RU2696499C1

RU2696499C1 - Biosensor for simultaneous glucose and blood lactate determination

Info

Publication number: RU2696499C1
Application number: RU2018104872A
Authority: RU
Inventors: Дарья Владимировна Вохмянина; Егор Андреевич Андреев; Елена Евгеньевна Карякина; Аркадий Аркадьевич Карякин
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2019-08-02

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to determination of concentrations of glucose and lactate in diluted blood, as well as serum and blood plasma. A planar biosensor for determining glucose and lactate in a liquid sample includes a silver chloride reference electrode placed on a substrate, two working electrodes and auxiliary electrode arranged between working electrodes. One of the working electrodes is coated with a film of Prussian blue and a membrane containing an enzyme – glucose oxidase, and a second working electrode is coated with a film of Prussian blue and a membrane containing an enzyme – lactate oxidase. Comparison electrode is located at equal distance from working electrodes so that it is possible to set constant zero potential on working electrodes, and auxiliary electrode has area exceeding total area of working electrodes, wherein all electrodes are configured to be connected to the potentiostat, and the electrode with the glucose oxidase containing membrane is placed in front of the electrode with the lactate oxidase containing membrane in the direction of movement of the liquid sample. Also disclosed is a unit for measuring glucose and/or lactate in solution.

EFFECT: group of inventions provides higher sensitivity of the biosensor and enabling more accurate simultaneous determination of glucose and lactate in the sample by excluding their mutual influence with simultaneous determination.

10 cl, 11 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к электроаналитическим системам анализа и может быть использовано в медицинских диагностических центрах или машинах скорой помощи для определения концентраций глюкозы и лактата в разбавленной крови, а также сыворотке и плазме крови.The invention relates to electroanalytical analysis systems and can be used in medical diagnostic centers or ambulances to determine glucose and lactate concentrations in diluted blood, as well as serum and blood plasma.

Уровень техникиState of the art

Из уровня техники известны технические решения, обеспечивающие определение глюкозы или лактата.The prior art technical solutions for the determination of glucose or lactate.

Известно решение, представленное в статье [A. Karyakin, Е.A.

et. al. Anal. Chem. 74 (2002) 1597], позволяющее с высокой чувствительностью и точностью определять концентрацию глюкозы в различных объектах. Для создания биосенсоров на глюкозу используются стеклоуглеродные электроды, модифицированные электрохимическим способом пленкой берлинской лазури (БЛ), поверх которой нанесена ферментсодержащая мембрана нафиона. Проточно-инжекционная система на основе биосенсора обладает следующими характеристиками: коэффициент чувствительности 50 мМ/Мсм², нижний предел определяемых концентраций 0,1 мкМ. Система позволяет проводить определение глюкозы в разбавленной крови с минимальной пробоподготовкой.The solution presented in [A. Karyakin, E.A.

et. al. Anal. Chem. 74 (2002) 1597], which allows determining the glucose concentration in various objects with high sensitivity and accuracy. To create biosensors for glucose, glassy carbon electrodes are used, modified electrochemically with a film of Prussian blue (BL), on top of which an Nafion-containing enzyme membrane is applied. A biosensor flow-through injection system has the following characteristics: sensitivity coefficient 50 mM / Mcm ² , the lower limit of detectable concentrations is 0.1 μM. The system allows the determination of glucose in diluted blood with minimal sample preparation.

Из диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук [Прибиль М.М. Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 2015] известно решение, позволяющее с высокой точностью определять лактат, в котором для создания биосенсоров использованы фермент-содержащие мембраны на основе геля силоксана, нанесенные на планарные электроды, модифицированные пленкой БЛ.From the dissertation for the degree of candidate of chemical sciences [Pribil MM Highly effective lactate biosensors based on immobilized lactic oxidase engineering. The dissertation for the degree of candidate of chemical sciences. Moscow. 2015], a solution is known that makes it possible to determine lactate with high accuracy, in which enzyme-containing membranes based on siloxane gel are used to create biosensors deposited on planar electrodes modified with BL film.

Однако ни одно из этих решений не позволяет проводить одновременное определение лактата и глюкозы в одной пробе. Кроме того, использованные в первом из решений стеклоуглеродные электроды и электрохимический способ синтеза БЛ не подходят для промышленного производства биосенсоров.However, none of these solutions allows simultaneous determination of lactate and glucose in one sample. In addition, the glassy carbon electrodes used in the first solution and the electrochemical BL synthesis method are not suitable for the industrial production of biosensors.

Из уровня техники известны также способы одновременного определения глюкозы и лактата.Methods for the simultaneous determination of glucose and lactate are also known in the art.

Из статьи [J. Wang, М.Р. Chatrathi, G.E. Collins Anal. Chimica Acta 585 (2007) 11] известно решение, позволяющее проводить одновременное определение глюкозы и лактата в разбавленных образцах крови и сыворотки крови. Для проведения анализа использовали микрочипы, в которых совмещали электрофоретическое разделение глюкозы и лактата на колонке с последующим протеканием реакций с соответствующими ферментами и амперометрическим измерением полученных концентраций. Но такой способ требует использования сложного оборудования для разделения аналитов, а также обладает недостаточно высокими показателями чувствительности (5,1 мкА/М и 5,3 мкА/М для определения глюкозы и лактата, соответственно) и нижнего предела определяемых концентраций (30 мкМ для глюкозы и 45 мкМ для лактата), что не позволяет использовать разведение больше, чем в 20 раз (и сократить, таким образом, объем требуемого для анализа образца).From the article [J. Wang, M.R. Chatrathi, G.E. Collins Anal. Chimica Acta 585 (2007) 11] a solution is known that allows simultaneous determination of glucose and lactate in diluted blood and serum samples. For the analysis, microarrays were used in which the electrophoretic separation of glucose and lactate on a column was combined with subsequent reactions with the corresponding enzymes and amperometric measurement of the obtained concentrations. But this method requires the use of sophisticated equipment for the separation of analytes, and also does not have sufficiently high sensitivity indicators (5.1 μA / M and 5.3 μA / M for determining glucose and lactate, respectively) and a lower limit of detectable concentrations (30 μM for glucose and 45 μM for lactate), which does not allow the use of dilution more than 20 times (and thus reduce the amount of sample required for analysis).

Из статьи [L.V. Shkotova, N.Y. Piechniakova et. al. Food Chemistry 197 (2016) 972] известен способ одновременного определения глюкозы и лактата в вине. Для определения аналитов использовали амперометрический мультибиосенсор с использованием тонких золотых пленок в качестве трансдьюсера и ферментов глюкозооксидазы (ГОД) и лактатоксидазы (ЛОД), «пришитых» к поверхности электрода химической связью. Датчик обладал следующими аналитическими характеристиками: коэффициент чувствительности 58,4 мМ/Мсм² и 37,1 мМ/Мсм² для глюкозы и лактата, соответственно; диапазон определяемых содержаний (ДОС) 5-800 мкМ и 5-1000 мкМ для глюкозы и лактата, соответственно. Однако не показана применимость данной системы для анализа крови, кроме того, результаты измерения изложенным в результате методом и методом сравнения в некоторых случаях отличаются в два раза.From the article [LV Shkotova, NY Piechniakova et. al. Food Chemistry 197 (2016) 972] a method for the simultaneous determination of glucose and lactate in wine is known. To determine the analytes, an amperometric multibiosensor was used using thin gold films as a transducer and glucose oxidase (GOD) and lactate oxidase (LOD) enzymes that were “sewn” to the electrode surface by chemical bonding. The sensor had the following analytical characteristics: a sensitivity coefficient of 58.4 mM / Mcm ² and 37.1 mM / Mcm ² for glucose and lactate, respectively; the range of determined contents (DOS) is 5-800 μM and 5-1000 μM for glucose and lactate, respectively. However, the applicability of this system to a blood test is not shown, in addition, the measurement results of the method set out as a result and the comparison method in some cases differ by half.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является электроаналитическая система, раскрытая в публикации [Н. Kanso, M.B.G.

et. al. Electroanalysis 29 (2017) 87]. Для совместного определения глюкозы и лактата в вине использовали электроаналитическую систему со встроенным биосенсором, в качестве трансдьюсера использовали БЛ, в качестве биораспознающего элемента - ферменты целлобиозодегидрогеназу и лактатоксидазу. Конструкция системы представляла собой тонкослойную ячейку (толщина 0,4 мм) шириной 5 мм и протяженностью 50 мм, объемом 100 мкл, в нижней части которой находился планарный четырехэлектродный биосенсор на керамической основе, а по краям располагались вход и выход из ячейки диаметром 5 мм. При этом два рабочих электрода (площадью 2 мм²), выполненные из углерода, располагались посередине между входом и выходом у боковой поверхности ячейки, электрод сравнения (площадью 2 мм²), выполненный из серебра, располагается между рабочими электродами, а электрод сравнения (площадью 10 мм²), выполненный из углерода, является протяженным и располагается у боковой поверхности ячейки напротив трех других электродов, при этом центр ячейки остается свободным. Ввод аналита осуществлялся через встроенный инжекционный порт, находящийся непосредственно на входе в ячейку. Но такая конструкция обладает рядом недостатков. Во-первых, площадь вспомогательного электрода больше, чем суммарная площадь рабочих электродов, всего в 2,5 раза, а расстояние между вспомогательным и рабочими электродами в два раза больше, чем между рабочими электродами и электродом сравнения, что может приводить к протеканию тока между рабочими электродами и электродом сравнения и поляризации последнего. Во-вторых, объем ячейки составляет 100 мкл, а система инжекции предусматривает вкалывание аналита в поток движущегося фонового раствора через микрошприц, что может приводить к размытию фронта аналита и его разбавлению фоновым раствором, степень которого зависит от скорости ввода аналита и скорости потока фонового раствора. Для получения воспроизводимого результата, независимого от этих параметров, объем вводимого образца должен значительно превышать объем ячейки, что некритично в случае с анализом вина (для которого применяли данное решение), но является одним из важнейших критериев при анализе крови. В-третьих, пленка берлинской лазури, использованная в данной системе в качестве трансдьюсера, отличается невысокими характеристиками: большое расстояние между анодным и катодным пиками (130 мВ) на циклической вольтамперограмме свидетельствует о замедленном процессе переноса электронов, а большая полуширина анодного пика (150 мВ) свидетельствует о неравномерности покрытия. Все это приводит к недостаточно низкому пределу обнаружения (50 мкМ) сенсора на пероксид водорода, и к невысоким аналитическим характеристикам биосенсоров на его основе: коэффициенты чувствительности 0,51 мМ/Мсм² и 1,64 мМ/Мсм² для глюкозы и лактата, соответственно; ДОС 0,5-5 мМ для глюкозы и 0,25-5 мМ для лактата. Так как определяемое содержание глюкозы в крови составляет 0,5-30 мМ, лактата - 0,5-25 мМ, а стандартное разбавление образца крови - в 50 раз, то биосенсор для анализа крови должен обладать ДОС 0,01-1 мМ для глюкозы и 0,01-0,5 мМ для лактата, что система, представленная в данном примере, обеспечить не может. Авторы использовали данную систему в анализе вин.Closest to the claimed technical solution is the electroanalytical system disclosed in the publication [N. Kanso, MBG

et. al. Electroanalysis 29 (2017) 87]. For the joint determination of glucose and lactate in wine, an electroanalytical system with an integrated biosensor was used, BL was used as a transducer, and cellobiose dehydrogenase and lactate oxidase enzymes were used as a bio-recognizing element. The system design was a thin-layer cell (0.4 mm thick) with a width of 5 mm and a length of 50 mm, a volume of 100 μl, in the lower part of which was a planar four-electrode biosensor based on a ceramic base, and the cell entrance and exit were 5 mm in diameter at the edges. In this case, two working electrodes (with an area of 2 mm ² ) made of carbon were located in the middle between the inlet and outlet at the side surface of the cell, a reference electrode (with an area of 2 mm ² ) made of silver was located between the working electrodes, and the reference electrode (with an area 10 mm ² ), made of carbon, is extended and is located at the side surface of the cell opposite three other electrodes, while the center of the cell remains free. The analyte was introduced through the built-in injection port located directly at the entrance to the cell. But this design has several disadvantages. Firstly, the area of the auxiliary electrode is larger than the total area of the working electrodes, only 2.5 times, and the distance between the auxiliary and working electrodes is two times greater than between the working electrodes and the reference electrode, which can lead to the flow of current between the working electrodes and electrode of comparison and polarization of the latter. Secondly, the cell volume is 100 μl, and the injection system provides for injecting the analyte into the flow of a moving background solution through a microsyringe, which can lead to smearing of the analyte front and its dilution with the background solution, the degree of which depends on the analyte input rate and the background solution flow rate. To obtain a reproducible result that is independent of these parameters, the volume of the injected sample should significantly exceed the cell volume, which is not critical in the case of wine analysis (for which this solution was used), but it is one of the most important criteria for blood analysis. Thirdly, the film of Prussian blue, used as a transducer in this system, has low characteristics: a large distance between the anode and cathode peaks (130 mV) in the cyclic voltammogram indicates a slowed electron transfer process, and a large half-width of the anode peak (150 mV) indicates uneven coverage. All this leads to an insufficiently low detection limit (50 μM) of the hydrogen peroxide sensor, and to low analytical characteristics of biosensors based on it: sensitivity coefficients of 0.51 mM / Mcm ² and 1.64 mM / Mcm ² for glucose and lactate, respectively ; DOS 0.5-5 mm for glucose and 0.25-5 mm for lactate. Since the determined blood glucose is 0.5-30 mM, lactate is 0.5-25 mM, and the standard dilution of the blood sample is 50 times, the blood biosensor should have a DOS of 0.01-1 mM for glucose and 0.01-0.5 mM for lactate, which the system presented in this example cannot provide. The authors used this system in the analysis of wines.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической проблемой заявленного изобретения является необходимость создания экспрессного биосенсора, обеспечивающего возможность одновременного определения глюкозы и лактата, а также точного и недорогого измерительного блока на его основе, подходящего для проведения рутинных анализов крови (определения концентраций глюкозы и лактата) в медицинских диагностических лабораториях.The technical problem of the claimed invention is the need to create an express biosensor that allows the simultaneous determination of glucose and lactate, as well as an accurate and inexpensive measuring unit based on it, suitable for routine blood tests (determination of glucose and lactate concentrations) in medical diagnostic laboratories.

