RU2694719C1 - Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals - Google Patents
Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694719C1 RU2694719C1 RU2018134797A RU2018134797A RU2694719C1 RU 2694719 C1 RU2694719 C1 RU 2694719C1 RU 2018134797 A RU2018134797 A RU 2018134797A RU 2018134797 A RU2018134797 A RU 2018134797A RU 2694719 C1 RU2694719 C1 RU 2694719C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- control sample
- schmallenberg
- mixture
- virus
- internal control
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000660220 Schmallenberg virus Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 1
- 241000589874 Campylobacter fetus Species 0.000 description 1
- 241000134426 Ceratopogonidae Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000047479 Escherichia virus MS2 Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 1
- 241001493158 Simbu orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- -1 internal control Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010494 opalescence Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики вирусных и инфекционных заболеваний у животных, в частности к наборам для выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у животных.The invention relates to veterinary Virology, and in particular to means of diagnosing viral and infectious diseases in animals, in particular to kits for detecting RNA of Schmallenberg disease in animals.
Известен набор для выявления инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2460803, C12Q 1/68, 2014 г.), с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя вируса инфекции и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образецKnown kit for the detection of infections by multiplex PCR with detection in real time (RF patent №2460803,
Наиболее близким по технической сущности является тест-система для выявления РНК вируса болезни Шмалленберга, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя вируса болезни Шмалленберга и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец (патент РФ №2515916, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип).The closest in technical essence is a test system for detecting RNA of the Schmallenberg disease virus, including a buffer for carrying out a polymerase chain reaction, a mixture for carrying it out consisting of deoxynucleoside triphosphates, primers and fluorescent probes specific for the pathogen of Schmallenberg disease and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies inhibiting the activity of the enzyme, TAQ POLYMERASE; RNA dilution buffer, internal control sample, negative control sample, positive control sample (RF patent №2515916,
Недостатком прототипа является недостаточная специфичность и чувствительность, олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, что влияет на точность диагностики.The disadvantage of the prototype is the lack of specificity and sensitivity, oligonucleotide primers, fluorescently-labeled probe and control samples, which affects the accuracy of diagnosis.
Техническим результатом является повышение точности диагностики.The technical result is to increase the accuracy of diagnosis.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных, включающем буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя вируса болезни Шмалленберга и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE; буфер для разведения РНК, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса Шмалленберга и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is achieved by the fact that in a test system for detecting the RNA of the Schmallenberg disease virus in farm animals, including a buffer for carrying out the polymerase chain reaction, a mixture for carrying it out consisting of deoxynucleoside triphosphates, primers and fluorescent probes specific for the causative agent of the Schmallenberg disease virus and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies inhibiting the activity of the enzyme, TAQ POLYMERASE; RNA dilution buffer, internal control sample, negative control sample, positive control sample according to the invention for the internal control sample, use bacteriophage MS2 suspension with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl, and a mixture of recombinant plasmid DNA is used for the positive control sample containing the fragment of the Schmallenberg virus pathogen genome and the fragment of the bacteriophage MS2 genome taken in a 1: 1 ratio with the following nucleotide sequences atelnostyami:
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики вируса болезни Шмалленберга используют набор, обеспечивающий возможность проведения последовательно двух реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома артериита олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.The novelty of the proposed technical solution lies in the fact that in order to obtain a reliable diagnosis of the Schmallenberg disease virus, a set is used that enables the successive two reactions: reverse transcription of viral RNA to obtain cDNA and polymerase chain reaction to amplify a fragment of the obtained cDNA template. Both reactions are carried out sequentially in the same PCR tube (one-tube) using oligonucleotide primers, specific for the arteritis genome region, a fluorescently-labeled probe and different types of controls for which different forms of the MS2 bacteriophage material are used: suspension and genome fragment with primers specific to it and probe. Such a real-time RT-PCR formulation reduces and simplifies the analysis procedure, reduces the risk of contamination and the possibility of error when transferring cDNA to another tube for PCR. In addition, the detection of amplification products is carried out using the principle of splitting the fluorescent label at the 5 'end of the oligonucleotide probe.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».Signs that distinguish the claimed technical solution from the prototype, aimed at achieving a technical result and not identified in the study of this and related areas of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики возбудителя вируса болезни Шмалленберга, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive method is recommended to use in veterinary virology, namely, to the means of diagnostics of the pathogen of Schmallenberg virus, which meets the criterion of "industrial applicability".
