RU2631934C1 - Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction - Google Patents
Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2631934C1 RU2631934C1 RU2016129387A RU2016129387A RU2631934C1 RU 2631934 C1 RU2631934 C1 RU 2631934C1 RU 2016129387 A RU2016129387 A RU 2016129387A RU 2016129387 A RU2016129387 A RU 2016129387A RU 2631934 C1 RU2631934 C1 RU 2631934C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorption
- membrane
- composite membrane
- dna
- polyaniline
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к аналитической химии в области молекулярной биологии и фармакологической биотехнологии и может найти широкое применение в современной медицинской диагностике. Эффективность современных методов медицинской диагностики в значительной мере определяется возможностью быстро выделить чистый препарат биополимера (нуклеиновой кислоты или соответствующего белкового маркера), не нарушая его вторичную или третичную структуру, из клинических образцов сложного состава (таких как кровь, плазма, моча, мазок, мокрота и т.д.).The invention relates to analytical chemistry in the field of molecular biology and pharmacological biotechnology and can be widely used in modern medical diagnostics. The effectiveness of modern methods of medical diagnostics is largely determined by the ability to quickly isolate a pure biopolymer preparation (nucleic acid or the corresponding protein marker), without violating its secondary or tertiary structure, from complex clinical samples (such as blood, plasma, urine, smear, sputum and etc.).
Как правило, способы разделения и выделения биополимеров, в частности, ДНК основаны на различной растворимости нуклеиновых кислот, белков и полисахаридов. Несмотря на их эффективность, большинство методов разделения многостадийны, трудоемки и часто сопровождаются потерями выделяемого компонента. Это является следствием того, что такие методы основываются на концепции «улавливания» и «удерживания» целевого биополимера сорбентом из смеси на первом этапе разделения с последующей отмывкой от примесей и элюцией целевого компонента из сорбционного материала на последующих этапах.Typically, methods for the separation and isolation of biopolymers, in particular DNA, are based on the different solubilities of nucleic acids, proteins and polysaccharides. Despite their effectiveness, most separation methods are multi-stage, time-consuming and often accompanied by losses of the excreted component. This is a consequence of the fact that such methods are based on the concept of “capture” and “retention” of the target biopolymer by the sorbent from the mixture at the first separation stage, followed by washing from impurities and elution of the target component from the sorption material at the subsequent stages.
На практике широко распространены различные микроколоночные методы биосепарации, основанные на использовании спин-колонок или картриджей, пропускание через которые мобильной фазы (т.е. элюента) осуществляют за счет воздействия центробежной силы в центрифуге или под действием давления с использованием различных насосов. Такие микроколонки содержат немодифицированные кремнеземы, модифицированные кремнеземы (с использованием низкомолекулярных и высокомолекулярных модификаторов), синтетические мембраны, полимерные монолиты, полимерные или стеклянные капилляры и т.д. В отличие от традиционной колоночной хроматографии, такой подход позволяет относительно быстро, с использованием незначительных количеств сорбционного материала, очистить и выделить необходимую ДНК.In practice, various microcolumn bioseparation methods are widely spread, based on the use of spin columns or cartridges, through which the mobile phase (i.e., eluent) is passed through the action of centrifugal force in a centrifuge or under pressure using various pumps. Such microcolumns contain unmodified silica, modified silica (using low molecular weight and high molecular weight modifiers), synthetic membranes, polymer monoliths, polymer or glass capillaries, etc. In contrast to traditional column chromatography, this approach allows one to purify and isolate the necessary DNA relatively quickly, using small amounts of sorption material.
Ряд методик выделения ДНК основан на предварительном концентрировании клеток микроорганизмов из биологических образцов, в частности, используются следующие методики: фильтрация образца (Icuta, K., Maruo, S., Fujisawa, Т., Yamada, А. Micro Concentrator with OptoSense Micro Reactor for Biochemical IC Chip Family - 3D Composite Structure and Experimental Verification Proc. of 12th IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS'99), Orlando, 1999: p. 376-381), электрокинетическая фокусировка (C.R. Cabrera, P. Yager, Continuous concentration of bacteria in a microfluidic flow cell using electrokinetic techniques. Electrophoresis, 2001, v. 22, p. 355-362), микродиализ (F. Xiang, Y. Lin, J. Wen, D.W. Matson, R.D. Smith. An integrated microfabricated device for dual microdialysis and on-line ESI-ion trap mass spectrometry for analysis of complex biological samples. Anal Chem., 1999, v. 71, p. 1485-1490), аффинная хроматография с целью концентрирования клеток и последующей твердофазной экстракции НК (C. Yu, M.H. Davey, F. Svec, J.M. Frechet, Monolithic porous polymer for on-chip solid-phase extraction and preconcentration prepared by photoinitiated in situ polymerization within a microfluidic device. Anal Chem., 2001, v. 73, p. 5088-5096).A number of DNA extraction methods are based on preliminary concentration of microorganism cells from biological samples, in particular, the following methods are used: filtering the sample (Icuta, K., Maruo, S., Fujisawa, T., Yamada, A. Micro Concentrator with OptoSense Micro Reactor for Biochemical IC Chip Family - 3D Composite Structure and Experimental Verification Proc. Of 12th IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS'99), Orlando, 1999: p. 376-381), electrokinetic focusing (CR Cabrera, P. Yager, Continuous concentration of bacteria in a microfluidic flow cell using electrokinetic techniques. Electrophoresis, 2001, v. 22, p. 355-362), microdialysis (F. Xiang, Y. Lin, J. Wen, DW Matson, RD Smith. An integrated microfabricated device for dual m icrodialysis and on-line ESI-ion trap mass spectrometry for analysis of complex biological samples. Anal Chem., 1999, v. 71, p. 1485-1490), affinity chromatography for cell concentration and subsequent solid-phase extraction of NK (C. Yu, M.H. Davey, F. Svec, J.M. Frechet, Monolithic porous polymer for on-chip solid-phase extraction and preconcentration prepared by photoinitiated in situ polymerization within a microfluidic device. Anal Chem., 2001, v. 73, p. 5088-5096).
В качестве полупроницаемых мембран могут быть использованы разнообразнейшие материалы из боросиликатного стекла, целлюлозы, политетрафторэтилена, поливинилидендифторида и пр.A variety of materials from borosilicate glass, cellulose, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluoride, etc., can be used as semipermeable membranes.
