RU2689328C1 - Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes - Google Patents
Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2689328C1 RU2689328C1 RU2017142482A RU2017142482A RU2689328C1 RU 2689328 C1 RU2689328 C1 RU 2689328C1 RU 2017142482 A RU2017142482 A RU 2017142482A RU 2017142482 A RU2017142482 A RU 2017142482A RU 2689328 C1 RU2689328 C1 RU 2689328C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cryoprotector
- ccs
- optimal
- cytochemical
- leukocytes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 36
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 244000230712 Narcissus tazetta Species 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 11
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 11
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-2h-tetrazole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1N=NNN=1 ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- YOEWQQVKRJEPAE-UHFFFAOYSA-L succinylcholine chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(=O)CCC(=O)OCC[N+](C)(C)C YOEWQQVKRJEPAE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике методами цитохимической экспертизы сукцинатдегидрогеназы (СДГ)* (*Сукциндегидрогеназа - фермент класса оксидоредуктаз (выявляется в лейкоцитах в виде гранул синего цвета) катализирует одну из главных реакций цикла трикарбоновых к-т, является одной из составных частей системы, обеспечивающей в аэробных условиях трансмембранный перенос ионов Na+ в органах.), и может быть использовано для определения оптимального криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной** (** Криогемотрансфузии - трансфузии компонентов крови, смешанных с криопротекторами.) терапии и предупреждения посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Для осуществления способа у больного до начала трансфузионной терапии получают порцию венозной крови, делят на равные части в пробирки, в одной из которых контрольная проба крови (КП) не содержит криопротектора, в другие добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторорв - опытные пробы (ОП), капли ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, из них делают тонкие мазки, высушивают на воздухе, готовят препараты по методике Нахласа в модификации Р.П. Нарциссова*** (*** Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. М.: "Медицина", 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова. М.: "Медицина", 1987 г.), лейкоциты микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) сегментоядерных (с/я) нейтрофилов и лимфоцитов с гранулами синего цвета СДГ ОП и КП. О пригодности тестируемых криопротекторов к использованию (ПКИ) в планируемых криогемотрансфузиях судят по значениям СЦК ОП и СЦК КП. При равности значений СЦК ОП и СЦК КП тестируемый криопротектор оценивают как оптимальный для конкретного больного и пригодный к использованию (ПКИ); при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП, делают заключение как о непригодном к использованию (НКИ) криопротекторе. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике современного онкогематологического центра. Использование предложенного способа позволяет определить in vitro - оптимальный криопротектор на доклиническом этапе и исключить по жизненным показаниям инфузию непригодного для конкретного больного криопротектора. Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике методам цитохимической экспертизы СДГ, и может быть использовано для определения оптимального персонифицированного криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и предупреждения постгрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Уровень техники.The invention relates to medicine, in particular to laboratory diagnosis by methods of cytochemical examination of succinate dehydrogenase (LDH) * (* * Succin dehydrogenase is an enzyme of the class of oxidoreductases (detected in leukocytes in the form of blue granules) catalyzes one of the main reactions of the tricarboxylic cycle to-t, is one of the parts of the system providing transmembrane transport of Na + ions in organs under aerobic conditions.), and can be used to determine the optimal cryoprotectant at the preclinical stage of cryohemotransfusion ** (** Cryohemotransfusion - transfusion of blood components mixed with cryoprotectants.) Therapy and prevention of posttransfusion complications of cryoprotective genesis. For the implementation of the method in a patient, prior to the start of transfusion therapy, a portion of venous blood is obtained, divided into equal parts into test tubes, in one of which the control blood sample (CP) does not contain a cryoprotectant, and others are added one at a time to the same dose of the tested cryoprotector - experimental samples (OD) , drops of OP and KP are applied in a volume of 4 μl on glass slides, thin smears are made of them, dried in air, preparations are prepared according to the method of Nakhlas in the modification of R.P. Narcissova *** (*** Handbook of clinical laboratory research methods under the editorship of E.A. Kost. M .: Medicine, 1975; reference book "Laboratory research methods in the clinic" under the editorship of Prof. V.V. Menshikov. M .: "Medicine", 1987), microscopic leukocytes in transmitted light, conduct a comparative study of the average cytochemical coefficient (CCS) of segmented (c / i) neutrophils and lymphocytes with blue granules SDG OP and KP. The suitability of the tested cryoprotectants for use (PKI) in planned cryohemotransfusions is judged by the values of the CCS OP and the CCS KP. With equal values of the CCS OP and CCS KP, the tested cryoprotector is assessed as optimal for a particular patient and usable (CRP); when the values of the CCS OP, other than the CCS KP, make the conclusion as unsuitable for use (NCI) cryoprotector. The method is simple and available to the doctor for the clinical laboratory diagnosis of a modern hematology center. Using the proposed method allows to determine in vitro - the optimal cryoprotector at the preclinical stage and, for health reasons, exclude the infusion of a cryoprotectant unsuitable for a particular patient. The invention relates to medicine, in particular to laboratory diagnosis of cytochemical examination of SDH, and can be used to determine the optimal personalized cryoprotectant at the preclinical stage of cryo-transfusion therapy and prevent post-transfusion complications of cryoprotective genesis. The level of technology.