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены скриншоты графиков и таблицы, на рис. 1 - представлен канал Cy5/Red - для тестирования сигнала внутреннего контрольного образца (ВКО), на рис. 2 представлен канал JOE/Yellow для специфического сигнала возбудителя вируса Шмалленберга; на рис. 3 - таблица количественных данных для Cycling А. A.Yellow (вирус Шмалленберга) и A.Red (ВКО).The invention is illustrated in the drawing, which presents screenshots of graphs and tables in Fig. 1 - Cy5 / Red channel is presented - for testing the signal of the internal control sample (ASD), in fig. 2 shows the JOE / Yellow channel for a specific signal of the Schmallenberg virus pathogen; in fig. 3 - a table of quantitative data for Cycling A. A.Yellow (Schmallenberg virus) and A.Red (CTP).
Пример конкретного использования тест-систему выявления ДНК возбудителя вируса болезни Шмалленберга сельскохозяйственных животных.An example of a specific use of a test system for detecting the DNA of the pathogen of Schmallenberg's disease of farm animals.
Для исследования с целью выделения РНК используют биологический материал животных по выбору: цельная кровь, сыворотка крови, фрагменты тканей и органов взятые от животных инфицированных возбудителем вируса болезни Шмалленберга. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса болезни Шмалленберга и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:For research to isolate RNA, biological material of animals of choice is used: whole blood, serum, tissue fragments and organs taken from animals infected with the pathogen of the Schmallenberg disease virus. For the internal control sample, bacteriophage MS2 suspension with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl is used, and for a positive control sample, a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the Schmallenberg virus pathogen genome and a fragment of the bacteriophage MS2 genome taken in a 1: 1 ratio is used , with the following nucleotide sequences:
Затем измеряют накопление флуоресцентного сигнала по каналам: JOE/ Yellow для специфического сигнала возбудителя вируса Шмалленберга; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.Then the fluorescent signal accumulation is measured by channels: JOE / Yellow for a specific signal of the Schmallenberg virus pathogen; Cy5 / Red for the internal control signal, if the fluorescent signal accumulation curves go up to 35 cycles, then the result of the reaction is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after 35 cycles, the result of the reaction is negative.
Вирус болезни Шмалленберг является представителем семейства буньявирусы (Bunyaviridae), рода ортобуньявирусы (Orthobunyavirus), серогруппы Симбу (Simbu serogroup). Вирус состоит из трех сегментов, называемых S (короткая), М (средняя) и L (длинная) и передается через кровососущих насекомых. Праймеры комплементарны консервативной области гена нуклеокапсидного белка N вируса болезни Шмалленберг (Schmallenberg virus N, NSs genes for nucleocapsid protein, non-structural protein, complete cds, strain: 167/Wiltshire/2012, код доступа LC3 09157.1, участок между 360 и 446) и не комплементарны каким-либо участкам геномов других вирусов. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Shm-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Shm-F и Shm-R). Зонд был помечен красителем HEX. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1 Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.The Schmallenberg disease virus is a member of the Bunyavirus family (Bunyaviridae), the genus Orthobunvirus (Orthobunyavirus), the Simboo serogroup (Simbu serogroup). The virus consists of three segments, called S (short), M (medium) and L (long), and is transmitted through blood-sicking insects. The primers are complementary to the conserved region of the Schmallenberg disease N nucleocapsid protein N gene (Schmallenberg virus N, NSs genes for nucleocapsid protein, cds, strain: 167 / Wiltshire / 2012, access code LC3 09157.1, region between 360 and 446) and not complementary to any parts of the genomes of other viruses. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and examined using BLAST to confirm their specificity. For the detection of amplification products, an oligonucleotide fluorescently-labeled Shm-Z probe was selected (complementary to the region of the nucleotide sequence bounded by the annealing positions of the Shm-F and Shm-R primers). The probe was labeled with the dye HEX. To quench the spontaneous fluorescence, a BHQ-1 quencher is attached to the 3'-end of the oligonucleotide probe. Using the program "Oligo 6.0", the main properties of the calculated oligonucleotides are described, which determine the possibility of their use in PCR.