Технический результат изобретения заключается в повышении аналитических характеристик биосенсора и измерительного блока на его основе, в частности, достигаемый технический результат заключается в повышении чувствительности биосенсора и обеспечении возможности более точного одновременного определения глюкозы и лактата в образце за счет исключения их взаимного влияния при одновременном определении. Технический результат заявляемого изобретения также заключается в повышения точности анализа крови с использованием заявляемого биосенсора в составе электроаналитической системы, за счет исключения систематической погрешности, которая, как правило, присутствует при измерении известными анализаторами.The technical result of the invention is to increase the analytical characteristics of the biosensor and the measuring unit based on it, in particular, the technical result achieved is to increase the sensitivity of the biosensor and enable more accurate simultaneous determination of glucose and lactate in the sample by eliminating their mutual influence while simultaneously determining. The technical result of the claimed invention also consists in increasing the accuracy of a blood test using the inventive biosensor in the electroanalytical system, by eliminating the systematic error, which, as a rule, is present when measured by known analyzers.

Известные анализаторы при определении концентрации глюкозы и лактата используют реакцию электроокисления пероксида водорода - продукта ферментативных реакций, катализируемых ГОД и ЛОД, - что требует использования высоких потенциалов (+ 0,4 - 0,6 В относительно хлорид-серебряного электрода сравнения (ХСЭ), в дальнейшем все потенциалы приводятся относительно ХСЭ). Это приводит к завышению отклика анализатора (на 5%) за счет присутствия в образцах крови заранее неизвестного количества восстановителей (урат, аскорбат, парацетамол и др.), которые также окисляются при этом потенциале.Known analyzers, when determining the concentration of glucose and lactate, use the hydrogen peroxide electrooxidation reaction, a product of enzymatic reactions catalyzed by YEAR and LOD, which requires the use of high potentials (+ 0.4 - 0.6 V relative to the silver chloride reference electrode (CSE), in further all potentials are given relative to the CSE). This leads to an overestimation of the analyzer response (by 5%) due to the presence in the blood samples of an unknown quantity of reducing agents (urate, ascorbate, paracetamol, etc.), which are also oxidized at this potential.

Технический результат достигается за счет использования при проведении анализа реакции электровосстановления пероксида водорода, селективно катализируемой БЛ и протекающей при относительно низком потенциале (- 0,05 - 0,05 В), при котором окисления присутствующих в крови восстановителей не происходит.The technical result is achieved by using hydrogen peroxide, which is selectively catalyzed by BL and proceeding at a relatively low potential (- 0.05 - 0.05 V), when oxidizing the reducing agents present in the blood during the analysis.

Поставленная задача решается тем, что планарный биосенсор для определения глюкозы и лактата в жидкой пробе включает размещенные на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, два рабочих электрода и вспомогательный электрод, размещенный между рабочими электродами. При этом на один из рабочих электродов нанесена пленка БЛ и мембрана, содержащая фермент - ГОД, а на второй рабочий электрод нанесена пленка БЛ и мембрана, содержащая фермент - ЛОД, электрод сравнения расположен на одинаковом расстоянии от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах, а вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, для уменьшения влияния протекающих на вспомогательном электроде процессов на измеряемый сигнал; при этом все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату, а электрод с мембраной, содержащей ГОД, расположен перед электродом с мембраной, содержащей ЛОД, по ходу движения жидкой пробы. Пленка БЛ может иметь толщину 60-80 нм, поликристаллическую структуру, и покрывает поверхность рабочего электрода сплошным однородным слоем.The problem is solved in that the planar biosensor for determining glucose and lactate in a liquid sample includes a silver chloride reference electrode placed on the substrate, two working electrodes and an auxiliary electrode located between the working electrodes. In this case, a BL film and a membrane containing an enzyme — LOD are deposited on one of the working electrodes, and a BL film and a membrane containing an enzyme — LOD are deposited on a second working electrode, the reference electrode is located at the same distance from the working electrodes, making it possible to set a constant zero potential on the working electrodes, and the auxiliary electrode has an area exceeding the total area of the working electrodes to reduce the influence of the processes occurring on the auxiliary electrode on the measured signal; in this case, all the electrodes are made with the possibility of connecting to the potentiostat, and the electrode with the membrane containing the LOD is located in front of the electrode with the membrane containing the LOD, in the direction of movement of the liquid sample. The BL film can have a thickness of 60-80 nm, a polycrystalline structure, and covers the surface of the working electrode with a continuous uniform layer.

Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией у-аминопропилтриэтоксисилана 0,1-3 _об. %, ЛОД - 1 мг/мл и воды - 10 _об. % в изопропиловом спирте, а мембрана, содержащая фермент - ГОД получена из мембранообразующей смеси с концентрацией перфторсульфонированного полимера (ПФС) 0,1-1,5 _об. %, ГОД - 1,5 мг/мл и воды - 15 _об. % в изопропиловом спирте. Рабочие электроды выполнены диаметром 0,8-1 мм. Рабочие электроды расположены на расстоянии от электрода сравнения не более 2 мм. Заявляемый биосенсор может быть изготовлен методом трафаретной печати и может иметь толщину 0,22-0,35 мм. Электрод сравнения выполнен протяженным от одного рабочего электрода до другого шириной не менее 0,5 мм. Поставленная задача также решается тем, что блок для измерения глюкозы и лактата в растворе он включает герметично соединенные между собой нижнюю и верхнюю части, между которыми закреплен биосенсор, выполненный по п. 1, при этом между биосенсором и верхней частью измерительного блока сформирована тонкослойная объемная ячейка толщиной менее 0,3 мм, имеющая основание в форме овала с утолщением вдоль длинного диаметра овала в виде протяженного капилляра шириной менее 1 мм и толщиной менее 0,3 мм, проходящим через все электроды биосенсора, при этом капилляр имеет вход, расположенный со стороны рабочего, электрода с мембраной, содержащей глюкозооксидазу, и выход - со стороны рабочего электрода с мембраной, содержащей лактатоксидазу, при этом вход и выход соединены с каналами подвода и отвода жидкой пробы или фонового буферного раствора.The membrane containing the enzyme - LOD, obtained from a membrane-forming mixture with a concentration of y-aminopropyltriethoxysilane 0.1-3 _vol. %, LOD - 1 mg / ml and water - 10 _vol. % in isopropyl alcohol, and the membrane containing the enzyme - YEAR is obtained from a membrane-forming mixture with a concentration of perfluorosulfonated polymer (PPS) of 0.1-1.5 _vol. %, YEAR - 1.5 mg / ml and water - 15 _vol. % in isopropyl alcohol. Working electrodes are made with a diameter of 0.8-1 mm. The working electrodes are located at a distance from the reference electrode of not more than 2 mm. The inventive biosensor can be made by screen printing and can have a thickness of 0.22-0.35 mm The reference electrode is made extended from one working electrode to another with a width of at least 0.5 mm. The problem is also solved in that the unit for measuring glucose and lactate in solution, it includes hermetically connected lower and upper parts, between which a biosensor made according to claim 1 is fixed, while a thin-layer volume cell is formed between the biosensor and the upper part of the measuring unit less than 0.3 mm thick, having an oval base with thickening along the long oval diameter in the form of an extended capillary less than 1 mm wide and less than 0.3 mm thick passing through all the biosensor electrodes, at ohm capillary has an input located on the side of the working, an electrode with a membrane containing glucose oxidase, and output - with the working electrode with a membrane containing lactate oxidase, wherein the inlet and outlet are connected with channels for supplying and discharging the liquid sample or background buffer.

Тонкослойная ячейка может быть снабжена по периметру уплотнительным элементом, обеспечивающим герметизацию биосенсора.A thin-layer cell can be equipped with a sealing element around the perimeter, which provides sealing of the biosensor.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется чертежами, гдеThe invention is illustrated by drawings, where

на фиг. 1 представлена схема биосенсора для совместного определения глюкозы и лактата,in FIG. 1 shows a biosensor scheme for the joint determination of glucose and lactate,

на фиг. 2 представлена схема действия сенсорного материала,in FIG. 2 shows a diagram of the action of sensory material,

на фиг. 3 - чувствительность определения глюкозы для рабочего электрода с пленкой, содержащей ГОД, и различными концентрациями перфторсульфонированного полимера в мембранообразующей смеси,in FIG. 3 - the sensitivity of the determination of glucose for the working electrode with a film containing YEAR, and various concentrations of perfluorosulfonated polymer in a membrane-forming mixture,

на фиг. 4 - чувствительность определения лактата для рабочего электрода с пленкой, содержащей ЛОД, и различными концентрациями γ-аминопропилтриэтоксисилана в мембранообразующей смеси,in FIG. 4 - sensitivity of the determination of lactate for the working electrode with a film containing LOD, and various concentrations of γ-aminopropyltriethoxysilane in a membrane-forming mixture,

на фиг. 5 - верхняя часть измерительного блока с отверстиями повода и отвода жидкой пробы,in FIG. 5 - the upper part of the measuring unit with holes for the occasion and removal of the liquid sample,

на фиг. 6 - градуировочные зависимости для заявляемого биосенсора,in FIG. 6 - calibration dependences for the inventive biosensor,

на фиг. 7 - зависимость чувствительности и времени отклика от скорости потока фонового буферного электролита,in FIG. 7 - dependence of sensitivity and response time on the flow rate of the background buffer electrolyte,

на фиг. 8 - влияние эквимолярных добавок лактата на определение глюкозы при обратном положении,in FIG. 8 - the effect of equimolar additives of lactate on the determination of glucose in the opposite position,

на фиг. 9 - влияние эквимолярных добавок лактата на определение глюкозы при прямом положении,in FIG. 9 - the effect of equimolar additives of lactate on the determination of glucose in the upright position,

на фиг. 10 - влияние эквимолярных добавок глюкозы на определение лактата при обратном положении иin FIG. 10 shows the effect of equimolar glucose supplements on the determination of lactate in the reverse position; and

на фиг. 11 - влияние эквимолярных добавок глюкозы на определение лактата при прямом положении.in FIG. 11 shows the effect of equimolar glucose supplementation on the determination of lactate in the upright position.

Позициями на фигурах обозначены:The positions in the figures indicated:

1 - первый рабочий электрод (с пленкой БЛ и мембраной, содержащей ГОД),1 - the first working electrode (with BL film and a membrane containing a YEAR),

2 - вспомогательный электрод,2 - auxiliary electrode,

3 - электрод сравнения,3 - reference electrode,

4 - фотоотверждаемый изолятор, ограничивающий рабочие электроды,4 - photocured insulator, limiting the working electrodes,

5 - второй рабочий электрод (с пленкой БЛ и мембраной, содержащей ЛОД),5 - the second working electrode (with BL film and a membrane containing LOD),

6 - термоотверждаемый изолятор для изоляции контактов,6 - thermosetting insulator for insulation of contacts,

7 - контакты,7 - contacts,

8 - мембрана, содержащая фермент,8 - membrane containing the enzyme,

9 - пленка БЛ,9 - BL film,

10 - поверхность рабочего электрода,10 - surface of the working electrode,

11 - выемка для герметизирующего кольца,11 - recess for the sealing ring,

12 - протяженный капилляр,12 is an extended capillary,

13 - корпус верхней части измерительного блока,13 - the housing of the upper part of the measuring unit,

14 - канал подвода жидкой пробы в ячейку,14 - channel for supplying a liquid sample to the cell,

15 - канал отвода жидкой пробы из ячейки,15 - channel for the removal of liquid samples from the cell,

Е - фермент (ГОД или ЛОД),E - enzyme (YEAR or LOD),

S - субстрат ферментативной реакции (глюкоза или лактат),S is the substrate of the enzymatic reaction (glucose or lactate),

Р - продукт ферментативной реакции (глюконолактон или пируват).P is the product of the enzymatic reaction (gluconolactone or pyruvate).

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Заявляемый биосенсор включает электрод сравнения, вспомогательный электрод, и два рабочих электрода, модифицированных сенсорными покрытиями, позволяющими селективно определять целевые аналиты - глюкозу и лактат. Сенсорное покрытие включает пленку электрокатализатора восстановления пероксида водорода (БЛ) и биораспознающий элемент (полимерную мембрану, содержащую фермент - ГОД или ЛОД).The inventive biosensor includes a reference electrode, an auxiliary electrode, and two working electrodes modified with sensor coatings, which allow selective determination of target analytes - glucose and lactate. The sensor coating includes a film of a hydrogen peroxide (BL) reduction electrocatalyst and a bio-recognizing element (a polymer membrane containing an enzyme - YEAR or LOD).

На первый рабочий электрод последовательно нанесены пленка БЛ и мембрана на основе ПФС (структурного аналога нафиона), содержащая фермент - ГОД для получения сенсорного покрытия для определения глюкозы. Сплошная однородная пленка БЛ толщиной 60-80 нм нанесена по методике [Borisova A.V., Karyakina Е.Е., Cosnier S., Karyakin A.A. // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией ПФС 0,1-1,5 _об. %, ГОД - 1,5 мг/мл и воды - 15 _об. % в изопропиловом спирте, по методике [Karyakin А.А.,

Е.A., Lukachova L.V., Karyakina Е.Е., Wang J. // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 1597].A BL film and a membrane based on PPS (a structural analogue of Nafion) containing the enzyme - YEAR to obtain a sensor coating for glucose determination are sequentially deposited on the first working electrode. A continuous homogeneous BL film 60-80 nm thick was deposited according to the procedure [Borisova AV, Karyakina E.E., Cosnier S., Karyakin AA // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. The membrane containing the enzyme - YEAR, is obtained from a membrane-forming mixture with a PPS concentration of 0.1-1.5 _vol. %, YEAR - 1.5 mg / ml and water - 15 _vol. % in isopropyl alcohol, according to the method [Karyakin A.A.,

E.A., Lukachova LV, Karyakina E.E., Wang J. // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 1597].

На второй рабочий электрод последовательно нанесены пленка БЛ и мембрана на основе силоксана, содержащая фермент - ЛОД для получения сенсорного покрытия для определения лактата. Сплошная однородная пленка БЛ толщиной 60-80 нм нанесена по методике [Borisova A.V., Karyakina Е.Е., Cosnier S., Karyakin A.A. // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией γ-аминопропилтриэтоксисилана 0,1-3 _об. %, ЛОД - 1 мг/мл и воды - 10 _об. % в изопропиловом спирте, по методике [Pribil М.М.,

F., Andreyev E.A., Lesch A., Karyakina E.E., Voronin O.G., Girault H.H., Karyakin A.A. // J. of Electroanal. Chem. 2014. Vol. 731. P. 112].A BL film and a siloxane-based membrane containing the enzyme, LOD, are sequentially deposited on the second working electrode to obtain a sensor coating for determining lactate. A continuous homogeneous BL film 60-80 nm thick was deposited according to the procedure [Borisova AV, Karyakina E.E., Cosnier S., Karyakin AA // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. The membrane containing the enzyme - LOD, obtained from a membrane-forming mixture with a concentration of γ-aminopropyltriethoxysilane 0.1-3 _vol. %, LOD - 1 mg / ml and water - 10 _vol. % in isopropyl alcohol, according to the method [Pribil MM,

F., Andreyev EA, Lesch A., Karyakina EE, Voronin OG, Girault HH, Karyakin AA // J. of Electroanal. Chem. 2014. Vol. 731. P. 112].

Рабочий электрод с мембраной, содержащей ГОД, расположен перед рабочим электродом с мембраной, содержащей ЛОД, по ходу движения жидкой пробы, для избежания взаимного влияния при совместном определении глюкозы и лактата.The working electrode with the membrane containing the YEAR is located in front of the working electrode with the membrane containing the LOD, in the direction of movement of the liquid sample, to avoid mutual influence in the joint determination of glucose and lactate.

Электрод сравнения расположен на равном расстоянии (не более 2 мм) от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах.The reference electrode is located at an equal distance (not more than 2 mm) from the working electrodes with the possibility of setting a constant zero potential at the working electrodes.

Вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, для уменьшения влияния процессов, протекающих на вспомогательном электроде, на измеряемый сигнал.The auxiliary electrode has an area exceeding the total area of the working electrodes to reduce the influence of the processes occurring on the auxiliary electrode on the measured signal.

Все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату.All electrodes are configured to be connected to a potentiostat.

Толщина биосенсора составляет 0,22-0,35 мм.The thickness of the biosensor is 0.22-0.35 mm

Биосенсор закреплен между герметично соединенными между собой нижней и верхней частей измерительного блока, при этом между биосенсором и верхней частью измерительного блока сформирована тонкослойная ячейка толщиной менее 0,3 мм. Ячейка представляет собой полость в виде объемной фигуры, в основании которой находится овал, с утолщением вдоль длинного диаметра овала в виде протяженного капилляра шириной менее 1 мм и толщиной менее 0,3 мм, проходящего через все электроды биосенсора. Капилляр имеет вход, расположенный со стороны рабочего электрода с пленкой, содержащей глюкозооксидазу, и выход - со стороны рабочего электрода с пленкой, содержащей лактатоксидазу, при этом вход и выход соединены с каналами подвода и отвода жидкой пробы или фонового буферного раствора. Тонкослойная ячейка снабжена по периметру уплотнительным элементом, обеспечивающим герметизацию биосенсора.A biosensor is fixed between the lower and upper parts of the measuring unit hermetically connected to each other, while a thin-layer cell less than 0.3 mm thick is formed between the biosensor and the upper part of the measuring unit. The cell is a cavity in the form of a three-dimensional figure, at the base of which there is an oval, with a thickening along the long diameter of the oval in the form of an extended capillary with a width of less than 1 mm and a thickness of less than 0.3 mm, passing through all the biosensor electrodes. The capillary has an inlet located on the side of the working electrode with a film containing glucose oxidase, and an outlet on the side of the working electrode with a film containing lactic oxidase, while the inlet and outlet are connected to the channels for supplying and discharging a liquid sample or background buffer solution. The thin-layer cell is equipped with a sealing element around the perimeter, which provides sealing of the biosensor.

Для совместного определения глюкозы и лактата используется биосенсор на основе четырехэлектродной печатной системы (ЧПС) (фиг. 1). ЧПС изготавливается методом трафаретной печати на пластиковой основе из полиэтилентерефталата (ПЭТФ). Изготовление печатной системы включает несколько этапов: на пластиковую подложку наносят слой серебросодержащей пасты, служащей в качестве токопроводящих контактов, а также материала электрода сравнения; далее наносят слой углеродной пасты, служащей материалом вспомогательного и рабочих электродов, затем наносят слой фотоотверждаемого изолятора, отделяющего рабочие электроды от электрода сравнения и вспомогательного электрода и на последнем этапе наносят слой термоотверждаемого изолятора, закрывающего токопроводящие контакты от соприкосновения с раствором в ячейке. Способ изготовления сенсорного покрытия биосенсора включает химическую модификацию поверхности рабочих электродов пленкой БЛ с последующей иммобилизацией ферментов (ГОД или ЛОД) в полимерную мембрану на поверхности модифицированного электрода. Полимерная мембрана состоит из ПФС с включенным в него ферментом - ГОД для сенсорного покрытия для определения глюкозы или из силоксана, полученного полимеризацией γ-аминопропилтриэтоксисилана, с включенным в него ферментом - ЛОД для сенсорного покрытия для определения лактата. Принцип действия сенсорного покрытия основан на селективном электрокаталитическом восстановлении пероксида водорода, выделяющегося в процессе катализируемой ферментом (ГОД или ЛОД) реакции, на поверхности электрода с нанесенной пленкой БЛ (фиг. 2). Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена путем нанесения капли мембранообразующей смеси, содержащей ПФС с концентрацией 0,1-1,5 _об. % (фиг. 3), ГОД - 1,5 мг/мл и воду - 15 _об. % в изопропиловом спирте, на поверхность рабочего электрода и последующего высушивания при температуре 4°С в течение 1 часа. Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена путем нанесения капли мембранообразующей смеси, содержащей γ-аминопропилтриэтоксисилан с концентрацией 0,1-3,0 _об. % (фиг. 4), ЛОД - 1,0 мг/мл и воду - 10 _об. % в изопропиловом спирте, на поверхность рабочего электрода и последующего высушивания при температуре 4°С в течение 1 часа.For the joint determination of glucose and lactate, a biosensor based on a four-electrode printing system (NPV) is used (Fig. 1). NPV is made by screen printing on a plastic basis from polyethylene terephthalate (PET). The manufacture of a printing system includes several stages: a layer of silver-containing paste is used on the plastic substrate, which serves as conductive contacts, as well as the material of the reference electrode; then a layer of carbon paste is applied, which serves as the material of the auxiliary and working electrodes, then a layer of a photocured insulator is applied that separates the working electrodes from the reference electrode and the auxiliary electrode, and at the last stage, a layer of thermoset insulator is used to close the conductive contacts from contact with the solution in the cell. A method of manufacturing a biosensor sensor coating involves chemical modification of the surface of the working electrodes with a BL film followed by immobilization of enzymes (YEAR or LOD) into a polymer membrane on the surface of the modified electrode. The polymer membrane consists of PPS with the enzyme included in it - the YEAR for the sensor coating for glucose determination or from siloxane obtained by polymerization of γ-aminopropyltriethoxysilane, with the enzyme included in it - LOD for the sensor coating for lactate determination. The principle of operation of the sensor coating is based on the selective electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide released during the reaction catalyzed by the enzyme (YEAR or LOD) on the surface of an electrode coated with BL film (Fig. 2). The membrane containing the enzyme - YEAR, obtained by applying a drop of a membrane-forming mixture containing PPS with a concentration of 0.1-1.5 _vol. % (Fig. 3), YEAR - 1.5 mg / ml and water - 15 _vol. % in isopropyl alcohol, on the surface of the working electrode and subsequent drying at a temperature of 4 ° C for 1 hour. The membrane containing the enzyme - LOD, obtained by applying a drop of a membrane-forming mixture containing γ-aminopropyltriethoxysilane with a concentration of 0.1-3.0 _vol. % (Fig. 4), LOD - 1.0 mg / ml and water - 10 _vol. % in isopropyl alcohol, on the surface of the working electrode and subsequent drying at a temperature of 4 ° C for 1 hour.

Биосенсор встроен в тонкослойную ячейку (ТЯ), вырезанную в измерительном блоке и ограниченную резиновым кольцом для обеспечения герметичности (фиг. 5). Через всю длину ТЯ проходит протяженный капилляр таким образом, что поток жидкости протекает через все 4 электрода биосенсора. ТЯ при помощи системы тонких шлангов соединяется с насосом, обеспечивающим постоянный поток фонового буферного раствора через систему. Непосредственно перед ячейкой в систему шлангов встроен шестиходовой инжектор для ввода пробы. Биосенсор посредством коннектора подсоединен к бипотенциостату, который используется для обеспечения постоянного потенциала и измерения тока в системе и имеет возможность передачи данных на персональный компьютер. Аналитический сигнал биосенсора регистрируется методом амперометрии при приложении потенциала 0 В (относительно хлорид-серебряного электрода сравнения, в дальнейшем - ХСЭ) по увеличению тока в присутствии аналита(ов) - глюкозы и лактата.The biosensor is embedded in a thin-layer cell (TJ) cut in the measuring unit and bounded by a rubber ring to ensure tightness (Fig. 5). An extended capillary passes through the entire length of the solid so that the fluid flows through all 4 electrodes of the biosensor. TH using a thin hose system is connected to a pump, providing a constant flow of background buffer solution through the system. Directly in front of the cell, a six-way injector for introducing the sample is built into the hose system. The biosensor is connected via a connector to a bipotentiostat, which is used to provide constant potential and measure current in the system and has the ability to transfer data to a personal computer. The analytical signal of the biosensor is recorded by amperometry at the application of a potential of 0 V (relative to the silver-silver reference electrode, hereinafter - CSE) to increase the current in the presence of analyte (s) - glucose and lactate.

Определение концентраций глюкозы и лактата осуществляется следующим образом:Determination of glucose and lactate concentrations is as follows:

- На первом этапе через электроаналитическую систему, включающую заявляемый измерительный блок на основе заявляемого биосенсора, пропускают фоновый буферный раствор (50 мМ КН₂РО₄/К₂НРО₄, 0,1 М KCl, pH 6.0), одновременно измеряя ток на обоих рабочих электродах при потенциале 0 мВ относительно внутреннего хлорид-серебряного электрода сравнения. Данный этап заканчивается установлением постоянного фонового тока на обоих рабочих электродах.- At the first stage, a background buffer solution (50 mM KN ₂ PO ₄ / K ₂ NRA ₄ , 0.1 M KCl, pH 6.0) is passed through an electroanalytical system including the inventive measuring unit based on the inventive biosensor, while simultaneously measuring the current on both workers electrodes at a potential of 0 mV relative to the internal silver chloride reference electrode. This stage ends with the establishment of a constant background current on both working electrodes.

