RU2662172C2 - Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium - Google Patents
Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662172C2 RU2662172C2 RU2016148715A RU2016148715A RU2662172C2 RU 2662172 C2 RU2662172 C2 RU 2662172C2 RU 2016148715 A RU2016148715 A RU 2016148715A RU 2016148715 A RU2016148715 A RU 2016148715A RU 2662172 C2 RU2662172 C2 RU 2662172C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- regenerative
- cells
- medium
- stem cells
- conditioned medium
- Prior art date
Links
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 abstract 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000012649 demethylating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000036575 thermal burns Effects 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения и применения в терапевтических целях регенеративного препарата, содержащего набор биологически активных веществ, выделенных из экстракта мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга (КМ) или жировой ткани (ЖТ) животных и кондиционной среды, полученной в результате культивирования данных клеток. Предлагаемый способ позволяет получить препарат, который обеспечивает эффективное стимулирование собственных восстановительных процессов организма животных.The invention relates to veterinary medicine and can be used to obtain and use for therapeutic purposes a regenerative preparation containing a set of biologically active substances isolated from an extract of mesenchymal stem cells (MSCs) of bone marrow (CM) or adipose tissue (VT) of animals and conditioned media obtained as a result of culturing these cells. The proposed method allows to obtain a drug that provides effective stimulation of the own recovery processes of the animal organism.
Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
В настоящее время интенсивно проводятся исследования возможности получения и дифференцировки клеток из различных типов стволовых клеток, применяемых для замещения утраченных или поврежденных клеток жизненно важных органов и тканей путем трансплантации. В ходе роста и при индукции дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные формируется кондиционная среда, которая также обладает различной биологической активностью, в том числе обладает терапевтическим эффектом.Currently, intensive studies are being conducted on the possibility of obtaining and differentiating cells from various types of stem cells used to replace lost or damaged cells of vital organs and tissues by transplantation. In the course of growth and upon induction of differentiation of the initial stem cells into specialized ones, a conditioned medium is formed, which also has various biological activity, including a therapeutic effect.
Создание препарата фармацевтического назначения, содержащего биологически активные вещества, в частности, ростовые факторы, на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды, на которой данные клетки культивируются, предполагает использование биотехнологических подходов, а не клеточных технологий, что не противоречит требованиям биоэтики и нормам права. Вследствие замены клеточных технологий на биотехнологические подходы, устраняются препятствия на всех этапах промышленного внедрения препарата от доклинических исследований и до коммерциализации с последующим получением разрешения на реализацию.The creation of a pharmaceutical preparation containing biologically active substances, in particular, growth factors, based on the extract of mesenchymal stem cells and the conditioned environment on which these cells are cultivated, involves the use of biotechnological approaches, rather than cellular technologies, which does not contradict the requirements of bioethics and law . Due to the replacement of cellular technologies with biotechnological approaches, obstacles are eliminated at all stages of the industrial introduction of the drug from preclinical studies to commercialization, followed by obtaining permission to sell.
Следует отметить, что дегенеративные заболевания обусловлены нарушением способности отдельных тканей организма к восстановлению за счет реализации собственного регенераторного потенциала и развитие дистрофических процессов на фоне разрастания склеротической ткани. Фармакологическое действие применяемых для лечения подобных состояний средств направлено на стимуляцию либо замещение функций сохранившихся клеточных элементов. Однако концепция компенсации нарушений органов-мишеней за счет адаптационных процессов часто оказывается несостоятельной. Представленные факты указывают на необходимость развития стратегии регенеративной медицины, которая заключается в замене погибших либо неправильно функционирующих клеточных элементов на новые.It should be noted that degenerative diseases are caused by a violation of the ability of individual body tissues to recover due to the realization of their own regenerative potential and the development of dystrophic processes against the background of proliferation of sclerotic tissue. The pharmacological effect of the drugs used to treat such conditions is aimed at stimulating or replacing the functions of the preserved cellular elements. However, the concept of compensating for target organ dysfunctions through adaptation processes is often unsound. The facts presented indicate the need to develop a strategy of regenerative medicine, which consists in replacing dead or malfunctioning cellular elements with new ones.
Уровень техникиState of the art
Известен ряд кондиционных сред и фармацевтических композиций, получаемых из питательных сред в результате культивирования мезенхимальных стволовых клеток стабильной культуры, данные среды могут содержать также факторы дифференцировки. Подобные аналоги обеспечивают стимуляцию регенерационных процессов, однако обладают слишком узконаправленным действием. Так, известны среды, направленные на восстановление опорно-двигательного аппарата - хрящевой [заявка на изобретение РФ 2001116126 от 08.11.1999 г., приоритет Италия] и костной ткани [Mbalaviele G, Jaiswal N et al., Endocrinology, 1999]. Известна композиция, содержащая костномозговые МСК человека в количестве не менее 105 клеток/мл и культуральную питательную среду, которая используется только для регенерации кожных покровов [патент RU 2455354 С1]. Разработана кондиционная среда Majumdar MK, Thiede MA, et al., Stem Cell Res., 2000], в которой поддерживают дифференцировку МСК в механоциты или остеобласты, выделяющие цитокины, которая способна активировать продолжительный рост гемопоэтических стволовых клеток.A number of conditioned media and pharmaceutical compositions are known that are obtained from culture media by culturing a mesenchymal stem cell in a stable culture; these media may also contain differentiation factors. Such analogs provide stimulation of regeneration processes, however, they have too narrowly targeted action. So, there are known environments aimed at restoring the musculoskeletal system - cartilaginous [application for the invention of the Russian Federation 2001116126 from 08.11.1999, priority Italy] and bone tissue [Mbalaviele G, Jaiswal N et al., Endocrinology, 1999]. A known composition containing bone marrow MSCs in humans in an amount of at least 10 5 cells / ml and a culture medium that is used only for the regeneration of the skin [patent RU 2455354 C1]. A conditioned medium Majumdar MK, Thiede MA, et al., Stem Cell Res., 2000] was developed, which supports the differentiation of MSCs into mechanocytes or osteoblasts that secrete cytokines, which can activate the long-term growth of hematopoietic stem cells.