С помощью программы «Oligo 6.0» проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка "созревания" (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентномеченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу «Oligo 6.0» описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.Using the Oligo 6.0 program, the nucleotide sequence of the bacteriophage MS2 was analyzed (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). The bacteriophage MS2 contains a single-stranded, positively oriented RNA with a size of 3569 bases. As a result of analysis of the maturation protein inside the gene (maturation protein), a region between 200 and 350 nucleotides was selected, containing unique nucleotide sequences, and primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected region of the genome were calculated. For the detection of amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled MS2P probe was selected that is complementary to the region of the nucleotide sequence bounded by the annealing positions of the MS2F and MS2R primers. Using the program "Oligo 6.0" describes the main properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Для исследования используют следующий материал:For research use the following material:
- Цельную кровь забирают в пробирку с ЭДТА, желательно использовать одноразовые системы взятия крови. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.- Whole blood is taken into the tube with EDTA, it is desirable to use disposable blood collection systems. Turn the closed test tube with blood several times.
- Сыворотку крови для ее получения берут 5 мл крови в пробирку без антикоагулянта. Желательно использовать одноразовые системы взятия крови.- Serum to get it take 5 ml of blood in a tube without anticoagulant. It is advisable to use disposable blood collection systems.
- Фрагменты тканей и органов павших животных (головной мозг, спинной мозг, плацента, пуповина), отбирают в стерильный контейнер.- Fragments of tissues and organs of dead animals (brain, spinal cord, placenta, umbilical cord), selected in a sterile container.
- Околоплодную жидкость новорожденных животных с пороками развития и мертворожденных плодов, берут в объеме не менее 1 мл в стерильные пробирки.- Amniotic fluid of newborn animals with malformations and stillborn fetuses, taken in a volume of at least 1 ml in sterile tubes.
- Кровососущие насекомые, переносчики вируса (комары, мокрецы), отбирают не менее 20 особей в контейнер.- Blood-sucking insects, carriers of the virus (mosquitoes, biting midges), take at least 20 individuals into a container.
Исследуемые образцы подготавливают следующим образом.The samples are prepared as follows.
Пробы цельной крови с ЭДТА, сыворотки крови, околоплодной жидкости используют без предварительной подготовки. Для экстракции РНК используют 50 мкл цельной крови, околоплодной жидкости или 100 мкл сыворотки.Whole blood samples with EDTA, serum, amniotic fluid are used without prior preparation. For the extraction of RNA use 50 μl of whole blood, amniotic fluid or 100 μl of serum.
Из тканей и органов вырезают небольшие кусочки до 1 г весом. Растирают в отдельных фарфоровых ступках, добавляют по 5-10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 3 мин, после чего переносят 50 мкл верхней фазы в пробирки типа «Эппендорф» и используют для экстракции РНК.From the tissues and organs cut out small pieces up to 1 g in weight. Pound in separate porcelain mortars, add 5-10 ml of sterile saline and mix thoroughly. The mixture is settled at room temperature for 3 minutes, after which 50 μl of the upper phase are transferred to Eppendorf tubes and used for the extraction of RNA.
Пробу комаров (используют 20-40 особей) растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков Полученные суспензии центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 1 мин. Для экстракции РНК используют 100 мкл надосадочной жидкости.A sample of mosquitoes (20-40 individuals are used) is ground in 1 ml of sterile saline using sterile porcelain mortars and pestles. The resulting suspensions are centrifuged at 12 thousand rpm for 1 minute. For the extraction of RNA using 100 μl of the supernatant.
Далее проводят анализ с помощью набора реагентов «ПЦР-ШМАЛЛЕНБЕРГ-ФАКТОР»Next, perform the analysis using a set of reagents "PCR-SHMALLBERG-FACTOR"
Набор состоит из комплектов 1 и 2 реагентов для проведения обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР РВ и контрольных образцов. Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ШМАЛЛЕНБЕРГ-ФАКТОР» для выявления РНК вируса Шмалленберга в биологическом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ) ТУ 21.10.60-122-51062356-2016 (для диагностики in vitro) http://www.vetfaktor.ru/.The kit consists of
Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.The composition of the kit is given in Tables 1 and 2.
Анализ состоит из трех этапов:The analysis consists of three stages:
- экстракция (нуклеиновых кислот) НК;- extraction of (nucleic acids) NK;
- проведение ОТ-ПЦР РВ;- carrying out RT-PCR RV;
- учет результатов анализа.- accounting of the results of the analysis.
Реакция ОТ-ПЦР РВ проводится в одной пробирке.The RT-PCR RT reaction is carried out in one tube.
* Возможна легкая опалесценция* Light opalescence is possible.
Экстракция (выделение) НК из клинического материалаExtraction (isolation) of NK from clinical material
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), внутренний контрольный образец (ВКО SHMAL) по 10 мкл.Select the required number of 1.5 ml disposable tubes, including the negative control selection. Bring in all test tubes, including a test tube for a negative control sample (EYE), the internal control sample (CKO SHMAL) 10 μl.
Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначают как ВК-).Bring the test samples in volume according to the instructions for the kit for isolating NK, in the test tube of the negative control of the release, instead of the test sample, make a CEF (test tube is designated as BK-).
Выделять НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.Highlight NK from the analyzed and control samples according to the protocol of the manufacturer's instructions for the NK selection.
Выделенную РНК можно хранить до 3 часов при температуре от 2°C до 8°C или в течение месяца при температуре не выше минус 68°C.The isolated RNA can be stored up to 3 hours at a temperature from 2 ° C to 8 ° C or for a month at a temperature not higher than minus 68 ° C.
Подготовка образцов к проведению ОТ-ПЦР РВSample preparation for RT-PCR RT
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the RNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО SCHMAL), ВКО SCHMAL и РНК буфера.Successful completion of the reaction is monitored using a positive control sample (SCHMAL FFP), CCH SCHMAL and RNA buffer.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate test tube, the components of the kit are mixed based on each reaction:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ SCHMAL5 μl PCR MIXTURE SCHMAL
10 мкл ПЦР БУФЕР SCHMAL10 μl PCR SCHMAL BUFFER
0,75 мкл RT PCR ENZ0.75 μl RT PCR ENZ
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. Затем вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси, используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки:Stir the mixture on the vortex and drop the drops by brief centrifugation. Select the required number of tubes for the amplification of NK of the studied and control samples. Then make 15 μl of the prepared reaction mixture, using tips with a filter in the prepared tubes:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;a) in a test tube of negative control PCR (K-) 10 μl of RNA buffer;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы, (включая пробу ВК-);b) in a series of test tubes for the studied samples - in each, make 10 μl of NC of the corresponding sample (including the VK-test);
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР
Проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекциейConducting RT-PCR RV with fluorescence detection
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q», представлены в таблице 3.The parameters of temperature-time amplification on the device "Rotor-Gene Q" are presented in table 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и запрограммировать прибор, согласно инструкции производителя. Учет результатов анализаPlace the test tubes prepared for PCR into the cells of the amplifier and program the instrument according to the manufacturer's instructions. Accounting of the analysis results
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The data obtained - the accumulation curves of the fluorescent signal are analyzed using the software used by the instrument for carrying out PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the instrument.
Учет результатов ОТ-ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового никла «Ct» для исследуемого образца).Recording of RT-PCR RT results is performed by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at an appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold value of the Ct nickle for the sample under study).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4 и рис. 1, 2, 3.The result is considered reliable if the positive and negative controls of amplification and extraction of NC are correctly passed in accordance with Table 4 and Figure. 1, 2, 3.
Появление любого значения Ct (см. таблице 4, рис. 1,2) результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE (HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ОТ-ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа но всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value (see table 4, fig. 1,2) of the results for the negative control of the VK-extraction stage on the JOE (HEX) / Yellow channel and for the negative control of the RT-PCR stage K-on any of the channels indicates the presence of contamination reagents or samples. In this case, the results of the analysis but all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as to take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу JOE (HEX)/Yellow значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР (таблица 4. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР РВ. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.Samples for which the Ct value is missing for the Cy5 / Red channel or exceeds the 35th cycle (the Ct value for the JOE (HEX) / Yellow channel is also absent) requires that the test be repeated from the PCR stage (Table 4. Delay in threshold cycle values for the studied samples on channel Cy5 / Red indicates the presence of inhibitors in samples or errors in the formulation of the RT-PCR RT reaction. A study is required from the NC extraction stage.
Образец считается положительным (РНК вируса Шмалленберга обнаружена) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow, при э том значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4, рис. 2, 3). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/ Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow > 37), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.A sample is considered positive (Schmallenberg virus RNA is detected) if the signal is observed to increase exponentially on the JOE (HEX) / Yellow channel, with this Ct value of control samples are within the normal range (Table 4, Fig. 2, 3). If for the sample under study on the JOE (HEX) / Yellow channel, the Ct value is determined later than the 37th cycle with the correct passing of positive and negative controls, it is considered controversial and is re-examined from the NC extraction stage. If during re-staging a similar result is observed (Ct on the JOE (HEX) / Yellow channel> 37), re-taking of material from the same animal is required to conduct a PCR study and (or) the use of alternative diagnostic methods.