В современной клинической медицине посттрансфузионные реакции и осложнения рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, характеризующихся накоплением в тканях организма избытка токсических продуктов обмена веществ или клеточного реагирования, маркерами которых служат качественные и полуколичественные характеристики определенных цитохимических ферментативных реакций в лейкоцитах крови до и после смешивания с криопротекторами. Эти процессы могут развиваться как по типу яркой многосимптомной реакции, так и по варианту скрытно развивающихся симптомов посттрансфузионных осложнений (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я.- Киев: Наук. Думка, 1981. -176 с). Поэтому возникает проблема выявления ранних признаков вредного влияния токсичных криопротекторов на клеточном уровне и эффективного предупреждения посттрансфузионных осложнений протекторного генеза.In modern clinical medicine, posttransfusion reactions and complications are considered as one of the universal mechanisms of pathogenesis of various diseases characterized by accumulation in the body tissues of an excess of toxic metabolic products or cellular response, which are qualitative and semi-quantitative characteristics of certain cytochemical enzymatic reactions in blood leukocytes before and after mixing. with cryoprotectants. These processes can develop both according to the type of bright multi-symptom reaction, and according to the variant of secretly developing symptoms of post-transfusion complications (Cytochemistry of a frozen cell / Oboznaya EI, Pushkar NS, Markova OP, Pankov E.Ya.- Kiev : Science. Dumka, 1981. -176 c). Therefore, there is the problem of identifying early signs of the harmful effects of toxic cryoprotectants at the cellular level and effectively preventing the post-transfusion complications of protector origin.
Известные методы биологического и биохимического исследования сыворотки крови (определение концентрации молекул средней массы, продуктов перекисного окисления липидов, билирубина и т.д.) имеют ряд недостатков:The known methods of biological and biochemical studies of blood serum (determination of the concentration of molecules of average weight, products of lipid peroxidation, bilirubin, etc.) have several disadvantages:
- необходимость вводить криопротектор или гемоконсервант на его основе в периферическую вену больного, то есть производить инвазивную манипуляцию, которая может быть сопряжена с техническими трудностями, осложнениями технического характера или непереносимостью субъектом лекарственного препарата;- the need to introduce a cryoprotectant or hemoconservative on its basis into the peripheral vein of the patient, that is, to produce invasive manipulation, which may be fraught with technical difficulties, complications of a technical nature or intolerance by the subject of the medicinal product;
- необходимость использования лабораторных животных и специальной биохимической лаборатории, оснащенной сложным оборудованием и реактивами, что делает анализы не всегда доступными и дорогими как для лечебно-профилактических учреждений, так и для пациентов.- the need to use laboratory animals and a special biochemical laboratory equipped with sophisticated equipment and reagents, which makes tests not always available and expensive for both treatment-and-prophylactic institutions and patients.
Эти недостатки ограничивают количество и частоту необходимых исследований.These shortcomings limit the number and frequency of research needed.
На основании предложенных в литературе лабораторных модификаций для оценки полноценности ядерных клеток крови на этапах низкотемпературного консервирования и прогнозирования предполагаемых результатов криогемотрансфузионной терапии широко используются технологии качественной и полуколичественной оценки цитохимических показателей активаторов жизненно важных клеточных ферментов в периферической крови доноров или больных.Based on the laboratory modifications proposed in the literature, technologies for qualitative and semi-quantitative assessment of cytochemical indicators of activators of vital cellular enzymes in the peripheral blood of donors or patients are widely used at the stages of low-temperature preservation and prediction of the expected results of cryohemotransfusion therapy.