- На втором этапе в петлю инжектора (в закрытом положении) вводится анализируемый раствор (объем петли инжектора 50 мкл, объем образца - 300 мкл, избыток образца выливается через слив петли). После этого инжектор устанавливают в открытое положение и часть введенного образца из петли (50 мкл) по системе шлангов поступает в тонкослойную ячейку. При этом бипотенциостат измеряет изменение катодного тока на рабочих электродах, выражающееся в появлении пиков на экспериментальных кривых зависимостей тока от времени. Высота пиков пропорциональна концентрации аналитов в исследуемом растворе. После измерения образец вымывается из ячейки фоновым буферным раствором через слив ячейки.- At the second stage, the analyzed solution is introduced into the injector loop (in the closed position) (injector loop volume is 50 μl, sample volume is 300 μl, excess sample is poured through the drain of the loop). After that, the injector is installed in the open position and part of the injected sample from the loop (50 μl) through a hose system enters a thin-layer cell. In this case, the bipotentiostat measures the change in the cathode current at the working electrodes, expressed in the appearance of peaks in the experimental curves of the current versus time. The height of the peaks is proportional to the concentration of analytes in the test solution. After measurement, the sample is washed out of the cell by the background buffer solution through the cell drain.

- Этапы 1 и 2 повторяют для ряда модельных растворов с концентрациями аналитов 1 мкМ - 1 мМ. Каждую концентрацию необходимо определить, по меньшей мере, три раза. По результатам измерений строится градуировочная зависимость. Далее в качестве анализируемого раствора используют образцы крови (разбавленные фоновым буферным раствором в 100 раз). Концентрацию глюкозы и лактата в образцах крови находят по построенной ранее градуировочной зависимости. После проведения 100 измерений разбавленных образцов крови построение градуировочной зависимости требуется повторить.- Steps 1 and 2 are repeated for a number of model solutions with analyte concentrations of 1 μM - 1 mm. Each concentration must be determined at least three times. Based on the measurement results, a calibration dependence is constructed. Further, blood samples are used as the analyzed solution (diluted 100 times with the background buffer solution). The concentration of glucose and lactate in blood samples is found from the calibration curve constructed earlier. After 100 measurements of diluted blood samples are taken, the construction of the calibration dependence needs to be repeated.

Сенсорные материалы, биосенсор на их основе, измерительный блок и электроаналитическая система позволяют селективно различать сигнал, обусловленный присутствием аналитов (глюкозы и лактата) в образце крови на фоне всех прочих компонентов образца. Коэффициент чувствительности биосенсора составляет более 20 мА⋅М^-1⋅см^-2 при определении глюкозы и более 85 мА⋅M^-1⋅см^-2 - для лактата; ДОС - от 5 до 1000 мкМ при определении глюкозы и от 1 до 500 мкМ - для лактата (фиг. 6). Электроаналитическая система обладает высокой воспроизводимостью (систематическая погрешность не превышает 3%), операционной стабильностью (свыше 600 измерений без необходимости перекалибровки при определении концентрации глюкозы и свыше 100 - при определении лактата) и может работать при скоростях потока фонового буферного раствора от 0,25 до 1,75 мл/мин (фиг. 7). ДОК биосенсора полностью перекрывает диапазон физиологических концентраций глюкозы и лактата в крови как в норме, так и в патологии или при интенсивной физической нагрузке. Объем пробы крови, необходимый для измерений, составляет всего 10 мкл, что в 2 раза меньше, чем для аналогов. Время анализа для биосенсора не превышает одной минуты.Sensor materials, a biosensor based on them, a measuring unit and an electroanalytical system make it possible to selectively distinguish the signal due to the presence of analytes (glucose and lactate) in the blood sample against the background of all other components of the sample. The biosensor sensitivity coefficient is more than 20 mA⋅M ^-1 ⋅ cm ^-2 in the determination of glucose and more than 85 mA⋅M ^-1 ⋅ cm ^-2 for lactate; DOS - from 5 to 1000 μM in the determination of glucose and from 1 to 500 μM for lactate (Fig. 6). The electroanalytical system has high reproducibility (systematic error does not exceed 3%), operational stability (over 600 measurements without the need for recalibration when determining glucose concentration and over 100 when determining lactate) and can work at background buffer flow rates from 0.25 to 1 75 ml / min (Fig. 7). The biosensor PKD completely covers the range of physiological concentrations of glucose and lactate in the blood, both in normal and pathological conditions or during intense physical exertion. The blood sample volume required for measurements is only 10 μl, which is 2 times less than for analogues. The analysis time for the biosensor does not exceed one minute.

В тонкослойной ячейке размещены одновременно 2 рабочих электрода (с мембраной, содержащей ГОД и с мембраной, содержащей ЛОД). Особенностью тонкослойной ячейки, однако, является экспонирование рабочего электрода с мембраной, содержащей один фермент, расположенного ниже по течению, пероксидом водорода от «верхнего» рабочего электрода с мембраной, содержащей второй фермент. Так как рабочие электроды в ячейке расположены последовательно друг за другом, поток фонового буферного раствора направлен от одного электрода ко второму. Расположение рабочих электродов, при котором первый рабочий электрод располагается перед вторым по направлению потока, мы будем называть прямым, а расположение, при котором первый рабочий электрод расположен после второго - обратным.In a thin-layer cell, 2 working electrodes are simultaneously placed (with a membrane containing a YEAR and with a membrane containing a LOD). A feature of a thin-layer cell, however, is the exposure of a working electrode with a membrane containing one enzyme located downstream with hydrogen peroxide from the “upper” working electrode with a membrane containing a second enzyme. Since the working electrodes in the cell are arranged sequentially one after another, the background buffer solution flow is directed from one electrode to the second. The location of the working electrodes, in which the first working electrode is located in front of the second in the direction of flow, we will call direct, and the location in which the first working electrode is located after the second - the reverse.

Исследовано взаимное влияние лактата и глюкозы на отклики рабочих электродов с мембранами, содержащими фермент, при совместном определении глюкозы и лактата в одной ТЯ. Для этого готовили модельные растворы, содержащие смесь эквимолярных концентраций глюкозы и лактата, а также модельные растворы индивидуальных аналитов. Отклики рабочего электрода с мембраной, содержащей фермент, на целевой аналит сравнивали с его откликами на раствор аналита, содержащий также эквимолярную концентрацию мешающего аналита.The mutual influence of lactate and glucose on the responses of working electrodes with membranes containing the enzyme was studied in the joint determination of glucose and lactate in one TN. For this, model solutions were prepared containing a mixture of equimolar glucose and lactate concentrations, as well as model solutions of individual analytes. The responses of the working electrode with the membrane containing the enzyme to the target analyte were compared with its responses to the analyte solution, which also contained the equimolar concentration of the interfering analyte.