Для оценки специфичности предлагаемых внутреннего и положительного контрольных образцов для метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ) для выявления РНК вируса Шмалленберга в биологическом материале исследовали препараты РНК, выделенной из образцов, содержащих гетерологичные вирусы и кровь от интактных животных.To assess the specificity of the proposed internal and positive control samples for the method of reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) with fluorescent detection in real time (RT PCR RT) to detect Schmallenberg virus RNA in biological material, RNA preparations isolated from samples containing heterologous viruses and blood from intact animals.
Показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении НК следующих вирусов и микроорганизмов: Bovine coronavirus, Bovine leukemia virus, Bovine respiratory syncytial virus, Bovine viral diarrhoea virus, Rotavirus, Brucella abortus, Pasteurella multocida, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium paratuberculosis, Escherichia coli, Campylobacter fetus, Clostridium perfringens, Salmonella dublin, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis. Также показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении образцов ДНК КРС, овец, свиньи, курицы, человека, а также комаров рода Culex.The absence of non-specific reactions of the components of the kit in relation to NK of the following viruses and microorganisms is shown: Bovine coronavirus, Bovine leukemia virus, Bovine viral diarrhoea virus, Bovine viral diarrhoea virus, Rotavirus, Brucella abortus, Pasteurella multocida, Leptospira interrogans, Brycella abortus, Pasteurella multocida, Leptospira interrogans, Brycela abortus, Pasteurella multocida , Escherichia coli, Campylobacter fetus, Clostridium perfringens, Salmonella dublin, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis. It also shows the absence of non-specific reactions of the components of the kit in respect of DNA samples of cattle, sheep, pigs, chickens, humans, as well as mosquitoes of the genus Culex.
Для оценки чувствительности предлагаемого способа проводили постановку реакции с использованием в качестве матрицы титрованного препарата транкрипта, полученного на рекомбинантной плазмиде, содержащей ограниченный праймерами ShmF и ShmR фрагмент генома вируса болезни Шмалленберг. Чувствительность системы составила 105 г-экв/мл.To assess the sensitivity of the proposed method, a reaction was set up using a titrated preparation of a transcript obtained on a recombinant plasmid containing a fragment of the Schmallenberg virus genome limited by ShmF primers and ShmR as a matrix. The sensitivity of the system was 10 5 g-eq / ml.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134797A RU2694719C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134797A RU2694719C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694719C1 true RU2694719C1 (en) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134797A RU2694719C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694719C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
| RU2515916C2 (en) * | 2012-06-13 | 2014-05-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Test system for detecting rna of schmallenberg virus and method for recognising schmallenberg virus genome |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134797A patent/RU2694719C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
| RU2515916C2 (en) * | 2012-06-13 | 2014-05-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Test system for detecting rna of schmallenberg virus and method for recognising schmallenberg virus genome |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (en) | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals | |
| RU2694713C1 (en) | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
| RU2694558C1 (en) | Method for genome detection of coronavirus infection causative agent in cattle | |
| RU2703401C1 (en) | Test system for detecting and genotyping rna of swine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| RU2703394C1 (en) | Method for detecting and genotyping rna of porcine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| RU2694719C1 (en) | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2696306C1 (en) | Method for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2698662C1 (en) | Test system for detecting rna of agent of arteritis virus in horses | |
| RU2689718C1 (en) | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals | |
| RU2694501C1 (en) | Test system for genome detection of rotavirus agent of type a in agricultural animals by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2700481C1 (en) | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses | |
| RU2703400C1 (en) | Method for detecting a genome of a brucella infection agent (brucella speciales) in farm animals | |
| RU2694499C1 (en) | Test system for detecting coronavirus infection pathogen genome in cattle by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2700254C1 (en) | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
| RU2719719C1 (en) | Method for detection of dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in animal biological material by means of polymerase chain reaction in real time | |
| RU2700448C1 (en) | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds | |
| RU2814556C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of moraxellosis kpc (moraxella bovis) in biological material of animals and feed using polymerase chain reaction in real time | |
| RU2700450C1 (en) | Test system for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv) | |
| RU2700449C1 (en) | Method for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
| RU2700247C1 (en) | Test system for detecting salmonella (salmonella spp.) dna in animal biological material, food products and animal and vegetable fodders | |
| RU2785381C1 (en) | Test system for identifying the dna of a cryptosporidiosis pathogen in biological material of animals and in feeds using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2700245C1 (en) | Method for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv) | |
| RU2700456C1 (en) | Method for detecting dna of avnithosis agent (chlamydophila psittaci) in birds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |