATATGGA and the second of two primers:

RD6-del1AACAATACCAACACTATTGAGTAAAA,RD6-del1AACAATACCAACACTATTGAGTAAAA,

RD6-del2AGCCATGCAATTATTAAAGC.RD6-del2AGCCATGCAATTATTAAAGC.

Подвид возбудителя туляремии определяют по размеру специфического амплификата, в случае первой реакции амплификации если он составляет 212 п.о., а во второй 85 п.о, то регистрируют Francisella tularensis subsp. holarctica, если соответственно 425-91 п.о., то Francisella tularensis subsp. tularensis и 419-85 п.о. определяют как Francisella tularensis subsp. mediasiatica.The subspecies of the causative agent of tularemia is determined by the size of the specific amplificate, in the case of the first amplification reaction, if it is 212 bp, and in the second 85 bp, then Francisella tularensis subsp. holarctica, if respectively 425-91 bp, then Francisella tularensis subsp. tularensis and 419-85 b.p. identified as Francisella tularensis subsp. mediasiatica.

Недостатком данного способа является использование двух наборов праймеров и, соответственно, необходимость проведения двух реакций амплификации, что увеличивает длительность идентификации. Кроме того, способ не предусматривает определения вида F. novicida.The disadvantage of this method is the use of two sets of primers and, accordingly, the need for two amplification reactions, which increases the duration of identification. In addition, the method does not provide for the determination of the species F. novicida.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию подвидов штаммов F. tularensis, выделенных в различных регионах, областях и странах.The technical objective of the present invention is to develop a new method that allows reliably, quickly and at low cost to differentiate subspecies of F. tularensis strains isolated in different regions, regions and countries.

Поставленная задача достигается тем, что в способе дифференциации штаммов F. tularensis путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма F. tularensis, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличие заключается в том, что на ДНК F. tularensis выявляют два общих INDEL-гена, имеющих делеции определенного размера, а именно ft1779 и ft426, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфическихпраймеров:The task is achieved by the fact that in the method for differentiating F. tularensis strains by molecular genetic typing, which includes DNA extraction from the studied F. tularensis strain, PCR with specific primers, and taking into account the reaction using electrophoresis, the difference lies in the fact that DNA F .tularensis identify two common INDEL genes with deletions of a certain size, namely ft1779 and ft426, with their subsequent amplification using designed specific primers:

к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG,to the ft1779 gene - primers GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT and TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG,

с длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 950 п.н.,with the length of the amplified fragment 98 bp. or 107 bp, or 950 bp,

к гену ft426 - праймеры GATAGACGCTGCATCGACAC и ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA,to the ft426 gene - primers GATAGACGCTGCATCGACAC and ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA,

с длиной амплифицированного фрагмента 174 п.н. или 196 п.н., при этом учет результатов определения подвидов F. tularensis проводят визуально после электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по двум INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают подвид исследуемых штаммов F. tularensis.with the length of the amplified fragment 174 bp. or 196 bp, while taking into account the results of determining the subspecies of F. tularensis is carried out visually after electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker, and for each strain a unique INDEL genotype is established for two INDEL genes, and by comparing the identified INDEL genotypes with the known genotypes of the identification table, a subspecies of the studied F. tularensis strains is established.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:2 мММg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед.ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов F.tularensis.In this case, PCR is carried out in a volume of 25 µl and the reaction mixture contains: 2 mMMg buffer, 0.2 mM dNTP mixture, 1.0 µM mixture of all primers (0.5 µM of each primer), 25 ng of DNA template, 1 unit .DNA polymerase, the remaining volume is water, while genomic DNA is used as a matrix, with a volume of 5 μl, which is obtained from different strains of F.tularensis.

Кроме того, ПЦР проводят с соблюдением режимов:In addition, PCR is carried out in compliance with the following modes:

1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл);stage 1 - denaturation at 95°C - 3 min (1 cycle);

2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов);stage 2 - denaturation at 95°C - 20 s, annealing at 55°C - 20 s, synthesis at 72°C - 20 s (35 cycles);

3 этап - досинтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).stage 3 - dosynthesis at 72°C - 5 min (1 cycle).