Наиболее предпочтительными являются полупроницаемые мембраны на основе поливинилидендифторида. Благодаря гидрофильности, химической инертности, механической прочности, легкости в обработке и отсутствию ингибирующего действия на полимерную цепную реакцию (ПЦР), данный тип фильтров может быть использован для осуществления механического концентрирования и химического лизиса клеток в формате миниатюрного закрытого устройства (микрофлюидного модуля).Most preferred are semi-permeable membranes based on polyvinylidene difluoride. Due to hydrophilicity, chemical inertness, mechanical strength, ease of processing and the absence of an inhibitory effect on the polymer chain reaction (PCR), this type of filter can be used to perform mechanical concentration and chemical lysis of cells in the form of a miniature closed device (microfluidic module).
Важно отметить, что все перечисленные материалы используются именно в качестве фильтров, позволяющих механически удержать целевой биополимер при пропускании через мембрану образца. Основным недостатком таких методик лизиса клеток и вирусных частиц является то, что в результате данной процедуры наряду с целевыми нуклеиновыми кислотами фильтром удерживается множество веществ, способных ингибировать ПЦР. В некоторых случаях процесс выделения и очистки ДНК основан на способности ДНК обратимо адсорбироваться на поверхности мембраны. При этом необходимо дополнительно осуществлять отмывку адсорбированной ДНК от примесей и последующую элюцию целевого продукта подходящим буферным раствором, что приводит к существенным потерям выделяемого компонента биологической смеси.It is important to note that all of the materials listed are used specifically as filters that mechanically retain the target biopolymer when passing through the sample membrane. The main disadvantage of such methods of lysis of cells and viral particles is that as a result of this procedure, along with the target nucleic acids, a filter retains many substances that can inhibit PCR. In some cases, the process of DNA isolation and purification is based on the ability of DNA to be reversibly adsorbed on the membrane surface. In this case, it is necessary to additionally wash the adsorbed DNA from impurities and subsequent elution of the target product with a suitable buffer solution, which leads to significant losses of the released component of the biological mixture.
Поэтому с практической точки зрения более привлекательной представляется одностадийная схема выделения целевого продукта. При этом выделяемый (а заодно и очищаемый) биополимер после контакта смеси с сорбентом остается в несвязанном виде, в то время как нежелательные примеси удерживаются сорбентом. Оказалось, что для некоторых полимерных материалов, в частности, для полианилинов и фторполимеров, такой подход реализуется при одностадийном отделении нуклеиновых кислот от белков. При этом компоненты фракции нуклеиновых кислот (однонитевые и двунитевые ДНК, РНК) не удерживается или слабо удерживаются поверхностью сорбента, в то время как белки обратимо сорбируются. При этом сохраняется возможность последовательно десорбировать компоненты удерживаемой белковой фракции в зависимости от заряда белковой макромолекулы.Therefore, from a practical point of view, a one-stage scheme for isolating the target product seems more attractive. In this case, the biopolymer emitted (and at the same time purified) after contact of the mixture with the sorbent remains in an unbound form, while undesirable impurities are retained by the sorbent. It turned out that for some polymeric materials, in particular, for polyanilines and fluoropolymers, this approach is implemented in a single-stage separation of nucleic acids from proteins. Moreover, the components of the nucleic acid fraction (single-stranded and double-stranded DNA, RNA) are not retained or are weakly retained by the surface of the sorbent, while proteins are reversibly sorbed. At the same time, it remains possible to sequentially desorb the components of the retained protein fraction depending on the charge of the protein macromolecule.
Получение таких сорбентов требует применения сложной трудоемкой процедуры отмывки, кроме того, они не всегда оказываются эффективными при выделении и очистке нуклеиновых кислот из некоторых «сложных» биологических образцов, таких как кровь, ткани растений и т.д., содержащих наряду с белками мощные ингибиторы ПЦР, такие как гем и хлорофиллы, или для разделения ДНК и РНК, однонитевых ДНК от двунитевых ДНК и т.д.Obtaining such sorbents requires the use of a complex labor-intensive washing procedure; in addition, they do not always prove to be effective in the isolation and purification of nucleic acids from some “complex” biological samples, such as blood, plant tissues, etc., containing powerful inhibitors along with proteins PCR, such as heme and chlorophyll, or for the separation of DNA and RNA, single-stranded DNA from double-stranded DNA, etc.
Напротив, использование полимерных мембран в качестве подложек при синтезе композиционных полианилинсодержащих сорбентов позволяет реализовать несколько преимуществ по сравнению с технологиями получения композиционных дисперсных носителей: во-первых, в настоящем изобретении полимерная мембрана используется именно в качестве носителя, имеющего требуемую химическую структуру поверхностного слоя, необходимую для формирования равномерно распределенного полианилинового покрытия в составе сорбционной композитной мембраны, в результате чего удается осуществить более технологичный способ получения композиционного сорбента (по сравнению с получением дисперсных или капиллярных сорбентов); во-вторых, модифицированная полианилиновым покрытием мембрана используется в составе биосепарирующего элемента в качестве селективного сорбента, но не в качестве фильтра.On the contrary, the use of polymer membranes as substrates in the synthesis of composite polyaniline-containing sorbents allows several advantages over the technologies for producing composite dispersed carriers to be realized: first, in the present invention, the polymer membrane is used specifically as a carrier having the required chemical structure of the surface layer necessary for the formation of a uniformly distributed polyaniline coating in the composition of the sorption composite membrane, as a result ate which manage to pull more manufacturable method of producing a composite sorbent (compared with access to disperse or capillary sorbents); secondly, the membrane modified with a polyaniline coating is used as a selective sorbent in the composition of the bioseparating element, but not as a filter.
Известен трехслойный мембранно-сорбционный элемент по патенту РФ №2239490, опубл. в 2004 г., предназначенный для обработки жидких сред с целью фильтрации, детоксикации и т.д. В соответствии с заявленным решением мембранно-сорбционный элемент состоит из двух микрофильтрационных мембран, между которыми размещен слой сорбционной мембраны, имеющий каркас с ячейками, заполненными сорбирующим материалом различной природы.Known three-layer membrane-sorption element according to the patent of the Russian Federation No. 2239490, publ. in 2004, intended for the treatment of liquid media for the purpose of filtration, detoxification, etc. In accordance with the stated solution, the membrane-sorption element consists of two microfiltration membranes, between which there is a layer of a sorption membrane having a frame with cells filled with sorbent material of various nature.
