RU2675376C1 - Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold - Google Patents
Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold Download PDFInfo
- Publication number
- RU2675376C1 RU2675376C1 RU2017125696A RU2017125696A RU2675376C1 RU 2675376 C1 RU2675376 C1 RU 2675376C1 RU 2017125696 A RU2017125696 A RU 2017125696A RU 2017125696 A RU2017125696 A RU 2017125696A RU 2675376 C1 RU2675376 C1 RU 2675376C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- scaffold
- cells
- images
- followed
- fluorescence microscopy
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 5
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Chemical group 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Chemical group 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предполагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам количественной оценки клеток в составе клеточно-инженерной конструкции (скаффолда).The alleged invention relates to medicine, biotechnology, regenerative medicine, in particular to methods for quantifying cells as part of a cell engineering construct (scaffold).
Одним из основных направлений современной регенеративной медицины и биотехнологий является разработка тканезамещающих материалов для восстановления поврежденных тканей и органов. Развитие скаффолд-технологий связано, прежде всего, с культивированием клеток на трехмерных матрицах естественного или искусственного происхождения с целью пространственного формирования будущего органа или его фрагмента для трансплантата. Одной из актуальных проблем, возникающих при исследовании в области скаффолд-технологий, является объективный прямой количественный анализ клеток культивируемых в скаффолде позволяющий охарактеризовать цитотоксические свойства клеточной матрицы, жизнеспособность и пролиферативную активность клеток в клеточно-инженерной конструкции. Данная проблема связана с особенностями культивирования клеток на трехмерных матрицах, в том числе с ограничением возможности прямого подсчета клеток при использовании световой микроскопии, что обусловлено трехмерностью структуры матриц и распределением клеток по всей толще скаффолда. Так же большинство скаффолдов не прозрачны, что вообще исключает методы количественного анализа с использованием световой микроскопии.One of the main directions of modern regenerative medicine and biotechnology is the development of tissue-replacing materials for the restoration of damaged tissues and organs. The development of scaffold technologies is primarily associated with the cultivation of cells on three-dimensional matrices of natural or artificial origin with the aim of spatial formation of the future organ or its fragment for transplantation. One of the urgent problems arising in research in the field of scaffold technologies is an objective direct quantitative analysis of cells cultured in a scaffold, which allows one to characterize the cytotoxic properties of the cell matrix, cell viability and proliferative activity in the cell engineering construct. This problem is associated with the peculiarities of culturing cells on three-dimensional matrices, including the limitation of the possibility of direct cell counting using light microscopy, which is due to the three-dimensional structure of the matrices and the distribution of cells throughout the thickness of the scaffold. Also, most scaffolds are not transparent, which generally excludes methods of quantitative analysis using light microscopy.
Существуют методы количественного анализа клеточной составляющей скаффолдов основанные на оценке метаболической активности клеток, например МТТ-тест. Однако эти методы являются косвенными и имеют большую погрешность, что связано с различной метаболической активностью клеток, например, находящихся в различных фазах митоза. Так же высокой степенью погрешности характеризуются методы, основанные на прямом подсчете количества клеток выделенных из скаффолда, что связано с потерей клеток при разрушении матрицы.There are methods for quantitative analysis of the cellular component of scaffolds based on an assessment of the metabolic activity of cells, for example, the MTT test. However, these methods are indirect and have a large error, which is associated with different metabolic activity of cells, for example, located in different phases of mitosis. Methods based on direct calculation of the number of cells isolated from the scaffold are also characterized by a high degree of error, which is associated with the loss of cells during matrix destruction.
В качестве прототипа выбран способ определения количества клеток (см. Rowe S.L., Lee S., Stegemann J.P. Influence of thrombin concentration on the mechanical and morphological properties of cell-seeded fibrin hydrogels // Acta Biomater. 2007. Vol. 3., N.1., P. 59-67), применяемый для фибриновых и коллагеновых скаффолдов, включающий дегидратацию и ферментирование скаффолда, разбавление и окрашивание полученных образцов флуорохромом Hoechst 33258, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, проведение флуоресцентной микроскопии с количественным определением ДНК и последующим вычислением абсолютного количества клеток в скаффолде.As a prototype, a method for determining the number of cells was selected (see Rowe SL, Lee S., Stegemann JP Influence of thrombin concentration on the mechanical and morphological properties of cell-seeded fibrin hydrogels // Acta Biomater. 2007. Vol. 3., N. 1., P. 59-67), used for fibrin and collagen scaffolds, including dehydration and fermentation of the scaffold, dilution and staining of the obtained samples with Hoechst 33258 fluorochrome, which is highly specific for a double-stranded DNA molecule, fluorescence microscopy with DNA quantification and subsequent calculation absolute number Twa cells in the scaffold.
Способ, представленный в прототипе, является косвенным и основан не на прямом подсчете клеток, а на количественном анализе ДНК в разрушенном скаффолде с последующим преобразованием количества ДНК в число клеток путем математического пересчета. Существенным недостатком представленного прототипа является необходимость дегидратации, разрушения скаффолда путем ферментации в протеиназе К и последующее разбавление полученных образцов, что может приводить к потере части клеточной составляющей скаффолда и вносить существенную погрешность в количественный анализ. Еще одним недостатком является длительность и трудоемкость способа, так только подготовительная часть анализа (ферментация) занимает от 16 до 20 часов, таким образом, для реализации всего способа необходимо более суток непрерывной работы. Так же крайне неудобен способ выражения результатов в виде абсолютного числа клеток в скаффолде. В связи с тем, что скаффолд может иметь значительные размеры и при этом достаточно малое количество клеток или наоборот небольшие размеры, но большое количество клеток способ не дает представления о плотности клеток в объеме скаффолда, а для получения последнего необходимы данные о размере скаффолда требующие проведения дополнительных измерений. Для корректного сравнения количества клеток в нескольких скаффолдах при использовании способа-прототипа по их абсолютному числу необходимы абсолютно идентичные образцы по размерам, что не всегда возможно реализовать в реальных условиях (например, клетки, растущие в скаффолде, могут изменять его структуру, что приводит к ретракции образцов и изменению их размеров). Таким образом, данный способ ограничивает возможность проведения последующего сравнительного анализа при работе с различными по размерам скаффолдами или их фрагментами.The method presented in the prototype is indirect and is based not on a direct count of cells, but on a quantitative analysis of DNA in a destroyed scaffold with subsequent conversion of the amount of DNA into the number of cells by mathematical recount. A significant drawback of the presented prototype is the need for dehydration, destruction of the scaffold by fermentation in proteinase K and subsequent dilution of the obtained samples, which can lead to the loss of part of the cellular component of the scaffold and introduce a significant error in the quantitative analysis. Another disadvantage is the length and complexity of the method, since only the preparatory part of the analysis (fermentation) takes from 16 to 20 hours, so for the implementation of the whole method requires more than a day of continuous work. It is also extremely inconvenient to express the results as an absolute number of cells in a scaffold. Due to the fact that a scaffold can have significant sizes and a rather small number of cells, or vice versa small sizes, but a large number of cells the method does not give an idea of the cell density in the volume of the scaffold, and to obtain the latter, data on the size of the scaffold are required, requiring additional measurements. To correctly compare the number of cells in several scaffolds when using the prototype method in terms of their absolute number, absolutely identical samples in size are necessary, which is not always possible to realize in real conditions (for example, cells growing in a scaffold can change its structure, which leads to retraction samples and resizing). Thus, this method limits the possibility of subsequent comparative analysis when working with scaffolds of various sizes or fragments thereof.
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.The objective of the proposed invention is the improvement of the method.
Технический результат - объективизация, сокращение временных затрат и трудоемкости, повышение точности исследования количества клеток в составе скаффолда с относительно равномерным распределением клеток.The technical result is objectification, reducing time and labor costs, improving the accuracy of the study of the number of cells in the scaffold with a relatively uniform distribution of cells.
Технический результат осуществляется за счет того, что в способе, включающем окрашивание образцов флуорохромом Hoechst, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК и проведение флуоресцентной микроскопии, исследуемые образцы скаффолдов не подвергают предварительной подготовке, цифровую флуоресцентную микроскопию проводят в 10 полях зрения с послойной съемкой по оси Z на заданную глубину с последующей сшивкой изображений, полученные снимки обрабатывают с применением фильтров по интенсивности флуоресцентного свечения и по площади объекта, проводят промежуточный статистический анализ с расчетом общего количества клеток в каждом снимке и среднего количества клеток в 10 снимках, с последующим перерасчетом количества клеток в 1 мм3 скаффолда.The technical result is due to the fact that in the method, including staining the samples with a Hoechst fluorochrome, which has high specificity for a double-stranded DNA molecule and performing fluorescence microscopy, the studied scaffold samples are not subjected to preliminary preparation, digital fluorescence microscopy is carried out in 10 fields of view with layered shooting along the axis Z to a given depth, followed by stitching the images, the resulting images are processed using filters according to the intensity of the fluorescent glow I and by the area of the object, carry out an intermediate statistical analysis with the calculation of the total number of cells in each image and the average number of cells in 10 images, followed by a recalculation of the number of cells in 1 mm 3 scaffold.
Способ количественного анализа клеточной составляющей скаффолда с относительно равномерным распределением клеток осуществляют следующим образом.The method of quantitative analysis of the cellular component of the scaffold with a relatively uniform distribution of cells is as follows.
1. Фрагмент скаффолда помещают в 24-х луночный планшет для флуоресцентной микроскопии с непрозрачными боковыми стенками. Затем проводят прижизненное окрашивание ядер клеток в скаффолде с применением флуорохрома Hoechst 3334 обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК. В лунку, содержащую фрагмент скаффолда и 2 мл культуральной среды (в зависимости от клеток, культивируемых в скаффолде DMEM или α-МЕМ содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки), добавляют 1 мкл раствора Hoechst 33342 в концентрации 10 мкг/мл. Планшет помещают в термостат и инкубируют в течение 30 мин. при 37°C. После инкубации фрагмент скаффолда дважды отмывают фосфатным буфером. Затем к фрагменту скаффолда добавляют 1 мл фосфатного буфера для предотвращения пересыхания образца.1. A fragment of the scaffold is placed in a 24-well plate for fluorescence microscopy with opaque side walls. Then, intravital staining of cell nuclei in a scaffold is carried out using Hoechst 3334 fluorochrome, which has high specificity for a double-stranded DNA molecule. To a well containing a scaffold fragment and 2 ml of culture medium (depending on the cells cultured in a DMEM scaffold or α-MEM containing 10% fetal calf serum), 1 μl of 10 μg / ml Hoechst 33342 solution is added. The tablet is placed in a thermostat and incubated for 30 minutes. at 37 ° C. After incubation, the scaffold fragment is washed twice with phosphate buffer. Then, 1 ml of phosphate buffer is added to the scaffold fragment to prevent the sample from drying out.
2. Планшет с фрагментом скаффолда переносят на оборудование позволяющее проводить цифровую флуоресцентную микроскопию (например: фотометр-имиджер Cytation™ 5). В 10 полях зрения с использованием объектива с 4-х кратным увеличением проводят послойную съемку по оси Z на заданную глубину не более 500 μm с последующей сшивкой изображений (стекинг, Z-stack). При использовании функции Z-stack объектив перемещается вдоль оси Z, снимает несколько изображений, извлекает только те участки, которые находятся в фокусе, и синтезирует их в полностью сфокусированное изображение.2. A tablet with a scaffold fragment is transferred to equipment that allows digital fluorescence microscopy (for example: Cytation ™ 5 photometer imager). In 10 fields of view using a lens with a 4x magnification, layer-by-layer shooting is carried out along the Z axis to a predetermined depth of not more than 500 μm, followed by stitching images (stacking, Z-stack). When using the Z-stack function, the lens moves along the Z axis, takes several images, extracts only those areas that are in focus, and synthesizes them into a fully focused image.
3. Снимки в количестве 10 штук полученные по п. 2 обрабатывают с применением фильтров порога интенсивности флуоресцентного свечения (при анализе учитываются объекты с интенсивностью свечения более 7000 условных единиц) и площади объекта (при анализе учитываются объекты с площадью менее 30 μm). Применение данных фильтров позволяет снизить погрешность при количественном анализе. Так объекты с интенсивностью свечения ниже выбранного яркостного порога относят к объектам более светлым и исключаются из анализа (например: окрашенные клеточные ядра, залегающие в более глубоких слоях скаффолда, чем анализируемый слой). Применение фильтра порога интенсивности флуоресцентного свечения так же позволяет разделить ряд близкорасположенных клеточных ядер - в центре ядра имеют более интенсивное свечение, чем по периферии, таким образом, происходит разделение объектов по интенсивности свечения и при анализе учитываются объекты с яркостью выше пороговой - центральные части ядер. Применение фильтра по площади объекта позволяет не учитывать при анализе объекты с площадью более заданной, что дает возможность исключить объекты, не относящиеся к клеточным ядрам (например: остатки красителя) или скопления близкорасположенных клеток которые не удалось разделить при применении предыдущего фильтра.3. Pictures in the amount of 10 pieces obtained according to claim 2 are processed using filters of the fluorescence fluorescence intensity threshold (when analyzing, objects with a fluorescence intensity of more than 7000 conventional units are taken into account) and object area (objects with an area of less than 30 μm are taken into account in the analysis). The use of these filters allows to reduce the error in the quantitative analysis. So objects with a luminosity below the selected brightness threshold are assigned to objects brighter and are excluded from the analysis (for example: stained cell nuclei lying in deeper scaffold layers than the analyzed layer). The use of a filter for the intensity threshold of fluorescence glow also allows you to separate a number of closely located cell nuclei - in the center of the nucleus they have a more intense glow than on the periphery, thus, objects are separated by the intensity of the glow and the analysis takes into account objects with brightness above the threshold - the central parts of the nuclei. The use of a filter by the area of the object allows not to take into account objects with an area more than specified during the analysis, which makes it possible to exclude objects that are not related to cell nuclei (for example: dye residues) or clusters of closely spaced cells that could not be separated using the previous filter.
4. Затем проводят промежуточный статистический анализ:4. Then carry out an intermediate statistical analysis:
а) расчет общего количества клеток в каждом из 10 снимков (по п. 2-3);a) calculation of the total number of cells in each of 10 images (according to p. 2-3);
б) расчет среднего количества клеток в 10 снимках (по п. 2-3).b) calculation of the average number of cells in 10 images (according to p. 2-3).
5. Вычисляют количество клеток в 1 мм3 скаффолда по формуле:5. Calculate the number of cells in 1 mm 3 scaffold according to the formula:
K=N/B*C*500*10-9,K = N / B * C * 500 * 10 -9 ,
где K - количество клеток в 1 мм3;where K is the number of cells in 1 mm 3 ;
N - среднее количество клеток на 10 снимках по п. 4б;N is the average number of cells in 10 images according to claim 4b;
В - размер анализируемого поля зрения в μm по оси x при использовании объектива с 4-х кратным увеличением;B is the size of the analyzed field of view in μm along the x axis when using a lens with a 4-fold increase;
С - размер анализируемого поля зрения в μm по оси y при использовании объектива с 4-х кратным увеличением;C is the size of the analyzed field of view in μm along the y axis when using a lens with a 4-fold increase;
500 - размер анализируемого поля зрения в μm по оси z при использовании объектива с 4-х кратным увеличением;500 - the size of the analyzed field of view in μm along the z axis when using a lens with a 4-fold increase;
10-9 - коэффициент, определяющий перевод μm3 в мм3.10 -9 - coefficient determining the conversion of μm 3 in mm 3 .
Пример 1Example 1
Для исследования количества клеток взяты два фрагмента фибрин-коллагенового скаффолда с относительно равномерным распределением клеток (МСК крысы) и известной начальной концентрацией клеток (120 клеток/мм3). Скаффолд инкубировался в культуральной среде α-МЕМ содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в клеточном инкубаторе с содержанием CO2 5% и температурой 37°C. Фрагмент скаффолда №1 был взят на исследование после 1 суток инкубации, фрагмент №2 был взят после 9 суток инкубации. Согласно представленного способа фрагменты скаффолдов были окрашены Hoechst 33342 и проведен последующий количественный анализ клеточной составляющей скаффолда. Цифровая флуоресцентная микроскопия проводилась на фотометр-имиджере Cytation™ 5 (BioTek), при длине волны возбуждения 377 нм и длине волны эмиссии 447 нм. В 10 полях зрения с использованием объектива с 4-х кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на заданную глубину 500 μm с последующей сшивкой изображений с и использованием функции Z-stack. В=1968 μm, С=1455 μm.To study the number of cells, two fragments of a fibrin-collagen scaffold with a relatively uniform distribution of cells (rat MSCs) and a known initial cell concentration (120 cells / mm 3 ) were taken. Scaffold was incubated in α-MEM culture medium containing 10% fetal calf serum in a cell incubator with a CO 2 content of 5% and a temperature of 37 ° C. Fragment of scaffold No. 1 was taken for examination after 1 day of incubation, fragment No. 2 was taken after 9 days of incubation. According to the presented method, fragments of scaffolds were stained with Hoechst 33342 and a subsequent quantitative analysis of the cellular component of the scaffold was carried out. Digital fluorescence microscopy was carried out on a Cytation ™ 5 photometer imager (BioTek) at an excitation wavelength of 377 nm and an emission wavelength of 447 nm. In 10 fields of view using a lens with a 4-fold increase, layer-by-layer shooting was carried out along the Z axis at a given depth of 500 μm, followed by stitching images with and using the Z-stack function. B = 1968 μm, C = 1455 μm.
Результат:Result:
После первых суток инкубации скаффолда в культуральной среде количество клеток увеличилось в 1,2 раза (Табл. 1). После девяти суток инкубации скаффолда в культуральной среде количество клеток увеличилось в 3,8 раза. Можно заключить, что скаффолд не цитотоксичен, обладает свойствами обеспечивающими высокую жизнеспособность и пролиферативную активность клеток.After the first day of incubation of the scaffold in the culture medium, the number of cells increased by 1.2 times (Table 1). After nine days of incubation of the scaffold in the culture medium, the number of cells increased by 3.8 times. We can conclude that scaffold is not cytotoxic, has properties that provide high cell viability and proliferative activity.
Пример 2.Example 2
Для исследования количества клеток взяты два фибрин-коллагеновых скаффолда содержащих дермальные фибробласты человека с разницей в концентрации клеток в 2 раза (скаффолд №1 - начальная концентрация клеток 90 клеток/мм3; скаффолд №2 - 180 клеток/мм3) и относительно равномерным распределением клеток по всему объему скаффолда. Скаффоды инкубировались в течении 3 суток в культуральной среде DMEM содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в клеточном инкубаторе с содержанием СO2 5% и температурой 37°C. Затем согласно представленного способа фрагменты скаффолдов были окрашены Hoechst 33342 и проведен последующий количественный анализ клеточной составляющей скаффолда. Цифровая флуоресцентная микроскопия проводилась на фотометр-имиджере Cytation™ 5 (BioTek), при длине волны возбуждения 377 нм и длине волны эмиссии 447 нм. В 10 полях зрения с использованием объектива с 4-х кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на заданную глубину 500 μm с последующей сшивкой изображений с и использованием функции Z-stack. В=1968 μm, С=1455 μm.To study the number of cells, two fibrin-collagen scaffolds containing human dermal fibroblasts with a 2-fold difference in cell concentration were taken (scaffold No. 1 - initial cell concentration of 90 cells / mm 3 ; scaffold No. 2 - 180 cells / mm 3 ) and a relatively uniform distribution cells throughout the scaffold. Scaffodes were incubated for 3 days in a DMEM culture medium containing 10% fetal calf serum in a cell incubator with a CO 2 content of 5% and a temperature of 37 ° C. Then, according to the presented method, fragments of scaffolds were stained with Hoechst 33342 and a subsequent quantitative analysis of the cellular component of the scaffold was carried out. Digital fluorescence microscopy was carried out on a Cytation ™ 5 photometer imager (BioTek) at an excitation wavelength of 377 nm and an emission wavelength of 447 nm. In 10 fields of view using a lens with a 4-fold increase, layer-by-layer shooting was carried out along the Z axis at a given depth of 500 μm, followed by stitching images with and using the Z-stack function. B = 1968 μm, C = 1455 μm.
Результат:Result:
После трех суток инкубации скаффолдов в культуральной среде в скаффолде №1 количество клеток увеличилось в 3,2 раза, в скаффолде №2 количество клеток увеличилось в 3,4 раза (Табл. 2). При этом концентрация клеток в скаффолде №2 была больше, чем в скаффолде №1 в 2,2 раза. Можно заключить, что в обоих скаффолдах дермальные фибробласты человека имели высокую пролиферативную активность, при этом в скаффолде №2 она была выше, чем в сокаффолде №1.After three days of incubation of the scaffolds in the culture medium in the scaffold No. 1, the number of cells increased by 3.2 times, in the scaffold No. 2 the number of cells increased by 3.4 times (Table 2). At the same time, the concentration of cells in scaffold No. 2 was 2.2 times higher than in scaffold No. 1. It can be concluded that in both scaffolds, human dermal fibroblasts had high proliferative activity, while in Scaffold No. 2 it was higher than in Socaffold No. 1.
Преимуществами представленного способа количественного анализа клеточной составляющей скаффолда являются:The advantages of the presented method for the quantitative analysis of the cellular component of the scaffold are:
- прямой, а не косвенный анализ количества клеток в скаффолде по подсчету количества ядер;- direct rather than indirect analysis of the number of cells in a scaffold by counting the number of nuclei;
- возможность проведения исследования без разрушения структуры скаффолда, что позволяет повысить точность исследований;- the ability to conduct research without destroying the structure of the scaffold, which allows to increase the accuracy of research;
- возможность проведения исследования без дополнительной предварительной подготовки образцов до окрашивания, что снижает трудоемкость и существенно сокращает временные затраты на проведение количественного анализа клеточной составляющей скаффолда;- the ability to conduct research without additional preliminary preparation of samples before staining, which reduces the complexity and significantly reduces the time spent on quantitative analysis of the cellular component of the scaffold;
- возможность проведения исследований на скаффолдах или их фрагментах различных размеров, что существенно расширяет сферу применения способа и возможности при проведении научно-исследовательских работ с клеточно-инженерными конструкциями;- the ability to conduct research on scaffolds or fragments thereof of various sizes, which significantly expands the scope of the method and the possibility of conducting research work with cellular engineering structures;
- выражение конечного результата в количестве клеток на единицу объема скаффолда, что дает представление о плотности клеток в скаффолде и возможность последующего корректного сопоставления количества клеток в независимости от размера анализируемых скаффолдов или их фрагментов.- the expression of the final result in the number of cells per unit volume of the scaffold, which gives an idea of the density of cells in the scaffold and the possibility of the subsequent correct comparison of the number of cells regardless of the size of the analyzed scaffolds or fragments thereof.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017125696A RU2675376C1 (en) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017125696A RU2675376C1 (en) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2675376C1 true RU2675376C1 (en) | 2018-12-19 |
Family
ID=64753011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017125696A RU2675376C1 (en) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2675376C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2740566C1 (en) * | 2020-06-08 | 2021-01-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук (ИМХ РАН) | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold |
| WO2022058859A1 (en) * | 2020-09-18 | 2022-03-24 | Avant Meats Company Limited | Quantification of cells embedded in a 3d scaffold |
| RU2776455C2 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-21 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» | Method for in vitro determination of biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110125029A1 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Targeted Dual-Axes Confocal Imaging Apparatus with Vertical Scanning Capabilities |
-
2017
- 2017-07-17 RU RU2017125696A patent/RU2675376C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110125029A1 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Targeted Dual-Axes Confocal Imaging Apparatus with Vertical Scanning Capabilities |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АНТОНОВА Л.В. и др. Сравнительное тестирование in vitro биодеградируемых сосудистых имплантатов для оценки перспективы использования в тканевой инженерии // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, 2015, N 4, стр.34-41. BAJCSY P. et al. A Method for the Evaluation of Thousands of Automated 3D Stem Cell Segmentations // J. Microsc., 2015, V.260, pp.363-376. DANA H. et al. Hybrid Multiphoton Volumetric Functional Imaging of Large Scale Bioengineered Neuronal Networks // Nat. Commun., 2014, V.5, pp.1-15. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2740566C1 (en) * | 2020-06-08 | 2021-01-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук (ИМХ РАН) | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold |
| WO2022058859A1 (en) * | 2020-09-18 | 2022-03-24 | Avant Meats Company Limited | Quantification of cells embedded in a 3d scaffold |
| RU2776455C2 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-21 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» | Method for in vitro determination of biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12042791B2 (en) | Method of osteogenic differentiation in microfluidic tissue culture systems | |
| CN102085390B (en) | Cartilage cell removal matrix and preparation method and application thereof | |
| Di Iorio et al. | Q‐FIHC: Quantification of fluorescence immunohistochemistry to analyse p63 isoforms and cell cycle phases in human limbal stem cells | |
| Xue et al. | Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy | |
| Cortvrindt et al. | Fluorescent probes allow rapid and precise recording of follicle density and staging in human ovarian cortical biopsy samples | |
| Galdames et al. | Sex determination by observation of Barr body in teeth subjected to high temperatures | |
| Susaki et al. | Perspective: extending the utility of three-dimensional organoids by tissue clearing technologies | |
| RU2675376C1 (en) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold | |
| Wang et al. | Human primary epidermal organoids enable modeling of dermatophyte infections | |
| CN110068559A (en) | A kind of biological tissue's transparence imaging method | |
| Galdames et al. | Sex chromatin in dental pulp. Performance of diagnosis test and gold standard generation | |
| Croes et al. | Adult sclerosing rhabdomyosarcoma: cytogenetic link with embryonal rhabdomyosarcoma | |
| CN117511880B (en) | Method for constructing in-vitro tumor in-situ model, culture medium and in-vitro application | |
| Meekel et al. | An in vitro method to keep human aortic tissue sections functionally and structurally intact | |
| Komatsu et al. | Ovarian tissue culture to visualize phenomena in mouse ovary | |
| Van Zundert et al. | Fluorescence Imaging of 3D Cell Models with Subcellular Resolution | |
| Reed et al. | Culture of murine aortic explants in 3-dimensional extracellular matrix: a novel, miniaturized assay of angiogenesis in vitro | |
| Kiewisz et al. | High-throughput screening of mitotic mammalian cells for electron microscopy using classic histological dyes | |
| Heuser et al. | Introducing a mammalian nerve-muscle preparation ideal for physiology and microscopy, the transverse auricular muscle in the ear of the mouse | |
| Egorikhina et al. | Quantitative analysis of cells encapsulated in a scaffold | |
| Gayoso et al. | Three-sectioning method: A procedure for studying hard tissues and large pieces under light and electron microscopy | |
| Choi | Integrative and Scalable Pipeline for Multi-omic Characterization of Biological Tissues | |
| JP7166348B2 (en) | Cell analysis device and cell analysis method | |
| CN102869988A (en) | Method for evaluating graft | |
| RU2695061C1 (en) | Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190718 |