Обоснование выбора праймеровRationale for the choice of primers

С помощью программного обеспечения, разработанного авторами (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора) было проанализировано более 2500 генов F. tularensis в базе данных GenBank. В процессе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis в базе данных GenBank авторы идентифицировали ряд INDEL-генов, отличающихся по размеру у штаммов F. tularensis различных подвидов. В результате было выделено 2 общих гена, имеющих делеции определенного размера, а именно: ft1779 и ft426 (см. идентификационную таблицу).Using the software developed by the authors (FKUZ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor), more than 2500 F. tularensis genes were analyzed in the GenBank database. In the process of computer analysis of the nucleotide sequences of F. tularensis strains in the GenBank database, the authors identified a number of INDEL genes that differ in size in F. tularensis strains of different subspecies. As a result, 2 common genes with deletions of a certain size were isolated, namely: ft1779 and ft426 (see identification table).

Примечание - nov-novicida, hol-holarctica, medi-mediasiatica, tul-tularensisNote - nov-novicida, hol-holarctica, medi-mediasiatica, tul-tularensis

С помощью программного обеспечения Primer3Plus и BLASTNCBI к варьирующим участкам указанных генов ft1779 и ft426 были сконструированы специфические праймеры.Using the Primer3Plus and BLASTNCBI software, specific primers were designed for the varying regions of these ft1779 and ft426 genes.

к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG;to the ft1779 gene - primers GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT and TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG;

к гену ft426 - праймеры GATAGACGCTGCATCGACAC и ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA.to the ft426 gene - primers GATAGACGCTGCATCGACAC and ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA.

Набор значений размера фрагментов для каждого штамма по каждому из двух INDEL-генов являются его индивидуальной характеристикой и позволяют определять его подвид.The set of fragment size values for each strain for each of the two INDEL genes is its individual characteristic and makes it possible to determine its subspecies.

Способ осуществляется следующим образомThe method is carried out as follows

Перед постановкой способа дифференциации штаммов F. tularensis выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Затем методом мультипраймерной ПЦР проводят амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами:Before setting up a method for differentiating F. tularensis strains, the DNA of the culture under study is isolated. A bacterial suspension of the studied strain in distilled water is added to a 1.5 ml microtube, after which the material is decontaminated and DNA is isolated according to MU 1.3.2569-09 [17]. Then, by the method of multiprimer PCR, amplification of the isolated DNA is carried out with specific primers:

к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG, c длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 950 п.н.,to the ft1779 gene - primers GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT and TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG, with amplified fragment length of 98 bp. or 107 bp, or 950 bp,

к гену ft426 -to the ft426 gene -

ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA, c длиной амплифицированного фрагмента 174 п.н. или 196 п.н.ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA, with amplified fragment length of 174 bp. or 196 b.p.

Условия проведения реакции амлификации.Conditions for the amplification reaction.

Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).Amplification is carried out according to the following scheme: denaturation at 95°C - 3 min (1 cycle); then 35 cycles: denaturation at 95°C - 20 s, annealing at 55°C - 20 s, synthesis at 72°C - 20 s; synthesis at 72°C - 5 min (1 cycle).

Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 2 мMMg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0, 5. мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов F. tularensis. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.An incubation mixture with a volume of 25 µl is prepared from the calculation: 2 mMMg buffer, 0.2 mM dNTP mixture, 1.0 µM mixture of all primers (0.5 µM of each primer) 25 ng of DNA template, 1 u. DNA polymerase, the remaining volume is water. Genomic DNA (volume 5 μl) obtained from different strains of F. tularensis is used as a matrix. Accounting for the results of amplification is carried out using electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker.

При этом учет результатов типирования проводят визуально после электрофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по двум генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов с идентификационной таблицей определяют подвид исследуемого штамма F. tularensis.At the same time, the typing results are recorded visually after electrophoresis, and for each strain a unique INDEL genotype is established for two genes, and by comparing the identified INDEL genotypes with an identification table, a subspecies of the F. tularensis strain under study is determined.

В случае подвида Francisella tularensis subsp. tularensis в мультипраймерной ПЦР к генам ft1779 и ft426 регистрируют появление двух ампликонов 98 и 196 п.н. соответственно. При анализе представителей подвидов Francisella tularensis subsp. holarctica специфические ампликоны имеют размеры 950 и 196 п.н., для Francisella tularensis subsp. mediasiatica 98 и 174 п.н., а для Francisella novicida - 107 и 196 п.н. (см. таблицу).In the case of the subspecies Francisella tularensis subsp. tularensis in multiprimer PCR to the ft1779 and ft426 genes, two 98 and 196 bp amplicons were detected. respectively. When analyzing representatives of the subspecies Francisella tularensis subsp. holarctica specific amplicons are 950 and 196 bp in size, for Francisella tularensis subsp. mediasiatica 98 and 174 bp, and for Francisella novicida - 107 and 196 bp. (see table).

Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного способа определения подвидов Francisella tularensis методом мультипраймерной ПЦР по структуре INDEL-генов позволяет выявлять штаммы различных подвидов.The conducted studies prove that the use of the developed method for determining the subspecies of Francisella tularensis by the method of multiprimer PCR by the structure of INDEL genes makes it possible to identify strains of various subspecies.

Пример 1.Example 1

В эксперименте используют штаммы F. tularensis из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis (вакцинный штамм 15/10 (holarctica) и 503 (holarctica) (лунки 1,2) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).The experiment uses F. tularensis strains from the collection of the Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. F. tularensis bacteria (vaccine strain 15/10 (holarctica) and 503 (holarctica) (wells 1, 2) were suspended in 150 µl of deionized water that did not contain nucleases. Next, DNA was isolated according to MU 1.3.2569-09 [17]. To set up a polymerase chain reaction, primers for the ft1779 and ft426 genes are used.Amplification is carried out according to the following scheme: denaturation at 95°C - 3 min (1 cycle), then 35 cycles: denaturation at 95°C - 20 s, annealing at 55°C - 20 s, synthesis at 72°C - 20 s, synthesis at 72°C - 5 min (1 cycle).

Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 2мMMg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов F. tularensis. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (см. фото).An incubation mixture with a volume of 25 µl is prepared from the following calculation: 2 mMMg buffer, 0.2 mM dNTP mixture, 1.0 µM mixture of all primers (0.5 µM of each primer) 25 ng of DNA template, 1 u. DNA polymerase, the remaining volume is water. Genomic DNA (volume 5 μl) obtained from different strains of F. tularensis is used as a matrix. Accounting for the results of amplification is carried out using electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker (see photo).

На фото видим электрофорез продуктов амплификации INDEL-генов ft779 и ft426. М-маркерная ДНК, стрелки указывают позиции аллелей 950 п.н. для гена ft1779 и 196 п.н. для гена ft426. Проводят сравнительный анализ выявленных аллелей INDEL - генов с идентификационной таблицей.In the photo we see electrophoresis of the products of amplification of the INDEL genes ft779 and ft426. M-marker DNA, arrows indicate positions of 950 bp alleles. for the ft1779 gene and 196 b.p. for the ft426 gene. Conduct a comparative analysis of the identified alleles INDEL - genes with an identification table.

Вывод: в лунках 1 и 2 обнаружены фрагменты 960 и 196 п.н. (см. фото), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду holarctica (табл.).Conclusion: in wells 1 and 2, fragments of 960 and 196 bp were found. (see photo), which indicates that the studied strains belong to the subspecies holarctica (table).

Пример 2.Example 2

В эксперименте используют штаммы F. tularensism коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis Schu (tularensis) и 261 (tularensis) (лунки 3,4) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводят выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.The experiment uses strains of F. tularensism from the collection of the Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. F. tularensis Schu (tularensis) and 261 (tularensis) bacteria (wells 3,4) were suspended in 150 µl of nuclease-free deionized water. Next, DNA is isolated according to MU 1.3.2569-09 [17]. To set up a polymerase chain reaction, primers for the ft1779 and ft426 genes are used. Conditions for PCR as in example 1. Accounting for the results of amplification carried out using electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker.

Вывод: в лунках 3 и 4 обнаружены фрагменты 196 и 98 п.н. (фото), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду tularensis (см. идентификационную табл.).Conclusion: in wells 3 and 4, fragments of 196 and 98 bp were found. (photo), which indicates that the studied strains belong to the subspecies tularensis (see identification table).

Пример 3.Example 3

В эксперименте используют штаммы F. tularensis из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis 543 (mediasiatica) и 240 (mediasiatica) (лунки 6,7) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.The experiment uses F. tularensis strains from the collection of the Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. F. tularensis 543 (mediasiatica) and 240 (mediasiatica) bacteria (wells 6,7) were suspended in 150 μl of nuclease-free deionized water. Next, DNA was isolated according to MU 1.3.2569-09 [17]. To set up a polymerase chain reaction, primers for the ft779 and ft426 genes are used. Conditions for PCR as in example 1. Accounting for the results of amplification carried out using electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker.

Вывод: в лунках 6 и 7 обнаружены фрагменты 98 и 174 п.н. (фото 1), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду mediasiatica (табл. 1).Conclusion: wells 6 and 7 contained fragments 98 and 174 bp. (photo 1), which indicates that the studied strains belong to the mediasiatica subspecies (Table 1).

Пример 4.Example 4

В эксперименте использованы штаммы F. novicidam коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. novicida Utah (novicida) и U112 (novicida) (лунки 8, 10) суспендировали в 150 мклдеионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.F. novicidam strains from the collection of the Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute were used in the experiment. The bacteria F. novicida Utah (novicida) and U112 (novicida) (wells 8, 10) were suspended in 150 µl of nuclease-free deionized water. Next, DNA was isolated according to MU 1.3.2569-09 [17]. To set up a polymerase chain reaction, primers for the ft1779 and ft426 genes are used. Conditions for PCR as in example 1. Accounting for the results of amplification carried out using electrophoresis in 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker.

Вывод: в лунках 8 и 10 обнаружены фрагменты 107 и 196 п.н. (фото 1), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду novicida (см. таблицу).Conclusion: wells 8 and 10 contained fragments of 107 and 196 bp. (photo 1), which indicates that the studied strains belong to the novicida subspecies (see table).

Стрелки указывают позиции аллелей 98,107 и 950 п.н. для гена ft779 и аллелей 174 и 196 п.н. для гена ft426. Лунки 5 и 9 маркерная ДНК.The arrows indicate the positions of alleles 98,107 and 950 bp. for the ft779 gene and alleles 174 and 196 b.p. for the ft426 gene. Wells 5 and 9 marker DNA.

Использование предлагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет подбора праймеров для мультипраймерной ПЦР в одной реакции в течение (2-3) часов определять подвид исследуемых бактерий рода Francisella, а именно: holarctica, tularensis, mediasiatica и novicida.The use of the proposed invention allows reliably and quickly by selecting primers for multiprimer PCR in one reaction within (2-3) hours to determine the subspecies of the studied bacteria of the genus Francisella, namely: holarctica, tularensis, mediasiatica and novicida.

Источники информацииSources of information

1. Hopla, С.Е., and А. K. Hopla. 1994. Tularemia, p. 113-126. In G. W. Beran(ed.), Handbook of zoonoses, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL.1. Hopla, C. E., and A. K. Hopla. 1994. Tularemia, p. 113-126. In G. W. Beran(ed.), Handbook of zoonoses, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL.

2. Centers for Disease Control and Prevention, Office of Inspector General, Department of Health and Human Services (HHS).2005. Possession, use, and transfer of select agents and toxins. Final rule. Fed. Regist. 70:13293-13325.2. Centers for Disease Control and Prevention, Office of Inspector General, Department of Health and Human Services (HHS).2005. Possession, use, and transfer of select agents and toxins. final rule. Fed. Register. 70:13293-13325.

3. Keim, P., A. Johansson, and D. M. Wagner.2007. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1105:30-66.3. Keim, P., A. Johansson, and D. M. Wagner. 2007. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N. Y. Acad. sci. 1105:30-66.

4. Олсуфьев Н.Г. Внутривидоваятаксономиявозбудителятуляремии Francisellatularensis / Н.Г. Олсуфьев, И.С. Мещерякова // Ж. ГигиеныЭпидемиол. Микробиол. Иммунол. - 1982. - №26. - С. 291-299.4. Olsufiev N.G. Intraspecific taxonomy of the causative agent of tularemia Francisellatularensis / N.G. Olsufiev, I.S. Meshcheryakova // J. Hygiene Epidemiol. Microbiol. Immunol. - 1982. - No. 26. - S. 291-299.

5. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев - М.: Медицина, 1975. - 192 с.5. Olsufiev N.G. Taxonomy, microbiology and laboratory diagnostics of the causative agent of tularemia / N.G. Olsufiev - M.: Medicine, 1975. - 192 p.

6. Svensson, K., P. Larsson, D. Johansson, М. Bystrom, М. Forsman, and А. Johansson. 2005. Evolution of subspecies of Francisellatularensis. J. Bacteriol. 187:3903-3908.6. Svensson, K., P. Larsson, D. Johansson, M. Bystrom, M. Forsman, and A. Johansson. 2005. Evolution of subspecies of Francisellatularensis. J. Bacteriol. 187:3903-3908.

7. Fey, P. D., M. M. Dempsey, M. E. Olson, M. S. Chrustowski, J. L. Engle, J. J. Jay, M. E. Dobson, K. S. Kalasinsky, A. A. Shea, P. C. Iwen, R. C. Wickert, S. C. Francesconi, R. M. Crawford, and S. H. Hinrichs. 2007. Molecular analysis of Francisellatularensissubspeciec tularensisand holarctica. Am. J. Clin. Pathol. 128:926-935.7. Fey, P. D., M. M. Dempsey, M. E. Olson, M. S. Chrustowski, J. L. Engle, J. J. Jay, M. E. Dobson, K. S. Kalasinsky, A. A. Shea, P. C. Iwen, R. C. Wickert, S. C. Francesconi, R. M. Crawford, and S. H. Hinrichs. 2007. Molecular analysis of Francisellatularensis subspeciec tularensisand holarctica. Am. J.Clin. Pathol. 128:926-935.

8. Dempsey, M. P., J. Nietfeldt, J. Ravel, S. Hinrichs, R. Crawford, and A. K. Benson. 2006. Paired-end sequence mapping detects extensive genomic rearrangement and translocation during divergence of Francisellatularensissuhsp. tularensisand Francisellatularensissuhsp. holarcticapopulations. J. Bacteriol. 188:5904-5914.8. Dempsey, M. P., J. Nietfeldt, J. Ravel, S. Hinrichs, R. Crawford, and A. K. Benson. 2006. Paired-end sequence mapping detects extensive genomic rearrangement and translocation during divergence of Francisellatularensissuhsp. tularensisand Francisellatularensissuhsp. holarctic populations. J. Bacteriol. 188:5904-5914.

9. Staples, J. E., K. A. Kubota, L. G. Chalcraft, P. S. Mead, and J. M. Petersen. 2006. Epidemiologic and molecular analysis of human tularemia, United States, 1964-2004. Emerg. Infect. Dis. 12:1113-1118.9. Staples, J. E., K. A. Kubota, L. G. Chalcraft, P. S. Mead, and J. M. Petersen. 2006. Epidemiologic and molecular analysis of human tularemia, United States, 1964-2004. Emerg. Infect. Dis. 12:1113-1118.

10. Garcia Del Blanco, N., M. E. Dobson, A. I. Vela, V. A. De La Puente, C. B.Gutie 'rrez, T. L. Hadfield, P. Kuhnert, J. Frey, L. Dominguez, and E. F.RodriguezFerri. 2002. Genotyping of Francisellatularensis strains by pulsed field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism fingerprinting, and 16S rRNA gene sequencing. J. Clin. Microbiol. 40:2964-2972.10. Garcia Del Blanco, N., M. E. Dobson, A. I. Vela, V. A. De La Puente, C. B. Gutie'rrez, T. L. Hadfield, P. Kuhnert, J. Frey, L. Dominguez, and E. F. Rodriguez Ferri. 2002. Genotyping of Francisellatularensis strains by pulsed field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism fingerprinting, and 16S rRNA gene sequencing. J.Clin. microbiol. 40:2964-2972.

11. Larsson, P., K. Svensson, L. Karlsson, D. Guala, M. Granberg, M. Forsman, and A. Johansson. 2007. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisellatularensis. Emerg. Infect. Dis. 13:1725-1732.11. Larsson, P., K. Svensson, L. Karlsson, D. Guala, M. Granberg, M. Forsman, and A. Johansson. 2007. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisellatularensis. Emerg. Infect. Dis. 13:1725-1732.

12. Johansson, A., J. Farlow, P. Larsson, M. Dukerich, E. Chambers, M.

, J. Fox, M. Chu, M. Forsman, A.

and P. Keim. 2004. Worldwide genetic relationships among FrancisellatularensisisolatQs determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 186:5808-5818.12. Johansson, A., J. Farlow, P. Larsson, M. Dukerich, E. Chambers, M.

, J. Fox, M. Chu, M. Forsman, A.

and P. Keim. 2004. Worldwide genetic relationships among FrancisellatularensisisolatQs determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 186:5808-5818.

13. Farlow, J., Smith, K. L., Wong, J., Abrams, M., Lytle, M., and Keim, P. (2001). Francisellatularensis strain typing using multiple-locus, variable number tandem repeat analysis. J. Clin. Microbiol. 39, 3186-3192. doi: 10.1128/JCM.39.9.3186-3192.2001.13. Farlow, J., Smith, K. L., Wong, J., Abrams, M., Lytle, M., and Keim, P. (2001). Francisellatularensis strain typing using multiple-locus, variable number tandem repeat analysis. J.Clin. microbiol. 39, 3186-3192. doi: 10.1128/JCM.39.9.3186-3192.2001.

14. Farlow, J., D. M. Wagner, M. Dukerich, M. Stanley, M. Chu, K. Kubota, J. Petersen, and P. Keim. 2005. Francisellatularensis in the United States. Emerg. Infect. Dis. 11:1835-1841.14. Farlow, J., D. M. Wagner, M. Dukerich, M. Stanley, M. Chu, K. Kubota, J. Petersen, and P. Keim. 2005 Francisellatularensis in the United States. Emerg. Infect. Dis. 11:1835-1841.

15. Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба. RU, патент №2478717, кл. C12Q 1/68,опубл. 10.04.13 г., Бюл. № 10.15. Method for differentiating subspecies of the tularemia microbe. RU, patent No. 2478717, class. C12Q 1/68, publ. 10.04.13, Bull. No. 10.

16. Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica, Francisella tularensis subsp. holarctica. RU, пат. №2612137, кл. C12Q 1/04, опубл. 02.03.2017. Бюл. № 2.16. Method for identifying subspecies of the tularemia pathogen Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica, Francisella tularensis subsp. holarctica. RU, Pat. No. 2612137, class. C12Q 1/04, publ. 03/02/2017. Bull. No. 2.

17. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.17. Organization of the work of laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV: Guidelines. MU 1.3.2569-09. - M.: Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, 2009. - 35 p.

Claims

1. A method for determining the subspecies of Francisella tularensis by multiprimer PCR, including DNA extraction from the studied strain of F. tularensis, PCR with specific primers, and taking into account the reaction by electrophoresis, characterized in that two common INDEL genes are detected on F. tularensis DNA, having deletions of a certain size, namely ft1779 and ft426, followed by their amplification using designed specific primers:

to gene ft1779 - primers GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT and

TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG,

with the length of the amplified fragment 98 bp. or 107 bp, or 950 bp,

to the ft426 gene - primers GATAGACGCTGCATCGACAC and ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA,

with the length of the amplified fragment 174 bp. or 196 bp,

at the same time, the results of determining the subspecies of F. tularensis are taken into account visually after electrophoresis in an 8% polyacrylamide gel in the presence of a DNA molecular weight marker, and for each strain a unique INDEL genotype is established for two INDEL genes, and by comparing the identified INDEL genotypes with genotypes of the following table

Штамм/подвидStrain/subspecies Размер ампликона для INDEL-локуса, п.н.Amplicon size for the INDEL locus, b.p. ft1779ft1779 ft426ft426 AL97-2214/new 107 196 AZ06-7470/new 107 196 D9846/new 107 196 F6168/new 107 196 Fx1/nov 107 196 PA10-7585/new 107 196 U112/nov 107 196 Lvs/hol 950 196 PHIT-FT049/hol 950 196 FSC147/medi 98 174 SHU-S4/tul A.I 98 196 WY-00W4114/tulA.II 98 196 WY96-3418/tulA.II 98 196 FSC022/hol(japan) 950 196 O'HARA/hol(japan) 950 196

establish the subspecies of the studied strains of F. tularensis.

2. The method according to p. 1, characterized in that PCR is carried out in a volume of 25 μl and the reaction mixture contains: 2 mMg buffer, 0.2 mM dNTP mixture, 1.0 μM mixture of all primers (0.5 μM of each primer ), 25 ng DNA template, 1 u. DNA polymerase, the remaining volume is water, while genomic DNA is used as a matrix, with a volume of 5 μl, which is obtained from different strains of F. tularensis.

3. The method according to p. 1, characterized in that PCR is carried out in compliance with the modes:

stage 1 - denaturation at 95°C - 3 min (1 cycle);

stage 2 - denaturation at 95°C - 20 s, annealing at 55°C - 20 s, synthesis at 72°C - 20 s (35 cycles);

Stage 3 - dosynthesis at 72°C - 5 min (1 cycle).