Известен метод цитохимического выявления СДГ для оценки в организме больного нормальных и патологических процессов (Углеводы и углеводный обмен: Материалы Второй Всесоюз. конф. по пробл. «Химия и обмен углеводов», 24-27 янв. 1961 г. М.: Изд-во АН СССР, 1962. - С. 157-163).A known method of cytochemical detection of SDH for the assessment in the patient's body of normal and pathological processes (Carbohydrates and carbohydrate metabolism: Materials of the Second All-Union Conf. On prob. "Chemistry and carbohydrate metabolism", January 24-27. 1961 M .: Izd-vo USSR Academy of Sciences, 1962. - p. 157-163).
За прототип предлагаемого изобретения выбран способ, позволяющий выявить криочувствительность СДГ в лейкоцитах донорской крови после экспозиции с криопротектором ПЭО-400 (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я. - Киев: Наук. Думка, 1981. - 176 с; Архагов Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей: Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2003. - 155 с). Основным недостатком способа-прототипа является отсутствие сравнительных исследований СЦК лейкоцитов на СДГ в мазках проб венозной крови, смешанных с 15% раствором гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (15% ГМБТОЭМ), 3,3% раствором глицерола (3,3% Гл), 10% раствором диметилсульфоксида (10% ДМСО), гемоконсервантом Тромбокриодмац (ТКД) или гемоконсервантом на основе 55% раствора диметилацетамида (ДМАЦ) с 5% раствором гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) (55% ДМАЦ+5% ГЭК), со значениями СЦК КП. Вместе с тем, выбор оптимального персонифицированного криопротектора на этапе, предшествующем криогемотрансфузионной терапии, очень важен для больного, так как позволяет снизить риск посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.For the prototype of the present invention, a method was chosen that allows detecting the cryosensitivity of SDH in donated blood leukocytes after exposure with the PEO-400 cryoprotector (Cytochemistry of a frozen cell / Oznaya E.I., Pushkar N.S., Markova OP, Pankov E.Ya. - Kiev: Nauk. Dumka, 1981. - 176 p .; Arkhagov YF, Changes in the morphology and functional-metabolic activity of leukocytes during the storage of donor blood and under the influence of various rays: Abstract of thesis ... Candidate of Medical Sciences. 2003. - 155 p.). The main disadvantage of the prototype method is the lack of comparative studies of leucocyte CCS in LDH in smears of venous blood samples mixed with a 15% hexamethylene bistetraoxyethyl urea solution (15% HBBTOEM), 3.3% glycerol solution (3.3% Gl), 10% dimethyl sulfoxide solution ( 10% DMSO), hemoconservative Thrombokrimodmats (TCD) or hemoconservative based on a 55% solution of dimethylacetamide (DMAC) with a 5% solution of hydroxyethyl starch (HES) (55% DMAC + 5% HES), with values of CCS KP. At the same time, the choice of the optimal personalized cryoprotectant at the stage preceding cryohemotransfusion therapy is very important for the patient, since it allows reducing the risk of posttransfusion complications of cryoprotective genesis.
Целью изобретения является устранение отмеченного недостатка и создание такого способа, который бы позволял индивидуально подобрать in vitro для конкретного больного оптимальный персонифицированный криопротектор или гемоконсервант на его основе на этапе, предшествующем плановой трансфузии криоконсервированного компонента крови.The aim of the invention is to eliminate the noted deficiency and the creation of such a method that would allow an individual to select the optimal personalized cryoprotectant or hemoconservative based on it in vitro for a particular patient at the stage preceding the planned transfusion of the cryopreserved blood component.
Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.
Техническим результатом изобретения является доступность, простота определения оптимального криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии.The technical result of the invention is the availability, ease of determining the optimal cryoprotectant at the preclinical stage of cryohemotransfusion therapy.
Технический результат в заявляемом способе определения оптимального персонифицированного криопротектора по содержанию сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах консервированной крови достигается тем, что, как и в способе-прототипе, анализ содержания СДГ в лейкоцитах осуществляют по методике Нахласа в модификации Р.П. Нарциссова***.The technical result in the claimed method of determining the optimal personalized cryoprotectant on the content of succinate dehydrogenase in leukocytes of canned blood is achieved by the fact that, as in the prototype method, the analysis of the content of SDH in leukocytes is carried out according to the method of Nakhlas in the modification R.P. Narcissova ***.
Новым в способе является то, что диагностику оптимального криопротектора проводят путем сравнительных исследований СЦК ОП на СДГ с 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, 10% ДМСО, гемоконсервантом ТКД или комбинированным гемоконсервантом 55% ДМАЦ с 5% ГЭК, со значениями СЦК КП. При этом: об оптимальности криопротектора судят в случаях равенства значений СЦК ОП и КП; о принадлежности ОП к препаратам с высоким клиническим риском и непригодными для криогемотрансфузии судят при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП.A new method is that the diagnosis of an optimal cryoprotectant is carried out through comparative studies of CCS OP on SDH with 15% HMBTOEM, 3.3% Gl, 10% DMSO, TKD hemoconservative, or 55% DMAC with 5% HES, with CCK values KP . In this case: the optimality of the cryoprotectant is judged in cases of equality of the values of the CCS OP and KP; About the belonging of OP to drugs with a high clinical risk and unsuitable for cryohemotransfusion are judged with the values of BCC OP, different from BCC KP.
Необходимое оборудование:Necessary equipment:
1. Предметные стекла,1. Slides
2. Пробирки для крови на 20 мл с винтовой герметичной пробкой.2. Test tubes for blood on 20 ml with a screw tight stopper.
3. Световой микроскоп с проходящим светом,3. Light microscope with transmitted light,
4. Набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России,4. A set of test doses of various cryoprotectants or hemoconservatives based on them allowed for clinical use by the Ministry of Health of Russia,
5. Набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах. Заявляемый способ имеет основное преимущество в сравнении с прототипом - определение оптимального криопротектора путем сравнительных исследований значений СЦК ОП ауто-крови на СДГ, смешанных с тест-дозами 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, ТКД, 10% ДМСО или 55% ДМАЦ +5% ГЭК, со значениями СЦК КП.5. Reagent kit for the cytochemical determination of glycogen in leukocytes. The inventive method has the main advantage in comparison with the prototype - determination of the optimal cryoprotectant by comparative studies of the values of SCS OP of auto-blood on SDH, mixed with test doses of 15% GMBTOEM, 3.3% Gl, TKD, 10% DMSO or 55% DMAC + 5% HES, with BCC values KP.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У обследуемого натощак до начала внутривенных трансфузий криоконсервированных компонентов крови (криогемотрансфузионной терапии) готовят в пробирках «линейку» из тест-доз с 15% ГМБТОЭМ, 3,3% глицерола, гемоконсервантом ТКД, 10% ДМСО или комбинированным гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК по 1,5 мл в каждой; эксфузируют 25 мл аутологичной венозной крови на стабилизирующем растворе и фасуют с помощью дозаторной пипетки в 6 помеченных маркером пробирок по 4,0 мл в каждую; затем в пробирку №1 вносят 0,25 мл тест-дозы 15% ГМБТОЭМ, в пробирку №2 - 0,25 мл тест-дозы 3,3% Гл, в пробирку №3 - 0,25 мл тест-дозы ТКД, в пробирку №4 - 0,25 мл 10% ДМСО, в пробирку №5 - 0,25 мл гемоконсерванта на основе 55% ДМАЦ +5% ГЭК, в пробирку №6 с контрольной пробой крови (КП) криопротектор не вносят; компоненты в пробирках №№1-6 герметизируют пробками, перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°С в течение 4 ч; из каждой пробирки биопробы с тестируемыми криопротекторами раскапывают с помощью дозаторной пипетки на чистые предметные стекла, готовят 6 тонких мазков, высушивают на воздухе, фиксируют 60% раствором ацетона, насыщенном трилоном Б при комнатной температуре 30 с. Промывают стекла в двух порциях дистиллированной воды по 5 с и высушивают на воздухе. Инкубируют в инкубационной среде при температуре плюс 37°С 60 мин. Инкубационный раствор готовят по методике Нахласа с соавт. (в модификации Р.П. Нарциссова***). Для этого готовят растворы А и В. Раствор А включает 540 мг сукцината натрия, 10 мл дистиллированной воды и 10 мл фосфатного буфере с рН 7,2. Для приготовления раствора В 20 мг нитротетразоля фиолетового растворяют в 3 каплях диметилформамида и 10 мл дистиллированной воды. Растворы А и В смешивают, фильтруют, затем добавляют 13 мг трилона Б, измеряют рН, добавляют 10 мл дистиллированной воды. Инкубация стекол в рабочем растворе идет в термостате при температуре плюс 37°С в течение 60 мин. Затем стекла промывают проточной водой 1 мин, ополаскивают дистиллированной водой 3-5 с. Докрашивают красителем Романовского в течение 5-10 мин. Смывают краску в проточной воде. Высушивают на воздухе. Окрашенные мазки микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование СДГ в сегментоядерных нейтрофилах и лимфоцитах с гранулами синего цвета СДГ ОП и КП по Каплоу Л. (1955) в модификации Астальди и Верга (1957). О пригодности тестируемых криопротекторов к использованию (ПКИ) в планируемых криогемотрансфузиях судят по значениям СЦК ОП и СЦК КП; при равности значений СЦК ОП и СЦК КП тестируемый криопротектор оценивают как оптимальный для конкретного больного и пригодный к использованию; при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП, делают заключение как о непригодном к использованию криопротекторе.The inventive method is as follows. In the subject on an empty stomach prior to the start of intravenous transfusions of cryoconserved blood components (cryohemotransfusion therapy), a “line” of test doses with 15% HMBTOEM, 3.3% glycerol, TKD hemoconservative, 10% DMSO or a combined hemoconservative on a 55% hemoconservative is prepared in test tubes 5% HES 1.5 ml each; 25 ml of autologous venous blood are excreted in a stabilizing solution and packaged with a dosing pipette into 6 4.0 ml-labeled test tubes each; then 0.25 ml of the test dose of 15% HMBTOEM is introduced into the test tube No. 1, 0.25 ml of the test dose of 3.3% Gl into the test tube No. 2, 0.25 ml of the test dose of TCD in the test tube No. 3, test tube No. 4 - 0.25 ml of 10% DMSO, in test tube No. 5 - 0.25 ml of hemoconservative based on 55% DMAC + 5% HES, cryoprotector is not added to test tube No. 6 with a control blood sample (KP); components in test tubes №№ 1-6 are sealed with plugs, mixed on a shaker at a temperature of + 37 ° C for 4 hours; From each tube, the bioassays with the cryoprotectants being tested are excavated using a dosing pipette on clean slides, 6 thin smears are prepared, air dried, fixed with 60% acetone solution saturated with Trilon B at room temperature for 30 s. Wash the glass in two portions of distilled water for 5 s and air dry. Incubated in the incubation medium at a temperature of + 37 ° C for 60 minutes. The incubation solution is prepared according to the method of Nahlas et al. (in the modification of R.P. Narcissova ***). To do this, prepare solutions A and B. Solution A contains 540 mg of sodium succinate, 10 ml of distilled water and 10 ml of phosphate buffer with a pH of 7.2. To prepare a solution In 20 mg of purple nitrotetrazol is dissolved in 3 drops of dimethylformamide and 10 ml of distilled water. Solutions A and B are mixed, filtered, then 13 mg of Trilon B is added, the pH is measured, 10 ml of distilled water are added. Incubation of glasses in the working solution is carried out in a thermostat at a temperature of + 37 ° C for 60 minutes. Then the glass is washed with running water for 1 min, rinsed with distilled water for 3-5 seconds. Paint over Romanovskiy dye for 5-10 minutes. Wash off the paint in running water. Dried in the air. Stained smears microscopically in transmitted light, conduct a comparative study of LDH in segmented neutrophils and lymphocytes with blue granules SDH OP and KP according to Kaplow L. (1955) modified by Astaldi and Verga (1957). The suitability of the tested cryoprotectants for use (PKI) in planned cryohemotransfusions is judged by the values of the CCS OP and the CCS KP; with equal values of CCS OP and CCS KP, the tested cryoprotectant is assessed as optimal for a particular patient and usable; when the values of the CCS OP, other than the CCS KP, conclude as unfit to use cryoprotector.
Необходимое оборудование: предметные стекла, пробирки для крови на 5 и 20 мл с винтовой герметичной пробкой, световой микроскоп с проходящим светом, набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России, набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах in vitro диагностики фирмы Диахим-ЦитоСтейн-ПАС (Россия).Equipment required: slides, 5 and 20 ml blood tubes with a screw-tight plug, a light microscope with transmitted light, a set of test doses of various cryoprotectants or hemoconservatives based on them allowed for clinical use by the Ministry of Health of Russia, a set of cytochemical glycogen reagents in white blood cells in vitro diagnostics company Diachim-CytoStein-PAS (Russia).
В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого способа диагностики оптимального криопротектора по содержанию сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах консервированной крови приводим 3 опыта (Табл. 1), которые подтверждают практическое применение данного способа.To illustrate the performance of the proposed method for diagnosing the optimal cryoprotectant on the content of succinate dehydrogenase in leukocytes of canned blood, we give 3 experiments (Table 1), which confirm the practical application of this method.
Опыт №1. Результаты исследования крови донора П-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор, включающий 55% раствор ДМАЦ +5% раствор ГЭК (СЦК с/я нейтрофилов и лимфоцитов ОП равны СЦК КП - 0,78 и 0,67 соответственно). Заключение: ПКИ является комбинированный криопротектор, включающий 55% раствор ДМАЦ +5% раствор ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД и 10% ДМСО, СЦК которых отличаются от таковых КП и сопряжены с рисками посттрансфузионных осложнений.Experience number 1. The results of the blood test of the donor P-va show that among the tested test doses of cryoprotectants, a combined cryoprotectant comprising a 55% DMAC solution + 5% HES solution is optimal (SCS with neutrophil c and I and OP lymphocytes are equal to SCB KP - 0.78 and 0 67, respectively). Conclusion: PKI is a combined cryoprotector comprising 55% DMAC solution + 5% HES solution, and NCI are 15% GMBTOEM, 3.3% Glycerol, TKD and 10% DMSO, the CCS of which differ from those of CP and are associated with the risks of post-transfusion complications.
Опыт №2. Результаты исследования крови донора Н-н показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является криопротектор ТКД, у которого СЦК с/я нейтрофилов в ОП и КП составляет 0,46, а СЦК лимфоцитов - 0,79 соответственно. Заключение: ПКИ является криопротектор ТКД, а НКИ являются: 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, 10% ДМСО и комбинированный криопротектор, включающий 55% раствор ДМАЦ +5% раствор ГЭК, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.Experience number 2. The results of the study of the donor Nn blood show that among the tested test doses of cryoprotectants, the cryoprotector TKD is optimal, with a SCS of neutrophils in the OP and a KP of 0.46 and a CCS of lymphocytes of 0.79, respectively. Conclusion: PKI is TKD cryoprotector, and NCI are: 15% HMBTOEM, 3.3% Glycerol, 10% DMSO, and a combined cryoprotectant, comprising a 55% DMAC solution + 5% HES solution, which carry the risks of post-transfusion complications.
Опыт №3. Результаты исследования крови донора С-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является ТКД (СЦК с/я нейтрофилов в ОП и КП составляет 0,86, лимфоцитов - 0,79 соответственно. Заключение: ПКИ является криопротектор ТКД, а НКИ являются 3,3% Глицерол, 15% ГМБТОЭМ, 10% ДМСО, комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.Experience number 3. The results of the blood test of the donor C-va show that among the tested test doses of cryoprotectants, TKD is optimal (SCR of neutrophil c / I in OP and KP is 0.86, lymphocyte count is 0.79, respectively. Conclusion: CRP is TCD cryoprotector, and NCIs are 3.3% Glycerol, 15% HMBTOEM, 10% DMSO, a combined cryoprotectant based on 55% DMAC and 5% HES, which carry the risks of post-transfusion complications.
Представленные примеры иллюстрируют применимость предлагаемого способа определения оптимального криопротектора по цитохимическому показателю содержания СДГ в лейкоцитах консервированной крови. Способ дешев и может быть внедрен в практику гематологического центра, использующего трансфузии криоконсервированных компонентов крови или костного мозга.The presented examples illustrate the applicability of the proposed method for determining the optimal cryoprotectant by the cytochemical index of the content of SDH in leukocytes of canned blood. The method is cheap and can be implemented in the practice of a hematology center using transfusions of cryoconserved components of the blood or bone marrow.