Заметное мешающее влияние наблюдается только для рабочего электрода с мембраной, содержащей ГОД, в обратном потоке, т.к. выделяющийся при этом на втором рабочем электроде в ферментативной реакции, катализируемой ЛОД, пероксид водорода вызывает дополнительный мешающий отклик (фиг. 8).A noticeable interfering effect is observed only for the working electrode with the membrane containing the YEAR in the reverse flow, because released at the same time on the second working electrode in the enzymatic reaction catalyzed by LOD, hydrogen peroxide causes an additional interfering response (Fig. 8).

В прямом потоке данный эффект не наблюдается (фиг. 9). Глюкоза не оказывает мешающего влияния на определение лактата независимо от направления потока фонового буферного раствора (фиг. 10, 11). Таким образом, расположение рабочего электрода с мембраной, содержащей ГОД, перед рабочим электродом с мембраной, содержащей ЛОД, в потоке фонового буферного раствора позволяет избежать мешающего влияния аналитов при их совместном определении.In a direct flow, this effect is not observed (Fig. 9). Glucose does not interfere with the determination of lactate, regardless of the direction of flow of the background buffer solution (Fig. 10, 11). Thus, the location of the working electrode with the membrane containing the YEAR, in front of the working electrode with the membrane containing the LOD, in the background buffer solution flow avoids the interfering influence of analytes in their joint determination.

Пример 1. Проведена проверка правильности работы биосенсора путем анализа стандартизованных образцов сыворотки крови с известной концентрацией аналитов с нормальным и патологическим их содержанием.Example 1. The biosensor was checked for correctness by analyzing standardized blood serum samples with a known concentration of analytes with their normal and pathological content.

После измерения серии откликов на образцы проводили измерение отклика на модельные растворы аналитов, при этом изменения откликов на модельные растворы после измерения образцов замечено не было. Данные по определенным концентрациям глюкозы и лактата представлены в табл. 1. Они не отличались от данных, представленных в паспорте образцов. Таким образом, разработанный мультибиосенсор может быть использован для анализа образцов разбавленной крови.After measuring a series of responses to samples, we measured the response to model analyte solutions, and there was no change in the responses to model solutions after measuring the samples. Data on specific concentrations of glucose and lactate are presented in table. 1. They did not differ from the data presented in the passport of samples. Thus, the developed multibiosensor can be used to analyze diluted blood samples.

Пример 2. При помощи биосенсора определена концентрация глюкозы и лактата в разбавленных образцах крови доноров (табл. 2). Процедура пробоподготовки сводилась к разбавлению образцов крови в 100 раз фоновым буферным раствором.Example 2. Using a biosensor, the concentration of glucose and lactate in diluted blood samples of donors was determined (Table 2). The sample preparation procedure was reduced to diluting blood samples 100 times with a background buffer solution.

Полученные результаты находятся в пределах нормы. Таким образом, технический результат заявляемого изобретения заключающийся в повышении чувствительности анализа и обеспечении возможности определения глюкозы и лактата с исключением их взаимного влияния при одновременном определении, достигается. В частности, коэффициент чувствительности увеличен относительно прототипа в 40 и в 50 раз для глюкозы и лактата, соответственно. Кроме того, достигается повышение точности анализа крови с использованием заявляемого биосенсора в составе электроаналитической системы, за счет исключения систематической погрешности, которая, как правило, присутствует при измерении известными анализаторами.The results are within normal limits. Thus, the technical result of the claimed invention is to increase the sensitivity of the analysis and provide the ability to determine glucose and lactate with the exception of their mutual influence while determining, is achieved. In particular, the sensitivity coefficient is increased relative to the prototype by 40 and 50 times for glucose and lactate, respectively. In addition, an increase in the accuracy of a blood test using the inventive biosensor in the electroanalytical system is achieved by eliminating the systematic error, which, as a rule, is present when measured by known analyzers.

Claims

1. A planar biosensor for determining glucose and lactate in a liquid sample, characterized in that it includes a silver chloride reference electrode placed on the substrate, two working electrodes and an auxiliary electrode located between the working electrodes, and a film of Berlin blue is applied to one of the working electrodes and a membrane containing the enzyme glucose oxidase, and a film of Prussian blue is applied to the second working electrode and a membrane containing the enzyme glucose oxidase, the reference electrode is located at the same distance from the working electrodes with the possibility of setting a constant zero potential at the working electrodes, and the auxiliary electrode has an area exceeding the total area of the working electrodes, while all the electrodes are made with the possibility of connecting to the potentiostat, and the electrode with the membrane containing glucose oxidase is located in front of the electrode with a membrane containing lactic oxidase, in the direction of movement of the liquid sample.

2. The biosensor according to claim 1, characterized in that the film of Prussian blue has a polycrystalline structure, is made of a thickness of 60-80 nm, and covers the surface of the working electrode with a continuous uniform layer.

3. The biosensor according to claim 1, characterized in that the membrane containing the enzyme - lactic oxidase, obtained from a membrane-forming mixture with a concentration of γ-aminopropyltriethoxysilane 0.1-3 _vol .%, Lactic oxidase - 1 mg / ml and water - 10 _vol .% in isopropyl alcohol, and the membrane containing the enzyme glucose oxidase was obtained from a membrane-forming mixture with a concentration of perfluorosulfonated polymer of 0.1-1.5 _vol .%, glucose oxidase - 1.5 mg / ml and water - 15 _vol .% in isopropyl alcohol.

4. The biosensor according to claim 1, characterized in that the working electrodes are made with a diameter of 0.8-1 mm.

5. The biosensor according to claim 1, characterized in that the working electrodes are located at a distance from the reference electrode of not more than 2 mm.

6. The biosensor according to claim 1, characterized in that it is made by screen printing.

7. The biosensor according to claim 1, characterized in that the reference electrode is made extended from one working electrode to another, with a width of at least 0.5 mm.

8. The biosensor according to claim 1, characterized in that it has a thickness of 0.22-0.35 mm

9. A unit for measuring glucose and / or lactate in a solution, characterized in that it includes lower and upper parts hermetically connected to each other, between which a biosensor made according to claim 1 is fixed, while a thin layer is formed between the biosensor and the upper part of the measuring unit a volume cell with a thickness of less than 0.3 mm, having an oval base with a thickening along the long diameter of the oval in the form of an extended capillary with a width of less than 1 mm and a thickness of less than 0.3 mm passing through all the biosensor electrodes, while the capillary p has an input located on the side of the working electrode with a membrane containing glucose oxidase, and output on the side of the working electrode with a membrane containing lactic oxidase, while the input and output are connected to the channels for supplying and discharging a liquid sample or background buffer solution.

10. The block according to claim 9, characterized in that the thin-layer cell is provided with a sealing element around the perimeter, which provides sealing of the biosensor.