Существенным недостатком данного мембранно-сорбционного элемента является технологическая сложность его изготовления, связанная с формированием внутреннего сорбционного слоя из сыпучего сорбента и мембранной конструкции, а также необходимости герметичной спайки внешних мембран. Кроме того, серьезным недостатком известного решения является высокая продолжительность выделения и очистки биологических жидкостей при его применении.A significant drawback of this membrane-sorption element is the technological complexity of its manufacture, associated with the formation of an internal sorption layer from a granular sorbent and a membrane structure, as well as the need for hermetically sealed external membranes. In addition, a serious drawback of the known solution is the high duration of isolation and purification of biological fluids during its use.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению в отношении сорбционной композитной мембраны служит композитная мембрана с фиксированной толщиной слоя полианилина, обладающая высокой электропроводностью и селективностью (Патент РФ 2481885 опубл. в 2013). Недостатком, препятствующим достижению обозначенного ниже технического результата, является присутствие в композите эфирных групп и остаточных сульфогрупп, обусловленное способом получения вышеуказанной мембраны, что значительно снижает эффективность возможного применения получаемых мембран при выделении нуклеиновых кислот, т.к. присутствие эфирных групп определяет рост неспецифической сорбции нуклеиновых кислот (Е.Yu. Yagudaeva, D.-J. Liaw, A.A. Ischenko, V.N. Bagratashvili, V.P. Zubov, A.I. Prostyakova, D.Yu. Ryazantsev, A.P. Sviridov, D.V. Kapustin. New polyamide-containing sorbents for one-step isolation of DNA. J Mater Sci (2014) 49:3491-3496), а наличие остаточных сульфогрупп может являться причиной потери нуклеиновыми кислотами нативных свойств при контакте с поверхностью такой мембраны вследствие апуринизации (Kapustin D., Prostyakova A., Bryk Ya., Yagudaeva E., Zubov V. New Composite Materials Modified with Nano-Layers of Functionalized Polymers for Bioanalysis and Medical Diagnostics. In: Nanocomposites and polymers with analytical methods. In: Nanocomposites and polymers with analytical methods / Cuppoletti J. (Ed.) - Croatia: Intech, 2011. ISBN: 978-953-307-352-1, p.p. 83-106).The closest technical solution to the proposed invention in relation to the sorption composite membrane is a composite membrane with a fixed thickness of the polyaniline layer, which has high electrical conductivity and selectivity (RF Patent 2481885 publ. In 2013). The disadvantage that impedes the achievement of the technical result indicated below is the presence in the composite of ether groups and residual sulfo groups, due to the method of obtaining the above membrane, which significantly reduces the effectiveness of the possible use of the obtained membranes in the isolation of nucleic acids, because the presence of ether groups determines the growth of non-specific sorption of nucleic acids (E. Yu. Yagudaeva, D.-J. Liaw, AA Ischenko, VN Bagratashvili, VP Zubov, AI Prostyakova, D.Yu. Ryazantsev, AP Sviridov, DV Kapustin. New polyamide- containing sorbents for one-step isolation of DNA. J Mater Sci (2014) 49: 3491-3496), and the presence of residual sulfo groups can cause nucleic acids to lose their native properties upon contact with the surface of such a membrane due to apurinization (Kapustin D., Prostyakova A ., Bryk Ya., Yagudaeva E., Zubov V. New Composite Materials Modified with Nano-Layers of Functionalized Polymers for Bioanalysis and Medical Diagnostics. In: Nanocomposites and polymers with analytical methods. In: Nanocomposites and polymers with analytical methods / Cuppoletti J. (Ed.) - Croatia: Intech, 2011. ISBN: 978-953-307-352-1, p.p. 83-106).
Известны устройства, в которых для проведения лизиса и выделения нуклеиновых кислот из получаемых лизатов, используется одна или несколько пористых мембран, через которые последовательно в автоматическом режиме пропускают образец. В одном из таких устройств, запатентованных фирмой Millipore Corporation, для выделения нуклеиновых кислот из клеток или вирусных частиц (Filter device for the isolation of a nucleic acid, Заявка ЕР 1873242, опубл. в 2008 г.) на первой пористой мембране, изготовленной из полисахарида или полиэфирсульфона, выполняется лизис клеток; полученный лизат поступает на стекловолоконный фильтр для последующей очистки и элюции нуклеиновых кислот. Фильтрующие мембраны соединены системой клапанов. Устройство может быть как одноразового, так и многоразового использования. Для одновременной обработки нескольких образцов несколько фильтрующих устройств могут быть собраны в кассету. Очевидным недостатком такого устройства является необходимость в использовании двух различных типов мембран, причем выделение нуклеиновых кислот проводится в результате многостадийной процедуры с использованием набора элюентов.Devices are known in which for the lysis and isolation of nucleic acids from the resulting lysates, one or more porous membranes are used through which a sample is automatically passed sequentially. In one such device, patented by Millipore Corporation, for the isolation of nucleic acids from cells or viral particles (Filter device for the isolation of a nucleic acid, Application EP 1873242, published in 2008) on a first porous membrane made of polysaccharide or polyethersulfone, cell lysis is performed; the resulting lysate enters a glass fiber filter for subsequent purification and elution of nucleic acids. The filtering membranes are connected by a valve system. The device can be either disposable or reusable. For the simultaneous processing of several samples, several filtering devices can be collected in a cassette. An obvious disadvantage of such a device is the need to use two different types of membranes, the nucleic acids being isolated as a result of a multistage procedure using a set of eluents.
Известно устройство для молекулярной сепарации и экстракции нуклеиновых кислот (патент US 7943393 опубл. в 2005 г.), в которых используют спин-колонки, например, в виде полипропиленовой трубки с одним или несколькими слоями адсорбента, такого как стекловолокна, стеклянные шарики, полимерные гранулы, частицы кремнезема, модифицированные силанами или полимерами и т.д. В этих патентах представлена реализация классического многостадийного принципа сепарации биомолекул на основе спин-колонок (картриджей), содержащих сорбционный материал, обратимо удерживающий целевой сорбат.A device for molecular separation and extraction of nucleic acids (patent US 7943393 publ. In 2005), which use spin columns, for example, in the form of a polypropylene tube with one or more layers of adsorbent such as glass fibers, glass beads, polymer granules silica particles modified with silanes or polymers, etc. In these patents, the implementation of the classical multistage principle of separation of biomolecules based on spin columns (cartridges) containing sorption material reversibly holding the target sorbate is presented.