Таким образом, благодаря использованию более чувствительного способа определения оптимального криопротектора по содержанию сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах консервированной ауто-крови удается оценить эффективность и снизить риски криопротекторного генеза на этапе планируемой криогемотрансфузионной терапии.Thus, due to the use of a more sensitive method for determining the optimal cryoprotectant by the content of succinate dehydrogenase in leukocytes of canned auto-blood, it is possible to evaluate the effectiveness and reduce the risks of cryoprotective genesis at the stage of the planned cryo-transfusion therapy.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования является возможность проведения индивидуального скрининга криопротекторов на доклиническом этапе их применения.The present invention meets the criteria of "novelty" and "inventive step", since the conducted patent information research did not reveal sources of patent and scientific literature that would slander the novelty of the proposed method, as well as the known methods with the essential features of the proposed technical solution. The technical result of the use is the possibility of conducting an individual screening of cryoprotectants at the preclinical stage of their use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142482A RU2689328C1 (en) | 2017-12-05 | 2017-12-05 | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142482A RU2689328C1 (en) | 2017-12-05 | 2017-12-05 | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2689328C1 true RU2689328C1 (en) | 2019-05-27 |
Family
ID=66636679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017142482A RU2689328C1 (en) | 2017-12-05 | 2017-12-05 | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2689328C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236466C2 (en) * | 2002-11-25 | 2004-09-20 | Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) |
-
2017
- 2017-12-05 RU RU2017142482A patent/RU2689328C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236466C2 (en) * | 2002-11-25 | 2004-09-20 | Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| А.А.Костяев и др. Зависимость кристаллогенных свойств плазмы донорской крови от температуры замораживания и вида криопротектора / МЕДИЦИНА ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЙ, 2013, N 1(43), стр. 91-96. * |
| А.А.Костяев и др. Зависимость кристаллогенных свойств плазмы донорской крови от температуры замораживания и вида криопротектора / МЕДИЦИНА ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЙ, 2013, N 1(43), стр. 91-96. Большой толковый словарь русского языка. Санкт-Петербург "НОРИНТ", 2000, стр. 1172. * |
| Большой толковый словарь русского языка. Санкт-Петербург "НОРИНТ", 2000, стр. 1172. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grisendi et al. | Detection of microparticles from human red blood cells by multiparametric flow cytometry | |
| Thom et al. | Measurements of CD34+/CD45-dim stem cells predict healing of diabetic neuropathic wounds | |
| Parida et al. | Hematological and plasma biochemistry in Psammophilus blanfordanus (Sauria: Agamidae) | |
| Antonucci et al. | Circulating neutrophils of nonalcoholic steatohepatitis patients show an activated phenotype and suppress T lymphocytes activity | |
| Kunstling et al. | Erythrocyte acetylcholinesterase deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)—a comparison of the complement-sensitive and insensitive populations | |
| US20160324144A1 (en) | Stabilization of whole blood at room temperature | |
| Harris et al. | Effect of sample storage on blood crossmatching in horses | |
| Pan et al. | Fatigue of red blood cells under periodic squeezes in ECMO | |
| Fiedler et al. | Evaluation of the in vitro function of platelet concentrates from pooled buffy coats or apheresis | |
| RU2689328C1 (en) | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes | |
| Newman et al. | Hyperglycemia enhances arsenic-induced platelet and megakaryocyte activation | |
| Li et al. | In vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy | |
| Maurer-Spurej et al. | Could microparticles be the universal quality indicator for platelet viability and function? | |
| RU2686107C1 (en) | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes | |
| McEntire et al. | Comparison of established and novel methods for the detection and enumeration of microparticles in canine stored erythrocyte concentrates for transfusion | |
| RU2676674C1 (en) | Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood | |
| RU2689334C1 (en) | Method for determining a personalized cryoprotector by leukocyte acid phosphatase of preserved blood | |
| Katsares et al. | A rapid and accurate method for the stem cell viability evaluation: the case of the thawed umbilical cord blood | |
| Demaret et al. | Intracellular flow cytometry improvements in clinical studies | |
| RU2491552C1 (en) | Diagnosticum for identifying donor-specific major histocompatibility complex antibodies and method for preparing it | |
| RU2485502C1 (en) | Method for assessing morphofunctional status of human thrombocytes | |
| US5674694A (en) | Clonogenic assay for detecting micro levels of tumor cells in hematopoietic samples | |
| CN110352952A (en) | A kind of composition saved for cell, aqueous compositions and its application | |
| RU2758064C1 (en) | Method for determining posttransplantation chimerism in course of study of abo system erythrocyte antigens | |
| Osman et al. | Diagnostic validity of flow cytometry vs manual counting of polymorphonuclear leukocytes in spontaneous bacterial peritonitis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191206 |