Известна фармацевтическая композиция, содержащая кондиционную питательную среду, поддерживавшую рост эукариотических клеток и фармацевтический носитель [RU 2001133453/13. Заявка от 12.05.2000 г., приоритет US: 09/313,538 от 14.05.1999]. Композиция может иметь различную лекарственную форму. Фармацевтический носитель может включать один или несколько внеклеточных продуктов (компонентов кондиционной среды) выделяемых методами разделения белков. Данную композицию используют для стимуляции заживления ран и ожогов. К недостаткам рассматриваемой фармацевтической композиции можно отнести то, что лечебное действие обеспечивается не применением самой кондиционной среды, а комплексом внеклеточных продуктов и других элементов композиции. При этом, роль среды заключается в поддержании жизнедеятельности используемых в композиции клеток и среды для сохранения фармацевтического носителя.Known pharmaceutical composition containing a conditioned nutrient medium that supports the growth of eukaryotic cells and a pharmaceutical carrier [RU 2001133453/13. Application of 05/12/2000, priority US: 09 / 313,538 of 05/14/1999]. The composition may have a different dosage form. A pharmaceutical carrier may include one or more extracellular products (components of a conditioned medium) secreted by protein separation methods. This composition is used to stimulate the healing of wounds and burns. The disadvantages of the pharmaceutical composition under consideration include the fact that the therapeutic effect is provided not by the use of the most conditioned medium, but by a complex of extracellular products and other elements of the composition. At the same time, the role of the medium is to maintain the vital functions of the cells and medium used to preserve the pharmaceutical carrier.
В регенеративной медицине возможно использование частиц, секретируемых МСК. Так, для лечения кожных заболеваний и ожогов могут быть применены везикулы, или экзосомы [WO 2009105044 А1]. Описан способ получения частиц, включающий получение среды, кондиционированной МСК, ее концентрирование, обработку путем гель-фильтрации, отбор фракции с динамическим рассеянием света, путем УФ-детектирования при 220 нм (сбор фракций, элюирующих со временем удерживания 11-13 минут). Полученная частица может быть использована в составе фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболеваний. Несмотря на то, что имеются данные, указывающие на важную роль экзосом в реализации паракринных эффектов МСК, нет доказательств того, что именно фракция, описанная в изобретении, является ключевой для регенеративного действия этих клеток. Также описанная технология довольно сложно применима в процессе производства и не обеспечивает должной стандартизации конечного продукта.In regenerative medicine, the use of particles secreted by MSCs is possible. Thus, vesicles or exosomes can be used to treat skin diseases and burns [WO 2009105044 A1]. A method for producing particles is described, including obtaining a medium conditioned by MSCs, concentrating it, processing by gel filtration, selecting a fraction with dynamic light scattering, by UV detection at 220 nm (collecting fractions eluting with a retention time of 11-13 minutes). The resulting particle can be used as part of a pharmaceutical composition used to treat diseases. Despite the fact that there is evidence indicating the important role of exosomes in the realization of the paracrine effects of MSCs, there is no evidence that the fraction described in the invention is the key to the regenerative action of these cells. Also, the described technology is rather difficult to apply in the production process and does not provide proper standardization of the final product.
Аналогом является ростовая среда, получаемая при выращивании кардиомиоцитов из МСК костного мозга [Fukuda К., Artificial Organs, 2001]. Основа рассматриваемой среды составляет IMDM, к которой добавлены антибиотики, антимикотики, L-глютамин и 20% фетальной сыворотки крови КРС, а также индуктор дифференцировки 5-азацитидин (деметилирующий агент). В ходе роста и пролиферации МСК и их дифференцировки в кардиомиоциты в среде накапливаются продукты жизнедеятельности, которые также являются компонентами данной среды. Недостатками указанной среды является то, что свойства продуктов жизнедеятельности не идентифицированы и эффект их не изучен. Кроме того, в среде сохраняются остатки препарата 5-азацитидин, которые обладают мутагенным действием.An analogue is the growth medium obtained by growing cardiomyocytes from bone marrow MSCs [K. Fukuda, Artificial Organs, 2001]. The basis of the medium under consideration is IMDM, to which antibiotics, antimycotics, L-glutamine and 20% fetal bovine serum are added, as well as a differentiation inducer 5-azacytidine (demethylating agent). During the growth and proliferation of MSCs and their differentiation into cardiomyocytes, the products of vital activity accumulate in the medium, which are also components of this medium. The disadvantages of this environment is that the properties of vital products are not identified and their effect has not been studied. In addition, the remains of the drug 5-azacytidine, which have a mutagenic effect, are preserved in the medium.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом при термических ожогах [патент RU №2292212, 27.01.07]. Данная среда содержит минеральные соли и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста МСК костного мозга человека, среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в G0 периоде клеточного цикла. Описанный прототип имеет ряд недостатков - ограниченный выбор сырья (МСК, получаемые только из костного мозга, не предполагает использование накопленной ранее и криоконсервированной культуры), узкий спектр регенеративного действия, а биологически активные вещества, входящие в клетки МСК в значительном количестве в состав препарата не входят. Определение времени сбора кондиционной среды косвенным путем (по фазе клеточного цикла), не позволяет получить продукт с максимальным содержанием цитокинов.As a prototype of the invention, a conditioned medium is considered that has a therapeutic effect in thermal burns [patent RU No. 2292212, 01/27/07]. This medium contains mineral salts and amino acids, penicillin, amphotericin, L-glutamine and fetal calf serum, sufficient to maintain the viability and growth of human bone marrow MSCs; the medium is obtained at the stage of stationary growth of a stable cell line of mesenchymal stem cells located in the G 0 period cell cycle. The described prototype has several drawbacks - the limited choice of raw materials (MSCs obtained only from bone marrow does not imply the use of previously accumulated and cryopreserved cultures), a narrow spectrum of regenerative action, and biologically active substances that enter the cells of MSCs in a significant amount are not included in the composition of the drug . Determining the time for collecting the conditioned medium indirectly (by the phase of the cell cycle) does not allow to obtain a product with a maximum content of cytokines.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Способ получения регенеративного препарата на основе экстракта МСК и кондиционной среды, образующейся в процессе роста клеток, включает следующие этапы: деконсервирование или выделение de novo клеточного материала из косного мозга или жировой ткани животных, культивирование МСК в среде на основе DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с 10 % содержанием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) до образования кондиционной среды с определенным содержанием ключевых интерлейкинов - ИЛ-β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата посредством глицина в конечной концентрации 20 мг/мл, стерилизующая фильтрация, розлив во флаконы и лиофильная сушка.A method of obtaining a regenerative preparation based on an extract of MSCs and a conditioned medium formed during cell growth includes the following steps: deconservation or isolation of de novo cellular material from the brain or adipose tissue of animals, culturing MSCs in a medium based on DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) with a 10% content of fetal bovine serum (FBS) before the formation of a conditioned medium with a certain content of key interleukins - IL-β, IL-2, IL-6, IL-10, collection of conditioned medium, obtaining an MSC extract by freezing i-thawing the cell suspension, combining the extract with the conditioned MSC medium, stabilizing the components of the obtained preparation with glycine at a final concentration of 20 mg / ml, sterilizing filtration, filling into bottles and freeze drying.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
При создании настоящего изобретения была поставлена задача по применению концепции регенеративной медицины в ветеринарии для восстановления функции жизненно важных органов животных путем замены дефективных клеточных элементов на новые за счет активации прогениторных клеток пораженной ткани.When creating the present invention, the task was set to apply the concept of regenerative medicine in veterinary medicine to restore the function of vital animal organs by replacing defective cellular elements with new ones by activating the progenitor cells of the affected tissue.
Технический результат достигается посредством разработки способа получения препарата для ветеринарии, обладающего комплексным воздействием на регенеративные процессы в организме.The technical result is achieved by developing a method for producing a drug for veterinary medicine, which has a complex effect on regenerative processes in the body.
Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата обладающего высокой эффективностью, которая обусловлена действием сбалансированного комплекса цитокинов, содержащихся в экстрактах и секретируемых мезенхимальными стволовыми клетками в культуральную среду. Для реализации регенеративного действия МСК было подобрано содержание ключевых интерлейкинов, а именно ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, являющихся основными стимуляторами механизмов неспецифической защиты организма и специфического иммунного ответа, а также активаторами репаративных процессов в поврежденных тканях.The proposed method provides a preparation having high efficiency, which is due to the action of a balanced complex of cytokines contained in extracts and secreted by mesenchymal stem cells into the culture medium. To realize the regenerative effect of MSCs, the content of key interleukins was selected, namely IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, which are the main stimulants of the mechanisms of nonspecific defense of the body and a specific immune response, as well as activators of reparative processes in damaged tissues.
Предлагаемый способ предполагает следующие операции: выделение мезенхимальных стволовых клеток из косного мозга или жировой ткани животных (de novo) или деконсервирование готовой клеточной культуры, культивирование МСК в среде на основе DMEM с 10 % содержанием ФБС до образования кондиционной среды (в которой определяется содержание ключевых интерлейкинов: ИЛ-1β - не менее 2 пг/мл, ИЛ-2 - не менее 2 пг/мл, ИЛ-6 - не менее 10 пг/мл, ИЛ-10 - не менее 2 пг/мл, определяемых при помощи иммуноферментного анализа (ELISA)), сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата (добавление глицина до конечной концентрации 20 мг/мл), розлив во флаконы по 1 мл и лиофильная сушка.The proposed method involves the following operations: isolation of mesenchymal stem cells from the brain or adipose tissue of animals (de novo) or de-preservation of the finished cell culture, cultivation of MSCs in a DMEM-based medium with 10% PBS to form a conditioned medium (in which the content of key interleukins is determined : IL-1β - not less than 2 pg / ml, IL-2 - not less than 2 pg / ml, IL-6 - not less than 10 pg / ml, IL-10 - not less than 2 pg / ml, determined by enzyme immunoassay (ELISA)), collection of conditioned medium, obtaining extract M K, by freezing-thawing of cell suspensions, the combined extracts were conditioned with MSC medium, stabilization components resulting formulation (addition of glycine to a final concentration of 20 mg / ml), filling into vials of 1 ml and freeze drying.
В данном изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному способу, и в виде коммерческих культур МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения (например, такие как АТСС).In this invention, MSCs obtained independently by any known method can be used and in the form of commercial cultures of MSCs that have a quality certificate and are intended, including for clinical use (for example, such as ATCC).
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Изобретение поясняется фото, графиками и таблицами:The invention is illustrated by photos, graphs and tables:
Фото 1. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 10×).
Фото 2. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, третий пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).
Фото 3. Колония МСК из ЖТ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).
График 1. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС МСК КМ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 2. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (КС МСК ЖТ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 3. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК КМ деконс.) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 4. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс) на активность АлТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).Figure 4. The effect of the drug on the basis of the extract and the conditioned environment of bone marrow mesenchymal stem cells (KS + MSC KM), adipose tissue (KS + MSC in VT) and deconserved bone marrow MSC (SC + MSC KM decons) on the activity of ALT in rat serum when modeling acute liver pathology (AKI).
График 5. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на активность АсТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).Figure 5. The effect of the drug based on the extract and the conditioned medium of bone marrow mesenchymal stem cells (KS + MSC KM), adipose tissue (KS + MSC MF) and deconserved MSC of bone marrow (SC + MSC KM decons.) On the activity of AcT in serum rats in modeling acute liver pathology (AKI).
График 6. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на содержание белка в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).Figure 6. The effect of the drug on the basis of the extract and the conditioned environment of bone marrow mesenchymal stem cells (KS + MSC KM), adipose tissue (KS + MSC MF) and deconserved bone marrow MSC (SC + MSC KM decons.) On the protein content in blood serum rats in modeling acute liver pathology (AKI).
Таблица 1. Значение ИП культур клеток ФЭП и МСК при добавлении разных концентраций регенеративного препарата.Table 1. The IP value of cell cultures of FEP and MSCs with the addition of different concentrations of the regenerative drug.
Таблица 2. Биохимические параметры поражения печени в исследуемых группах животных.Table 2. Biochemical parameters of liver damage in the studied groups of animals.
Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения подтверждаются следующими примерами:The possibility of carrying out the invention and the effectiveness of its application are confirmed by the following examples:
Пример 1. Клетки костного мозга (КМ) выделяли из бедренных костей крыс (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×106 кл/мл) сразу после декапитации, помещали в охлажденную среду DMEM/F12 (Biowest, USA), содержащую гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия) и амфотерицин Б (0,25 мкг/мл, Biowest, USA), дважды отмывали от крови указанной средой центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 минут.Example 1. Bone marrow (CM) cells were isolated from rat thigh bones (in an amount providing an inoculum concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml) immediately after decapitation, placed in a cooled DMEM / F12 medium (Biowest, USA) containing gentamicin (80 μg / ml, Biolot, Russia) and amphotericin B (0.25 μg / ml, Biowest, USA) were washed twice from the blood by the indicated medium by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes.
Клетки высевали с концентрацией 1×106 кл/мл (для чего производили предварительный подсчет клеток в камере Горяева с учетом жизнеспособности путем субвитального окрашивания трипановым синим) культивировали в пластиковых флаконах (SPL, Корея) с площадью ростовой поверхности 175 см2 при температуре 37°С в атмосфере с 5%-м содержанием СО2. В состав ростовой среды входила питательная среда DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10 % ФБС (Sigma Aldrich, USA), гентамицин (80 мкг/мл), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Выделение клеточной фракции МСК основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату.Cells were seeded with a concentration of 1 × 10 6 cells / ml (for which preliminary cell counting was performed in the Goryaev’s chamber, taking into account viability by subvital staining with trypan blue), they were cultured in plastic bottles (SPL, Korea) with a growth surface area of 175 cm 2 at a temperature of 37 ° C in an atmosphere with a 5% CO 2 content. The growth medium included DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10% PBS (Sigma Aldrich, USA), gentamicin (80 μg / ml), amphotericin B (25 μg / ml, Biowest, USA) . Isolation of the cell fraction of MSCs is based on the adhesion of these cells to the culture plastic, as a substrate.
Спустя сутки после начала культивирования производили ополаскивание средой с антибиотиком для удаления флотирующей фракции клеток и производили замену ростовой среды. В дальнейшем замену среды выполняли раз в 3-4 суток. По достижению конфлюентности монослоя (контролируется визуально при помощи инвертированного микроскопа) не менее 85%, его дезагрегировали диспергирующим раствором (0,05-0,1% трипсина (Biowest, USA) в растворе Версена (ПанЭко, Россия)) и проводили посев в новые культуральные флаконы с коэффициентом пересева 1:3.A day after the start of cultivation, rinsing with an antibiotic medium was performed to remove the floating fraction of cells and the growth medium was replaced. Subsequently, the medium was replaced every 3-4 days. To achieve the confluence of the monolayer (visually checked with an inverted microscope) at least 85%, it was disaggregated with a dispersing solution (0.05-0.1% trypsin (Biowest, USA) in Versen's solution (PanEco, Russia) and inoculated in new culture bottles with a reseeding ratio of 1: 3.
Для получения кондиционной среды культуру вели в течение 3-4 пассажей, затем выполняли посев в культуральные флаконы из расчета 5-15×103 клеток на 1 см2 площади ростовой поверхности в 90±5 мл ростовой среды и культивировали в описанных выше условиях до достижения необходимой концентрации интерлейкинов в среде.To obtain a conditioned medium, the culture was carried out for 3-4 passages, then inoculation was carried out in culture bottles at the rate of 5-15 × 10 3 cells per 1 cm 2 of the surface area in 90 ± 5 ml of growth medium and cultivated under the conditions described above until the necessary concentration of interleukins in the environment.
При достижения необходимой концентрации биологически активных веществ кондиционную среду, содержащую все продукты секреции МСК, собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±1°С в течение 10 минут от клеточного дебриса.Upon reaching the required concentration of biologically active substances, a conditioned medium containing all MSC secretion products was collected in sterile centrifuge tubes, purified by centrifugation at 3000 rpm and a temperature of 5 ± 1 ° C for 10 minutes from cell debris.
Полученная кондиционная среда может использоваться непосредственно по назначению или храниться в течение продолжительного времени в определенных условиях (до семи суток - при температуре 3±1°С, более длительно хранение требует температуры не выше минус 20°С).The resulting conditioned medium can be used directly for its intended purpose or stored for a long time under certain conditions (up to seven days at a temperature of 3 ± 1 ° C, longer storage requires a temperature of no higher than minus 20 ° C).
После сбора кондиционной среды, получали экстракт МСК КМ: клеточный монослой, при конфлюентности не менее 90%, дезагрегировали указанным выше диспергирующим раствором, добавляли 0,9%-й раствор хлорида натрия (5-10 мл на 1 культуральный флакон), подвергали замораживанию при температуре минус 20±2°С, после чего выполняли оттаивание при комнатной температуре. Полученный экстракт МСК КМ собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±3°С в течение 10 минут.After collecting the conditioned medium, an extract of MSC KM was obtained: cell monolayer, with a confluency of at least 90%, was disaggregated with the above dispersing solution, 0.9% sodium chloride solution (5-10 ml per 1 culture bottle) was added, it was frozen temperature minus 20 ± 2 ° C, after which thawing was performed at room temperature. The obtained MSC KM extract was collected in sterile centrifuge tubes, purified from cell debris by centrifugation at 3000 rpm and a temperature of 5 ± 3 ° C for 10 minutes.
Для получения регенеративного препарата, осадок после центрифугирования, представляющий собой экстракт МСК КМ, объединяли с кондиционной средой, измеряли содержание ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, добавляли глицин (до конечной концентрации 20 мг/мл), разливали во флаконы по 1 мл и лиофильно высушивали.To obtain a regenerative preparation, the centrifugation pellet, which is an extract of MSC KM, was combined with a conditioned medium, the contents of IL-1, IL-2, IL-6, IL-10 were measured, glycine was added (to a final concentration of 20 mg / ml), Poured into vials of 1 ml and freeze-dried.
Так, к концу четвертой недели от начала культивирования МСК КМ крыс можно получить до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×106 кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной среды МСК КМ, который может быть использован для приготовления препарата, стимулирующего регенеративные процессы организма животного.So, by the end of the fourth week from the beginning of the cultivation of MSC of KM rats, up to 3000 ml (at a seeding concentration at the stage of isolation of at least 1 × 10 6 cells / ml) of a lyophilization solution based on the extract and conditioned medium of MSC KM can be obtained, which can be used for the preparation of a drug that stimulates the regenerative processes of the animal’s body.
Пример 2. Клеточный материал получали из подкожной жировой ткани (ЖТ) крысы (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×106 кл/мл) в стерильных условиях, после декапитации животного. Жировую ткань помещали в буферный раствор Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (Biowest, USA), содержащий гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия), фрагментировали до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергали ступенчатой ферментативной обработке. Ферментативную обработку выполняли следующим образом: к измельченной жировой ткани добавляли питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA) с добавлением антибиотика и антимикотика, а также фермента трипсина до концентрации 0,1-0,15%, выдерживали 30±5 минут при температуре 37±1°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем среду с клетками фильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD) и добавляли 0,2-0,5% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), для инактивации трипсина. Повторяли описанную операцию дважды со снижением времени инкубации до 15±5 минут.Example 2. Cellular material was obtained from subcutaneous adipose tissue (VT) of a rat (in an amount providing an inoculum concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml) under sterile conditions after decapitation of the animal. Adipose tissue was placed in Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) buffer solution (Biowest, USA) containing gentamicin (80 μg / ml, Biolot, Russia), fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to stepwise enzymatic treatment. The enzymatic treatment was carried out as follows: DMEM high glucose nutrient medium (Biowest, USA) was added to the crushed adipose tissue with the addition of an antibiotic and antimycotics, as well as trypsin enzyme to a concentration of 0.1-0.15%, kept for 30 ± 5 minutes at a temperature of 37 ± 1 ° С with constant stirring on a magnetic stirrer, then the medium with cells was filtered through 100 μm (BD) nylon membranes and 0.2-0.5% PBS (Sigma-Aldrich, USA) was added to inactivate trypsin. The described operation was repeated twice with a decrease in incubation time to 15 ± 5 minutes.
После фильтрации клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин, супернатант полностью удаляли. Полученный осадок ресуспендировали в питательной среде DMEM high glucose (Biowest, USA) с 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), после чего клетки высевали в культуральные флаконы (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) с площадью ростовой поверхности 175 см2 (SPL, Корея) с концентрацией 1×106 кл/мл и культивировали при 37°С с 5%-ной концентрацией СО2.After filtration, the cell suspension was centrifuged for 10 min at 1200 rpm, the supernatant was completely removed. The resulting pellet was resuspended in DMEM high glucose growth medium (Biowest, USA) with 10% PBS (Sigma-Aldrich, USA), after which the cells were seeded in culture vials (70 ± 5 ml of cell suspension / vial) with a growth surface area of 175 cm 2 (SPL, Korea) with a concentration of 1 × 10 6 cells / ml and cultured at 37 ° C with a 5% concentration of CO 2 .
Выделение клеточной фракции МСК, как и в предыдущем примере, основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату. Накопление клеточной массы, формирование кондиционной среды и получение регенеративного препарата выполняли аналогичным образом примеру 1. Время производства препарата также составляло 4 недели, количество продукта - до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×106 кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной средыThe selection of the cell fraction of MSCs, as in the previous example, is based on the adhesion of these cells to the culture plastic, as a substrate. The accumulation of cell mass, the formation of a conditioned medium and the preparation of a regenerative preparation were carried out in the same manner as in Example 1. The production time of the preparation was also 4 weeks, the amount of the product was up to 3000 ml (at the inoculation concentration at the extraction stage of at least 1 × 10 6 cells / ml) of the solution lyophilization based on extract and conditioned medium
Пример 3. Клеточный материал получали путем деконсервирования культур клеток МСК (КМ или ЖТ крыс). Криопробирку с клетками (концентрация клеток не менее 1×106 кл/мл, объем клеточной суспензии - 1 мл) помещали на водяную баню с температурой воды 37±1°С, периодически встряхивая, до полного размораживания. Производили отмывку клеток от криопротектора при помощи питательной среды DMEM high glucose (Biowest, USA). Для этого клеточную суспензию переносили в стерильный культуральный флакон с площадью ростовой поверхности S=25 см2, добавляли небольшими дозами, чтобы исключить осмотическое повреждение, питательную среду DMEM high glucose (10-15 мл), полученную взвесь равномерно распределяли на две центрифужные пробирки и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в ростовой среде, содержащую питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), гентамицин (40 мкг/мл, Биолот, Россия), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Производили посев клеток (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) в концентрации 8-10×104 кл/мл в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 175 см2 (SPL, Корея) и культивировали при 37°С с 5% содержанием СО2. Ростовую среду меняли каждые 3-4 суток. Накопление клеточной биомассы, получение кондиционной среды и препарата осуществляли аналогично как в Примере 1.Example 3. Cellular material was obtained by deconservation of cell cultures of MSCs (KM or VT rats). A cryovial with cells (a cell concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml, a cell suspension volume of 1 ml) was placed in a water bath with a water temperature of 37 ± 1 ° C, shaking periodically, until completely thawed. Cells were washed from the cryoprotectant using DMEM high glucose growth medium (Biowest, USA). For this, the cell suspension was transferred into a sterile culture vial with a growth surface area of S = 25 cm 2 , small doses were added to exclude osmotic damage, DMEM high glucose medium (10-15 ml), the resulting suspension was uniformly distributed into two centrifuge tubes and centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was resuspended in a growth medium containing DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10% PBS (Sigma-Aldrich, USA), gentamicin (40 μg / ml, Biolot, Russia), amphotericin B (25 μg / ml, Biowest, USA). Cells were sown (70 ± 5 ml of cell suspension / vial) at a concentration of 8-10 × 10 4 cells / ml in culture bottles with a growth surface area of 175 cm 2 (SPL, Korea) and cultivated at 37 ° C with 5% CO 2 . The growth medium was changed every 3-4 days. The accumulation of cellular biomass, obtaining a conditioned environment and the drug was carried out similarly as in Example 1.
Пример 4. Свойства лекарственного средства на основе экстракта и кондиционной среды МСК костного мозга и жировой ткани оценивали по влиянию на пролиферацию культуры клеток фибробластов эмбрионов человека (ФЭЧ) и мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крыс (in vitro).Example 4. The properties of the drug based on the extract and the conditioned environment of MSCs of bone marrow and adipose tissue were evaluated by the effect on the proliferation of cell culture of human embryo fibroblasts (PEC) and mesenchymal stem cells isolated from rat bone marrow (in vitro).
Для этого, модельные культуры клеток брали на третьем пассаже, производили посев в 12-ти-луночные культуральные планшеты (SPL, Германия) с добавлением исследуемого регенеративного препарата в ростовую среду в различных концентрациях (1%, 5%, 10%) культивировали в течение трех суток в стандартных условиях (инкубировали во влажной камере в CO2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2) с добавлением 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA) к среде 199 (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия) для ФЭЧ и DMEM/F12 (1:1) (Biowest, USA) - для МСК. Посевная концентрация клеток ФЭК - 8-10×104 кл/мл, МСК - 7-9×104 кл/мл среды. В качестве контроля использовали клетки, выращенные в ростовой среде без добавления регенеративного препарата.To do this, model cell cultures were taken at the third passage, seeded in 12-well culture plates (SPL, Germany) with the test regenerative preparation added to the growth medium at various concentrations (1%, 5%, 10%), cultured for three days under standard conditions (incubated in a humid chamber in a CO 2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 ) with the addition of 10% PBS (Sigma-Aldrich, USA) to medium 199 (MPE Chumakov Institute of Applied Mathematics and Epidemiology) , Russia) for PMF and DMEM / F12 (1: 1) (Biowest, USA) - for MSCs. The inoculum concentration of FEC cells is 8-10 × 10 4 cells / ml, MSC - 7-9 × 10 4 cells / ml medium. As a control, cells grown in growth medium without the addition of a regenerative preparation were used.
По окончании инкубации проводили снятие выросших культур с поверхности пластика и определение пролиферативного индекса. Индекс пролиферации (ИП) определяли, как отношение количества клеток в 1 мл суспензии, полученной в результате снятия клеток с подложки по достижению конфлюентности монослоя к посевной концентрации клеток (количество клеток в мл раствора при посеве на культуральные планшеты).At the end of the incubation, the grown cultures were removed from the plastic surface and the proliferative index was determined. The proliferation index (IP) was determined as the ratio of the number of cells in 1 ml of the suspension obtained by removing the cells from the substrate to achieve confluence of the monolayer to the inoculum cell concentration (the number of cells in ml of the solution when plated on culture plates).
Полученные данные для культур двух морфологических типов свидетельствуют (табл. 1, графики 1-3) о повышении уровня пролиферативных свойств клеток обеих культур при добавлении в ростовые среды предлагаемого регенеративного препарата (полученного всеми тремя описанными в предыдущих примерах модификациях способа) на 10-85% для ФЭЧ и 2-25 % для МСК по сравнению с ростовой средой, при этом наблюдалась линейная зависимость между концентрацией препарата и значением индекса пролиферации.The data obtained for cultures of two morphological types indicate (Table 1, charts 1-3) that the level of proliferative properties of cells of both cultures is increased when the proposed regenerative preparation (obtained by all three process modifications described in the previous examples) is added to growth media) by 10-85% for PEC and 2–25% for MSC as compared with the growth medium, while a linear relationship was observed between the concentration of the drug and the value of the proliferation index.
Пример 5. Регенеративное действие препарата на основе экстракта и кондиционной среды культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани было изучено на модели острого поражения печени (МОПП) крыс (in vivo). Модель острого поражения печени была выполнена путем однократного введения крысам в желудок через зонд парацетамола (N-(4-гидроксифенил)ацетамида) в виде суспензии в дозе 700 мг на 1 кг массы тела. Процедура лечения после МОПП заключалась в ежедневном внутримышечном введении 0,5 мл исследуемого препарата животным опытной группы в течение 5 дней. В качестве контроля использовали крыс с МОПП, которые не подвергались терапевтическим воздействиям.Example 5. The regenerative effect of a preparation based on an extract and a conditioned medium of a culture of mesenchymal stem cells from bone marrow or adipose tissue was studied in an acute in vivo model of liver damage (MOPP) in rats. The model of acute liver damage was performed by a single injection of rats into the stomach through a probe of paracetamol (N- (4-hydroxyphenyl) acetamide) in the form of a suspension at a dose of 700 mg per 1 kg of body weight. The treatment procedure after MOPP consisted in daily intramuscular administration of 0.5 ml of the studied drug to the animals of the experimental group for 5 days. As a control, rats with MOPP that were not subjected to therapeutic effects were used.
Спустя сутки после окончания курса лечения крыс выводили из эксперимента путем декапитации, предварительно обеспечив наркоз за счет внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 400 мг на 1 кг массы тела животного. В сыворотке крови определили активность ферментов аспартат-(АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ) с помощью стандартного набора Vital и содержание общего белка - биуретовым методом. Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени. Ферменты АсТ и АлТ присутствуют в значительных количествах в печени и почках, поэтому в норме концентрации АсТ и АлТ в крови невелики. При повреждении гепатоцитов происходит потеря ферментов АсТ и АлТ, и концентрация этих биохимических маркеров в крови возрастает. Изменение уровня общего белка (признак грубой патологии печени) не наблюдалось.A day after the end of the course of treatment, the rats were removed from the experiment by decapitation, having previously provided anesthesia due to the intraperitoneal administration of chloral hydrate at a dose of 400 mg per 1 kg of animal body weight. In the blood serum, the activity of the aspartate- (AcT) and alanine aminotransferase (ALT) enzymes was determined using a standard Vital kit and the total protein content was determined using the biuret method. The studied biochemical parameters reflect the functional state of the liver. The enzymes AcT and Alt are present in significant quantities in the liver and kidneys, therefore, normally, the concentrations of AcT and Alt in the blood are low. When hepatocytes are damaged, the enzymes AcT and Alt are lost, and the concentration of these biochemical markers in the blood increases. A change in the level of total protein (a sign of gross pathology of the liver) was not observed.
Результаты исследования (табл. 2 и графики 4-6) показывают, что применение в течение 5 дней предлагаемого регенеративного препарата на основе экстракта и кондиционной среды с использованием мезенхимальных стволовых клеток, как полученных de novo из костного мозга и жировой ткани, так и деконсервированных, приводило к значительному улучшению состояния животных с ОПП, что подтверждается концентрацией исследованных маркеров повреждения печени (показатели уровней АсТ, АлТ). Так, концентрации указанных ферментов в группе животных, получавших регенеративный препарат, значимо не отличались от показателей в группе интактных крыс (не подвергшихся МОПП).The results of the study (Table 2 and graphs 4-6) show that the use for 5 days of the proposed regenerative preparation based on the extract and conditioned medium using mesenchymal stem cells, both de novo obtained from bone marrow and adipose tissue, and deconserved, led to a significant improvement in the condition of animals with AKI, which is confirmed by the concentration of the studied markers of liver damage (indicators of ACT, ALT levels). Thus, the concentrations of these enzymes in the group of animals treated with the regenerative preparation did not significantly differ from those in the group of intact rats (not exposed to MOPP).
Таким образом, предлагаемый регенеративный препарат обладает терапевтическим эффектом при остром поражении печени животных. Существенных различий в эффективности препарата, полученного из различных источников культур мезенхимальных стволовых клеток, также не было выявлено.Thus, the proposed regenerative drug has a therapeutic effect in acute liver damage of animals. Significant differences in the effectiveness of the drug obtained from various sources of mesenchymal stem cell cultures were also not detected.
Источники информации:Information sources:
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков - М.: Мир, 1983. - 264 с.1. Adams R. Methods of cell culture for biochemists - M .: Mir, 1983. - 264 p.
2. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С. 4-8.2. Digay A.M., Zyuzkov G.N. Cell therapy: new approaches // Science in Russia. - Moscow: Publishing House "Science", 2009. - Volume. 169. - No. 1. S. 4-8.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фонима Т.Н., Ветошкина Т.В., Хричкова Т.Ю., Ермакова Н.Н., Плотников М.Б., Алиев О.И., Чернышева Г.А. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Приложение 2. - С. 14-21.3. Goldberg ED, Dygay AM, Zhdanov VV, Zyuzkov GN, Miroshnichenko LA, Simanina EV, Stavrova LA, Udut EV, Fonima T. N., Vetoshkina T.V., Khrichkova T.Yu., Ermakova N.N., Plotnikov M.B., Aliev O.I., Chernysheva G.A. Pharmacological aspects of regenerative medicine // Bull. an experiment. biol. and medicine. - 2008. -
4. Патофизиология: Учебник для медицинских ВУЗов. / Под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2001. - 681-687.4. Pathophysiology: Textbook for medical universities. / Ed. V.V. Novitsky, E.D. Goldberg. - Tomsk: Publishing house of Tomsk University, 2001. - 681-687.
5. Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Удут В.В. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.5. Digay A.M., Zyuzkov TN, Zhdanov VV, Madonov PG, Artamonov AV, Bekarev AA, Udut VV Immobilized granulocyte colony stimulating factor. Pharmacological properties and prospects of use. - Tomsk: Publishing House: LLC Printing Manufactory, 2011. - 149 p.
6. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Френши - М.: Мир, 1989. - 333 с.6. Culture of animal cells. Methods / Ed. R. Francis - Moscow: Mir, 1989 .-- 333 p.
7. «Кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом», № патента 2292212, дата публикации 27.01.07 г, авторы: Коноплянников А.Г., Колесникова А.И., Саенко А.С., Бардычев М.С., Пасов В.В., Курпешева А.К., Крикунова Л.И.;7. “A conditioned environment with a therapeutic effect”, patent number 2292212, publication date 01/27/07, authors: Konoplyannikov A.G., Kolesnikova A.I., Saenko A.S., Bardychev M.S., Pasov V. .V., Kurpesheva A.K., Krikunova L.I .;
8. «Биологически активный препарат "лимфокинин", обладающий иммуномодулирующими свойствами», № патента 2048816, № заявки 93031657/14, дата подачи заявки 06.07.1993, дата публикации 27.11.1995, авторы: Быковская С.Н., Шадрин О.В., Дворянченко Д.Ю., патентообладатель ЗАО «Симера»;8. "Biologically active drug" lymphokinin, with immunomodulating properties ", patent number 2048816, application number 93031657/14, application filing date 06/07/1993, publication date 11/27/1995, authors: Bykovskaya S.N., Shadrin O.V. ., Dvoryanchenko D.Yu., patent holder of Simera CJSC;
9. «Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран», № патента 2574017, авторы: Стамбольский Д.В., Ткачук В.А., Семина Е.В., Тарасова Е.В., Рубина К.А., Кочегура Т.Н., Сысоева В.Ю., Ефименко А.Ю., Акопян Ж.А.;9. "The tool for the treatment of burns and wounds based on cytokines and growth factors secreted by human mesenchymal cells, a method of obtaining a means and method of treating burns and wounds", patent number 2574017, authors: Stambolsky DV, Tkachuk VA, Semina E.V., Tarasova E.V., Rubina K.A., Kochegura T.N., Sysoeva V.Yu., Efimenko A.Yu., Akopyan J.A .;
10. «Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, способ его получения, способ стимуляции заживления ран или лечения ожогов, способ коррекции косметического дефекта, способ ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос», № патента 2280459, № заявки 2001133453/13, дата публикации заявки 20.01.2005, дата публикации 27.07.2006, авторы: Нотон Г.К. (Us), Хорвитз Д.Л. (Us), Эпплгейт М.А. (Us), Зелтинджер Дж. (Us), Мэнсбридж Дж.Н. (Us), Керн A. (Us), Лэндин Л.К. (Us), Рэтклифф Э. (Us), Пинни Р.Э. (Us); патентообладатель: Скинмедика, Инк. (Us);10. "Means for changing the growth rate or reproduction of cells, a method for its production, a method for stimulating wound healing or treatment of burns, a method for correcting a cosmetic defect, a method for inhibiting skin aging and a method for stimulating hair growth", Patent No. 2280459, Application No. 2001133453/13 publication date of the application 01/20/2005, publication date 07/27/2006, authors: Noton G.K. (Us), Horvits D.L. (Us), Applegate M.A. (Us), Zeltinger J. (Us), Mansbridge J.N. (Us), Kern A. (Us), Landin L.K. (Us), Ratcliffe E. (Us), Pinney R.E. (Us); patent holder: Skinmedics, Inc. (Us);
11. «Mesenchymal stem cell conditioned medium», № патента WO 2008020815 A1, № заявки PCT/SG2007/000257, дата публикации 21.02.2008 г., авторы: Sai Kiang Lim, Elias Lye, патентообладатель Agency For Science, Technology And Research;11. "Mesenchymal stem cell conditioned medium", patent number WO2008020815 A1, application number PCT / SG2007 / 000257, publication date 02.21.2008, authors: Sai Kiang Lim, Elias Lye, patent holder Agency For Science, Technology And Research;
12. A. van Koppen, J.A. Joles, B. W. M. van Balkom et al., "Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescues kidney function in rats with established chronic kidney disease," PLoS ONE, vol. 7, no. 6, Article ID e38746, 2012;12. A. van Koppen, J.A. Joles, B. W. M. van Balkom et al., "Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescues kidney function in rats with established chronic kidney disease," PLoS ONE, vol. 7, no. 6, Article ID e38746, 2012;
13. В.R. Zhou, Y. Xu, S.L. Guo et al., "The effect of conditioned media of adipose-derived stem cells on wound healing after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 519126, 9 pages, 2013;13. B.R. Zhou, Y. Xu, S.L. Guo et al., "The effect of conditioned media of adipose-derived stem cells on wound healing after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 519126, 9 pages, 2013;
14. M.K. Jr. Patterson, Measurement of growth and viability of cells in culture. In: W.B. Jakoby, I.H. Pastin, eds., Methods in Enzymology, New York: Academic Press Inc., Vol. 58, 141-152, 1979;14. M.K. Jr. Patterson, Measurement of growth and viability of cells in culture. In: W.B. Jakoby, I.H. Pastin, eds., Methods in Enzymology, New York: Academic Press Inc., Vol. 58, 141-152, 1979;
15. Mbalaviele G, Jaiswal N, Meng A, Cheng L, Van Den Bos C, Thiede M. Human mesenchymal stem cells promote human osteoclast differentiation from CD34+ bone marrow hematopoietic progenitors // Endocrinology. 1999 Aug; 140 (8): 3736-3743;15. Mbalaviele G, Jaiswal N, Meng A, Cheng L, Van Den Bos C, Thiede M. Human mesenchymal stem cells promote human osteoclast differentiation from CD34 + bone marrow hematopoietic progenitors // Endocrinology. 1999 Aug; 140 (8): 3736-3743;
16. S.H. Bhang, S. Lee, J.Y. Shin, T.J. Lee, H.K. Jang, and B.S. Kim, "Efficacious and clinically relevant conditioned medium of human adipose-derived stem cells for therapeutic angiogenesis," Molecular Therapy, vol. 22, no. 4, p. 862, 2014;16. S.H. Bhang, S. Lee, J.Y. Shin, T.J. Lee, H.K. Jang, and B.S. Kim, "Efficacious and clinically relevant conditioned medium of human adipose-derived stem cells for therapeutic angiogenesis," Molecular Therapy, vol. 22, no. 4, p. 862, 2014;
17. Leo Timmers, Sai Kiang Lim, Imo E. Hoefer «Human mesenchymal stem cell conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction», Stem Cell Research vol. 6, pp. 206-214, 2011;17. Leo Timmers, Sai Kiang Lim, Imo E. Hoefer "Human mesenchymal stem cell conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction", Stem Cell Research vol. 6, pp. 206-214, 2011;
18. Reza Moghadasali, Henricus A.M. Mutsaers, Mahnaz Azarnia "Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates regeneration of human renal proximal tubule epithelial cells after gentamicin toxicity" - Experimental and Toxicologic Pathology - vol. 65, pp.. 595-600, 2013.18. Reza Moghadasali, Henricus A.M. Mutsaers, Mahnaz Azarnia "Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates regeneration of human renal proximal tubule epithelial cells after gentamicin toxicity" - Experimental and Toxicologic Pathology - vol. 65, pp. 595-600, 2013.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016148715A3 RU2016148715A3 (en) | 2018-06-13 |
| RU2016148715A RU2016148715A (en) | 2018-06-13 |
| RU2662172C2 true RU2662172C2 (en) | 2018-07-24 |
Family
ID=62619402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662172C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720812C1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Method of producing agent possessing anti-inflammatory, regenerative, immunomodulating, detoxification, adaptogenic activity and capable of regulating metabolism |
| RU2720800C1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Agent for cattle, having anti-inflammatory, regenerative, immunomodulating, detoxification, adaptogenic activity and able to regulate metabolism |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111426C1 (en) * | 1995-11-03 | 1998-05-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Method of lyophilic drying of biological preparation |
| RU2178309C2 (en) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Antithymocytic globulin for intravenous injection and method for its obtaining |
| RU2341270C2 (en) * | 2006-12-28 | 2008-12-20 | Александр Сергеевич Ботин | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof |
| RU2409350C2 (en) * | 2005-03-08 | 2011-01-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Chemically specified stabiliser |
| RU2495565C1 (en) * | 2012-10-03 | 2013-10-20 | Игорь Николаевич Габриэль | Method to stimulate growth and to improve resistance of farm animals |
-
2016
- 2016-12-13 RU RU2016148715A patent/RU2662172C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111426C1 (en) * | 1995-11-03 | 1998-05-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Method of lyophilic drying of biological preparation |
| RU2178309C2 (en) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Antithymocytic globulin for intravenous injection and method for its obtaining |
| RU2409350C2 (en) * | 2005-03-08 | 2011-01-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Chemically specified stabiliser |
| RU2341270C2 (en) * | 2006-12-28 | 2008-12-20 | Александр Сергеевич Ботин | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof |
| RU2495565C1 (en) * | 2012-10-03 | 2013-10-20 | Игорь Николаевич Габриэль | Method to stimulate growth and to improve resistance of farm animals |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АНДРЕЕВА Е.Р. "Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при моделировании тканевой ("физиологической") гипоксии in vitro" // Авто дмн, Москва, 2016, стр.17, 18, 24, [он-лайн], [найдено 03.11.2017]. * |
| АНДРЕЕВА Е.Р. "Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при моделировании тканевой ("физиологической") гипоксии in vitro" // Автореферат дмн, Москва, 2016, стр.17, 18, 24, [он-лайн], [найдено 03.11.2017]. Найдено из Интернет: URL: http://www.imbp.ru/webpages/win1251/Science/DisserSov/Andreeva2016/Andreeva-ref.pdf. * |
| Найдено из Интернет: URL: http://www.imbp.ru/webpages/win1251/Science/DisserSov/Andreeva2016/Andreeva-ref.pdf. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720812C1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Method of producing agent possessing anti-inflammatory, regenerative, immunomodulating, detoxification, adaptogenic activity and capable of regulating metabolism |
| RU2720800C1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Agent for cattle, having anti-inflammatory, regenerative, immunomodulating, detoxification, adaptogenic activity and able to regulate metabolism |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016148715A3 (en) | 2018-06-13 |
| RU2016148715A (en) | 2018-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Comparison of mesenchymal stem cells derived from gingival tissue and periodontal ligament in different incubation conditions | |
| CN106109496B (en) | Human umbilical cord mesenchymal stem cells extract freeze-drying powder and preparation method | |
| Yoon et al. | Enhanced cartilage formation via three-dimensional cell engineering of human adipose-derived stem cells | |
| CN103070161B (en) | Cryopreservation liquid and cryopreservation method for adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ( ADSC) | |
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| CN105112362B (en) | A kind of serum free medium of placenta mesenchyma stem cell and preparation method thereof | |
| Veron et al. | Isolation and characterization of olfactory ecto-mesenchymal stem cells from eight mammalian genera | |
| JP2010538681A (en) | Methods for extracting mesenchymal stem cells from human or animal embryos and their secretions | |
| US20200360443A1 (en) | Stem cell material and method of manufacturing | |
| Liang et al. | Progress in the treatment of osteoarthritis with umbilical cord stem cells | |
| US20170240856A1 (en) | Placenta-derived potential cells and preparing method thereof | |
| Schwarz et al. | Characterization of adipose-derived equine and canine mesenchymal stem cells after incubation in agarose-hydrogel | |
| RU2662172C2 (en) | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium | |
| JP2017104091A (en) | Method for producing mesenchymal cell | |
| CN107429233B (en) | Method for producing nervous system cell | |
| CN106701670A (en) | Methods for enhancing bioactive factor secretion capacity of mesenchymal stem cells and extracting active factors in culture solution | |
| RU2640556C2 (en) | Culture environment for mesenchymal stem cells of human | |
| JP2022501034A (en) | Isolated septal cartilage exosomes used to generate cartilage tissue | |
| Samadikuchaksaraei et al. | How does the supernatant of Lactobacillus acidophilus affect the proliferation and differentiation activities of rat bone marrow-derived stromal cells? | |
| Putra et al. | Evaluation of secretome tenogenic potential from adipose stem cells (ACS) in hypoxic condition with fresh frozen tendon scaffold using scleraxis (Scx), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and collagen type 1 | |
| RU2812015C1 (en) | Method of obtaining and using mesenchymal stem cell spheroids for; treatment of skin injuries | |
| KR101538969B1 (en) | Medium Composition for Culturing Mesenchymal Stem Cells Comprising Extract of Ecklonia cava | |
| Chailakhyan et al. | Proline-rich hypothalamic polypeptide has opposite effects on the proliferation of human normal bone marrow stromal cells and human giant-cell tumour stromal cells | |
| JP2007525193A (en) | Clinical and commercial stem cells | |
| RU2646792C1 (en) | Horse remedy with regenerative activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191214 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -MM4A- IN JOURNAL 28-2020 |