Аналогичный принцип положен в основу ряда более сложных технических устройств пробоподготовки. Так, запатентованы колонки (Заявка KR 100286896, опубл. в 2001 г.) со стеклянным микроволокном и методики очистки на этих колонках плазмидной ДНК, выделение ее из агарозного и полиакриламидного гелей, а также очистка РНК, изотопов, продуктов полимеризационной цепной реакции (ПЦР). Колонки содержат слой боросиликатного стеклянного микроволокна и гидрохлорид гуанидина. Дезинтеграция клеток образца осуществляется за счет содержащегося в колонках гидрохлорида гуанидина, который, являясь хаотропным веществом, оказывает специфическое воздействие на живые клетки микроорганизмов: разрушает мембраны, рибосомы и другие клеточные структуры, обуславливая тем самым дезинтеграцию клеток и переход ДНК в свободную форму. Кроме того, он вызывает быструю денатурацию всех клеточных белков, в том числе нуклеаз. При этом в обработанных клетках удерживается высокомолекулярная геномная ДНК, не только доступная для неспецифических (таких как, например, микрококковая нуклеаза) и специфических (рестриктазы) нуклеаз, но и способная служить матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Освобожденная ДНК сорбируется на пористый слой боросиликатного стеклянного микроволокна.A similar principle underlies a number of more complex technical devices for sample preparation. So, patented columns (Application KR 100286896, published in 2001) with glass microfibre and methods of purification of plasmid DNA on these columns, its isolation from agarose and polyacrylamide gels, as well as purification of RNA, isotopes, products of polymerization chain reaction (PCR) . The columns contain a layer of borosilicate glass microfiber and guanidine hydrochloride. The disintegration of the sample cells is carried out due to the guanidine hydrochloride contained in the columns, which, being a chaotropic substance, has a specific effect on living cells of microorganisms: it destroys membranes, ribosomes and other cellular structures, thereby causing cell disintegration and the transition of DNA to free form. In addition, it causes rapid denaturation of all cellular proteins, including nucleases. At the same time, high molecular weight genomic DNA is retained in the treated cells, not only available for nonspecific (such as micrococcal nuclease) and specific (restrictase) nucleases, but also capable of serving as a matrix in the polymerase chain reaction (PCR). The released DNA is sorbed onto a porous layer of borosilicate glass microfiber.
Данный метод является вариантом традиционного способа очистки ДНК: дезинтеграция клеток хаотропными агентами и адсорбция ДНК на сорбенте. Данный метод очистки ДНК достаточно прост, дает хороший выход ДНК и не требует дальнейших процедур по очистке. Однако имеется и ряд недостатков. Во-первых, степень дезинтеграции клеток не достаточно высокая, и данный метод эффективен только при использовании довольно высокого исходного титра микроорганизмов или при проведении предварительного концентрирования и лизиса клеток. Т.е., метод не достаточно эффективен при работе с разбавленными образцами. Во-вторых, метод является относительно дорогостоящим для широкомасштабного использования.This method is a variant of the traditional method of DNA purification: disintegration of cells with chaotropic agents and adsorption of DNA on a sorbent. This method of DNA purification is quite simple, gives a good DNA yield and does not require further purification procedures. However, there are a number of disadvantages. Firstly, the degree of cell disintegration is not high enough, and this method is effective only when using a rather high initial titer of microorganisms or during preliminary concentration and lysis of cells. That is, the method is not effective enough when working with diluted samples. Secondly, the method is relatively expensive for widespread use.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому в отношении биосепарирующего устройства для выделения нуклеиновых кислот является устройство по международной заявке WO/2005/012521, опубл. в 2005 г. фирмы Inivitrogen «Nucleic acid isolation» по Corp., США. В соответствии с решением прототипа устройство состоит из картриджа, включающего пробирку, соединенную с фильтрующим элементом и далее с колонкой для очистки нуклеиновых кислот, при этом фильтрующий элемент содержит несколько слоев фильтров, а колонка включает носитель, способный связывать нуклеиновые кислоты, например носитель с переменным зарядом. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса. Недостатком данного метода также является наряду с лизисом клеток, разбавлением сыворотки крови и т.п. манипуляций, необходимость проведения многостадийной процедуры выделения нуклеиновые кислоты. Причиной, препятствующей достижению обозначенного ниже технического результата, является отсутствие специального селективного сорбционного слоя в фильтрующем элементе, а также технологическая громоздкость заявленного решения, приводящая к продолжительности выделения целевого продукта.The closest technical solution to the claimed in relation to a bioseparating device for the isolation of nucleic acids is a device according to international application WO / 2005/012521, publ. in 2005, Inivitrogen "Nucleic acid isolation" by Corp., USA. In accordance with the solution of the prototype, the device consists of a cartridge that includes a test tube connected to the filter element and then to a column for cleaning nucleic acids, while the filter element contains several layers of filters, and the column includes a carrier capable of binding nucleic acids, for example, a carrier with a variable charge . Sample manipulations are carried out using a syringe or pump. The disadvantage of this method is also along with cell lysis, dilution of blood serum, etc. manipulations, the need for a multistage nucleic acid extraction procedure. The reason that impedes the achievement of the technical result indicated below is the lack of a special selective sorption layer in the filter element, as well as the technological bulkiness of the claimed solution, leading to the duration of the selection of the target product.
Суть изобретения заключается в следующем.The essence of the invention is as follows.
Единой технической задачей заявляемого изобретения является разработка сорбционной композитной полимерной мембраны для выделения ДНК и устройства на ее основе, обеспечивающего выделение целевого продукта в одну стадию.A single technical task of the claimed invention is the development of a sorption composite polymer membrane for DNA extraction and a device based on it, which provides the selection of the target product in one stage.
Единым техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение продолжительности выделения ДНК при высокой эффективности используемой сорбционной композитной полимерной мембраны и устройства, содержащего данную мембрану.A single technical result of the claimed invention is a reduction in the duration of DNA isolation with high efficiency of the used sorption composite polymer membrane and a device containing this membrane.
Технический результат в отношении заявляемой сорбционной композитной мембраны для выделения ДНК достигается за счет введения в структуру сорбционной композитной мембраны пористой подложки и сорбционного покрытия подложки, что пористая подложка представляет собой микрофильтрационную полимерную мембрану со средним размером пор 0,2-0,65 мкм, выполненную из полиамида, полиэфирсульфона или поливинилиденфторида, сорбционное покрытие выполнено из полианилина, а массовая доля сорбционного покрытия из полианилина в составе сорбционной композитной мембраны составляет 10-25%.The technical result in relation to the claimed sorption composite membrane for DNA isolation is achieved by introducing into the structure of the sorption composite membrane a porous substrate and a sorption coating of the substrate that the porous substrate is a microfiltration polymer membrane with an average pore size of 0.2-0.65 μm made of polyamide, polyethersulfone or polyvinylidene fluoride, the sorption coating is made of polyaniline, and the mass fraction of the sorption coating of polyaniline in the composition of the sorption compo the membrane is 10–25%.
Наиболее эффективным вариантом осуществления изобретения является выполнение сорбционной композитной мембраны для выделения ДНК со средним размером пор 0,45 мкм.The most effective embodiment of the invention is the implementation of a sorption composite membrane for DNA isolation with an average pore size of 0.45 μm.
Технический результат в отношении биосепарирующего устройства для выделения ДНК достигается за счет включения в конструкцию устройства пластикового картриджа, вставленного в микропробирку, при этом пластиковый картридж содержит вышеописанную сорбционную композитную мембрану, скрученную в рулон с плотностью упаковки 25-60 см2/см3.The technical result with respect to the bioseparating device for DNA isolation is achieved by incorporating a plastic cartridge inserted into the microtube into the device design, while the plastic cartridge contains the sorption composite membrane described above twisted into a roll with a packing density of 25-60 cm 2 / cm 3 .
Дополнительные исследования, проведенные заявителем, показали, что заявляемая композитная мембрана выполняет роль селективного сорбента, а выделение ДНК осуществляется не за счет фильтрации, а за счет селективной сорбции компонентов разделяемой биологической смеси, в частности, ДНК, протекающей на поверхности вышеупомянутой мембраны.Additional studies conducted by the applicant showed that the inventive composite membrane acts as a selective sorbent, and DNA is not isolated by filtration, but by selective sorption of the components of the shared biological mixture, in particular DNA, flowing on the surface of the aforementioned membrane.
Кроме того, достижение заявленного технического результата обусловлено применением полианилина для модифицирования поверхности полимерной мембраны за счет следующего фактора. Преимущество полианилинов перед другими полимерами заключается в том, что макромолекула полианилина содержит как гидрофобные участки, так и заряженные азотсодержащие фрагменты. При этом молекула полианилина характеризуется наличием системы полисопряжения, что определяет рН-чувствительность полианилиновых покрытий. Благодаря этому структура молекулы полианилина подвержена обратимым изменениям в зависимости от рН среды, что дает возможность обратимо изменять сорбционные свойства полианилиновых покрытий. В частности, это свойство проявляется в способности полианилиновых покрытий разделять компоненты смесей белков и/или пептидов в зависимости от значений pI сорбатов, изменяя рН среды (элюента). Высокая селективность и гидрофильность полианилиновых покрытий в условиях разделения биополимеров на определенных этапах разделения позволяет не использовать элюент (мобильную фазу) для эффективного разделения компонентов используемой смеси (т.е. для эффективного разделения достаточно растворителя, присутствующего в пробе). В результате изменяются сорбционные свойства поверхности мембраны за счет образования устойчивого равномерного биосовместимого полимерного покрытия на поверхности мембраны (включая поверхность пор), обеспечивающего высокую селективность в процессах выделения нуклеиновых кислот из сложных биологических смесей в одну стадию с одновременной очисткой нуклеиновых кислот от примесей. При пропускании ДНК-содержащего лизата через слой модифицированной указанным способом мембраны достигается соотношение интенсивностей поглощения при 260 нм и 280 нм (А260/280) получаемого элюата от 1,7 до 1,85.In addition, the achievement of the claimed technical result is due to the use of polyaniline to modify the surface of the polymer membrane due to the following factor. The advantage of polyanilines over other polymers is that the polyaniline macromolecule contains both hydrophobic sites and charged nitrogen-containing fragments. In this case, the polyaniline molecule is characterized by the presence of a polyconjugation system, which determines the pH sensitivity of polyaniline coatings. Due to this, the structure of the polyaniline molecule is subject to reversible changes depending on the pH of the medium, which makes it possible to reversibly change the sorption properties of polyaniline coatings. In particular, this property is manifested in the ability of polyaniline coatings to separate the components of mixtures of proteins and / or peptides depending on pI values of sorbates, changing the pH of the medium (eluent). The high selectivity and hydrophilicity of polyaniline coatings under conditions of separation of biopolymers at certain stages of separation allows not to use an eluent (mobile phase) for the effective separation of the components of the mixture used (i.e., for the effective separation of sufficient solvent present in the sample). As a result, the sorption properties of the membrane surface change due to the formation of a stable uniform biocompatible polymer coating on the membrane surface (including the pore surface), which provides high selectivity in the processes of nucleic acid extraction from complex biological mixtures in one stage with the simultaneous purification of nucleic acids from impurities. When a DNA-containing lysate is passed through a layer of a membrane modified by this method, the ratio of absorption intensities at 260 nm and 280 nm (A 260/280 ) of the resulting eluate from 1.7 to 1.85 is achieved .
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.
Для получения сорбционной композитной мембраны проводят матричную окислительную полимеризацию анилина на поверхности микрофильтрационной полимерной мембраны при комнатной температуре в присутствии персульфата аммония в качестве окислителя. Затем полученную сорбционную композитную мембрану промывают спиртом, дистиллированной водой до обесцвечивания фильтрата, а потом деионизованной водой до исчезновения оптического поглощения в фильтратах в диапазоне длин волн от 200 до 700 нм и сушат в вакууме при комнатной температуре до стабилизации веса.To obtain a sorption composite membrane, matrix aniline oxidation polymerization is carried out on the surface of a microfiltration polymer membrane at room temperature in the presence of ammonium persulfate as an oxidizing agent. Then, the resulting sorption composite membrane is washed with alcohol, distilled water until the filtrate becomes discolored, and then with deionized water until optical absorption disappears in the filtrates in the wavelength range from 200 to 700 nm and dried in vacuum at room temperature until the weight stabilizes.
При необходимости осуществляют модификацию (увеличение массовой доли сорбционного покрытия) микрофильтрационной полимерной мембраны полианилином следующим образом. Лист мембраны помещают в стеклянную или пластиковую ванну с ровным дном и добавляют половину подготовленного непосредственно перед модификацией водного раствора анилина и окислителя. Раствор готовят, отбирая реагенты из тары производителя в стеклянный лабораторный стакан с помощью механических дозаторов с одноразовыми наконечниками. Полученную смесь инкубируют 15 мин при постоянном перемешивании при температуре 25°С. Затем к реакционной смеси добавляют необходимый объем приготовленного непосредственно перед модификацией водного раствора персульфата аммония. Затем лист мембраны переносят во вторую ванну с раствором анилина и соляной кислоты (вторая половина объема рабочего раствора). Полимеризацию ведут при комнатной температуре до приобретения мембраной темно-синего цвета. Затем лист переносят в чистую ванну с дистиллированной водой и отмывают поверхность мембраны от несвязанных частиц анилина при постоянном перемешивании с периодической сменой дистиллированной воды в ванне, контролируя степень отмывки путем измерения поглощения промывочной воды на спектрофотометре. Отмывку продолжают до отсутствия поглощения отмывочной воды в УФ-области. Отмытую мембрану растягивают с помощью подходящих прищепок или иных устройств на деревянной рамке и высушивают до постоянной массы при комнатной температуре. Полученный лист сорбционной композитной мембраны хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре до дальнейшего использования или нарезают на единичные ленты размером 1×12 см2.If necessary, carry out the modification (increase in the mass fraction of the sorption coating) of the microfiltration polymer membrane with polyaniline as follows. The membrane sheet is placed in a glass or plastic bath with a flat bottom and half of the aniline and oxidizer aqueous solution prepared immediately before the modification is added. The solution is prepared by selecting reagents from the manufacturer’s packaging in a glass beaker using mechanical dispensers with disposable tips. The resulting mixture was incubated for 15 minutes with constant stirring at a temperature of 25 ° C. Then, the necessary volume of ammonium persulfate prepared immediately before modification is added to the reaction mixture. Then the membrane sheet is transferred to a second bath with a solution of aniline and hydrochloric acid (the second half of the volume of the working solution). The polymerization is carried out at room temperature until the membrane becomes dark blue. Then the sheet is transferred to a clean bath with distilled water and the membrane surface is washed off from unbound particles of aniline with constant stirring with a periodic change of distilled water in the bath, controlling the degree of washing by measuring the absorption of washing water on a spectrophotometer. Washing is continued until the absorption of washing water in the UV region is absent. The washed membrane is stretched using suitable clothespins or other devices on a wooden frame and dried to constant weight at room temperature. The resulting sorption composite membrane sheet is stored in a tightly closed glass or plastic container until further use or cut into single tapes with a size of 1 × 12 cm 2 .
Для модифицирования отрезка мембраны площадью 100 см2 (одновременно с обеих сторон) одним слоем полианилина использовали 5,85 мл 37%-ной соляной кислоты и 2.095 мл анилина, смешанных в 210 мл воды, а также 4.56 г персульфата аммония.To modify a segment of the membrane with an area of 100 cm 2 (simultaneously on both sides) with one layer of polyaniline, 5.85 ml of 37% hydrochloric acid and 2.095 ml of aniline mixed in 210 ml of water, as well as 4.56 g of ammonium persulfate were used.
Прирост массы образца модифицированной мембраны по сравнению с исходной мембраной составляет 10±0.1% (в среднем, 9,91%).The weight gain of the sample of the modified membrane compared to the original membrane is 10 ± 0.1% (on average, 9.91%).
Единичный образец сорбционной композитной мембраны (площадь 12 см2) скручивают и помещают в пластиковый картридж. Картридж закрывают крышкой и упаковывают в стерильных условиях в плотную полиэтиленовую тару. Полученную сорбционную композитную мембрану используют в виде скрученной в рулон с плотностью упаковки 25-60 см2/см3 и помещенной в пластиковый катридж для одностадийного выделения (очистки) ДНК из сложных биологических смесей.A single sample of the sorption composite membrane (area 12 cm 2 ) is twisted and placed in a plastic cartridge. The cartridge is closed with a lid and packaged under sterile conditions in a dense plastic container. The resulting sorption composite membrane is used in the form of a rolled up roll with a packing density of 25-60 cm 2 / cm 3 and placed in a plastic cartridge for one-step extraction (purification) of DNA from complex biological mixtures.
Заявляемое биосепарирующее устройство для выделения ДНК представлено на фиг. 1, гдеThe inventive bio-separating device for DNA isolation is shown in FIG. 1 where
1 - сорбционная композитная мембрана, скрученная в рулон1 - sorption composite membrane twisted into a roll
2 - микропробирка2 - microtube
3 - пластиковый картридж3 - plastic cartridge
Заявляемое биосепарирующее устройство для выделения ДНК работает следующим образом.The inventive bioseparating device for DNA extraction works as follows.
ДНК-содержащую смесь (например, бактериальный лизат, 50-100 мкл) помещают на предварительно смоченную деионизованной водой скрученную сорбционную композитную мембрану 1 с плотностью упаковки 25-60 см2/см3, помещенную в мембранный биосепарирующий элемент, представляющий собой пластиковый картридж 2 (6×25 мм), помещенный в микропробирку 3. При необходимости избыток воды удаляют. Затем пластиковый картридж 2 помещают в центрифугу центрифугируют в течение 30 с при скорости оборотов 2000 об/мин. Полученный раствор очищенной ДНК пригоден для различных биотехнологических применений, в первую очередь, для проведения ПЦР-анализа.A DNA-containing mixture (e.g., a bacterial lysate, 50-100 μl) is placed on a twisted
Для реализации изобретения используют следующие вещества и материалы.To implement the invention using the following substances and materials.
В качестве пористой подложки использовали микрофильтрационные композиционные гидрофильные мембраны из полиамида, полиэфирсульфона и поливинилиденфторида.Microfiltration composite hydrophilic membranes made of polyamide, polyethersulfone and polyvinylidene fluoride were used as a porous substrate.
В качестве реагентов для получения сорбционного покрытия и оценки его сорбционных свойств использовали анилин, персульфат аммония, ацетат натрия; изопропиловый спирт, хлороформ, гидроксид натрия, трис(гидроксиметил)аминометан (трис), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), борную кислоту, агарозу, бромид этидиума, оранжевый Ж, глицерин, бычий сывороточный альбумин - все реагенты производства Sigma, Германия, а также соляную кислоту (ГОСТ 3118-77) производства ООО «Сигма Тек», Россия, водный аммиак (ГОСТ 24147-80) производства ЗАО «Химсервис», Россия, этиловый спирт 96%-ный (ГОСТ 5962-2013) производства ОАО «Медхимпром, Россия. Все реагенты и материалы - марки о.с.ч. или для ВЭЖХ-анализа, с чистотой от 96,5 до 99,5% - использовали без дополнительной очистки.Aniline, ammonium persulfate, sodium acetate were used as reagents to obtain a sorption coating and evaluate its sorption properties; isopropyl alcohol, chloroform, sodium hydroxide, tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), boric acid, agarose, ethidium bromide, orange W, glycerin, bovine serum albumin - all reagents produced by Sigma, Germany, as well as acid (GOST 3118-77) produced by Sigma Tech LLC, Russia, aqueous ammonia (GOST 24147-80) manufactured by Khimservice CJSC, Russia, 96% ethyl alcohol (GOST 5962-2013) manufactured by Medkhimprom OJSC, Russia . All reagents and materials - grade o.s.ch. or for HPLC analysis, with a purity of 96.5 to 99.5% - used without further purification.
Деионизацию воды проводили с помощью установки Milli Q RG ultra pure water system (Millipore, США).Deionization of water was carried out using a Milli Q RG ultra pure water system (Millipore, USA).
Тесты с использованием модельных микроорганизмов или клинических проб проводили на базе группы Молекулярной диагностики ИБХ РАН и НПФ «Генлаб» (Россия), соответственно, с использованием аппаратурной базы, наборов и реагентов и в соответствии с лабораторными протоколами указанных организаций.Tests using model microorganisms or clinical samples were carried out on the basis of the Molecular Diagnostics Group of the IBCh RAS and NPF Genlab (Russia), respectively, using hardware, kits and reagents and in accordance with the laboratory protocols of these organizations.
Эффективность применения сорбционной композитной мембраны для выделения и очистки ДНК оценивали путем использования модельных смесей в заявленном биосепарирующем устройстве в виде пластикового картриджа, вставленного в микропробирку-приемник.The effectiveness of the use of a sorption composite membrane for the isolation and purification of DNA was evaluated by using model mixtures in the claimed bioseparating device in the form of a plastic cartridge inserted in a microtube receiver.
Для эксперимента использовали сорбционные композитные мембраны с массовой долей сорбционного покрытия из полианилина 10, 15, 25% соответственно и со средним размером пор, соответственно, 0,65; 0,45 и 0,2 мкм.For the experiment, sorption composite membranes were used with a mass fraction of a polyaniline sorption coating of 10, 15, 25%, respectively, and with an average pore size of 0.65, respectively; 0.45 and 0.2 microns.
Выделение ДНК из клеточных культур (Е. coli) проводили следующим образом:DNA isolation from cell cultures (E. coli) was performed as follows:
- к 50 мл клеточной суспензии (109 клеток/мл) добавляли 100 мкл буфера-1 (250 мкл 1М Трис HCl pH 8.0, 250 мкл 1М хлорида магния, 500 мкл Triton X 100, 5.48 г сахарозы, доводили объем до 50 мл деионизованной воды) и 20 мкл 3% водного раствора протеиназы К (полученного с использованием препарата протеиназы К, иммобилизованной на частицах полиэтиленгликоля - Максатазы), полученную смесь перемешивали на шейкере 5-10 с и инкубировали при 60°С в течение 10 мин;- to 50 ml of cell suspension (10 9 cells / ml) was added 100 μl of buffer-1 (250 μl of 1M Tris HCl pH 8.0, 250 μl of 1M magnesium chloride, 500 μl of Triton X 100, 5.48 g of sucrose, the volume was brought up to 50 ml of deionized water) and 20 μl of a 3% aqueous solution of proteinase K (obtained using a proteinase K preparation immobilized on particles of polyethylene glycol - Maxatase), the resulting mixture was stirred on a shaker for 5-10 s and incubated at 60 ° C for 10 min;
- к смеси добавляли 100 мкл буфера-2 (5 мл 1М Трис-HCl pH 8,0, 0,5 мл 0,5М ЭДТА pH 8,0, 2 мл 5М хлорида натрия, 0.1 г додецилсульфата натрия и доводили объем до 50 мл деионизованной водой), перемешивали на шейкере 5-10 сек и повторно инкубировали при 60°С в течение 10 мин;- to the mixture was added 100 μl of buffer-2 (5 ml of 1M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, 2 ml of 5M sodium chloride, 0.1 g of sodium dodecyl sulfate and the volume was adjusted to 50 ml deionized water), stirred on a shaker for 5-10 seconds and re-incubated at 60 ° C for 10 min;
- смесь перемешивали на шейкере 10-15 сек и наносили на предварительно смоченные деионизованной водой поверхности мембраны по 50-100 мкл на картридж. Для смачивания на каждый картридж предварительно наносили по 250 мкл воды и центрифугировали 2 мин при 2000 об/мин;- the mixture was stirred on a shaker for 10-15 seconds and applied to the membrane surfaces previously wetted with deionized water, 50-100 μl per cartridge. For wetting, 250 μl of water was preliminarily applied to each cartridge and centrifuged for 2 min at 2000 rpm;
- картриджи инкубировали не менее 2.5 мин, затем центрифугировали 30 сек при 2000 об/мин;- cartridges were incubated for at least 2.5 minutes, then centrifuged for 30 seconds at 2000 rpm;
- полученные элюаты анализировали спектрофотометрически и после проведения электрофореза в 2% агарозном геле.- the obtained eluates were analyzed spectrophotometrically and after electrophoresis in 2% agarose gel.
Соотношение интенсивностей поглощения при 260 нм и 280 нм (А260/280) получаемых элюатов составило 1,71; 1,85 и 1,82.The ratio of absorption intensities at 260 nm and 280 nm (A 260/280 ) of the resulting eluates was 1.71; 1.85 and 1.82.
Для демонстрации эффекта обратимого удерживания белков в биосепарирующее устройство, содержащего сорбционную композитную мембрану скрученную в рулон с заданной плотностью, с помощью механического дозатора вносили 100 мкл раствора БСА (550 мкг) в ТЭ-буфере (pH 7,2). Картриджи инкубировали в течение 2,5 мин, затем центрифугировали 30 сек при 2000 об/мин. Затем полученный элюат переносили в пластиковую пробирку и анализировали спектрофотометрически, определяя по калибровочной кривой содержание белка в пробе. После этого на биосепарирующий элемент наносили 100 мкл разбавленной соляной кислоты (pH 4,0) и снова переносили полученный элюат и анализировали спектрофотометрически.To demonstrate the effect of reversible retention of proteins, 100 μl of a BSA solution (550 μg) in a TE buffer (pH 7.2) was introduced into a bioseparating device containing a sorption composite membrane twisted into a roll with a given density. Cartridges were incubated for 2.5 minutes, then centrifuged for 30 seconds at 2000 rpm. Then, the resulting eluate was transferred to a plastic tube and analyzed spectrophotometrically, determining the protein content in the sample from the calibration curve. After that, 100 μl of diluted hydrochloric acid (pH 4.0) was applied to the bioseparating element and the resulting eluate was again transferred and analyzed spectrophotometrically.
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что белок, удерживаемый при нейтральных значения pH среды, практически полностью десорбируется с поверхности мембраны при понижении pH.An analysis of the obtained data indicates that the protein retained at neutral pH values is almost completely desorbed from the membrane surface with decreasing pH.
В результате проведенных экспериментов по выделению ДНК получены данные по выходу целевого вещества до 90-95% с продолжительностью всего технологического цикла от 4 до 5 мин при продолжительности стадии центрифугирования (собственно стадии выделения ДНК) - 30 сек.As a result of the experiments on DNA extraction, data were obtained on the yield of the target substance up to 90-95% with a duration of the entire technological cycle from 4 to 5 minutes with a duration of the centrifugation stage (actually the stage of DNA extraction) - 30 sec.
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет эффективно выделить в одну стадию ДНК. При этом ДНК не удерживается поверхностью созданной сорбционной композитной мембраны (исключается последующая стадия десорбции при ее выделении) и может быть выделена с поверхности этой же мембраны с помощью элюции подходящим буфером. Процесс предельно прост и одинаково удобен как для ручного, так и для автоматического исполнения.As can be seen from the above examples, the present invention can effectively isolate DNA in one stage. In this case, DNA is not retained by the surface of the created sorption composite membrane (the subsequent stage of desorption is excluded when it is isolated) and can be isolated from the surface of the same membrane by elution with a suitable buffer. The process is extremely simple and equally convenient for both manual and automatic execution.
Таким образом, предлагаемая сорбционная композитная мембрана для выделения ДНК и биосепарирующее устройство на ее основе является простым, экономически эффективным решением, позволяющим проводить экспресс-выделение и очистку как нуклеиновых кислот, так и белков, не требующим использования дорогих материалов в качестве носителя при получении композиционного сорбента.Thus, the proposed sorption composite membrane for DNA isolation and a bioseparating device based on it is a simple, cost-effective solution that allows for the rapid isolation and purification of both nucleic acids and proteins that do not require the use of expensive materials as a carrier in the preparation of a composite sorbent .
Приведенные экспериментальные данные показывают перспективность нового материала - сорбционной композитной мембраны и биосепарирующего устройства на ее основе, применяемых для одностадийного выделения и очистки ДНК. Полученные новые мембранные сорбенты могут быть с успехом использованы в биотехнологии и медицинской диагностике, в частности, при упрощенной пробоподготовке при проведении ПЦР-анализа.The experimental data presented show the promise of a new material - a sorption composite membrane and a bioseparating device based on it, used for single-stage DNA extraction and purification. The obtained new membrane sorbents can be successfully used in biotechnology and medical diagnostics, in particular, with simplified sample preparation during PCR analysis.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129387A RU2631934C1 (en) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129387A RU2631934C1 (en) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2631934C1 true RU2631934C1 (en) | 2017-09-28 |
Family
ID=60040575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016129387A RU2631934C1 (en) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2631934C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697275C1 (en) * | 2018-03-19 | 2019-08-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Синтол" (ООО "Синтол") | Magnetic support for test tubes for extraction and purification of nucleic acids and/or macromolecules from biological sample |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2239490C2 (en) * | 2002-12-25 | 2004-11-10 | Закрытое акционерное общество "Плазмофильтр" | Membrane-sorption element and a method of its production |
| US20050019950A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Gierde Douglas T. | Method and device for extracting an analyte |
| WO2005012521A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-02-10 | Invitrogen Corporation | Nucleic acid isolation |
| RU2481885C1 (en) * | 2012-04-06 | 2013-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КубГУ") | Method of producing composite membrane with fixed polyaniline layer thickness |
-
2016
- 2016-07-18 RU RU2016129387A patent/RU2631934C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2239490C2 (en) * | 2002-12-25 | 2004-11-10 | Закрытое акционерное общество "Плазмофильтр" | Membrane-sorption element and a method of its production |
| US20050019950A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Gierde Douglas T. | Method and device for extracting an analyte |
| WO2005012521A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-02-10 | Invitrogen Corporation | Nucleic acid isolation |
| RU2481885C1 (en) * | 2012-04-06 | 2013-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КубГУ") | Method of producing composite membrane with fixed polyaniline layer thickness |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КАПУСТИН Д.В., ПРОСТЯКОВА А.И. И др., Высокоэффективный метод одностадийного выделения ДНК для ПЦР-диагностики Mycobacterium tuberculosis // ACTA NFTURAE, том.6, N 2 (21), 2014, стр.52-57. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697275C1 (en) * | 2018-03-19 | 2019-08-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Синтол" (ООО "Синтол") | Magnetic support for test tubes for extraction and purification of nucleic acids and/or macromolecules from biological sample |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2215103B1 (en) | Method for purifying nucleic acids | |
| JP3941842B2 (en) | Cast membrane structures for sample preparation | |
| JP3115324B2 (en) | Apparatus and method for isolating nucleic acid | |
| US20050254995A1 (en) | Devices and methods to immobilize analytes of interest | |
| EP1147226B1 (en) | Materials and methods for the purification of polyelectrolytes | |
| US8574923B2 (en) | Sample preparation device | |
| Jain et al. | Protein purification with polymeric affinity membranes containing functionalized poly (acid) brushes | |
| US20130115693A1 (en) | Device for isolation and/or purification of biomolecules | |
| KR20170075769A (en) | Mixed bed ion exchange adsorber | |
| JP2015232573A (en) | Pretreatment cartridge for substance separation and pretreatment method utilizing the same | |
| WO2016083823A1 (en) | Pipette tip and method of use thereof | |
| JP2006509994A (en) | Surface coated housing for sample preparation | |
| JP5230196B2 (en) | Instruments and methods for more efficient isolation of nucleic acids | |
| JP4976391B2 (en) | Isolation of proteins based on isoelectric point using solid buffer | |
| RU2631934C1 (en) | Sorption composite membrane and bioseparating device for dna extraction | |
| EP2067019A1 (en) | Multicapillary device for sample preparation | |
| US20110009503A1 (en) | Fractionation apparatus | |
| US20080272053A1 (en) | Combinatorial separations and chromatography renewable microcolumn | |
| JP7199027B2 (en) | concentration device | |
| WO2021100801A1 (en) | Nucleic acid separation method, detection method, nucleic acid purification column and method for producing same | |
| US20120045788A1 (en) | Device for sample preparation | |
| JP2005292105A (en) | Temperature responsive liquid chromatography carrier and liquid chromatography using it |